Regulacja transkrypcji genów eukariotycznych
advertisement
Regulacja transkrypcji genów eukariotycznych Klasyczne wyobrażenie genu – fragment DNA, który koduje mRNA Definicja genu GEN- podstawowa jednostka dziedziczenia Region DNA, który określa charakterystyczną dziedziczoną cechę organizmu; zwykle koduje pojedyncze białko lub RNA. Zawiera całą funkcjonalną podjednostkę wraz z sekwencją kodującą, niekodującymi sekwencjami regulatorowymi DNA oraz z intronami. Molecular Biology of the Cell Forth Edition Współczesne definicje odnoszą się do produktu, jakim jest funkcjonalny transkrypt i nie biorą pod uwagę białka • Jak zawsze w biologii, istnieją wyjątki. • Trans-splicing: Istnieją geny ‘ w kawałkach’. Transkrypt pochodzący z jednego fragmentu jest łączony z transkryptem z innego fragmentu, aby mógł powstać funkcjonalny RNA. • Geny nakładające się: Niektóre ‘geny’ nakładają się. Oznacza to, że pojedynczy fragment DNA może być częścią dwóch lub nawet trzech genów. • Redagowanie RNA: Niekiedy pierwotny transkrypt ulega intensywnemu redagowaniu zanim stanie się transkryptem funkcjonalnym. W najbardziej skrajnych przypadkach dochodzi do wstawiania lub usuwania nukleotydów. Oznacza to, że zawartość informacyjna ‘genu’ jest niepełna dla zapewnienia jego funkcjonalności i musi być uzupełniona z udziałem innych ‘genów’ Geny eukariotyczne • • • • Proces ekspresji genu składa się z wielu etapów Na każdym z etapów możliwe działanie regulacyjne Procesy transkrypcji i translacji są rozdzielone w przestrzeni i czasie Informacja kierująca syntezą białka może być modyfikowana po transkrypcji (alternatywne składanie, redagowanie) – złożoność proteomu przekracza złożoność genomu Etapy ekspresji/poziomy regulacji • struktura chromatyny • transkrypcja • obróbka i kontrola jakości RNA • transport RNA • degradacja RNA • translacja • modyfikacje post-translacyjne • degradacja białka Transkrypcja • Kluczowym etapem regulacyjnym większości genów jest transkrypcja • Regulacja z reguły na poziomie inicjacji transkrypcji • Czynniki cis – sekwencje regulatorowe w obrębie promotorów i enhancerów (wzmacniaczy) • Czynniki trans – białka wiążące się z sekwencjami regulatorowymi (elementami cis) Czynniki cis Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Czynniki trans Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Rozmieszczenie sekwencji regulatorowych Ekson - odcinek genu, który koduje sekwencje amonokwasów w białku Intron - niekodujący odcinek genu, rozdziela eksony UAS – ang. upstream activating sequence 3 (+1) główne polimerazy RNA Eukaryota polimeraza produkty wrażliwość na α-amanitynę Polimeraza I geny rRNA (18S; 28S; 5,8S) nie wrażliwa Polimeraza II hn/mRNA, większość snRNA (U1, U2, U4, U5), miRNA Polimeraza III małe RNA: tRNA, snoRNA, 5S rRNA, U6 snRNA • Polimeraza mitochondrialna bardzo wrażliwa umiarkowanie wrażliwa Skład podjednostkowy 3 głównych polimeraz RNA Eukaryota Polimeraza RNA E.coli Eukariotyczne polimerazy RNA Podjednostki typu β i β’ Podjednostki typu α Podjednostki wspólne Podjednostki specyficzne dla danej polimerazy CTD- C końcowa domena Pol II, o krytycznym znaczeniu dla transkrypcji Polimeraza II Polimeraza II RNA rozplata nici DNA, syntetyzuje RNA i łączy ponownie obie nici DNA. Samodzielnie nie jest w stanie rozpoznać promotora genu i zainicjować transkrypcji. Do tego celu niezbędna jest obecność OGÓLNYCH CZYNNIKÓW TRANSKRYPCYJNYCH Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. • • • U prokariontów geny są najczęściej ciągłe, tj. kolinearne z ich mRNA. U wyższych eukariontów geny są nieciągłe, tj. niekolinearne z ich mRNA. Części genu ulegające ekspresji noszą nazwę eksonów, zaś sekwencje przedzielające eksony – intronów. Inicjacja transkrypcji • Ogólne czynniki transkrypcyjne (podstawowe) – wspólne dla wielu promotorów, wiązanie w proksymalnej części promotora GTF – ang. general transcription factor TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH Podstawowe elementy cis • Promotor rdzeniowy (podstawowy) – wiąże ogólne czynniki transkrypcyjne Elementy bliskiego promotora – wiążą czynniki wspólne dla wielu różnych promotorów, które zapewniają podstawowy poziom transkrypcji • element CAAT –czynniki NF-1 i NF-Y • element GC – czynnik Sp1 • oktamer – czynnik Oct1 Promotor podstawowy Pierwszy etap inicjacji transkrypcji przyłączenie ogólnego czynnika transkrypcyjnego TFIID TATA binding protein (TBP) w kompleksie z DNA w rejonie ‘TATA-box’ TBP- składnik ogólnego czynnika transkrypcyjnego TFIID Molecular Biology of the Cell Forth Edition Sekwencyjny model składania Kompleksu Preinicjacyjnego (PIC – preinitiation complex) Aktywność transkrypcyjna na poziomie podstawowym, jeszcze nie regulatorowym " " " " }IIA" " " IIF" IIB" " IIE" " " IIE" IIF" IIA " IIB" " " " " IIE" IIF" IIB" IIA" " " " -30 TBP " +1 TFII A, B, D,E, H, F – Ogólne Czynniki Transkrypcyjne (GTF) Inr" TAFs TATA" TFIID polimeraza II Pol IIa helicase IIH Czynniki TAF – składowe TFIID (ang. TBP Associated Factors) " CTD protein kinase PolIIH IIa TATA Inr " Kompleks preinicjacyjny ATP - hydroliza Pol IIa TATA Inr IIH TATA – TATA box – sekwencja TATAAA rozpoznawana przez białko TBP Inr – sekwencja inicjatorowa rozpoznawana przez białka TAF " Kompleks inicjacyjny, DNA na I nukl. stopiony Polimeryzacja pierwszych kilku nukleozydotrifosforanów i fosforylacja CTD prowadzą do uwolnienia promotora. Regulacja inicjacji transkrypcji czynniki transkrypcyjne i koaktywatory • Podstawowe – wspólne dla wielu promotorów, wiązanie w proksymalnej części promotora • Specyficzne (tkankowo, w odpowiedzi na sygnały regulacyjne, w rozwoju), wiązanie w dystalnej części promotora i w enhancerach Specyficzne elementy cis promotorów i enhancerów • Moduły odpowiedzi na sygnał – np. moduł CRE – odpowiedź na cAMP (czynnik transkrypcyjny CREB) • Moduły specyficzne dla komórek i tkanek – np. moduł mioblastowy rozpoznawany przez czynnik MyoD; moduł limfoblastoidalny – czynnik NF-κB • Moduły rozwojowe – np. moduły Bicoid i Antennapedia D. melanogaster Modularna organizacja elementów cis Yuh et al. (1998) Science 279, 1896-1902. Endo16 regulatory system of the sea urchin. Modularna organizacja elementów cis • W sekwencjach regulatorowych występują różne kombinacje elementów cis wiążących różne czynniki trans, co daje bardzo wiele możliwości regulacji przy udziale stosunkowo niewielkiej liczby regulatorów – kombinatoryka Promotor ludzkiego genu insuliny Alternatywny start transkrypcji • Wiele genów wyższych eukariontów posiada wiele alternatywnych miejsc startu transkrypcji (promotorów), specyficznych tkankowo • Dzięki temu z jednego genu powstają różne transkrypty i białka w różnych komórkach i tkankach mięśnie móżdżek siatkówka kom. Schwanna kora Gen dystrofiny człowieka pozostałe tkanki Sekwencje wzmacniające i wyciszające „Enhancery” i „Silencery” • Enhancery stsymulują transkrypcję, silencery hamują transkrypcję . • Jedne i drugie działają niezależnie od orientacji, tj. odwrócenie ich sekwencji nie wpływa na efekt. • Jedne i drugie działają niezależnie od miejsca położenia w genomie. – Mogą działać na odległość w stosunku do promotora – Enhancery wykrywa się nieomal wszędzie • Jedne i drugie stanowią miejsce wiązania dla specyficznych czynników transkrypcyjnych. Specyficzne czynniki transkrypcyjne Struktura domenowa aktywatorów transkrypcji domena wiążąca DNA domena odpowiedzialna za dimeryzację domena aktywująca Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. domena regulatorowa Domeny obecne w czynnikach transkrypcyjnych • Palce cynkowe • Helisa-skręt-helisa (H-T-H) – np. homeodomena, domena HMG, domena PAU • Suwak leucynowy • Helisa-pętla-helisa (H-L-H) • i wiele innych Domeny wiążące DNA Palec cynkowy Czynnik transkrypcyjny SP1 Homeodomena zawiera domenę HTH (helisa-skręt-helisa) atlasgeneticsoncology.org/Deep/Images/TFfig2.jpg Dimeryzacja czynników transkrypcyjnych • Suwak leucynowy • Np. protoonkogeny rodziny c-Fos i c-Jun • Rodzina CREB – (cAMP response element binding protein) Represory Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Regulacja inicjacji transkrypcji Czynniki transkrypcyjne i koaktywatory • Podstawowe – wspólne dla wielu promotorów, wiązanie w proksymalnej części promotora • Specyficzne (tkankowo, w odpowiedzi na sygnały regulacyjne, w rozwoju), wiązanie w dystalnej części promotora i w enhancerach • Koaktywatory –uczestniczą w aktywacji transkrypcji, ale nie wiążą się z DNA. Działają przez oddziaływania z białkami kompleksu transkrypcyjnego – Kompleks mediatora jest ogólnym koaktywatorem polimerazy II Mediator – kompleks białkowy Kornberg R D PNAS 2007;104:12955-12961 ©2007 by National Academy of Sciences Polimeraza II RNA wraz z Mediatorem • niezbędny do regulowanej transkrypcji • absolutnie wymagany do transkrypcji większości genów eukariotycznych • oddziałuje bezpośrednio z aktywatorami transkrypcji i polimerazą II RNA • ważny zarówno dla pozytywnej jak i negatywnej regulacji transkrypcji Kornberg R D PNAS 2007;104:12955-12961 ©2007 by National Academy of Sciences Elongacja transkrypcji genów eukariotycznych jest ściśle związana z obróbką RNA Molecular Biology of the Cell Forth Edition Domena CTD polimerazy II RNA koordynuje wydarzenia transkrypcyjne Domena CTD zawiera powtarzającą się sekwencję aminokwasową (YSPTSPS) Hiperfosforylacja domeny CTD determinuje nowy zestaw regulatorów przyłączających się do pol II i zaznacza przejście od inicjacji do elongacji transkrypcji. Zatrzymanie w pobliżu promotora i uwolnienie promotora; przejście do fazy produktywnej transkrypcji – jest zależne od fosforylacji CTD Saunders et al. Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, 557–567 (August 2006) | doi:10.1038/nrm1981 Terminacja i poliadenylacja CPSF- kompleks białkowy, czynnik specyficzności cięcia i poliadenylacji Terminacja i poliadenylacja Poliadenylacja • Kontroluje (zwiększa) stabilność mRNA • Dotyczy większości mRNA, wyjątkiem są mRNA kodujące histony • Pełni funkcję w procesie translacji Chromatyna - ważny element regulacji transkrypcji genów eukariotycznych http://www.accessexcellence.org/AB/GG/nucleosome.html Transkrypcja genów eukariotycznych zachodzi w chromatynie Kornberg R D PNAS 2007;104:12955-12961 ©2007 by National Academy of Sciences KOLEJNE STOPNIE KONDENSACJI CHROMATYNY http://www.us.elsevierhealth.com/SIMON/Pollard/favoritefigs/W_Earnshaw_favorite_figures.html Dwa podstawowe stany chromatyny Heterochromatyna konstytutywna – jest obecna stale w komórce, DNA wchodzący w jej skład nie zawiera genów, dzięki czemu zachowuje zwartą strukturę (obszary centromerów i telomerów) fakultatywna – ta forma chromatyny pojawia się w jądrze okresowo i tylko w niektórych komórkach, prawdopodobnie zawiera geny nieaktywne w czasie niektórych faz cyklu komórkowego, Euchromatyna – to luźno upakowana forma chromatyny, zawierająca geny aktywne transkrypcyjnie Domeny funkcjonalne i izolatory • Izolatory oddzielają domeny funkcjonalne w chromatynie • Białka wiążące się z izolatorami uniemożliwiają interferencję regulatorów z sąsiedniej domeny (innych genów) Izolator Izolator Obszary kontrolujące loci • LCR (locus control regions) – utrzymują domeny funkcjonalne otwarte, czyli aktywne transkrypcyjnie Chromatyna – preparaty mikroskopowe • http://cellbio.utmb.edu/cellbio/nucleus2.htm Struktura chromatyny DNA + związane białka 1. Histony (małe, zasadowe białka) 2. Niehistonowe białka regulatorowe We wszystkich stanach chromatyny białka są związane z DNA, a różnice strukturalne wynikają z różnego stopnia upakowania chromatyny PODSTAWOWE BIAŁKA BUDUJĄCE CHROMATYNĘ TO HISTONY – najbardziej konserwowane ewolucyjnie białka u Eucariota Histony H3 i H4 : bogate w argininy, najbardziej konserwowane ewolucyjnie sekwencje białkowe Histony H2A i H2B : wzbogacone w lizyny, sekwencje konserwowane ewolucyjnie Histon H1 : bardzo bogaty w lizyny, sekwencja białkowa słabiej konserwowana ewolucyjnie, związany z nukleosomem poza jego rdzeniem Struktura Krystaliczna Nukleosomu Luger K, Mader AW, Richmond RK, Sargent DF, Richmond TJ. Nature 1997 Sep18;389(6648):251-60 Nukleosom zbudowany jest z rdzenia białkowego, z około 147 bp DNA owiniętego wokół rdzenia oraz z 50 bp DNA łącznikowego Rdzeń składa się z dwóch kopii każdego z histonów H2A, H2B, H3 i H4 Poza rdzeniem nukleosomu dołączony jest histon H1 DNA histon H1 histon H2A histon H2B histon H3 histon H4 http://fermat-2.cer.jhu.edu/~as410610/lecture_pdf/What_is_the_organization_of_a_eukaryote_.PDF Regulacja dostępności chromatyny Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. Modyfikacje struktury chromatyny wpływające na regulację procesu transkrypcji 1. Metylacja DNA Metylacja DNA: przyłączenie grupy metylowej do cytozyny NH H O 3 5 2 6 Cytozyna 1 SAM-CH DNMT SAM NH CH O 3 5 2 6 1 5-Metylocytozyna Metylacja DNA (u ssaków metylacji podlegają głównie sekwencje CpG, do 10% cytozyn jest metylowanych u ssaków ) • powoduje zamknięcie danego obszaru chromatyny • może być podtrzymywana podczas podziałów komórkowych • może powstawać de novo metylacja DNA a struktura chromatyny podtrzymywanie wzoru metylacji DNA Metylacja DNA odgrywa ważną rolę w regulacji ekspresji genów oraz w dziedziczeniu epigenetycznym Epigenetyczna regulacja genów to zjawisko polegające na dziedziczeniu poziomu ekspresji genów, niezależnie od zmian w sekwencji DNA Metylacja DNA odgrywa podstawową rolę w inaktywacji chromosomu X. Dzięki inaktywacji jednego z chromosomów X, u samic tak jak i u samców aktywna jest tylko jedna kopia genów sprzężonych z płcią. Metylacja DNA utrzymuje się podczas mitozy, u zwierząt w procesie mejozy jest usuwana Metylacja DNA jest znacznikiem epigenetycznym decydującym o prawidłowym zachodzeniu piętna genomowego (ang. genetic imprinting), znacznik ten jest niezbędny do utrzymania mono-allelicznej ekspresji piętnowanego genu (np. gen Igf2 – koduje czynnik wzrostowy, wyłącznie allel od ojca jest aktywny). Proces ten jest niezbędny do właściwego rozwoju. Przykład epimutacji (zmiana we wzorze metylacji DNA) Lcyc kontroluje symetrię góra-dół kwiatu: u mutanta nieaktywny z powodu silnej, dziedziczonej metylacji Cubas et al 1999, Nature 401: 157-161 http://www.epigenome.org/ Modyfikacje struktury chromatyny wpływające na regulację procesu transkrypcji 2. Kowalencyjne modyfikacje histonów rdzeniowych Nukleosom Nature Reviews Molecular Cell Biology 4, 809-814 (October 2003) Timeline: Chromatin history: our view from the bridge Donald E. Olins1 & Ada L. Olins Zasadowe N- i C-końce histonowe wystają na zewnątrz nukleosomu, ponad DNA owinięty na oktamerze białkowym. Są miejscem wielu potranslacyjnych modyfikacji Enzymy modyfikujące histony rdzeniowe mogą być aktywatorami bądź represorami transkrypcji kinazy P S/T fosfatazy Acetylotransferazy histonowe (HAT) S/T fosforylacja Ac acetylacja K Deacetylazy histonowe (HDAC) metylazy K/R K Me K/R demetylazy metylacja Po-translacyjne modyfikacje histonów wg. B.Turner, Cell 2002 Ponad 100 miejsc modyfikowanych Możliwość mono-, di-, trimetylacji podnosi poziom skomplikowania systemu Nierównomierne rozmieszczenie na obszarze chromatyny Zależne od stanu komórki TEORIA KODU HISTONOWEGO Mechanizm działania modyfikacji potranslacyjnych białek histonowych Acetylacja histonów rdzeniowych rozluźnia strukturę chromatyny dea lac cety ja Zmiana dostępności chromatyny dla czynników transkrypcyjnych i polimeraz Modyfikowane histony rekrutują specyficzne białka rozpoznające określone modyfikacje Tony Kozaurides, Cell 128 (2007) 693-705 Typowy wzór modyfikacji histonowych na aktywnym transkrypcyjnie genie Saunders et al. Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, 557–567 (August 2006) | doi:10.1038/nrm1981 Modyfikacje struktury chromatyny wpływające na regulację procesu transkrypcji 3. Remodeling (przebudowa) struktury chromatyny Regulacja struktury nukleosomowej chromatyny przesuwanie nukleosomów - zwalnianie dostępu do miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych Kompleksy remodelujące chromatynę - są zbudowane zazwyczaj z kilkunastu podjednostek - aktywność zależna od ATP - w wyniku ich działania zmienia się sposób oddziaływania pomiędzy histonami, a DNA Kompleksy remodelujące zaangażowane są zarówno w aktywację jak i represję transkrypcji (koaktywatory i korepresory transkrypcji) Przebudowa (remodeling) chromatyny przesunięcie oktameru histonowego zmiana konformacji ATP-zależna przebudowa chromatyny (remodeling) nukleosom histony rdzeniowe usunięcie oktameru histonowego wymiana histonów w oktamerze Mohrmann & Verrijzer, Biochimica et Biophysica Acta 1681 (2005) 59-73 SWI/SNF – kompleks remodelujący chromatynę Konserwowane funkcje biologiczne kompleksów SWI/SNF: SWP73A SWP73B BRM AtBRM BSH SWI3 SWI3 ü Regulacja inicjacji oraz elongacji transkrypcji ü Udział w rekombinacji homologicznej, naprawie DNA ü Regulacja cyklu komórkowego ü Regulacja procesów rozwojowych – także u roślin ü Udział w szlakach sygnalizacyjnych uruchamianych przez hormony – także u roślin Podstawowe modyfikacje zmieniające strukturę chromatyny • Metylacja DNA (zamykanie obszarów chromatyny) • Kowalencyjne modyfikacje histonów, np. acetylacja lub metylacja (kod histonowy) • ATP-zależna przebudowa (remodeling) chromatyny- zmiana konformacji nukleosomów lub ich pozycji względem DNA Współzależność różnych typów modyfikacji chromatyny Metylacja DNA i potranslacyjne modyfikacje histonów rdzeniowych współzależą od siebie i mogą się wzajemnie indukować. Kompleksy remodelujące chromatynę zazwyczaj zawierają białka rozpoznające modyfikacje histonów oraz metylację DNA. Nieprawidłowe funkcjonowanie systemu modyfikacji chromatyny jest charakterystyczne dla większości nowotworów Zmiany wzoru metylacji DNA w procesie nowotworzenia Charakterystyczną cechą komórek nowotworowych jest obniżony poziom metylacji DNA w skali całego genomu (hipometylacja) i jednoczesna hipermetylacja niektórych obszarów DNA Wzór modyfikacji histonów rdzeniowych w komórkach niezmienionych i nowotworowych Komórka zdrowa Obszary bogate w geny Geny supresorowe Centromer Acetylacja Metylacja Komórka nowotworowa Esteller, M., Nature 8:286-292, 2007 Obszary subtelomerowe Powtórzenia satelitarne Heterochromatyna Zmiany w kompleksie SWI/SNF zidentyfikowane w różnych typach nowotworów człowieka Nowotwory Głowy i szyi Nowotwory piersi Nowotwory ośrodkowego układu nerwowego Białaczki Nowotwory płuc Neuroblastoma Nowotwory skóry Nowotwory nerek Nowotwory przewodu pokarmowego Nowotwory jelita grubego Nowotwory Jajników cervical Cancer Res 2009; 69: (21). November 1, 2009 Nowotwory prostaty
