9_dozymetria biologiczna
advertisement
OCHRONA RADIOLOGICZNA 2 Dozymetria biologiczna Jakub Ośko Dozymetria biologiczna Pozwala na ocenę dawki pochłoniętej na podstawie zmian zachodzących w organizmie człowieka. Stosowana w sytuacjach awaryjnych do określania dużych dawek. 2 Estymator dawki System zarządzania wypadkami radiacyjnymi (Radiation Event Medical Management) opracowany przez Narodowy Instytut Zdrowia (National Health Institute) w USA zawiera estymator dawki (REMM Dose Estimator) oparty na trzech metodach oszacowania dawki: • ocenie czasu wystąpienia wymiotów • ocenie kinetyki zaniku limfocytów • ocenie częstości występowania chromosomów dicentrycznych. 3 Estymator dawki Ocena czasu wystąpienia wymiotów i ocena kinetyki zaniku limfocytów • obserwacje kliniczne • Badanie odpowiedzi całego organizmu 4 Estymator dawki Częstość występowania chromosomów dicentrycznych (dozymetria biologiczna) • metoda laboratoryjna • ocena natężenia czynnika uszkadzającego DNA (np. dawki pochłoniętej promieniowania) na podstawie zmian w komórkach lub tkankach człowieka (np. komórkach krwi obwodowej lub szpiku kostnego, kościach czy szkliwie zębów) • korelacja skutków napromienienia z badaniami modelowymi pozwala na oszacowanie dawki pochłoniętej 5 Metody dozymetrii biologicznej • natychmiastowe • retrospektywne 6 Metody natychmiastowe Ocena dawki w krótkim czasie po napromienieniu poprzez pomiar zjawisk przemijających, związanych z powstawaniem uszkodzeń DNA. 7 Metody natychmiastowe ZALETA pomiar zjawisk bezpośrednio związanych z ekspozycją na promieniowanie WADA pomiar zjawisk bezpośrednio związanych z ekspozycją na promieniowanie – procesy naprawy uszkodzeń DNA zachodzące w komórce po napromienieniu eliminują przyczynę powstawania tych zjawisk, metod natychmiastowych nie można użyć retrospektywnie. 8 Metody natychmiastowe • Test kometowy • Test ognisk histonu γH2AX 9 Test kometowy Metoda badania narażenia populacji ludzkich na określone czynniki środowiskowe lub endogenne. Oznaczanie uszkodzeń DNA na poziomie pojedynczych komórek w limfocytach krwi obwodowej. 10 Test kometowy • Umieszczenie zawiesiny badanych komórek w agarozie o niskiej temperaturze krzepnięcia • Naniesienie preparatu na podstawowe szkiełko mikroskopowe • Zestalenie się warstwy agarozowej komórki • Liza w obecności detergentu • Elektroforeza niskonapięciowa • Zobojętnienie preparatu i barwienie barwnikiem fluorescencyjnym interkalującym DNA • Ocena wybarwionego DNA przy uzyciu mikroskopu fluorescencyjnego i ocena uszkodzenia DNA Agaroza - polisacharyd będący polimerem pochodnych galaktozy, otrzymywany przez oczyszczanie z agaru jadalnego. Liza - rozpad obłonionych elementów (zwykle komórek) poprzez dezintegrację błony i wylanie się zawartości do środowiska 11 Test kometowy • • • Wysokie pH i stężenie soli w procesie lizy i elektroforezy powoduje oddysocjowanie większości białek macierzy jądrowej oraz rozerwanie wiązań wodorowych pomiędzy nićmi DNA, co powoduje częściową relaksację superzwinięcia nici DNA. Po przyłożeniu napięcia nici DNA są wywlekane z jądra w kierunku anody, powodując powstawanie tzw. "ogona" komety. Nieuszkodzona część DNA, pozostaje związana z macierzą jądrową tworząc "głowę" komety. 12 Test kometowy • Prostota wykonania • Mała inwazyjność • Do przeprowadzenia testu wystarczy kropla krwi z palca. • Duża czułość • Możliwość mierzenia uszkodzeń DNA w pojedynczych komórkach 13 Test ognisk histonu γH2AX Określenie liczby podwójnoniciowych pęknięć nici DNA (DSB) na podstawie występowania skupisk (ognisk) charakterystycznych białek w miejscach uszkodzeń. Histony – białka składowe chromatyny, bezpośrednio związanymi z nićmi DNA. W momencie powstania DSB jeden z histonów (H2AX) ulega fosforylacji, dając γH2AX. Reakcja ta występuje tylko w miejscu powstania DSB. Liczba ognisk γH2AX odpowiada liczbie DSB. Fosforylacja – przyłączenia reszty fosforanowej do nukleofilowego 14 Test ognisk histonu γH2AX • Umieszczenie komórek na szkiełku podstawowym • Utrwalenie • Dodanie przeciwciała wyznakowanego barwnikiem fluorescencyjnym specyficznie wiążącego się z histonem γH2AX. 15 Test ognisk histonu γH2AX WADA szybkie zanikanie ognisk w wyniku naprawy DSB, co uniemożliwia użycie testu w dozymetrii retrospektywnej. ZALETA wysoka specyficzność, histon H2AX ulega fosforylacji tylko w momencie wystąpienia DSB. 16 Metody retrospektywne oparte na pomiarze zjawisk biologicznych lub zjawisk fizyko-chemicznych badanie trwałych skutków działania promieniowania. • • biologiczne fizyko-chemiczne 17 Metody biologiczne określenie częstości powstawania zmian genetycznych w wyniku nieprawidłowej naprawy DNA – mikrojądrowa, – oznaczanie częstości występowania wymian odcinków chromatyd siostrzanych – oznaczanie częstości występowania aberracji chromosomowych Czułość 0,1-0,5 Gy 18 Metody fizyko-chemiczne • spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) czułość 0,1 Gy 19 Metoda mikrojądrowa • Metoda cytogenetyczna pozwalającą na wykrywanie podwójnoniciowych pęknięć DNA i uszkodzeń wrzeciona podziałowego ujawniających się po podziale komórek. • Mikrojądro powstaje, jeżeli w czasie mitozy cały chromosom lub fragment chromosomu nie zostanie rozdzielony pomiędzy dwa jądra potomne. Powinno ono być: – mniejsze niż ⅓ wielkości normalnego jądra, – wyraźnie oddzielone od jądra, – podobnie wybarwione jak jądro komórki. 20 Metoda mikrojądrowa • Mikrojądra łatwo liczy się przy użyciu mikroskopu – w czasie normalnych podziałów komórki (historycznie pierwsza metoda), – w komórkach dwujądrzastych stosując cytochalazynę B, która blokuje podział cytoplazmy (cytokinezę) – łącząc test z metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ 21 Metoda mikrojądrowa z cytochalazyną 0h – stymulacja podziałów komórki przez dodanie fitohemaglutyniny mitoza 48h – zablokowanie podziału cytoplazm-my przez dodanie cytochalazyny B bez cytochalazyny 22 Metoda mikrojądrowa • Test mikrojądrowy wykonuje się z reguły na: – limfocytach krwi obwodowej – komórkach nabłonka worka policzkowego, – erytrocytach – komórkach szpiku kostnego. 23 Metoda wymian odcinków chromatyd siostrzanych • SCE, ang. sister chromatid exchange • Badanie częstości występowania wzajemnych, symetrycznych wymian fragmentów pomiędzy identycznymi sekwencjami DNA obu chromatyd w chromosomie. • Ocena w płytkach metafazalnych uzyskanych z hodowli komórek prowadzonych w obecności bromodeoksyurydyny (BrdU), która jest wbudowywana w nić DNA w czasie syntezy. 24 Metoda wymian odcinków chromatyd siostrzanych • W czasie podziału mitotycznego BrdU trafia do jednej z komórek potomnych. Obecność BrdU w DNA można wykryć stosując specjalne metody barwienia. • W drugiej mitozie obserwuje się symetryczne wymiany pomiędzy chromatydami zawierającymi BrdU i tymi, które BrdU nie zawierają. 25 Metoda wymian odcinków chromatyd siostrzanych + BrdU Limfocyt G0 + BrdU 1 mitoza 0h – stymulacja podziałów komórki przez dodanie fitohemaglutyniny 2 mitoza 72h – zablokowanie podziału jądra przez dodanie kolcemidu 26 Metoda wymian odcinków chromatyd siostrzanych • SCE jest prawdopodobnie procesem naturalnym zwiększający zróżnicowanie genetyczne. • Brak korelacji z dawką pochłoniętą promieniowania. • Obecnie metoda wychodzi z użycia i jest używana głównie do badania cytotoksyczności związków chemicznych in vitro. 27 Metoda aberracji chromosomowych • Aberracje chromosomowe powstają w wyniku błędnej naprawy DSB (jeżeli w komórce występują jednocześnie dwa lub więcej DSB, wolne końce nici mogą zostać błędnie połączone). translokacje międzychromosomowe translokacje wewnątrzchromosomowe 28 Metoda aberracji chromosomowych • W wyniku aberracji przywrócona zostaje ciągłość nici DNA, więc zmiany, o ile nie prowadzą do śmierci komórki, są trwałe i mogą być przekazywane w czasie podziału komórkom potomnym. • Do badań narażenia ludzi wykorzystuje się zwykle limfocyty krwi obwodowej. Po około 48 godzinach dodaje się do hodowli limfocytów kolcemidu, substancji blokującej tworzenie się wrzeciona podziałowego i rozchodzenie się chromosomów w czasie mitozy. W ten sposób podział komórki jest zablokowany na początku mitozy, co pozwala na ocenę wszystkich chromosomów 29 Metoda aberracji chromosomowych • Analiza aberracji chromosomowych w komórkach pozwala na wykrycie dostrzegalnych przy użyciu mikroskopu zmian w liczbie (aberracje numeryczne) i morfologii chromosomów (aberracje strukturalne). 30 Metoda aberracji chromosomowych • Aberracje numeryczne zwykle są nieprzydatne dla potrzeb dozymetrii biologicznej, z uwagi na często występujące artefakty związane z preparatyką komórek. • Aberracje strukturalne – – – – złamania chromosomów i chromatyd, chromosomy pierścieniowe chromosomy dicentryczne fragmenty acentryczne. są wykorzystywane do szacowania dawki pochłoniętej. 31 Metoda aberracji chromosomowych • Najlepszą korelację pomiędzy występowaniem określonego typu aberracji i dawką pochłoniętą uzyskuje się dla chromosomów dicentycznych. • Powstanie chromosomu dicentrycznego prowadzi zwykle do śmierci komórki, co powoduje, że są one stosunkowo szybko eliminowane z krwioobiegu. • Duża pracochłonność i konieczność zatrudnienia do oceny preparatów wysokokwalifikowanego personelu. 32 Metoda aberracji chromosomowych • Metoda hybrydyzacji in situ z zastosowaniem barwników fluorescencyjnych (FISH) pozwala na wykrywanie niedostrzegalnych bez takiego barwienia translokacji fragmentów chromosomów. 33 Metoda aberracji chromosomowych Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (ang. fluorescent in situ hybridization, FISH) • technika cytogenetyczną, • wykrywanie w badanym materiale genetycznym określonej sekwencji DNA za pomocą fluorescencyjnych sond DNA. – usunięcie cytoplazmy z komórek i utrwalenie jąder komórkowych na szkiełku podstawowym – naniesienie sondy na preparat i krótkotrwała denaturacja w podwyższonej temperaturze, która powoduje rozerwanie się wiązań wodorowych pomiędzy nićmi DNA – hybrydyzacja, w czasie której fluorescencyjnie wyznakowane odcinki znanego DNA (sonda) wiążą się z komplementarnymi odcinkami badanego DNA. – analiza przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. 34 Metoda aberracji chromosomowych FISH • badanie aberracji chromosomowych w limfocytach krwi obwodowej • dokładniejsza analiza translokacji niż w klasycznej analizie cytogenetycznej technika wielokolorowej FISH (ang. multicolor FISH, m-FISH), • każdy chromosom hybrydyzuje z sondą wyznakowaną innym kolorem • badanie translokacji złożonych z fragmentów kilku chromosomów 35 Metoda aberracji chromosomowych 36 EPR Metoda elektronowego paramagnetycznego rezonansu (EPR) • pomiar ilości stałych rodników tworzących się w ciele człowieka pod wpływem promieniowania jonizującego • np. hydroksyapatyt (Ca10 (PO4)6(OH)2) zawarty w kościach i szkliwie zębów – – Węglany zawarte w hydroksyapatycie pod wpływem promieniowania jonizującego przekształcają się w anionorodniki węglanowe (CO2-). Trwałość: 107 lat. 37 EPR Przygotowanie próbki: • oddzielenie korzenia zęba od jego korony i usunięcie z niej dentyny • kruszenie szkliwa i rozcieranie na proszek. Pomiar w spektrometrze EPR w paśmie X. Dawkę pochłoniętą określa się na podstawie wielkości piku sygnału charakterystycznego dla CO2-. Czułość: 0,1 Gy. 38 Dziękuję za uwagę 39
