charakterystyka fenotypowa i genotypowa krajowych izolatów

CHARAKTERYSTYKA FENOTYPOWA I GENOTYPOWA
KRAJOWYCH IZOLATÓW YERSINIA RUCKERI W ASPEKCIE ICH
PATOGENNOŚCI DLA RYB
AUTOR: mgr Agnieszka Pękala
PROMOTOR:
prof. dr hab. Jerzy Antychowicz
RECENZENCI:
prof. dr hab. Antonina Sopińska, prof. dr hab. Józef Pilaszek
STRESZCZENIE
Choroba czerwonej gęby (ERM - Enteric Red Mouth), nazywana inaczej jersiniozą, jest
groźną jednostką chorobową ryb łososiowatych, wywoływaną przez Yersinia ruckeri. Po raz
pierwszy bakterię tą wyizolowano w 1955 roku od chorych pstrągów tęczowych w miejscowości
Hagerman w stanie Idaho (USA). ERM wciąż rozprzestrzenia się w populacji ryb i obecnie
diagnozowana jest na obu kontynentach amerykańskich, Australii, a także prawie wszystkich krajach
Europy, w tym w Polsce. Jersinioza jest wciąż aktualnym problemem w hodowlach ryb
łososiowatych. Straty spowodowane wystąpieniem tej jednostki chorobowej mogą sięgać 30 – 70%
obsady rocznie. W latach 2000-2007 ogółem zgromadzono 126 izolatów Yersinia ruckeri
pochodzących z obiektów hodowli ryb zlokalizowanych na terenie całego kraju. Najwięcej, 102
(80,9%) izolaty pochodziło z północnej i północno-zachodniej części Polski, pozostałe 24 (19%) z
części centralnej i południowej. Przeważającą część izolatów, bo aż 113, pozyskano od pstrągów
tęczowych, które wykazywały objawy ERM i/lub śnięcia. Pozostałe 8 izolatów Y. ruckeri pochodziło
od ryb klinicznie zdrowych: pstrągów - 4 izolaty, karpi - 1 izolat oraz szczupaków, od których, po
raz pierwszy na świecie, wyosobniono 3 izolaty Y. ruckeri. Do badań wykorzystano również pięć
izolatów znajdujących się w kolekcji szczepów bakteryjnych Zakładu Chorób Ryb PIWet-PIB.
Wszystkie
zgromadzone
izolaty
Y.
ruckeri
były
Gram-ujemnymi
pałeczkami,
w większości nie wykazującymi ruchu (74,6% zgromadzonych izolatów). Określenie profili
biochemicznych izolatów Y. ruckeri wykonano przy użyciu zestawu API 20E wraz z testami
komplementarnymi. Wyniki odnoszono do danych literaturowych. Niektóre izolaty różniły się
między sobą w reakcjach w testach na produkcję β-galaktozydazy, dekarboksylazę lizyny,
wykorzystanie cytrynianu, reakcji V-P, hydrolizy żelatyny i wytwarzania sorbitolu.
Jako metodę potwierdzającą identyfikację izolatów Y. ruckeri wybrano technikę PCR, w
której zastosowano specyficzne startery umożliwiające powielenie fragmentu DNA regionu
konserwatywnego małej podjednostki (16S) rybosomalnego RNA. Przed przystąpieniem do badań
zoptymalizowano warunki reakcji poprzez określenie temperatury przyłączania starterów oraz dobór
ich stężenia, a także koncentrację jonów Mg+2. Próg wykrywalności dla PCR ustalono na 5 x 102
komórek bakterii/ml.
Charakterystykę fenotypową zgromadzonych izolatów Y. ruckeri przeprowadzono określając
biotypy na podstawie różnic w profilach biochemicznych izolatów Y. ruckeri. Podział na biotypy
opierał się na zdolności ruchu bakterii oraz reakcjach w testach na hydrolizę Tween 80, hydrolizę
żelatyny i kazeiny, reakcje V-P, β-galaktozydazę oraz wytwarzanie kwasu z sorbitolu. Na podstawie
analizy tych reakcji, wszystkie 126 izolaty Y. ruckeri podzielono na biotypy: 32 izolaty
zaklasyfikowano do biotypu 1, a 94 do biotypu 2. Dodatkowo, w obrębie biotypu 1 wyróżniono dwie
biogrupy: biogrupę 1, do której zaliczono 24 izolaty oraz biogrupę 2 z 8 izolatami. Izolaty pozyskane
od karpi, szczupaków, a także 4 izolaty pozyskane od klinicznie zdrowych pstrągów zostało
zaliczone do biotypu 2 biotypu 1. Izolaty zaklasyfikowane do biotypu 2 pochodziły natomiast od
pstrągów wykazujących charakterystyczne objawy jersiniozy połączone ze śnięciami.
Do określenia serotypów izolatów Y. ruckeri wykorzystano reakcję aglutynacji. Badano
zdolność aglutynacji izolatów Y. ruckeri ze specyficznymi surowicami poliklonalnymi skierowanymi
na określony serotyp bakterii Y. ruckeri. Wykazano, że na terenie Polski występują trzy serotypy:
O1, O5 i O7, przy czym serotyp O1 stanowi najliczniejszą grupę (93,6%). Serotyp O5
reprezentowany był przez izolaty wyosobnione od szczupaków, a do serotypu O7 zaliczono izolaty
pozyskane od karpi oraz klinicznie zdrowych pstrągów.
Określano
chemioterapeutyki,
wrażliwość
takie
jak
Y.
ruckeri
na
oksytetracyklina,
najczęściej
flumechina,
stosowane
w
enrofloksacyna,
ichtiopatologii
sulfonamidy
potencjonowane trimetoprimem oraz kwas oksolinowy. Wykazano skuteczność działania
oksytetracykliny, flumechini i enrofloksacyny, jak również sulfonamidów potencjonowanych
trimetoprimem na wszystkie (100%) izolaty Y. ruckeri. Natomiast kwas oksolinowy wykazywał
skuteczność w stosunku do 80% izolatów.
Rozdział SDS-PAGE nie wykazał różnic na poziomie białkowym pomiędzy zgromadzonymi
izolatami Y. ruckeri. Technika Western blot z wykorzystaniem surowic królików immunizowanych
poszczególnymi serotypami bakterii Y. ruckeri wykazała charakterystyczne reakcje antygenprzeciwciało, specyficzne dla konkretnych serotypów tej bakterii. Wykryto pięć specyficznych
reakcji dla białek serotypu O1 o masach molekularnych 18 kDa, 65 kDa, 80 kDa, 90 kDa i 100 kDa,
z przeciwciałami skierowanymi przeciwko serotypowi O1. Wykryto trzy specyficzne reakcje białek
izolatów należących do serotypu O5 z przeciwciałami skierowanymi przeciwko serotypowi O5.
Masy molekularne tych białek wynosiły 50 kDa, 66 kDa i 68 kDa. Specyficzne sygnały dla białek o
masie molekularnej 18 kDa oraz z zakresu 60 – 80 kDa wykryto w reakcji izolatów Y. ruckeri
należących do serotypu O7 z przeciwciałami skierowanymi przeciwko serotypowi O7.
W oparciu o analizę komputerową obrazów elektroforetycznych uzyskanych przy
zastosowaniu metody ERIC-PCR, wygenerowano dendrogram, który wyróżnił trzy grupy izolatów
Y. ruckeri o stosunkowo niskim pokrewieństwie względem siebie. Izolaty reprezentujące serotyp O5,
wraz z izolatami z serotypu O7, utworzyły oddzielną grupę filogenetyczną. Referencyjne szczepy
reprezentujące serotyp O5 i O7 również utworzyły własną grupę, ale znajdującą się na odrębnej
gałęzi. Izolaty zaklasyfikowane do serotypu O1 zostały rozmieszczone głównie w obrębie jednej
gałęzi. Metoda PCR-RFLP nie wykazała żadnych różnic pomiędzy izolatami Y. ruckeri oraz
szczepami referencyjnymi.
Eksperymentalnie zakażano pstrągi tęczowe izolatami Y. ruckeri należącymi do serotypu O1,
a dodatkowo zaklasyfikowane do biotypu 2. Izolaty te były chorobotwórcze dla ryb i wywołały u
nich objawy kliniczne jersiniozy połączone ze śnięciami. Wykazano, że objawy choroby są zależne
od wieku ryb i temperatury wody, w której są one przetrzymywane. Najbardziej wrażliwy na
zakażenie były narybek pstrąga tęczowego o masie jednostkowej wynoszącej od 10 do 100 g, bez
względu na temperaturę wody. Pstrągi o masie jednostkowej wynoszącej 220 g nie wykazywały
objawów chorobowych w temperaturze wynoszącej 22ºC. Zakażenia pstrągów izolatami należącymi
do serotypu O5 i O7 nie powodowały rozwoju choroby. Tylko u wylęgu żerującego pstrąga,
przetrzymywanego w temperaturze wody wynoszącej 8ºC, obserwowano śnięcia, które wyniosły
73%.
SUMMARY
Enteric redmouth (ERM), called yersiniosis, caused by Yersinia ruckeri, is a serious disease
of salmonids. The bacterium was initially isolated from diseased rainbow trout in the Hagerman
valley of Idaho, USA, in the 1955. ERM is still spreading in fish populations and now it is identified
throughout other parts of North and South America, Australia, Europe including Poland. Yersiniosis
is still a topical problem in trout farms. The mortality caused by this disease amounted to about 30 –
70% of stock per year. During 2000 – 2007, 126 isolates of Y. ruckeri were collected from trout
farms located in different areas of Poland. Much more isolates (102 - 80,9%) were found from the
northern and the north-western part of Poland than from the central and southern part of our country
(24 isolates - 19%). The predominating number of isolates (113) has originated from the rainbow
trout’s showing the ERM symptoms, the rest isolates (8 isolates) from clinically healthy fish i.e. 4
from rainbow trouts, 1 from carps and, for the first time in the world, 3 isolates from pikes. Also 5
isolates from the Department of Fish Diseases of NVRI own strain collections were used in the
investigations.
All isolates of Y. ruckeri were Gram-negative and 74,6% of them were nonmotile rods.
Biochemical tests were performed by API 20E system with complementary tests and the achieved
results were compared with the published data. The different reactions were observed in some of the
isolates in production of β-galactosidase, lysine decarboxylase, citrate utilisation, Voges-Proskauer
reaction, gelatin degradation and acid production from srobitol.
A PCR test has been used to determine the identification of Y. ruckeri isolates by utilizing
partial 16S rRNA sequences of a species-specific 16S rRNA oligonucleotide. Certain component
concentration and conditions like the temperature used in the primers annealing step and their
concentration, and Mg2+ concentration in the reaction mixture were optimizing. The detection limit
of PCR was determined on 5 x 102 cells/ml level.
Phenotypic characteristic of Y. ruckeri isolates was carried out by comparing the different
biochemical profiles of isolates Y. ruckeri for biotypes determination. Motility, Tween 80 hydrolysis,
gelatin and caseine hydrolysis, Voges-Proskauer reaction, production of β-galactosidase and acid
production from srobitol were taken into consideration to distinguish biotypes. After analysis of
these reactions, all of 126 isolates were classified to biotypes: 32 isolates were classified to biotype1
and 94 isolates to biotype 2. Additionally, biotype 1 was divided on two biogroups: biogroup 1 with
24 bacteria isolates and biogroup 2 with 8 bacteria isolates. The bacteria isolates collected from
carps, pikes and four isolates collected from healthy trouts were classified to biogroup 2 biotype 1.
All bacteria isolates belonging to biotype 2 were collected from diseased trout.
The agglutination tests have been used to determine the serotypes of isolates. The bacterial
cultures of isolates of Y. ruckeri were examined for ability to agglutinate polyclonal antisera raised
against all serotypes of Y. ruckeri strains. The presence of three serotypes i. e.: O1, O5 and O7 have
been determined in Poland. Serotype O1 showed to be the most popular (93,6%) in our country. The
bacteria isolates collected from pikes belonged to serotype O5. Serotype O7 was represented by Y.
ruckeri isolates collected from carps and healthy trout’s.
The Y. ruckeri isolates were tested for antimicrobial susceptibility. The following
chemotherapeutic
agents
were
used:
oxytetracycline,
flumequine,
enrofloxacine,
sulphonamide/trimethoprim and oxolinic acid. All isolates appeared to be highly sensitive (100%) to
oxytetracycline, flumequine, enrofloxacine and sulphonamide/trimethoprim. The majority i. e. 80%
of Y. ruckeri isolates was sensitive to oxolinic acid.
No protein differences among all the bacteria isolates were determined by SDS-PAGE.
Serums from rabbits immunized by reference strains belonging to each serotypes were used in
Western blott. Serotypes-specific antigen-antibodies reactions were discriminated. Five proteins of
molecular weight of 18 kDa, 65 kDa, 80 kDa, 90 kDa and 100 kDa were serotype-specific for
reaction of proteins of isolates belonging to serotypes O1 with antibodies anty-O1. Antibodies antyO5 reacted specific to three proteins of the isolates belonging to O5 serotypes. The molecular
weights of these proteins were discriminated on 50 kDa, 66 kDa and 68 kDa molecular weight.
Specific reactions between the isolates belonging to serotypes O7 and anty-O7 antibodies were
detected as well. The serotypes specific signals were distinguished for proteins of the range of
molecular weight from 60 to 80 kDa and 18 kDa of isolates belonging to O7 serotype with
antybodies anty-O7.
Dendrogram based on the computer analysis data of agarose gels of ERIC-PCR products was
generated. Three groups were discriminated denoting a low degree of genetic variability among the
isolates of Y. ruckeri. The isolates classified to serotypes O5 and O7 shared the same group. The
reference strains of serotypes O5 and O7 formed the own group but on the other cluster. The isolates
belonging to serotypes O1 mostly shared the same group. PCR-RFLP methods showed no difference
between the isolates and references strains of Yersinia ruckeri.
The isolates belonging to serotype O1 and additionally to biotype 2 were pathogenic for
rainbow trout in laboratory-based infectivity experiments. The clinical signs of ERM and dead fish
were observed. It occurred the clinical signs are the age and water temperature dependent. Juvenile
rainbow trout of body’s weight about 10 – 100 g were the most susceptible for bacteria inoculations
without dependence on water temperature. The rainbow trout at about 220 g of body’s weights,
maintained in water temperature about 22°C showed no clinical signs. Groups of the rainbow trout
inoculated by isolates of Yersinia ruckeri belonging to serotypes O5 and O7 showed no clinical
signs. Only group of rainbow trout fry maintained in water temperature about 8°C showed 73%
mortalities.