Zastosowanie metod analiz DNA we współczesnym leśnictwie (PDF
advertisement
Stowarzyszenie Inżynierów i Techników Leśnictwa i Drzewnictwa postępy techniki w leśnictwie 122 Zastosowanie metod analiz DNA we współczesnym leśnictwie Stowarzyszenie Inżynierów i Techników Leśnictwa i Drzewnictwa Dyrekcja Generalna Lasów Państwowych rekomenduje publikację do celów szkoleniowych kadry leśnej. Komitet Redakcyjny „Postępów Techniki w Leśnictwie”: Przewodniczący i redaktor naczelny – Krzysztof Jodłowski Zastępca przewodniczącego – Marek Berft Sekretarz – Zbigniew Święcicki Redaktorzy – Olgierd Łęski, Tadeusz Moskalik Jacek Stocki, Anna Tylman, Jerzy Zieliński Redaktor wiodący zeszytu – Justyna Nowakowska Treść artykułów zamieszczanych w „Postępach Techniki w Leśnictwie” jest wyrazem poglądów prezentowanych przez Autorów opracowań. Komitet Redakcyjny zastrzega sobie prawo do dokonywania zmian wynikających z opracowania redakcyjnego artykułów. © Copyright by Zarząd Główny SITLiD, Warszawa 2013 r. ISSN 0562-1445 Wydawnictwo Świat, 02-554 Warszawa Al. Niepodległości 156/6, tel./fax 849-41-96 www.wydawnictwo-swiat.pl Okładka: Gacki brunatne w kolonii letniej znajdującej się w leśniczówce w okolicach Stężycy. Z przeprowadzonych badań genetycznych wynika, że przedstawiciele tego gatunku występujący na terenie naszego kraju charakteryzują się niezwykle wysokim zróżnicowaniem genetycznym, co więcej – blisko 75% uzyskanych haplotypów było unikatowych, występujących tylko w jednej lokalizacji (fot. A. Tereba). Nakład 2000 egz., ark. wyd. 4,50, ark. druk. 3,50 + 0,25 (wkł. barwna) = 3,75. Spis treści DZIAŁ A. ZASTOSOWANIE METOD ANALIZ DNA WE WSPÓŁCZESNYM LEŚNICTWIE Od Komitetu Redakcyjnego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Justyna A. Nowakowska, Agata Konecka DNA jako narzędzie w badaniach struktury genetycznej drzew leśnych . . . . . . . . . Andrzej Lewandowski Markery mitochondrialnego DNA pomocne w ustaleniu pochodzenia świerka pospolitego w Polsce . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Małgorzata Sułkowska, Jan Łukaszewicz Historia poglądów na temat zasięgu buka zwyczajnego w świetle badań molekularnych . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Tomasz Oszako Wykrywanie i identyfikacja za pomocą analiz DNA inwazyjnych patogenów w szkółkach i drzewostanach . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Robert Rutkowski, Ewa Suchecka, Dorota Zawadzka Migracyjność zależna od płci a genetyczna struktura populacji kuraków leśnych . . Anna Tereba Wpływ fragmentacji środowisk leśnych na strukturę genetyczną wybranych gatunków nietoperzy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Zbigniew Borowski Zastosowanie biologii molekularnej w łowiectwie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Podstawowe terminy genetyczne i objaśnienia używanych skrótów Literatura uzupełniająca 5 7 13 17 22 28 34 40 . . . . . . . . . . . . . 45 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 DZIAŁ B. WYBRANE NOWOŚCI PIŚMIENNICTWA LEŚNEGO Zagospodarowanie lasu, łowisk i wód . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ekologia i ochrona lasu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ekonomika, organizacja, zarządzanie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 49 50 52 DZIAŁ A. ZASTOSOWANIE METOD ANALIZ DNA WE WSPÓŁCZESNYM LEŚNICTWIE Od Komitetu Redakcyjnego Współczesne leśnictwo wykorzystuje w duże mierze nowoczesne osiągnięcia techniki, a w ostatnim czasie również narzędzia molekularne do detekcji i identyfikacji organizmów na poziomie gatunkowym, populacyjnym i osobniczym. Analizy informacji genetycznej zapisanej w cząsteczkach kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) stały się ostatnio filarem badań systematycznych (identyfikujących organizm do rangi gatunku) oraz są wysoce pomocne w poznaniu struktury genetycznej (bogactwa) genów oraz historycznego pochodzenia roślin, grzybów i zwierząt. Niniejsze zeszyt Postępów Techniki w Leśnictwie wypełnia lukę w świecie wydawniczym, spowodowaną brakiem polskojęzycznych opracowań na temat zastosowań najnowszych osiągnięć biologii molekularnej w szeroko pojętym leśnictwie, od analiz struktury genetycznej drzew, po precyzyjną identyfikację molekularną patogenów i poznanie zróżnicowania genetycznego populacji zwierząt. Zawiera najnowszy przegląd technik i metod badawczych opartych na markerach genetycznych DNA, które znajdują praktyczne zastosowanie w leśnictwie. Dalszy postęp nauk biotechnologii ukierunkowanej na poznanie struktury genetycznej organizmów umożliwi głębsze poznanie struktury genetycznej gatunków tworzących ekosystemy leśne, oraz opracowania strategii zachowania leśnych zasobów genowych, gwarantujących adaptację osobników i populacji do zmiennych warunków środowiska. Komitet Redakcyjny Postępów Techniki w Leśnictwie Zarządu Głównego SITLiD Justyna A. Nowakowska Agata Konecka Zakład Hodowli Lasu i Genetyki Drzew Leśnych, Instytut Badawczy Leśnictwa DNA jako narzędzie w badaniach struktury genetycznej drzew leśnych Analiza cząsteczek DNA jest szeroko wykorzystywanym narzędziem w badaniach struktury genetycznej drzew leśnych, począwszy od odczytu sekwencji genomów poszczególnych gatunków, poznania mechanizmów ekspresji genów odpowiedzialnych za ważne cechy hodowlane, po transformację komórek i tworzenie organizmów o nowych cechach – GMO. Poznanie struktury genetycznej sadzonek hodowanych w szkółkach leśnych daje możliwość oszacowania wpływu sposobu produkcji na poziom puli genowej materiału rozmnożeniowego, a zbadanie struktury genetycznej na poziomie DNA w sztucznym i naturalnym odnowieniu, umożliwia ocenę poziomu zachowania puli genowej w odnowieniu. Nowoczesne techniki identyfikacji profili genetycznych DNA drzew dają mocny dowód w trakcie prowadzenia postępowań karnych w dochodzeniu o kradzież drewna. Na genom drzew leśnych składa się zbiór informacji genetycznej zawartej w cząsteczkach kwasu deoksyrybonukleinowego (ang. DNA) zlokalizowanych w jądrze komórkowym oraz organellach (mitochondria i chloroplasty). Odkrycie budowy kodu genetycznego w postaci podwójnej helisy DNA, dokonane przez Jamesa Watsona i Watsona Cricka w 1953 roku, zrewolucjonizowało pojęcie współczesnej genetyki u wszystkich organizmów żywych. Dzięki informacji zapisanej za pomocą kodu genetycznego opartego na kombinacji tylko czterech par zasad (A-adeniny, T-tyminy, C-cytozyny i G-guaniny), możliwe jest zapewnienie wszystkich funkcji życiowych drzewa, rozwinięcie cech strukturalnych (m.in. budowa pnia, korony, kształt i kolor blaszki liściowej) i funkcjonalnych (oddychanie, fotosynteza), od narodzin do naturalnej śmierci. Dodatkowo, precyzyjny układ kombinacji czterech par zasad nukleinowych A, T, C i G, stanowi unikalny zapis informacji genetycznej, charakterystycznej dla danego gatunku, a nawet osobnika (wkładka barwna, rys. 1). Drzewa wytwarzają określone cząsteczki i substancje, np. białka budulcowe w trakcie wzrostu stymulowanego naturalnymi hormonami wzrostu, lub związki eteryczne w trakcie żeru na liściach szkodników owadzich, oraz kalusowe podczas infekcji patogenów. Obecnie, prowadzonych jest wiele badań mających na celu zrozumienie mechanizmów, dzięki którym drzewa postrzegają i reagują na bodźce środowiskowe, uruchamiając procesy adaptacyjne i ewolucyjne. Na wzrost wegetatywny i rozwój drzewa, od stadium zarodka do wykształcenia poszczególnych tkanek i narządów (w tym rozwój korzeni i powstawanie drewna, wykształcanie kwiatów, owoców i nasion) składa się szereg procesów precyzyjnie regulowanych w czasie (fazy wzrostu i ontogenezy) i przestrzeni (lokalizacja tkankowa), na podstawie zapisu dziedzicznego w cząsteczkach DNA. Dynamicznie rozwijające się techniki biologii molekularnej, w tym sekwencjonowanie genomów i tworzenie baz danych sekwencji dla drzew umożliwi 8 Justyna A. Nowakowska, Agata Konecka w najbliższym czasie poznanie genomów topoli, sosny i świerka. Trwają prace nad poznaniem genetycznego podłoża cech gwarantujących adaptację i przetrwanie gatunków zagrożonych wyginięciem (jak cis pospolity), a nawet interakcji między mikroorganizmami współzależnymi z gatunkiem. Od kilkudziesięciu lat, badanie ekspresji genów przyniosło wiele informacji odnośnie funkcji i aktywności wielu genów, głównie u topoli. U Populus tremula x P. alba, P. tremuloides i P. euramericana poznano ekspresję genów odpowiedzialnych za tworzenie włókien drewna reakcyjnego, geny odpowiedzialne za procesy przejścia z fazy wzrostu do fazy spoczynku oraz geny biorące udział w procesie kwitnienia. Aktywność genów kodujących białka uczestniczące w syntezie ściany komórkowej potwierdzono w przypadku ekspozycji liści topoli na podwyższone stężenie (560 ppm) CO2 i 1,5-krotne podwyższone ponad normę stężenie ozonu (O3), jak również na atak wirusa plamistości mozaikowej topoli (PopMV). Jak dotąd, analizy ekspresji genów u gatunków iglastych, przeprowadzono jedynie w badaniach niektórych gatunków sosny i świerka. U sosny (Pinus taeda L.) przebadano geny kodujące białka strukturalne, które ulegały zmniejszonej ekspresji w komórkach ksylemu podczas tworzenia drewna wczesnego i późnego. Tworzenie się korzeni bocznych u Pinus contorta charakteryzuje się zmianą w profilu ekspresji ok. 220 genów, m.in. odpowiedzialnych za syntezę białek odpowiedzialnych za podziały komórkowe, transport auksyn, fotosyntezę i syntezę ściany komórkowej. U świerka (Picea abies L. Karst.) i sosny (Pinus taeda L.) badano mechanizmy regulacji rozwoju zarodków somatycznych podczas procesu embriogenezy za pomocą techniki mikromacierzy. Co ciekawe, u Pinus taeda wykryto 131 różnic w ekspresji genów w zależności od geograficznego położenia badanych drzewostanów, co może świadczyć o genetycznym podłożu procesów adaptacyjnych w obrębie gatunku. Identyfikacja genów adaptacyjnych u gatunków drzewiastych oraz charakterystyka poszczególnych populacji pod kątem ekspresji genów warunkujących adaptację do zmiennych warunków środowiska może być podstawą do zachowania różnorodności biologicznej podczas sztucznych odnowień stanowisk leśnych. Wykorzystanie analiz DNA do określenia skutków genetycznych działalności człowieka w populacjach drzew leśnych W naukach leśnych zauważa się istotny niedobór informacji i badań na temat zmian struktury genetycznej drzewostanów powodowanych aktywnością ludzką. Największe oddziaływanie na lasy mają leśnicy, których obowiązkiem jest dbanie o ekosystem leśny poprzez wprowadzanie zabiegów pielęgnacyjnych. Badacze zajmujący się ekologią roślin wykazali, że decydujące znaczenie w utrzymaniu równowagi każdej populacji, również drzew leśnych, odgrywa poziom różnorodności biologicznej i zmienności genetycznej. Kształtowana jest ona głównie przez zróżnicowanie genetyczne drzewostanów wpływające na stabilność i trwałość ekosystemów leśnych. Również polityka leśna państwa zaleca, aby cele produkcyjne były łączone z celami ekologicznymi, przede wszystkim dotyczącymi zachowania różnorodności biologicznej na poziomie ekosystemów, gatunków i puli genowej poszczególnych populacji. Na podstawie przeprowadzonych badań genetycznych populacji drzew leśnych można przypuszczać, że drzewostany o ubogiej puli genowej są mniej odporne na zmiany środowiskowe oraz bardziej narażone na działanie niepożądanych czynników. Działalność człowieka, mająca na celu poprawę jakości i stanu sanitarnego drzewostanów, najprawdopodobniej zubaża już zawężoną pulę genetyczną w przypadku populacji powstających w wyniku odnowienia sztucznego. Powstaje jednak pytanie w jakim stopniu zróżnicowanie genetyczne jest przy okazji wykonywania zabiegów pielęgnacyjnych modyfikowane? Czy podjętymi działaniami zubożamy pulę genetyczną populacji? Czy osobniki usuwane cechują się jednakowym genotypem? Pytania można mnożyć. Obecnie ponad 90% lasów powstaje na drodze odnowienia sztucznego. Pula genetyczna takich populacji jest zredukowana już na etapie zbioru nasion. Wysiewane na szkółkach partie DNA jako narzędzie w badaniach struktury genetycznej drzew leśnych 9 nasion pochodzą z drzewostanów wytypowanych przez człowieka pod względem fenotypowym, ponadto nie ze wszystkich drzew lecz z obradzających w danym roku. W pierwszym etapie hodowli lasu badacze skupili się na selekcji nasion i sadzonek. Dodatkowo obserwacje wykazały, że z 1000 nasion sosny wyrasta około 250 siewek, a do wieku rębnego na uprawie pozostaje tylko 5 drzew. Kolejnym etapem na poziomie szkółek jest sortowanie pod względem wielkości materiału sadzeniowego. Tu również następuje ściśle określona selekcja eliminująca część genotypów. Powyżej przytoczone zostały tylko niektóre aspekty produkcji szkółkarskiej, które wymagają głębszej analizy pod kontem genetycznym. Aktualnie, w Instytucie Badawczym Leśnictwa prowadzone są badania nad wpływem sposobu produkcji szkółkarskiej na zróżnicowanie genetyczne materiału sadzeniowego. Na podstawie analiz laboratoryjnych DNA jądrowego oraz chloroplastowego przeprowadzonych przy użyciu wybranych markerów dla loci DNA mikrosatelitarnego (SSR), określona zostanie pula genowa sadzonek sosny zwyczajnej wyhodowanej metodą kontenerową i polową oraz pokolenia rodzicielskiego, z którego zostały zebrane nasiona do produkcji sadzonek. Dla pełniejszej charakterystyki zbadane zostanie również zróżnicowanie genetyczne naturalnego odnowienia występującego pod drzewami rodzicielskimi. Analiza poziomów bogactwa genetycznego poszczególnych grup pozwoli wyróżnić bardziej pożądany, pod względem utrzymania możliwie wysokiej różnorodności genotypowej, sposób produkcji materiału sadzeniowego, w zależności od warunków w jakich siewki wzrastają (wkładka barwna rys. 2). Nadal żywym zagadnieniem wśród leśników jest kwestia wyższości odnowienia naturalnego nad odnowieniem sztucznym stosowanym w lasach. W Instytucie Badawczym Leśnictwa zespół Zachary przeprowadził badania nad odnowieniami naturalnymi sosny zwyczajnej, świerka pospolitego i dębu szypułkowego. Do analiz wykorzystano jądrowe i organellowe DNA mikrosatelitarne (SSR). Wykazano, że we wszystkich przypadkach pokolenie potomne i rodzicielskie charakteryzuje się zbliżoną strukturą genetyczną. U sosny i dębu nastąpiło nieznaczne wzbogacenie puli genowej potomstwa o odpowiednio 0,7% i 4,4%. Odnowienie naturalne świerka posiadało nieco zubożoną (o 1%) pulę genetyczną w stosunku do pokolenia rodzicielskiego. Prawdopodobnie zmiana ta spowodowana została selekcją adaptacyjną do panujących warunków wzrostu. Badania potwierdziły dobrą jakość genetyczną odnowienia naturalnego, co może gwarantować wysoką trwałość lasów. Istnieje teza, że populacje pochodzenia sztucznego są lepsze pod względem cech jakościowych, jednak uboższa pula genetyczna prawdopodobnie czyni je mniej odpornymi na niepożądane czynniki zewnętrzne w porównaniu do bardziej zróżnicowanych populacji naturalnych. W konsekwencji, niski poziom zmienności genetycznej drzewostanu sprawia, że populacja taka jest mniej stabilna i bardziej narażona na zniszczenie pod wpływem czynników patogenicznych oraz szkodliwych zmian środowiska. Badacze zajmujący się dziedziną leśnictwa widzą więc potrzebę prowadzenia dalszych analiz z wykorzystaniem narzędzi genetyki molekularnej. W kolejnych fazach wzrostu drzewostanów to cięcia pielęgnacyjne, poprzez zabiegi czyszczeń oraz trzebieży, kształtują pulę genową, która tworzy kolejne pokolenia. W historii lasów Polski można wyróżnić konkretne tendencje w gospodarowaniu i kształtowaniu zasobów leśnych. Błędne gospodarowanie lasami doprowadziło swego czasu do praktykowania trzebieży jako źródła pozyskania cennych sortymentów wielkowymiarowych, cechujących się wysoką jakością. Trzebież sortymentowa prowadziła do pozostawiania drzew najgorszych pod względem fenotypowym, jakościowym, zdrowotnym i najprawdopodobniej genetycznym. Obecnie trzebieże prowadzone są racjonalnie a uwaga leśników skierowana jest na równomierne oraz planowe wykorzystywanie i pielęgnowanie zasobów leśnych. Dotychczasowe badania nie zgłębiały zagadnienia struktury genetycznej drzewostanów poddawanych zabiegom pielęgnacyjnym w różnych fazach wzrostu. Zarówno w Polsce, jak i za granicą, prowadzone badania nad kształtowaniem zróżnicowania genetycznego drzewostanów pod wpływem usuwania drzew najczęściej prowadzono na plantacjach nasiennych, ponieważ znany układ i rozmieszczenie drzew pozwalają na precyzyjne założenie doświadczenia i jasne 10 Justyna A. Nowakowska, Agata Konecka wyniki. Badania prowadzono jednak na poziomie markerów morfologicznych poprzez opis cech fenotypowych poszczególnych osobników lub markerów enzymatycznych. Wiele przeprowadzonych badań dotyczyło przepływu pyłku i systemów kojarzenia oraz poziomu wsobności populacji na plantacjach np. sosny zwyczajnej, gdzie wykazano, że u drzew iglastych dominuje zapłodnienie krzyżowe, które podlega zmienności zarówno pod wpływem czynników środowiskowych tj. pogoda w danym roku, jak i genetycznych tj. dopływ obcego pułku do populacji. Również działalność człowieka, poprzez np. trzebieże powoduje modyfikację systemu kojarzenia. Inne badania prowadzone na plantacji sosny kalifornijskiej (Pinus radiata D.) wykazały, że różne metody trzebieży odmiennie wpływają na zróżnicowanie genetyczne. Na podstawie pomiaru pierśnicy stwierdzono, że zastosowana trzebież losowa i selekcyjna oraz ich kombinacja, nieznacznie zniekształciły różnorodność genetyczną plantacji. Wszystkie zastosowane metody zmieniły strukturę genetyczną populacji. Wyniki badań prowadzonych na terenie Niemiec w drzewostanach świerka pospolitego wskazują na wpływ zabiegu trzebieży dolnej i górnej, nawet o małej intensywności, na zróżnicowanie genetyczne populacji. Przeprowadzone doświadczenia w drzewostanach bukowych, naśladujące naturalne procesy wypadu poszczególnych drzew również zmieniły strukturę puli genowej. Stwierdzono jednak, że selektywne usuwanie poszczególnych osobników naśladujące przyrodę mniej narusza zmienność genetyczną niż wyrąb drzew pożądanych pod względem surowcowym. Kolejne analizy wykazały, że powtarzanie trzebieży w 60-letnim drzewostanie bukowym nie miało negatywnego wpływu na zmienność puli genowej drzewostanu. Należy podkreślić, że powyższe badania ukierunkowane są na analizę zmian w strukturze genetycznej populacji drzew leśnych na podstawie markerów morfologicznych lub markerów enzymatycznych. W dobie dostępności bardziej precyzyjnych narzędzi badawczych istotne jest prowadzenie badań weryfikujących wpływ obowiązujących kierunków hodowli, gospodarowania i pielęgnacji lasów na strukturę ekosystemów leśnych w oparciu o markery DNA jądrowego oraz organellowego. Modyfikacja genetyczna drzew leśnych Modyfikacja informacji genetycznej drzew, polega na zmianie wybranych odcinków DNA i wykorzystaniu markerów molekularnych do stworzenia drzewa o nowych, korzystnych cechach hodowlanych. Pierwszym organizmem zmodyfikowanym genetycznie była w 1973 roku bakteria pałeczki okrężnicy Escherichia coli, występująca w sposób naturalny w jelicie grubym człowieka, do której wprowadzono gen odporności na antybiotyk. Osiągnięcie to zapoczątkowało erę laboratoryjnej inżynierii przy pomocy genomowych strategii selekcji prowadzonej na komórkach zwierzęcych (żaby, świni, krowy, owcy) i roślinnych (rzepaku, soi, kukurydzy, ryżu). Wyprodukowanie białka nici pajęczej w mleku kozim, insuliny ludzkiej w bakteriach, czy substancji krzepliwości krwi w komórkach ssaków to już rzeczywistość medycyny 21-go wieku. Od dwóch dziesięcioleci, biotechnologia odgrywa również coraz większą rolę w światowym leśnictwie. Głównym celem badań prowadzonych w tym kierunku jest utworzenie transgenicznych drzew odpornych na żery szkodników owadzich i patogenów grzybowych, oraz na szkodliwe czynniki abiotyczne (susza, zasolenie). Odporność na środki chwastobójcze (herbicydy) stosowane w uprawie sadzonek na szkółkach i plantacjach leśnych, jak również takie cechy, jak zmiana jakości włókien drewna są brane pod uwagę w tworzeniu drzew GMO. W jaki sposób powstają drzewa transgeniczne? Prześledźmy ten proces na podstawie poszczególnych etapów tworzenia transgenicznej topoli, odpornej na glifosfat – herbicyd o szerokim zakresie skuteczności oraz na żer owadów z rzędu błonkówek, muchówek i chrząszczy. W pierwszym etapie transformacji, pozyskiwane są geny, które posłużą do modyfikacji genomu drzewa, np. gen białka EPSP z bakterii Salmonella typhimurium, odpowiadający za blokadę biosyntezy związków aromatycznych w roślinie, oraz gen białka cry wyizolowany z bakterii Bacillus thuringiensis (Bt) i odpowiedzialny za syntezę toksyny niszczącej nabłonek jelit u owadów DNA jako narzędzie w badaniach struktury genetycznej drzew leśnych 11 (wkładka barwna rys. 3). Dalej, transformacja komórek topoli, może być przeprowadzona przy użyciu wektora – bakterii glebowych Agrobacterium tumefaciens. W trakcie infekcji wywołanej przez A. tumefaciens, następuje przeniesienie fragmentu informacji genetycznej do genomu rośliny – gospodarza, i w konsekwencji powstanie narośli tumorowych. Ale udoskonalona, gdyż syntetycznie pozbawiona wirulentych genów bakteria jest nadal dobrym nośnikiem informacji genetycznej i w laboratoryjnych warunkach in vitro (na szkle) możne posłużyć do infekcji blaszek liściowych topoli Populus trichoderma, po uprzednim wprowadzeniu do kolistego DNA (plazmidy) A. tumefaciens obu genów (białka EPSP i cry). W trakcie infekcji, bakterie przekazują fragmenty DNA wraz z genami EPSP i cry do jądra komórki roślinnej, gdzie następuje integracja z genomem topoli. W kolejnym etapie transformacji, następuje selekcja transgenicznych siewek topoli, które zintegrowały geny EPSP i cry w swoim genomie. Siewki, których cząsteczki DNA nie zostały zmienione, nie przeżyją na pożywkach wzbogaconych herbicydem. Na końcu procesu transformacji ma miejsce regeneracja odpornej topoli GMO w szklarni i jej uprawa w warunkach polowych. W ten sposób prowadzone są uprawy topoli w USA, gdzie na plantacjach stosowane są herbicydy o szerokim zakresie działania, charakteryzujące się małą toksycznością dla środowiska i człowieka. Nadal nierozwiązanym pozostaje aspekt niekontrolowanego zapylenia naturalnych drzew danego gatunku przez pyłek zawierający bakteryjne geny, oraz ciągła synteza białek odporności w trakcie długiego życia drzewa, co niesie ze sobą ryzyko uodpornienia się żerujących szkodników. Dwie trzecie upraw drzew GMO w Chinach to około 15 mieszańców topoli Populus sp. ze zintegrowanym genem odporności na owady oraz zmienioną strukturą włókien drewna. W Kanadzie, Argentynie, Brazylii to również chętnie uprawiany gatunek transgeniczny, włącznie z eksperymentami, aby blaszki liściowe topoli miały zwiększoną asymilację jonów amonowych (źródło azotu z gleby), co w konsekwencji zwiększy produkcję asymilatów i da korzystny przyrost biomasy. Zwiększenie aktywności innego genu ligazy kumarynowej C4L, biorącej udział w łańcuchu biosyntezy lignin, pozwoli na łatwiejszy przerób pulpy w przemyśle papierniczym bez użycia szkodliwych związków chloru, a modyfikacja genów kwitnienia nly czy lfy umożliwi kontrolę sterylności drzew na plantacjach. Jak dotąd, w świetle Dyrektywy UE 2001/18/WE, wprowadzenie do obrotu organizmu o zmienionym genotypie GMO jest możliwe dopiero po wieloletnich badaniach i udowodnieniu ich nieszkodliwości dla człowieka i środowiska. Procedury dopuszczenia GMO do upraw mogą trwają na ogół 10 lat i jak dotąd, zezwolono jedynie na uprawę transgenicznej kukurydzy poprzez wprowadzenie genu Bt (kukurydza odmiany MON810, odporna na omacnicę prosowiankę). Lista innych zmodyfikowanych genetycznie gatunków roślin uprawnych czekających na rejestrację UE jest długa, ale nie ma wśród nich gatunków drzewiastych. Spośród drzew „kandydatów” do modyfikacji, najłatwiejszym gatunkiem jest topola, ze względu na najprostszą budowę DNA oraz łatwość regeneracji w warunkach laboratoryjnych i polowych. Inne gatunki, takie jak świerk, sosna, brzoza posiadają bardziej rozbudowany genom i wymagają większego wkładu pracy w tworzeniu odmian transgenicznych. Mimo optymistycznych wizji upraw drzew GMO na plantacjach, o szybkim czasie rotacji, o cechach odporności na szkodniki i środki ochrony roślin, nadal istnieje wiele kontrowersji, dotyczących głównie kwestii niekontrolowanego uwolnienia bakteryjnych genów do środowiska oraz ryzyko szybkiej adaptacji szkodników do toksyn syntetyzowanych przez drzewo. DNA drewna jako dowód w postępowaniu karnym Genetyka sądowa jest jedną z dynamicznie rozwijających się dziedzin nauki, która precyzyjnie łączy badania podstawowe, oparte głównie na analizach DNA organizmów, z praktyką – w procesach sądowych. Postęp technologiczny, jaki dokonał się w ostatnich dziesięcioleciach w badaniach struktury DNA organizmów żywych, umożliwia obecnie przeprowadzenie identy- 12 Justyna A. Nowakowska, Agata Konecka fikacji materiału dowodowego z precyzją, sięgającą nawet 99,99%. Analizy porównawcze wykonywane dla celów procesowych opierają się na zestawieniu profili wybranych fragmentów DNA (markerów), pochodzących co najmniej z dwóch różnych próbek materiału organicznego np. kawałków drewna. Charakterystyka kodu genetycznego materiału dowodowego, zabezpieczonego na miejscu przestępstwa i porównawczego, pobranego od domniemanego sprawcy ma na celu dostarczenie dowodów w sprawie karnej na podstawie potwierdzenia bądź wykluczenia podobieństwa badanych prób. Sposób pobrania materiału biologicznego do badań (zachowanie czystości i prawidłowy opis prób), oraz jego przechowywanie do czasu wykonania analiz biochemicznych (unikanie wilgoci i ciepła podczas) są kluczowymi elementami, gwarantującymi prawidłowe wykonanie analiz DNA w laboratorium. Tamże, przeprowadzana jest ekstrakcja i analiza cząsteczek DNA w celu uzyskania profilu genetycznego danej próbki (wkładka barwna rys. 4 i 5). Ogromną zaletą badań DNA w celach porównawczych jest szybkość i precyzja ich wykonania: od kilku do kilkunastu dni. Dodatkowo, informacja genetyczna nie zależy od danych takich, jak wiek i rozmiar drzewa, rodzaj pobranej tkanki, czy miąższość. W podsumowaniu można stwierdzić, że ingerencja człowieka w strukturę genetyczną drzew leśnych oraz poznanie naturalnych procesów regulacji zróżnicowania populacji drzew mogą przynieść liczne korzyści hodowlane, użytkowe i ekonomiczne, respektując działania leśników, które powinny gwarantować zachowanie możliwie pełnej zmienności genetycznej drzewostanów. Ponieważ techniki badań genetycznych istotnie mogą wzbogacić wiedzę o hodowli i gospodarowaniu lasami, dlatego warto wykorzystać nowe możliwości określania wpływu działalności człowieka na podstawie markerów molekularnych. Dzięki zdobyczy nauki, jakimi są techniki molekularne, leśnicy mają coraz większe możliwości wnikliwego poznania tajemniczych i dynamicznych praw rządzących ekosystemem leśnym. Andrzej Lewandowski Instytut Dendrologii w Kórniku Markery mitochondrialnego DNA pomocne w ustaleniu pochodzenia świerka pospolitego w Polsce Artykuł prezentuje wykorzystanie dziedziczącego się wyłącznie w linii matecznej mitochondrialnego markera DNA – mt15-D02 – do określenia pochodzenia świerka pospolitego [Picea abies (L.) Karst.] w Polsce. Badania przeprowadzono na próbie 3067 drzew z 138 populacji, pochodzących z całego obszaru naszego kraju, z wyłączeniem Pomorza Zachodniego, gdzie świerk pospolity jest wyłącznie sztucznego pochodzenia. Struktura genetyczna współcześnie występujących populacji świerka pospolitego w Polsce jest wypadkową wielu procesów. Najważniejszym z nich było naturalne kształtowanie się zasięgu w czasie rozprzestrzeniania się gatunku po ostatnim zlodowaceniu. Pierwsze, śladowe ilości pyłku świerka notowane na terenie Polski pochodzą już z okresu późnoglacjalnego, tj. sprzed ok. 13 tys. lat. Z wyników badań palinologicznych wiadomo, że migracja świerka nastąpiła z dwóch odmiennych kierunków, jednak w różnym czasie. Najpierw świerk wkroczył z kierunku południowego – karpackiego. Dopiero później, bo pod koniec okresu borealnego, tj. ok. 8 tys. lat temu z kierunku północno-wschodniego Na naturalny proces kształtowania się zasięgu świerka nałożyły się działania człowieka, z początku związane z wylesieniami pod rozwijające się osadnictwo, pozyskiwaniem drewna na cele gospodarcze, aż po zastępowanie naturalnych drzewostanów sztucznymi nasadzeniami. Koniec dziewiętnastego i początek dwudziestego wieku był w leśnictwie okresem, w którym preferowano uprawę świerka, jako gatunku stosunkowo łatwego w hodowli, zapewniającego duży i szybki zysk. Rys. Kierunki naturalnej migracji świerka pospolitego po ostatnim zlodowaceniu. Kropkami zaznaczono badane populacje 1 – Nadleśnictwo Gołdap 2 – Puszcza Białowieska 3 – Nadleśnictwo Skrilno 4 – Nadleśnictwo Kartuzy Szlaki naturalnej migracji Zasięg północny Zasięg południowy 14 Andrzej Lewandowski Na szeroką skalę, w miejsce wyciętych lasów, często liściastych, wprowadzano szybkorosnące monokultury świerkowe. Przy czym używany materiał siewny był zazwyczaj nieznanego pochodzenia. Należy pamiętać, że nasze najstarsze dzisiaj drzewostany pochodzą z okresu zaborów i kształtowane były, w zależności od zaboru, przez różne praktyki leśne. W wyniku tego obecne drzewostany świerkowe i te z udziałem świerka są silnie przekształcone, i dalekie od tego, jakie byłyby bez ingerencji człowieka. Opisane wyżej fakty miały niewątpliwie istotny wpływ na ukształtowanie puli genowej świerka. O ile na temat istnienia na terenie naszego kraju dwóch odrębnych, pod względem pochodzenia, pul genowych świerka od dawna panowała zgodna opinia, to kontrowersje dotyczyły charakteru i pochodzenia tzw. „strefy bezświerkowej”, która rozdziela te dwa zasięgi na Niżu Polskim. Dyskusje na ten temat rozpoczęły się na początku dwudziestego wieku. Z początku Raciborski wyróżnił na terytorium Polski tylko jeden obszar występowania świerka, ograniczony liniami zasięgowymi od południowego wschodu i północnego zachodu. Następnie Szafer wydzielił obszar dysjunkcji w zasięgu, jako rejon oddzielający w sposób naturalny dwie odrębne pule genowe świerka, południową i północno-wschodnią. Wiązał on tę nieciągłość z niedokończoną, holoceńską migracją świerka z dwóch różnych ostoi glacjalnych. W związku z tym, sporadycznie występujący tu świerk należy, jego zdaniem, uznać wyłącznie jako sztucznego pochodzenia. Zupełnie odmiennego zdania był Jedliński, który w latach dwudziestych ubiegłego wieku zakwestionował istnienie pasa bezświerkowego. Jako pierwszy zasugerował, że do braku świerka na omawianym terenie w dużej mierze przyczynił się człowiek. Ostatecznie też poddał w wątpliwość celowość wyodrębniania tego pasa, zwłaszcza w sytuacji odnotowania tu wielu wyspowych, jego zdaniem, naturalnego pochodzenia stanowisk świerka. W drugiej połowie dwudziestego wieku coraz częściej pojawiły się opracowania potwierdzające przypuszczenia Jedlińskiego. Najbardziej prawdopodobna wydawała się więc teza o ciągłym, w sensie historycznym zasięgu świerka i wtórnym pochodzeniu nieciągłości. Natomiast nie podlegał wątpliwości fakt uformowania zasięgu przez dwa odmienne regiony refugialne. Otwartą pozostawała kwestia wyznaczenia strefy kontaktu północnego i południowego szlaku migracyjnego. Nic także nie wiadomo było na temat skali wymieszania różnych pochodzeń świerka na skutek działalności człowieka. Brak odpowiednich narzędzi badawczych nie pozwalał na rozwikłanie tych wątpliwości. Sytuacja uległa radykalnej zmianie wraz z rozwojem technik biologii molekularnej i znalezieniem dziedziczących się wyłącznie w linii matecznej markerów mitochondrialnego DNA. U roślin DNA występuje w jądrze komórkowym, mitochondriach i chloroplastach. Jednak sposób jego dziedziczenia jest odmienny. Jądrowe DNA dziedziczy się po obu rodzicach. DNA chloroplastowe, u roślin nagozalążkowych, a więc i u świerka, dziedziczy się wyłącznie w linii ojcowskiej, a mitochondrialne – tylko w linii matecznej. Jednym z wykorzystywanych w badaniach świerka markerem mitochondrialnego DNA jest marker o oznaczeniu mt15-D02. Marker ten doskonale nadaje się do analizy pochodzenia świerka w naszym kraju, ponieważ posiada trzy fragmenty o różnej długości, charakterystyczne dla różnych rejonów pochodzenia. Fragment najdłuższy (o długości 1249 pz) jest charakterystyczny dla świerka pochodzenia karpackiego. Fragment krótszy (1107 pz) występuje u świerka pochodzenia alpejskiego, który został wprowadzony w naszym kraju sztucznie przez import nasion obcego pochodzenia. Natomiast fragment najkrótszy (ok. 800 pz) posiadają świerki pochodzenia borealnego, północno-wschodniego. Na przestrzeni ostatnich kilku lat, z zastosowaniem tego markera, w Pracowni Biologii Molekularnej Instytutu Dendrologii w Kórniku, przeanalizowano pod kątem pochodzenia łącznie 3067 drzew z 138 populacji. Badany materiał pokrywa cały obszar naszego kraju, z wyłączeniem Pomorza Zachodniego, gdzie świerk pospolity jest wyłącznie sztucznego pochodzenia. Z przeprowadzonych analiz wyłania się w miarę przejrzysty obraz rozprzestrzenienia świerka w Polsce. W południowej części zasięgu w większości występują świerki pochodzenia karpackiego. Tylko sporadycznie, w kilku populacjach, znaleziono domieszkę świerków pochodzenia alpejskiego. Teren Polski północno-wschodniej jest opanowany głównie przez świerki pochodzenia borealnego. Chociaż dokładne analizy przeprowadzone na terenie Nadleśnictwa Gołdap uznanego za Markery mitochondrialnego DNA pomocne w ustaleniu pochodzenia świerka pospolitego w Polsce 15 mikroregion mateczny dla świerka rominckiego, ekotypu świerka północno-wschodniego, wykazały duży udział świerka pochodzenia, głównie alpejskiego, ale i karpackiego, które zostały tu wprowadzone sztucznie przez człowieka pod koniec dziewiętnastego i na początku dwudziestego wieku. Drzewa obcego pochodzenia znaleziono zarówno w gospodarczych, jak i wyłączonych drzewostanach nasiennych (WDN). Skala zanieczyszczenia materiałem obcego pochodzenia jest różna i wynosi od 0% aż do 85%. Tylko dwa na cztery zbadane WDN-y były czyste pod względem pochodzenia. Jeden z WDN-ów ma w swoim składzie zaledwie 15% drzew pochodzenia lokalnego i aż 69% drzew pochodzenia alpejskiego. Zamieszanie dotyczy także drzew matecznych. Osiem na 24 zbadane drzewa były drzewami obcego pochodzenia, głównie alpejskiego. Pod tym względem najlepiej prezentują się rezerwaty przyrody, ponieważ w żadnym z czterech zbadanych rezerwatów nie znaleziono ani jednego drzewa obcego pochodzenia. Natomiast w „strefie bezświerkowej”, w większości badanych populacji, współwystępują osobniki pochodzenia północno-wschodniego – borealnego, jak i południowego – karpackiego. Podobnie, osobniki obu pochodzeń współwystępują we wszystkich kilku zbadanych stanowiskach świerka z Puszczy Białowieskiej, w tym na terenie rezerwatu ścisłego. Przy czym w większości przypadków zaznacza się przewaga świerków pochodzenia południowego. Podobnie zresztą jest także po białoruskiej stronie puszczy. Jest to zaskakujące zważywszy na fakt, że do tej pory rejon Puszczy Białowieskiej w sposób niepodlegający żadnej dyskusji był włączany do zasięgu świerka północno-wschodniego. Uzyskane wyniki w sposób jednoznaczny wskazują, że teren „strefy bezświerkowej” oraz Puszczy Białowieskiej jest miejscem, gdzie w sposób naturalny doszło do spotkania się i wymieszania dwóch odrębnych pul genowych świerka – północno-wschodniej i południowej. Jak już wspomniano wcześniej, na terenie naszego kraju spotyka się także świerki pochodzenia alpejskiego. Okazuje się, że ich udział jest stosunkowo duży w licznych populacjach ze „strefy bezświerkowej”. Może to świadczyć o dawnych próbach sztucznego wprowadzania na te tereny upraw świerkowych. Z powodu braku lokalnej bazy nasiennej nasiona były prawdopodobnie sprowadzane z innych rejonów, w tym z zachodniej Europy. Natomiast świerka pochodzenia alpejskiego nie znaleziono na terenie Puszczy Białowieskiej, gdzie w zasadzie nie zakładano monokultur świerkowych, co potwierdza przypuszczenie, że świerk alpejski jest na terenie naszego kraju pochodzenia sztucznego i został tu zawleczony z obcym materiałem siewnym. Opisany marker genetyczny potencjalnie może zostać użyty do rekonstrukcji przebiegu naturalnych granic zasięgu świerka w Polsce, co z uwagi na niemożność określenia pochodzenia większości stanowisk było bardzo trudne do ustalenia. Do tej pory uważało się, że naturalnie świerk pochodzenia południowego występuje najdalej na północ po Wzniesienia Rawskie. Jednak ostatnie badania mitochondrialnego DNA wskazują, że granica ta może być przesunięta o ok. 100 km bardziej na północ. Na terenie Nadleśnictwa Skrwilno (RDLP Toruń), w okolicach Lipna i Sierpca znaleziono czyste drzewostany świerkowe pochodzenia karpackiego. Na naturalne pochodzenie świerka w tym rejonie wskazywał już Jedliński w swoim opracowaniu z 1928 roku. Badane w tym czasie przez niego pniaki ściętych świerków były w wieku ok. 110 lat, czyli drzewa pochodziły z początku dziewiętnastego wieku, a więc okresu, kiedy jeszcze do lasów nie wprowadzano na większą skalę materiału obcego pochodzenia. Zwłaszcza na tych terenach, które wtedy znajdowały się w zaborze rosyjskim, gdzie prowadzono z reguły ekstensywną gospodarkę leśną. Na możliwą, naturalną kolonizację tego terenu przez świerka po ostatnim zlodowaceniu wskazują również badania palinologiczne. Z praktycznego punktu widzenia, bardzo interesujące są badania mające na celu określenie pochodzenia świerka na Pojezierzu Kartuskim. Co do pochodzenia świerka pospolitego na tym terenie, przeważa pogląd, oparty głównie na wynikach badań palinologicznych, że został on tu posadzony sztucznie. Przeprowadzone badania, wykazały obecność wszystkich trzech, pod względem pochodzenia, fragmentów mitochondrialnego DNA. Zmieszanie drzew wszystkich trzech pochodzeń stwierdzono w 12 na 26 przebadanych drzewostanach. Najwięcej drzew, średnio 59%, było pochodzenia alpejskiego. Drzewa pochodzenia alpejskiego znaleziono we wszystkich drzewostanach, jednak z bardzo różną częstością występowania, od 6% aż do 90%. Znacznie mniej 16 Andrzej Lewandowski było drzew pochodzenia karpackiego, średnio 30%. Wśród wszystkich zbadanych drzew, najmniej było drzew pochodzenia północno-wschodniego, bo tylko 11%. Duży udział świerka alpejskiego na terenie Pojezierza Kartuskiego nie jest dużym zaskoczeniem. Teren ten znajduje się poza przyjmowanym, naturalnym zasięgiem świerka w Polsce. W związku z tym, należy założyć, że w większości został on tu wprowadzony sztucznie przez człowieka. W dziewiętnastym i na początku dwudziestego wieku na tych terenach gospodarowali leśnicy niemieccy, którzy prowadzili intensywną gospodarkę leśną. Jak już wspomniano wcześniej, jest to także okres, w którym preferowano uprawę świerka. Na dużą skalę działały już wtedy firmy nasienne, rozprowadzające materiał po całej Europie, nie zwracając zazwyczaj uwagi na jego pochodzenie. W owym czasie, nie prowadzono jeszcze badań proweniencyjnych i nie zdawano sobie sprawy jakim ryzykiem hodowlanym może być obarczony materiał obcego pochodzenia, niedopasowany do warunków klimatycznych miejsca uprawy. Większość działających firm było firmami niemieckimi bądź austriackimi. W związku z tym można sądzić, że w większości, w obrocie handlowym były nasiona świerka najłatwiejsze dla nich do pozyskania, a więc te, które były pochodzenia alpejskiego. Z podobną sytuacją mamy do czynienia na terenie Nadleśnictwa Gołdap, które chociaż znajduje się w granicach naturalnego zasięgu świerka północno-wschodniego, to posiada duży udział posadzonego sztucznie świerka pochodzenia alpejskiego. W kilku drzewostanach Nadleśnictwa Kartuzy, obok świerka pochodzenia alpejskiego, niewątpliwie obcego pochodzenia, występuje także świerk pochodzenia północno-wschodniego, niekiedy nawet do 88%. Wydaje się prawdopodobne, że w niektórych przypadkach może być on naturalnego pochodzenia. Nadleśnictwo Kartuzy znajduje się przecież w bezpośrednim sąsiedztwie uznawanej dzisiaj za naturalną zachodniej granicy świerka północno-wschodniego i jest wysoce prawdopodobne, że forpoczty naturalnej migracji świerka mogły przed setkami lat dotrzeć na teren Pojezierza Kartuskiego. Nie rozstrzygając ostatecznie kwestii o ewentualnej, częściowej rodzimości świerka w Nadleśnictwie Kartuzy, należy zaznaczyć, że jest on dzisiaj na tym terenie dobrze zadomowionym, odnawiającym się w sposób naturalny, ważnym z gospodarczego punktu widzenia gatunkiem. Wiele faktów świadczy też o tym, że Pojezierze Kartuskie znajduje się w granicach potencjalnego, naturalnego zasięgu świerka pospolitego. Jak się uważa sztuczne poszerzenie areału uprawy tego gatunku na omawianym obszarze należy potraktować jako przyspieszenie jego naturalnej ekspansji. Przeprowadzone do tej pory badania z wykorzystaniem mitochondrialnego markera DNA pozwalają na następujące podsumowania, dotyczące pochodzenia świerka w Polsce: • na terenie Polski występują naturalnie dwie, odrębnego pochodzenia, pule genowe świerka pospolitego, północno-wschodnia (borealna) i południowa (karpacka), • tak zwaną „strefę bezświerkową”, rozdzielającą dwa odrębne zasięgi świerka na Niżu Polskim, należy raczej uważać za rejon o rozrzedzonym występowaniu świerka. Obszar ten jest miejscem naturalnego spotkania i wymieszania się dwóch odrębnych pul genowych (borealnej i karpackiej), ale pochodzenie pasa jest sztuczne – związane z działalnością człowieka. Niewątpliwie występują tu resztki naturalnych populacji świerkowych. Być może warto zainteresować się nimi z hodowlanego punktu widzenia. Już na początku dwudziestego wieku Jedliński wykazał dodatni wpływ świerka na kształtowanie drzewostanów sosnowych na tym terenie. Na obszarze „strefy bezświerkowej” występują także liczne populacje założone przez człowieka z materiału obcego pochodzenia, w dużej mierze reprezentującego populacje świerka alpejskiego, • również obszar Puszczy Białowieskiej jest miejscem naturalnego wymieszania się dwóch odrębnych pul genowych świerka pospolitego, dlatego południową granicę północno-wschodniego zasięgu świerka należy przesunąć na północ, poza rejon Puszczy Białowieskiej, • północna granica południowego zasięgu świerka przebiega przez Nadleśnictwo Skrwilno, a więc ok. 100 km bardziej na północ, niż do tej pory sądzono, • na terenie naszego kraju, na dużą skalę, w sposób niekontrolowany, wprowadzono świerka obcego pochodzenia. Świerk nielokalnego pochodzenia może występować nawet w mikroregionach matecznych, które zostały utworzone z myślą o ochronie lokalnych ekotypów oraz wśród drzew matecznych. Małgorzata Sułkowska Jan Łukaszewicz Zakład Hodowli i Genetyki Drzew Leśnych, Instytut Badawczy Leśnictwa Historia poglądów na temat zasięgu buka zwyczajnego w świetle badań molekularnych Obecny zasięg występowania buka zwyczajnego na terenie Polski ukształtowany został w wyniku zlodowaceń oraz działalności człowieka. W pierwszym etapie historię wędrówki buka na ziemie polskie poznano dzięki badaniom paleobotanicznym, a w szczególności analizom pyłkowym i makroszczątków wydobywanych z pokładów torfowych. Badania genetyczne potwierdziły dotychczasową wiedzę i dostarczyły dużo nowych informacji pokazujących drogi migracji gatunku, znaczące interakcję genotypu ze środowiskiem widoczną w różnym wzroście tej samej populacji w odmiennych warunkach siedliskowych. Wykazano też niewielkie zróżnicowanie między populacjami i dużą zmienność wewnątrzpopulacyjną. Wyniki tych badań mają istotne znaczenie dla gospodarki leśnej i ochrony przyrody w ekosystemach leśnych z udziałem tego gatunku. Krótka historia poglądów na temat zasięgu buka zwyczajnego w świetle badań przyrodniczych i paleobotanicznych Buk zwyczajny należy do podstawowych gatunków lasotwórczych w Polsce. Występuje na 5,5% powierzchni leśnej kraju i ma udział 6,8% ogólnej miąższości drewna. Rozmieszczeniem buka nauka zajęła się pod koniec XIX wieku, a rozwój metod analiz pyłkowych w pierwszej połowie XX wieku doprowadził do powstania map zawartości pyłku buka w skali przestrzennej i czasowej obejmującej wędrówkę gatunku na ziemie polskie po ostatnim zlodowaceniu. W roku 1912, prof. M. Raciborski wykreślił granicę występowania buka na ziemiach polskich (rys. 1). Nazwał ją kresem północno-wschodnim. Było to pierwsze, powszechnie przyjęte opracowanie naukowe przedstawiające w aspekcie historycznym i przyrodniczym granice rozmieszczenia buka. Według Raciborskiego buk występował naturalnie na terenie całej obecnej Polski z wyjątkiem skrawka północno-wschodniego obejmującego w przybliżeniu teren obecnej RDLP Białystok. Tak wytyczony zasięg zamieszczony był w Encyklopedii Polskiej i długie lata był podstawą do rozważań naukowych na temat występowania tego gatunku. Rozmieszczeniem buka na terenie Polski zajmowało się wielu naukowców i w opublikowanych pracach na podstawie analiz dokumentów historycznych i badań paleobotanicznych przedstawili oni autorskie koncepcje występowania tego gatunku w czasach historycznych i obecnie. Znane są prace polskich badaczy m.in.: Szafera, Ralskiej-Jasiewiczowej i Środonia. Część autorów kreśląc obszary naturalnego występowania buka w czasach współczesnych nie brała pod uwagę wpływu człowieka na powstanie obszaru bezbukowego w środkowej i środkowo-wschodniej Polsce, a szczególnie na Mazowszu. W wyniku działalności rolniczej, a szczególnie gospodarki wypaleniskowej trwającej ponad dwa tysiące lat, obszar występowania tego gatunku został 18 Małgorzata Sułkowska, Jan Łukaszewicz Rys. 1. Zasięg buka (nazwany kresem północnowschodnim) i innych gatunków na ziemiach polskich wg Raciborskiego (1912) zredukowany, na wielu stanowiskach buk został niemal wyrugowany. Świadczą o tym prace naukowe potwierdzające występowanie rodzimego buka na tym obszarze od wieków. Niedziałkowski w pracy z 1931 roku opisuje obecność drzewostanów z udziałem tego gatunku na terenie Nadleśnictwa Skierniewice i stawia tezę, że stosowanie rębni zupełnej i regulacja serwitutów znacznie ograniczyły obszar jego występowania. Buk przywędrował wraz z jodłą do Polski w okresie atlantyckim 11 000–8 000 lat temu, a jego rola lasotwórcza jest szczególnie znacząca w okresie subatlantyckim, który zaczął się 4500 lat temu i trwa do dzisiaj. Jest gatunkiem, któremu odpowiada łagodny klimat morski. Klimat kontynentalny z ekstremalnymi mrozami i późnymi przymrozkami nie sprzyja zasiedlaniu takich obszarów przez buka. W warunkach klimatu przejściowego Polski, wraz ze wzrostem wpływu klimatu kontynentalnego drzewa narażone są na duże szkody mrozowe i przymrozkowe. Przykładem może być zima na przełomie lat 1928 i 1929, kiedy buki zamarły na znacznym obszarze Polski. Analizy zawartości pyłku buka w pokładach torfu w Europie, wskazują na wędrówkę buka po okresie lodowcowym na teren Polski, z dwóch kierunków: z jednej strony z Półwyspu Bałkańskiego, a z drugiej strony z Półwyspu Apenińskiego i Iberyjskiego. Na terenie kraju buk wkraczał Historia poglądów na temat zasięgu buka zwyczajnego w świetle badań molekularnych 19 obniżeniami w pasmach górskich przez Bramę Morawską i Przełęcz Dukielską w Karpatach oraz przez Bramę Lubawską w Sudetach. Po przekroczeniu pasma gór buk przemieszczał się na zachód, północ i powoli w kierunku wschodnim. Praktycznie cały obszar kraju był terenem ekspansji buka i tylko warunki siedliskowe i ostry klimat kontynentalny na północnym wschodzie decydowały o jego obecności i stopniu udziału w składzie gatunkowym drzewostanów. Działalność człowieka i ograniczenia klimatu kontynentalnego związane z przymrozkami i mrozami na terenie Mazowsza, Kurpi i północnowschodniej Polski oraz układ stosunków glebowych w dawnych pradolinach rzek Wisły i Warty, doprowadziły do powstania dwóch obszarów: występowania buka górsko-wyżynnego i pomorskiego. Wyznaczony przez Szafera i powszechnie przyjęty obszar bezbukowy ani obecnie, ani w ostatnich wiekach nie był pozbawiony naturalnych stanowisk tego gatunku. Wielu autorów uważa, że rodzaj Fagus w Europie Środkowej i Zachodniej zaznaczył swój udział dwukrotnie w historii rozwoju zbiorowisk leśnych tych obszarów. Pierwszy raz stwierdzono jego obecność w neogenie trzeciorzędu na podstawie analiz kopalnych ziaren pyłków, szczątków liści, owoców i drewna. W Polsce, Środoń w latach 60. XX wieku, badał obecność pyłku buka w 61 stanowiskach osadów neogeńskich. Szczególnie duże ilości wykrył w Kotlinie Nowotarsko-Orawskiej, na Dolnym Śląsku i na Pojezierzu Dobrzyńskim. Ochłodzenie klimatu ograniczyło występowanie buka w zbiorowiskach leśnych Europy na przełomie trzecio- i czwartorzędu, aż do czasów holocenu. Podczas okresów zlodowacenia ostoje buka w Europie znajdowały się w górskich regionach południowej części kontynentu. Według oceny Szafera w latach 30-tych ubiegłego stulecia po ustąpieniu zlodowacenia, buk powtórnie pojawił się na terenie obecnej Polski z kierunku południowo-wschodniego (prawdopodobnie z ostoi w południowej części Wschodnich Karpat lub/i Besarabii). Jego zdaniem Fagussylvatica L. początkowo posuwał się wzdłuż łuku Karpat, a następnie przez Bramę Morawską w kierunku Sudetów. W ten sposób zasiedlił polską część Karpat i Sudetów, a następnie tereny nizinne na północy i dotarł do linii Bałtyku. Powszechnie znane są opracowania pod kierunkiem prof. Ralskiej-Jasiewiczowej, która analizowała zawartość pyłku buka na terenie Polski w okresie ostatnich ok. 11000 lat, tj. od momentu ustąpienia lodowców do czasów obecnych. Najnowsze opracowania przedstawiające izolinie jednakowych zawartości pyłku buka, np. ponad 1500 lat temu (rys. 2), pozwalają stwierdzić, że buk był w różnym udziale w składzie gatunkowym drzewostanów na terenie praktycznie całej Rys. 2. Mapa izopolowa obecności pyłku buka 1500 lat BP (czyli przed rokiem 1950) na terenie Polski (Ralska-Jasiewiczowa 2004) 20 Małgorzata Sułkowska, Jan Łukaszewicz Polski. Ralska-Jasiewiczowa uważa, że buk przybył do Polski nie z jednego a kilku refugiów, w których zachował się na południu Europy podczas okresu zlodowacenia. Około 5000 BP buk zaczął rozprzestrzeniać się z południa i południowego zachodu w obrębie Karpat i prawdopodobnie przez Beskid Niski i Bramę Morawską lub wzdłuż sąsiednich pasm. Tak więc buk pochodzący z tego refugium mógł zasiedlić także Sudety. Jej zdaniem buk w Sudety mógł przybyć też ze wschodu – do 5000 BP. Istnieją jej zdaniem też dowody na migrację buka z północnego zachodu, wzdłuż pojezierzy i stamtąd ekspansję na wschód i południe. Okres sprzed około 1000 lat zaznaczył się maksymalnie dużym zasięgiem buka (większym, niż obecny) i wyraźnie dużym udziałem w Górach Świętokrzyskich w stosunku do otaczających je regionów. Zmienność genetyczna buka w badaniach molekularnych na terenie Polski Gömöryi współautorzy na podstawie badań zmienności białek izoenzymatycznych, jako pierwsi pod koniec ubiegłego wieku zauważyli, że buk na teren Europy przywędrował z jednego refugium lub kilku refugiów, nie zróżnicowanych genetycznie, za wyjątkiem obszaru południowych Włoch i Bałkanów. Wskazują oni, że główne refugium buka w Europie podczas okresu zlodowacenia znajdowało się w południowej części Gór Dynarskich (Słowenia) oraz południowej Francji i południowej części Karpat. Ostatnie interdyscyplinarne badania dotyczące szlaków migracji gatunku prowadzone przez Magrii zespół, łączące wyniki badań paleontologicznych pyłku i fragmentów roślin oraz analiz molekularnych na podstawie analiz markerów białek enzymatycznych i DNA jądrowego oraz chloroplastowego, potwierdzają ich wyniki (rys. 3). Wskazują na ograniczenie występowania buka do obszarów środkowej i południowej części Włoch, południowo-wschodniej Francji, Słowenii i możliwe, że także południowej części Moraw, które stanowiły centra migracji na teren Europy Centralnej i Północnej oraz Półwyspu Bałkańskiego i północnej części Iberyjskiego – refugia basenu śródziemnomorskiego Europy. Aktualna struktura genetyczna populacji buka została ukształtowana pod wpływem wielu, często przeciwstawnie działających czynników, związanych między innymi z przepływem genów między populacjami. Lokalne środowi- Rys. 3. Rozmieszczenie geograficzne chloroplastowych markerów DNA: (a) (PCR-RFLP), (b) mikrosatelitarnych (dane dla obszaru Włoch na podstawie Vettori i inni., 2004) W: Magri i inni 2006 Historia poglądów na temat zasięgu buka zwyczajnego w świetle badań molekularnych 21 sko wzrostu selekcjonuje populacje buka poprzez eliminację osobników nieprzystosowanych do panujących w nim warunków wzrostu, co wpływa na zmianę struktury genetycznej danej populacji. Decydujące znaczenie na obecny stan zasobów genowych buka miały zmiany klimatyczne w czwartorzędzie, które ograniczyły występowanie buka do niewielkich refugiów w okresie zlodowacenia. Istnienie takich refugiów Fagussylvatica L. w Europie potwierdzono na podstawie analiz izoenzymatycznych oraz zróżnicowania chloroplastowego DNA, które jest dziedziczone u buka w linii matecznej. W Polsce mamy stosunkowo bogatą wiedzę na temat zmienności i zróżnicowania tego gatunku. Między innymi badania IBL objęły 25 populacji buka w ramach naturalnego zasięgu występowania gatunku przeprowadzone wspólnie z Uniwersytetem Technicznym z Zvolen (Słowacja), a także w ramach projektu oceny kondycji gatunku na granicy zasięgu szacowano zmienność genetyczną 18 populacji. Badania innych 30 populacji buka przeprowadzono na powierzchni proweniencyjnej w Bystrzycy Kłodzkiej. Analizy prowadzono dla pokolenia matecznego oraz potomnego z wykorzystaniem markerów izoenzymatycznych, także markerów molekularnych DNA (RAPD i mikrosatelitarnych). Badania te uszczegółowiono dla 6 pochodzeń z tej powierzchni poprzez zastosowanie 3 markerów chloroplastowych oraz wybranych markerów jądrowych. Badania 9 pochodzeń buka, reprezentujące zwarty zasięg gatunku, dotyczące struktury genetycznej pokolenia matecznego i potomnego, w oparciu o charakterystykę glebową siedlisk, potwierdziły potrzebę wyróżnienia ekotypów glebowych. Wszystkie cytowane powyżej badania potwierdzają mozaikowy, ekotypowy charakter zmienności genetycznej buka w Polsce. Istnieje potrzeba przeprowadzenia oceny zróżnicowania gatunku poza granicami jego gromadnego występowania, szczególnie na terenach Polski, gdzie odnawia się naturalnie. Prowadzone dotychczas badania zróżnicowania genetycznego buka w Polsce na podstawie analiz molekularnych oraz białek enzymatycznych wykazały: • nieznaczne zubożenie genetyczne populacji buka z północnej Polski w stosunku do południowych, • obraz zróżnicowania populacji buka w Polsce, który nie umożliwia wydzielenia regionów geograficznych o podobnym poziomie zmienności genetycznej, • mozaikowy charakter zmienności genetycznej gatunku, który wskazuje na jego siedliskowy i lokalny charakter zróżnicowania. Tomasz Oszako Zakład Ochrony Lasu, Instytut Badawczy Leśnictwa Wykrywanie i identyfikacja za pomocą analiz DNA inwazyjnych patogenów w szkółkach i drzewostanach W artykule opisano współczesne zagrożenia dla europejskich lasów związane z rozwojem międzynarodowego handlu i obserwowanymi zmianami klimatycznymi. Dotyczą one przenoszenia obcych, inwazyjnych organizmów zagrażających różnorodności biologicznej i trwałości ekosystemów leśnych. Podstawowe metody prewencji polegają na ich wykrywaniu i identyfikacji w próbkach środowiskowych. Metody biologii molekularnej (testy diagnostyczne, PCR, sekwencjonowanie DNA) stale się rozwijają, są szybkie i niezawodne. Dynamiczne zmiany środowiska faworyzują rozwój organizmów zarówno nowych jak i wcześniej znanych (dotychczas o znaczeniu drugorzędnym), niegdyś zawleczonych do Europy. Pojawienie się tych pierwszych w ekosystemach leśnych jest szczególnie niebezpieczne. Na skutek braku naturalnych wrogów są niezwykle trudne do opanowania. Niezbędny jest ich stały monitoring umożliwiający opracowanie metod prewencji, metody biologii molekularnej służące do ich wykrywania i identyfikacji są w tym przypadku nieocenione. Druga grupa, znanych od lat organizmów, korzysta z powstałej nowej, sprzyjającej im sytuacji w środowisku. Prowadzi to do ich masowego namnażania, co z kolei sprawia, że nabierają pierwszorzędnego znaczenia gospodarczego. Obydwie grupy patogenów, występując w formie epifitoz, powodują nie tylko dotkliwe straty gospodarcze, ale i lokalnie zagrożą trwałości lasów i ich różnorodności biologicznej. Niepokojące są okresowo obserwowane w różnych regionach Europy procesy zamierania gatunków liściastych (dębów, buków, jesionów i olszy) oraz ostatnie doniesienia o występowaniu chorób drzewostanów iglastych (sosen i świerków). Ryzyko przenoszenia i zadomowienia się szkodliwych organizmów Jeszcze nigdy w historii, europejskie lasy nie stanęły w obliczu kompleksowego zagrożenia szkodnikami i patogenami. Główne czynniki wpływające na ich rozprzestrzenianie to szybko zachodzące zmiany klimatyczne oraz wzrost światowego handlu, mobilność ludności i turystyka. Przewiduje się zwiększoną częstość występowania ekstremalnych zjawisk pogodowych (np. powodzi, burz, mrozów w nietypowych okresach, suszy) jako konsekwencji gwałtownych zmian klimatu. Wzrost średnich rocznych temperatur powietrza powoduje rozszerzanie granic występowania wielu szkodników i patogenów. Już teraz lokalnie zagrożone wymarciem są rodzime gatunki roślin, wrażliwe na atak szkodników i patogenów, z którymi nie miały dotychczas kontaktu. Szacuje się, że w niektórych obszarach Europy, takich jak np. basen Morza Śródziemnego, około 15% roślin naczyniowych zagrożonych jest wyginięciem. Rozwojowi populacji patogenów sprzyja także ich zawlekanie przez importerów (np. obrotu drewnem, bonsai, opakowań drewnianych) czy środki transportu (samoloty, statki, transgraniczne przewozy drogowe). Wykrywanie i identyfikacja za pomocą analiz DNA inwazyjnych patogenów w szkółkach i ... 23 Skutkiem rozprzestrzeniania się chorób jest utrata przez ekosystemy leśne ich podstawowych funkcji: produkcyjnych, pozaprodukcyjnych i ochronnych. Obumieranie drzew i spadek jakości pozyskiwanego drewna to główne skutki dla gospodarki leśnej. Do funkcji pozaprodukcyjnej lasu przywiązuje się współcześnie coraz większą wagę. Obszary leśne dotknięte chorobami drzew, na których stosuje się znaczne ilości pestycydów, utracą swoje funkcje rekreacyjne. Wraz ze zmianami klimatu można spodziewać się zmian dynamiki populacji porażonych gatunków drzew, wynikających z tego przekształceń w ekosystemach leśnych i krajobrazach. Powstałe szkody zmniejszą potencjał lasów jako miejsca wiązania węgla i tym samym ograniczą ich zdolności do łagodzenia zmian klimatu. Poza tym, wzrośnie ryzyko powodzi, erozji, osuwania się ziemi lub lawin (funkcja ochronna lasów). Nowe zagrożenia dla lasów w Europie Istnieje wiele przykładów inwazji obcych szkodników i patogenów wcześniej niespotykanych w danym regionie. Wiele egzotycznych bezkręgowców, zwłaszcza owadów, stanowi ogromne zagrożenie dla leśnictwa na całym świecie. Wśród ostatnich najbardziej spektakularnych przykładów jest bez wątpienia szrotówek (minerka) Cameraria ohridella, powodujący defoliację kasztanowców w całej Europie. Pryszczarek robiniowy Obolodiplosis robiniae, również szybko rozprzestrzenia się w całej Europie. Prawdopodobnie został on zawleczony z Ameryki Północnej już w końcu XX wieku, jednakże przez wiele lat nie został rozpoznany. W Europie uszkodzenia lasu przez egzotyczne bezkręgowce były do niedawna stosunkowo niewielkie w porównaniu do innych kontynentów, pomimo, że na skutek ich działania wyginęło ponad 450 egzotycznych gatunków roślin drzewiastych, z których większość (35%) pochodziła z Azji. Szkodniki roślin określa się jako „wszelkie gatunki, szczepy lub biotypy roślin, zwierząt lub czynniki chorobotwórcze, szkodliwe dla roślin lub produktów roślinnych”. W definicji tej mieszczą się, więc nie tylko wspomniane bezkręgowce, ale także cały szereg drobnoustrojów (bakterii czy grzybów). Obecnie jednymi z najbardziej szkodliwych czynników chorobotwórczych w ekosystemach leśnych na całym świecie są mikroorganizmy z rodzaju Phytophthora zaliczane do grupy lęgniowców Oomycetes, które rozwleczone zostały po kontynencie wraz z międzynarodowym handlem. Częstość występowania ekstremalnych zjawisk (w tym powodzi i suszy), spowodowanych przez globalne zmiany klimatyczne znacznie zwiększa ryzyko uszkodzenia roślin przez patogeniczne gatunki Phytophthora. Szczególnie niebezpieczny patogen Phytophtora cinnamomi, atakuje ponad 950 gatunków roślin żywicielskich i jest prawdopodobnie najbardziej rozpowszechnionym, inwazyjnym organizmem na świecie. Pojawienie się P. cinnamomi na terenie lasów Zachodniej Australii i Victorii doprowadziło do ich ekologicznej dewastacji polegającej na masowym zamieraniu eukaliptusów. Gatunek P. cinnamomi jest również szeroko rozpowszechniony w Europie na kasztanowcach (razem z P. cambivora) i w ciepłolubnych dąbrowach Portugalii i Hiszpanii. Ograniczenia szkód wywoływane przez P. cinnamomi w innych rejonach, takich jak północno-wschodnia Szkocja jest prawdopodobnie spowodowane występowaniem tam niskich temperatur; zatem przewidywane ocieplenie klimatu pozwoli patogenom na przezimowanie i zwiększenie zasięgu występowania (wkładka barwna rys 6) Kolejny gatunek P. lateralis pojawił się w Oregonie w połowie XX wieku, na zainfekowanym materiale roślinnym importowanym z Dalekiego Wschodu i całkowicie zmienił produkcyjność lasów w tym regionie, poważnie ograniczając ilość drewna Chamaecyparis lawsoniana dla lokalnego i międzynarodowego przemysłu leśnego. Podobne szkody w leśnictwie odnotowano także we Francji, dlatego gatunek patogena wpisano na listę kwarantannową. Inny przykład to heteroploidalny mieszaniec P. alni (i jego podgatunki) atakujące nadbrzeżne olchy w całej Europie, a przede wszystkim osławiony już patogen P. ramorum, który po raz pierwszy opisano w roku 2000 dzięki współpracy holendersko-niemieckiej. Powoduje on choroby 24 Tomasz Oszako wielu gatunków drzew na przykład nagłe zamieranie dębów (SOD – Sudden Oak Death) w Kalifornii i Oregonie. W Wielkiej Brytanii doszło do skoku ewolucyjnego i zmiany gospodarzy z dębów na modrzewie. W zachodniej części tego kraju jeszcze w zeszłym roku porażonych zostało ponad pół miliona drzew na powierzchni powyżej 2000 ha. W chwili obecnej zamierających drzew jest kilkakrotnie więcej. Patogen przemieszcza się pomiędzy krajami na roślinach ozdobnych i leśnych (różaneczniki, wrzosowate, borówka brusznica, bez czarny, kalina) stanowiących przedmiot handlu i zagraża ważnym gatunkom lasotwórczym, m.in. dębom, bukom i modrzewiom. Zarodniki tego patogena jak i innych gatunków Phytophthora stwierdzano w ciekach wodnych (w sąsiedztwie szkółek) i w glebie roślin uprawianych w pojemnikach z zakrytym systemem korzeniowym (wkładka barwna rys. 7). P. ramorum jako jedyny gatunek zawleczony do lasu powoduje oprócz uszkodzeń strzał także i zamieranie pędów (liści/igieł), a dzięki rozprzestrzenianiu się wraz z wiatrem i kroplami deszczu zajmuje szybko nowe tereny. Najpierw w Wielkiej Brytanii i później w Nowej Zelandii opisano także nowy gatunek P. kernoviae niebezpieczny dla europejskich buków. Wiele inwazyjnych gatunków takich jak P. plurivora (dawniej P. citricola), P. cactorum, P. cambivora i P. pseudosyringae powoduje zamieranie buków w całej Europie. W 2007 r. potwierdzono, że nowa choroba występująca na igłach sosny (Pinus radiata) w Chile spowodowana była przez P. pinifolia. W rolnictwie straty duże w plonach powoduje Phytophthora infestans, patogen, który w ciągu dziesięciu dni może zniszczyć plantację ziemniaków lub pomidorów (tzw. zaraza ziemniaków). Choroba ta była w przeszłości przyczyną śmierci głodowej lub konieczności emigracji do USA aż 1/4 populacji Irlandczyków. Inna ważna grupa patogenów obejmuje stadia niedoskonałe grzybów workowych. Rodzaj Mycosphaerella jest bardzo duży. Zawiera około 10 000 gatunków, z których wiele stanowi groźne czynniki chorobotwórcze dla upraw rolnych i ogrodniczych, a także gatunków drzew leśnych. Na przykład w ciągu ostatnich 15 lat M. pini (Dothistroma septosporum) – przyczyna zespołu czerwonej zarazy igieł sosny stała się szczególnym problemem rozszerzając swój zasięg występowania w całej Europie. Oprócz sosen atakuje również świerki, modrzewie i daglezje, powodując zamieranie pędów. Duże zróżnicowanie genetyczne patogena umożliwia przystosowanie do dynamicznie zmieniających się warunków środowiska. Rodzaj Ceratocystis zawiera wiele słabo poznanych gatunków o bardzo podobnej morfologii, z których kilka stwarzać może poważne zagrożenia dla wielu europejskich gatunków roślin. Spośród roślin występujących w naturalnych ekosystemach wymienić można: topolę, dąb, platan, śliwę, orzesznik, świerk, sosnę i modrzew. Patogen o nazwie Ceratocystis platani atakuje platany w południowej Europie. Ophiostoma novo-ulmi (Ceratocystis ulmi) jest przyczyną holenderskiej choroby wiązów. Występowanie różnych szczepów/podgatunków jest dowodem na zjawisko hybrydyzacji pomiędzy gatunkami europejskimi i obcymi. Niedawno udało się powiązać proces masowego zamierania jesionu (Fraxinus excelsior L.) we wschodniej, centralnej i północnej Europie z występowaniem grzyba Chalara fraxinea. Do najczęstszych symptomów chorobowych należy zaliczyć: nekrozy tkanek na pniach i gałęziach, zamieranie wierzchołków drzew, zamieranie gałęzi lub ich szczytów. Porażane są drzewa we wszystkich klasach wieku, najbardziej chorują jednak drzewostany młode, odnowione sztucznie. Żaden z wymienionych organizmów nie jest całkowicie odosobniony w środowisku naturalnym. Ciekawym przykładem współdziałania patogenów jest porażanie jesionów przez C. fraxinea i Phytophthora spp. (P. pseudosyringae, P. plurivora, P. hungarica). Podczas gdy grzyb atakuje pędy, Phytophthora poraża korzenie. Osłabienie korzeni może stymulować więc rozwój C. fraxinea lub odwrotnie – infekcje pędów i niedożywienie korzeni ułatwia infekcję przez Phytophthora. Innym przykładem są zawleczone owady leśne. Choć same powodują niewielkie szkody to jednak mają ogromny wpływ na gospodarkę leśną roznosząc choroby. Europejski kornik wiązu, Scolytus multistriatus jest wektorem wspomnianej holenderskiej choroby wiązu, powodowanej przez Ophiostoma ulmi oraz O. novo-ulmi w Ameryce Północnej. Wykrywanie i identyfikacja za pomocą analiz DNA inwazyjnych patogenów w szkółkach i ... 25 Identyfikacja i wykrywanie Skuteczna obrona przed obcymi, inwazyjnymi patogenami w miejscach ich introdukcji (w strategicznych punktach wzdłuż dróg inwazji) i w porażonych drzewach powinna być oparta na ich wczesnym wykrywaniu i identyfikacji. Ma to kluczowe znaczenie w szybkim reagowaniu na zagrożenia poprzez stosowanie środków ograniczających rozwój szkodliwych mikroorganizmów. Wykrywanie szkodliwych organizmów prowadzone jest w terenie, a ich identyfikacja potwierdzana jest w warunkach laboratoryjnych (morfologia, fizjologia, testy genetyczne). Cennym uzupełnieniem obserwacji objawów porażenia roślin wydają się być szybkie testy diagnostyczne ELISA np. ALERT LF firmy NEOGEN. Zasada działania testu opiera się na specyficznym wiązaniu przeciwciał z obecnym w badanej próbce antygenem patogena (np. składnikiem ściany komórkowej). Niewątpliwą zaletą testu jest łatwość wykonania i szybki odczyt wyniku. Pobrane fragmenty porażonej tkanki roślinnej umieszczane są w specjalnej torebce z roztworem testowym. Rozdrabniane tkanki (poprzez rozcieranie) tworzą zawiesinę, której jedynie dwie krople nanoszone są na pasek testowy. Po 3–5 min. można dokonać odczytu. Prawidłowe działanie testu i brak patogena w badanej próbce potwierdza pojawienie się jedynie linii kontrolnej (C) w okienku testowym, o wyniku pozytywnym świadczą dwie linie (T, C) (wkładka barwna rys. 8). Istnieje jednak ryzyko uzyskania wyniku fałszywego, np. przy bardzo niewielkiej ilości patogena w tkance. Testy tego typu sprawdzają się w praktyce rolniczej przy diagnozowaniu zakażeń wirusowych ziemniaka. Na rynku polskim dostępne są testy pozwalające wykryć m.in. Phytophthora spp., Pythium spp., Fusarium spp. i Rhizoctonia spp. Analizie laboratoryjnej poddawane są próbki pobrane w terenie (gleba, woda, tkanki roślinne). Przykładem kompleksowej analizy populacji grzybów chorobotwórczych są badania zamierających jesionów (Fraxinus excelsior L.) w drzewostanach Nadleśnictwa Staszów prowadzone przez zespół profesora Tadeusza Kowalskiego. Zwracają oni uwagę na duże znaczenie izolacji grzybów z chorych tkanek na selektywne podłoża hodowlane, a nie tylko oznaczanie na podstawie owocników. Zauważyli, że grzyba Fusarium lateritium nie można było w ogóle zidentyfikować na podstawie zarodnikowania w naturze, a Chalara fraxinea wytworzył zarodniki tylko na jednym pędzie. Dzięki izolacji możliwe było wykazanie częstego występowanie tych gatunków. Przypadek C. fraxinea jest też dowodem na przydatność metod genetycznych. Ich zastosowanie potwierdziło, że patogen ten występuje w nekrotycznych tkankach jesionu znacznie częściej niż udaje się go wyizolować na pożywki. Podobne metody stosuje się w przypadku lęgniowców Oomycetes. Tradycyjnie wykrywanie tych mikroorganizmów obejmuje ich wychwytywanie z próbek gleby i wody za pomocą roślin pułapkowych (jabłka, liście różanecznika) czy izolację na specyficzne podłoża hodowlane z dodatkiem antybiotyków. Znacznie szybsze i dokładniejsze są analizy DNA (materiału genetycznego), które pozwalają nie tylko na wykrycie, ale i identyfikację gatunków szkodliwych mikroorganizmów. Niedogodność, podobnie jak w przypadku testów serologicznych stanowi zbyt mała ilość potrzebnego materiału w próbce. W tym przypadku możliwe jest ulepszenie dotychczasowych procedur poprzez zastosowanie tzw. przednamnażania, a następnie zastosowanie reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qPCR). Do badanej próbki dodaje się pożywkę sprzyjającą rozwojowi patogenów (np. Phytophthora spp.) i poddaje inkubacji, aby następnie ich genomowe DNA amplifikować i oznaczać ilościowo i jakościowo. W tym celu projektuje się dla każdego gatunku specyficzne sondy do reakcji qPCR. Mimo ciągłych modyfikacji metod wykrywania patogenów potrzebne są dalsze badania na temat obcych gatunków (znanych i nieznanych), które mogą być zawleczone do Europy, w tym o ich pochodzeniu, biologii i cyklach rozwojowych oraz ryzyku wprowadzenia do lasów Europy przez transport. Korzystając z tych danych, można będzie przewidywać zmiany w przyszłej dystrybucji szkodników i patogenów w Europie, oraz oceniać potencjalny wpływ tych organizmów na integralność ekosystemów leśnych i ich produkcyjność. Takie podejście dostarczy również danych do opracowania ulepszonych zasad fitosanitarnych, aby usunąć zagrożenia ze strony kluczowych dróg przenoszenia agrofagów. 26 Tomasz Oszako Jak się bronić Destrukcyjny charakter wymienionych szkodników i patogenów obrazuje, jak ważna jest kontrola potencjalnych miejsc ich introdukcji oraz utrzymywania wysokiej czujności służb kwarantanny roślin. Kluczem do sukcesu w efektywnej ochronie ekosystemów leśnych jest unikanie wprowadzania i rozprzestrzeniania obcych organizmów oraz podjęcie odpowiednich działań ochronnych. W większości są to działania prewencyjne. Istotnym elementem prewencji jest eliminacja źródeł zakażenia już na etapie produkcji materiału sadzeniowego. Dobrą metodą jest zapewnianie odpowiedniej czystości wody stosowanej do podlewania kwater produkcyjnych w szkółkach. Woda pobierana z ujęć naturalnych (jeziora, rzeki) często zawiera liczne grzyby, lęgniowce Oomycetes, patogeniczne bakterie. Jednym ze sposobów ich eliminacji jest stosowanie filtrów piaskowych powolnego przesącaczania (slow sand filters – SSF), których efektywność została potwierdzona zarówno w warunkach polskich (w szkółce leśnej Kiejsze, Nadleśnictwo Koło) jak i uprawach szklarniowych w Szwajcarii. W sytuacji porażenia pojedynczych roślin powinno się je eliminować z terenów szkółek i utylizować. Inne przykłady działań to odkażanie narzędzi agrotechnicznych po pracy w zakażonym terenie czy wysiew i uprawa roślin o charakterze sanitarnym (gryka, gorczyca) ograniczających liczebność patogenów. Cenna jest również wiedza na temat roślin żywicielskich poszczególnych patogenów. W przypadku rodzaju Phytophthora można świadomie unikać sadzenia roślin z rodziny wrzosowatych w otoczeniach szkółek. Brak środków chemicznych skutecznie zwalczających szkodliwe mikroorganizmy lub obostrzenia w ich stosowaniu, powodują wzrost zainteresowania alternetywnymi sposobami ich zwalczania. Biokontrola obejmuje poszukiwanie organizmów antagonistycznych względem fitopatogenów. Szczególnym zainteresowaniem badaczy cieszą sie szczepy grzybów rodzaju Trichoderma i bakterii rodzaju Bacillus oraz produkowane przez nie substancje, które mogą stanowić alternetywę dla tradycyjnych pestycydów. Na uwagę zasługują również nawozy – stymultory wzrostu i odporności. Zazwyczaj zawierają one w swoim składzie fosforyny (amonu lub potasu), wyciągi z grejfruta, chityny, czosnku lub piołunu. Podsumowanie Wpływ zmian klimatycznych na stan zdrowotny lasów jest ciągle niejasny i wymaga intensywnych badań w celu przygotowania na nie administracji leśnej i przemysłu w perspektywie długoterminowej. Pojawiają się problemy związane z wpływem zmian klimatu na żywotność ekosytemów leśnych czy zmianami zagrożenia ze strony zarówno znanych, jak i zawleczonych na teren Europy szkodników i patogenów. Konieczne jest większe zrozumienie potencjalnego wpływu zmian środowiska na dynamikę szkodników i patogenów leśnych, badanie zasięgów ich występowania i kierunków rozprzestrzeniania. Aby skutecznie monitorować te szkodliwe organizmy powstał szereg miedzynarodowych inicjatyw. Projekt IUFRO (International Union of Forest Research Organizations) Phytophthora in Forests and Natural Ecosystems funkcjonuje jako globalna platforma wymiany informacji o postępie badań naukowych nad Phytophthora. Ostatnie spotkanie odbyło się w 2012 r. w Faro (Portugalia) i Cordobie (Hiszpania). IBL włączył się w ramach IUFRO w program badania zjawisk związanych z niepożądanym przemieszczaniem się inwazyjnych gatunków grzybów, owadów, nicieni i roślin (Alien Invasive Species and International Trade). Pierwsze spotkanie grupy zostało zorganizowane w lipcu 2006 w Jedlni przez Tomasza Oszako z IBL i Leszka B. Orlikowskiego z Instytutu Ogrodnictwa w Skierniewicach, kolejne w 2008 r. w USA i w 2012 r. w Japonii. Na 3 konferencji IUFRO poświęconej obcym, inwazyjnym gatunkom w Tokyo dyskutowano możliwości identyfikacji patogenów drzew przy użyciu genomiki (metod sekwencji genomu patogenów i tzw. platformy mikromacierzy). Wykrywanie i identyfikacja za pomocą analiz DNA inwazyjnych patogenów w szkółkach i ... 27 Od 2009 roku w IBL prowadzone są także badania nad udoskonaleniem metod wykrywania i identyfikacji Phytophthora (w ramach akcji COST FP 0801 Established and Emerging Phytophthora: Increasing Threats to Woodland and Forest Ecosystems in Europe). Instytut jest także partnerem w projekcje ISEFOR mającym na celu tworzenie zasad postępowania przeciwko inwazyjnym szkodnikom i patogenom w warunkach zmian klimatycznych (w ramach 7 Programu Ramowego Unii Europejskiej). Robert Rutkowski Ewa Suchecka Muzeum i Instytut Zoologii PAN Dorota Zawadzka Instytut Nauk Leśnych, Uniwersytet Łódzki, Filia w Tomaszowie Mazowieckim Migracyjność zależna od płci a genetyczna struktura populacji kuraków leśnych Genetyczna struktura populacji jest jedną z najważniejszych charakterystyk opisujących gatunek pod względem ekologii populacyjnej. Genetyczną strukturę populacji można zdefiniować jako opis rozmieszczenia zmienności genetycznej w obrębie gatunku. Spośród wielu czynników wpływających na wzorzec tego rozmieszczenia jednym z najistotniejszych jest przepływ genów między populacjami. W przypadku wielu gatunków stwierdzono, że zdolności migracyjne osobników różnią się w zależności od płci. Różnice między poziomem migracyjności samców i samic zdefiniowano jako migracyjność zależną od płci. Identyfikacja i charakterystyka migracyjności zależnej od płci ma bardzo ważne znaczenie dla poznania biologii gatunków, a także w planowaniu strategii ochronnych gatunków zagrożonych wyginięciem. Przegląd badań z zakresu molekularnej genetyki populacyjnej kuraków leśnych wskazuje, że w przypadku głuszca i cietrzewia różnice w dyspersyjności samców i samic nie odgrywają istotnej roli w kształtowaniu genetycznej struktury populacji. Wydaje się, że poziom przepływu genów, generowany przez obie płcie jest podobny. Spośród europejskich kuraków leśnych jarząbek jest najsłabiej scharakteryzowany pod względem genetycznej struktury populacji, jednak obecne dane molekularne sugerują większą dyspersyjność samców. Wstęp Genetyczną strukturę populacji można zdefiniować, jako opis rozmieszczenia zmienności genetycznej w obrębie gatunku. Jest wiele czynników wpływających na to, w jaki sposób zmienność genetyczna jest dystrybuowana w obrębie gatunków. Jednym z najistotniejszych jest przepływ genów między populacjami. Proces ten należy rozumieć, jako przeniesienie materiału z jednej populacji do innej w następstwie dyspersji osobników oraz przystąpienia migrantów do rozmnażania. W przypadku wielu organizmów stwierdzono, że zdolności migracyjne osobników są ściśle związane z ich płcią. Różnice między poziomem migracyjności samców i samic zdefiniowano jako migracyjność zależną od płci – zjawisko polegające na tym, że jedna z płci jest istotnie bardziej filopatryczna (osobniki tej płci z reguły pozostają i przystępują do rozrodu w populacji, w której przyszły na świat), a płeć przeciwna jest istotnie bardziej skłonna do dyspersji (osobniki tej płci z reguły opuszczają populację, w której przyszły na świat, migrują i przystępują do rozrodu w innej populacji). Na przykład u ssaków poziom migracyjności jest wyższy u samców, natomiast u ptaków postuluje się obowiązywanie odwrotnego schematu. Migracyjność zależna od płci a genetyczna struktura populacji kuraków leśnych 29 Zaproponowano kilka teorii, tłumaczących różnice w migracyjności między płciami, które można pogrupować w trzy podstawowe kategorie: (i) hipoteza konkurencji o zasoby (ii) hipoteza rywalizacji o lokalnego partnera (iii) hipoteza unikania kojarzeń w pokrewieństwie. Właściwie wszystkie z nich przewidują większą dyspersyjność samców w przypadku gatunków poligynicznych (przeważający typ systemu kojarzenia u ssaków), natomiast u gatunków monogamicznych (w tym wielu gatunków ptaków)hipoteza konkurencji o zasoby przewiduje wyższą migracyjność samic. Metody szacowania poziomu migracyjności, w tym migracyjności zależnej od płci, można podzielić na dwie klasy: (i) metody bezpośrednie, polegające na obserwacyjnej identyfikacji osobników przemieszczających się między populacjami (np. „CMR” lub metody radiotelemetryczne), (II) metody pośrednie, nie wymagające intensywnych obserwacji terenowych, do których obecnie zalicza się przede wszystkim metody szacowania przepływu genów między populacjami, wykorzystujące osiągnięcia molekularnej genetyki populacyjnej. Metody bezpośrednie wymagają bądź schwytania i oznakowania osobnika bądź przeprowadzenia jego bezpośredniej obserwacji, połączonej z identyfikacją płci. Co więcej, wiarygodna ocena poziomu przemieszczania się osobników między populacjami wymaga oznakowania dużej liczby zwierząt. Taka strategia jest bardzo często trudna do zastosowania w przypadku wielu gatunków, np. gatunków rzadkich, zagrożonych wyginięciem lub prowadzących skryty tryb życia. Jednakże najpoważniejszym problemem, związanym z metodami bezpośrednimi jest to, że pozwalają one oszacować mobilność osobników, a nie „efektywną migracyjność”, polegającą na przemieszczeniu się do innej populacji i przystąpieniu do rozrodu, czyli przekazaniu przez migranta genów na następne pokolenia. Rozróżnienie między tymi dwoma formami dyspersji jest niezwykle ważne, ponieważ „efektywna migracyjność” może być niska mimo wysokiej mobilności osobników lub na odwrót. Metody pośrednie, opierające się na zastosowaniu molekularnych markerów genetycznych, pozwalają wyeliminować znaczną część opisanych powyżej problemów. Po pierwsze, molekularna genetyka populacyjna umożliwia prowadzenie badań nad danym gatunkiem bez potrzeby prowadzenia bezpośredniej obserwacji osobników lub ich chwytania. Wykorzystanie tzw. prób nieinwazyjnych, czyli wszelkich śladów biologicznych, pozostawianych przez osobniki na obszarze, który stale zajmują lub na którym chwilowo przebywają, znacznie ułatwiło badania nad gatunkami rzadkimi lub skrytymi, a także objętymi ścisłą ochroną. Po drugie, metody genetyki molekularnej, wykorzystujące analizę na poziomie DNA, pozwalają nie tylko zidentyfikować obecność tego samego osobnika w różnych populacjach (co świadczy o jego mobilności i przemieszczeniu się między populacjami w okresie prowadzenia badań), lecz także zidentyfikować jego geny, przekazane na potomstwo, a więc stwierdzić poziom „migracyjności efektywnej”. Poza tym, strategie opierające się na nieinwazyjnym pozyskiwaniu materiału do badań genetycznych są zazwyczaj o wiele wydajniejsze pod względem ilościowym – w przypadku pewnych gatunków znacznie łatwiej zgromadzić odchody czy pióra od dużej liczby osobników niż je schwytać, oznakować i schwytać ponownie. Metody analizy migracyjności zależnej od płci, opierające się na osiągnięciach molekularnej genetyki populacyjnej, można podzielić na dwie grupy. Pierwsza grupa metod wykorzystuje informacje uzyskane dzięki analizie tzw. dwurodzicielskich markerów genetycznych, których przykładem są sekwencje mikrosatelitarne. Te wysoce zmienne obszary genomu charakteryzują się polimorfizmem na poziomie populacji – w danej grupie osobników (np. w populacji) dana sekwencja mikrosatelitarna może występować pod postacią wielu różnych form (alleli), a analiza kilku bądź kilkunastu markerów mikrosatelitarnych pozwala stworzyć unikatowe genotypy dla każdego osobnika w populacji (profil genetyczny), określić poziom zmienności genetycznej w populacji oraz oszacować różnice genetyczne między populacjami wynikające, między innymi, z poziomu przepływu genów, czyli opisać genetyczną strukturę populacji. Sekwencje mikrosatelitarne są przekazywane na potomstwo przez oboje rodziców, stąd też określa się je mianem markerów dwurodzicielskich. Markery dwurodzicielskie umożliwiają określenie spokrewnienia między osobnikami. Jeśli osobniki danego gatunku nie migrują daleko od miejsca 30 Robert Rutkowski, Ewa Suchecka, Dorota Zawadzka swoich narodzin lub rodzimej populacji, spokrewnienie osobników żyjących w tej samej populacji powinno być istotnie wyższe niż spokrewnienie osobników z różnych populacji. Dlatego też zakładając, że jedna płeć jest filopatryczna, a druga wykazuje tendencję do migracji, osobniki płci filopatrycznej powinny być bardziej spokrewnione w obrębie populacji niż osobniki płci migrującej. Inne podejście opierające się na molekularnych markerach dwurodzicielskich, wykorzystuje różnice we frekwencji alleli między populacjami do wyznaczenia poziomu międzypopulacyjnego zróżnicowania genetycznego, szacowanego na podstawie tzw. indeksu utrwalenia – FST. W tym przypadku oczekuje się, że wartość zróżnicowania między populacjami dla płci migrującej częściej powinna być istotnie niższa niż dla płci filopatrycznej. W związku z tym genetyczna struktura populacji płci filopatrycznej powinna być znacznie wyraźniejsza (duże różnice genetyczne między populacjami, wyrażone wysoką wartością FST) niż struktura genetyczna płci migrującej (podobne frekwencje alleli w poszczególnych populacjach, wyrażone niską wartością FST). Druga grupa metod opiera się na porównaniu wyników uzyskanych na podstawie analizy markerów różniących się typem dziedziczenia, czyli markerów dwurodzicielskich i jednorodzicielskich. Markery jednorodzicielskie są przekazywane na potomstwo tylko przez jednego z rodziców – na przykład genom mitochondrialny (mtDNA) dziedziczy się tylko w linii żeńskiej, a chromosom Y u ssaków tylko w linii męskiej. W analizie migracyjności zależnej od płci najczęściej wykorzystuje się porównanie danych z analiz genomu mitochondrialnego i dwurodzicielskich markerów jądrowych, znajdujących się na chromosomach autosomalnych, na przykład wspominanych już wcześniej sekwencji mikrosatelitarnych. Ponieważ osobniki jednej płci nie przekazują markerów jednorodzicielskich na potomstwo (na przykład samce w przypadku mtDNA), a w przypadku markerów dwurodzicielskich zarówno samiec, jak i samica mają wkład w genetyczną zmienność potomstwa, oczekuje się, że efektem występowania migracyjności zależnej od płci będą różnice w poziomie struktury genetycznej, oszacowanej na podstawie tych dwóch klas markerów. W przypadku gatunków, u których samice są filopatryczne, a samce wykazują tendencję do migracyjności, zróżnicowanie genetyczne między populacjami, szacowane na podstawie mtDNA, powinno być wyższe niż zróżnicowanie szacowane na podstawie markerów dwurodzicielskich. Zarówno monogamia, jak i większa migracyjność samic obserwowane u wielu gatunków ptaków, wynikają z konkurencji o zasoby. Dla samców korzystna jest filopatria, ponieważ są zaznajomione z zasobami terenu, na którym występują, natomiast samice korzystają na migracyjności, ponieważ pozwala im ona wybierać spomiędzy samców i bronionych przez nie zasobów. Migrujące samice unikają także kojarzenia ze spokrewnionymi partnerami. Choć w przypadku ptaków samice wydają się o wiele bardziej migracyjne od samców, istnieją liczne wyjątki. Wzorce migracyjności najdokładniej poznano w przypadku gatunków fakultatywnie monogamicznych, natomiast wciąż istnieje niewiele danych dla ptaków poligenicznych, a szczególnie rozmnażających się w systemie tokowiskowym. Tokowiskowy system rozrodu różni się od monogamii, charakterystycznej dla wielu gatunków ptaków. Stwierdzono, że samice gatunków tokowiskowych powinny migrować dalej niż samce, jeśli samce dzielą się zasobami wcześniej, nim następuje wybór partnerów. System tokowiskowy może faworyzować filopatrię również poprzez dobór krewniaczy. Jednak z drugiej strony konkurencja w obrębie płci i konkurencja między rodzicami i potomstwem powinna promować intensywniejszą migracyjność samców, ponieważ konkurencja o wolne terytoria jest najprawdopodobniej silniejsza niż konkurencja między samicami o miejsca gniazdowe. W Polsce występują trzy gatunki kuraków leśnych: głuszec (Tetraourogallus), cietrzew (Tetraotetrix) i jarząbek (Bonasabonasia). Wszystkie są gatunkami osiadłymi, przy czym dwa pierwsze charakteryzują się polygynicznym systemem rozrodu na tokowiskach, natomiast jarząbek jest monogamiczny. Celem niniejszej pracy jest przegląd dotychczasowych badań, wykorzystujących metody analizy DNA do szacowania genetycznej struktury populacji kuraków leśnych występujących w Polsce; zestawienie tych danych z wiedzą dotyczącą migracyjności zależnej od Migracyjność zależna od płci a genetyczna struktura populacji kuraków leśnych 31 płci u tych gatunków, oraz odpowiedź na pytanie, w jaki sposób określone wzorce migracyjności oddziałują na strukturę genetyczną w populacjach kuraków leśnych. Głuszec Głuszec (Tetraourogallus) należy do gatunków o tokowiskowym systemie rozrodu. Poszczególne tokowiska są zajmowane zazwyczaj przez grupę 3–20 samców. Koguty w wieku co najmniej trzech lat lub starsze są ściśle terytorialne i biorą udział w rozrodzie na jednym tokowisku. Młode, jedno- lub dwuletnie koguty mają bardzo duże terytoria i mogą odwiedzać dwa lub nawet trzy sąsiednie tokowiska. Pojawiające się na tokowiskach samice wybierają spośród dominantów samca, który je zapładnia. Do rozrodu przystępuje jeden dominujący samiec z tokowiska lub kilka współdominujących, zapładniając wszystkie lub zdecydowaną większość samic. Migracyjność głuszca stała się przedmiotem intensywnych badań, ponieważ w ostatnich dziesięcioleciach ten gatunek, podobnie jak cietrzew, wyginął bądź jest zagrożony wyginięciem w wielu krajach Europy zachodniej i środkowej. Przyjmuje się, że migracyjność głuszca powinna być niewielka, a płcią częściej migrującą są samice. Podobnie jak u innych gatunków, największą mobilność wykazują ptaki młode, a najmniejszą stare samce, związaną z silnym terytorializmem w okresie zimowania i toków. Jednakże wyniki poszczególnych badań nie są jednoznaczne. W Alpach, w przypadku dorosłych osobników, samice wydają się migrować na mniejsze odległości niż samce, natomiast w Norwegii średni dystans migracji był wyższy u dorosłych samic (1.9 km) niż samców (1.5 km), choć maksymalny dystans migracji był wyższy u samców (10 km) niż samic (8 km). Jednoznacznej odpowiedzi nie udzielają także metody pośrednie, bazujące na analizach molekularnych markerów genetycznych. Markery dwurodzicielskie w przypadku wielu regionów Europy sugerują występowanie wyraźnej struktury genetycznej w populacjach głuszca, natomiast analizy oparte na DNA mitochondrialnym, prowadzone zarówno w skali lokalnej, jak i kontynentalnej pokazują dość duże podobieństwo genetyczne między poszczególnymi populacjami. Takie porównanie wyników uzyskanych z markerów dwu- i jednorodzicielskich sugeruje, że w przypadku głuszca migracyjność jest zależna głównie od samic. Jednakże badania, których głównym celem była weryfikacja hipotez o większej dyspersyjności samic głuszca, nie potwierdziły wcześniejszych założeń. Autorzy, wykorzystując markery molekularne, określili genotypy i haplotypy osobników z ponad 100 tokowisk w północnej Finlandii. Analizy wykazały, że choć przepływ genów między poszczególnymi tokowiskami jest w pewnym stopniu ograniczony, to jednak nie zaobserwowano różnic w strukturze genetycznej samców i samic. Wartość FST dla całej badanej populacji wynosiła 0.17 i 0.19 (odpowiednio dla markerów dwurodzicielskich i jednorodzicielskich) oraz 0.226 w przypadku samic i 0.208 w przypadku samców (markery dwurodzicielskie), sugerując nieco wyraźniejszą strukturę genetyczną w przypadku tej pierwszej płci. Wskazuje to, że w warunkach północnej Finlandii (brak intensywnej fragmentacji środowisk leśnych) samice mogą być bardziej osiadłe od samców. Cietrzew Podobnie jak głuszec, także i cietrzew uważany jest za gatunek, w przypadku którego samice są bardziej migracyjne od samców. Większą zdolność migracyjną samic potwierdziły badania telemetryczne, przeprowadzone we Francji, Anglii i Finlandii, a także analizy wykorzystujące molekularne markery genetyczne: analiza locimikrosatelitarnych wykazała występowanie struktury genetycznej wśród tokujących samców, ale nie wśród samic odwiedzających tokowiska. Zasugerowano, że grupa samców na danym tokowisku składa się ze spokrewnionych osobników z tego samego „stada zimowego”. Ponieważ badania opierały się na małej liczbie markerów molekularnych, należy je interpretować z dużą ostrożnością, tym bardziej, że podobne analizy, 32 Robert Rutkowski, Ewa Suchecka, Dorota Zawadzka oparte na znacznie większej liczbie markerów mikrosatelitarnych nie potwierdziły, że na tokowiskach gromadzą się głównie spokrewnione ze sobą koguty cietrzewia, co powinno być naturalnym następstwem silnie zaznaczonej filopatrii. Choć w populacji tego gatunku tokowisko może być uważane za podstawową jednostkę genetycznej struktury populacji (poszczególne tokowiska różniły się między sobą pod względem frekwencji alleli mikrosatelitarnych), to jednak poziom spokrewnienia kogutów na tym samym tokowisku był bardzo niski. Niemniej także i te badania, oparte na markerach dwurodzicielskich, wykazały istotnie bardziej zaznaczoną strukturę genetyczną w przypadku samców (FST = 0.015) niż samic (FST = 0.003), wspierając hipotezę o nieco wyższej migracyjności cieciorek. Jarząbek Jarząbki, w przeciwieństwie do głuszców i cietrzewi, są monogamiczne. Dopóki młode zostają przy rodzicach, jarząbki żyją w stadach rodzinnych, wspólnie zdobywając pokarm i broniąc terytorium. Terytoria par sąsiadują lub nachodzą na siebie i charakteryzują się dużą trwałością, tj. są niezmienne przez wiele lat. Możliwości migracji jarząbków są ograniczone i ptaki niechętnie przemieszczają się na duże odległości. Badania prowadzone w Szwecji wykazały, że średni dystans migracji waha się od 800 m do 900–1500 m. We francuskich Alpach średnia odległość pokonana przez samca wyniosła 4 km (najdłuższy dystans 24.9 km), natomiast przez samicę – 2 km. Wydaje się więc, że w przypadku jarząbka samce mogą migrować na większe odległości niż samice, w odróżnieniu od innych głuszcowatych. Jarząbki są najsłabiej poznaną pod względem genetycznym grupą w obrębie rodziny głuszcowatych. Analizy z wykorzystaniem markerów molekularnych dotyczyły głównie zagadnień filogeograficznych (DNA mitochondrialny) oraz genetyki populacyjnej stabilnych, szeroko rozprzestrzenionych populacji skandynawskich. Jednak żadna z tych prac nie skupiała się na zagadnieniu migracyjności zależnej od płci. Badania polskiej populacji gatunku, były oparte na próbach pozyskiwanych nieinwazyjnie, co uniemożliwiało określenie płci osobników, od których pozyskiwano materiał genetyczny. Jednakże równoległe zastosowanie w tej pracy dwóch markerów różniących się typem dziedziczenia (jednorodzicielsko dziedziczone mtDNA i dwurodzicielskie markery mikrosatelitarne) pozwala na wyciągnięcie pewnych wniosków dotyczących migracyjności zależnej od płci. W Polskiej populacji gatunku wyróżniono dwie grupy genetyczne, między którymi przepływ genów jest wyraźnie ograniczony: rejon północno-wschodni oraz południowy. W obrębie tych regionów wartości zróżnicowania międzypopulacyjnego były najczęściej znacznie niższe dla markerów mikrosatelitarnych (FST = 0.0003–0.12) niż dla DNA mitochondrialnego (FST = 0.08–0.92). Sugeruje to, że przepływ materiału genetycznego dziedziczonego w linii żeńskiej może być mniej intensywny niż przepływ genów dziedziczonych dwurodzicielsko. Wskazywałoby to na większą migracyjność samców jarząbka w porównaniu z samicami. Co więcej, analiza korelacji między dystansem geograficznym między populacjami a dzielącym je dystansem genetycznym (model izolacji przez dystans) sugeruje znacznie silniejszą, pozytywną zależność w przypadku markerów mikrosatelitarnych (r = 0.913; P< 0.05) niż w przypadku markera mitochondrialnego (r = 0.168; P = 0.077). Jarząbek jest gatunkiem osiadłym, rzadko przemieszczającym się na duże odległości. Zazwyczaj w przypadku takich gatunków populacje położone bliżej siebie wymieniają geny częściej niż populacje znacznie bardziej oddalone – migrującemu osobnikowi łatwiej jest przenieść geny do populacji położonej bliżej populacji rodzimej. W efekcie, poziom zróżnicowania genetycznego między populacjami staje się zależny od odległości geograficznej między nimi. Badania nad jarząbkiem sugerują, że zależność ta jest bardzo wyraźna w przypadku samców, natomiast niemal zupełnie niewidoczna w przypadku samic. Być może więc, genetyczna struktura populacji samic jarząbka jest kształtowana głównie przez zjawisko izolacji między poszczególnymi kompleksami leśnymi i następującego w jej efekcie dryfu genetycznego, co prowadzi do losowego pojawiania się różnic gene- Migracyjność zależna od płci a genetyczna struktura populacji kuraków leśnych 33 tycznych między populacjami. Natomiast w przypadku samców, bardziej skłonnych do migracji, struktura genetyczna jest zgodna z modelem izolacji przez dystans. Podsumowanie Wzorzec migracyjności zależnej od płci wpływa na genetyczną strukturę populacji kuraków leśnych. Z drugiej strony, analiza struktury genetycznej pozwala weryfikować, a nawet przewidywać zdolności migracyjne samców i samic określonego gatunku. U głuszca i cietrzewia badania struktury genetycznej wykazały, że obje płcie mogą brać udział w przepływie genów. Brak wyraźnej struktury genetycznej w populacji samic przypisano skłonności do migracji, natomiast słabo zaznaczona struktura genetyczna populacji samców wynika najprawdopodobniej z o wiele słabszej niż przypuszczano filopatrii osobników tej płci. Głównym następstwem takiego wzorca migracyjności jest brak wyraźnych różnic w poziomie zróżnicowania międzypopulacyjnego, szacowanego na podstawie markerów dwurodzicielskich i jednorodzicielskich, jak również zróżnicowania międzypopulacyjnego, szacowanego odrębnie dla samic i samców. Jarząbek, różniący się od głuszca i cietrzewia systemem rozrodu, wydaje się także różnić pod względem migracyjności zależnej od płci. Choć dostępnych jest niewiele danych dotyczących struktury genetycznej jarząbka, porównanie markerów dziedziczonych jedno- i dwurodzicielsko sugeruje, że płcią bardziej skłonną do migracji są samce, a przepływ genów podlega modelowi izolacji przez dystans. Anna Tereba Zakład Hodowli Lasu i Genetyki Drzew Leśnych Instytut Badawczy Leśnictwa Wpływ fragmentacji środowisk leśnych na strukturę genetyczną wybranych gatunków nietoperzy Wzrastające tempo przekształcania naturalnych środowisk przez człowieka ma znaczący wpływ na populacje dzikich zwierząt i innych organizmów. Metody biologii molekularnej stosowane w badaniach populacyjnych pozwalają na identyfikacje zagrożeń dla naturalnej fauny i flory oraz pomagają w wyznaczaniu kierunków działań niwelujących negatywne skutki działalności człowieka. Wiele gatunków objętych ochroną, jak np. gatunki nietoperzy występujących w Polsce, wymagają wnikliwej analizy czynników wpływających na kondycję populacji i o ile to możliwe aktywnego ograniczania zagrożeń. Wstęp W ostatnich latach osiągnięcia biologii molekularnej dały początek rewolucji w badaniach ekologicznych. Obecnie rutynowo wykonuje się badania zróżnicowania genetycznego na poziomie osobnika, populacji czy gatunku. Zastosowanie tych metod dostarczyło ogromu danych pozwalających na badanie ekologii i ewolucji organizmów zupełnie w nowym ujęciu. Dzięki analizie polimorfizmu (zmienności) markerów genetycznych możemy odtwarzać drogi migracji, identyfikować wsobność w populacjach, badać nowe gatunki (często kryptyczne czyli gatunki blisko spokrewnione, które są do siebie tak podobne, że utrudnia to ich rozróżnienie na podstawie morfologii). Metody genetyki molekularnej mają ogromne znaczenie w badaniach i często są jedyną drogą do rozwiązania wielu problemów ekologicznych, prowadząc do praktycznych rozwiązań. Biologia molekularna posługuje się wieloma bardzo zróżnicowanymi metodami laboratoryjnymi, które dają nam możliwość poznania mechanizmów ewolucji na najbardziej fundamentalnym poziomie jakim jest DNA. Narzędzia te możemy wykorzystywać między innymi do szczegółowej identyfikacji osobników. Przykładem mogą tu być badania identyfikacji drewna na potrzeby straży leśnej. W takich przypadkach wykorzystuje się analizę markerów genetycznych charakteryzujących się bardzo szybkim tempem mutacji. Nie jest to oczywiście jedyne zastosowanie tego typu markerów, mogą one posłużyć również w ocenie pokrewieństwa np. w sprawach weryfikacji ojcostwa, pozwalają również na określenie stopnia hybrydyzacji np. pomiędzy bardzo blisko spokrewnionymi gatunkami dębów (Quercus sp). Metody molekularne mają bardzo szerokie zastosowanie w badaniach analizy zmienności genetycznej w populacjach, ale również bardzo intensywnie eksplorowanym polem badań są analizy filogenetyczne polegające na weryfikacji zależności ewolucyjnych pomiędzy gatunkami. W tych badaniach, wykorzystuje się jako markery, fragmenty sekwencji o znacznie wolniejszym tempie mutacji. Wymienione powyżej zastosowania technik molekularnych to jedynie niewielka część, z kolei opis stosowanych metod znacznie wykroczyłby poza ramy publikacji, niemniej jednak ich wspólną podstawą jest analiza zmienności na poziomie kwasu deoksyrybonukleinowego. Wpływ fragmentacji środowisk leśnych na strukturę genetyczną wybranych gatunków nietoperzy 35 Fragmentacja środowiska przyrodniczego Tempo rozwoju cywilizacji znacznie wzrosło, a z nim nieodzownie wiąże się rozwój infrastruktury, co z kolei skutkuje przekształcaniem środowisk naturalnych na potrzeby stale zwiększającej się populacji ludzkiej. Tak silna urbanizacja oraz intensyfikacji przemysłu i rolnictwa, w drastyczny sposób wpływa na ograniczenie i ciągłe zmniejszanie się powierzchni środowisk naturalnych i w konsekwencji na ich fragmentacje. Izolowane obszary przyrodnicze są przyczyną ograniczenia dyspersji i migracji zwierząt i roślin, co na poziomie molekularnym przekłada się na ograniczony przepływ genów pomiędzy izolowanymi populacjami i zubożenie zróżnicowania genetycznego w ich obrębie. Konsekwencją tych zjawisk może być wzrastający inbred (polega on na kojarzeniu osobników spokrewnionych ze sobą w stopniu wyższym niż wartość średniego spokrewnienia populacji, skutkiem inbredu jest wzrost homozygotyczności potomstwa), a nawet wyginięcie całej populacji. W odpowiedzi na te realne zagrożenia dla przetrwania wielu gatunków, powstały już konkretne rozwiązania mające na celu wspomóc ochronę zasobów przyrodniczych. Jeszcze do niedawna główny nacisk wywierano na ochronę konkretnych gatunków, bądź obszarów wartościowych z przyrodniczego punktu widzenia, nadając status rezerwatów przyrody czy parków narodowych. Dodatkowym narzędziem, jakie uzyskano w ochronie środowiska były przepisy unijne stanowiące podstawę dla tworzenia sieci Natura 2000. Zostały one wprowadzone do polskiego prawodawstwa poprzez Ustawę z dnia 16 kwietnia 2004 r. o ochronie przyrody (Dz. U. z 2009 r. Nr 151, poz. 1220, z późn. zm.), ta forma ochrony przyrody jest najmłodszą formą prawną w Polsce. Głównym celem funkcjonowania Europejskiej Sieci Ekologicznej Natura 2000 jest zachowanie zróżnicowanych typów siedlisk przyrodniczych i gatunków, które uważa się za cenne i zagrożone wyginięciem w skali całej Europy. Podstawą funkcjonowania tego systemu są dwie unijne dyrektywy – Dyrektywa 2009/147/WE Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 30 listopada 2009 r. w sprawie ochrony dzikiego ptactwa (zwana dyrektywą ptasią) oraz Dyrektywa 92/43/EWG Rady z dnia 21 maja 1992 r. w sprawie ochrony siedlisk przyrodniczych oraz dzikiej fauny i flory (zwana dyrektywą siedliskową). Zgodnie z wytycznymi obu dyrektyw każdy kraj członkowski Unii Europejskiej ma obowiązek zapewnić siedliskom przyrodniczym, gatunkom roślin i zwierząt, warunki sprzyjające ochronie lub zadbać o odtworzenie ich dobrego stanu, m.in. poprzez wyznaczenie obszarów specjalnej ochrony ptaków (OSO) oraz specjalnych obszarów ochrony siedlisk (SOO). Obecnie w Polsce, sieć Natura 2000 zajmuje prawie 1/5 powierzchni lądowej kraju, przy blisko 1000 wyznaczonych obszarów ochrony siedlisk i ochrony ptaków. Tradycyjnie pojmowana ochrona środowiska polegała głównie na ochronie gatunkowej (dany gatunek otrzymywał odpowiedni status), bądź też na ochronie wybranego obszaru przyrodniczego. Podejście to zmieniło się jednak pod wpływem wyników badań, wskazujących na bardzo ważną rolę, jaką pełni zachowanie bioróżnorodności. Nadanie statusu ochronnego danemu gatunkowi nie będzie efektywne, jeśli nie będzie rozpatrywane łącznie z funkcjonowaniem całego ekosystemu. Można oczywiście to zagadnienie rozpatrywać w skali lokalnej, lecz nie należy zapominać o regionach gdzie populacje funkcjonują jako metapopulacje (populacje zamieszkujące pofragmentowane środowisko składające się z płatów, pomiędzy którymi regularnie przemieszczają się osobniki; płaty muszą być wystarczające do bytowania i rozmnażania). Jeszcze szersze pojęcie odnosić się będzie do zasięgu całego gatunku w wymiarze kontynentalnym. Ochrona bioróżnorodności, oprócz ochrony gatunków i siedlisk, dotyczy również ochrony zróżnicowania genetycznego, gdzie niezbędne jest zachowanie łączności ekologicznej, pozwalającej na przepływ genów. Fragmentacja środowiska stanowi jedno z głównych zagrożeń w przypadku dużych ssaków, gdzie wymagania dotyczące wielkości zajmowanych areałów przez zwierzęta często znacznie przewyższają wielkość wyznaczonych terenów ochrony siedlisk. Skutkiem tego może być również fragmentacja populacji, zarówno zmniejszenie jej liczebności jak i zróżnicowania genetycznego. Niskie zróżnicowanie genetyczne wpływa na obniżenie możliwości adaptacyjnych i zwiększa ryzyko zapadalności na choroby. W Polsce przykładem może być 36 Anna Tereba populacja żubrów, u której obserwuje się bardzo niską zmienność genetyczną oraz od wielu lat monitorowany jest poziom inbredu. Potencjalne skutki fragmentacji środowiska obserwujemy również u znacznie mniejszych organizmów, co ilustrują badania prowadzone na gatunku motyla perłowca (Speyeria idalia). Porównywano populacje tego gatunku występujące zarówno w środowisku niepofragmentowanym jak i ulegającym fragmentacji. Wyniki wskazały, ze w drugim typie środowiska obniżony jest poziom migracji osobników i zmienność genetyczna populacji. Wpływ i konsekwencje fragmentacji środowiska schematycznie przedstawia rys. 1. Rys 1. W pierwotnej populacji wymiana osobników i przepływ genów przebiegają bez zakłóceń. Fragmentacja środowiska, ograniczając poziom migracji, prowadzi do obniżenia zróżnicowania genetycznego i osłabienia subpopulacji, a z upływem czasu do jej wyginięcia. Próbą zniwelowania skutków postępującej fragmentacji środowiska jest idea korytarzy ekologicznych, których zadaniem jest utrzymanie ciągłości populacji i umożliwienie przepływu genów między populacjami zasiedlającymi izolowane fragmenty środowiska. Korytarze ekologiczne z definicji mają za zadanie umożliwić migracje zwierząt, roślin i grzybów. Ich tworzenie bądź odtwarzanie nie jest jednak łatwym zadaniem, ze względu na wielką różnorodność i odmienne wymagania i możliwości przemieszczania się różnych gatunków. Co dla niektórych będzie korytarzem ekologicznym dla innych może stanowić barierę niemożliwą do przebycia. Z założenia korytarze ekologiczne zawsze istniały w krajobrazie, można tu wyróżnić korytarze ciągłe lub nie. Charakter ciągły będą miały korytarze takie jak doliny rzek, pasma górskie, natomiast połączenia nieciągłe to siedliska pomostowe (stepping stones). Są to siedliska, które nie są wystarczające do utrzymania subpopulacji, z powodu zbyt małych rozmiarów bądź niewystarczających warunków siedliskowych, jednak ze względu na położenie pełnią kluczową rolę w przepływie genów i wymianie osobników pomiędzy siedliskami. Przy planowaniu korytarzy ekologicznych brane pod uwagę powinny być cztery typy przemieszczania się osobników: • w ramach dobowej aktywności (np. gdy potrzebny się dostęp do żerowisk), • w ramach migracji sezonowych (np. pomiędzy letnimi i zimowymi ostojami), Wpływ fragmentacji środowisk leśnych na strukturę genetyczną wybranych gatunków nietoperzy 37 • dyspersja młodych osobników, • przemieszczanie się zwierząt związane ze zmianami klimatycznymi. Zidentyfikowanie korytarzy łączących siedliska ważne dla zachowania i przemieszczania się konkretnych gatunków, wymaga bardzo dobrej znajomości zarówno samej ekologii gatunku, tras przemieszczania się jak i dobrego rozpoznania zależności gatunek siedlisko w danych lokalnych warunkach. Wyniki analiz molekularnych w istotny sposób przyczyniają się do rozwoju i poszerzania wiedzy w tych zakresach. Zmienność genetyczna nietoperzy Zmiany antropogeniczne środowiska naturalnego często prowadzą do sztucznej fragmentacji siedlisk, a to z kolei prowadzi do podziału i dalszej izolacji żyjących w nich populacji. Grupą zwierząt, której warto się przyjrzeć bliżej w kontekście degradacji i fragmentacji środowiska są nietoperze. Chodź zwierzęta te są mało poznane, to pełnią ważne funkcje biologiczne. W naszej szerokości geograficznej są przede wszystkim drapieżnikami wielu owadów niszczących uprawy rolne, mogą również przenosić niebezpieczne dla ludzi wirusy m.in. wściekliznę. Badania populacji nietoperzy pozwalają na identyfikację czynników wpływających na zmiany ich liczebności czy zmiany zasięgu występowania. Czynnikami takimi oprócz postępującej degradacji i fragmentacji środowiska mogą być zanieczyszczenia pestycydami. Identyfikacja stopnia zróżnicowania genetycznego wewnątrz- i międzypopulacyjnego może mieć istotne konsekwencje w przypadku działań ochronnych podejmowanych na poziomie poszczególnych populacji, jak i całego gatunku. W niektórych przypadkach geograficznie izolowane populacje mogą wymagać szczególnej, indywidualnej ochrony. W badaniach molekularnych dotyczących nietoperzy zazwyczaj stosuje się dwa typy markerów: mikrosatelitarne (jądrowe – dziedziczone po obu rodzicach) i mitochondrialne (dziedziczone tylko w linii żeńskiej). Markery mikrosatelitarne, charakteryzujące się bardzo szybkim tempem ewolucji, pozwalają na prowadzanie analiz na poziomie populacyjnym i osobniczym. Równie często stosowane w badaniach populacyjnych są markery mitochondrialne. Zaletą genomu mitochondrialnego jest szybkie tempo mutacji (około 10 razy szybsze niż genomu jądrowego), brak intronów (część sekwencji genu, która nie koduje sekwencji polipeptydu), oraz konserwatywność wielu fragmentów, co daje możliwość amplifikacji przy wykorzystaniu uniwersalnych starterów do łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR). Przykładem wykorzystania markera mitochondrialnego są wyniki badań Salgueiro i współpracowników, przeprowadzone w 2004 roku u borowca azorskiego (Nyctalus azoreum) na wyspach archipelagu Azory. Cały rodzaj Nyctalus jest zaliczany do grupy nietoperzy migrujących. Jednak w przypadku endemicznego N. azoreum nie zaobserwowano migracji sezonowych. W badaniach tych stwierdzono jednak, że połowa otrzymanych haplotypów była unikatowa dla poszczególnych wysp, a przepływ genów w obrębie archipelagu był bardzo ograniczony, co wskazuje, że otaczające wyspy morze stanowiło barierę dla tych zwierząt, pomimo fizycznej możliwości pokonania odległości jakie były między wyspami. Podobny schemat zaobserwowano na archipelagu Komorów, gdzie analizowano strukturę genetyczną nietoperzy z rodzaju Miniopterus. Przepływ genów między osobnikami zasiedlającymi dwie sąsiadujące wyspy był bardzo ograniczony, pomimo dość małej odległości (80 km) pomiędzy wyspami. Choć powyższe przykłady pochodzą z regionów tropikalnych, to wskazują one, że pomimo możliwości aktywnego lotu i dużej mobilnością nietoperzy, można zaobserwować w tej grupie również ograniczoną migrację z powodu barier geograficznych. A ograniczenia w przepływie genów nie muszą dotyczyć wyłącznie gatunków osiadłych, ale także tych migrujących, u których spodziewana jest bardzo słabo zarysowana struktura genetyczna bądź zupełny brak zróżnicowania genetycznego pomiędzy populacjami. Migracyjność nietoperzy jest bardzo zróżnicowana i w głównej mierze zależna od gatunku. Badania z użyciem technik obrączkowania wykazały, że niektóre gatunki nietoperzy z rodzajów Nyctalus czy Pipistrellus mogą 38 Anna Tereba migrować nawet kilka tysięcy kilometrów pomiędzy koloniami letnimi a zimowiskami. Natomiast u gatunków osiadłych lub migrujących fakultatywnie przeloty ograniczają się do znacznie krótszych dystansów. Sezonowe przeloty u nocka rudego (Myotis daubentonii) średnio wynoszą 100–150 km, a najdłuższy znany przelot u tego gatunku to około 304 km. Częściową izolację populacji wykryto również u innego gatunku charakteryzującego się wysoka migracyjnością. Petit i Mayer zbadali poziom zróżnicowania genetycznego między koloniami letnimi borowca wielkiego (Nyctalus noctula). Podstawowe indeksy mówiące o poziomie zróżnicowania genetycznego były niskie (świadczące o intensywnym przepływie genów), jednak kolonie z północnej części Europy były częściowo izolowane od pozostałych badanych populacji z południowej i zachodniej części kontynentu. W tym przypadku czynniki środowiskowe prawdopodobnie miały znaczący wpływ na otrzymaną strukturę genetyczną, lokalne warunki sprzyjały intensywnemu rozwojowi populacji co doprowadziło do utrwalenia efektu założyciela (występuje on gdy populacja w przeszłości przeszła przez stadium z bardzo niewielką liczbą osobników). Wynik ten jest zaskakujący, ze względu na wysoką migracyjność tego gatunku. Dość istotną rolę pełnią też pasma górskie stanowiące bariery geograficzne ograniczające przepływ genów. U nocka rudego (Myotis daubentonii) istnieje silnie ograniczony przepływ genów związany z pasmami górskimi na obszarze Szkocji. Z kolei Alpy stanowią barierę geograficzną dla nocków dużych (Myotis myotis). Powyższe przykłady obrazujące ograniczenia w przepływie genów pomiędzy populacjami różnych gatunków nietoperzy odnoszą się jednak do skali geograficznej o wymiarze kontynentalnym. Jednak również w mniejszej skali, bardziej lokalnej, prowadzone były badania dotyczące czynników wpływających na ograniczenia w przepływie genów w tej grupie zwierząt. Wpływ fragmentacji środowisk leśnych był sugerowany jako istotny czynnik wpływający na ograniczenia w przepływie genów u gatunku nietoperza z rodzaju nocków (Myotis bechsteinii). Badania te prowadzone były na terenie Niemiec, Szwajcarii i Bułgarii. Wyniki otrzymane na podstawie tych badań były zgodne z modelem izolacji przez dystans w przypadku markerów mikrosatelitarnych. Jednak dla sekwencji mitochondrialnego DNA te same analizy tylko w jednym z trzech analizowanych regionów dały podobny jak wyżej wynik. Wyjaśnienie uzyskanego zróżnicowania genetycznego w tym przypadku skupia się na fragmentacji środowiska, a mniejsze znaczenie wydaje się mieć dystans geograficzny. W Polsce również prowadzone były badania genetyczne wybranych gatunków nietoperzy. Przedstawicielem tej grupy może być pospolity gatunek gacka brunatnego (Plecotus auritus). Nietoperze te są średniej wielkości, a cechą charakterystyczną tego rodzaju są bardzo duże uszy sięgające ¾ długości ciała. Gatunek ten występuje na obszarze całej Polski. Zazwyczaj gacki brunatne można spotkać w lasach bądź w ich pobliżu, kolonie często tworzą na strychach budynków lub w skrzynkach dla nietoperzy. Morfologia skrzydeł decyduje o tym, że gatunek ten nie wykonuje lotów na długich dystansach. Maksymalny dystans zarejestrowany w Niemczech pomiędzy letnią a zimową kryjówka wynosił 71 km (dla samca) i 29 km (dla samicy). Większość przelotów nie przekracza jednak 30 km. Gacki brunatne są nietoperzami osiadłymi i przez cały rok występują w tej samej okolicy. Kolonie rozrodcze formowane są w kwietniu, a większość z nich wykorzystuje te same kryjówki letnie z roku na rok. Z przeprowadzonych badań genetycznych wynika, że przedstawiciele tego gatunku występujący na terenie naszego kraju charakteryzują się niezwykle wysokim zróżnicowaniem genetycznym, co więcej blisko 75% uzyskanych haplotypów (różne warianty danego markera molekularnego) było unikatowych – występujących tylko w jednej lokalizacji. Ekologia gatunku z pewnością jest jednym z głównych czynników wpływających na strukturę genetyczna, jednak nie w pełni wyjaśnia ona wyraźną izolacje kolonii z obszaru północno-wschodniej Polski, jaką zaobserwowano na podstawie analiz molekularnych. Nie można zatem wykluczyć roli innych czynników związanych ze środowiskiem. Za wpływem ukształtowania i fragmentacji środowiska leśnego, może przemawiać również fakt, iż z badań tych nie wynikała jednoznaczna zależność pomiędzy dystansem genetycznym a geograficznym, co z kolei przemawiałoby za jednoznacznym wpływem filopatryczności (tendencja osobników do przebywania w miejscu pochodzenia) jako jedynego Wpływ fragmentacji środowisk leśnych na strukturę genetyczną wybranych gatunków nietoperzy 39 czynnika kształtującego strukturę genetyczną gacków brunatnych w Polsce. Lepsze zrozumienie ekologii i behawioru nietoperzy pozwala na bardziej efektywną ochronę na poziomie populacyjnym i gatunkowym. Obserwowane bardzo wysokie zróżnicowanie genetyczne wymaga działań ochronnych gatunku i utrzymania różnorodności biologicznej na obecnym poziomie. Działania te jednak nie mogą być podejmowane w oderwaniu od ochrony wybranych siedlisk. Istotny wpływ ma również edukacja społeczeństwa, ponieważ nietoperze często zakładają kolonie rozrodcze na strychach prywatnych budynków położonych w pobliżu terenów leśnych. Podsumowanie Postępujące negatywne zmiany środowisk naturalnych powodują daleko idące i trudne do przewidzenia implikacje dla poszczególnych gatunków i całych ekosystemów. W przypadku dużych ssaków zagrożenia wydają się być ewidentne, jednak nawet w przypadku bardzo mobilnych gatunków takich jak nietoperze badania genetyczne wskazują na ograniczenia w przepływie genów związane z fragmentacją środowiska. Zwłaszcza w przypadku gatunków osiadłych należy zwrócić dodatkowo uwagę na silną filopatrię samic i jak w przypadku gacków brunatnych na wysokie zróżnicowanie genetyczne pomiędzy koloniami rozrodczymi. Kolonie te są nie tylko głównym komponentem populacji lokalnych, ale też miejscami koncentracji samic, co wiąże się z wysoką wrażliwością na lokalne negatywne czynniki; w przypadku znacznej redukcji osobników w kolonii rozrodczej nie można oczekiwać odbudowy takiej kolonii wskutek migracji samic z kolonii sąsiednich, a fragmentacja środowiska dodatkowo utrwala efekt izolacji. Dlatego metody ochrony łączności ekologicznej są niezwykle ważne, choć projektowanie i ochrona korytarzy ekologicznych jest zadaniem trudnym. Zbigniew Borowski Zakład Ekologii Lasu, Instytut Badawczy Leśnictwa Zastosowanie biologii molekularnej w łowiectwie W niniejszym artykule przedstawiono w dużym skrócie zastosowanie metod genetycznych do badań łowieckich i zarządzania populacjami zwierzyny. Omówiono i przedyskutowano zastosowanie biologii molekularnej w następujących zagadnieniach: określania liczebności i efektywnej wielkości populacji, oszacowania zróżnicowania genetycznego, określenia tempa dyspersji i jej skutków dla populacji oraz ekosystemu, a także pośrednich i bezpośrednich skutkach selekcji łowieckiej. Wstęp Nagły rozwój nowych technik molekularnych, który nastąpił w ciągu ostatnich 30 lat stworzył imponujący zestaw narzędzi genetycznych wielce użytecznych w szeroko pojętych badaniach przyrody. Złożyło się na to szereg przyczyn, ale najważniejszymi były: zaprojektowanie nowych markerów molekularnych, automatyzacja oprzyrządowania laboratoryjnego oraz wydatne zwiększenie mocy obliczeniowej komputerów. W konsekwencji w badaniach genetycznych można było oprzeć się na zupełnie nowych metodach analitycznych przy zwiększonej liczbie markerów molekularnych. To z kolei umożliwiło oszacowanie genetycznej różnorodności gatunków oraz populacji, śledzenie przemieszczania się osobników, określenie stopnia kojarzenia krewniaczego (inbredu), wyróżnienie nowych gatunków oraz określenie obecnych i historycznych zasięgów gatunków. Dobrym przykładem tego przełomu w badaniach genetycznych było odkrycie obecnych w genomie jądrowym sekwencji mikrosatelitarnych (STR – short tandem repeats), które dostarczyło olbrzymią liczbę wysoce zmiennych (polimorficznych) neutralnych markerów do identyfikacji osobników i populacji. Kolejną zaletą starterów STR jest fakt, że są one amplifikowane w wyniku reakcji łańcuchowej polimerazy, PCR (ang. Polymerase Chain Reaction), dzięki czemu metody tej można używać nawet przy niewielkiej ilości DNA badanego organizmu. Wymienione wyżej cechy, takie jak: wysoka zmienność i łatwość amplifikacji, dosłownie zrewolucjonizowały analizy dotyczące genetyki populacji. Dzięki temu w badaniach dotyczących ekologii i zarządzania łowieckiego coraz częściej zaczęto stosować poza tradycyjnymi także techniki molekularne. Poniżej podam kilka przykładów zastosowania badań molekularnych do szeroko pojętego łowiectwa. Szacowanie liczebności populacji i minimalna wielkość populacji Jednym ze sztandarowych przykładów jest zastosowanie metod genetycznych do oszacowania liczebności populacji, podstawowego parametru umożliwiającego zarządzanie populacjami dzikich zwierząt. Jedną z najdokładniejszych metod szacowania liczebności w populacjach zwie- Zastosowanie biologii molekularnej w łowiectwie 41 rząt jest metoda znakowania i ponownego odłowu osobników (CMR), polegająca na serii powtarzanych odłowów połączonych ze znakowaniem nowych osobników. Ponieważ nie jesteśmy w stanie złowić wszystkich osobników w populacji nasze oszacowania oparte ma metodzie CMR są zwykle zaniżone. Dodatkowo im rzadszy jest gatunek zwierzęcia, mniej liczny lub prowadzący skryty tryb życia, tym trudniej precyzyjnie oszacować liczebność jego populacji metodami CMR. Generującymi dodatkowo wysoki poziom stresu u odławianych osobników przekładający się często na ich kondycję, status rozrodczy i przeżywalność. W związku z tym w ochronie przyrody oraz biologii łowieckiej w przypadku populacji rzadkich i zagrożonych gatunków zwierząt coraz częściej stosuje się molekularne metody szacowania liczebności populacji. W przypadku tej metody niezbędne jest co prawda zebranie DNA od poszczególnych osobników, ale można je dość łatwo uzyskać nieinwazyjnymi metodami np. z odchodów, włosów lub piór. Dodatkowo w przypadku tej metodyki każdy osobnik może być stwierdzony wielokrotnie w trakcie tylko jednej sesji zbioru prób, natomiast w przypadku tradycyjnych odłowów w jednej sesji odłownej osobnik może być złowiony tylko raz. Dlatego bardzo często metoda ta stosowana jest w przypadku inwentaryzacji drapieżników, takich jak wilki, wydry lub pantery lub gatunków rzadkich. Dla utrzymania ewolucyjnej zmienności niezbędnej do tego, aby populacja zwierząt trwała w czasie i w przestrzeni, niezbędna jest minimalna wielkość populacji pozwalająca jej zachować zmienność genetyczną. Jest to tzw. minimalna efektywna wielkość populacji (Ne), która różni się (jest znacznie mniejsza) od rzeczywistej liczebności populacji (N). Jednakże oszacowanie parametru Ne dla konkretnej populacji bez szeroko zakrojonych badań jest praktycznie niemożliwe. Wymaga bowiem znajomości wielu podstawowych parametrów populacyjnych, takich jak: struktura płci i wieku, system kojarzenia, sukces rozrodczy poszczególnych osobników (płodność), odziedziczalność poszczególnych cech, poziom zmienności genetycznej populacji (mierzony poziomem heterozygotyczności), czy też liczba rozmnażających się osobników. W związku z tym, iż niewiele populacji zwierząt na świecie jest zbadane w takim stopniu, że można dla nich wyliczyć parametr Ne, wielu naukowców interpoluje wartości otrzymane w dobrze zbadanych populacjach na inne, mniej zbadane populacje. Idąc tym tropem, z dużym przybliżeniem można stwierdzić, że w przypadku populacji zwierząt Ne powinna zawierać się w przedziale od 500 do 1000 osobników. Wciąż jednak nie daje nam to podstaw do zarządzania populacją, gdyż Ne jest miarą teoretyczną, na której należy bazować chcąc dowiedzieć się jak liczna powinna być rzeczywista populacja N, aby spełnione było kryterium Ne. Opierając się na wynikach wielu badań opisanych w pracy Frankham’a1 można z dużym przybliżeniem ustalić, że w przypadku jeleniowatych (występuje tutaj ogromna zmienność w zależności od grupy zwierząt) proporcja Ne/N waha się w przedziale od 0,27 do 0,65 i dotyczy jedynie dorosłych rozmnażających się osobników. Łatwo więc wyliczyć, że najmniejsza liczebność dorosłych i rozmnażających się osobników powinna wynosić około 2000 sztuk. Migracje, przestrzenna struktura populacji i genetyka krajobrazu Kolejną informacją niezbędną do zarządzania populacjami dzikich zwierząt jest wiedza na temat przemieszczenia się i struktury ich populacji. Tradycyjnie stosowane dotąd metody, jak znakowanie zwierząt lub wykorzystanie radio-telemetrii mają podstawową wadę:odnoszą się tylko do pewnej ograniczonej liczny wybranych osobników. Dodatkowo najczęściej nie są w stanie wykazać, czy migracja podjęta przez osobnika była efektywna w sensie ekologicznym, czyli czy zwierzę pozostawiło potomstwo w nowej populacji. Ponadto techniki molekularne mogą wskazać nie tylko potomków tych osobników, które podjęły migrację, lecz także nakreślić bardzo 1 Frankham R. 1995. Effective population size/adult population size ratios in wildlife: a review. Genetical Research, 66, pp 95–107. 42 Zbigniew Borowski odległe historycznie migracje – na przykład rekolonizację terenów przez organizmy po ostatnim zlodowaceniu. Dobrym przykładem zastosowania metod molekularnych do analizy przemieszczania się zwierząt było zbadanie struktury genetycznej i wzorców rozmieszczenia zdziczałych świń, które zasiedlały szeroki obszar geograficzny w Australii. Najważniejszym problemem w lokalnym zarządzaniu łowieckim populacjami tych zwierząt był wysoki poziom imigracji generowany przez osobniki przemieszczające się z innych obszarów. Zastosowane markerów genetycznych pozwoliło stwierdzić, że populacje zdziczałych świń były rozlokowane wzdłuż zlewni, w związku z tym występowały duże migracje osobników w obrębie zlewni, lecz populacje znajdujące w różnych zlewniach były od siebie izolowane. Poznanie mechanizmów przemieszczania się tych zwierząt w Australii umożliwiło przede wszystkim efektywne zarządzanie ich populacjami, co w konsekwencji doprowadziło do minimalizowania szkód oraz opracowania strategii zapobiegania rozprzestrzenianiu się chorób roznoszonych przez zdziczałe świnie. Całkiem niedawno poprzez połączenie danych genetycznych z systemami informacji geograficznej (GIS) pojawiła się nowa dyscyplina określana jako genetyka krajobrazu. Takie połączenie danych molekularnych z ekologią krajobrazu oferuje zupełnie inny poziom zarządzania dziką przyrodą. W tej nowej dyscyplinie możliwe jest na przykład zebranie informacji na temat interakcji procesów mikroewolucyjnych (oszacowanych przy użyciu markerów molekularnych) i krajobrazu. Genetyka krajobrazu jest szczególnie przydatna do rozszyfrowania wpływu cech terenu na rozmieszczenie i przemieszczanie się zwierząt. W związku z tym istnieje możliwość określenia czynników wpływających na przestrzenne rozmieszczenie zwierząt, co z kolei jest niemiernie ważne dla opracowania zrównoważonej strategii zarządzania populacjami zwierząt. Rozmieszczenie, przemieszczanie się lub wymiana osobników w krajobrazie określają genetyczną strukturę ich populacji. W populacjach o zwartym zasięgu (tzw. ciągłych) częstotliwość alleli zmienia się często wraz z dystansem geograficznym w wyniku dryfu genetycznego. Jest to proces znany jako izolacja przez dystans. Należy jednak zauważyć, iż różne cechy krajobrazu mogą działać w odmienny sposób na przepływ genów, na przykład jako bariery dla dyspersji lub też korytarze migracyjne (np. góry, cieki) i w związku z tym mogą mieć olbrzymi wpływ na strukturę genetyczną obserwowaną w populacjach zwierząt. Dodatkowo zróżnicowanie genetyczne populacji w skali lokalnej może pojawiać się na przykład ze względu na zróżnicowanie siedliskowe, zwłaszcza w odniesieniu do gatunków będących specjalistami środowiskowymi. Wśród zwierząt generaliści środowiskowi, zasiedlający olbrzymie tereny o bardzo zróżnicowanych środowiskach, tacy np. jak wiele gatunków jeleni często wykazują niski poziom zmienności struktury genetycznej populacji i wysokie wskaźniki przepływu genów w obrębie zarządzanej łowiecko jednostki [np. jeleń wirginijski (Odocoileus virginianus, sarna (Capreolus capreolus, mulak (Odocoileus hemionus)]. Analogicznie wiele gatunków dużych drapieżników rozmieszczonych jest na dużych odległościach tak, że często strukturę genetyczną populacji obserwować można jedynie w skali kontynentalnej. Selekcja łowiecka Większość intensywnie pozyskiwanych gatunków zwierząt to duże ssaki, przede wszystkim takie jak kopytne (Ungulates) i drapieżne (Carnivora). Selektywne pozyskiwanie zwierząt, bazujące na płci, wieku lub innych kryteriach fenotypowych takich jak masa ciała, wielkość i kształt poroża, praktykowana była przez ludzi już od czasów prehistorycznych. W związku z tym w większości populacji zwierząt poddanych presji łowieckiej sztuczna selekcja dokonywana przez ludzi zastąpiła dobór naturalny, generowany w przeszłości przez drapieżniki. Zważywszy na fakt, że sztuczna, tworzona przez myśliwych, selekcja jest wszechobecna na całym świecie, powinna zasługiwać na szczególną uwagę. Selektywne pozyskanie może bowiem mieć istotny wpływ Zastosowanie biologii molekularnej w łowiectwie 43 poprzez zmiany w naturalnej śmiertelności na dostosowanie osobników (fitness) oraz selekcję określonych fenotypów (rys. 1, Ratneri Lande 2001). Poznanie struktury genetycznej zarządzanej łowiecko populacji jest warunkiem wstępnym dla modelowania lub przewidywania potencjalnych genetycznych skutków zarządzania łowieckiego (pozyskania). Zastosowanie markerów molekularnych w biologii łowieckiej, w szczególności mikrosatelitów i mitochondrialnego DNA (mt DNA), pozwala ocenić strukturę genetyczną oraz powiązania występujące pomiędzy zarządzanymi gatunkami. Wysoce polimorficzne jądrowe markery, takie jak mikrosatelity mogą służyć do oszacowania systemu kojarzenia i/lub odziedziczalności poszczególnych cech. Natomiast mtDNA (dziedziczone tylko w linii matczynej) lub mikrosatelitychromosomu y (dziedziczone w linii męskiej) mogą posłużyć do oceny międzypłciowych różnic w przepływ genów. W zarządzaniu łowieckim informacje te są o tyle istotne, że pozyskanie wielu gatunków zwierząt jest selektywnie ukierunkowane na którąś płeć. Modyfikowanie selekcji naturalnej Zmiany we frekwencji fenotypów Pozyskanie łowieckie Modyfikowanie doboru płciowego Wzrost śmiertelności Zmniejszenie częstości odpowiednich genotypów i redukcja jakości genetycznej Zmiany w dynamice populacji Selektywne zmiany dla osiągnięcia wcześniejszej płodności Rys. 1. Schemat ilustrujący bezpośredni i pośredni wpływ pozyskania łowieckiego na strukturę genetyczną populacji, jakość populacji a w konsekwencji na pozyskanie łowieckie w przyszłości Trofeum myśliwskie najczęściej dotyczy samców z dobrze rozwiniętymi wtórnymi cechami płciowymi takimi jak rogi lub poroże. Jednakże te trzeciorzędowe cechy płciowe charakteryzują się często wysoką odziedziczalnością, a co najważniejsze mogą być oznaką odporności na choroby i/lub jakości osobniczej. Na przykład u owiec wielkorogich (Oviscanadensis) i koziorożca alpejskiego (Capraibex) rozmiar rogów jest pozytywnie skorelowany z rozmiarami ciała u obu płci i płodnością matek oraz różnorodnością genetyczną. Z kolei rozwój poroża u jeleni związany jest z egenami zgodności tkankowej (MHC) i płodności, dlatego wielkość i kształt poroża u tego gatunku uznaje się za wiarygodny sygnał świadczący o jakości samca. Przykłady cech będących pod wpływem sztucznej, generowanej przez człowieka, selekcji w eksploatowanych łowiecko populacjach przedstawia tabela 1. 44 Zbigniew Borowski Tabela 1. Cechy będące pod wpływem sztucznej (nienaturalnej) selekcji w eksploatowanych łowiecko populacjach Cecha Kierunek selekcji Wpływ na populację Remedium Wiek i rozmiar dojrzałych płciowo osobników Zwiększona śmiertelność Dojrzałość płciowa w młodszym wieku i przy mniejszych rozmiarach, zmniejszenie płodności Zmniejszanie lub zmiana selektywności pozyskania Rozmiary ciała lub morfologia, dymorfizm płciowy Związany z płcią oręż (poroże, cios, róg) Pozyskiwanie większych lub wyróżniających się osobników. Łowiectwo trofealne Redukcja tempa wzrostu, zmniejszenie zróżnicowanie fenotypów Zmniejszenie wielkości oręża lub wielkości Ograniczenie presji łowieckiej na duże i wyróżniające się osobniki Zmiana kryteriów selekcji ograniczające pozyskanie osobników bazujące na cechach związanych z doborem płciowym Rozpoczęcie rozrodu Selektywne pozyskanie osobników rozmnażających się wcześniej lub później Zmodyfikowanie okresu rozrodu (skracanie lub zmodyfikowanie sezonowości) Pozyskanie w trakcie sezonu rozrodczego Zachowanie Pozyskiwanie bardziej aktywnych, dominujących i/lub agresywnych osobników Zmniejszenie dominacji w żerowaniu i zalotach, potencjalnie ograniczenie produktywności Wprowadzenie takich metod polowań, które ograniczą odstrzał osobników dominujących Dyspersja/migracja Pozyskiwanie osobników migrujących Zmodyfikowanie tras migracji Przerwanie polowań w okresie migracji i w pobliżu ścieżek migracji Podsumowanie Reasumując zastosowanie technik molekularnych otworzyło zupełnie nowe możliwości zarówno dla badań łowieckich, jak i zrównoważonego zarządzania populacjami zwierzyny. Na ich podstawie bowiem określić możemy nie tylko liczebność populacji, lecz także jesteśmy w stanie stwierdzić, czy populacja, którą zarządzamy, cechuje się odpowiednim stopniem zróżnicowania genetycznego oraz czy składa się ona z czystych genetycznie osobników, czy też występują tam hybrydy. Ponadto śledzić możemy także genetyczne skutki przyjętych kryteriów selekcji (odstrzału), modyfikować te kryteria oraz określić stopień odziedziczalności cech uznanych przez nas za pożądane (np. masa ciała, masa i kształt poroża). Podstawowe terminy genetyczne i objaśnienia używanych skrótów Allel – jedna z możliwych form genu, różniących się sekwencją DNA i odpowiadających za daną cechę Białka izoenzymatyczne – różne strukturalnie formy białka pełniące te same funkcje enzymatyczne w organizmie, różniące się nieznacznie budową chemiczną i ładunkiem elektrycznym cząsteczki BP – Before Present (ang. „przed teraźniejszością”), to system oznaczania lat, stosowany w geologii i archeologii do oznaczania wydarzeń z przeszłości. Za „teraźniejszość” przyjęty został rok 1950 DNA – kwas deoksyrybonukleinowy, molekularna podstawa dziedziczności, zawiera informację genetyczną odnośnie struktury i regulacji funkcji życiowych organizmu Gen – fragment DNA, który zawiera podstawową informację genetyczną Genetyka molekularna – dział genetyki (nauki o dziedziczeniu cech zawartych w DNA), zajmujący się strukturą i funkcjonowaniem genów na poziomie cząsteczkowym Genom – całość informacji genetycznej organizmu, zawarta w DNA jądrowym i organellowym (chloroplasty i mitochondria) Genotyp – całość informacji genetycznej organizmu GST, FST – współczynniki zmienności genetycznej, wyrażające stosunek zmienności międzypopulacyjnej do zmienności całkowitej, Haplotyp – kombinacja alleli na poziomie haploidalnym Heterozygota – organizm, który posiada dwie różne kopie (allele) danego genu Homozygota – organizm, który posiada dwie jednakowe kopie (allele) danego genu Kod genetyczny – genetyczny zapis informacji w DNA Locus (l.mn. loci) – region DNA, w którym występują różne allele Markery genetyczne – fragmenty DNA stosowane do identyfikacji gatunków, osobników i populacji Mikromacierze – krótkie 25–70 nukleotydowe sekwencje sond DNA naniesione na płytkę w celu detekcji aktywnych regionów genomu PCR – reakcja łańcuchowa polimerazy (Polymerase Chain Reaction), w której amplifikowane (namnażane) są fragmenty DNA qPCR – reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym Polimorfizm – zmienność form, tu sekwencji lub budowy DNA Starter – niewielki fragment jednoniciowego DNA, komplementarny do DNA matrycy, od którego bierze początek amplifikacja łańcucha DNA w reakcji PCR SSR – mikrosatelitarne fragmenty DNA, (Simple-Sequence Repeat), czyli powtarzające się sekwencje 2–6 nukleotydów w genomie Literatura uzupełniająca Banach, J., Skrzyszewska K., Kempf M.: Zmienność genetyczna i gospodarka nasienna. W: Buk zwyczajny. Red. J. Skrzyszewski. PWRiL. Warszawa. Str. 75-99. 2012. Kowalski T., Czekaj A.: Symptomy chorobowe i grzyby na zamierających jesionach (Fraxinus excelsior L.) w drzewostanach Nadleśnictwa Staszów. Leśne Prace Badawcze 71 (4): 357–368. 2010. Kubiak K., Oszako T, Jabłoński T.: Detekcja fitopatogenów z rodzaju Phytophthora w glebach leśnych za pomocą analiz DNA. Sylwan 156: 437–443. 2012. Lewandowski A., Litkowiec M., Fischer A.: Śladami Władysława Jedlińskiego – określenie pochodzenia świerka na terenie Nadleśnictwa Skrwilno. Sylwan 156 (9): 703–709. 2012. Lewandowski A., Litkowiec M., Grygier A., Dering M.: Weryfikacja pochodzenia świerka pospolitego (Picea abies) w Nadleśnictwie Gołdap. Sylwan 156 (7): 494-501. 2012. Modrzyński J.: Potencjalny naturalny zasięg świerka uzasadnia jego hodowlę na Pomorzu Zachodnim. Sylwan 143 (7): 63–67. 1999. Nevoigt F., Oszako T., Nowakowska J.A.: Monitorowanie chorób wywołanych przez patogeniczne lęgniowce za pomocą analiz DNA. Sylwan 154 (7): 450–455. 2010. Niedziałkowski Wł.: Buk na granicy zasięgu w leśnictwie Lipce. Prace i Sprawozdania Zakładu Urządzania Lasu Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie. Nr XLIX, Warszawa. 1–18. 1931. Nowakowska J.A.: Detekcja ekspresji genów drzew leśnych za pomocą mikromacierzy DNA. Sylwan 4: 33–43. 2006. Nowakowska J.A.: Zastosowanie markerów DNA (RAPD, SSR, PCR-RFLP i STS) w genetyce drzew leśnych, entomologii, fitopatologii i łowiectwie. Leś. Pr. Badaw. 2006/1: 73–101. 2006. Nowakowska J.A., Górniak A.: Nowoczesne metody identyfikacji kradzionego drewna na podstawie DNA. Biblioteczka Leśniczego, Zeszyt 343. ISSN 1232-8111, SITLiD, Wydawnictwo Świat, Warszawa 2012, ss. 11. 2012. Nowakowska J.A., Oszako T.: Stan zdrowotny i zróżnicowanie genetyczne buka zwyczajnego w Nadleśnictwie Siewierz na podstawie analiz chloroplastowego DNA. Sylwan 152(9): 11–20. 2008. Perzanowska J., Makomaska-Juchiewicz M., Cierlik G., Król W., Tworek S., Kotońska B., Okarma H.: Korytarze ekologiczne w Małopolsce. Instytut Nauk o Środowisku UJ, Instytut Ochrony Przyrody PAN, Kraków 2005 r. Raciborski M.: Rozmieszczenie oraz granice drzew oraz ważniejszych krzewów i roślin na ziemiach polskich. W praca zbiorowa: Geografia fizyczna ziem polskich i charakterystyka fizyczna ludności. Akademia Umiejętności. Kraków. 349–355. 1912. Rutkowski R., Keller M., Jagołkowska P.: Populacje i podgatunki – genetyka molekularna w badaniach europejskich głuszcowatych Tetraonidae. Notatki Ornitologiczne 48: 260–274. 2007. Sabor J.: Wpływ stosowanych zabiegów pielęgnacyjnych i rębni na zmianę struktury genetycznej drzewostanów. Sylwan nr 2: 39–48. 2003. Sułkowska M., Kowalczyk J., Przybylski P.: Zmienność genetyczna i ekotypowa buka zwyczajnego (Fagus sylvatica L.) w Polsce. Leśne Prace Badawcze, 69 (2): 133-142. 2008. Literatura uzupełniająca 47 Sułkowska, M.: Zróżnicowanie ekotypowe populacji buka zwyczajnego (Fagus sylvatica L.) w Polsce. Sylwan 150 (7): 38–50. 2006, Środoń A.: Świerk pospolity w czwartorzędzie Polski. Acta Paleobotanica 8: 1–60. 1967. Środoń A.: Buk w historii lasów Polski w: Buk zwyczajny Fagus sylvatica. Warszawa – Poznań: PWN. str. 7–25. 1990. Tereba A.: Genetyczne zróżnicowanie gacka brunatnego Plecotus auritus (Linnaeus, 1758) w Polsce. Rozprawa doktorska, MIIZ PAN, Warszawa, 2010. Zachara T. i in.: Odnowienie naturalne najważniejszych gatunków lasotwórczych w Polsce jako element strategii trwałego i zrównoważonego zagospodarowania lasu. Sprawozdanie końcowe tematu BLP-339. Sękocin Stary. Grudzień 2011. Dział B. WYBRANE NOWOŚCI PIŚMIENNICTWA LEŚNEGO SPIS OMÓWIONYCH WYDAWNICTW 1. Zagospodarowanie lasu, łowisk i wód 1.1. Sosna zwyczajna 1.2. Rośliny obcego pochodzenia w Polsce 2. Ekologia i ochrona lasu 2.1. Gleba w środowisku 2.2. Grzyby jakich nie znamy 2.3. Porosty w lasach 2.4. GMO w świetle najnowszych badań 3. Ekonomika, organizacja, zarządzanie 3.1. Poradnik dla właścicieli lasów Zagospodarowanie lasu, łowisk i wód 49 Zagospodarowanie lasu, łowisk i wód 1.1. Sosna zwyczajna. Odnawianie naturalne i alternatywne metody hodowli – Andrzejczyk T., Żybura H. Warszawa: Powszechne Wydawnictwo Rolnicze i Leśne, 2012 (omówienie książki) Kolejna pozycja z serii Drzewa polskich lasów poświęcona jest odnowieniu naturalnemu i alternatywnym metodom hodowli sosny zwyczajnej. Podstawą do powstania tej publikacji były wieloletnie badania prowadzone w Katedrze Hodowli Lasu SGGW w Warszawie. Dotyczyły one inicjowania i warunków rozwoju samosiewów sosnowych oraz hodowli drzewostanów o zróżnicowanej strukturze. Na początku autorzy przedstawili ogólną charakterystykę sosny zwyczajnej – zasięg, pokrój drzew, wzrost i produkcyjność, wymagania siedliskowe i właściwości ekologiczne. Następnie omówiono rozwój naturalnych drzewostanów sosnowych w warunkach zaburzeń zewnętrznych oraz bez zaburzeń zewnętrznych. Kolejny rozdział poświęcono biologicznym i ekologicznym aspektom naturalnego odnawiania sosny. Opisano cechy reprodukcyjne sosny (kwitnienie, budowę i właściwości nasion, obradzanie, rozsiewanie i kiełkowanie nasion) oraz rolę czynników siedliskowych takich jak światło, temperatura, woda, stan pokrywy glebowej, allelopatia w procesie kiełkowania nasion i rozwoju siewek. W rozdziale dotyczącym hodowlano-technicznych aspektów inicjowania odnowienia naturalnego sosny omówiono uwarunkowania siedliskowe i drzewostanowe, przygotowanie gleby, cięcia odnowieniowe. Dwa ostatnie rozdziały poświęcone odnawianiu naturalnemu sosny zawierają informacje na temat pielęgnacji i ochrony samosiewów sosnowych, a także wzrostu i rozwoju samorzutnych podrostów podokapowych oraz postępowania hodowlanego w drzewostanach z ich udziałem. Część druga książki omawia alternatywne metody hodowli drzewostanów sosnowych. W zależności od urozmaicenia struktury drzewostanu i zróżnicowania wiekowego metody te przedstawiono w następującej kolejności: 1. drzewostany przestojowe 2. drzewostany dwugeneracyjne 3. drzewostany różnowiekowe zagospodarowane rębnią stopniową gniazdową 4. drzewostany przerębowe Poruszane w publikacji zagadnienia są bardzo istotne z punktu widzenia utrzymania różnorodności biologicznej w lasach, a także pełnienia przez las funkcji środowiskotwórczych i ochronnych. Autorami książki są pracownicy Wydziału Leśnego SGGW w Warszawie. Korzystać z niej mogą zarówno studenci leśnictwa, jak i praktycy zajmujący się hodowlą lasu. Publikacja ma charakter praktycznego poradnika, zawierającego wskazówki i zalecenia przydatne w codziennej pracy służb terenowych Lasów Państwowych. 50 Wybrane nowości piśmiennictwa leśnego 1.2. Rośliny obcego pochodzenia w Polsce ze szczególnym uwzględnieniem gatunków inwazyjnych – Tokarska-Guzik B., Dajdok Z., Zając M., Zając A., Urbisz A., Danielewicz W., Hołdyński C. Warszawa: Generalna Dyrekcja Ochrony Środowiska, 2012 (omówienie książki) Prezentowana publikacja to rodzaj przewodnika po obcych gatunkach roślin we florze Polski. Na początku omówione zostały zjawiska rozprzestrzeniania się gatunków obcego pochodzenia oraz prognozy zadomawiania się gatunków obcych w Polsce. Przedstawiono definicje z zakresu ekologii inwazji, terminologię i klasyfikacje roślin obcego pochodzenia. Dokonano porównania terminów z zakresu ekologii inwazji stosowanych w literaturze zachodnioeuropejskiej i polskiej. W kolejnych rozdziałach omówiono ogólną charakterystykę roślin obcego pochodzenia we florze Polski oraz oddziaływanie gatunków inwazyjnych i możliwości przeciwdziałania. Główną część książki tworzą cztery załączniki w formie tabelarycznej. Załącznik 1: Obce gatunki roślin w Polsce to uporządkowany alfabetycznie wykaz gatunków obcych. Przy każdym gatunku znajdują się następujące informacje: nazwa łacińska, nazwa polska, przynależność do rodziny, forma życiowa, pochodzenie, czas przybycia na obszar Polski, rodzaj kolonizowanych zbiorowisk roślinnych, grupa geograficzno-historyczna, status. Załącznik 2: Obce rośliny inwazyjne w skali kraju, regionów lub lokalnie oraz rośliny potencjalnie inwazyjne stanowi wyodrębniona z listy gatunków obcych grupa gatunków inwazyjnych. Dane o gatunku uzupełniono dodatkowymi informacjami o rodzaju, identyfikacji i skali zagrożenia. W Załączniku 3 znalazły się obce gatunki drzew i krzewów, które w przypadku zadomowienia na obszarach cennych przyrodniczo mogą zagrażać różnorodności biologicznej. Wymienione gatunki zostały podzielone na trzy grupy: gatunki inwazyjne w skali kraju, gatunki inwazyjne regionalnie i lokalnie oraz gatunki nieinwazyjne, zadomowione w zbiorowiskach naturalnych i półnaturalnych. W Załączniku 4 przedstawiono występowanie gatunków inwazyjnych w obrębie siedlisk przyrodniczych Natura 2000 będących przedmiotem zainteresowania Wspólnoty. Wiedza zawarta w niniejszym opracowaniu daje podstawy do działań zapobiegających negatywnym skutkom introdukcji gatunków obcych do środowiska przyrodniczego Polski oraz przyczyni się do lepszej ochrony przyrody w Polsce. Ekologia i ochrona lasu 2.1. Gleba w środowisku – Hillel D. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 2012 (omówienie książki) Publikacja jest pierwszym polskim wydaniem popularnego na świecie amerykańskiego podręcznika gleboznawstwa. Przedstawia glebę jako element środowiska łączący litosferę, atmosferę i hydrosferę, jako czynnik wpływający na klimat na Ziemi oraz siedlisko życia organizmów lądowych. W kolejnych rozdziałach omówione zostały następujące zagadnienia: – dynamiczna rola gleby w środowisku, – gleba w historii cywilizacji, – procesy glebotwórcze, – klasyfikacja gleb, – fizyczne i chemiczne właściwości gleb oraz procesy glebowe, – statyka i dynamika oraz obieg wody glebowej, Ekologia i ochrona lasu 51 – równowaga między wodą glebową a energią glebową, – żyzność gleby i odżywianie roślin, – bioróżnorodność gleby, – gospodarka wodna gleb, – erozja i ochrona gleby, – zanieczyszczenie gleby i środki naprawcze. Książka ma na celu przedstawienie roli gleby w środowisku i życiu człowieka w warunkach zmian klimatycznych, kontroli zanieczyszczeń, zarządzania zasobami naturalnymi, harmonijnego i zrównoważonego rozwoju. Skierowana jest szczególnie do studentów i pracowników naukowych ochrony środowiska, architektury krajobrazu, biologii, ekologii, leśnictwa, hydrologii, geografii. Podręcznik ma bardzo przejrzysty układ, zaopatrzony jest w słownik, bogaty wykaz literatury i skorowidz. Niektóre użyte w treści wyrażenia uzupełnione zostały oryginalnymi terminami angielskimi, a czasem dodatkowymi przypisami. Wynikało to z wieloznaczności lub innego zakresu pojęciowego zwrotów, a miało na celu jak najwierniejsze oddanie sensu terminologicznego. 2.2. Grzyby jakich nie znamy – Wrzosek M., Sierota Z. Warszawa: Centrum Informacyjne Lasów Państwowych, 2012 (omówienie książki) Prezentowana książka przedstawia grzyby, jako niezwykle ważny element środowiska, w zupełnie innym ujęciu niż zazwyczaj. Składa się z czterech rozdziałów. Pierwszy to wprowadzenie, w którym omówiono różnorodność królestwa grzybów pod względem kolorów, kształtów, ilości gatunków. W rozdziale drugim zaprezentowano grzyby ważne w ekosystemie i gospodarce leśnej. Omówiono saprofity takie jak pleśniak, rozłożek, czernidłak, grzyby mykoryzowe (lakówki), endofity, grzyby ambrozjowe czy owadomorki, a także grzyboglony, czyli porosty. Wiele miejsca poświęcono roli grzybów w biologicznym zwalczaniu szkodników. Opisano wykorzystanie grzyba pożytecznego – żylaka olbrzymiego do bezpośredniej walki z hubą korzeni oraz grzyby będące wrogami naturalnymi owadów. Rozdział trzeci prezentuje grzyby ważne w życiu każdego człowieka. Przedstawiono w nim zastosowanie grzybów w medycynie, przemyśle papierniczym, jako stymulatorów kiełkowania i wzrostu roślin czy ukorzeniania się siewek. Znalazły się tu informacje na temat smacznych i przydatnych w kuchni oraz przemyśle spożywczym grzybów spożywczych – twardnika jadalnego i drożdży, a także grzybów niezbędnych w winnicach i przy produkcji wina. W dalszej części książki omówiono różne gatunki muchomorów, czubajek, pospolite podgrzybki, kurki i podobne do nich lisówki, a także tajemnicze trufle. Publikacja dostarcza informacji na temat zjawisk zachodzących w przyrodzie z udziałem grzybów. Uzupełnieniem są interesujące zdjęcia oraz wykaz literatury, a ułatwieniem dla czytelnika jest umieszczony na końcu słowniczek wyrazów trudnych użytych w tekście. 2.3. Porosty w lasach. Przewodnik terenowy dla leśników i taksatorów – Fałtynowicz W. Warszawa: Centrum Informacyjne Lasów Państwowych, 2012 (omówienie książki) Porosty występują powszechnie w lasach, ale ich rola jest niedoceniana. Również literatura na ich temat jest dość uboga w porównaniu z innymi grupami organizmów – drzewami, roślinami runa, ssakami, ptakami czy owadami. Dlatego bardzo cenna wydaje się publikacja profesora Wiesława Fałtynowicza z Uniwersytetu Wrocławskiego. Przygotowana została w formie przewodnika terenowego przeznaczonego dla leśników i taksatorów. Początkowe rozdziały książki poświęcone są podstawom lichenologii, biologii, anatomii i morfologii porostów. Omówiono rolę porostów jako biowskaźników, poziom zagrożenia poro- 52 Wybrane nowości piśmiennictwa leśnego stów w Polsce oraz ich ochronę. Znajdziemy tu wykaz wybranych gatunków chronionych, które można spotkać w lasach oraz uwagi o zbieraniu i oznaczaniu porostów. Druga część publikacji to klucze do oznaczania gatunków porostów najczęściej spotykanych w lasach oraz wykaz gatunków wraz z ich opisami. Książka jest bogato ilustrowana kolorowymi zdjęciami, posiada spis literatury, indeks nazw polskich oraz indeks nazw łacińskich, a także informacje, gdzie można znaleźć specjalistów zajmujących się porostami. Przewodnik wydano w kieszonkowym formacie wygodnym do korzystania w terenie. 2.4. GMO w świetle najnowszych badań – Niemirowicz-Szczytt K. [red.] Warszawa: Wydawnictwo SGGW, 2012 (omówienie książki) Publikacja jest efektem wykładów prowadzonych dla studentów i doktorantów uczelni warszawskich w Instytucie Problemów Współczesnej Cywilizacji im. Marka Dietricha w Warszawie. Jej autorami są specjaliści z zakresu problematyki GMO. Książka GMO w świetle najnowszych badań ma przybliżyć wiedzę na temat metod otrzymywania wprowadzanych genów, oddziaływania na środowisko rolnicze, regulacji prawnych, kontroli. Zastosowanie genetycznie modyfikowanych mikroorganizmów w gospodarce jest faktem. Wykorzystuje się je w produkcji biofarmaceutyków, żywności, biopaliw. Mimo tak powszechnego stosowania modyfikacji genetycznych istnieje wiele obaw, związanych z negatywnymi następstwami dla zdrowia i środowiska. Wiele argumentów popierających GMO można znaleźć w niniejszym opracowaniu. Autorzy uważają, że bardzo ważną kwestią jest właściwa edukacja społeczna oparta na rzetelnej wiedzy, prowadzonych badaniach i monitoringu procesów wdrażania. Nowe technologie związane z GMO przyczyniły się do rozwoju metod kontroli żywności, a powstanie sieci laboratoriów referencyjnych pozwala państwu kontrolować i oceniać ryzyko sprowadzanego do Polski GMO. Podręcznik posiada słownik terminów związanych z prezentowaną tematyką oraz skorowidz rzeczowy. Adresowany jest do studentów różnych kierunków studiów, dziennikarzy, polityków i wszystkich zainteresowanych problematyką organizmów genetycznie modyfikowanych. Ekonomika, organizacja, zarządzanie 3.1. Poradnik dla właścicieli lasów Warszawa, Oficyna Wydawnicza OIKOS, 2013 (omówienie książki) Redakcja „Lasu Polskiego” wraz z RDLP w Białymstoku oraz przy wsparciu Krajowej Sieci Obszarów Wiejskich opracowała poradnik dla właścicieli lasów. Informacja taka jest bardzo potrzebna, ponieważ udział lasów prywatnych w leśnej powierzchni Polski to prawie 20%. Nie każdy właściciel lasu wie, że ustawa o lasach gwarantuje mu profesjonalne, bezpłatne doradztwo, a z pytaniami dotyczącymi gospodarowania we własnym lesie należy zwracać się do nadleśnictwa. W publikacji znajdują się podstawowe informacje, jak prawidłowo zająć się hodowlą i ochroną lasu, organizacją prac i związanymi z tym formalnościami, jak odnosić korzyści z posiadanego drzewostanu z zachowaniem jego walorów przyrodniczych. Poruszono zagadnienia z zakresu prawa leśnego (legalne pozyskanie drewna, dokumenty gospodarki leśnej w lasach niepaństwowych), podatku leśnego, sadzenia i odnawiania, pielęgnacji upraw i młodników, wykonywania trzebieży, celowości podkrzesywania, pomiaru, sprzedaży i cechowania drewna. Na stronach poradnika znalazł się kalendarz prac w lesie – omówione zostały czynności, jakie należy wykonać w zależności od pór roku. Rys. 1. Schemat budowy cząsteczki kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA), nośnika informacji genetycznej. Zawarte w jądrze komórkowym chromosomy zbudowane są z długiego łańcucha DNA, w którym precyzyjne ułożenie zasad nukleotydowych (A, T, C, G) determinuje kod genetyczny danego organizmu. (Źródło: www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/graphics/slides/01-0085jpg.shtml) Rys. 2. Sadzonki sosny zwyczajnej wyhodowane z tej samej partii nasion różnymi metodami produkcji, które istotnie wpływają na rodzaj selekcji oddziaływującej na pulę genetyczną materiału sadzeniowego (fot. A. Konecka) wyizolowany z bakterii gen odporności na owady Bakteria Bacillus thuringiensis cry3A Wprowadzenie genu do A. tumefaciens DNA bakterii plazmid Ti z genem cry3A Agrobacterium tumefaciens Infekcja komórki roślinnej i przekazanie plazmidu Ti uprawa GMO odpornych na owady jądro komórkowe i chromosomy Komórka roślinna regeneracja roślin transgenicznych Integracja genu cry3A z roślinnym DNA namnażanie komórek transgenicznych in vitro Rys. 3. Schemat transformacji rośliny drzewiastej ze zwiększoną ekspresją genów odporności na owady Źródło: J. Nowakowska Reakcja PCR Przygotowanie reakcji PCR Reakcja PCR Materiał roślinny Rozcieńczenie z buforze Rys. 4. Przygotowanie reakcji PCR z tkanek roślinnych Źródło: © Copyright 2011 Thermo Fisher Scientific Inc (www.finnzymes.com) Gotowe z próbki Rys. 5. Migracja elektroforetyczna cząsteczek DNA w żelu agarozowym. M: marker wielkości fragmentów DNA 1kB Ladder Plus (Fermentas). 1–5: fragmenty DNA z poszczególnych prób Źródło: J. Nowakowska A B Rys. 6. Aktywność Phytophthora cinnamomi w Europie. Średnica kropek odzwierciedla aktywność patogena. (A) Koniec lat 90. XX wieku (B) Prognoza oparta na modelu komputerowym zakładającym wzrost średniej rocznej temperatury powietrza o 3°C (zmiany do 2100 roku) Źródło: http://www.scientificsocieties.org/aps/proceedings/sod/Papers/Brasier/default.htm) P. plurivora. Zarodnia (sporangium) uwalniające zarodniki pływkowe (zoospory) otoczone błoną P. citricola. Puste sporangium P. cactorum. Lęgnia i plemnia – organy rozmnażania płciowego Phytophthora sp. Cienkościenne chlamydospory (zarodniki przetrwalnikowe) lub rozdęte strzępki Rys. 7. Organy rozmnażania Phytophthora spp. A B Rys. 8. Szybki test immunologiczny w kierunku Phytophthora spp.: (A) wynik pozytywny (B) kontrola – wynik negatywny
