wyklad_10_i_11_strategie_analizy_genomow 2016

advertisement
Mapowanie fizyczne genomów
-konstrukcja map wyskalowanych w jednostkach fizycznych
-najdokładniejszą mapą fizyczną genomu, o
największej rozdzielczości jest sekwencja
nukleotydowa
-mapowanie fizyczne genomu to zadanie genomiki
strukturalnej
Dlaczego nie mapa genetyczna?
Strategie tworzenia map fizycznych o wysokiej
rozdzielczości – sekwencjonowania genomów
1. Strategia hierarchiczna
2. Strategia przypadkowej fragmentacji genomu tzw. „shotgun”
Wspólną cechą obu strategii jest dekonstrukcja genomu a
następnie jego rekonstrukcja
Strategia hierarchiczna (albo inaczej kontigu klonów)
1.
podzielenie genomu na
„mniejsze” (rzędu
dziesiątków lub setek
tysięcy pz) części i
sklonowanie do
odpowiednich wektorów –
biblioteka genomowa)
2.
poukładanie klonów
biblioteki w ciągi (kontigi)
nachodzących na siebie
fragmentów genomu w
sposób który
odzwierciedla taki sam
liniowy porządek jaki
występuje w genomie
(chromosomie) z którego te
fragmenty DNA powstały
3.
Wybór minimalnego
zestawu klonów i ich
sekwencjonowanie
Biblioteki genomowe (banki DNA) - zbiór klonów
pokrywających cały genom
•zwykle wstawki DNA w klonach biblioteki są duże
•Zbiór ten musi być uporządkowany tak aby sklonowane fragmenty
odzwierciedlały naturalny porządek DNA badanego organizmu
•Uporządkowanie klonów biblioteki genomowej jest istotą
strategii hierarchicznej
•Jest możliwe dzięki ustaleniu pozycji charakterystycznych
sekwencji w genomie za pomocą technik molekularnych (inżynierii
genetycznej)
Zanim skonstruujemy bibliotekę genomową
powinniśmy ustalić:
•Ile musi być takich klonów w naszej bibliotece?
•Czym strawić genomowe DNA aby uzyskać fragmenty o dużej
wielkości?
•W jakim wektorze je sklonować?
1. Ile musi być klonów w bibliotece genomowej? czyli:
Stopień pokrycia genomu przez bibliotekę
Liczbę potrzebnych klonów łatwo obliczyć:
•zależy to od wielkości genomu
•wielkości fragmentów na które został podzielony (czyli de facto wielkości
wstawki klonów biblioteki)
•Dla 95% prawdopodobieństwa pokrycia przez bibliotekę całego genomu
potrzeba 3x większego nadmiaru sklonowanych fragmentów
genomu względem wielkości genomu, a dla 99% 5x większego
nadmiaru sklonowanych fragmentów DNA - reprezentatywna biblioteka
genomowa
•Reprezentatywna biblioteka genomowa musi zawierać nadmiar
fragmentów genomu (3-5 krotny) w postaci zrekombinowanych klonów
np. plazmidowych w stosunku do wielkości genomu
Biblioteka genomowa musi zawierać nadmiar fragmentów w
postaci zrekombinowanych klonów np. plazmidowych w
stosunku do wielkości genomu
2. Wybór enzymu do klonowania
Liczba potrzebnych klonów zależy to od wielkości wstawki i wielkości
genomu
Zasada jest prosta: im większa wstawka tym mniej
klonów do uporządkowania
Organizm
wielkość
genomu
enzym
czwórkowy
(n/256)
enzym
szóstkowy
(n/4096)
enzym
ósemkowy
(n/~65 kpz)
E. coli
4,7 x 106
18 tys
1 tys
72
drożdże`
1,35 x 107
52 tys
3 tys
206
człowiek
3,0 x 109
ok. 1 mln
683 tys
420
Miejsca rozpoznawane przez enzymy rzadkotnące np. ósemkowe są
rozmieszczone w genomach bardzo nierównomiernie
•Jeśli wymagane są fragmenty o bardziej wyrównanej wielkości stosuje
się tzw. trawienie częściowe lub ograniczone enzymem
czwórkowym lub szóstkowym
Zaleta: trawienie jest losowe – żadna część genomu nie jest pominięta,
uzyskane fragmenty będą się częściowo nakładały (zachodziły) na siebie
3. Wybór wektora do tworzenia biblioteki
System klonowania PAC – P1-derived artificial chromosome
połączenie wektora P1 i plazmidu F, zachowuje pewne cechy wektora
fagowego P1 (miejsca loxP), ale zamiast systemu pakowania w główki
zrekombinowane PAC-i są wprowadzane przez elektroporację do komórek E.
coli cre+. Rekombinaza Cre działa w miejscach loxP tworząc kolisty plazmid,
który może być amplifikowany przez indukcję litycznego operonu P1
Zakres wielkości wstawek w PAC: 100-300 kpz,
F ori
elektroporacja
Sztuczny chromosom bakteryjny – BAC (Bacterial
Artificial Chromosome)
•Bakteryjny system klonowania oparty na
niskokopijnym plazmidzie E. coli – plazmidzie F
•Łatwy w manipulacji
•Zapewnia dużą stabilność sklonowanego DNA
•Niechimeryczny
•Wysoka wydajność transformacji
Sztuczny chromosom bakteryjny BAC
(Shizuya i in. 1992)
•Wektory BAC skonstruowano, aby
uniknąć problemów związanych ze
stosowaniem wektorów YAC.
•Do wektorów BAC można wstawić
fragment o długości około 100-500
kpz.
•W porównaniu do wektorów YAC,
wektory BAC są bardziej stabilne,
łatwiej transformuje się nimi
komórki E. coli oraz łatwiej się je
namnaża i izoluje z komórek
bakteryjnych.
Dysponując biblioteką musimy zestawić sklonowane fragmenty DNA w takim
samym liniowym porządku, w jakim znajdowały się w genomie, z którego
zostały otrzymane.
Kontig – seria zachodzących fragmentów, które
wspólnie pokrywają jakiś region chromosomu, cały
chromosom lub cały genom
Biblioteka genomowa – bardzo specyficzne „puzzle”
Sprowadza się to do wyszukiwania w klonach biblioteki wspólnych
molekularnych elementów pasujących do siebie.
Ponieważ sklonowanych fragmentów DNA w bibliotece zwykle jest dużo,
metoda ich układania czyli znajdowania pokrywających się odcinków
powinna być szybka i wydajna
1. Tworzenie kontigu klonów przez spacery po chromosomie
(chromosome walking)
Wady metody spacerów po chromosomie:
•Pracochłonność i czasochłonność,
•Źle spisuje się jeśli DNA jest bogate w sekwencje powtarzające się – prowadzi wtedy do
uzyskania błędnych wyników
2. Tworzenie kontigu klonów przez mapowanie restrykcyjne - metoda
„odcisku palca” enzymów restrykcyjnych (restriction enzymes
fingerprinting)
Mapowanie restrykcyjne – polega na trawieniu poszczególnych klonów
biblioteki DNA enzymem (najczęściej szóstkowym) i porównywanie
wzorów trawienia
Mapa kontigów powstaje z i nakładających się klonów, o podobnych wzorach
restrykcyjnych
Metoda „odcisku
palca” enzymów
restrykcyjnych
(restriction
enzymes
fingerprinting)
Nakładające się
klony identyfikuje
się na podstawie
identyczności co
najmniej 5
kolejnych miejsc
trawienia –
„podobnych
odcisków palców”
poszczególnych
klonów
Skalę mapowania restrykcyjnego ograniczają rozmiary
fragmentów klonów biblioteki
•Mapy restrykcyjne tworzy się łatwo kiedy jest mało miejsc
restrykcyjnych, czyli dla stosunkowo krótkich fragmentów DNA (nie
więcej niż 50 – 100 kpz)
•Kiedy rośnie liczba miejsc rośnie liczba fragmentów do analizy, granicę
stanowi moment kiedy jest tak dużo pojedynczych fragmentów że
zaczynają się one ze sobą zlewać
3. Tworzenie kontigu klonów przez mapowanie
tzw. etykietek sekwencyjnych (znaczników
sekwencyjnych) typu STS i EST
Wykorzystanie etykietek STS i EST jest jedną z
najlepszych technik tworzenia kontigów klonów
bibliotek genomowych
Etykietki typu STS (STS – sequence
tagged sites) - miejsca znaczone
sekwencyjnie (czyli miejsca, których
sekwencję DNA znamy i możemy dla
tego miejsca zaprojektować startery
do reakcji PCR)
•STS – to krótka, znana sekwencja
genomu (100-500 pz), łatwa do
rozpoznania (np. możliwa do powielenie w
reakcji PCR)
•pojawiająca się w genomie tylko jeden
raz – unikalna (nie powinna być
zlokalizowana w obrębie sekwencji
powtarzających się lub zawierać sekwencji
powtórzonych !!!)
•STS – mogą pochodzić np. z losowego
sekwencjonowania końcówek wstawek
biblioteki genomowej DNA
Tworzenie kontigu polega na sprawdzaniu poprzez reakcję PCR- (łatwo ją
zautomatyzować), które fragmenty (klony biblioteki) zawierają daną
etykietkę sekwencyjną - STS.
Fragmenty zawierające to samo STS muszą na siebie zachodzić
Mapowanie EST (expressed sequence tag) – etykietki
ekspresyjne (sekwencyjne znaczniki ekspresji)
•specyficzny rodzaj STS-ów stosowany głównie w analizie genomów
eukariotycznych
•są to krótkie sekwencje uzyskiwane przez analizę klonów cDNA –
powstałego w wyniku odwrotnej transkrypcji preparatów mRNA
Zaletą używania EST-ów (poza takimi samymi jakie pełnią STS w
mapowaniu) jest to, że wykazują bezpośredni związek z genami
ulegającymi ekspresji w genomie, ponieważ pochodzą z mRNA
Kiedy już poukładamy bibliotekę w kontigi….
Czy trzeba sekwencjonować wszystkie klony biblioteki
genomowej?
chromosom
kontigi klonów
biblioteki
uzyskane
sekwencje
Zalety i wady strategii hierarchicznej
chromosom
kontigi klonów
biblioteki
uzyskane
sekwencje
Zalety
1. Łatwość wypełniania przerw w ciągłej sekwencji
2. Łatwiejsze składanie uzyskanych sekwencji szczególnie w
przypadku złożonych genomów bogatych w sekwencje
powtórzone
Wady
1. Konieczność konstrukcji i układania klonów biblioteki
2. Czasochłonność
Strategia przypadkowej fragmentacji genomu „shotgun”
1. nie wymaga tworzenia bibliotek i kontigów klonów
Metoda szybsza (szybciej uzyskujemy sekwencję genomu), uznawana
(niesłusznie!!!) za przydatną do sekwencjonowania jedynie małych genomów
Izolacja DNA
Przypadkowa fragmentacja genomu
(trawienie lub
sonikacja)
Elektroforeza w żelu agarozowym i
izolacja fragmentów DNA określonej
wielkości (zwykle małe do 10 kpz,
najczęściej jeszcze mniejsze 1.6-2.0
kpz
Klonowanie w uniwersalne wektory
(pUC) niekoniecznie
(nieobligatoryjne w metodach
sekwencjonowania NGS)
Sekwencjonowanie ogromnej ilości
klonów z użyciem uniwersalnych
starterów wektora (suma
uzyskanych odczytów
sekwencji shot-gun musi co
najmniej 6-8 krotnie pokrywać
wielkość genomu) (w metodach
NGS wiele więcej!!!)
Składanie kontigów sekwencji i
wypełnianie przerw
Zalety:
1. Szybko uzyskujemy prawie
pełną sekwencję genomu
2. Małe przerwy w ciągłej
sekwencji można wypełniać
stosując np. technikę
wędrówki starterów
WADY :
1.
trzeba przeanalizować
ogromną ilość klonów (duży
ciężar badań przeniesiony
na analizy
bioinformatyczne)
2.
problemem jest zamykaniem
dużych przerw w sekwencji
3.
problemem dla shot-gun są
genomy bogate w sekwencje
powtórzone
3. Problemem dla shot-gun są genomy bogate w sekwencje powtórzone
Która strategia jest lepsza?
Ukierunkowana strategia „shotgun”
Strategia ukierunkowanego shotgun:
•Większość sekwencji uzyskuje się na drodze sekwencjonowania klonów
„biblioteki” o średniej wielkości wstawek ok. 2 kpz (80-90% sekwencji
genomu)
•Pozostałe sekwencje pochodzą z odczytania sekwencji klonów drugiej
„biblioteki” o średniej wielkości wstawek rzędu 10 kpz lub więcej (10-20%
sekwencji genomu)
Zalety:
•Zastosowanie dwóch „bibliotek” daje lepsze pokrycie genomu
•Biblioteka klonów z dużymi wstawkami zapobiega błędom wynikającym z
powtórzeń w genomie
•Ułatwia składanie sekwencji zwłaszcza obejmujących powtórzone DNA
Download
Random flashcards
ALICJA

4 Cards oauth2_google_3d22cb2e-d639-45de-a1f9-1584cfd7eea2

Motywacja w zzl

3 Cards ypy

Create flashcards