Cytometria przepływowa
advertisement
Fakultet: Cytometria – zastosowanie w badaniach biologicznych Wprowadzenie do cytometrii przepływowej: co i jak mierzy cytometr Nadzieja Drela Zakład Immunologii WB UW [email protected] FLOW = fluid CYTO = cell METRY = measure Czy są jakieś cechy wspólne? Blood cells Algae Chromosomes Protozoa beads 8 mm 12 mm 14 mm • wielkość względna • ziarnistość względna wewnętrzna organizacja Co się dzieje, gdy na komórkę pada wiązka światła? Pomiar światła rozproszonego „do przodu” (FSC) i „na boki” (SSC) Forward scatter Cell size (488 nm) Coherent lightsource (488 nm) Side scatter Granularity (488 nm) Forward scatter (FSC) Side scatter (SSC) measured along the axis of the incoming light measured in 90° direction to the excitation light proportional the the cell size / cell surface (only true for perfect round cells) proportional to cell „complexity“ or granularity Fluorescencja l=488 nm l=530 nm Excitation light Emission light • The fluorochrome molecule absorbes the energy of the incoming light • It releases the absorbed energy by: vibration and dissipated heat emission of a photon with a higher wavelength ( = less energetic) Intensywność fluorescencji FITC FITC FITC Number of Events FITC FITC FITC 101 102 103 Relative fluorescence intensity 104 „Automatyczny mikroskop” Detector & Counter Waste Sample This primitive diagram shows the principle: Cells are passing the microscope objective, and an electronic circuit decides whether the cells is fluorescent or not. This is how a flow cytometer works! Jak to jest mierzone? Elementy typowego cytometru przepływowego: • Układ hydrauliczny (układ płynów) • Źródła światła • Układ optyczny • Układ elektryczny (przetwarzanie sygnałów świetlnych na impulsy elektryczne (analogowe) • System analizy danych FACS Calibur FACS Verse FACS Aria Cytometr – schemat budowy Cytometr – schemat budowy Źródło światła Układ hydrauliczny Flow chamber Komputer (zbieranie danych, analiza) Układ optyczny Układ elektryczny Źródła światła Blue laser (488 nm) Red laser (637 nm) Blue laser (488 nm) Red laser (635 nm) Yellow laser (561 nm) Violet laser (407 nm) Głównym źródłem światła są lasery emitujące światło monochromatyczne o dużym natężeniu. Światło laserowe charakteryzuje się ograniczonym „spot size”, co oznacza, że wiązka światła jest zogniskowana w małej objętości płynu, przez który przechodzi komórka. W efekcie, w wiążce światła znajduje się tylko jedna komórka. Najczęściej używane lasery są chłodzone powietrzem: Argonowy, blue laser – 488 nm He-Ne – 633 nm Moc laserów: 10-25 mW Laser diodowy, 488 nm, 200 mW (większa moc lasera zwiększa jego czułość. Lasery o dużej mocy używane są do analizy chromosomów i ich sortowania. Układ hydrauliczny (flow chamber/ flow cell) Ogniskowanie hydrodynamiczne Ogniskowanie hydrodynamiczne Sample Sample Sheath Sheath Sample pressure low, small core stream. Good for DNA analysis High sample pressure, broader core stream. Bad for DNA analysis Laser Beams Ogniskowanie hydrodynamiczne c.d. Prędkość przepływu komórek: Low - 240/sekundę Medium - 700/sekundę High – 1200/sekundę Układ optyczny Układ optyczny Filtry optyczne Absorbed Reflected Transmited Typowy układ filtrów selekcjonujących światło o określonej długości fali Filtry/zwierciadła dichroiczne – filtry optyczne do selektywnego przepuszczania światła w danym zakresie widma, a odbijania w każdym innym zakresie. Filtry optyczne Longpass 460 500 LP 500 540 Shortpass 460 500 SP 500 540 Bandpass 460 500 540 BP500/50 Układ elektryczny: jak powstaje sygnał elektryczny przy pomocy fotopowielaczy t 1. Laser Voltage t 2. Laser Voltage t 3. Laser Voltage A B C Zadania układu elektronicznego Convert the optical signals into electronic signals (voltage pulses) Digitise the data Analyse Height (H), Width (W) and Area (A) of the pulse Send the data to the analysis computer Pulse Height (H) Voltage Height, Area, and Width Pulse area(A) 0 40 Pulse Width (W) Time (µs) Generowanie sygnału cyfrowego Field Programmable Gate Arrays Digital data in memory Digital Signal Processor Area PE Height Computer FITC Przetwarzanie sygnału Fluorescencja jeszcze raz l=488 nm l=530 nm Excitation light Emission light • The fluorochrome molecule absorbes the energy of the incoming light • It releases the absorbed energy by: vibration and dissipated heat emission of a photon with a higher wavelength ( = less energetic) Wykorzystywanie fluorochromów Wzbudzenie fluorescencji Wzbudzenie fluorescencji Przesunięcie Stokesa Fluorochromy pojedyncze i tandemowe Większość tandemowych wzbudzana przez 488 nm (cel: zwiększenie przesunięcia Stokesa) Spektra emisji fuorescencji Spektra emisji fuorescencji Spektra emisji fuorescencji Spektra emisji fuorescencji Kompensacja ~700 ~700 Kompensacja Which marker for compensation? Small errors in compensation of a dim control (A) can result in large compensation errors with bright reagents (B & C). Use bright markers to setup proper compensation. Kompensacja PE 585/42 FITC PE-Cy7 780/60 PerCP-Cy5.5 695/40 Relative Intensity 530/30 APC 660/20 500nm 550nm 600nm 650nm Wavelength (nm) 700nm 750nm 800nm Analiza danych Histogram Cytogram A - dot plot B - density plot C - contour plot Jak wykorzystać informacje o rozproszeniu światła przez różne obiekty (komórki) Side scatter Granulocytes Monocytes Lymphocytes Debris Forward scatter Skala liniowa vs logarytmiczna Skala liniowa vs logarytmiczna Cytometria przepływowa •Pomiar komórek zawieszonych w płynie •Analiza wielu parametrów jednocześnie (analiza wieloparametrowa) •Jedna komórka analizowana jest raz: analizowane są komórki w populacji w zawiesinie •Pomiar światła rozproszonego i pomiar fluorescencji emitowanej przez fluorochromy •Sortowanie komórek/chromosomów •Duża szybkość pomiaru (do 10 tys. komórek/sek.) •Wykrywanie śladowych populacji komórek Dziękuję za uwagę
