Transformacja genetyczna i losy heterologicznego DNA w

Transformacja genetyczna i losy heterologicznego DNA w komórkach bakterii
Mirosława Piechowska
Emerytowany pracownik (doc. dr hab. ) Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN, Warszawa
Adres prywatny: ul. Wołoska 88B m.
20, 02-507 Warszawa; e-mail: miroslawa.
[email protected]

Artykuł otrzymano 3 sierpnia 2015 r.
Artykuł zaakceptowano 3 sierpnia 2015 r.
Słowa kluczowe: transformacja bakterii, homologiczny DNA, heterologiczny DNA, czynnik kompetencji
STRESZCZENIE
W
artykule przedstawiono w skróconej formie wyniki badań nad transformacją bakterii
przez DNA, zainicjowanych i prowadzonych pod kierunkiem prof. Davida Shugara w
latach 1961–1988. Wykryto wydzielanie metabolitu prowokującego zdolność paciorkowców
(Streptococcus) do ulegania transformacji genetycznej. Korzystając z tej obserwacji podwyższono około 20 krotnie wydajność tego procesu. Zauważono przy tym, że duże ilości DNA
mają bakteriobójcze działanie wskazujące, że co najmniej 70% komórek było zdolnych do
pobrania polimeru. Badając molekularny mechanizm transformacji bakterii Bacillus subtilis
wykazano, że pobrany DNA tworzy kompleksy ze składnikami komórkowymi zawierającymi białko, co utrudniało określenie jego struktury. Znaleziono sposób na dysocjację kompleksów, po czym okazało się, że pobrany DNA ma formę jednołańcuchową. Włączanie do
DNA biorcy odbywa się we fragmentach o masie cząsteczkowej około 106 Daltona. Nie transformujący DNA może zachowywać się podobnie, ale nie ulega integracji do DNA biorcy.
Zbadano wybiórczość receptorów komórkowych B. subtilis wobec DNA fagów zawierających modyfikowane zasady: uracyl, putryscynylotyminę i jej glikozydową pochodną, a także
wobec dwuniciowego RNA faga f2. Wszystkie modyfikacje były tolerowane przez receptory
komórkowe, za wyjątkiem glikozylacji oraz grupy 2’-OH w RNA.
WPROWADZENIE
Autorka tego artykułu pracowała z profesorem Davidem Shugarem w Zakładzie Biofizyki Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN w latach 1961–1988. Profesor
Shugar już wcześniej zainteresował się transformacją genetyczną bakterii i wraz
z zajmującym się tą problematyką zespołem prof. Romana Pakuły (Zakład Mikrobiologii Państwowego Zakładu Higieny) badał inaktywację markerów oporności na streptomycynę u paciorkowców przez promieniowanie jonizujące [1,2].
Przedmiotem moich badań była transformacja genetyczna dwóch rodzajów
bakterii: Streptococcus i Bacillus. Pierwsza moja opublikowana praca dotycząca
paciorkowców powstała także we współpracy z prof. Pakułą. Panowała wówczas fascynacja widokiem wyodrębnianego z bakterii DNA w formie białych,
długich nici dających się nawijać na laboratoryjną bagietkę. Towarzyszyła temu
zwodnicza prostota wywoływania dziedzicznych zmian za pomocą takich preparatów. Początkowe, technicznie łatwe doświadczenia stopniowo prowadziły
do badania molekularnego mechanizmu tego procesu przy użyciu radioaktywnych i ciężkich izotopów pierwiastków chemicznych. Ilustruje to gradacja technicznych trudności w omawianych poniżej pracach. Postęp w badaniach stymulowały staże naukowe autorki w zagranicznych laboratoriach zajmujących się
podobną tematyką: prof. M. S. Foxa w Massachusetts Institute of Technology
(staż podoktorski, 1969/70), prof. G. Venemy w Instytucie Genetyki Uniwersytetu w Groningen (1974, 1975, 1981) oraz w Instytucie Immunologii i Biologii
Bakterii w Madrycie (1980). Wyniki tej współpracy znalazły odzwierciedlenie
we wspólnych publikacjach.
STAN WIEDZY O TRANSFORMACJI BAKTERII W POŁOWIE LAT 60.
Ówczesny stan wiedzy o transformacji bakterii przedstawiłam w artykule
przeglądowym [3]. Transformacja jest procesem międzykomórkowego przenoszenia informacji genetycznej, polegającym na wniknięciu do komórek bakterii,
biorców cząsteczek DNA, pochodzących z bakterii dawców i zastąpieniu przez
nie odpowiednich fragmentów genomu w wyniku genetycznej rekombinacji.
Transformację bakterii można było uzyskać przy użyciu zabitych lub rozpuszczonych komórek dawców, a także wyodrębnionego z nich DNA. Dla uzyskania transformacji in vitro, z hodowli bakterii izolowało się komórki mutanta, na
przykład opornego na streptomycynę, rozmnażało, a następnie wyodrębniało
DNA. Oczyszczone DNA dodane do płynnej hodowli wyjściowego szczepu
wrażliwego na streptomycynę, wywoływało przekształcenie niektórych bakterii
w komórki oporne na ten antybiotyk. Było wiadomo, że zjawisko transformacji
in vitro ma zasięg dość ograniczony. W ciągu około dwudziestu lat badań od
256www.postepybiochemii.pl
jego odkrycia (Avery i wsp., 1944) udało się wywołać transformację zaledwie u kilkudziesięciu szczepów, przynależnych do 9 grup rodzajowych bakterii. Najlepiej poznano 4
układy transformacji : Diplococcus pneumoniae, Hemophilus
influenzae, Bacillus subtilis i Streptococcus grupy H. Do uzyskania transformacji, bakterie muszą być zdolne do pobrania DNA i wbudowania go w chromosom. Jest to przejściowy stan fizjologiczny, nazywany kompetencją, występujący
tylko w ściśle określonych warunkach hodowli: pH, temperatury, stężenia jonów, składu pożywki, napowietrzenia itp.
Wiadomości o istocie stanu kompetencji były wówczas bardzo ograniczone. Zauważono, że w kilku układach transformacji pojawienie się stanu kompetencji jest warunkowane wytwarzaniem przez bakterie tak zwanego „czynnika
kompetencji”, który prawdopodobnie pełni istotną rolę w
aktywnym transporcie cząsteczek DNA przez błonę komórkową. Czynnik kompetencji wytwarzany przez paciorkowce (szczep Challis) oraz D. pneumoniae i B. subtilis ulega inaktywacji pod wpływem proteolitycznych enzymów, jest więc
najprawdopodobniej białkiem lub jego aktywna część jest
białkowa. Istotny wkład w te badania wniosły m.in. prace
zespołów R. Pakuły, W.T. Dobrzańskiego i R.D. Hotchissa.
Pierwszym etapem wnikania DNA do bakterii jest odwracalna, bardzo szybka adsorpcja jego cząsteczek na powierzchni komórek. Drugi, wolniejszy etap (czas trwania
od kilku sekund do kilku minut w zależności od rodzaju
bakterii) polega na trwałym związaniu DNA z komórkami
w sposób zabezpieczający go przed działaniem DNAzy. Minimalny czas pobierania DNA, potrzebny dla otrzymania
podwójnego transformanta, jest liniową funkcją odległości
między dwoma cechami tworzącymi parę. Wskazuje to, że
cząsteczka DNA wnika do komórki równolegle do swojej
dłuższej osi. Komórki kompetentne mogą również pobierać
heterologiczny DNA pochodzący z innego gatunku lub rodzaju bakterii. Heterologiczny DNA na ogół nie wywołuje
transformacji, ponieważ jest ona możliwa jedynie przy dużym podobieństwie składu i sekwencji nukleotydów DNA
dawcy i biorcy. Przypuszczano zatem, że wystąpienie rekombinacji genetycznej wymaga utworzenia przejściowego
połączenia pomiędzy chromosomem biorcy a DNA dawcy,
opartego na komplementarności zasad rekombinujących
cząsteczek DNA. W doświadczeniach wykorzystujących
pary związanych cech ustalono, że transformowana cecha
zajmuje na chromosomie miejsce odpowiadającej jej cechy
allelicznej. Wielu informacji o losie transformującego DNA
w komórkach biorcy dostarczyły badania, w których używano DNA dawcy znakowanego izotopami radioaktywnymi (32P) oraz ciężkimi (15N, 2H), w połączeniu z techniką
ultrawirowania w gradiencie chlorku cezu (metoda opracowana przez M. Meselsona, F. Sthala i J. Vinograda, 1957),
pozwalającą na odróżnienie” ciężkiego” DNA dawcy od
„lekkiego” DNA biorcy. Zagadnienia związane z kompetencją komórek i losami pobranego DNA były wówczas
przedmiotem rosnącego zainteresowania badaczy.
TRANSFORMACJA HOMOLOGICZNYM DNA
Jak już wspomniano, przedmiotem naszych badań była
transformacja genetyczna dwóch rodzajów bakterii: Streptococcus i Bacillus. Poszukiwaliśmy m. in. czynników odpowiedzialnych za stan kompetencji u paciorkowców. WykryPostępy Biochemii 61 (3) 2015
liśmy wydzielanie do środowiska hodowli bakterii metabolitu prowokującego zdolność ich komórek do transformacji,
nazywanym czynnikiem kompetencji [4]. Proces nabywania
kompetencji w jego obecności przez komórki niekompetentnego szczepu Wicky miał charakter reakcji enzymatycznej,
ze względu na kinetykę i zależność temperaturową. Kilka
lat potem (1966 r.) zespół prof. W.T. Dobrzańskiego z Akademii Medycznej w Warszawie wyodrębnił i scharakteryzował białkowy charakter tego metabolitu [3]. Także A.
Tomasz i R.D. Hotchkiss z Rockefeller University opisali
analogiczne zjawisko w przypadku transformacji Diplococcus pneumoniae [3].
W celu wzbogacenia cech wybranych do transformacji
w DNA paciorkowców, frakcjonowaliśmy wyodrębnione DNA po częściowej, selektywnej inaktywacji cieplnej.
Cienka i długa nić DNA bakteryjnego chromosomu (ciężar
cząsteczkowy rzędu 109 Da) jest mechanicznie nietrwała i
w czasie oczyszczania pęka wielokrotnie, w rezultacie powstaje z niej polidyspersyjna mieszanina 100-200 fragmentów. Spodziewaliśmy się, że frakcjonowanie preparatu
może doprowadzić do wyselekcjonowania puli fragmentów wzbogaconej w te cechy. Niestety nie udało się otrzymać oczekiwanych rezultatów, ale opracowaliśmy metodę
wydzielania zdenaturowanych, jednołańcuchowych cząsteczek DNA przez ekstrakcję chloroformem z wodnego roztworu zawierającego również natywny DNA [5,6].
Optymalizacja warunków transformacji doprowadziła
do ok. 20-krotnego zwiększenia wydajności transformacji
populacji paciorkowców [7], co stanowiło istotny postęp w
porównaniu z 1% wydajnością według ówczesnych danych
literaturowych. Ponadto zaobserwowano bakteriobójcze
działanie dużych ilości pobranego DNA. Było ono uwarunkowane zdolnością pobierania DNA, lecz niezależne od
transformacji genetycznej. Efekt letalny pozwolił określić
wielkość frakcji komórek pobierających DNA na przynajmniej 70% [8-11].
Przemiany jakim ulegają cząsteczki DNA pobrane
przez bakterie badałam w układzie Bacillus subtilis w trakcie mojego stażu podoktorskiego w laboratorium prof.
M.S. Foxa. Wobec literaturowych sprzeczności w ocenie
wydajności transformacji u tych bakterii, przeprowadziliśmy dokładną analizę losu transformującego DNA
w komórkach biorcy w funkcji czasu. Transformujący
„ciężki” DNA, zawierający trytowaną 3H-tyminę i deuterowane zasady oraz cukry, odróżniano od znakowanego radioaktywną 14C-tyminą DNA komórek biorcy za
pomocą frakcjonowania lizatów transformowanych komórek przez ultrawirowanie w gradiencie chlorku cezu.
Wykazaliśmy, że bezpośrednio po transformacji ok. 2/3
pobranego przez bakterie transformującego DNA występuje w kompleksie z białkowymi składnikami komórek.
Po uwolnieniu DNA z kompleksu okazało się, że pobrane
DNA występują w formie zdenaturowanej. Pozostała 1/3
transformującego DNA ko-sedymentowała z DNA biorcy, co wskazywało, że została do niego włączona. Wydłużenie inkubacji transformowanych komórek powodowało wzrost tej frakcji DNA kosztem frakcji zdenaturowanej. Oceniliśmy, że włączanie transformującego DNA
odbywa się w formie fragmentów o masie cząsteczkowej
257
ok. 106 Da [12]. Praca ta była często cytowana (ponad 100
razy), ostatni raz nawet w 2013 r.
Doskočila (Czechosłowacja), P. Lopez i M. Espinozy (Hiszpania) oraz R.A.J. Warrena (Kanada).
LOSY HETEROLOGICZNEGO DNA
W KOMÓRKACH BAKTERII
PODSUMOWANIE
Metody poznane i opracowane w laboratorium prof.
Foxa zastosowałam po powrocie ze stażu w badaniach losu
heterologicznego, nietransformującego DNA u B. subtilis.
Heterologiczny DNA wyodrębniony z Escherichia coli zachowywał się podobnie jak homologiczny, transformujący
DNA, to jest występował w połączeniu z białkowymi składnikami komórek, a po uwolnieniu z kompleksu miał jednoniciową budowę. Jednakże włączanie jego fragmentów do
DNA biorcy następowało poprzez monomery powstałe z
ich degradacji. Nie wykryto włączania większych fragmentów polimeru. Inaczej zachowywał się DNA fagów T6, zawierający zamiast cytozyny jej glikozylowaną 5-hydroksymetylową pochodną. Pobierany był w małych ilościach zachowując początkowo dwułańcuchową budowę, po czym
ulegał degradacji. Natomiast nie glikozylowany DNA faga
T6 wiązał się dobrze z bakteriami i po pobraniu przyjmował
strukturę jednoniciową [13,14]
Badania DNA wyodrębnionego z różnych szczepów B.
subtilis doprowadziły do wykrycia kilkunastoprocentowej
jego frakcji wrażliwej na degradację endonukleazą S1- enzymem działającym wybiórczo na jednołańcuchowy DNA.
Frakcjonowanie w alkalicznym gradiencie chlorku cezu wykazało, że wielkość jednołańcuchowej frakcji DNA zależy
od sposobu jego wyodrębniania i oczyszczania z kompleksów zawierających białko, RNA i komponenty błon komórkowych. Renaturacja jednołańcuchowej frakcji prowadziła
do wzbogacenia markerów położonych blisko początku
replikacji chromosomu, wskazując ten region jako źródło
frakcji jednołańcuchowej [15,16].
Dalsze badania dotyczyły wybiórczości receptorów komórkowych B. subtilis wobec DNA różnych fagów zawierających modyfikowane zasady: uracyl, putryscynylotyminę
i jej acetylowaną pochodną, 5-hydroksymetylocytozynę i
jej glikozylowaną pochodną, a także wobec dwuniciowego
RNA faga f2. Badania te wykazały, że badane modyfikacje
są tolerowane przez receptory komórkowe, z wyjątkiem
glikozylacji i grupy 2’-OH w RNA [17]. Ponadto wykazano, że DNA fagów φW-14, w którym połowa reszt tyminy
jest zastąpiona putryscynylo-tyminą, podany równocześnie
z DNA transformującym lub transfekcyjnym, zmniejsza
efektywność obu procesów. Następuje to w wyniku jego
wpływu na wewnątrzkomórkowe etapy procesów transformacji i transfekcji. W przypadku transformacji obserwowano wzmożenie degradacji pobranego DNA przed rekombinacją z chromosomem biorcy [18-20]. Na uwagę zasługuje
obserwacja, że DNA fagów φW-14 był pobierany w większej ilości niż homologiczny DNA. Brały w tym udział nie
tylko receptory właściwe dla transformujących cząsteczek,
jak również dodatkowe receptory komórkowe. Obie drogi miały charakter transportu aktywnego. DNA fagów był
szybko degradowany, a jego część włączana do DNA biorcy
pochodziła przypuszczalnie z monomerów wykorzystywanych w procesie replikacji [21,22]. Badania te prowadzono
w szerokiej międzynarodowej współpracy z laboratoriami J.
Badania zespołu prof. Davida Shugara w latach 60-80.
ubiegłego wieku wniosły niewątpliwie istotny wkład w
rozwój wiedzy o mechanizmach trasformacji. Czytelników
zainteresowanych wielkim postępem jaki dokonał się w tej
dziedzinie w czasie ostatnich 30 lat odsyłam do krótkiego
artykułu przeglądowego [23].
PIŚMIENNICTWO
1. Pakula R, Walczak W, Shugar D (1961) Inactivation of the streptomycin resistance markers of three species of bacteria by ionizing radiation. Acta Biochim Polon 8: 413-425
2. Pakula R, Walczak W, Shugar D (1962) Oxygen and dose-rate effects
on survival curves of gamma-irradiated transforming DNA in the
presence of protective substances. Acta Biochim Polon 9: 227-237
3. Piechowska M (1968)Transformacja bakterii. Postepy Biochem 14: 561580
4. Pakula R, Piechowska M, Bankowska E, Walczak W (1962) A characteristic of DNA mediated transformation systems of two streptococcal
strains. Acta Microbiol Pol 11: 205-222
5. Piechowska M, Shugar D (1963) Fractionation of native and heat denatured transforming DNA by chloroform treatment. Acta Biochim
Polon 10: 263-277
6. Piechowska M, Shugar D (1965) Further observations on the fractionation of DNA by chloroform treatment. Acta Biochim Polon 12: 11-21
7. Piechowska M, Shugar D (1967) Streptococcal group H transforming
system with reproducible high transformation yields. Acta Biochim
Polon 14: 349-360
8. Piechowska M, Shugar D (1967) Inhibitory and lethal effects of DNA
on transformable streptococci. Biochem Biophys Res Commun 26: 290295
9. Piechowska M, Shugar D (1967) Influence of DNA on growth and viability of transformable group H streptococci. Acta Biochim Polon 14:
277-291
10.Piechowska M, Shugar D (1967) Evaluation of transformation frequencies in bacterial transforming systems. Bull Acad Pol Sci Biol 15: 595598
11.Żiżina GP, Piechowska M, Shugar D (1968) An effect of DNA on
growth and viability of transformed Streptococci of H group. Mikrobiologia A N ZSSR 37: 908-913
12.Piechowska M, Fox MS (1971) Fate of transforming deoxyribonucleate
in Bacillus subtilis. J Bacteriol 108: 680-689
13.Piechowska M, Soltyk A, Shugar D (1975) Fate of heterologous deoxyribonucleic acid in Bacillus subtilis. J Bacteriol 122: 610-622
14.Soltyk A, Shugar D, Piechowska M (1975) Heterologous deoxyribonucleic acid uptake and complexing with cellular constituents in competent Bacillus subtilis. J Bacteriol 124: 1429-1438
15.Piechowska M, Piwnicka M, Venema G (1977) Some characteristics of
endonuclease S1-sensitive DNA isolated from Bacillus subtilis. W: Portoles A, Lopez R, Espinosa M (red) Modern trends in bacterial transformation and transfection. Elsevier/Noth Holland Biomedical Press,
Amsterdam, str. 135-142
16.Piwnicka M, Maciejko D, Piechowska M (1981) Single-stranded fraction of deoxyribonucleic acid from Bacillus subtilis. J Bacteriol 147: 206216
17. Soltyk A, Piechowska M, Shugar D (1976) Discrimination of competent Bacillus subtilis with respect to ribonucleic acids. Mol Gen Genet
148: 307-313
18.López P, Espinosa M, Piechowska M, Shugar D (1980) Influence of
bacteriophage PBS1and phi W-14 deoxyribonucleic acids on homologous deoxyribonucleic acid uptake and transformation in competent
Bacillus subtilis. J Bacteriol 143: 50-58
258www.postepybiochemii.pl
19.Lopez P, Espinosa M, Piechowska M, Shugar D, Warren RA (1981)
Phi W-14 DNA inhibits transfection of Bacillus subtilis by SPP1 DNA.
J Virol 37: 559-563
22.Lopez P, Espinosa M, Piechowska M, Shugar D, Warren RA (1984)
Intracellular effects of phage phi W-14 DNA on transformation of Bacillus subtilis. Mol Gen Genet 193: 85-91
20.Lopez P, Espinosa M, Warren RA, Piechowska M, Shugar D (1981)
Competition by phage φW-14 of transforming DNA uptake and influence on transformation in Bacillus subtilis. W: Polsinelli M (red) Transformation 1980. Cotswold Press, Oxford, str. 353-363
23.Mell JC, Redfield RJ (2014) Natural Competence and the Evolution of
DNA Uptake Specificity. J Bacteriol 196: 1471-1483
21.Lopez P, Espinosa M, Piechowska M, Shugar D, Warren RA (1982)
Uptake and fate of bacteriophage phi W-14 DNA in competent Bacillus
subtilis. J Bacteriol 149: 595-605
Genetic transformation and fate of heterological DNA in bacterial cells
Mirosława Piechowska
Docent Emeritus at the Institute of Biochemistry and Biophysics, Polish Academy of Sciences, Warsaw, Poland

e-mail: [email protected]
Key words: bacterial transformation, homologous DNA, heterologous DNA, competence factor
ABSTRACT
Secretion of a metabolite enabling Streptococci to undergo genetic transformation was discovered. The metabolite combined with an optimization process were applied to increase the transformation yield about 20-fold. It was observed that large amounts of DNA exert a bactericidal
effect, indicating the ability of at least 70% of cells to uptake the polymer. While studying the molecular mechanism of transformation of
Bacillus subtilis it was shown that the uptaken DNA forms complexes with bacterial proteins, which hinders determination of its structure.
A method was found to dissociate these complexes which enabled to determine the single-stranded structure of the uptaken DNA. Donor
DNA fragments incorporated into the host DNA were of about 106 Da. Non-transforming DNA can be uptaken similarly but does not undergo
incorporation into the host DNA. The selectivity of Bacillus subtilis receptors was determined towards DNA of phages containing modified
bases: uracil, putrescinyl-thymine and its acetylated derivative, 5’-hydroxymethylcytosine and its glycosylated derivative and also towards
double-stranded RNA of f2 phage. All these modifications were tolerated by the cellular receptors, with the exception of glycosylation and
the 2’-OH group in RNA.
Postępy Biochemii 61 (3) 2015
259