Pragnę z³o¿yć wyrazy głębokiej i szczerej wdzięcznoœci mojemu
advertisement
Medyczne zastosowania promieniowania laserowego w niskoenergetycznej terapii laserowej. Agnieszka Płachta Instytut Fizyki UJ 1 Pragnę złożyć wyrazy głębokiej i szczerej wdzięczności mojemu promotorowi, Panu Prof. Dr hab. Wojciechowi Gawlikowi za ciekawy temat pracy magisterskiej, zaangażowanie i czas, który mi poświęcił oraz za niezwykle cenne i pouczające rady i wskazówki udzielane w czasie powstawania niniejszej pracy. Agnieszka Płachta 2 Spis treści: 1. Streszczenie.................................................................................................................5 2. Wstęp ..........................................................................................................................6 3. Krytyczny przegląd literatury..................................................................................7 3.1. Mechanizm oddziaływania promieniowania laserowego z obiektami biologicznymi..............................................................................................................7 3.1.1. Parametry energetyczne promieniowania laserowego.......................................8 a) Długość fali promieniowania. b) Dawka. c) Powierzchniowa gęstość energii. d) Moc średnia (praca impulsowa). e) Całkowity czas naświetlania. f) Natężenie promieniowania. 3.1.2. Znaczenie parametrów energetycznych promieniowania laserowego w biostymulacji................................................................................................12 3.2. Efekty biologiczne wywołane promieniowaniem laserowym..................................14 3.2.1. Badania laboratoryjne na poziomie komórkowym..........................................15 3.2.2. Badania kliniczne.............................................................................................26 3.2.3. Hipotezy wyjaśniające mechanizmy biostymulacyjnego oddziaływania promieniowania laserowego na układy biologiczne:.............32 a) Mechanizm pierwszorzędowy.....................................................................33 b) Mechanizm drugorzędowy..........................................................................36 4. Własności promieniowania laserowego stosowanego w badaniach....................39 5. Badania własne........................................................................................................44 5.1. Badanie wpływu niskoenergetycznego promieniowania laserowego na parametry krwi ludzkiej...........................................................................................44 5.1.1. Materiały i metody..........................................................................................44 5.1.2. Dlaczego promieniowanie laserowe o długości fali 780 nm? – pomiar widma absorpcji krwi.....................................................................................46 5.1.3. Badanie zmiany lepkości krwi pod wpływem promieniowania laserowego.....................................................................................................47 5.1.4. Wpływ promieniowania laserowego na elementy morfotyczne krwi............53 5.1.5. Badanie struktury erytrocytów poddanych działaniu LLLR, przy użyciu mikroskopu sił atomowych..................................................................70 5.1.6.Wnioski............................................................................................................75 5.2. Badanie wpływu niskoenergetycznego promieniowania laserowego (780 nm, 70 mW) na plemniki buhaja ...................................................................................................76 5.2.1. Materiał i metody............................................................................................77 5.2.2. Wyniki przeprowadzonych badań...................................................................83 5.2.3. Wnioski...........................................................................................................85 6. Wnioski końcowe........................................................................................................86 7. Spis rysunków.............................................................................................................87 8. Spis tabel....................................................................................................................107 9. Literatura...................................................................................................................109 3 1. Streszczenie. Niniejsza praca stanowi pierwszy etap systematycznych badań wpływu niskoenergetycznego promieniowania laserowego na wybrane układy biologiczne. Dokonano krytycznego przeglądu dostępnej literatury dotyczącej biostymulacyjnego działania promieniowania laserowego. Zebrano i usystematyzowano dotychczasowe najważniejsze hipotezy, które próbują wyjaśnić procesy odpowiedzialne za wywołanie efektów stymulacyjnych w kulturach komórkowych, tkankach i w całym organizmie. Przeprowadzono także badania, wpływu promieniowania laserowego (780 nm, 70 mW), na następujące układy biologiczne. - krew i jej składniki (badano wpływ promieniowania laserowego na zmianę lepkości krwi, poziomu jej elementów morfotycznych, kształt erytrocytów i charakter ich błony), - plemniki buhaja (badano wpływ promieniowania laserowego plemnikowych). 4 na ruchliwość i żywotność komórek 2. Wstęp. „ Aby zrozumieć i pogłębić wiedzę o terapii laserowej niskiej mocy, konieczne jest zrozumienie zależności między światłem a życiem” Teuro Higa [1] Bez światła nie ma życia wyżej zorganizowanych form biologicznych. We wszystkich organizmach szereg procesów fizyko – chemicznych zachodzi pod wpływem lub przy udziale światła. Promieniowanie laserowe to światło, charakteryzujące się wysokim stopniem monochromatyczności, spójności, ukierunkowania oraz dużym natężeniem. Lasery są stosowane w medycynie niemal od pierwszych lat od ich powstania. Biostymulacja laserowa, zwana też niskoenergetyczną terapią laserową – LLLT (z ang. Low Level Laser Therapy) jest najmłodszą dziedziną zastosowań laserów, która bardzo szybko rozwinęła się, głównie za sprawą rozwoju techniki laserów półprzewodnikowych. Biostymulacją laserową, nazywamy reakcję komórek, tkanek i całego organizmu na naświetlanie niskoenergetycznym promieniowaniem laserowym. Ze względu na brak modelu charakteryzującego mechanizmy odpowiedzialne za wywołanie efektu biostymulacyjnego i jednocześnie pozytywne wyniki terapeutyczne, metoda ta budzi zarówno wiele nadziei, jak i kontrowersji. Niniejsza praca miała dwa główne cele. Pierwszy to dokonanie krytycznej analizy doniesień literaturowych dotyczących działania niskoenergetycznego promieniowania laserowego na kultury komórkowe, tkanki i cały organizm. Drugim celem było podjęcie systematycznych badań doświadczalnych mających na celu zaobserwowanie ewentualnego wpływu promieniowania laserowego na układy biologiczne, lub też udowodnienie braku takiego wpływu. 5 3.1. Stan wiedzy na temat mechanizmu oddziaływania promieniowania laserowego z obiektami biologicznymi. Proces oddziaływania promieniowania laserowego na tkanki biologiczne jest bardzo skomplikowany ze względu na ich wielowarstwową i niejednorodną strukturę. W zależności od własności tkanek rozchodzące się w nich światło ulega wielokrotnemu odbiciu, rozpraszaniu i częściowej absorpcji. Struktura próbki, zawartość wody, hemoglobiny, melaniny i innych składników mają kluczowe znaczenie dla procesów zachodzących w materiale biologicznym pod wpływem promieniowania laserowego. Oddziaływanie zależy też od: długości fali promieniowania, gęstości mocy i aplikowanej dawki [1-11]. Z punktu widzenia biostymulacyjnego działania promieniowania laserowego ważne jest, aby wnikało ono możliwie najgłębiej w tkanki i docierało do obszarów terapeutycznych. Jeżeli warunek ten ma być spełniony, to promieniowanie musi trafiać w tzw. okno optyczne skutecznej transmisji w wodzie (rys.1), rozciągające się od 400 nm do 1500 nm oraz, co widać na rys.1, omijać obszar dużej absorpcji hemoglobiny i melaniny. Zatem promieniowanie mogące wywołać ewentualne efekty biostymulacyjne przypada na zakres długości fali od 600 nm do 1100 nm [12]. Okno Rys. 1. Absorpcja światła przez różne składniki tkanek (wg. [12]). 6 Wraz ze stosowaną gęstością mocy zmienia się charakter oddziaływania promieniowania laserowego z obiektem biologicznym od wywoływania efektów fotobiochemicznych, przy najniższym gęstościach, poprzez fototermiczne (powyżej 500 mW/cm2), aż do fotojonizacyjnych i fotodysocjacyjnych powodujących rozrywanie wiązań chemicznych. W biostymulacji najczęściej stosuje się promieniowanie o gęstości mocy nie przekraczającej 100 mW/cm2 . Obserwowane efekty uwarunkowane są długością fali promieniowania oraz jego gęstością mocy [3, 9, 13-17]. Kolejnym czynnikiem wpływającym na zachodzące oddziaływanie jest czas naświetlania i związana z nim dawka energii. W chirurgii, gdy wymagamy od promieniowania laserowego precyzyjnego cięcia (skalpel laserowy) stosujemy duże moce i krótkie czasy naświetlania. W przypadku stosowania terapii LLLT i dla wywołania efektów biostymulacyjnych, postępujemy odwrotnie stosując małe moce i znacznie dłuższe czasy naświetlania [3, 9, 17, 18]. O tym, jak duży wpływ na zróżnicowanie uzyskanych efektów w naświetlanych hodowlach komórkowych (fibroblastów, erytrocytów, limfocytów) czy tkankach mają parametry stosowanego promieniowania laserowego, przekonało się wielu badaczy [18, 19, 20, 21, 25-28]. Stąd tak ważny zarówno w badaniach laboratoryjnych, jak i klinicznych jest dobór wszystkich parametrów promieniowania. 3.1.1. Parametry energetyczne promieniowania laserowego: a) Długość fali: Zależność uzyskanych efektów biologicznych od długości fali promieniowania została przedstawiona w wielu publikacjach. Oto najbardziej popularne długości fali promieniowania stosowane obecnie w LLLT: 633 nm (He-Ne), 635 nm, 650 nm, 660 m., 670 nm (InGaAIP), 780 nm, 820 nm, 830 nm (GaAIAs), 904 nm (GaAs), 10600 nm (CO2).Większość z tych laserów pracuje w reżimie ciągłym, ale możliwa też jest praca w reżimie impulsowym. Od długości fali zależy oddziaływanie z konkretnym chromoforem – czyli rezonansowe oddziaływanie z materią, a więc możliwość wywołania skutku biostymulacyjnego, oraz głębokość penetracji promieniowania laserowego w głąb tkanki, co ma niebagatelne znaczenie w przypadku zastosowań klinicznych (rys.2) [29]. 7 Rys. 2. Transmisja światła przez skórę, dla różnych długości fali [29]. b) Dawka: Energia promieniowania E zdeponowana w naświetlanym obszarze A. D= E [J/cm2] A (1) c) Często w literaturze zamiast pojęcia dawki używa się określenia powierzchniowej gęstości energii: Jeżeli moc promieniowania nie ulega zmianie podczas naświetlania, energię możemy przyrównać do iloczynu mocy P i czasu naświetlania t: P ⋅t [J/cm2] A D= (2) d) Moc średnia (praca impulsowa): Dla laserów pracujących w reżimie impulsowym określamy moc średnią promieniowania: Pśr = P i t i f i (3) gdzie: Pi – moc w impulsie, t i – czas trwania impulsu, (dla impulsów nieprostokątnych t i jest tzw. efektywną szerokością impulsu, tzn. szerokością takiego impulsu prostokątnego, który miałby tę samą energię co impuls rzeczywisty) f i – liczba impulsów na sekundę D= Pśr ⋅ t i [J/cm2] A 8 (4) Np. czas trwania impulsu: t = 150 ns, Pmax = 10 W, da nam wartość energii na impuls: E = 1,5 µJ. Jeżeli laser emituje 100 takich impulsów na sekundę (częstotliwość repetycji = 100 Hz), to średnia moc wyniesie Pout = 0,15 mW. Natomiast wzrost częstotliwości do 1000 Hz, da nam moc Pout = 1,5 mW. Zatem średnia moc zależy od częstotliwości pracy lasera. A moc w impulsie jest stała. e) Całkowity czas naświetlania: ∆t f) Natężenie promieniowania: Istim Wpływ natężenia promieniowania o określonej długości fali, na napromieniowywane komórki został przedstawiony m. in. w pracach Lubart [30, 31] (obserwacja wzrostu fibroblastów), oraz w eksperymentach przeprowadzanych na zwierzętach przez Trelles'a [32]. Wykazano, że efekty biostymulacyjne można uzyskać dla odpowiedniej gęstości energii i natężenia promieniowania, czyli określono istnienie progu Istim i powiązano te parametry w jedno równanie Low-Intensity-Laser-Activated-Biostimulation (LILAB) [5, 14, 33-35]: I stim E a act = ∆t tot (5) gdzie: ∆ ttot – całkowity czas naświetlania, (E/a)act – progowa gęstość energii powodująca aktywację, Istim – progowe natężenie promieniowania potrzebne do wywołania efektów biostymulacyjnych. Przy doborze odpowiedniej wartości natężenia promieniowania (czyli gęstość mocy) należy uwzględnić też straty związane z odbiciem i rozpraszaniem. Pojawia się też kwestia określenia progu dawki, która już nie wywoła efektów stymulacyjnych. Weryfikując literaturę odnoszącą się szczególnie do klinicznych zastosowań laseroterapii widać, że wartość tego zasadniczego parametru jest bagatelizowana przez autorów i rzadko kiedy podawana. Wiele wczesnych doniesień na temat pozytywnych efektów klinicznych uzyskanych dla bardzo słabego promieniowania laserowego (He-Ne) napawało zarówno optymizmem jak i sceptycyzmem. W swoich badaniach Walker [36] (dawka 0,005 J na punkt, gdzie punkt jest 9 rozumiany jako rozmiar wiązki) i Snyder-Mackler [37] (dawka 0,01 J na punkt) nie potwierdzili efektywności niskoenergetycznego promieniowania laserowego. Sprawą dyskusyjną wydają się zbyt niskie wartości dawek. Należy pamiętać, że w doświadczeniach wykonywanych przez Mester’a, pioniera klinicznych zastosowań niskoenergetycznego promieniowania, używano dawek rzędu 1 J na punkt. Natomiast w leczeniu ran skórnych wartość dawki wynosiła od 1,5 J/ cm2 do 4,8 J/cm2 [38, 39, 40]. Stosował on laser o mocy 25 mW. Zależność uzyskanych efektów od wielkości dawki promieniowania w leczeniu ran skórnych i otwartych przedstawił w 1981 r. Kana [35]. Używał on również lasera He-Ne o mocy 25 mW i energiach promieniowania: 4,10 i 20 J. Należy zwrócić uwagę, że w przypadku terapii bólu stosuje się dużo większe dawki, niż np. w leczeniu trudno- gojących ran. W literaturze fakt ten interpretowany jest na zasadzie: silny bodziec ujemny (tutaj ból) może być zwalczony tylko przez silny bodziec dodatni (niskoenergetyczne promieniowanie laserowe o odpowiedniej dawce) [3, 9, 35, 38]. Wiele grup badawczych nie przywiązywało wagi do zależności uzyskanych efektów od wartości mocy promieniowania, uzyskując niejednokrotnie brak wyników dla zbyt małych wartości stosowanej mocy [23, 24, 41, 42, 43]. Poniżej w formie tabeli (tabela 1) przedstawione zostaną parametry, które powinny być określone dla poprawnej charakterystyki doświadczeń do obserwacji efektów LLLT. Jako przykład nonszalancji autorów niech posłuży praca J.R. Basford’a : „ Low-energy HeNe laser treatment of thumb osteoarthritis” [44]: Typ lasera HeNe – 633 nm Moc wyjściowa 0,9 mW Reżim pracy lasera ciągły Częstotliwość impulsów - Dawka Nie sprecyzowano! Nie sprecyzowano! Odległość od źródła do obiektu naświetlania i rozbieżność wiązki Nie sprecyzowano! Liczba pacjentów Nie sprecyzowano Gęstość energii Czas naświetlania Dynatronics (?) 4 punkty naokoło 3 stawów (razem 12 punktów) 180 s na punkt Liczba zabiegów 9 Model lasera Naświetlana powierzchnia Przerwy w naświetlaniu Nie sprecyzowano Tabela 1. Wykaz parametrów, które powinny być określone badaniach biostymulacyjnych. 10 Zakładając 50- procentowe straty związane z absorpcją, otrzymamy dawkę na punkt: 15 s × 0,9 mW × 0,5 = 0,0007 J. Zazwyczaj wartości dawek stosowanych w naświetlaniu punktowym wynoszą od 0,5 – 2 J na punkt (dla takich wartości obserwowano pozytywne efekty kliniczne). Jeśli więc przyjąć istnienie progowej mocy, to nie jest zatem zaskoczeniem, że przy takim doborze parametrów nie zaobserwowano żadnych efektów. Potwierdza, to znaczenie doboru odpowiednich parametrów promieniowania laserowego, aby mogło ono wywołać efekty biostymulacyjne [45, 46, 47, 48]. Większość autorów skupia swoją uwagę głównie na odpowiednim doborze długości fali, mocy promieniowania, określeniu dawki, zapominając, że równie ważne dla określenia efektywności LLLT są własności naświetlanego obszaru, technika terapeutyczna, odpowiedni dobór grupy kontrolnej, itp. Persson [49] nie zaobserwował wzrostu angiogenezy (czyli tworzenia się nowych naczyń krwionośnych) w wyniku naświetlania, jednak został on potwierdzony przez Kusakari [50], który zarejestrował wzrost mikrokrążenia. Nie dostrzegł tego zjawiska Persson. Obaj wykorzystywali w eksperymentach zdrowych ludzi, czy zdrowe zwierzęta, których system immunologiczny był w znakomitej formie. Kondycja systemu immunologicznego jest jednym z czynników odpowiedzialnych za efektywność LLLT. Oczywiste jest, że dla zdrowego organizmu nie zaobserwujemy efektów klinicznych wywołanych naświetlaniem promieniowaniem laserowym. Stąd mogą wypływać różnice między badaniami klinicznymi, a laboratoryjnymi. Należy też podkreślić, że uzyskana odpowiedź biologiczna może bardziej zależeć od warunków metabolicznych komórek, niż parametrów energetycznych lasera [42, 51]. 11 3.1.2. Znaczenie parametrów energetycznych promieniowania laserowego ważne w biostymulacji. W literaturze ogólnie przyjmuje się, że efekt biostymulacji laserowej, tak jak wiele innych efektów biologicznych opisany jest empirycznym prawem Arndta – Schultza: słabe bodźce pobudzają aktywność fizjologiczną, umiarkowane bodźce sprzyjają aktywności fizjologicznej, silne – opóźniają aktywność fizjologiczną, a bardzo silne ją hamują [9]. W oparciu o to prawo i wyniki wieloletnich badań własnych i innych [5, 9, 14, 16, 45, 46, 47, 48] T. Oshiro zmodyfikował je na potrzeby LLLT, wykreślając tzw. krzywą Arndta – Schultza – Oshiro obrazującą różnicę wartości reakcji komórek na bodziec w zależności od gęstości energii (rys.3). Znowu pojawia się problem określenia progu, który definiowałby zakres wartości gęstości energii promieniowania laserowego, dającego efekt biostymulacyjny. Dla wartości energii mniejszych niż te, które przewiduje krzywa Arndta-Schultza, nie obserwowano efektów klinicznych. Rys.3. Prawo Arndta-Schultza-Oshiro w odniesieniu do laseroterapii.[wg. 9] Przed przeszło wiekiem (1888 r.) Schultz [52] wykazał, że wiele pierwiastków chemicznych (w małych stężeniach) ma stymulujący wpływ na proces wzrostu i oddychania 12 drożdży. Fenomen ten znany w literaturze jako prawo Arndta-Schultza przenieśli na grunt biostymulacji Mester i Oshiro. Po pierwsze - autorzy nie podają skąd wziął się przedstawiany na wykresie (rys.3) zakres dawek, które mają wywołać efekt biostymulacyjny. Już sam ten fakt napawa niepokojem. Po drugie - dotyczy ono tylko dawek energetycznych, a nie ma związku z gęstością mocy. Wielkości dawek, które Oshiro przypisał krzywej (z rys. 3) należy traktować z dużą rezerwą. Owszem, w większości badań potwierdzających pozytywne efekty LLLT, stosowano dawki od 1 J/cm2 do 6 J/cm2 , które to wartości według krzywej Arndta-Schultza pobudzają aktywność biologiczną [13-17, 25, 29, 45-50, 53, 54, 55, 56, 57]. Jednakże wiadomo, że oprócz wartości dawki ważne jest też natężenie i moc promieniowania. Np. krutkie impulsy (< 1ms) laserowe o gęstościach energii rzędu J/cm2 prędzej spowodują destrukcję tkanek niż ich stymulacje. Dlatego krzywą Arndta-Schultza-Oshiro należy traktować raczej orientacyjnie, a nie jako przedstawienie popartego teorią prawa. 3.2. Efekty biologiczne wywołane promieniowaniem laserowym. Przypatrując się rezultatom badań prowadzonych w zakresie biostymulacji, można dojść do wniosku, że praktyka w tej dziedzinie wyprzedziła teorię. Szczególnie duża liczba pozytywnych efektów klinicznych sprawia, że badania wpływu promieniowania laserowego małej energii na obiekty biologiczne cieszą się rosnącym zainteresowaniem. Aby jednak można było porównywać różne wyniki i doświadczenia, konieczne jest jednakowe – standardowe charakteryzowanie ich warunków. Większość badaczy jest zgodna, że charakter oddziaływania zmienia się przy przechodzeniu od niskich dawek do coraz wyższych, od stymulacyjnego do hamującego (o czym była już mowa powyżej) [40]. Promieniowanie laserowe oddziałując z tkanką biologiczną może wywoływać w niej różnorodne zmiany: kształtu, właściwości powierzchni, aktywności enzymatycznej, regulacji wzrostu i procesów metabolicznych komórek, uwalniania hormonów i wiele innych [58-64]. Poniżej zostaną przedstawione charakterystyczne przykłady wyników laboratoryjnych i klinicznych uzyskanych w różnych pracach dla niskoenergetycznego promieniowania 13 laserowego. Należy jednak podkreślić, że wyniki uzyskane w różnych laboratoriach, przez różne grupy badawcze, choć przedstawiają taki sam materiał badawczy, są często trudne do porównania, a nawet bywają sprzeczne [19]. Jednym z powodów takiego stanu rzeczy są różne warunki prowadzenia eksperymentu, różne techniki naświetlania, rodzaje stosowanych laserów i brak ujednolicenia parametrów promieniowania. W przypadku badań laboratoryjnych prowadzonych najczęściej in vitro, uzyskane rezultaty zależą od tego, czy naświetlane komórki znajdują się w monowarstwie czy w zawiesinie, czy w każdej komórce zdeponowano jednakową dawkę energii, czy laser pracował w reżimie ciągłym czy impulsowym, etc.. Wpływ na uzyskane rezultaty ma także wybrana długość fali promieniowania, sposób w jaki uzyskano żądaną dawkę (mała moc i dłuższy czas, czy odwrotnie). Tu dane są (zwłaszcza dla zależności od λ) bardzo skąpe. Pomimo różnic wynikających ze sposobów naświetlania, doboru parametrów promieniowania, niektóre z obserwowanych efektów potwierdzały się wielokrotnie. 3.2.1. Badania laboratoryjne na poziomie komórkowym. Większość badań, w których obserwowano efekty fotobiologiczne wywołane przez niskoenergetyczne promieniowanie laserowe na poziomie komórkowym była prowadzona in vitro. Komórki były odpowiednio preparowane, umieszczane w monowarstwie lub zawiesinie, po czym naświetlano je światłem laserowym i w zależności od oczekiwanych efektów stosowano odpowiednie metody identyfikacji zmian jakie wywołało promieniowanie (np. mikroskop elektronowy, spektrometr optyczny). Najczęściej stosowanym laserem był laser He-Ne (632,8 nm), jednakże były wykorzystywane również lasery półprzewodnikowe (od 670 nm do 904 nm) i laser rubinowy (694 nm) [62-67]. Poniżej zostaną przedstawione obiegowe opinie na temat efektów, jakie może wywoływać w komórkach niskoenergetyczne promieniowanie laserowe. Jest to podsumowanie doniesień na temat wpływu tegoż promieniowania na poszczególne komórki, jej organelle i struktury tkankowe. 14 Krew i jej składniki. Badania nad wpływem promieniowania laserowego na tę tkankę i komórki ją tworzące, są istotne ze względu na jej rolę w organizmie. Krew nie tylko jest transporterem O2 i CO2 w naszym organizmie, ale odpowiada też za jego homeostazę. Z kolei jej komórki (szczególnie leukocyty) bronią nasz organizm przed różnego rodzaju infekcjami, czyli uczestniczą w tzw. odpowiedzi immunologicznej. W wyniku naświetlania promieniowaniem laserowym odnotowano pobudzenie procesów immunologicznych, zwiększenie ukrwienia naświetlanych obszarów, zmniejszenie ciśnienia krwi, wzmożoną angiogenezę naczyń krwionośnych (już 5 dni po naświetlaniu) [66-80]. Badano również poszczególne elementy morfotyczne krwi: • Erytrocyty – krwinki czerwone. W wyniku naświetlania laserem zaobserwowano niewielkie zmiany kształtu erytrocytów oraz podwyższenie stopnia ich agregacji [78]. Może być to związane ze wzrostem lepkości krwi poddanej naświetlaniu (własne badania opisuję w rozdz. 5.2.3). Efekt był odwrotny, gdy naświetlano krew zmienioną patologicznie, mającą własną tendencję do tworzenia agregatów erytrocytów [80-83]. Wówczas jako efekt naświetlania zaobserwowano zwiększenie płynności.. Jednym z głównych efektów, które są badane w przypadku erytrocytów, jest zmiana płynności ich błony. Pierwsze prace w tym zakresie były przeprowadzane dla erytrocytów zwierzęcych, m. in. psa [84]. Efekty te zostały zaobserwowane również w przypadku erytrocytów ludzkich [85]. Wyizolowane błony komórkowe erytrocytów poddano naświetlaniu promieniowaniem o długości fali 810 nm, o różnych wartościach gęstości powierzchniowej mocy i energii. Badając aktywność (Na+,K+,Mg2+) ATPazy określono zmiany funkcjonalne i strukturalne błony. Przy zachowaniu tej samej dawki zmiana aktywności (Na+,K+,Mg2+) ATPazy była zależna od mocy promieniowania laserowego (stosowano różne czasy naświetlania). Przy małej mocy (10 mW) zaobserwowano aktywację enzymu, natomiast przy większej mocy (200 mW, 400mW) jej spadek. Promieniowanie laserowe powodowało zwiększenie płynności dwuwarstwy lipidowej błony komórkowej. Nie zaobserwowano zmian takich parametrów, jak stabilność komórki, poziom produkcji peroksydacji lipidów, zredukowanego glutationu wewnątrzkomórkowego ani oksyhemoglobiny [85]. Obserwowany iv vitro wzrost przepuszczalności błony dla jonów i aktywności pomp jonowych, zdaje się odgrywać kluczową 15 rolę w regulacji procesów komórkowych in vivo (patrz rozdz. 3.2.3), i sugeruje możliwość wyjaśnienia w ten sposób obserwowanych stymulujących efektów promieniowania laserowego [80, 82, 83, 87, 86]. Jednocześnie w literaturze spotykamy też przeciwne doniesienia na temat omawianych powyżej efektów [84]. W pracy [83] nie zaobserwowano wzrostu przepuszczalności błony dla erytrocytów ludzkich, które były naświetlane laserem He-Ne o mocy 0,5 mW. Wydaje się, że w tym eksperymencie stosowana moc promieniowania była za mała, co przy braku podania czasu naświetlania poddaje w wątpliwość, czy zdeponowana dawka była wystarczająca dla wywołania jakichkolwiek efektów, nie mówiąc o biostymulacyjnych (patrz rozdz. 3.1.2). Również w badaniach aktywności błonowego transportu jonów w erytrocytach (w szczególności: Na+-K+-ATPazy i Ca2+- ATPazy), po naświetlaniu laserem He-Ne (690 nm, P = 20 mW) nie stwierdzono zwiększenia wypływu jonów przez błonę [92]. W określaniu ewentualnych zmian aktywności jonowych pomp błonowych, wykorzystano tutaj metodę pH – metryczną, oraz analizę radioizotopową. Niestety autor nie podaje stosowanych czasów naświetlania, co uniemożliwia określenie dawki zdeponowanej w naświetlanych komórkach. Z analiz widm absorpcji enzymów błonowych wynika, że część z nich pochłania promieniowanie podczerwone [11, 93] a nie koniecznie 632 nm. Również stosowana metoda analizy aktywności błon nie jest opisana, stąd trudno ocenić jej poprawność. Kilka prac dotyczyło też analizy hematologicznej krwi, w szczególności erytrocytów poddanych działaniu promieniowania laserowego [93-99] (badania własne opisuję w rozdz.5.2.4.). W wynikach, zawartych pracach [93-99] są rozbieżności dotyczące zmiany poziomu czerwonych krwinek, ich objętości, zmiany poziomu hemoglobiny w erytrocycie. Rozbieżności te mogą być spowodowane różną techniką naświetlania, stosowaną długością fali lub deponowaną dawką. Bezsporne jest to, że zaobserwowano wyraźny efekt, jaki wywołało promieniowanie laserowe w stosunku do grupy kontrolnej. Jednak konieczne są dalsze badania w tym zakresie, które pozwoliłyby ujednolicić wyniki i wyciągnąć głębsze wnioski. Naświetlaniu poddano też pojedynczy, wyizolowany erytrocyt, w którym nie stwierdzono zmian kształtu, czy też uwalniania hemoglobiny [99]. Jak dotąd są to, jedyne badania dotyczące pojedynczych erytrocytów i trudno porównywać je z wynikami, jakie otrzymano naświetlając jednocześnie miliony komórek. Należy bowiem pamiętać o wpływie środowiska, który w 16 biostymulacji wydaje się mieć kluczowe znaczenie, co potwierdzają liczne badania prowadzone na tych samych grupach komórek in vivo i in vitro [11]. Głównym zadaniem czerwonych krwinek w naszym organizmie, jest transport tlenu możliwy dzięki zawartej w nich hemoglobinie. Ta makromolekuła zawiera w swojej strukturze atomy żelaza, które wiążą tlen. W wyniku naświetlania krwi promieniowaniem laserowym, zaobserwowano zmiany transformacyjno - konformacyjne hemoglobiny, co w rezultacie interpretowano jako czynnik zwiekszajacy wydajność procesów metabolicznych [89]. Na podstawie analizy doniesień literaturowych dotyczących badania wpływu niskoenergetycznego promieniowania laserowego na erytrocyty, można wysnuć wnioski, że światło laserowe:: - nie wpływa na zmianę kształtu erytrocytów (badania własne opisuję w rozdz. 5.2.4), - może wpływać na zmianę współczynnika dyfuzji erytrocytów i ich potencjału błonowego, - wpływa na aktywność transportu jonów w błonie, - zwiększa własności adhezyjne erytrocytów i wydajność tlenową, - zmienia parametry hematologiczne naświetlanych erytrocytów (badania własne opisuję w rozdz. 5.2.3). • Limfocyty: Limfocyty krążące we krwi obwodowej są niejednorodną grupą komórek, zarówno pod względem miejsca ich powstawania, jak i pod względem pełnionych funkcji. Krążą one pomiędzy tkankami układu limfoidalnego, dzielą się, dojrzewają i zmieniają swoje właściwości. Największą grupę tworzą limfocyty T - grasiczozależne (ok. 70%), odpowiedzialne za niszczenie komórek zawierających obce antygeny, czyli np. takich, w których rozwijają się wirusy. Natomiast limfocyty B - szpikozależne są odpowiedzialne za humoralny mechanizm odpowiedzi immunologicznej. Ostatnią grupę stanowią limfocyty NK – naturalni niszczyciele (z ang. natural killer cells) [108]. Niskoenergetycznemu promieniowaniu laserowemu przypisuje się wpływ na stymulacje odpowiedzi immunologicznej, stąd większość badań polega na badaniu wpływu tego promieniowania na leukocyty, w tym limfocyty. Jednym z przykładów badań, które miały doprowadzić do poznania wpływu promieniowania laserowego na stymulacje odpowiedzi immunologicznej, było naświetlanie jednojądrzastych komórek obwodowej krwi laserem He-Ne o różnym czasie ekspozycji i 17 wartości dawki (30 min - 18,9 J/cm2; 60 min-37,8 J/cm2) [100, 101, 102]. Stwierdzono wzrost sekrecji interleukin (IL-1α, IL-2), dla krótszego czasu naświetlania i mniejszej dawki. Duże dawki i czasy ekspozycji powodowały spadek poziomu cytokin. Substancje te pobudzają wydzielanie wzrostowych czynników hematopoetrycznych oraz aktywują limfocyty T, B i NK. Określono także poziom interferonu alpha (INF-α) i czynnika martwicy nowotworów alpha (TNF-α), których poziom wzrasta jeżeli formuje się ognisko zapalne. Uzyskany efekt wyraźnie zależał od powierzchniowej gęstości stosowanej energii. Naświetlając limfocyty obwodowej krwi ludzkiej laserem He-Ne (E = 56 J/m2, P = 5.6 W/m2, t = 10s) zaobserwowano w ich chromatynie jądrowej efekt podobny do transformacji jaką wywołuje fitohemaglutynina - (PHA) (rodzaj lektyny) [109-113]. Poniższy schemat (rys. 4) przedstawia porównanie tych dwóch metod: Rys. 4. Porównanie zmian w limfocycie pod wpływem fitohemaglutyniny (PHA) i promieniowania laserowego [110]. 18 Wyraźny wzrost długości chromatyny w substancji jądrowej, przebudowę struktury jąderek (zwiększony transport jonów Ca2+), można interpretować jako efekt aktywacji syntezy RNA przez promieniowanie czerwone. W naświetlanych komórkach nie odnotowano przyrostu DNA, którego wzrost stężenia występuje w wyniku działania ftohemaglutyniną. Zaobserwowano spowodowany naświetlaniem wzrost liczby mitochondriów w limfocytach, bez zwiększenia ich rozmiarów i masy całkowitej, podczas gdy wzrostowi liczby mitochondriów w limfocytach pobudzanych fitohemaglutyniną towarzyszył przyrost masy całkowitej. Na tej podstawie wysunięto przypuszczenie, że niskoenergetyczne promieniowanie laserowe (szczególnie podczerwone) aktywuje limfocyty pozostające w interfazie (G0), a fitohemaglutynina pobudzając limfocyt będący w interfazie, przesuwa go do cyklu mitotycznego (faza S) [18, 109-113] . Jeżeli niskoenergetyczne promieniowanie laserowe, w zależności od gęstości energii, hamuje lub pobudza transformację blastyczną limfocytów, to może być to dowód świadczący o tym, że ingeruje ono w odpowiedź immunologiczną. Również badania prowadzone w zakresie analizy hematologicznej krwi poddanej naświetlaniu promieniowaniem laserowym, zdają się potwierdzać ten efekt [94, 95, 96, 113, 115]. Zaobserwowano znaczny wzrost liczby leukocytów, w szczególności limfocytów, zależny od dawki stosowanego promieniowania i czasu jaki upłynął od naświetlania [patrz też rozdz. 5.2.3]. Efekt wzrostu liczby limfocytów potwierdza wyniki prowadzonych badań w zakresie zmian stopnia proliferacji limfocytów po naświetleniu [116]. W badaniach przeprowadzonych in vitro, potwierdzono wzrost proliferacji limfocytów [116] pod wpływem promieniowania laserowego o gęstości energii 2,4 – 4,8 J/ cm2, jak również odnotowano w tych komórkach wzrost syntezy ATP [118, 119]. Niezależnym efektem, jaki zaobserwowano w wyniku naświetlania limfocytów laserem He-Ne (56 J/m2, 5.6 w/ m2) i badania ich aktywności, jest odkrycie formowania się w nich olbrzymich mitochondriów [120, 221]. Prawdopodobnie powstają one w wyniku fuzji mniejszych mitochondriów, a ich formowanie odzwierciedla wzrost energii wymienianej na tym poziomie. Są to jednak pojedyncze doniesienia, które nie znalazły potwierdzenia w innych badaniach prowadzonych w tym zakresie. 19 Podsumowywując analizę doniesień literaturowych [18, 109-121], dotyczących badania wpływu niskoenergetycznego promieniowania laserowego na limfocyty, można stwierdzić, że promieniowanie laserowe: - wywołuje zmiany aktywności limfocytów (w większości doniesień), - zwiększa ich proliferacje i syntezę DNA (badania własne opisuję w rozdz. 5.2.3), - podnosi wydajność immunologiczną, - zwiększa uwalnianie jonów Ca2+, co wzmaga syntezę ATP i podnosi metabolizm komórek. • Granulocyty: neutrofile, eozynofile. Neutrofile utrzymują równowagę pomiędzy makroorganizmem człowieka i drobnoustrojami. Ich czynność związana jest z właściwościami przemieniania się, fagocytozy, degranulacji, oddychania wybuchowego oraz odbioru i wysyłania humoralnych sygnałów w postaci cytokinin [108, 122]. W literaturze spotkać można wzmianki na temat wpływu promieniowania laserowego właśnie na produkcję cytokin przez neutrofile, co ma pobudzać obronne reakcje organizmu [123127]. W wyniku naświetlania zaobserwowano wzrost poziomu cytokinin takich, jak: interleukina 1, 6 i 8. Zaobserwowano ogólnie wzrost ich aktywności żernej w obszarach ran i ropni poddanych naświetlaniu laserem He-Ne (632.8 nm, P = 10 mW). Odnotowano także wzrost ich proliferacji w badaniach analizy hematologicznej pełnej krwi ludzkiej, poddanej naświetlaniu laserem He-Ne, gdzie zaobserwowano zmianę efektu w zależności od mocy i dawki stosowanego promieniowania (zobacz też rozdz. 5.2.3) [94, 95, 112]. Są to wszystko jednak efekty uboczne, które zaobserwowano badając wpływ promieniowania laserowego na inne grupy komórek. Jak dotąd nie spotkano w literaturze doniesień, na temat badania wpływu naświetlania samych neutrofili. Wydaje się to trudnym zadaniem, ze względu na silną zależność funkcji czynnościowych tych komórek od środowiska, w którym się znajdują. Eozynofile wykazują te same właściwości chemotaksji i fagocytozy, co neutrofile. W warunkach fizjologicznych inaktywują substancje wywołujące odczyn zapalny, natomiast w warunkach rozwiniętego procesu patologicznego nasilają ten odczyn. W wyniku naświetlania krwi promieniowaniem laserowym, zaobserwowano nieznaczne podniesienie poziomu eozynofili, szczególnie gdy naświetlaniu poddano krew zmienioną chorobowo [94, 95]. W dokonanej analizie biochemicznej komórek pochodzących z obszarów trudno gojących się ran, które uprzednio zostały naświetlone, stwierdzono wzrost poziomu 20 leukotrienów: B4, histaminy i interleukiny 5, czynników wzmagających aktywność eozynofili [102, 119, 123]. Tłumaczy to wzrost ich liczby w tych obszarach. Analizując dostępne doniesienia na temat wpływu niskoenergetycznego promieniowania naeozynofile, można wysnuć wnioski, że promieniowanie laserowe: - wzmaga aktywność żerną neutrofili i eozynofili, - podnosi ich proliferacje w obszarach zmienionych chorobowo, - podnosi produkcję interleukin i cytokinin w naświetlanych obszarach. Bardzo mało jest doniesień odnośnie tego, jakie moce i dawki promieniowania laserowego wywołają największy efekt i jaka długość fali jest przez te komórki absorbowana. Wynikać może to z faktu, że efekty zaobserwowane dla tych grup komórek wypłynęły jako uboczne informacje z eksperymentów, które były prowadzone dla innych populacji komórkowych. Ze względu na rolę jaką pełnią te komórki w regulacji procesów obronnych organizmu, interesujące wydaje się dokładniejsze zbadanie obserwowanych efektów. Fibroblasty. Fibroblasty, to komórki tkanki łącznej, odgrywające główną rolę w procesach gojenia się ran i formowania blizny. Ponieważ biostymulacja jest najczęściej stosowana właśnie w przypadku trudno gojących się ran i owrzodzeń, naturalne jest duże zainteresowanie wpływem promieniowania laserowego na te komórki [108]. Badania takie były głównie prowadzone in vitro na szczepach komórkowych oraz in vivo, gdzie badano substancje uwalniane przez fibroblasty w wyniku naświetlania. Stwierdzono zależność stopnia proliferacji fibroblastów i aktywności dehydrogenazy bursztynianowej od powierzchniowej gęstości energii promieniowania laserowego o długości fali 860 nm [128-131]. Przy zastosowaniu dawki 2 J/cm2 proliferacja komórek i aktywność enzymu istotnie wzrosły, a naświetlanie promieniowaniem o gęstości powierzchniowej energii 16 J/cm2 spowodowały osłabienie tych procesów. Zaobserwowano także (od 2- do 5-krotny) wzrost syntezy kolagenu i DNA pod wpływem promieniowania laserowego 780 nm [129]. Również badania prowadzone przy użyciu lasera He- 21 Ne (632.8 nm, Pmax= 15mW) potwierdzają uzyskane efekty. Jednocześnie nie stwierdzono by zmianom tym towarzyszyły zmiany degeneracyjne w organellach komórkowych [13, 130-133]. Należy zauważyć, że autorzy prac [130-133] nie podają wartości dawek, jakie odpowiadały poszczególnym naświetlaniom i trudno porównywać prezentowane przez nich wyniki z innymi doniesieniami literaturowymi [128,129]. Promieniowanie o 632.8 nm i mocy 10mW, zastosowano do badania dynamiki zmian obserwowanych w fibroblastach pod wpływem naświetlania [133]. Zaobserwowano, że w 24 godziny po naświetlaniu komórki fibroblastów zaczęły się przekształcać w miofibroblasty, czyli elementy wyposażone dodatkowo w włókna kurczliwe. Ma to znaczenie w kształtowaniu się morfologii blizny oraz poprawieniu jej wytrzymałości mechanicznej. Większość prac związanych z wpływem promieniowania laserowego na fibroblasty to badania kliniczne dotyczące biostymulacji ran, oparzeń, czy owrzodzeń [3, 18, 19, 134, 135]. Doniesienia o pozytywnym efekcie biostymulacji w tych przypadkach, pomimo kiepskiej metodologii samych badań (patrz rozdz. 3.2.2), zdają się potwierdzać, że w fibroblastach zachodzą zmiany czynnościowe i wzmożona proliferacja pod wpływem naświetlania. Aanalizę doniesień literaturowych na ten temat można podsumować stwierdzając, że promieniowanie laserowe: - wzmaga proliferacje fibroblastów, - zwiększa produkcje kolagenu i syntezę DNA, Konieczne jednak jest usystematyzowanie procesów zachodzących w fibroblastach pod wpływem naświetlania promieniowaniem laserowym, w celu określenia dalszych kierunków badań w tej materii. Komórki nerwowe - neurony. Tkanka nerwowa spełnia w naszym organizmie rolę najważniejszego i najszybszego systemu sterowania i łączności, dzięki szczególnie dobrze wykształconym właściwościom: pobudliwości, czyli zdolności wytwarzania bodźców i reagowania na nie, oraz przewodnictwu, czyli możliwości ich przekazywania nawet na duże odległości [108]. Stąd też, gdyby promieniowanie laserowe wpływało na zmianę tych właściwości, możliwe stałoby się kontrolowanie i stymulowanie procesów zachodzących w naszym organizmie. 22 Większość prac w tym zakresie, dotyczy badania zmiany potencjału czynnościowego neuronów w wyniku naświetlania promieniowaniem laserowym [137-141]. W stanie spoczynku komórki nerwowe wykazują nierównomierne rozmieszczenie ładunków dodatnich i ujemnych pomiędzy cytoplazmą a przestrzenią międzykomórkową. Za wzbudzenie bodźca i jego przewodzenie odpowiedzialne są obecne w błonie komórkowej kanały sodowe otwierane zmianą potencjału. Ich aktywacja może też być wywołana promieniowaniem laserowym, powodującym pobudzenie enzymów błonowych, które zwiększają transport jonów (patrz rozdz. 3.2.3). Otwarcie kanałów sodowych powoduje gwałtowne przesunięcie jonów Na+ zgodnie z gradientem stężeń, co w efekcie prowadzi do depolaryzacji błony i pozwala na przewodzenie wytworzonego potencjału, tzw. potencjału czynnościowego. W ten sposób przekazywany jest impuls między komórkami, tkankami i całymi narządami. Poziom energetyczny metabolizmu w neuronach jest zbliżony do ich aktywności (potencjał aktywujący depolaryzacje błon ⇒ przepływ impulsów nerwowych) [140, 141]. Oczywiście proces ten jest bardziej skomplikowany i uczestniczą w nim różnego rodzaju komórki i neuromediatory. Bardzo czułym wskaźnikiem aktywności neuralnej okazała się być oksydaza cytochromowa [142, 143]. Biorąc pod uwagę wyniki badań i hipotezy przedstawione w rozdz. 3.2.3, przypuszcza się, że efekty terapeutyczne uzyskane przy pomocy promieniowania laserowego są wynikiem stymulacji procesów komórkowych związanych ze wzrostem aktywności oksydazy cytochromowej. W literaturze przedstawionych jest szereg eksperymentów, które badały prawdziwość powyższego twierdzenia [110, 142-144]. Ich metodyka jest podobna, prowadzone są in vitro i in vivo najczęściej na neuronach szczurów, a różnice polegają jedynie na doborze długości fali promieniowania i stosowanej gęstości mocy. W badaniach tych poddano szczepy komórek nerwowych blokadzie przewodnictwa impulsów nerwowych przy użyciu TTX (tetradotoksyna – hamuje pobudzenie błon włókien nerwowych i mięśniowych, co prowadzi do paraliżu oddechowego), która blokuje też konał sodowy (napięcio – zależny). Zgodnie z hipotezą prezentowaną w pracach [110], użycie promieniowania powoduje częściowe lub całkowite odwrócenie redukcji aktywności oksydazy cytochromowej przez TTX. Promieniowanie było aplikowane w komórkach nerwowych przy użyciu diody elektroluminescencyjnej - LED (Light Emitting Diode), o długość fali 670 nm o mocy 50 mW i 23 gęstość energii 4 J/cm2, a czas naświetlania wynosił 80 s. W wyniku naświetlania zaobserwowano wzrost aktywności oksydazy cytochromowej w neuronach poddanych działaniu TTX i osiągnięcie przez nią poziomu aktywności grupy kontrolnej [140]. Inne badania na neuronach dotyczyły wpływu promieniowania laserowego na proces regeneracji uszkodzonych włókien nerwowych [21, 145, 146, 150]. Istotną rolę odgrywają tutaj komórki Schwanna, które powodują mielinizację włókien nerwowych, a także wspomagają je metabolicznie poprzez syntezę substancji odżywczych, oraz regulację stężenia jonów w ich bezpośrednim sąsiedztwie. Komórki Schwanna szczurów naświetlano laserem He-Ne (632.8 nm, P = 6 mW), stosując różne czasy naświetlania od 0.5 do 10 min. codziennie przez 8 dni. Znaczny wzrost proliferacji komórek w stosunku do grupy kontrolnej, zaobserwowano w 5 dniu naświetlania. Wydaje się, że dla uzyskania szybszego efektu konieczne jest zwiększenie mocy promieniowania. Jednocześnie w wyniku naświetlania nie zaobserwowano wzrostu syntezy lamininy, która obok kolagenu jest głównym składnikiem budującym włókno nerwowe. Stąd trudno powiedzieć, jakie czynniki wpłynęły na wzrost proliferacji neuronów. Być może należałoby zastosować inna metodę analizy biochemicznej zachodzących efektów. Wiele doniesień literaturowych opisuje przeciwbólowe działanie promieniowania laserowego, w szczególności w różnego rodzajach neuralgiach i zwyrodnieniach reumatoidalnych [147-150]. Efekty te zostaną szerzej opisane w rozdz. 3.2.2, ale wspomniano o nich w tym miejscu, aby zasygnalizować czytelnikowi, że w procesach tych oprócz substancji chemicznych, biorą również udział komórki nerwowe. Podsumowywując doniesienia na temat efektów, jakie mogą być wywołane przez promieniowanie laserowe w komórkach nerwowych, można powiedzieć, że: - powoduje ono zmianę potencjałów czynnościowych włókien nerwowych, - w większości przypadków wzmaga mielinizaję i wzrost włókien nerwowych, - podnosi wydajność przewodnictwa impulsów nerwowych, - zwiększa proliferacje komórek Schwanna. 24 Keratynocyty. Keratynocyty to komórki pobudzające wydzielanie czynników wzrostowych hematopoetrycznych oraz aktywują neutrofile i wydzielanie leukotrienów, co z kolei prowadzi do wzrostu komórek biorących udział w odpowiedzi immunologicznej organizmu na działanie antygenu [118]. Większość badań nad tymi komórkami była prowadzona in vitro, na kulturach komórkowych. Stosując laser He-Ne o gęstości energii od 0,5 do 1,5 J/cm2, zaobserwowano wzrost uwalniania przez ludzkie keratynocyty interleukin IL-1 i IL-8 (białka hormonalne o działaniu lokalnym). Również inne badania prowadzone w tym zakresie zdają się potwierdzać, że promieniowanie laserowe wywołuje zmiany w keratynocytach. W wyniku naświetlania promieniowaniem o długości fali 780 nm i gęstości energii 0,45 – 0,95 J/ cm2, odnotowano prawie dwukrotny wzrost proliferacji keratynocytów [151]. Autorzy sugerują, że kluczową rolę w przyspieszeniu proliferacji komórek pod wpływem promieniowania laserowego, odgrywają aktywne formy tlenu, które powstają w wyniku naświetlania – podobnie, jak w przypadku znanego efektu fotodynamicznego [228, 229]. Tlen singletowy może stymulować aktywność reakcji redoks łańcucha oddechowego (patrz rozdz. 3.2.3). Zwiększenie produkcji ATP pobudza aktywność procesów komórkowych prowadzących do wzrostu proliferacji komórek [152]. Również Lubart w swoich pracach wykazuje, że absorpcja promieniowania laserowego następuje przez endogenne porfiryny i w konsekwencji obserwuje się wytwarzanie tlenu singletowego [110, 153, 155]. Może to być wytłumaczenie obserwowanych efektów wzrostu keratynocytów. Analizując doniesienia literaturowe na temat wpływu promieniowania laserowego na keratynocyty można wysnuć następujące wnioski: - wpływ promieniowania na keratynocyty nie jest jednoznaczny, - zaobserwowano wzrost ich proliferacji po naświetlaniu, - odnotowano wzmożone uwalnianie interleukin przez naświetlone keratynocyty. 25 3.2.2. Wyniki kliniczne. W poprzednim rozdziale zostały przedstawione wyniki badań laboratoryjnych prowadzonych w zakresie biostymulacji. Ich pozytywne rezultaty stały się przyczyną zastosowania laserów w terapii klinicznej, a w szczególności w leczeniu ran, trudno gojących się owrzodzeń, w chorobach powodujących patologiczne zmiany krwi. W szczególności przy klinicznych zastosowaniach promieniowania, należy zwrócić uwagę na odpowiedni dobór stosowanych dawek i techniki naświetlania. Jak wspomniano w rozdz. 3.1.2, oczekiwany efekt stymulacyjny zależy od wielkości zdeponowanej dawki, jednorazowe podanie zbyt dużej dawki prowadzi do zahamowania, bądź nawet odwrócenia efektu stymulacyjnego [9, 17, 19, 153, 154, 156]. W doniesieniach literaturowych stosowane dawki nie przekraczały 25 J/cm2, a w większości przypadków oscylowały na poziomie od kilku do kilkunastu J/cm2, przy mocach promieniowania laserowego do 100mW. Organizm ludzki jest bardzo skomplikowanym układem, na funkcjonowanie którego wpływa szereg czynników takich, jak np. stan metaboliczny, czy psychofizyczny organizmu. Dlatego w badaniach biostymulacyjnych, oprócz doboru parametrów energetycznych promieniowania i techniki naświetlania, istotne jest określenie kryteriów i metod, które dawałyby obiektywną ilościową ocenę zmian zachodzących pod wpływem naświetlania. Nie jest, to zadanie łatwe ze względu na występujący efekt placebo. Niestety w większości prac poprzestano jedynie na wyborze długości fali promieniowania i ewentualnie doborze dawek. Oceny obserwowanych efektów, dokonywano w oparciu o analizę statystyczną badanych parametrów, lub w oparciu o subiektywne odczucia pacjenta, jak ma to miejsce w terapii bólu. Celem tej pracy nie jest przedstawienie wyników wszystkich (bardzo licznych) badań klinicznych prowadzonych w zakresie biostymulacyjnego działania laserów, ale zasygnalizowanie głównych obszarów zainteresowań, przedstawienie obiegowych opinii na temat obserwowanych efektów oraz przybliżenie problemów, które towarzyszą badaniom na tym polu. Analizując efekty jakie wywołało promieniowanie laserowe w różnych grupach komórek (patrz rozdz.3.2.1), można wnioskować o możliwościach jego klinicznych zastosowań. Stwierdzono immunomodulacyjne działanie światła laserowego, stąd nadzieja na zastosowanie 26 biostymulacji w poprawie szeroko rozumianej obrony immunologicznej, szczególnie w zmniejszeniu ognisk zapalnych. W oparciu o doniesienia literaturowe możemy wyróżnić grupy schorzeń, które poddano biostymulacji: ♦ Stany zapalne (szczególnie przewlekłe z reumatoidalnym zapaleniem stawów włącznie) Zapalenie stanowi sumaryczną reakcję tkanek organizmu na uszkodzenie lub obumieranie komórek. Charakteryzuje się obrzękiem, bólem i zaburzeniem funkcji okolicy objętej patologią. Prace [79, 159, 160] donoszą o obiecujących wynikach uzyskanych przez uzupełnienie tradycyjnej terapii chronicznego zapalenia nerek o naświetlania laserem He-Ne (20 mW, E = 25J). U większości pacjentów zaobserwowano szybsze cofanie się symptomów choroby, takich jak: puchlina wodna, zwiększony opad i występowanie białka w moczu, zmniejszony poziom albumin w osoczu, podwyższony poziom cholesterolu w surowicy i zwiększona liczba leukocytów. Są to jednak badania typowo medyczne i niestety nie jest w nich określona technika naświetlania, ani też wielkości zdeponowanych dawek. Leczenie przewlekłych form zapalenia stawów jest bardzo złożone i wymaga leczenia farmalogicznego w połączeniu z fizjoterapią. Biostymulację należy traktować tutaj jako metodę leczenia objawowego [158, 161-163]. Najczęściej stosuje się tutaj lasery: Nd:YAG (1064 nm, D = 15-25 J/cm2) [166], GaAlAs (780 nm, P = 10 mW) [165] i GaAlAs (830 nm, P = 60 mW) [167-170]. Warte jest zauważenia, że stosowane tutaj dawki promieniowania są stosukowo duże, sięgające ok. 32 J/ cm2 , podczas gdy w badaniach laboratoryjnych dawki nie przekraczały kilku J/ cm2, a dla tak dużych wartości obserwowano efekt przeciwny do stymulacyjnego. Autorzy w żaden sposób nie uzasadniają takiego wyboru dawki. Według doniesień literaturowych dotyczących tych zmian, w większości przypadków uzyskano poprawę stanu pacjentów, w zakresie takich cech, jak: obniżenie OB i eozynofili, zmniejszenie odczynów wysiękowo-zapalnych, złagodzenie bólu, wzrost transformacji blastycznej limfocytów, poziomu immunoglobulin [3, 13, 18, 23, 166, 170-174]. Należy jednak podkreślić, że w badaniach nie został uwzględniony efekt placebo, a terapia obejmowała też leczenie farmakologiczne i trudno jest obiektywnie określić rolę lasera.. 27 ♦ Trudno gojące się rany i owrzodzenia. W wyniku naświetlania promieniowaniem laserowym zaobserwowano wyraźny efekt przyspieszenia gojenia się ran i owrzodzeń, których nie udało się zlikwidować metodami klasycznej terapii [9, 175, 176, 179, 181]. Badania w zakresie trudno gojących się ran były pierwszymi próbami klinicznych zastosowań laserów [16, 17, 25]. Naświetlanie powodowało również wzrost szybkości podziału komórek i przyspieszenie formowania się ziarniny, występowanie wzmożonej produkcji kolagenu przez fibroblasty skórne, przyrost nowych naczyń krwionośnych i poprawienie mikrokrążenia [25, 179, 180]. Jednocześnie w literaturze pojawia się wiele sprzecznych doniesień na temat efektów naświetlania [177, 178, 182, 183]. Wydaje się, że różnice wynikają z długości fali i energii stosowanego promieniowania. Szczególnie, że jak przedstawiono w rozdz. 3.2.3, prostaglandyny i interleukiny, które biorą udział w regulacji procesu gojenia, mają pasmo absorpcyjne w bliskiej podczerwieni, a w pracach [178,182], w których nie stwierdzono żadnego efektu stosowano promieniowanie widzialne o barwie czerwonej. ♦ Zmiany pourazowe (rehabilitacja) i zmiany zwyrodnieniowo-wytwórcze. Promieniowanie laserowe jest powszechnie stosowane w rehabilitacji, jako uzupełnienie fizjoterapii [3, 18, 180, 184, 186, 187]. W przypadkach stosowania metod skojarzeniowych zaobserwowano przyspieszenie procesów gojenia i zaniku urazów. Biostymulacyjne działanie promieniowania laserowego zostało wykorzystane przy przyspieszaniu leczenia trudno zrastających się złamań kości długich i w przypadkach wytworzenia się stawów rzekomych [3, 13, 18, 181, 185]. Podobnie jak w przypadku zmian zwyrodnieniowych stosowana była tutaj terapia skojarzeniowa. Stąd wynika trudność interpretacyjna uzyskanych efektów. ♦ Neuralgie Często spotykamy się z opinią o przeciwbólowym działaniu promieniowania laserowego. Zastosowania kliniczne w terapii bólu wynikają z pozytywnych wyników doświadczeń prowadzonych in vitro na komórkach nerwowych (patrz rozdz. 3.2.1) [137-139]. Oprócz komórek nerwowych w odczuciu bólu biorą udział neuromediatory i substancje chemiczne. 28 Większość doniesień potwierdza przeciwbólowe działanie promieniowania laserowego [20, 50, 187, 188, 189, 201] . Należy zwrócić uwagę na dużą trudność oceny obserwowanych efektów. Oprócz efektów placebo, dochodzi tutaj subiektywność oceny wpływu naświetlania. Oczywiście stosowane są różnego rodzaju testy określające poziom bólu, ale nie są to dane ilościowe, które łatwo można weryfikować. Większość eksperymentów była prowadzona z tzw. podwójną ślepą próbą, która miała minimalizować takie efekty. Wyniki takich badań z podwójną ślepą próbą pokazują, że wyniki uzyskane w wyniku naświetlania nie różnią się od tych dla grupy placebo. Co jest sprzeczne z dotychczasowymi doniesieniami literaturowymi [20, 50, 188, 189]. Ze względu na złożoność procesów towarzyszących odczuciom bólowym, badania wpływu promieniowania laserowego na ich modulacje są trudne, a interpretacja problematyczna. ♦ Patologie krwi i układu krążenia Badania nad wpływem promieniowania laserowego na parametry krwi zmienionej chorobowo były prowadzone in vitro. Zaobserwowano wyraźne zmiany w właściwościach krwi po naświetlaniu (patrz rozdz. 3.2.1), jednak nie stosowano jak dotąd naświetlania krwi in vivo. Jedynym doniesieniem na temat klinicznych zastosowań krwi naświetlanej jest praca Fu-Shou Yang z zespołem [193]. Naświetlali oni krew pobraną od poszczególnych pacjentów laserem He-Ne o długości fali 632 nm i mocy 8 mW, a następnie krew naświetlona była im z powrotem przetaczana. Z przedstawionych danych wynika, że po naświetlaniu nastąpiła poprawa funkcji immunologicznych organizmu i zmniejszenie liczby pacjentów wykazujących objawy chorobowe. Terapia ta była skorelowana z terapią tlenową [194]. Do wyników tych należy jednak podchodzić z dużą rezerwą ze względu na niejasną metodykę analizy obserwowanych efektów. Jednakże inne badania prowadzone nad wpływem promieniowania laserowego na krew donoszą, że poprawia ono ukrwienie i mikrokrążenie naświetlanych obszarów [73, 94, 95]. Obniża też ciśnienie krwi i wzmaga angigenezę, która pojawia się już pięć dni po naświetlaniu [66-68, 71, 74, 194, 195]. ♦ Zastosowanie w stomatologii Biostymulacja stomatologiczna jest szerokim zagadnieniem. Na jej temat dostępnych jest już kilka monografii w języku polskim [18, 196, 197] i dlatego nie będzie tu dokładniej 29 omawiana. Dla orientacji czytelnika wymienimy tylko kilka typowych zastosowań: stymulacja wzrostu miazgi, leczenie nadwrażliwości zębiny, afty nawrotne, akceleracja gojenia ran poekstrakcyjnych, zapalenia zębodołów. Przedstawione powyżej efekty kliniczne obserwowane w wyniku naświetlania promieniowaniem laserowym, określają jedynie w przybliżeniu rozległy obszar medycznych zastosowań biostymulacji. W przedstawionej poniżej tabeli (tabela 2) usystematyzowano doniesienia literaturowe na temat efektów biostymulacjnych. Grupy schorzeń /narządy Brak efektu Doniesienia ogólne Efekt pozytywny - 29 67, 68, 69, 72+, 73+, poddane naświetlaniu Układ krwionośny 74+, 75+, 76, 79, 100-, 115, 117, 195, 199Rany, owrzodzenia 41, 182-, 183, 3, 18 185 Reumatologia 9, 45, 47+, 46, 48-, 50, 127, 128, 131 190, 186 12, 18 53, 54, 162-163, 164, 165, 167+, 168-, 201 Neuralgie 191, 200- 138 140-143+, 146, 147, 148, 149 Płuca, funkcje oddechowe - - 171, 173, 174-, 182 Nerki - - 159-, 160 Stomatologia 203 - 195-197 Tabela 2. Doniesienia literaturowe na temat efektów niskoenergetycznej terapii laserowej (gdzie: + - przy referencji oznacza (według oceny własnej) rzetelnie przeprowadzone badania, - - badania, co do których poprawności mam zastrzeżenia). 30 3.2.3. Hipotezy wyjaśniające mechanizmy biostymulacyjnego oddziaływania promieniowania laserowego na układy biologiczne. Promieniowanie laserowe może oddziaływać na poszczególne komórki tylko za pośrednictwem substancji, które to promieniowanie pochłaniają. Ze względu na to, jaka cząsteczka będzie fotoakceptorem (tzw. chromoforem), w komórce będą zachodzić różnego rodzaju procesy fizyko – chemiczne. Stąd też hipotezy przedstawiane w literaturze i mające na celu wyjaśnienie mechanizmów tych procesów, różnią się właśnie ze względu na rodzaj cząstki będącej fotoakceptorem i dalszego transferu dostarczonej energii. Gdzie szukać fotoakceptorów? Jeżeli promieniowanie laserowe ma wpływać na główne procesy komórkowe, to oczywiste wydaje się szukanie ich w miejscach, które wpływają na procesy metaboliczne. Ważną taką organellą komórkową jest mitochondrium, które dostarcza naszym komórką energii niezbędnej do życia [86, 195-198, 204-207]. Zawiera ono szereg enzymów, biorących udział w przebieg tzw. reakcji redoksowych łańcucha oddechowego, które są głównym mechanizmem przemian metabolicznych toczących się w komórce. Jednym z absorbentów światła z zakresu podczerwonego i czerwonego, który spełnia powyższe warunki jest: cytochrom c oksydazy [204, 208-212]. Jest to enzym z serii porfiryn zawierający w swojej strukturze żelazo. Oksydaza cytochromowa jest białkiem transbłonowym (integralnym) posiadającym cztery redoksowe centra aktywne [7, 8] i silnie absorbującym w obszarze bliskiej podczerwieni [211]. Katalizuje przeniesienie elektronów z cytochromu c na tlen cząsteczkowy, redukując go do cząsteczek wody: 4cyt c (+2) + 4 H+ + O2 → 4cyt c (+3) + 2 H2O (6) a uwolnione protony są pompowane z macierzy mitochondrialnej do cytozolu. Energia, która tworzy się w wyniku tej reakcji jest zamieniana na elektrochemiczny potencjał transbłonowy, co z kolei zwiększa syntezę ATP i w konsekwencji podnosi wydajność procesów metabolicznych. Liczne doniesienia na temat fotoaktywacji przemian łańcucha oddechowego, zdają się potwierdzać, że właśnie oksydaza cytochromu c jest pierwszorzędowym akceptorem promieniowania [9, 62, 76, 77, 107]. Jednak nie jest to jedyny możliwy akceptor światła 31 laserowego mogący brać udział udział w tych procesach. Potwierdzono doświadczalnie, że absorbentem promieniowania może też być dysmutaza ponadtlenkowa – NADH zawierająca w swojej cząsteczce miedź [110, 209, 219, 220, 226]. NADH jest enzymem błonowym, który również jest zaangażowany w przebieg procesów redoksowych. Pomimo tego, że wiemy, które cząsteczki mogą być absorbentami promieniowania laserowego, sam mechanizm jego oddziaływania na te molekuły nie jest do końca poznany. Z tego powodu w literaturze dyskutowane są cztery próby jego wyjaśnienia, których idea zostanie przedstawiona poniżej. a) Mechanizm pierwszorzędowy: • Zwiększenie transferu elektronów w łańcuchu oddechowym spowodowane zmianą własności redoksowych fotoakceptorów [10, 110, 204, 206, 207]. Wzbudzenie elektronowe molekuły fotoakceptora powoduje zmianę jej własności redoksowych [10, 11, 107, 234]. W szczególności, cytochrom c oksydazy i NADH zawierają centra aktywne (np. CuA, CuB, czy grupy hemowe a i a 3 [110]), które mogą ulec fotowzbudzeniu zmieniając ich stany redoksowe i w konsekwencji przepływ elektronów w molekule [7, 8, 107, 208, 209]. Liczne doniesienia na ten temat zdają się potwierdzać, że fotoindukowane reakcje transferu elektronów mogą inicjować syntezę i zmiany konformacyjne białek [10, 110]. Na przykład, mogą wpływać one na wzrost syntezy DNA i RNA [110, 221, 235-237]. • Lokalny wzrost temperatury powoduje zmiany strukturalne i pobudzają aktywność enzymów [110, 213, 214, 215]. Podczas wzbudzania stanów elektronowych molekuły, część zdeponowanej energii jest przekazywana do stanów oscylacyjnych i rotacyjnych, a więc zostaje zamieniona na ciepło, co powoduje lokalny wzrost temperatury chromoforów i pobudza ich aktywność enzymatyczną. Hipoteza ta wydaje się dość problematyczna, choćby ze względu na fakt, że nie zostało sprecyzowane, jak duże miałyby być zmiany temperatury, aby powodować pożądany efekt. Lokalny wzrost temperatury też nie wydaje się możliwy do osiągnięcia ze względu na 32 towarzyszący temu zjawisku gradient temperatury. Niedawna, bardzo wszechstronna i rzetelna praca [73] w zasadzie obaliła tę hipotezę, ponieważ stwierdzono niewątpliwy ukrwienia tkanek miękkich, dłoni po oświetleniu laserem 780 nm przy braku zmian temperatury większych niż 0.10C. • Udział reaktywnych form tlenu tzw. ROS (Reactive Oxygen Spiecies) w modulacji aktywności enzymów [110, 152, 155, 223-227, 230]. W wyniku fotoabsorpcji promieniowania przez egzo-, lub endogenne akceptory (P) możliwa jest na drodze przemian fotodynamicznych, produkcja następujących form wolnorodnikowych (ROS): P + hν → P* P* + 3O2 → P + ROS ROS = 1 O2 , O2*- , OH*- , H2O2 (7) (8) (9) Powszechnie wiadomo, że duża koncentracja ROS prowadzi do śmierci komórki (peroksydacja lipidów, hamowanie produkcji ATP), jednakże wyniki przeprowadzonych badań pokazują, że stosunkowo małe i kontrolowane koncentracje wolnych rodników odgrywają ważną rolę w aktywacji wielu reakcji chemicznych zachodzących w komórce [110, 152, 155]. W szczególności, podnoszą wydajność redoksową przemian łańcucha oddechowego, co moduluje aktywność mitochondriów i wpływa na komórkowe przemiany metaboliczne. Odnotowano, że niewielka zmiana koncentracji O2*- w komórce powoduje wielorakie zmiany drugorzędowe, takie jak wzrost uwalniania jonów Ca2+, wzrost pH, aktywację pomp jonowych Na+/H+ i Ca2+ATPazy oraz przyspieszenie wymiany jonowej Na+- Ca2+ [110, 152, 230]. 33 W poniższej tabeli (Tabela 3) przedstawiono przykłady udokumentowanego zaangażowania ROS w proces fotobiostymulacji: Badane komórki Obserwowany efekt Referencje Haemopoietic U937 obecność O2*- i H2O2 Callaghan i wsp.[221] Plemniki obecność H2O2 Cohen i wsp. [222] Krew ludzka zmiany chemiluminescencji Ryabykh i Karu [223] Fibroblasty wzmożona proliferacja Lubart i wsp. [224] Karotenocyty (NHK) zahamowanie procesu Grossman i wsp. [151] proliferacji Kom. E. coli i zahamowanie procesu antyoksydanty proliferacji Kom. E. Coli w roztworze zwiększona proliferacja Polo i wsp. [225] redukcja w fazie Cohen i wsp. [221] Polo i wsp. [225] D2O Sperma i katalazy zapłodnienia Tabela 3. Przykłady udziału ROS w fotobiostymulacji. • Mechanizm wzbudzania oparty na metodzie fotodynamicznej [110, 206, 210, 227]. Metoda fotodynamiczna (stosowana w leczeniu nowotworów) polega na wprowadzeniu do organizmu fotouczulacza (np. porfiryny), którego pasmo absorpcyjne pokrywa się z długością fali promieniowania, którym fotouczulone miejsce jest naświetlane. Egzogenny charakter tego fotoakceptora (uczulacza) odróżnia ten mechanizm od poprzedniego. W wyniku procesu absorpcji porfiryna zostaje wzbudzona. Następnie przekazuje energię cząsteczce tlenu w stanie podstawowym (3O2), w wyniku czego powstaje tlen singletowy (1O2): hν porfiryna → porfiryna * (10) porfiryna * + 3O2 → porfiryna + 1O2 (11) 34 Tlen singletowy ma tutaj działanie destrukcyjne. Może się jednak zdarzyć, że zostanie on włączony w szereg reakcji redoks łańcucha oddechowego. Zmiana 3O2 na 1O2 stymuluje aktywność tych reakcji. Elektronowy transport reakcji redoks pompuje jony H+ z matrycy mitochondrialnej na zewnątrz, co w konsekwencji wpływa na syntezę DNA, RNA i wzrost komórek [232, 235, 236]. Podsumowywując powyższe rozważania, można wysnuć wniosek, że w pierwszorzędowy mechanizm biostymulacji laserowej jest zaangażowanych wiele reakcji. Nie ma podstaw do stwierdzenia, że zachodzi jedynie jeden z przedstawionych procesów i jest on dominujący. Bezdyskusyjny jest udział chromoforów i flawin (np. NADPH) łańcucha oddechowego w całym procesie. Istotnym pytaniem na przyszłość jest, czy uda się z całego gąszcza procesów towarzyszących fotowzbudzeniu, wybrać ten, który będzie odpowiedzialny za efekty rozumiane jako biostymulacyjne. b) Mechanizm drugorzędowy: Mechanizm pierwszorzędowy próbuje wyjaśnić procesy zachodzące podczas absorpcji promieniowania. Jak wiadomo jest to, akt krótkotrwały. Tymczasem wiele reakcji biochemicznych zachodzących w komórce wymaga godzin, a nawet dni do wywołania efektów wpływających na funkcjonowanie komórki, tkanek i w efekcie całego organizmu. Jeżeli fotoakceptory są zlokalizowane w mitochondriach, to w jaki sposób reakcje pierwszorzędowe oddziałujące na procesy łańcucha oddechowego są powiązane z syntezą DNA, która ma miejsce w jądrze komórkowym? Poniższy rysunek (rys. 5) spróbuje wyjaśnić te wątpliwości: 35 Rys. 5. Schematyczne przedstawienie możliwego mechanizmu proliferacji komórek na skutek naświetlania promieniowaniem laserowym [110]. Kwant promieniowania jest absorbowany przez składniki łańcucha oddechowego, tutaj NADH. Następuje utlenienie NADH, co powoduje zmianę stanów redoksowych zarówno mitochondrium, jak i cytoplazmy [110, 205, 216]. Aktywacja transportu elektronów w łańcuchu oddechowym, wpływa na kształtowanie się elektrochemicznego transbłonowego gradientu protonowego (∆Ψ) w mitochondriach. To z kolei podnosi wydajność siły protono – motorycznej (∆µ) i powoduje zwiększone uwalnianie jonów wapnia z mitochondrium do cytoplazmy: 2+ + + 2+ 2 H out + Cain → 2 H in + Caout 36 (12) Siła protono - motoryczna zwiększa produkcję ATP, który aktywuje pompy jonowe Na+/ H+ [62, 63, 110, 206]. Następuje depolaryzacja błony mitochondrialnej i zwiększenie pH wewnątrzkomórkowego [205]. Zmianie uległ nie tylko stan redoksowy mitochondrium i cytoplazmy, ale i całej komórki. Oprócz wzmożonego wypływu protonów z mitochondrium, obserwujemy też aktywację innego enzymu błonowego, jakim jest Na+- K+-ATPaza. Enzym ten kontroluje poziom cAMP (cyklicznego adenozyno mono fosforanu) w komórce, który może być odpowiedzialny za wzrost prolifercji komórek [63, 208, 232, 234]. Procesy, które mogłyby powodować wzrost syntezy DNA i RNA, są bardzo skomplikowane i mechanizm towarzyszących im przemian nie jest jeszcze do końca poznany. Wydaje się, że kluczową rolę odgrywają tutaj jony wapnia, których wypływ do cytoplazmy powoduje jej alkalizację. Zmiana pH prowadzi z kolei do następnych aktywacji grup enzymów, które są odpowiedzialne za regulacje funkcji życiowych komórki [80, 82, 110, 205, 221, 233]. W tych procesach istotną rolę odgrywa również wzmożona synteza ATP, a jak wiadomo, nawet niewielka zmiana w poziomie ATP wpływa na metabolizm komórki [110, 210, 226, 227]. Analizując przedstawione powyżej możliwe drogi przemian biochemiczno-fizycznych, jakie mogą zachodzić pod wpływem niskoenergetycznego promieniowania laserowego, można wysnuć wniosek, że w samym mechanizmie biostymulacji nadal więcej jest pytań, niż odpowiedzi. Dla znalezienia właściwej drogi, która pozwoliłaby przedstawić podstawy teoretyczne omawianych efektów, istotna wydaje się konsolidacja działań różnych dyscyplin nauki, poczynając od biochemików a na fizykach kończąc. Ujednolicenie metodyki badawczej i „dobra” charakterystyka stosowanego promieniowania, dałaby możliwość porównywania wyników eksperymentalnych. 37 4. Własności promieniowania laserowego stosowanego w badaniach. Słowo LASER jest akronimem angielskiego wyrazenia: Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation – wzmocnienie światła poprzez wymuszoną emisję promieniowania. Pierwszym laserem był laser rubinowy, uruchomiony przez Maimana w 1960 roku, o długości fali 694.3 nm [238-241]. Obecnie stosowane lasery pracują w szerokim zakresie widma fal elektromagnetycznych, od mikrofal do promieniowania rentgenowskiego. Promieniowanie laserowe charakteryzuje się tym, że foton wygenerowany w wyniku emisji wymuszonej ma ten sam kierunek co foton wymuszający, taką samą częstotliwość i fazę. Stąd wynikają podstawowe cechy promieniowania laserowego, takie jak: • spójność (koherencja), • monochromatyczność, • równoległość wiązki, • duża energia promieniowania. Różnorodność typów laserów wynika z wielu rodzajów materiałów stosowanych do budowy ośrodków aktywnych i sposobów ich wzbudzania. Dzielimy je także z punktu widzenia wartości mocy promieniowania [242, 243]. Ponieważ w prowadzonych rozważaniach i dalszych badaniach interesuje nas fotochemiczny (biostymulacyjny) mechanizm oddziaływania promieniowania laserowego na układy biologiczne, dlatego do badań przeprowadzonych w ramach tej pracy wybrano laser małej mocy. Był to laser diodowy DL7140-201 firmy Sanyo, o maksymalnej mocy 70 mW i długości fali 780 nm. Jest to urządzenie o małych rozmiarach, proste w obsłudze, do zasilania którego wystarczy płaska bateryjka. Laser diodowy: Laser diodowy jest urządzeniem półprzewodnikowym, w którym akcja laserowa zachodzi w wyniku przepływu prądu przez złącze p-n. Zjawisko to jest tłumaczone na gruncie teorii pasmowej półprzewodników. 38 Rys. 6. Schemat lasera półprzewodnikowego [wg. 238]. Gdy obszar typu p jest spolaryzowany ujemnie względem obszaru typu n, przez złącze płynie bardzo mały prąd. Natomiast gdy obszar typu p jest spolaryzowany dodatnio, przez złącze popłynie duży prąd. Wówczas dziury z obszaru typu p są wstrzykiwane do obszaru typu n, a elektrony z obszaru typu n – do obszaru typu p. Jeżeli elektron napotka dziurę, dochodzi do ich rekombinacji, w wyniku której zostaje wyemitowany foton o energii równej szerokości przerwy energetycznej [238, 244]. Promieniowanie emitowane przez laser półprzewodnikowy nie jest ściśle równoległe, co jest związane z małymi rozmiarami obszaru, z którego pochodzi światło i wynikającą stąd silną dyfrakcją. Poprawia to wprawdzie sprawność diody laserowej i zapewnia pracę w jednym podstawowym modzie poprzecznym, ale jednocześnie powoduje rozbieżność wiązki laserowej różną w różnych płaszczyznach co powoduje eliptyczny kształt jej przekroju poprzecznego. Dla lasera diodowego DL7140-210, szerokość połówkowa kątowego rozkładu natężenia wiązki w kierunku pionowym θ⊥ = 170, a szerokość połówkowa kątowego rozkładu natężenia wiązki w kierunku poziomym θ|| = 70. Aby móc dokładnie określić dawkę promieniowania w różnych odległościach próbki takiego lasera, wykonano pomiar zmiany powierzchni przekroju poprzecznego wiązki w zależności od odległości pomiędzy diodą laserową a naświetlaną powierzchnią. Natężenie emitowanego światła, a co za tym idzie jego moc, zależy od prądu wstrzykiwanych nośników. Poniższy wykres (rys.7) przedstawia zależność optycznej mocy wyjściowej w funkcji prądu płynącego przez stosowaną diodę laserową. 39 Rys. 7. Moc diody laserowej w funkcji prądu płynącego przez stosowaną diodę DL7140-210. Jak widać z rys. 7, moc diody szybko rośnie, gdy prąd przekracza wartość progową - Ith, a poniżej tej wartości emisja jest słaba. Prąd progowy Ith, przy którym rozpoczyna się akcja laserowa, definiuje się przez ekstrapolację stromej części krzywej do zera. Wartość ta dla testowanej diody wynosi około 27,5 mA. Laser diodowy jest urządzeniem bardzo wrażliwym na krótkotrwałe, gwałtowne zmiany natężenia prądu i napięcia na złączu, które mogą doprowadzić do zniszczenia lub uszkodzenia lasera. Dlatego wymagany jest specjalny układ zasilania, posiadający zabezpieczenia przed nagłymi zmianami napięcia przy włączaniu i wyłączaniu lasera. W przypadku wykorzystywanej diody zabezpieczeniem tym był układ kondensatorów i potencjometrów, oraz szybkie diody. Jest on przedstawiony na poniższym schemacie (rys. 8). 40 10 Ω − 10k DZ 1000µ + 10 Ω D LD PD 250 Ω Rys. 8. Schemat układu zasilającego użytego dla diody laserowej. Opis schematu: LD – dioda laserowa, PD – zintegrowana z LD fotodioda umożliwiająca pomiar i kontrolę mocy emitowanej przez LD, DZ – oznacza diodę Zenera, D – szybkie diody zabezpieczające. 41 5. Badania własne. 5.1. Badanie wpływu niskoenergetycznego promieniowania laserowego na parametry krwi ludzkiej. Krew już przez starożytnych była uważana za esencję życia. Jest to rzeczywiście bardzo ważny składnik naszego organizmu - jej brak czy znaczny ubytek doprowadza szybko do śmierci. Rola krwi jest bardzo zróżnicowana, wyróżnia się jej trzy główne funkcje: transportową, obronną i homeostatyczną (czyli utrzymująca stałość parametrów biochemicznych i biofizycznych organizmu). Na przełomie kilku ostatnich lat można zaobserwować wyraźny wzrost zainteresowania badaczy dotyczący wpływu biostymulacji na funkcje i parametry krwi, w szczególności na erytrocyty [79, 80, 82, 84, 108, 115]. Wiele doniesień przedstawia pozytywne wyniki badań klinicznych (np. poprawa mikrokrążenia, zmniejszenie ciśnienia krwi, pobudzenie obrony immunologicznej) i laboratoryjnych (np. zmiana przepuszczalności błony erytrocytów, zwiększona produkcja limfocytów), które zdają się potwierdzać biostymulacyjny efekt LLLR [73, 74, 80, 82, 89, 92, 93, 98, 101]. Jednak jak podkreślono w rozdz. 3.1.1, aby móc opierać się na tych wynikach, należy zwrócić uwagę na poprawność metodyki badań i określenie parametrów stosowanego promieniowania. Ponieważ krew odgrywa w naszym organizmie istotną rolę, niniejsza praca ma na celu zbadanie, czy i jaki wpływ na podstawowe parametry krwi ma promieniowanie laserowe o określonych własnościach. 5.1.1. Materiały i metody. Źródło światła: Laser diodowy (Sanyo DL7140-210) opisanych w rozdz. 4. Obiekt badań: Materiałem do przeprowadzonych badań była krew ludzka uzyskana z Centrum Krwiodawstwa CM UJ. Krew pochodziła od zdrowych dawców, jako środki przeciw krzepnięciu użyto 3% cytrynian sodu ( dla tzw. masy krwi - krew częściowo odwirowana ), lub wersenian dwusodowy - EDTA. 42 Odczynniki: Wszystkie odczynniki użyte podczas przygotowywania próbek pochodziły z Centrum Analityki i Diagnostyki CM UJ, oraz z firmy SIGMA. Przygotowanie materiału: W pomiarach współczynnika lepkości używana była masa krwi ( krew częściowo odwirowana ) o objętości (każdorazowo) 75ml, nie rozcieńczona. Do naświetlań i badań morfologicznych użyto krwi, gdzie środkiem przeciw krzepnięciu był EDTA. Próbki przeznaczone do naświetlania i pomiarów metodą mikroskopii skaningowej: AFM i LFM, były wirowane (5 min, 600g), a następnie zbierano z nich nadsącz (osocze). Uzyskane w ten sposób erytrocyty rozcieńczono 0.8% wodnym roztworem NaCl, podzielono na grupy i poddano naświetleniu promieniowaniem laserowym (780 nm, 70 mW). Następnie naświetloną krew i grupy kontrolne poddano następującej procedurze (w , stosowanej standardowo do badań AFM w powietrzu: • krew rozcieńczono sto razy buforem fosforanowym (PBS), który jest roztworem izotonicznym o składzie podobnym do płynów ustrojowych, • rozcieńczoną krew nałożono na szkiełko pokrywkowe PLL, czas osadzania 15 min., • próbkę utrwalono glutaraaldehydem (roztwór 2,5%) przez 2 min., • następnie wypłukano utrwalacz wodą destylowanąi osuszono próbki w temp. 8-60C. Pomiar elementów morfotycznych krwi: Obraz morfologii krwi uzyskano przy użyciu analizatora hematologicznego: Sysmex -KX21 (Centrum Analityki Medycznej CM UJ). Pomiar widma absorpcji: Zarówno dla krwi odwirowanej, jak i nieodwirowanej wykonano pomiar widma absorpcji na spektrofotometrze – w Zakładzie Cienkich Warstw IF UJ (metodą kuli Ulbrichta), w celu sprawdzenia, czy promieniowanie, którym naświetlamy próbki krwi jest przez nią absorbowane. 43 5.1.2. Dlaczego 780 nm? - pomiar widma absorpcji krwi. Krew ludzka ma wiele składników, z których każdy charakteryzuje się innym widmem absorpcji. Głównym absorbentem jest hemoglobina - czerwony barwnik krwi. Hemoglobina składa się z białka - globiny - oraz z czterech cząsteczek hemu. W hemie "główne skrzypce" gra atom żelaza, który wiąże się z jedną cząsteczką tlenu, tworząc oksyhemoglobinę i stając się tym samym transporterem tlenu w naszym organizmie. Na poniższym wykresie (rys.9) przedstawiono widmo absorpcyjne dla hemoglobiny (Hb) i oksyhemoglobiny (HbO2). Rys. 9. Widmo absorpcji dla hemoglobiny ( HB ) i oksyhemoglobiny (HbO2) [254]. Ustrojowa krew ludzka charakteryzuje się innym widmem absorpcji, ze względu na obecność białych krwinek, licznych kationów i anionów. Dlatego w celu określenia pasma absorpcji wykonano, pomiar absorpcji dla pełnej krwi przy użyciu spektrofotometru. 44 77,0 76,5 T [%] 76,0 75,5 75,0 74,5 74,0 500 600 700 800 900 λ [nm] Rys. 10. Widmo transmisji pełnej krwi ludzkiej zmierzone przez autorkę z udziałem Pana Mgr J. Olejniczaka (#- krew nieodwirowana, #- odwirowana). Z analizy powyższego wykresu wynika, ze pełna krew ustrojowa posiada w obszarze pomiędzy 690 nm., a 800nm. pasmo transmisyjne. Zatem stosując do naświetlań promieniowanie laserowe o długości fali 780 nm. trafiamy w pasmo absorpcyjne. 5.1.3. Pomiar lepkości krwi. Ciecze są lepkie co znaczy., że między dwiema warstwami cieczy, poruszającymi się względem siebie, występują siły styczne pochodzenia cząsteczkowego. Jeżeli po powierzchni cieczy rozlanej w płaskim naczyniu będziemy przesuwali płaską deszczułkę, to napotkamy pewien opór. Pochodzi on stąd, że warstwy cieczy znajdujące się bliżej deski mają prędkość większą, a te w pobliżu dna mniejszą. Na pokonanie tarcia wewnętrznego cieczy trzeba użyć siły: F =η⋅S ∆v . ∆x (13) Gdzie: - F – siła oporu, - ∆v – różnica prędkości warstw płynu o powierzchni S odległych o ∆x. - η -jest współczynnikiem lepkości. [η] = Ns/m2 = kg/ms = Pa s (jednostką η jest centyPuaz, cP = 10-3 Ns/m2. 45 Współczynnik ten zależy od rodzaju cieczy i od temperatury. Ze wzrostem temperatury lepkość cieczy maleje wykładniczo według wzoru: −B η = Ae kT . (14) W pomiarach współczynnika lepkości cieczy korzystamy najczęściej z dwóch praw: Stokesa i Poiseuille’a. Prawo Poiseuille’a dotyczy oporu lepkości cieczy, jaki towarzyszy jej przepływowi w rurce. Środkiem rurki ciecz płynie najszybciej. W miarę zbliżania się do ścian prędkość stopniowo maleje, a przy ścianach staje się równa zeru. Można z tego wnioskować, że istnieje opór lepkości. Do pokonania oporu trzeba zastosować nadwyżkę ciśnienia p1 - p2 między jednym końcem rurki a drugim. Nadwyżka ta powoduje wypływ cieczy z rurki. Objętość V wypływającej cieczy w czasie t będzie równa: V = π ⋅ r 4 ( p1 − p 2 )∆t . 8ηl (15) Wzór (15) nosi nazwę prawa Poiseuille’a. Przekształcając dalej powyższe wyrażenie otrzymujemy wzór na średnią prędkość wypływu cieczy: v= r 2 ( p1 − p 2 ) . 8ηl (16) Należy jednak podkreślić, że krew jest cieczą nieniutonowską i nie podlega ściśle prawu Poiseuille’a, które stosuje się do cieczy pozbawionych struktury wewnętrznej. Na przykład współczynnik lepkości krwi, który dla cieczy niutonowskiej (w danej temperaturze) ma wartość stałą, zależy od średnicy rurek, w których go mierzymy, oraz od prędkości przepływu. W miarę zmniejszania się średnicy kapilar, współczynnik lepkości najpierw maleje, ale dla bardzo wąskich kapilar silnie wzrasta i wreszcie przepływ krwi ustaje. W doświadczeniu pozbyto się tego typu problemów stosując stałą średnicę kapilary pomiarowej dla wody destylowanej i krwi. Do pomiaru lepkości użyto wiskozymetru Hoppler’a, którego zasada działania oparta jest na prawie Stokes’a. Stokes badał opór, jaki napotyka kulka poruszająca się względem cieczy przy założeniu, że opływ jest laminarny, to znaczy charakteryzuje się małą liczbą Reynoldsa. W tym przypadku opór jest wywołany głównie przez siły lepkości i wynosi: 46 F = 6πrvη , (17) gdzie: η- współczynnik lepkości, r - promień kulki, v - prędkość kulki względem cieczy. Na rysunku poniżej ( rys. 11) przedstawiono schemat wiskozymetru Hopplera. Gdzie: 1- kulka opadająca w badanej cieczy 2- cylinder szklany z badaną cieczą 3- obudowa wypełniona wodą pełniącą rolę cieczy termostatującej 4- poziomica 5- termometr 6- zatrzask sprężynowy 7,8,9 - podłączenie do termostatu Rys. 11. Wiskozymetr Hopplera [wg. 253]. Wiskozymetr podłączony jest do wymuszonego obiegu wody, której temperatura stabilizowana jest przez termostat do żądanej temperatury z dokładnością do około 0,50C, co umożliwia wyznaczenie współczynnika lepkości badanej cieczy w zależności od temperatury. Kulka spada w rurce szklanej wypełnionej badaną cieczą, średnica rurki jest zbliżona do rozmiarów kulki. Aby utrzymać laminarny przepływ cieczy w rurce, została ona odchylona od pionu o ok. 100, co zapobiega wahadłowemu opadaniu kulki. Kulka opadając doznaje oporu lepkości (zgodnie z prawem Stokesa), który hamuje jej ruch. Działają na nią trzy siły: składowa siły ciężkości, składowa siły wyporu Fw, siła lepkości F. Jeśli ruch kulki jest jednostajny, to występuje równowaga tych sił: mg cos α − Fw cos α = krvη , gdzie: • siła ciężkości P = mg = ρ k Vg , 47 (18) • siła wyporu: Fw = ρ cVg . Jednocześnie prędkość kulki v = s , gdzie droga mierzona jest od kreski A do kreski B t zaznaczonych na rys. 10. Otrzymujemy następujący wzór na współczynnik lepkości: η= 4πr 2 g ( ρ k − ρ c ) cos αt , 3ks (19) gdzie: K= 4πr 2 g cos α (20) - jest wielkością stałą dla danej kulki i rurki. 3ks Przy takim założeniu: η = K ( ρ k − ρ c )t . (21) Stałą K wyznaczamy posługując się cieczą wzorcową o znanym współczynniku lepkości. Lepkość krwi wyznaczono względem wody destylowanej o temperaturze 300C : ηH2O[dla 300C] = 0,7982 cP Błąd pomiarowy został wyznaczony na podstawie średniego odchylenia standardowego i metody różniczki zupełnej. Poniżej przedstawiono ( Tabela 4) uzyskane dane doświadczalne: 48 0 Temp. [ C] 27 ± 0.5 29 ± 0.5 31 ± 0.5 35 ± 0.5 37 ± 0.5 w bez naświetlana (kontrola) Krew bez naświetlania (kontrola) Średni czas opadania kulki [s] 183 ± 0.8 137 ± 1.2 97 ± 1 79 ± 0.9 70 ± 0.9 Temp. [0C] 27 ± 0.5 29 ± 0.5 31 ± 0.5 35 ± 0.5 37 ± 0.5 Temp. [0C] 25 ± 0.5 27 ± 0.5 30 ± 0.5 31 ± 0.5 36 ± 0.5 0 Temp. [ C] 25 ± 0.5 27 ± 0.5 30 ± 0.5 33 ± 0.5 36 ± 0.5 Tabela 4. Wyniki pomiarów. Z analizy zamieszczonych Krew po naświetlaniu (2 min) Średni czas opadania kulki [s] 210 ± 1.3 195 ± 0.9 171 ± 0.8 110 ± 1 85 ± 1.2 Krew po naświetlaniu (3 min) Średni czas opadania kulki [s] 211 ± 1.4 199 ± 1.3 181 ± 1.3 169 ± 1.2 99 ± 1 Krew po naświetlaniu (6 min) Średni czas opadania kulki [s] 221 ± 1.2 194 ± 0.8 166 ± 0.9 120 ± 1.1 100 ± 1 powyżej tabel (Tab.4) wynika, η[cP] 4,87 ± 0.2 3,63 ± 0.31 2,58 ± 0.27 2,12 ± 0.25 1,86 ± 0.23 η[cP] 5.6 ± 0.31 5.18 ± 0.28 4.56 ± 0.26 2.93 ± 0.32 2.25 ± 0.31 η[cP] 5.61 ± 0.32 5.29 ± 0.31 4.81 ± 0.28 4.37 ± 0.26 2.63 ± 0.25 η[cP] 5.9 ± 0.33 5.16 ± 0.32 4.43 ± 0.28 3.21 ± 0.28 2.66 ± 0.32 że naświetlenie krwi niskoenergetycznym promieniowaniem laserowym, spowodowało wzrost jej współczynnika lepkości. Jest to zgodne z wynikami, które uzyskał D.Siposan dla pełnej krwi obwodowej [94, 49 95]. Jednakże należy zauważyć, że w prezentowanych przez niego wynikach nie została uwzględniona zależność temperaturowa zmian lepkości, co ma kluczowe znaczenie w dalszej interpretacji odnośnie efektów klinicznych. Zmiany przedstawione w tabelach 4. zostały zilustrowane na poniższym wykresie (rys. 12): Rys. 12. Zmiana współczynnika lepkości krwi w zależności od temperatury. W wyniku naświetlania promieniowaniem laserowym, zmienił się nie tylko współczynnik lepkości, ale także charakter krzywej przedstawiającej zależność zmiany współczynnika lepkości ze wzrostem temperatury. Dla krwi nie naświetlanej (punkty, do których dopasowano krzywą), przyjmuje ona charakter eksponencjalny zgodnie ze wzorem (14). Natomiast dla krwi poddanej działaniu promieniowania laserowego, wyraźnie odbiega od tej zależności. Szczególnie duża różnica jest widoczna dla krwi naświetlanej przez 2 min., co odpowiadało dawce promieniowania: 0.42 J/cm3. Należy podkreślić, że zastosowana technika pomiarowa jest obarczona licznymi błędami pomiarowymi, które wynikają z niedokładności metody pomiarowej stosowanej w wiskozymetrze Hopplera. Zatem aby potwierdzić uzyskane rezultaty konieczne jest przeprowadzenie podobnych pomiarów z zastosowaniem innej metody pomiarowej np. wiskozymetru Hessa, który jest przeznaczony do pomiaru lepkości płynów ustrojowych. 50 W przeprowadzonych pomiarach za materiał doświadczalny służyła krew zdrowa. Interesujące wydaje się przeprowadzenie podobnych prób dla krwi, której parametry wykraczałyby poza standardowe normy. Krew zmieniona chorobowo posiada inne własności, w szczególności ma zmienioną lepkość. Pytanie brzmi czy w takim przypadku w wyniku naświetlania lepkość będzie nadal wzrastała, czy może efekt będzie odwrotny. Również zbadanie dynamiki obserwowanych efektów mogłoby dać interesujące informacje odnośnie tego, czy zmiany wywołane promieniowaniem laserowym zależą w jakiś sposób od czasu, który upłynął od naświetlania. A jeżeli tak, to dla jakich czasów i dawek obserwowany efekt będzie największy. Oczywiście należałoby też sprawdzić, czy podobne wyniki uzyskamy dla innych długości fal promieniowania laserowego, oraz różnych dawek. Są to problemy, którymi warto zająć się w przyszłości, aby móc wyciągnąć głębsze wnioski na temat obserwowanych efektów. 5.1.4. Wpływ promieniowania laserowego (780 nm, 70 mW) na elementy morfotyczne krwi. Ponieważ w badaniach opisanych w rozdz. 4.2.2. zaobserwowano efekt (zmianę lepkości), jaki wywołało niskoenergetyczne promieniowanie laserowe działające na krew, postanowiono zbadać, czy wpłynie ono także na składniki krwi - elementy morfotyczne. Zmiana lepkości krwi może być spowodowana zmianą potencjałów błonowych krwinek, bądź też ich gęstości, czy też zmianą masy i stężenia hemoglobiny, a także ewentualną zmianą kształtu samych krwinek. Ze względu na fakt, że głównym absorbentem w krwi, jest znajdująca się w erytrocytach hemoglobina, w poniżej przedstawionych badaniach dokonano analizy morfologicznej głównie czerwonych krwinek. Poniżej podane są normy fizjologiczne tych składników morfotycznych krwi, które oznaczono podczas pomiaru wpływu niskoenergetycznego promieniowania laserowego ( 780 nm, 70 mW ) na ludzką krew ustrojową: 51 HEMATOKRYT (Ht, HCT) Stosunek objętościowy erytrocytów do osocza krwi, określany jako % objętości krwinek w pewnej objętości krwi. NORMA: K 37-47%, M 40-54% , gdzie: K- kobieta, M. - mężczyzna . HEMOGLOBINA (Hb, HGB) Ilość barwnika krwi wiążącego tlen i dwutlenek węgla. Określana w gramach na 100 ml [g%] lub w milimolach na litr [mmol/l] NORMA: K 6.82-9.31 mmol/l (11.0-15.0 g%); M 7.45-10.55 mmol/l (12.0-17.0 g%). ERYTROCYTY (Krwinki czerwone - E, RBC) Erytrocyty dzięki swemu kształtowi i zawartości hemoglobiny służą wymianie gazowej (przenoszeniu tlenu i dwutlenku węgla). NORMY: Liczba: K 4.8 +/- 0.8 T/l (4.8 +/- 0.8 M/l); M 5.4 +/- 0.8 T/l (5.4 +/- 0.8 M/l), Średnia objętość w fl (MCV): 82 - 92 , Średnia masa Hb w pg (fmol) (MCH): 1.8 - 2.2 (27 - 31), Średnie stężenie Hb w % (mmol/l) (MCHC): 20 - 21 (32 - 34), Grubość w µm.:1.7 - 2.5 , Średnica w µm.: 6.0 - 9.0. TROMBOCYTY (Płytki krwi - T, PLT) Płytki krwi biorą udział w procesie hemostazy, krzepnięciu krwi, a także magazynują i transportują niektóre aminy (m.in. serotoninę). NORMA: (150 - 300) x109/l. LEUKOCYTY (Krwinki białe - L, WBC) Krwinki białe odgrywają bardzo ważną rolę w mechanizmach obronnych ustroju. NORMA: (4.0 - 10.0) x109/l. We krwi obwodowej znajduje się kilka rodzajów krwinek białych. Ich liczbę określa się zwykle w procentach (%) lub w wartościach bezwzględnych (x109/l): - granulocyty obojętnochłonne (neutrofile - NEUT): 40 - 70% ((1,8 - 7,7) x109/l), - granulocyty kwasochłonne (eozynofile - EOZN): 2 - 4 % ((0.12 - 0.32) x109/l), - granulocyty zasadochłonne (bazofile - BAZO): 0 - 0.5 % ((0.02 - 0.04) x109/l), - limfocyty (LYM): 20 - 45 % ((1.2 - 2.7) x109/l), - monocyty (MONO): 4 - 8 % ((0.24 - 0.28) x109/l). 52 Błąd pomiarowy poszczególnych wartości określono jako odchylenie od średniej, dla 3 do 5 pomiarów. Jeżeli wartości pomiaru przed i po naświetleniu wykraczały poza granicę błędu pomiarowego, wówczas określano ich zmianę procentową (rv). Znak plus przed tą wartością oznacza wzrost wartości danego elementu, a minus jej spadek. Poniższe tabele (Tab. 5, 6) przedstawiają uzyskane dane eksperymentalne dla czasów naświetlania 1 i 3 min, odpowiadającym dawkom 3,6 i 10,8 J/cm3. Próbki były naświetlane od góry i mieszane podczas naświetlania w celu uzyskania jednorodnego rozkładu zdeponowanej dawki. Obie serie pomiarowe prowadzono 53 dla różnych zestawów 5 próbek. K K M 2 3 4 5 4,5 - 29,03 29,13 +2,3 +1 210 181 207 177 268 - - - -0,8 -0,4 -0,8 -1,8 rv [%] -0,8 54 Tabela 5. Wyniki pomiarów analizy hematologicznej dla dawki 3,6 J/cm3. 33,83 34,6 33,46 33,8 274 - - +1,9 307 29,23 29,2 33,56 34,2 33,6 34,46 +2,6 - 5,23 5,19 4,59 4,57 4,54 4,33 4,25 28,83 29,1 - - - - 307 4,4 7,4 4,6 5,7 ai 4,50 4,46 bi - 4,4 7,46 4,63 5,63 rv [%] - 29,7 30,06 0,8 0,8 0,8 ai 5,93 6,03 bi PLT płytki krwi [x103/ml] bi ai rv [%] 232 227 - 3,6 3,6 3,6 0,8 V [ml] 0,8 RBC erytrocyty [x106/ml] MCH MCHC eryt/masa eryt/siężenie [pg] [g/dl] bi ai rv bi ai rv [%] [%] 29,13 29,36 - 33,63 34,43 +2,4 1 1 1 3,6 K 1 1 D tir [min] [J/cm3] M. 1 3,6 Nr Płeć WBC leukocyty [x103/ml] 15,2 13,43 13,1 HCT hematokryt [%], MCV erytr/obj [fl] - - - 86,2 -1,4 44,93 43,73 -2,7 85,83 84,46 -1,9 40,16 39,4 -1,9 87,4 39,03 38,2 -2,1 85,96 84,3 -1,9 38,3 37,03 -3,3 88,46 87,13 -1,6 Gdzie: - K- kobieta, - M.- mężczyzna, - tir - czas naświetlania, - D – dawka, - V - objętość próbki, - ai – przed naświetlaniem, - bi – po naświetlaniu. 15,13 13,3 13,1 - rv bi ai rv bi ai rv [%] [%] [%] 13,33 - 39,03 38,13 -2,3 86,7 85,37 -1,5 ai 12,866 12,76 13,13 bi HGB hemoglobina [g/ml] K K M 2 3 4 5 - 29,03 29,2 +1 210 181 213 180 266 - - - -2,4 - -0,6 - rv [%] -0,5 55 Tabela 6. Wyniki pomiarów analizy hematologicznej dla dawki 10,8 J/cm3. 33,83 34,16 33,46 33,83 +1,1 +1,3 274 - 34 - 29,23 29,43 33,56 310 - 33,6 33,76 +0,5 5,1 PLT 5,23 28,83 28,96 - 4,59 4,58 4,54 4,51 4,33 4,33 307 4,46 - - - ai 4,50 4,48 bi - 4,4 7,46 7,43 4,63 4,56 5,63 5,63 rv [%] - 29,7 39,73 1 1 1 ai 5,93 6,06 bi płytki krwi [x103/ml] bi ai rv [%] 232 216 - 10,8 10,8 10,8 1 V [ml] 1 RBC erytrocyty [x106/ml] MCH MCHC eryt/masa eryt/siężenie [pg] [g/dl] bi ai rv bi ai rv [%] [%] 29,13 29,23 - 33,63 33,93 +0,9 3 3 3 10,8 K 1 3 D tir [min] [J/cm3] M. 3 10,8 Nr Płeć WBC leukocyty [x103/ml] 15,2 13,43 13,1 12,866 13,13 bi MCV erytr/obj [fl] - - - - 44,93 43,6 -2,9 85,83 85,46 -0,4 40,16 39,86 -0,7 87,4 86,93 -0,5 39,03 38,43 -1,5 85,96 85,16 -0,9 38,3 37,13 -0,4 88,46 88,06 -0,4 rv bi ai rv bi ai rv [%] [%] [%] - 39,03 38,6 -1,1 86,7 86,93 -0,6 HCT hematokryt [%], Gdzie: - K- kobieta, - M.- mężczyzna, - tir - czas naświetlania, - D – dawka, - V- objętość próbki, - ai – przed naświetlaniem, - bi – po naświetlaniu. 14,9 13,5 13,06 12,9 13,1 ai HGB hemoglobina [g/ml] Z analizy powyższych tabel (Tab. 5, 6) wynika, że promieniowanie laserowe spowodowało około 2 - 3% obniżenie hematokrytu. Zmiana poziomu zawartości hematokrytu w wyniku naświetlania poszczególnych próbek niskoenergetycznym promieniowaniem laserowym (λ = 780 nm, P = 70 mW, D = 3.6 J/cm3) została zobrazowana graficznie na poniższym wykresie (rys. 13): 46% 44% 42% 40% kontrola po naświetlaniu 38% 36% 34% 32% 1 2 3 4 5 Rys. 13. Zmiana poziomu hematokrytu w wyniku naświetlania przez 1 min (D = 3,6 J/cm3). Zmiana poziomu zawartości hematokrytu w wyniku naświetlania zwiększoną promieniowania laserowego (λ = 780 nm, P = 70 mW, D = 10.8 J/cm3) jest przedstawione na rys. 14.. 46% 44% 42% kontro la 40% po naśw ietlan iu : D = 10,8 J/cm3 38% 36% 34% 1 2 3 4 5 Rys. 14. Zmiana poziomu hematokrytu w wyniku naświetlania przez 3 min (D = 10,8 J/cm3). W obu przypadkach odnotowano spadek poziomu hematokrytu, czyli zmalała objętość erytrocytów w stosunku do pełnej krwi, choć nie wykroczyła poza normę. Jest to zgodne z 57 dotychczasowymi doniesieniami literaturowymi [95, 96]. Jednak efekt dla większej gęstości energii promieniowania jest wyraźnie słabszy, co mogłoby potwierdzić tezę, że małe dawki promieniowania powodują większy efekt. Dla tych samych próbek odnotowano nieznaczny wzrost średniego stężenia hemoglobiny w erytrocycie. Poniższy wykres (rys. 15) ilustruje zmianę MCHC pod wpływem niskoenergetycznego promieniowania laserowego (λ = 780 nm, P =70 mW, D = 3,6 J/cm3): 34,2 34 33,8 kontrola po naświetlaniu 33,6 33,4 33,2 33 1 2 3 4 5 Rys. 15. Zmiana średniego stężenia hemoglobiny w wyniku naświetlania ( D = 3,6 J/cm3). Z kolei dla większej dawki, zmiana średniego stężenia hemoglobiny w erytrocycie pod 70 mW, D = 10,8 J/cm3) wpływem promieniowania laserowego (λ = 780 nm, P = zmieniała się tak, jak to przedstawia poniższy wykres (rys. 16): 3 4 ,8 3 4 ,3 3 3 ,8 k o nt ro la 3 3 ,3 po na ś w ie t la niu 3 2 ,8 3 2 ,3 1 2 3 4 5 Rys. 16. Zmiana średniego stężenia hemoglobiny w wyniku naświetlania ( D = 10,8 J/cm3). 58 W tym przypadku również widać wyraźny spadek obserwowanych zmian wraz ze wzrostem dawki promieniowania. Kolejnym elementem, który uległ zmianie w wyniku naświetlania jest średnia masa hemoglobiny w erytrocycie (rys. 17). 88,5 88 87,5 87 86,5 kont rola 86 po naświetlaniu D = 3,6 J/cm3 85,5 85 84,5 84 1 2 3 4 5 Rys. 17. Zmiana średniej masy hemoglobiny w wyniku naświetlania ( D = 3,6 J/cm3). Dla większej dawki zmiana średniej masy hemoglobiny w erytrocycie przedstawiała się jak na rys. 18, a więc większej dawce odpowiadają wyraźnie mniejsze zmiany. 88,5 88 87,5 87 86,5 kont rola 86 po naświetlaniu D = 10,8 J/cm3 85,5 85 84,5 84 1 2 3 4 5 Rys. 18. Zmiana średniej masy hemoglobiny w wyniku naświetlania ( D = 10,8 J/cm3). 59 Odnotowano również zmianę poziomu czerwonych krwinek w wyniku naświetlania (λ = 780 nm, P = 70 mW, D = 3.6 J/cm3) (rys. 19). 5,4 5,2 5 4,8 kont rola 4,6 po naświetlaniu D = 3,6 J/cm3 4,4 4,2 4 1 2 3 4 5 Rys. 19. Zmiana poziomu erytrocytów w wyniku naświetlania ( D = 3,6 J/cm3). Spadek poziomu czerwonych krwinek wydaje się być następstwem zmniejszenia się poziomu hematokrytu. Dużo mniejsze zmiany poziomu czerwonych krwinek w wyniku naświetlania odnotowano dla większej dawki: 10,8 J/cm3: 5,4 5,2 5 4,8 kontrola 4,6 po naświetlaniu D = 10,8 J/cm3 4,4 4,2 4 1 2 3 4 5 Rys. 20. Zmiana poziomu erytrocytów w wyniku naświetlania ( D = 10,8 J/cm3). 60 Analizując przedstawione powyżej wykresy, które obrazują efekty jakie wywołało promieniowanie laserowe na erytrocyty, można powiedzieć, że największe zmiany zachodziły dla hematokrytu. Należy zauważyć, że obserwowane zmiany systematycznie zmniejszały się wraz ze wzrostem dawki. Charakterystyki pozostałych elementów zamieszczonych w Tab.5 i 6, dawały znacznie mniejszy efekt nie wykraczający poza granicę błędu. Opisane w niniejszej pracy badania stanowią wstępny etap szerszego programu. Potwierdziły już jednak fakt wywoływania zmian w komórkach krwi przez naświetlanie światłem laserowym i niektóre wcześniejsze doniesienia [96, 97, 110]. Ponieważ w wyniku naświetlania zaobserwowano efekt wywołany przez promieniowanie laserowe (zmiany np. poziomu hematokrytu), kolejnym pytaniem, które się nasuwa jest to, czy zmiany te mają charakter dynamiczny, a więc obserwowane zmiany zależą od czasu jaki upłynął od momentu absorpcji promieniowania. Żeby odpowiedzieć na to pytanie wykonano doświadczenie, w którym trzy próbki (nr 74, 75, 76) poddano naświetlaniu promieniowaniem laserowym (tnaś =1 min), a następnie wykonano analizę hematologiczną w następujących odstępach czasu: 1, 30, 60, 90 min. po naświetlaniu. Próbki były naświetlane tak, jak poprzednio (od góry probówki i mieszanie podczas naświetlania). Poniższa tabela (Tab. 7) przedstawia uzyskane dane eksperymentalne: 61 10,9 11,2 11,03 8,3 ( 0,1) 8,6 8,9 9,2 9 7,5 (0,2) 7,4 7,3 7,4 7,3 30 min. 60 min. 90 min. Kontrola 30 min. 60 min. 90 min. Kontrola 30 min. 60 min. 90 min. 5,38 5,38 5,97 5,33 (0,03) 5,4 4,49 4,51 4,53 5,31 (0,02) 4,57 3,77 3,8 3,79 6,35 (0,03) 6,48 15,87 15,9 15,8 15,9 (0,01) 16 13,4 13,3 13,3 16,3 (0,06) 13,3 11,5 11,6 11,8 19,4 (0,1) 20,1 46,8 47 47 47,7 (0,42) 47,3 39,9 40,2 40,3 47,9 (0,15) 40,7 34,4 34 34,8 58,7 (0,21) 58,8 87 87,2 87,5 88,5 (0,35) 87,5 88,8 89,3 89 90,2 (0,15) 89,1 91,4 91,2 91,3 92,4 (0,2) 91,1 29,4 29,5 29,2 29,5 (0,2) 19,8 29,7 29,6 29,5 30,7 (0,06) 29,4 30,4 30,4 30,9 30,5 (0,4) 31,1 33,8 33,9 33,4 33,3 (0,31) 34,2 33,5 33,2 33 34 (0,7) 32,4 33,2 33,4 33,7 33 (0,35) 34,0 134 138 135 139 (5,1) 145 325 321 311 238 (4,2) 311 318 322 309 116 (3,6) 128 MCH MCHC PLT ERYT/ ERYT/S PŁYTKI MASA T. KRWI [PG] [G/DL] [X103/M L] 24,8 24,7 27,6 27,9 (0,8) 26,9 19,4 18,4 18,6 18,8 (0,3) 18,8 16,8 17,3 17,6 13 11,9 12,5 8,9 (1,26) 10,8 8,4 7,6 6,8 6,4 (0,42) 6,2 13 13,1 12,5 62,2 62,4 59,9 64,2 (0,12) 62,3 72,2 74,1 74,8 74,5 (0,47) 75,3 70,2 69,6 69,9 62 1,8 1,83 2 2,1 (0,06) 1,9 1,7 1,7 1,7 1,6 (0,06) 1,6 1,86 1,93 1,95 LYM MONO NEUT LYM % % % [X103/ LIM MONO- NEUT ML] FO- CYTY ROCYT FILE Y 20,2 6 74,1 1,2 (0,3) (0,15) (0,2) (0,1) 21,5 8,5 69,7 1,1 Tabela 7. Wyniki pomiarów hematologicznych określające dynamikę efektów wywołanych promieniowaniem laserowym. 1 min. 1 min. 1 min. 5,7 ( 0,2) 5,4 Kontrola WBC RBC HGB HCT MCV LEUKOC ERYTRO HEMOGLO HEMATO ERYTR YTY CYTY BINA KRYT [%] /OBJ [X103/M [X106/M [G/ML] [FL] L] L] Z analizy przedstawionych powyżej danych wynika, że pod wpływem naświetlania próbek promieniowaniem laserowym wzrosła liczba białych krwinek, co może być spowodowane namnażaniem się limfocytów i eozynofili. Zaobserwowano także zmianę tego efektu wraz z czasem jaki upłynął od chwili naświetlania, co zostało przedstawione na rysunku poniżej (rys. 21): 9,5 9 8,5 8 7,5 7 6,5 1 m in. kontrola 75 30 m in. próbka nr 75 60 m in. kontrola 76 90 m in. próbka nr 76 Rys. 21. Zmiana liczby białych krwinek pod wpływem naświetlania promieniowaniem laserowym (780nm, 70 mW), w funkcji czasu jaki upłynął od naświetlania Zaobserwowano również podwyższenie poziomu poszczególnych grup białych krwinek. Szczególnie dużą zmianę odnotowano w przypadku monocytów. Efekt ten zmieniał się systematycznie z czasem, jaki upłynął od momentu naświetlania, co zostało przedstawione na rys. 22.. Analiza wykresów (rys. 21, 23, 24) pokazuje duży rozrzut wyników dla poszczególnych próbek (np. wyniki dla próbki 75 bardzo różnią się od próbki 76) jest to spowodowane zarówno stanem zdrowia dawcy, jak i danymi cechami osobniczymi. 65 14% 12% kontrola 10% 1 min.po naświetlaniu 8% 30 min. po naświetlaniu 6% 60 min. po naświetlaniu 4% 90 min po naświetlaniu 2% 0% próbka nr 75 próbka nr 76 Rys. 22. Zmiana względnej liczby odsetkowej monocytów pod wpływem światła laserowego, w funkcji czasu jaki upłynął od naświetlania. Zaobserwowane zmiany mogą świadczyć o wpływie promieniowania laserowego na wzrost proliferacji leukocytów, w szczególności limfocytów, jak i monocytów. Doniesienia literaturowe na ten temat zostały przedstawione w rozdz. 3.2.1. i potwierdzają zaobserwowane przez nas efekty. Natomiast w przypadku czerwonych krwinek (podobnie jak w wcześniejszych badaniach) zaobserwowano nieznaczne obniżenie się ich poziomu, co ilustruje poniższy wykres (rys. 23): 5 ,8 5 ,6 5 ,4 5 ,2 5 4 ,8 4 ,6 4 ,4 4 ,2 1 min. kon tro la 75 3 0 min. p ró b ka n r 75 6 0 min. kon tro la 76 9 0 min. p ró b ka n r 76 Rys. 23. Zmiana poziomu czerwonych krwinek pod wpływem naświetlania, w zależności od czasu jaki upłynął od naświetlania. 66 Wyniki te są skorelowane z zaobserwowanym spadkiem poziomu hematokrytu (rys. 24): 55% 50% kontrola 1 min po naświetlaniu 30 min. po naświetlaniu 60 min po naświetlaniu 90 min.po naświetlaniu 45% 40% 35% 30% próbka nr 75 próbka nr 76 Rys. 24. Zmiana poziomu hematokrytu pod wpływem światła laserowego, w funkcji czasu jaki upłynął od naświetlania. Zmiany te mogłyby być rezultatem częściowej hemolizy erytrocytów, ale to byłoby sprzeczne z wynikami uzyskanymi przy użyciu mikroskopii sił atomowych i brakiem występowania efektów termicznych w przypadku stosowanego promieniowania. Inną przyczyną mogłaby być błędna analiza hematologiczna, wynikająca z stosowanej metody pomiarowej. Niedokładność ta może wynikać ze zmiany właściwości elektrycznych krwi po naświetlaniu, co mogłoby wpłynąć na warunki pomiaru aparatu Sysmex KX21, którego metoda pomiarowa opierała się na pomiarze konduktometrycznym. Należy uwzględnić te czynniki, aby ustrzec się przed wyciąganiem zbyt daleko idących wniosków. Należy zauważyć, że wielkość i intensywność obserwowanych zmian wywołanych promieniowaniem laserowym zależała od stanu zdrowia dawcy, od którego pochodziła krew wykorzystywana w badaniach. Jako przykład niech posłużą przedstawione poniżej wyniki uzyskane dla próbki nr 74, której parametry kontrolne wykazywały znaczne odchylenia od dopuszczalnej normy (rys. 25): 67 poziom poszczególnych składników krwi[j.w.] kontrola 1 min po naświetlaniu 30 min. ponaświetlaniu 1 godz. ponaświetlaniu 1,5 godz. ponaświetlaniu LYM% 20 MXD% 15 WBC NEUT 10 RBC 5 LYM MXD 5 6 0 0 1 2 3 4 7 8 elementy morfotyczne krwi Rys. 25. Zmiana wybranych elementów morfotycznych krwi, dla próbki nr 74, w wyniku naświetlania promieniowaniem laserowym. Z analizy tego wykresu (rys. 25) wynika, że w wyniku naświetlania promieniowaniem laserowym zaobserwowano bardzo duży (nawet o czynnik 1,2) wzrost poziomu leukocytów, monocytów i neutrofili, co może świadczyć o uaktywnieniu odpowiedzi immunologicznej w przypadku krwi zmienionej chorobowo. Również inne parametry krwi w tej próbce uległy znacznym modyfikacją, co przedstawiono na rysunku (rys. 26). Wyniki te wskazują również, że maksymalne zmiany obserwowane są po 30 – 90 min od naświetlania. 68 PLT 350 poziom elementów krwi [j.w.] 300 250 kontrola 1 min po naświetlaniu 30 min. po naświetlaniu 1 godz. po naświetlaniu 1,5 godz. po naświetlaniu 200 150 NEUT% HCT 100 50 0 0 1 2 3 4 elementy morfotyczne krwi Rys. 26. Zmiana wybranych elementów morfotycznych krwi, dla próbki nr 74, pod wpływem promieniowania laserowego. Podsumowywując wyniki badań wpływu promieniowania laserowego na parametry krwi ludzkiej, można wyciągnąć następujące wnioski: • w wyniku naświetlania zaobserwowano wyraźny wpływ promieniowania na elementy morfotyczne krwi, • odnotowano zmiany takich parametrów jak: hematokryt, poziom leukocytów, czerwonych krwinek, średniej masy i stężenia hemoglobiny w erytrocycie, • zaobserwowano dynamikę obserwowanych efektów, taką że maksymalne zmiany po 30 - 90 min. • zarejestrowano zmianę wielkości obserwowanych efektów, od stanu naświetlanej krwi (czy była zmieniona chorobowo), • konieczne jest przeprowadzenie podobnych badań dla większej liczby dawek, w celu znalezienia dawki optymalnej, a także dla większej liczby próbek, w celu oceny rozrzutu wyników otrzymanych z różnymi próbkami. 69 5.1.5. Badanie struktury erytrocytów poddanych działaniu niskoenergetycznego promieniowania laserowego (780 nm, 70 mW), przy użyciu mikroskopii sił atomowych -AFM (Atomic Force Microscopy). Mikroskopia skaningowa jest metodą obrazującą to co się dzieje na powierzchni ciała stałego, czy też układu biologicznego. Mikroskop sił pozwala na osiągnięcie atomowej zdolności rozdzielczej. Ideą mikroskopii skaningowej jest skanowanie powierzchni przez wprowadzenie odpowiednio małego ostrza (ang. tip) umieszczonego na ramieniu elastycznym, oraz badanie zmian danej wielkości fizycznej np. siły oddziaływania ostrza z materiałem próbki. AFM (Mikroskopia Sił Atomowych). Mierzy siły pomiędzy atomami ostrza i atomami (cząsteczkami) badanego, elektrycznie obojętnego obiektu. W szczególności pozwala na obserwację żywych komórek w ich naturalnym środowisku. Możliwa jest tutaj praca w trzech modach: a) kontaktowym - ostrze styka się z powierzchnią ze stałą siłą. b) bezkontaktowym - ostrze przesuwa się nad próbką c) „tapping mode” – czyli w tzw. modzie dziobiącym. Opisane w niniejszej pracy pomiary wykonano w Zakładzie Fizyki Doświadczalnej IF UJ korzystając z mikroskopu pracującego w modzie kontaktowym. • Konstrukcja obrazu w modzie kontaktowym (rys. 28): W modzie kontaktowym odległość ostrza od próbki wynosi mniej niż kilka angstremów, a działające siły mają charakter odpychający. Rys. 28. Schemat tworzenia obrazu w modzie kontaktowym. 70 Do detekcji ugięcia ramienia stosuje się pomiar odchylenia światła laserowego odbitego od jego powierzchni. Skanowanie odbywa się linia po linii, złożenie sygnałów od poszczególnych linii daje obraz dwuwymiarowy. W niniejszej pracy wykorzystano mikroskopię sił do zbadania kształtu erytrocytów i charakteru ich błony, po poddaniu ich działaniu promieniowania laserowego. Naświetlano jednakowe objętości krwi (do 1-2 ml) przez: 0.5, 1, 3, 5, 10 i 60 min. Zmieniano także odległość lasera od probówki, co umożliwiło stosowanie różnych gęstości mocy promieniowania. Uzyskane dawki promieniowania były porównywalne z tymi, które stosowano zarówno w pomiarze zmian lepkości, jak i analizy hematologicznej. Zbadano zarówno erytrocyty pochodzące z tzw. masy krwi (która była wykorzystywana do pomiaru lepkości), jak i te uzyskane w wyniku wirowania krwi pełnej. Po naświetlaniu uzyskano 10 próbek, z czego z każdej przygotowano po trzy preparaty, które następnie oglądano przy pomocy mikroskopu sił atomowych. Dla każdego preparatu dokonano analizy statystycznej kształtu i wielości erytrocytu, oraz ukształtowania błony. Na podstawie przeprowadzonych badań nie stwierdzono zmian kształtu i rozmiarów erytrocytów w wyniku naświetlania promieniowaniem laserowym. Średnica erytrocytów mieściła się w granicach normy i nie przekraczała wartości od 6 do 8 m. Natomiast ich grubość wahała się w przedziale od 1,6 do 2,6 m. Poniższy rysunek (Rys. 29) przedstawia obraz erytrocytu uzyskany metodą skaningowej mikroskopii sił, dla próbki naświetlanej 1 min i o zdeponowanej dawce objętościowej 3 J/ml. 71 Rys. 29. Obraz erytrocytu poddanego naświetlaniu promieniowaniem laserowym: tnaś = 1 min, D = 3 J/ml. Natomiast jeżeli chodzi o badanie wpływu promieniowania laserowego na błonę erytrocytów, zaobserwowano pofalowanie jej struktury, czego nie można jednak traktować jako reguły i nie pozwala na wyciągnięcie bardziej precyzyjnych wniosków. Wydaje się, że w wyniku naświetlania mogły się zmienić własności elektryczne błony (jej ładunek), co potwierdzają też inni badacze. Byłoby to w jakimś sensie wytłumaczeniem zaobserwowanego zjawiska, polegającego na zwiększonym osadzaniu się cząsteczek utrwalacza i zanieczyszczeń na błonie, w porównaniu z próbką kontrolą. Efekt ten występował w ok. 80% badanych przypadków. Jeżeli rzeczywiście w wyniku naświetlania uległ zmianie potencjał błonowy, a co za tym idzie własności adhezyjne błony, to dalsze badania powinny wyjaśnić, czy naświetlanie wpłynie na aktywność enzymów błonowych w szczególności ATPaz, które zmieniają przepuszczalność błony i regulują procesy metaboliczne. Ponieważ dla małych dawek promieniowania laserowego nie zaobserwowano żadnych zmian kształtu erytrocytów, znacznie zwiększono czas naświetlania – do godziny (przy mocy 30 mW). W wyniku dużej dawki erytrocyty zaczęły się odkształcać. Około 70% uległo znacznym zmianą prowadzącym do formy charakteryzującej się licznymi wypustkami (echinocyt), 20% procent miało niewielkie pojedyncze wypustki, a 10% nie odbiegała od kontroli. 72 Opisane wyniki ilustruje poniższy rysunek (Rys. 30): a) Populacja 10%-towa (obraz 3 i 1D) b) Populacja 20%-towa (obraz 3 i 1D). c) Populacja 80%-towa (obraz 3 i 1D). Rys. 30. Obrazy erytrocytów naświetlanych (1 godz.) promieniowaniem laserowym: a) brak zmian kształtu, b) nieznaczne wypustki, c) forma echinocytu. 73 Uzyskane wyniki pozwalają wyciągnąć wniosek, ze niskoenergetyczne promieniowanie laserowe nie powoduje zmian kształtu erytrocytów i ich błony. Należy pamiętać, ze stosowana preparatyka pozwalała na utrwalenie wewnętrznego szkieletu białkowego erytrocytu, a przecież zewnętrzna błona jest dwuwarstwą lipidową. Zatem celowe byłoby dla lepszego zobrazowania samej błony zastosowanie innej preparatyki, umożliwiającej jej dokładną analizę. Również zastosowanie szerszego zakresu dawek promieniowania i zbadanie dynamiki ewentualnych efektów dałoby pełniejszy obraz sytuacji. Ciekawe byłoby zbadanie erytrocytów poddanych działaniu promieniowania o innej długości fali, szczególnie lasera He-Ne, który trafia bezpośrednio w pasmo absorpcyjne dla hemoglobiny będącej najliczniejszym składnikiem erytrocytów. 74 5.1.6. Wnioski: Przeprowadzone badania w zakresie badania wpływu promieniowania laserowego na parametry krwi miały orientacyjny, jakościowy charakter. Materiał badawczy został wybrany ze względu na kluczową rolę jaką odgrywa krew w naszym organizmie. W wyniku naświetlania niskoenergetycznym promieniowaniem laserowym zaobserwowano 3,5 - 5,5% wzrost lepkości krwi. Pomiar zależności lepkości od temperatury wskazuje, na zmianę nie tylko wartości lepkości, ale i charakteru tych zmian. Również pomiary elementów morfotycznych krwi poddanej naświetlaniu promieniowaniem laserowym wykazały, że wywołuje ono zmiany ich wartości. Największe zmiany odnotowano dla poziomu hematokrytu i białych krwinek Przeprowadzone badania przy pomocy skaningowej mikroskopii sił pokazują, że promieniowanie laserowe o długości fali 780 nm i mocy do 70 mW nie powoduje zmian w kształcie i rozmiarach erytrocytów. Nie zaobserwowano też zauważalnej zmiany charakteru, czy uszkodzenia ich błony. W oparciu o uzyskane wyniki eksperymentalne można wysnuć wniosek, że stosowane w doświadczeniach promieniowanie laserowe wpływa na zmianę własności krwi. Interpretacja tych wstępnych wyników jest jednak problematyczna ze względu na mnogość procesów biochemiczno - fizycznych, które mogą towarzyszyć procesom absorpcji promieniowania przez komórki krwi. Konieczne jest więc przeprowadzenie dodatkowych badań w zakresie wpływu promieniowania na aktywność różnego rodzaju enzymów (w szczególności ATPaz błonowych), które są odpowiedzialne za przebieg procesów komórkowych. 75 5.2. Wpływ niskoenergetycznego promieniowania laserowego (780 nm, 70 mW) na plemniki buhaja: Gdyby niskoenergetyczne promieniowanie laserowe miało bezpośredni wpływ na ruchliwość i reakcje akrosomalne plemników, to mogłoby ono być wykorzystywane do poprawy wydajności hodowli zwierząt hodowlanych. Było to jednym z czynników inspirujących do przeprowadzenia współpracy z Panem poniższych badań, które wykonano we dr M. Godlewskim, Panią dr T. Kwiecińską, Panią dr D. Wierzuchowską, Panią mgr B. Szczęśniak-Fabiańczyk, Panem dr P. Gogolem w Instytucie Zootechnologii, Balice. Jak wspomniano w rozdz. 3.2.3, za jednen z możliwych mechanizmów wyjaśniających stymulację, bądź hamowanie procesów komórkowych, uważa się indukowane promieniowaniem laserowym uwalnianie jonów Ca2+. Promieniowanie laserowe wzmacnia elektrochemiczny trans-błonowy gradient protonowy w mitochondriach. To z kolei podnosi wydajność siły protono - motorycznej i zwiększa uwalnianie wapnia z mitochondriów do cytoplazmy [203, 241]. Wykazano, że niskoenergetyczne promieniowanie laserowe z zakresu czerwieni (He-Ne: 628 nm) i bliskiej podczerwieni (780 nm, 805 nm), zwiększa uwalnianie jonów Ca+ i syntezę ATP również w komórkach plemnikowych buhaja. Wpływa to na zwiększenie ich zdolności do zapłodnienia oraz czasu życia po rozmrożeniu, co odgrywa istotną rolę w ewentualnej infertelizacji [243-247]. Oprócz wzmożonego uwalniania jonów wapnia, zaobserwowano wzrost formowania się rodników grupy ROS (Reactive Oxygen Species) w wyniku fotowzbudzenia. Może to wynikać ze zwiększenia aktywności reakcji redoks łańcucha oddechowego, albo z pobudzenia aktywności NADPH w błonie komórkowej. Duża koncentracja ROS prowadzi do śmierci komórki, co wykorzystuje się w terapii fotodynamicznej. Natomiast stosunkowo mała koncentracja ROS odgrywa kluczową rolę w stymulacji procesów komórkowych [108, 150, 207, 221]. W przypadku komórek plemników, ROS takie jak: H*+, OH*-, NO*- powodują aktywację spermy, wzrost ruchliwości, pobudzenie reakcji akrosomalnych [219, 245, 246]. Niniejsza praca ma na celu sprawdzenie tych efektów in vitro dla promieniowania bliskiej podczerwieni (780 nm, 70 mW). 76 5.2.1. Materiały i metody: Źródło światła: Laser diodowy (Sanyo DL7140-210) opisanych w rozdz. 4. Obiekt badań: Materiałem do przeprowadzonych badań było mrożone nasienie byków. Odpowiadało ono jakościowo typowemu nasieniu używanemu do sztucznego unasieniania. Pochodziło z Banku Materiałów Biologicznych Instytutu Zootechniki w Balicach. W doświadczeniu wykorzystano mrożone nasienie byków: • VITAMIN określono ruchliwość przed zamrożeniem na 65%, • FROST określono ruchliwość przed zamrożeniem na 60%. Odczynniki: Do przygotowania roztworów używanych do badań wykorzystano odczynniki produkowane przez POCH Gliwice oraz firmę Sigma. Roztwór buforowy PBS pochodził z firmy: Gibco Life Technologies Ltd., Palsley, Scotland. Użyte do testu RZW i eozyna-nigrozyna pochodziły z firmy Molecular Probes. Przygotowanie materiału: Rozmrożono po 15 próbek nasienia, następnie: • rozrzedzono przez dodanie 30 ml roztworu PBS, • wirowano roztwór (10 min, 600 g), • zdjęto nadsącz, • do pozostałego osadu dodano 30 ml PBS, • wirowano (10 min, 600 g), • zebrano nadsącz, Uzyskany w ten sposób osad: • rozcieńczono w przypadku VITAMINA w 7 ml roztworu PBS, otrzymano nasienie o koncentracji 23 x 10 6/cm3. • w przypadku FROSTA odwirowano drugi nadsącz i osad rozcieńczono roztworem PBS do 4 ml; uzyskano w ten sposób nasienie o koncentracji 17 x 10 6/ cm3. Plemniki przygotowane do badań w przedstawiony powyżej sposób, wstawione były do łaźni wodnej i inkubowane w temperaturze 380C. 77 Określenie koncentracji: Koncentracje obliczano w komorze Burkera [255]. Jako błąd pomiaru przyjęto odchylenie standardowe pojedynczego pomiaru (mieści się w granicach: 6-10%). Ostateczna koncentracja badanych próbek mieściła się w przedziale: 30-50x106 komórek /ml. Określenie ruchliwości: Ruchliwość plemników oceniana była subiektywnie przez obserwację mikroskopową jako procent ruchliwości ogólnej (niepewność pomiaru: 5%). Określenie wskaźnika RZW: Procentowy wskaźnik Receptorowej Zdolności Wiązania (RZW) specyficznych barwników błonowych wyliczono na podstawie oceny rozmazów barwionych różnicowo wg Bloma eozyną-nigrozyną [255]. Dokładność w granicach: 12-28% przy zliczaniu 200 komórek. Pomiar widma absorpcji: Zebrano widmo absorpcji dla obu rodzajów nasienia przy użyciu spektrofotometru. Ze względu na bardzo silne rozproszenie, nie było możliwe stosowanie pomiaru natężenia wiązki transmisyjnej, co jest standardową metodą pomiarów absorpcji ośrodków jednorodnych. Konieczna była integracja natężenia rozproszonego w pełny kąt bryłowy przez tzw. kulę Ulbrichta dla znalezienia odpowiedniej poprawki natężenia transmisji. Pomiary te przeprowadzono w pracowni Cienkich Warstw IF UJ przy udziale Pana mgr J. Olejniczaka. Poniższe wykresy (rys. 32, 33) przedstawiają uzyskane widma dla Vitamina i Frosta: 78 Transmisja Vitamin w PBS 2ml + 1ml PBS 21 T [%] 20 19 18 17 16 600 650 700 750 800 850 900 λ [nm] Rys. 32. Widmo transmisji z korekcją na rozpraszanie dla próbki Vitamin. 19 Transmisja kom. Frost (2.5ml + 1ml PBS) 18 T [%] 17 16 15 14 13 600 650 700 750 800 850 900 950 λ [nm] Rys.33. Widmo transmisji z korekcją na rozpraszanie dla próbki Frost. Przed rozpoczęciem naświetlania została oszacowana ruchliwość plemników: • VITAMIN - 50% • FROST - 40%. 79 Technika naświetlania: Uzyskane nasienie obu rodzajów podzielono na osiem próbek o objętości 1ml każda, z czego dwie potraktowano jako kontrolne (nie poddano naświetlaniu). Dla poszczególnych próbek zmieniano czasy naświetlania i gęstość mocy promieniowania zmieniając odległość między próbką a diodą laserową. Próbki były naświetlane od góry przez: 1, 2, 4 i 60 min (naświetlanie ciągłe w łaźni wodnej) w odległościach: 2 i 4 cm od dna probówki (rys 34). Rys. 34. Schemat układu stosowanego podczas naświetlania. Po naświetleniu były wkładane do łaźni wodnej, a następnie po upływie: 1, 2 i 3 godz. określano ich ruchliwość, oraz przeprowadzano test żywe/martwe. 5.2.2. Wyniki przeprowadzonych pomiarów. W przeprowadzonych badaniach, określano wpływ niskoenergetycznego promieniowania laserowego (780 nm, 70 mW) na plemniki byka na podstawie zmian ich ruchliwości i żywotności (test żywe/martwe). Parametry wyjściowe plemników określone przed naświetlaniem: • ruchliwość: Vitamin - 50%, Frost - 40%, • procentowa zawartość komórek żywych: Vitamin - 71%, Frost - 70%. 80 Test żywe/martwe był przeprowadzony dla wszystkich próbek. Za każdym razem liczbę żywych komórek określały niezależnie trzy osoby, a ostateczny wynik jest średnią tych obserwacji. Za błąd przyjęto odchylenie standardowe średniej. Natomiast ruchliwość plemników szacowano jakościowo metodą mikroskopową (niepewność pomiaru 5%). Ocenę obu parametrów dokonywano kolejno po: 1, 2 i 3 godz. od naświetlania. Ze względu na subiektywność oceny, wydaje się, że metody oceny zarówno ruchliwości, jak i żywotności komórek są obarczone błędem większym niż 5%. Analiza otrzymanych wyników wykazała, iż niskoenergetyczne promieniowanie laserowe powoduje niewielkie zmiany ruchliwości plemników. Jedynie dla próbki poddanej przez godzinę ciągłemu naświetlaniu, zaobserwowano kilku procentowy wzrost tego parametru w stosunku do próby kontrolnej. Wydaje się, że zastosowanie innej, obiektywnej metody oceny ruchliwości (np. cytometrii), mogłoby wpłynąć na poprawę jej dokładności, a co za tym idzie umożliwiło bardziej ścisłą interpretację wyników. W przypadku badania zmian żywotności plemników poddanych działaniu promieniowania laserowego, obserwowane zmiany są bardziej widoczne. Błąd pomiarowy w tej metodzie wahał się od wartości 0,5% do 2%. Procentowe zmiany ruchliwości odnotowano w trzech próbach: • Vitamin (próbka nr. 2) - naświetlany 2 min, 2 cm od dna probówki, • Vitamin (próbka nr.3) - naświetlany ciągle przez godzinę w łaźni wodnej, • Frost (próbka nr.5) - naświetlany 2 min, 4 cm od dna probówki. W przypadku Vitamina oceny żywotności dokonywano po 1 i 2 godz. od naświetlenia. Natomiast próbki zawierające komórki Frosta oceniano po upływie 1,2 i 3 godz. od naświetlania. Pomiary przeprowadzane w coraz dłuższych odstępach czasowych, miały na celu zbadanie dynamiki ewentualnych efektów, które miało wywoływać niskoenergetyczne promieniowanie laserowe. Zaobserwowane zmiany żywotności zostały przedstawione na poniższym wykresie (rys. 35): 81 80% 75% Nr 5 70% kontrol 65% dawka - 4,2 J/cm3 dawka - 2,6 J/cm3 60% 55% 50% 45% 40% 1h Vitamin 1h Frost 2h Vitamin 2h Frost Rys. 35. Zmiana żywotności komórek plemników poddanych działaniu promieniowania laserowego w porównaniu z grupą kontrolną. Z analizy powyższego wykresu wynika, że promieniowanie laserowe powoduje w komórkach plemników byka wzrost ich żywotności od 5 do 13%. w stosunku do grupy kontrolnej. Należy też zwrócić uwagę na zmianę dynamiki tego efektu ze wzrostem czasu jaki upłynął od naświetlenia. Dla próbki nr.5 poddanej naświetleniu, obserwano wyraźne podwyższenie liczby żywych komórek w stosunku do grupy kontrolnej. Ocena żywotności dokonana trzy godziny po naświetlaniu dla tej próbki, przedstawia ewidentny wzrost (13%) tego parametru w porównaniu z kontrolą. Ocena zmiany ruchliwości pod wpływem naświetlania plemników tej próbki, też daje wynik pozytywny (wzrost ruchliwości). Jednakże uzyskana wartość nie wykracza poza granicę niepewności pomiarowej. Nie jest także powiedziane, że te dwa parametry, tzn. ruchliwość i żywotność plemników są od siebie bezpośrednio zależne. Owszem, plemnik badany mikroskopowo jest uważany za żywy, gdy charakteryzuje się uporządkowanym ruchem. 82 5.2.3. Wnioski. Przedstawione powyżej badania miały na celu sprawdzenie, czy niskoenergetyczne promieniowanie laserowe wpłynie w jakiś sposób na parametry życiowe plemników buhaja. Do oceny ewentualnych zmian posłużyły metody subiektywnej mikroskopowej oceny ruchliwości i żywotności naświetlanych plemników. W przypadku niektórych próbek odnotowano wyraźną poprawę żywotności w stosunku do grupy kontrolnej, nawet do kilku procent. Należy podkreślić, że stosowany w badaniach tzw. test żywe/martwe identyfikował komórki jako martwe w przypadku, gdy uszkodzeniu uległa ich błona komórkowa wtedy bowiem barwnik może zaznaczyć taką komórkę. I faktycznie stwierdzono eksperymentalnie [255], że w przypadku większości plemników śmierć następuje przez uszkodzenie błony komórkowej. Istnieje jednak pewien procent przypadków, w których śmierci komórki nie będzie towarzyszył ten efekt. W oparciu o uzyskane dane eksperymentalne nie można bezsprzecznie stwierdzić, że promieniowanie laserowe spowodowało wyraźny wzrost ruchliwości plemników. Można natomiast powiedzieć, że parametry próbek naświetlanych były w większości przypadków porównywalne z grupą kontrolną. Problematyczna jest natomiast sama metoda określania ruchliwości, która daje nam jedynie oszacowanie jakościowe, a nie ilościowe, co jest dość trudne w dalszej interpretacji. Dlatego konieczne wydaje się przeprowadzenie podobnych pomiarów z zastosowaniem innej, dokładniejszej metody oceny ruchliwości, np. z wykorzystaniem mikrografii cytologicznej. Jak dotąd w literaturze nie spotkano prób, które badałyby zmianę tego parametru, który notabene jest kluczowym dla procesu infertelizacji. Dlatego dalsze badania w tym zakresie wydają się ciekawe i uzasadnione. Również planowane w przyszłości pomiary luminescencji plemników [255] poddanych naświetlaniu mogą przynieść dodatkowe cenne informacje. Na przykład potwierdziłyby, czy plemniki faktycznie absorbują promieniowanie laserowe w zakresie długości fal stosowanych w badaniach. Dałyby też odpowiedź na pytanie, czy absorpcji tegoż promieniowania towarzyszy formowanie się reaktywnych form tlenu tzw. ROS, o których roli w procesie fotostymulacji wspomniano we wstępie (rozdz. 5.3). 83 Przedstawione w powyższym rozdziale wyniki badań ukażą się jako komunikat zatytułowany: Effect of low level laser radiation on bull sprematozoa; w: Molecular and Physiological Aspects of Regulatory Prosseses of Organism, (Materials of 11th International Sympozjum of Polish Network of Molecular and Cellular Biology UNESCO (PAS)) [253]. 84 6. Wnioski końcowe. Mimo ponad 40 lat badań wpływu promieniowania laserowego na żywą materię, mechanizmy jego biostymulacyjnego działania wciąż nie są do końca poznane. Przedstawione w tej pracy (rozdz. 3.2.2) hipotezy usiłujące wyjaśnić te procesy, to nadal jedynie spekulacje, częściowo tylko potwierdzone wynikami badań. Uzyskiwane obecnie efekty terapeutyczne i rezultaty przedstawionych w niniejszej pracy doświadczeń laboratoryjnych, zdają się potwierdzać pozytywny wpływ niskoenergetycznego promieniowania laserowego na układy biologiczne, w szczególności na organizm człowieka. Jednak należy podkreślić, że konieczne jest standardowe charakteryzowanie warunków przeprowadzanych badań, jak i parametrów stosowanego promieniowania, co umożliwiłoby obiektywne porównywanie wyników i ich głębszą interpretacje. Istotny wpływ na wielkość efektów biostymulacyjnych może mieć też stan metaboliczny naświetlanych komórek, co nie zawsze jest uwzględniane w badaniach. Tak więc nadal jest więcej pytań, niż odpowiedzi. Rodzi to potrzebę intensyfikacji badań podstawowych w zakresie oddziaływania światła laserowego z żywą materią. Badania własne przedstawione w niniejszej pracy, miały właśnie taki charakter. Przy pomocy dobrze scharakteryzowanego źródła promieniowania laserowego, zbadano wpływ tego promieniowania na parametry krwi i plemniki buhaja: - W wyniku naświetlania krwi promieniowaniem laserowym zaobserwowano wzrost lepkości krwi, - Zaobserwowano wyraźny efekt działania promieniowania laserowego na elementy morfotyczne krwi, objawiający się m.in. obniżeniem poziomu hematokrytu, zmianą stężenia hemoglobiny w erytrocycie, wzrostem poziomu leukocytów (w tym limfocytów i monocytów), - Przy pomocy pomiaru mikroskopii sił atomowych, nie stwierdzono zmian rozmiaru i kształtu erytrocytów poddanych naświetlaniu promieniowaniem laserowym, - Zaobserwowano wpływ promieniowania laserowego na parametry życiowe plemników buhaja, takie jak: wzrost ich żywotności i ruchliwości. W przyszłości konieczne jest wykonanie dodatkowych systematycznych badań, które potwierdziłyby i umożliwiły poznanie zaobserwowanych efektów. 85 8. Spis rysunków: 1. Rysunek nr 1. Absorpcja światła przez różne składniki tkanek [wg. 12]. (str. 7) 2. Rysunek nr 2. Transmisja światła przez skórę, dla różnych długości fali [29]. (str. 9) 3. Rysunek nr 3. Prawo Arndta-Schultza-Oshiro w odniesieniu do laseroterapii.[wg. 9]. (str. 13) 4. Rysunek nr 4. Porównanie zmian w limfocycie pod wpływem fitohemaglutyniny (PHA) i promieniowania laserowego [110]. (str. 19) 5. Rysunek nr 5. Schematyczne przedstawienie możliwego mechanizmu proliferacji komórek na skutek naświetlania promieniowaniem laserowym [110]. (str. 36) 6. Rysunek nr 6. Schemat lasera półprzewodnikowego [rysunek własny w oparciu o 238]. (str. 39) 7. Rysunek nr 7. Moc diody laserowej w funkcji prądu płynącego przez diode. (str.40) 8. Rysunek nr 8. Schemat układu zasilającego użytego dla diody laserowe.j (str.41) 9. Rysunek nr 9. Widmo absorpcji dla hemoglobiny ( HB ) i oksyhemoglobiny (HbO2). (str.44) 10. Rysunek nr 10. Widmo transmisji pełnej krwi ludzkiej . (str. 44) 11. Rysunek nr 11. Wiskozymetr Hopplera. (str.47) 12. Rysunek nr 12. Zmiana współczynnika lepkości krwi w zależności od temperatury. (str. 50) 13. Rysunek nr 13. Zmiana poziomu hematokrytu w wyniku naświetlania (D = 3,6 J/cm3). (str. 56) 14. Rysunek nr 14. Zmiana poziomu hematokrytu w wyniku naświetlania (D = 10,8 J/cm3). (str. 56) 15. Rysunek nr 15. Zmiana średniego stężenia hemoglobiny w wyniku naświetlania (D = 3,6 J/cm3). (str. 57) 16. Rysunek nr 16. Zmiana średniego stężenia hemoglobiny w wyniku naświetlania (D = 10,8 J/cm3). (str. 58) 17. Rysunek nr 17. Zmiana średniej masy hemoglobiny w wyniku naświetlania (D = 3,6 J/cm3). (str. 58) 18. Rysunek nr 18. Zmiana średniej masy hemoglobiny w wyniku naświetlania (D = 10,8 J/cm3). (str. 59) 19. Rysunek nr 19. Zmiana poziomu erytrocytów w wyniku naświetlania 86 (D = 3,6 J/cm3). (str. 59) 20. Rysunek nr 20. Zmiana poziomu erytrocytów w wyniku naświetlania (D = 10,8 J/cm3). (str. 60) 21. Rysunek nr 21. Zmiana liczby białych krwinek pod wpływem naświetlania promieniowaniem laserowym (780nm, 70 mW), w funkcji czasu jaki upłynął od naświetlania. (str. 64) 22. Rysunek nr 22. Zmiana względnej liczby odsetkowej monocytów pod wpływem LLLR, w funkcji czasu jaki upłynął od naświetlania. (str. 65) 23. Rysunek nr 23. Zmiana poziomu czerwonych krwinek pod wpływem naświetlania, w zależności od czasu jaki upłynął od naświetlania. (str. 65) 24. Rysunek nr 24. Zmiana poziomu hematokrytu pod wpływem LLLR, w funkcji czasu jaki upłynął od naświetlania. (str. 66) 25. Rysunek nr 25. Zmiana wybranych elementów morfotycznych krwi, dla próbki nr 74, w wyniku naświetlania promieniowaniem laserowym. (str. 67) 26. Rysunek nr 26. Zmiana wybranych elementów morfotycznych krwi, dla próbki nr 74, pod wpływem promieniowania laserowego. (str. 68) 27. Rysunek nr 27. Krzywa oddziaływania van der Waalsa. (str. 69) 28. Rysunek nr 28. Schemat tworzenia obrazu w modzie kontaktowym. (str. 70) 29. Rysunek nr 29. Obraz erytrocytu poddanego naświetlaniu promieniowaniem laserowym: tnaś = 1 min, D = 3 J.ml. (str. 71) 30. Rysunek nr 30. Obrazy erytrocytów naświetlanych (1 godz.) promieniowaniem laserowym: a) brak zmian kształtu, b) nieznaczne wypustki, c) forma echinocytu. (st. 74) 31. Rysunek nr 32. Widmo transmisji dla próbki Vitamin. (str. 79) 32. Rysunek nr 33. Widmo transmisji dla próbki Frost. (str. 79) 34. Rysunek nr 34. Schemat układu stosowanego podczas naświetlania. (str. 80) 35. Rysunek nr 35. Zmiana żywotności komórek plemników poddanych działaniu promieniowania laserowego, w porównaniu z grupą kontrolną. (str. 82) 87 9. Spis tabel: 1. Tabela nr 1. Wykaz parametrów, które powinny być określone badaniach biostymulacyjnych. (str. 11) 2. Tabela nr 2. Doniesienia literaturowe na temat efektów niskoenergetycznej terapii laserowej. (str. 31) 3. Tabela nr 3. Przykłady udziału ROS w fotobiostymulacji. (str. 34) 4. Tabela nr 4. Wyniki pomiarów. (str. 49) 5. Tabela nr 5. Wyniki pomiarów analizy hematologicznej dla dawki 3,6 J/cm3. (str. 54) 6. Tabela nr 6. Wyniki pomiarów analizy hematologicznej dla dawki 10,8 J/cm3. (str. 55) 7. Tabela nr 7. Wyniki pomiarów hematologicznych określające dynamikę efektów wywołanych promieniowaniem laserowym. (str. 63) 88 7. Literatura: 1. Higa, T. (1989) Light & life, Progress in laser therapy, J. Wiley & Sons, London. 2. Gawlik, W. (2000) „Zastosowanie światła laserowego w diagnostyce i terapii”, w „Fizyczne metody diagnostyki medycznej i terapii” p. red. Hrynkiewicza, A.Z. i Rokity, E., PWN, Warszawa. 3. Glinkowski, W., Pokora, L. (1993) Lasery w terapii, Laser Instruments, Warszawa. 4. Pascu, M. L. (2000) Laser physics, in: Lasers in Medicine, 23-75. 5. Mester, E., Mester, A., Toth, J. (1983) Biostimulative effect of laser beam, in: New Frontiers in Laser Medicine and Surgery, 481-489. 6. Sommer, P. (1994) The Low Intensity Laser Activated Biostimulation (LILAB) System, Laser Therapy, 6 (1). 7. Suppan, P. (1997) Chemia i światło, PWN, warszawa. 8. Paszyc, S. (1983) Podstawy fotochemii, PWN, Warszawa. 9. Oshiro, T. (1988) Low level laser Therapy: a practical introduction, New York, John Willey&Sons, 30. 10. Karu, T. (1989) Photobiology of low power laser therapy, In:Letokov VS et all editors Laser Science Technology, an International Handbook, vol. 8, Harwood Academic Publishers,London. 11. Karu, T. (1995) Interactions of monochromatic visible light nad near infrared radiation with cells: currently discussed mechanisms, Proc. SPIE vol. 2391, 576- 586. 12. Boulnois, J. L. (1986) Photophysical processes in recent medical laser developements: a review, Lasers in Med.Sci., 1, 47. 13. P. red. Fiedora, P. (1995) Zarys klinicznych zastosowań laserów, D.W. ANKAR, Warszawa. 14. Sommer, P., Franke, R.P. (1993) LILAB – a new system for low intensity laser activated biostimulation, Biomed. Tech., 38, 168-171. 15. Rosner, M., Schwartz, M., et al. (1993) Dose and temporal parameters in delaying injured optic nerve degeneration by low energy laser irradiation, Lasers Surg. Med., 13 (6), 611-617. 16. Mester, E. (1981) Uber die stimulierende Wirkung der Laserstrahlung auf die Wundheilung, Der Laser, New York, Springer, 109-118. 89 17. Mester, A.R. (1992) Modalities of low power laser application. Laser applications in medicine and surgery. Laser Bologna’92. Third World Congress. 18. Sieroń, A., Cieślar, G., Adamek, M. (1994) Magnetoterapia i laseroterapia, ŚAM, Katowice. 19. Tuner, T., Hode, G. (1998) Are all negative LLLT studies really negative?, in Low Level Laser Therapy, Prima Books. 20. Moore, K, Calderhead, G. (1991) The clinical application of low incident power density 830nm GaAlAs diode laser radiation in the therapy of chronic intractable pain: A historical and optoelectronic rationale and clinical review, J Optoelectronics;6, 503-520. 21. Van Breugel, H.H., Bar, P.R. (1993) He-Ne laser irradiation affects proliferation of cultured rat Schwann cells in a dose-dependent manner, Journal of Neurocytology. 22(3):185-90. 22. Basford, J.R., Daude, J.R., Hallman, H.O., Miljard, T.l., Moyer, S.K. (1990) Does low intensity He-Ne laser irradiation alter sensory nerve action potentials or distal latencies, Lasers Med. Surg., 10, 35-39. 23. Basford, J.R., Sheffield, C.G., Cieslak, K.R. (2000) Laser therapy: a randomized, controlled trial of the effects of low intensity Nd:YAG laser irradiation on lateral epicondylitis, Archives of physical medicine and rehabilitation, 81 (11): 1504-1510. 24. de Bie, R.A., de Vet, H.C., Lenssen, T.F., van den Wildenberg, F.A.., Koosta, G., Knipschild, P.G. (1998) LLLT in ankle sprains: a randomized clinical trial, Arch. Phys. Med. Rehabil. Nov., 79 (11), 1415-1420. 25. Mester, A.R. (1994) Low power laser in complex wound management, Laser Therapy, 6 (1), 39. 26. Brill, G. E., Dobrovolsky, G.A., Romanova, T.P. (1997) Influence of low power laser radiation on mast cells function and biogenic amines content in stress, Proc. SPIE, vol. 2975, 446-450. 27. Amaral, A.C., Parizotto, N.A., Salvini, T.F. (2001) Dose-dependency of Low-energy HeNe laser effect in regeneration of skeletal muscle in mice, Lasers Med. Sci. 16, 44-51. 28. Turner, J. (2000) What is in LLLT literature?, in Lasers in Medicine, 217-227. 29. Danhof, G. (2000) Biological effects of laser beam, in Lasers in Medicine, 127-153. 90 30. Lubart, R., Friedmann, H., Sinyakov, M., Grossman, N., Adamek, M. and A. Shainberg (1997) Low energy doses of HeNe radiation change intracellular Ca2+ concentration in fibroblasts, Laser Therapy, 9, 115-120. 31. Oren, D., Lavie, R., Charney, D. S. and R. Lubart (2001) Stimulation of Reactive Oxygen Species production in fibroblasts by a traditional antidepressant visible light source, Biological Psychiatry, 49, 464-467. 32. Trelles, M.A., Mayayo, E. (1992) Mast cells are implicated in low power laser effect on tissue: A primary study, Lasers in Med. Sci., 7, 73-77. 33. Mester, E. (2001) How all started? - Dr. Endre Mester's pioneering work, 2nd International Conference on NOA & Photobiology, Johnson Space Flight Center, Houston, May 31 - June 1, 2001. 34. Sommer, P. (1993) LILAB-A new System for Low Intensity Laser Activated Biostimulation. Biomed. Tech., 38 (7-8), 168 –171. 35. Kana J.S. et al. (1981) Effect of low-power density laser radiation on healing of open skin rounds in tats, Arch Surg., vol. 116,293. 36. Walker, J. (1983) Relief from chronic pain by low power laser irradiation, Neuroscience Letters, 43, 339. 37. Synder-Mackler, L. (1989) Effect of He-Ne laser irradiation on skin resistance and pain in patients with tigger points in neck or back, Physical Therapy, 69. 38. Mester, E., Szende, B., Gartner, P. (1968) The effect of laser beams on growth of hair in mice, Radiobiol. Radioter., 9, 621-626. 39. Mester, E., Spiry, T., Szende, B., Tota, J.G. (1971) Effcts of laser rays on wound healing, Am. J. Surg., 122, 532-535. 40. Simunovic, Z. (2000) Lasers in medicine: basic science and up-to-date clinical application of LLLT, ELMA. 41. Yamamoto, M., Tamura, K., Hiratsuka, K., Abiko, Y. (2001) Stimulation of MCM3 gene expression in osteoblast by low level laser irradiation, Lasers Med. Sci., 16, 213-217. 42. Yamamoto, J., Isbii, I., Chikamori, A., Sasaki, Y., Nagamatsu, Y., Morita, S., Tsakahara, M. (1993) Effect of long-term aerobic exercise on He-Ne laser inducted thrombogenesis in rat mesenteric arterioles and platelet aggregation, Homeostasis 23, 129-134. 91 43. Akai, M., Usuba, M., Maeshima, T., Yasuoka, S., Shirasaki, Y. (1997) Laser’s effect on bone and cartliage change inducted by joint immobilization: an experiment with animal model, Lasers Surg. Med., 21 (5), 480-484. 44. Basford, J. R. (1987) Low energy He-Ne laser treatment of thumb osteoarthritis, Arch., Phys. Med. Rehab, 68, 794-797. 45. Mester, A. R., Nagylucskay, S., Mako, E. et al. (1998) „Experimental immunological study with radiological application of low power lasers”, in: Laser in Medicine, New York, Springer, 502-512. 46. Mester, E., Mester, A.F ., Mester, A. (1985) The biomedical effect of laser application, Lasers Surg. Med., 5, 31-39. 47. van Breugel, H. H., Bar, P. R. (1992) Power density and exposure time of He-Ne laser irradiation are more important than total energy dose in photo-biomodulation of human fibroblasts in vitro, Lasers in Surgery & Medicine. 12 (5), 528-37. 48. Lagan, K. M., Mc Donough, S. M., Clements, B. A., Baxter, G. D. (2000) A case report of low intensity laser therapy (LILT) in the management of venous ulceration: potential effects of wound debridement upon efficacy, Journal of Clinical Laser Medicine & Surgery, 18 (1), 15-22. 49. Person, L., Ryden, H., Beber, H., Bergstrom, J. (1990) Effect of low-energy laser on givinal inflamation, Swedish Dental Jurnal, 14, 17. 50. Kusahari H., Orikasa N., Tani H. (1992) Effect of low power laser on wound healing of gingiva and bone, Laser Bologna, 49, Monduzzi Editare, Bologna, Italy. 51. Steinlecher C., Dyson M., (1993) The effect of low level laser therapy on politeration of keratinocytes, Laser Therapy, 5(2), 65. 52. Schultz, H. (1888) Uber Hefegiffe, Pflugers Archiv fur die Gesamte Physiologie des Menschen und der Tierre, 42, 517-541. 53. Yamada, K. (1991) Biological effect of low power laser irradiation on clonal osteoblastic cells (MC3T3-E1), J.Jpn. Orthop. Assoc., 65, 787-799. 54. Trelles, M.A., Mayayo, E. (1987) Bone fracture consolidates faster with low power laser, Lasers Surg. Med., 7, 36-45. 55. Wu, W., Naim, J. O., Lanzafame, R. J. (1994) The effect of laser irradiation on the release of bGFG from 3T3 fibroblasts, Photochem. Photobiol, 59 (2), 167-170. 56. Phineiro, A. L., Cavalcanti, E. T., et all. (1997) Low level laser therapy in management of disorders of the maxillofacial region, J. Clin. Laser Med. Surg., 15 (4), 181-183. 92 57. Bihari, I. (1994) CO2 laser in low power applicaion in wound healing, Laser Therapy, 6 (1), 43. 58. Sroka, R., Schaffer, M., Fuchs, C., Pongratz, T., Schrader-Reichard, U., Busch, M., Schaffer, P.M., Duhmke, E., Baumgartner, R. (1999) Effects on mitosis of normal snd tumor cells inducted by light treatment of different wavelenghts, Laser Surg. Med., 25 (3), 263-271. 59. Karu, T., Pyatibrat, L., Kolendo, G. S. (1995) Irradiation with He-Ne aser increases ATP level in cells cultivated in vitro, J. Photochem&Photobiol, B-Biol., 27(3), 219223. 60. Bolognani, L., Bolognani, A. M., Franchini, A., Volpi, N., Venturelli, T., Fuhrman, A. M. (1994) Effect of low-power 632 nm radiation on human cell line: influence on Adenylnucleotides and gytosceletal structures, J. Photochem. Photobiol., B. Biol., vol. 26, 257-264. 61. Vladimirov, Y. A., Gorbatenkowa, E. A., Paramonov, N. V., Azizova, O. A. (1988) Photoreactivation of superoxide dismutase by intensive red (laser) light, Free Radical Biol. Med., vol. 5, 281-286. 62. Karu, T., Pyatibrat, L., Kolendo, G. S. (1993) The effect of He-Ne laser radiation on adhesive properitiesof cell membrane, Biull. Eksp. Biol. Med. 115, 622-623. 63. Quickenden, T. I., Daniels, L. I., Byrne, L. T. (1995) Does low intensity He-Ne laser radiation affect the intracellular pH of intact E. coli cells?, Proc. SPIE vol. 2391, 535-545. 64. Daniels, L. L., Quickenden, T. I. (1994) Does low-intensity He-Ne laser radiation produce a photobiologigal growth response in E. coli?, Photochem&Photobiol, 60 (5), 481-485. 65. Lubart, R., Friedmann, H., Cohen, N. and Breitbart, H. (1998) „Effect of HeNe laser on calcium signals in sperm cells”, G.F. Bottiroli, T. Karu and R. Lubart, Editor. Effects of Low Power Light on Biological Systems IV. Proceedings of SPIE, vol. 3569, 45-49. 66. Smith, K. C. (1991) The photobiological basis of Low Level Laser Radiation Therapy, Laser Therapy, 3, 19-24. 67. Dyson, M. (1990) „Cellular and subcellular aspects of laser therapy”, in:Ohshiro T & Calderhead G, editors. Progress in Laser Therapy. John Wiley & Sons, Chichester, 221-224. 93 68. Umeda, Y. (1990) Blood pressure controlled by low reactive level diode laser therapy, by John Wiley&Sons, Ltd. 69. Czerniecki, J., Radziszewski, K., Talar, J. (1994) Wpływ biostymulacj na krążenie kończyn w leczeniu arteriosklerozy, Pol. Tyg. Lek., 49, 363-365. 70. Bibikova, A., Belkin, V., Oron, U. (1994) Enhancement of angiogenesis in regenerating gastrocnemius muscle of the toad (Bufo viridis) by low-energy laser irradiation, Anatomy & Embryology, 190 (6), 597-602. 71. Takahashi, Y., Hitomi, S., Hirata, T., Fukuse, T., Yamazaki, F., Cho, K., Wada, H. (1992) Neovascularization effect with He-Ne laser in the rat trachea, Thoracic & Cardiovascular Surgeon., 40 (5), 288-91. 72. Jankiewicz, Z. (1993) Lasery stosowane w medycynie, VII Krajowa szkoła Optoelektroniki, Zegrze. 73. Schaffer, M., Bonel, H., Sroka, R., Schaffer, P.M., Busch, M., Reiser, M., Duhmke, E. (2000) Effects of 780 nm diode laser irradiation on blood microcirculation: preliminary findings on time-dependent T1-weighted contrast-enhanced magnetic resonance imaging (MRI), J. Photochem. Photobiol. B: Biology, vol. 54, 55-60. 74. Schindl, A., Schindl, L. (1996) Systemic increase in blood flow in conditions of disturbed microcirculation after low power irradiation, in: G. Jori. T. Karu (Eds.), Proc. SPIE vol. 2929, 63-69. 75. Stadler, I, Evans, R, Kolb, B, Naim, J. Oet al. (2000) In vitro effects of low-level laser irradiation at 660 nm on peripheral blood lymphocytes, Lasers in Surgery and Medicine, 27 (3): 255-261. 76. Kolarova, H. (1991) Effect of He-Ne laser irradiation on phagocitic activity of leukocytes in vitro, Acta Univ.Palacki. Olomuc. Fac.Med., 129, 127-132. 77. Guzzardella, G. A., Morrone, G., Torricelli, P. et al. (2000) Assessment of lowpower laser biostimulation on chondral lesions: an "in vivo" experimental study, Artificial cells, blood substitutes, and immobilization biotechnology, 28 (5): 441449. 78. Halevy, S., Lubart, R., Grossman, N. and Reuveni, H. (1997) 780 nm low power laser therapy for wound healing, in vivo and in vitro studies, in Laser Therapy, 9, 159-164. 79. Morimoto, Y., Matsuo, H., Arai, T., Kikuchi, M. (1996) Low-intensity light induces vascorelaxation: a study for possible mechanism, Proc. SPIE vol. 2681, 126-132. 94 80. Vatsale, M., et. all (1979) He-Ne laser inducted changes in erythrocytes, Curr. Sci., 48, 720-721. 81. Karu, T. (1990) Effect of visible radiation on cultured cells, Photochem. Photobiol. 52, 1089-1099. 82. Utz, I. A, Utz, S. R, Tuchin, V. V. (1993) Effects of low-energy laser biostimulation on rheological propertties of blood, Proc. SPIE vol. 1883, 83-90. 83. Sentjure, M., Schara, M., Prelesnik, T., Nemec, M., Demsar, F. (1986) The influence of lase irradiation on erythrocyte membrane fluidity, Stud. Biophys., 112, 57-62. 84. Kontorschikova, K.W. (1992) Wljanie niskointensiwnogo pokazateli krowi postreanimovcjonogo perioda, Kardiologia, 21, 357-359. 85. Kujawa, J., Pyszcek, I., Zavodnik, L., Zavodnik, I., Buko, V., Kilańczyk, E., Bryszewska, M., Talar, J. (2001) Wpływ niskoenergetycznego promieniowania laserowego (IR, λ = 810 nm) na aktywność ATP-az i strukturę błony komórkowej krwinki czerwonej, Fizjoterapia Polska vol.1, 3, 248-253. 86. Lubart, R., Friedmann, H., Grossman, N., Adamek, M. and Shainberg, A. (1996) The role of calcium in photobiostimulation, Lasers in Technology, 6, 63-69. 87. Iijima, K., Shimoyama, N., Shimoyama, M., Mizuguchi, T. (1993) Effect of lowpower He-Ne laser on deformability of stored human erythrocytes, J.Clin Laser.Med.Surg., 11, 185-189. 88. Karu, T., Tiphlova, O., Letokhov, V.S., Matveyets, Yu. A., Yartsev, A. P. ( 1991) Comparison of effects of visible femto-second pulses and continous wave laser radiation of low avarage intensity on the clonogenicity of E. coli., J. Photobiol. Photochem. B: Biology, vol. 10, 339-344. 89. Karu, T. (1992) Local pulsed heating of absorbing chromophores as a possible primary mechanism of low-power laser effects, in G. Galetti, L. Bologhoni, G. Ussia (Eds.), Laser Applications in Medicine and Surgery, Monduzzi Editare, Bologna, 253-258. 90. Karu, T., Ryabykh, T., Letokhov, V.S. (1997) Different sensitivity of cells from tumor-bearing organisms to continuous-wave and pulsed laser radiation (λ=632,8nm) evaluated by chemiluminescence test ; III Effect of dark period between pulses, Laser Life Sci., 7, 141-156. 95 91. Sentjurc, M., Schara, M., Prelesnik, T., Nemec, M., Demstar, F. (1986) The influence of laser irradiation on erythrocyte membrane fluidity, Stud. Biophys., 112, 57-62. 92. Yeliseenko, V. I., (1994) Low-level-laser- their role in the mechanisms of the stimulation of the reperative processes, Proc. SPIE vol. 2134A, 451-454. 93. Karu, T., Piatibrat, L. V., Esenaliev, R. O. (1994) The effect of monochromatic light in the red and near infrared ends of the spectrum on adhesive properties of the cell membrane: dependence on wavelength, Biulleten Eksperimentalnoi Biologii i Meditsiny, 117(6):670-2. 94. Siposan, G. D., Lukacs, A. (2000) Effect of low-level laser radiation on some rheological factors in human blood an in vitro study, J.Clin.Laser Med.&Surg., 18, 185-195. 95. Siposan, G. D., Lukacs, A. (2001) Relative variation to recievied dose of some erythrocytic and leukocytic indices of human blood as a result of LLLR: an in vitro study, J.Clin. Laser Med.&Surg., 19, 89-103. 96. Paleev, N. R., Karandashov, V. I., Voronina, M. A., Fin'ko I. A. (1993) Changes in the blood rheological properties in the transcutaneous irradiation of the ulnar vascular fascicle with a helium-neon laser, Biulleten Eksperimentalnoi Biologii i Meditsiny, 116(10), 428-30. 97. Campana, V., et al. (1998) Effects of diclofenac sodium adn He-Ne laser irradiation on plasmatuc fibrinogen levels in inflamatory processes, J. Clin.Laser Med. Surg., 16, 317-320. 98. Olban, M. (1998) The biostimulatory effect of red laser irradiation on pig blood platelet function, Cell. Biol. Int., 22, 245-248. 99. Wilander, L., Rundquist, I., Oberg, P. A. (1986) Laser He-Ne light exposure of red blood cells, Med.&Biol. Eng&Comput., 24, 558-560. 100. Brill, G. E., Proshina, O. V., Zhigalina, V. N., Filimonovskaya, L. S., Romanova, T. P., Petrisheva, S. G., Zolotaryova, T. M. (1995) Formation of secondary messengers by blood formed elements in low power laser irradiation, Proc. SPIE vol. 2391, 601-609. 101. Funk, J. O., Kruse, A., Neustock, P., Kirchner, H. (1993) He-Ne laser irradiation induces effects on cytokine production at the protein and the mRNA level, Exp. Dermatol., N 2, 75-83. 102. Funk, J. O., Kruse, A., Kirchner, H. (1992) Cytokine production after He-Ne 96 laser irradiation in cultures of human peripherial blood mononuclear cells, J. Photochem. Photobiol. B, 16, 347-355. 103. Polosukhin, V. V. (2000) Ultrastructure of the blood and lymphatic capillaries of the respiratory tissue during inflammation and endobronchial laser therapy, Ultrastructural Pathology, 24 (3): 183-189. 104. Brill, G. E., Proshina, O. V., Zhigalina, V. N., Filimonovskaya, L. S.(1993) Modification of lipid peroxidation by He-Ne laser radiation in short-term immobilization stress, Proc. SPIE vol. 1981, 210-219. 105. Sadowska, M., Krajewska, E., Bryszewska, M. (2001) Photodynamically inducted changes of acetylcholinesterese activity from human erythrocytes, Lasers Med. Sci., 16, 10-15. 106. Iijima, K., Shimoyama, N., Shimoyama, M., Mizuguchi, T. (1991) Red and green low-powered He-Ne lasers protect human erythrocytes from hypotonic hemolysis, J.Clin.Laser Med. Surg., 9, 385-389. 107. Itoh-T, Murakami-H, Orihashi-K et al. (2000) Low power laser protects human erythrocytes In an In vitro model of artificial heart-lung machines, Artificial Organs., 24 (11): 870-3. 108. Cichocki, T., Litwin, J. A., Mirecka, J. (1998) Kompendium histologii, Wydawnictwo UJ. 109. Manteifel, V. M., Andreichuk, T. N., Karu, T. (1992) A comparative study of chromatin from lymphocyte nuclei upon activation of transcription by irradiation from an He-Ne laser or phytohemaglutinin, Molekulinarnaia Biologiia, 12 (5), 1054-1062. 110. Karu, T. (1999) Primary and secondary mechanism of action of visible to nearIR radiation on cells, J. Photochem. Photobiol. B:Biology, vol. 49, 1-17. 111. Karu, T. (1992) Depression of genome after irradiation of human lymphocytes with He-Ne laser, Laser Therapy, 1, 5-25. 112. Meyer, A. D., Joice, J., Cohen, C. C. (1987) Effects of low-watt He-Ne laser irradiation on human lymphocytes cultures, Laser Surg. & Med., vol. 6, 540-542. 113. Belotski, S., Lubart, R., Shainberg, B., Seledeera, I., Friedmann, H. and Avtalion, R. (2001) Visible light control of spontaneous respiratory burst in leukocytes of high and low vertebrates, Submitted for publication: Laser Therapy. 97 114. Karu, T., Ryabykh, T. P., Fedoseyeva, G. E., Puchkova, N. I. (1989) He-Ne laser inducted respiratory burst of phagocytic cells, Lasers Surg. Med., vol. 9, nr 6, 585-588. 115. Yang, F. S., Yang, X. Ch., Zhang, H. L. (1995) Labolatory research of laserradiated blood therapy and its clinic application, Proc. SPIE vol. 2391, 610-617. 116. Stadler, T., Evans, R., Kolb, B., Naim, J.D. et. all (2000) In vitro study of lowlevel laser irradiation at 660 nm on peripherial blood lymphocytes, Lasers in Surg. & Med., 27 (3), 255-261. 117. Yu, W., Chi, L., Naim, J. O., Lanzatrama, R. J. (1997) Improvement of host response to spesis by photobiomodulation, Lasers Surg. Med., 21, 262-268. 118. Yu, H., Chang, K., Yu, C., Chen, G. (1996) Low-energy He-Ne laser irradiation stimulates interleukin-1 alpha and interleukin-8 relase from cultured human keratinocytes, J. Invest. Dermatol., 107, 593-596. 119. Bolognani, L., Venturelli, T., Vopoli, N., Zirilli, O. (1995) Adenylate pool and energy charge in human lymphocytes and granulocytes irradiated at 632 nm, Proc. SPIE vol. 2391, 587-593. 120. Bakeeva, L. E., Manteifel, V. M., Rodichev, E. B., Karu, T. I. (1993) Formation of gigantic mitochondria in human blood lymphocytes under the effect of an He-Ne laser, Molekuliarnaia Biologiia, 27 (3), 608-17. 121. Manteifel, V., Bekeeva, L., Karu, T. (1997) Ultrastructural changes in chondriome of human lymphocytes after irradiation with HeNe laser: appearance of giant mitochondria, J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 38, 25-30. 122. Traczyk, W. Z. (1997) Fizjologia człowieka w zarysie, PZWL, Warszawa. 123. Belotski, S., Avtalion, R., Friedmann, H. and Lubart, R. (1998) Modulatory effect of visible light on chemiluminescence of stimulated and non-stimulated blood leukocytes of carp, Proc. SPIE vol. 3569, 104-111. 124. Khomeriki, S. G., Morozov, L. A. (1998) Ultrastructural changes of neutrophilic granulocytes in dilated cardiomiopathy and their dynamics after blood irradiation with He-Ne laser in vitro, Arkh. Patol., 60, 28-31. 125. Funk, J.O., Kruse, A., Neustock, P., Kirchner, H., (1993) Helium-neon laser irradiation induces effects on cytokine production at the protein and the mRNA level, Experimental Dermatology, 2 (2), 75-83. 126. Loevenshall, H., Scharft, O. B., Foder, B., Arenholdt-Bindslev, D. (1998) 98 Effects of low level laser irradiation on cytosolic Ca2+ in human neutrophils in vitro, Lasers in Life Sci, 8, 127-136. 127. Stadler, I., Lanzafame, R. J., Evans, R. et al.(2001) 830-nm irradiation increases the wound tensile strength in a diabetic murine model, Lasers in Surgery and Medicine, 28 (3), 220-226. 128. Bolton, P., Young, S., Dyson, M. (1995) The dirct effect of 860 nm light on cell proliferation and on succinic dehydrogenase activity in human fibroblasts in vitro, Laser Therapy, 7, 55-60. 129. Whelan, H. T., et all (2001) NASA LED – near –infrared technology for biostimulation, Space Tech. & App Int’l Forum, 552, 35-45. 130. Van der Veen, P., Lievens, P. (2000) LLLT: the influence on proliferation of fibroblast and influence on the regeneration process of lymphatic, muscular and cartilage tissue, in Lasers in Medicine, 127-217. 131. Boulton, M., Marshall, J. (1986) He-Ne laser stimulation of human fibroblast proliferation and attachment in vitro, Laser Life Sci., vol. 1, 125-134. 132. Theodossiou, T., Rapti, G.S., Harhannisyan, V., Georgiu, E., Politiopoulus, K., Yova, D. (2002) Thermally inducted irreversible conformational changes in collagen probed by optical second harmonic generation and laser-inducted fluorescence, Lasers med. Sci., 17, 34-41. 133. Noble, P., Shields, E. D., Blecher, P. D. M., Beutley, K. C. (1992) Locomotory characteristics of fibroblasts within a three dimensional collagen lattince: modulation by a He-Ne soft laser, Lasers Surg. Med., vol. 12, 669-674. 134. Lam, T., Abergel, P., Meekar, C.A., Gastcl, J.C., Dweyer, R.M, Uitto, J. (1986) Laser stimulation of collagen synthesis inhuman skin fibroblast cultures, Laser Life Sci., vol. 1, 61-67. 135. Steinlecher, C. W. B., Dyson, M. (1993) The effects of low level laser therapy on proliferation and attachment in vitro, Laser Therapy, vol. 5, 65-73. 136. Rigau, J., Sun, C. H., Trelles, M. A., Berns, M. W. (1996) Effects of the 633-nm laser on the behavior nd morphology of primary fibroblast culture, Proc. SPIE vol. 2630, 38-42. 137. Cambier, D., Blom, K., Ollevier, G., Munyck, M., Vanderstraeten, G. (2000) The influence of low intensity infrared laser irradiation on conduction characteristics of pheripheral nerve: a randomised, controlled, dpuble blind study on sural nerve, Lasers Med. Sci., 15, 195-200. 99 138. Simunovic, Z. (2000) Neurology, in Lasers in Medicine, 303-309. 139. Cassone, M. C., Lombard, A., Rossetti, V., Urciuoli, R., Rolfo, P. M. (1993) Effect of in vivo He-Ne laser irradiation on biogenic amine levels in rat brain. Journal of Photochemistry & Photobiology, B - Biology. 18 (2-3), 291-294. 140. Wong-Riley, M.T. (2001) Effect of NIR emitting diode light on neuronal cultures, 2nd International Conference on NOA&Photobioogy, Johnson Filght Space Center, Houston, May 31- June 1. 141. Balaban, P., Esenaliev, R., Karu, T., Kutomkina, E., Letokhov, V., Oraevsky, A., Ovcharenko, N. (1992) He-Ne laser irradiation of single identified neurons, Lasers in Surgery & Medicine, 12 (3), 329-37. 142. Wong-Riley, M.T. (1989) Cytochrome oxidase: an endogenous metabolic marker for neuronal activity, Trends Neurosci., 12, 94 -101. 143. Zhang, C., Wong-Riley, M.T. (2000) Sythesis and degradation of cytochrome oxidase subunit mRNA in neurons: Differential biogenomic regulation by neuronal activity, J.Neurosci. Res., 60, 338 – 344. 144. Karu, T., Andreichuk, T., Ryabykh, T. (1993) Changes in oxidative metabolism of murine spleen following laser and superluminous diode (660-959 nm) irradiation: effect of cellular composition and radiation parameters, Lasers Surg. Med., vol. 13, 453-462. 145. Rochkind, S. (2000) Laser therapy in the treatment of peripherial nerve and spinal cord injuries, in Lasers in Medicine, 309-319. 146. Rochkind, S., Nissan, M., Alon, M. et al. (2001) Effects of laser irradiation on the spinal cord for the regeneration of crushed peripheral nerve in rats, Lasers in Surgery and Medicine, 28 (3): 216-219. 147. Simunovic, Z. (2000) Pain and practical aspects of its menagment, in: Lasers in Medicine, 269-303. 148. Kemmotsu, O., Sato, K., Furumido, H., Harada, K., Takingawa, C., Kaseno, S., Yokota, S., Hanaoka, Y., Yamamura, T. (1991) Efficiancy of low reactive-level laser therapy for pain attenuation of postherpetic neuralgia, Laser Therapy, 3, 71-75. 149. Gur, A., Karako, M., Nas, K., Cevik, R., Sarac, J., Demir, E. (2002) Efficacy of low power lasr therapy in fibromialgia: a single-blind, placebo-controlled trial, Lasers Med. Sci., 17, 57-61. 150. Schwartz, H., Yales, E., Salomon, A., Chaya, K., Hai, I., Belkin, M. (1995) Low 100 energy laser irradiation: A possible neuroprotective modality, Proc SPIE vol. 2391, 627-633. 151. Grossman, N., Schneid, N., Reuveni, H., Halevy, H. and Lubart, R. (1998) Enhanced proliferation of keratinocyte cultures following 780 nm low power diode laser irradiation. Involvement of reactive oxygen species, Lasers Surg. Med., 22, 212-218. 152. Grossman, N., Schneid, N., Reuveni, H., Halevy, H. and Lubart, R. (2000) Enhanced proliferation of keratinocyte cultures following low power HeNe laser irradiation. Involvement of reactive oxygen species, Lasers in the Life Sciences, 9 (2), 111-126. 153. Lubart, R., Friedmann, H., Grossman, N., Cohen, N. and Breitbart, H. (1997) The role of reactive oxygen species in photobiostimulation, Trends in Photochemistry and Photobiology, 4, 277-283. 154. Basford, J. R. (1989). Low-energy laser therapy : controversis and new research findings, Laser Surg. Med., 9, 1-5. 155. Lubart, R., Friedmann, H., Grossman, N., Lavie, R., Sinyakov, M. and Belotski, S. (2000) Effect of visible light on reactive oxygen species production. Accepted for publication in Laser Technology. 156. Karu, T. (1987) Photobiological fundamentals of low-power laser therapy, IEEE J.Quantum Electron. QE-23, 1703-1717. 157. Schafer, M., Sroka, R., Fuchs, C., Schrader-Reichardt, U., Schaffer, P.M, Busch, M., Duhmke, E. (1997) Biomodulative effects inducted by 805 nm laser light irradiation of normal and tumor cells, J. Photochem. Photobiol. B: Biology, 40, 253-257. 158. Oshiro, T., Caladerhead, R. G. (1991) Development of low reactive-level laser therapy and its present status, J. Clin. Laser Med. Surg., 9 (4), 267-275. 159. Koultcavienia, E. V. (1998) Influence of LLLT on kidney function, Proc. SPIE vol. 3569, 70-74. 160. Buglova, S. E., Sokolakov, V. I., Pilotovich, V. S., Gomolko, N. N., Chizh, K. A., Vlasik, V. A., Finin, V. S. (1994) The use of laser irradiation in nephrological practice, Urologia i Nefrologia, 4, 27-30. 161. Simunovic, Z. (1996) LLLT with trigger points technique: a clinical study on 243 patients, J. Clin Laser Med. Surg., 14 (4), 163-167. 162. Simunovic, Z., Trobonjaca, T., Trobojnaca, Z. (1998) Treatment of medical and 101 lateral epicondylitis- tennis and golfer’s elbow – with LLLT: a multicenter double blind, placebo- controlled clinical study on 324 patients, J. Clin. Laser Med. Surg., 16 (3), 145-151. 163. Morre, G., Guzzardella, G. A., Giavaresi, G., Fini, M., Rocca, M., Torricelli, P., Martini, L., Giardino, R. (1998) Muscular trauma treated with a Ga-Al.-As diode laser: in vivo experimental study, Lasers Med Sci., 13, 293-298. 164. Ortutay, J., Barabas, K. (2000) Laser therapy in rhrumatology, in Lasers in Medicine, 329-345. 165. Goldman, L. (1990) Laser non-surgical medicine, a new challenge for an old application, Technomic Publishing Inc, Basel. 166. Gartner, C. (1992) Low reactive-level laser therapy (LLLT) in rheumatology: a review of the clinical experience in the author’s labolatory, Laser Therapy, 4, 107-115. 167. Asada, K., Yutani, Y., Sakawa, A., Shimazu, A. (1991) Clinical application of GaAlAs 830 nm diode laser in treatment of rheumatoid arthritis, Laser Therapy, 3, 77-82. 168. Kozlova, I. S., Tsurko, V. V., Piriazeva, N. A., Volkova, Z. I., Kariakina, E. V., Nikolaev, V. I., Mul'diiarov, P. I. A. (1994) The mechanism of the action of laser therapy in rheumatoid arthritis, Terapevticheskii Arkhiv., 66 (5), 38-41. 169. Morrone, G., Guzzardella, G. A., Torricelli, P. et al. (2000) Osteochondral lesion repair of the knee in the rabbit after low-power diode Ga-Al-As laser biostimulation: an experimental study, in: Artificial Cells, Blood Substitutes, and Immobilization Biotechnology. 28 (4), 321-336. 170. Smith, C. F., Vangsness, C. T. (1992) Future of laser biostimulation in America today: microlight 830, Proc. SPIE vol. 1643, 275-276. 171. Pidaev, A. V. (1997) A mathematical assessment of the efficacy of the methoda for treating paiets with chronic nonspecific lung at health resort, Lik Sprava Nov., 6, 168-172. 172. Gomez-Villamandos, R. J., Santisteban Valenzuela, J. M., Ruiz Calatrava, I., Gomez-Villamandos, J. C., Avila Jurado, I. (1995) He-Ne laser therapy by fibroendoscopy in the mucosa of the equine upper airway, Lasers in Surgery & Medicine., 16 (2), 184-8. 173. Bensadou, R. (2000) Low energy He-Ne laser in the prevention of radiation inducted mucositis, in: Lasers in Medicine, 255-269. 102 174. Brill, G. E., Archangelsky, A. V., Panina, N. P., Maslyakowa, G. N., Kulikowa, E. G., Brill, A. G. (1998) Influence of low-power laser radiation on lung tumor induction in mice, Proc. SPIE vol. 3569, 76-84. 175. Mester, A., Mester, E., Mester, A. (2000) Open wound healing- bad scores, ulcus crucis, burns – with systemic effects of LLLT, in: Lasers in Medicine, 227-245. 176. Simunovic, Z. (2000) The healing of post-operative wound with LLLT, in: Lasers in Medicine, 245-252. 177. Verdote-Robertson, R., Munchua, M. M., Reddon, J. R. (2000) The use of low intensity laser therapy (LILT) for the treatment of open wounds in psychogeriatric patients: A pilot study, Physical and Occupational Therapy in Geriatrics, 18/2 (1-19). 178. Tsourouktsoglou, A. T. (2000) The use of LLLT in wound healing in Greece, in: Lasers in Medicine, 251-255. 179. Schaffer, M., Bonel, H., Sroka, R. (2000) Magnetic resonance imaging (MRI) controlled outcome of side effects caused by ionizing radiation, treated with 780 nm-diode laser - Preliminary results. Journal of Photochemistry and Photobiology B:Biology.59 , 1-8. 180. Flemming, K. A, Cullum, N. A., Nelson, E.A. (1999) A systematic review of laser therapy for venous leg ulcers, J. Wound Care Mar., 8 (3), 11-114. 181. Pinheiro, A. L. B. (2001) Biomodulatory effects of LLLT on bone regeneration, 2nd International Conference on NOA&Photobioogy, Johnson Filght Space Center, Houston, May 31- June 1, 2001. 182. Lucas, C., Cochen, C.M., de Maan, R.J. (2000) The effect of low level laser therapy on stage III Decubitus ulcers (pressure sores): a prospective randomised single blind, multicentre pilot study, Lasers Med.Sci., 14, 94-100. 183. Lucas, C., Stanborough, R. W., Freeman, C. L., Haan, R. J. (2000) Efficancy of LLLT on wound healing in human subjects: a systemic review, Lasers Med. Sci., 15, 84-93. 184. Petersen, S. L., Botes, C., Olivier, A., Guthrie, A. J. (1999) The effect of LLLT on wound healing in horses, Equine Vet J., 31 (3), 228-231. 185. Usuba, M., Akai, M., Shirasaki, Y. (1998) Effect of LLLT on viscoelasticity of contracted knee jont: comparison with whirloop treatment in rats, Lasers Surg. 103 Med., 22 (2), 81-85. 186. Bibikova, A., Oron, U. (1993) Promotion of muscle regeneration in the toad (Bufo viridis) gastrocnemius muscle by low-energy laser irradiation, Anatomical Record., 235 (3), 374-80. 187. Barushka, O., Yaakobi, T., Oron, U. (1995) Effect of low-energy laser (He-Ne) irradiation on the process of bone repair in the rat tibia, Bone., 16 (1), 47-55. 188. Schuhfried, O., Korpan, M., Fialko-Moser, V. (2000) He-Ne laser irradiation: effect on the experimental pain threshold, Lasers Med. Sci., 15, 169-173 189. Padua, L., Padua, R., Moretti, C., Nazzano, M., Tonali, P. (1999) Clinical outcome and neurophysiological results of low-power laser irradiation in carpal tunel syndrome, Lasers Med. Sci., 14, 196-202. 190. Gladkova, N. D., Karachistov, A. B., Komarowa, L. G., Alekseeva, O. P., Gruninina, E. A. (1996) Clinical effectivness of low-power laser radiation and functioning of hemosalivatory barier in patients with rheumatic diseases, Prc. SPIE vol. 2929, 124-131. 191. Basford, J. R., Sheffield, C. G, Harmsen, W. S. (1999) Laser therapy: a randomized, controlled trial of the effects of low intensity Nd-Yag laser irradiation on musculoskeletal pain, Arch. Phys. Med. Rehabil. Jun., 80 (6), 647-652. 192. Smith, C. F., Vangsness, C. T., Anderson, T., Good, W. (1995) Treatment of repetitive use carpal tunnel syndrome, Proc. SPIE vol. 2395, 658-661. 193. Gao, Y. O., Liu, T. C, Tang, X. J. (1998) Intravascular low-intensity He-Ne laser irradiation therapy on idiophatic edema, proc. SPIE vol. 3344, 167-170. 194. Brill, G. E., Proshina, O. V., Zhigalina, V. N., Filimonovskaya, S.N., Grigoriev, L. S., Romanova, T. P., Petrisheva, S. G., Zolotaryova, T. M. (1994) The reaction of blood formed elements to transcutaneous laser irradiation in shortterm stress, Proc. SPIE vol. 57, 657-660. 195. Kipshidze, N. N., Khomeriki, S.G., Kubatiev, A. A., Korochkin, I. M., Denisov, S. M., Shliapnikov, V. N. (1992) Lectin-induced chemiluminescence of peripheral blood neutrophils in patients with ischemic heart disease before and after blood irradiation with helium-neon laser, Kardiologiia., 32 (1), 53-66. 196. Pokora, L. (1992) Lasery w syomatlogii, Laser Instruments, Warszawa. 197. Bladowski, M., Czelej, G. (1995) Lasery terapeutyczne w stomatologii ogólnej, Laser Instruments, Warszawa. 104 198. Khotiaintsev, K. S., Doger-Guerrero, E., Glebova, L., Svirid, V., Sirenko, Y. (1996) Laser blood irradiation effect on electrophysical characteristics of acute coronary syndrome patients, Proc. SPIE vol. 2929, 132-137. 199. Kipshidze, N., Shota, H., Komorowski, R., Nikolaychik, V., Keelan, Jr MH., (1998) Photoremodeling of arterial wall reduces restenosie after baloon angioplasty in an atherosclerotic rabbit model, J. AM. Coll. Cardiol., 31 (5), 1152-1157. 200. Conti, P. C. (1997) LLLT in thhe treatment of temporomondibular disorders (TMD): a double-blind pilot study, Cranio Apr, 15 (2), 144-149. 201. Webb, C., Dyson, M., Lewis, W. H. (1998) Stimulatory effect of 660 nmlow level laser energy on hypertrophic scar-derived fibroblasts: possible mechanism for increase in cell counts, Lasers Surg. Med., 22 (5), 294-301. 202. Craig, J. A., Barlas, P., Baxter, G. D, Walsh, D. M., Allen, J. M (1996) Delayedonset muscle soreness: lack of effect of combined phototherapy/LLLT at low pulse repetition rates, J. Clin. Laser Med. Surg., 14 (6), 375-380. 203. Brugnera, A., Cruz, F. M., Zanin, F. A., Pecora, J. D. (1999) Clinical results evaluation of dentinary hypersensitivity patients treated with laser therpy, Proc. SPIE vol. 3593, 66-68. 204. Kato, M., Shinizawa, K., Yoshikawa, S. (1981) Cytochrome oxidase is a possible photoreceptor in mitochondria, Photochem. Photobiophys. vol. 2, 263-269. 205. Passarella, E., Casamassima, E., Molinari, S., Pastore, D., Quagliarieli, E., Catalano, I. M., Cingolani, A. (1984) Increase of proton electrochemical potential and ATP synthesis in rat liver mitochondria irradiated in vitro by HeNe laser, FEBS Lett.,vol. 175, 95-99. 206. Kim. C. S., Jung, J. (1995) Inactivation of the respirathory chain in plant mitochondria by visible light: the primary target of photodamage and endogenous photosensitizing chromophores, J. Photochem, Photobiol B: Biology, 29, 135-139. 207. Wilden, L., Karthein, R. (1998) Import of radiation phenomena of electrons and therapeutic low-level laser in regard to the mitochondrial energy transfer, J. Clinical Laser Medicine & Surgery, vol. 16, Number 3, 159-165. 208. Stryer, L. (1995) Biochemia, PWN, Warszawa. 209. Atkinson, D. E. (1977) Cellular energy metabolism and its regulation, 105 Academic Press, New York. 210. Bril, G. E. (2000) Molekularno-kinetyczne aspekty terapełtycznego zastosowania niskoenergetycznego promieniowania laserowego, Saratow. (in Russian) 211. Cooper, C. E., Springett, R. (1997) Measurment of cytochrome oxidase and mitochondrial energetics by near-infrared spectroscopy, Philes. Trans. R. Scotland B: Biol. Sci., 352, 669-676. 212. Mostnikov, V. A., Mostnikova, G. R., Plavski, V. Y. (1995) Molecular mechanism of biological and therapeutical effect of low-intensity laser irradiation, Proc. SPIE vol. 2391, 561-572. 213. Olson, H. J., Schimmering, W., Tobias, C. A. (1980) Laser action spectrum of reduced excitability in nerve cells, Brain Res., 204, 430-440. 214. Karu, T. (1992) Local pulsed heating of absorbing chromophores as a possible primary mechanism of low-power laser effects, in: G. Galletti L. Bolognani, G. Ussia (Eds.), Laser application in medicine and surgery, Monduzzi Editore, Bologna, 253-258. 215. Letokhov, V. S. (1990) Effects of trnsient local heating of spatially and spectrally heterogenous biotissue by short laser pulses, Nuovo Climento D, 13, 939-948. 216. Karu, T. (2000) Mechanism of low-power laser light action on cellular level, in: Lasers in Medicine, 97-127. 217. Bolognani, L., Volpi, N. (1991) Riactivation of partialy inactivated enzymes by low power laser beams, Radiol.Med., vol. 81, 81-86. 218. Lubart, R. and Breitbart, H. (2000) Biostimulative effects of Low Energy Lasers and their implication for medicine, Drug Development Research, 50, 471-475. 219. Ostuni, A., Passarella, S., Quagliariello, E. (1993) Photomodulation of glutamate dehydrogenase properties by red light, Journal of Photochemistry & Photobiology. B - Biology. 20 (2-3):101-11 220. Lubart, R., Sinyakov, M., Friedmann, H., Grossman, N., Solodiev, I., Zurgil, N. and Belotsky, S. (1999) Photobiostimulation by visible light: Involvement of hydroperoxide, Trends in Photochemistry and Photobiology, 6, 169-174. 221. Callaghan, G. A., Riordan, C., Gilmore, W. S., Mcintyre, I. A., Allen, J. M., Hanningan, B. M. (1996) Reactive oxygen species inducible by low-intensity laser radiation after DNA synthesis in the haemopoietic cell line U937, Lasers Surg. Med., 19, 201-206. 106 222. Cohen, N., Lubart, R., Rubinstein, S., Breibart, H., (1998) Light irradiation of mouse spermatoza: stimulation of in vitro fertilization and calcium signals, Photochem. Pchotobiol., 68, 404-413. 223. Ryabykh, T., Karu, T. (1995), Proc. SPIE vol. 2630, 12-21. 224. Lubart, R., Friedmann, H., Sinkov, M., Grossman, N. (1995), Laser Ther., 7, 101-106. 225. Polo, L., Jori, G., Bertoloni, L., Schindl, L., Schindl, A. (1997) Proc. SPIE vol. 3620. 226. Karu, T., Tiphlova, O., Esenaliev, R., Letokhov, V., (1994) Two different mechanisms of low-intensity laser photobiological effects on Escherichia coli. Journal of Photochemistry & Photobiology. B – Biology, 24 (3), 155-61. 227. Karu, T., Pyatibrat, L., Kalendo, G. (1994) Irradiation with He--Ne laser can influence the cytotoxic response of HeLa cells to ionizing radiation, International Journal of Radiation Biology, 65 (6), 691-7. 228. P. red. Graczyk, A. (1999) Fotodynamiczna metoda rozpoznawania i leczenia nowotworów, D.W. BELLONA, Warszawa. 229. P. red. Chwirot, B., Chwirot, S. (1995) Spektroskopia tkankowa – optyczne metody wczesnego wykrywania i lokalizacji nowotworów u człowieka, D.W. Pomerania, Toruń. 230. Lavie, L, Shainberg, A., Friedmann, H. and Lubart, R.(2001) Low power visible light and hydrogen peroxide change intracellular Ca concentration in cardiac cells, Submitted for publication: Photochem. Photobiol.. 231. Bolognani, L., Costato, M., Magnani, C., Venturelli, T., Vopoli, N., (1993) Laser stimulation of yeast: determination of fermentation activity and energy charge, Phisica Medica, vol. 9, 153-157. 232. Young, S. R., Dyson, M., Bolton, P. (1991) Effect of light on calcium uptake by macrofages, Laser Therapy, 3, 1-5. 233. Friedmann, H. and Lubart, R. (1996) Photobiostimulation by light-induced cytosolic Ca2+ oscillations, Laser Therapy, 8, 137-144. 234. Karu, T., Andreichuk, T., Ryabykh, T., (1993) Changes in oxidative metabolism of murine spleen following laser and superluminous diode (660-950 nm) irradiation: effects of cellular composition and radiation parameters, Lasers in Surgery & Medicine, 13 (4), 453-62. 235. Vacca, R. A., Marra, E., Quagliariello, E., Greco, M. (1994) Increase of both 107 transcription and translation activities following separate irradiation of the in vitro system components with He-Ne laser, Biochemical & Biophysical Research Communications, 203 (2), 991-7. 236. Vacca, R. A., Marra, E., Quagliariello, E., Greco, M., (1993) Activation of mitochondrial DNA replication by He-Ne laser irradiation, Biochemical & Biophysical Research Communications, 195 (2), 704-9. 237. Sroka, R., Schaffer, M., Fuchs, C., Pongratz, T., Schrader-Reichard, U., Busch, M., Schaffer, P.M., Duhmke, E., Baumgartner, R. (1999) Effect on mitosis of normal and humor cells inducted by light treatment of different wavelength, Lasers Surg. Med., 25, 263-271. 238. Shimoda, H. (1993) Wstęp do fizyki laserów, PWN, Warszawa. 239. Kaczmarek, F. (1986) Wstęp do fizyki laserów, PWN, Warszawa. 240. Niechoda, Z., Nowicki, M. (1995) „Podstawowe wiadomości o laserach i promieniowaniu laserowym”, w Zarys klinicznych zastosowań laserów, D.W. ANKAR, Warszawa. 241. Gawlik, W. (1987) „Współczesne źródła promieniowania świetlnego wykorzystywane w badaniach fotobiologicznyc, w „Molekularne podstawy zjawisk fotobiologicznych” p. red. Więckowskiego, S., Zeszyty Naukowe UJ. 242. Jóżwicki, R. (1981) Optyka laserów, WN-T, Warszawa. 243. Kujawski, A., Szczepański, P. (1999) Lasery – podstawy fizyczne, WPW, Warszawa. 244. Mroziewicz, B., Bugajski, M., Nakwaski, W. (1985) Lasery półprzewodnikowe, PWN, Warszawa. 245. Lubart, R., Friedmann, H., Sinyakov, M., Cohen, N. and Breitbart, H. (1997) Changes in calcium transport in mammalian sperm mitochondria and plasma membranes caused by 780 nm irradiation, Lasers in Surgery and Medicine, 21, 493-500. 246. Lubart, R., Friedmann, H., Levinshal, T., Lavie, R., Breitbart, H. (1992) Effect of light on calcium transport in bull sperm cells, Journal of Photochemistry & Photobiology. B – Biology, 15 (4), 337-41. 247. Cohen, N., Lubart, R., Rubinstein, S. and Breitbart, H. (1998) Light irradiation of mouse spermatozoa: stimulation of in vitro fertilization and intracellular calcium. Photochem. Photobiol., 68 (3), 407-413. 108 248. Lubart, R., Breitbart, H., Soffer, Y. and Lavie, R. (2001) He-Ne irradiation of human spermatozoa: Enhancement in Hamster Egg Penetration. Accepted for publication in Laser Therapy. 249. Ocana-Quero, J. M., Gomez-Villamandos, R., Moreno-millan, M., SantistebanValenezuela, J. M. (1997) Biological Effects of He-Ne laser irradiation on acrosome reaction in bull sperm cells, Photohem.Photobiol. B: 40, 294-298. 250. Lubart, R., Friedman, H., Cohen, N., Breitbart, H. (1998) Effect of He-Ne laser on calcium signals in sperm cells, G.F. Bottiroli, T. Karu and R. Lubart, Editor. Effect of Low Power Light on Biological System IV. Proceeding of SPIE, vol. 3569, 45-49. 251. de Lamirande, E., Jiang, H., Zini, A., Kodama, H., and Gagnon, C. (1997), Rev. Reprod. 2, 48-54. 252. Bolognani, L., Volpi, N. (1991) Riactivation of partialy inactivated enzymes by low power laser beams, Radiol.Med., vol. 81, 81-86. 253. Szydłowski, H. (1994) Pracownia fizyczna, PWN, Warszawa. 254. Strona internetowa: http://www.macromolecules.spectrum.com. 255. Laszczka, A., Godlewski, M., Kwiecińska, T., Rajfur, Z., Sitko, D., SzczęśniakFabiańczyk, B., Sławiński, J. (1995) Ultraweak luminescence of spermatoza, Curr. Topics Biophys., 19, 20-31, 256. Godlewski, M., Kwiecińska, T., Wierzuchowska, D., Szczęśniak-Fabiańczyk, B., Gogol, P., Płachta, A. and Gawlik, W. (2002) Effect of low level laser radiation no bull spermatozoa, in: Molecular and physiological aspects of regulatory processes of the organism (Materials of 11th International Symposium of Polish Network of Molecular and Cellular Biology UNESCO (PAS)), ed: Lach, H., Wydawnictwo Naukowe AP, Cracow. 109 110
