(11) PL/EP 1745138 PL/EP 1745138 T3

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12)
(96)
TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO
Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:
13.01.2005 05700860.9
(97)
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej
Polskiej
(19)
PL
(11)
PL/EP 1745138
(13)
T3
(51) Int. Cl.
C12P13/12
C12R1/15
(2006.01)
(2006.01)
O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono:
19.05.2010 Europejski Biuletyn Patentowy 2010/20
EP 1745138 B1
(54) Tytuł wynalazku:
Sposób fermentacyjnego wytwarzania metioniny z zastosowaniem rekombinowanych bakterii coryneform
(30) Pierwszeństwo:
DE200410009454
27.02.2004
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
24.01.2007 Europejski Biuletyn Patentowy 2007/04
(45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:
29.10.2010 Wiadomości Urzędu Patentowego 10/2010
(73) Uprawniony z patentu:
Evonik Degussa GmbH, Essen, DE
(72) Twórca (y) wynalazku:
PL/EP 1745138
T3
TRÖTSCHEL Christian, Köln, DE
KRÄMER Reinhard, Jülich, DE
BURKOVSKI Andreas, Jülich, DE
BATHE Brigitte, Salzkotten, DE
(74) Pełnomocnik:
Polservice Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o.
rzecz. pat. Kawczyńska Marta
00-950 Warszawa
skr. pocz. 335
Uwaga:
W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw
dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą
wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
3
17/T1822PL00
Opis
[0001]
Przedmiotem
fermentacyjnego
5
zastosowaniem
które
wynalazku
wytwarzania
niewiele
sposób
L-metioniny,
rekombinowanych
pobierają
jest
bakterii
albo
z
coryneform,
wcale
metioniny
z
otaczającej pożywki. Zgodnie z wynalazkiem osiąga się
to poprzez atenuację, a w szczególności deaktywację,
układu
10
poboru
metioniny
Met2,
kodowanego
przez
geny
yaeC, abc i yaeE.
Stan techniki
[0002]
Związki chemiczne, przez które rozumie się w
szczególności
15
L-aminokwasy,
witaminy,
nukleozydy
i
nukleotydy oraz D-aminokwasy, znajdują zastosowanie w
medycynie
człowieka,
w
przemyśle
farmaceutycznym,
w
kosmetykach, w przemyśle spożywczym, a w szczególności
w żywieniu zwierząt.
Wiele z tych związków wytwarza się poprzez
[0003]
20
fermentację
bakterii
drobnoustrojów,
coryneform,
korzystnie
wytwarzanych
w
ze
szczepów
szczególności
z
Corynebacterium glutamicum.
[0004] Ze względu na duże znaczenie stale są czynione
wysiłki
25
w
celu
udoskonalenia
sposobów
wytwarzania.
Udoskonalenia sposobów mogą dotyczyć cech technicznych
fermentacji,
takich
jak,
na
przykład,
mieszanie
i
zaopatrywanie w tlen, albo składu pożywek hodowlanych,
takiego
jak,
na
przykład,
stężenie
cukru
podczas
fermentacji, albo obróbki produkcji przez, na przykład,
30
chromatografię
jonowymienną,
albo
wewnętrznych
właściwości produkcyjnych samych drobnoustrojów.
4
[0005]
W
celu
udoskonalenia
właściwości
produkcyjnych tych drobnoustrojów stosuje się sposoby
mutagenezy, selekcji i doboru mutantów. W ten sposób
otrzymuje
5
się
szczepy,
które
są
oporne
na
anty-
metabolity, takie jak na przykład, analog lizyny S-(2aminoetylo)-cysteina albo analogi metioniny α-metylometioninę,
etioninę,
norleucynę,
N-acetylonorleucynę,
S-trifluorometylohomocysteinę, kwas 2-amino-5-heprenowy
(ang.
10
2-amino-5-heprenoit
acid),
seleno-metioninę,
sulfoksaminę metioniny, metoksynę, kwas karboksylowy 1aminocyklopentanowy, albo, które są auksotroficzne pod
względem
istotnych
metabolitów
regulatorowych
i
wytwarzają L-aminokwasy.
[0006]
15
Do udoskonalania szczepów corynebacterium
glutamicum wytwarzających aminokwasy przez kilka lat
wykorzystywano technologię rekombinacji DNA, w której
amplifikuje
się
geny
biosyntezy
poszczególnych
aminokwasów i bada wpływ na wytwarzanie L-aminokwasu.
20
Cel wynalazku
[0007]
Twórcy
wynalazku
postawili
sobie
za
cel
dostarczenie nowych podstaw dla udoskonalonych sposobów
fermentacyjnego
wytwarzania
L-metioniny,
z
zastosowaniem bakterii coryneform.
25
Opis wynalazku
[0008]
Poniżej
wymieniono
L-aminokwasy
lub
aminokwasy, oznaczające tu jeden lub wiele aminokwasów
proteinogennych,
30
kwasu
w
tym
L-asparaginowego,
ich
soli,
wybranych
L-asparaginy,
z
grupy
L-treoniny,
L-
seryny, kwasu L-glutaminowego, L-glutaminy, L-glicyny,
5
L-alaniny,
L-cysteiny,
L-waliny,
L-metioniny,
L-
izoleucyny, L-leucyny, L-tyrozyny, L-fenyloalaniny, Lhistydyny,
L-lizyny,
L-tryptofanu,
L-argininy
i
L-
proliny. Szczególnie korzystna jest L-metionina.
5
[0009]
Przez aminokwasy proteinogenne rozumie się
aminokwasy, które występują w naturalnych białkach, to
znaczy w białkach drobnoustrojów, roślin, zwierząt i
ludzi. Służą one jako jednostki strukturalne białek, w
których są związane ze sobą poprzez wiązania peptydowe.
10
Wspomniana poniżej L-metionina lub metionina
[0010]
odnosi się również do soli, takich jak, na przykład,
chlorowodorek metioniny albo siarczan metioniny.
[0011]
bardzo
15
Pobór metioniny z pożywki fermentacyjnej jest
istotny
dla
wytwarzania
metioniny,
ponieważ
możliwa re-absorpcja wydzielanego produktu obniżyłaby
szybkość wytwarzania. Atenuowane geny yaeE, abc i yaeC
opisane w tym wynalazku dla corynebacterium glutamicum,
kodują wiążące ATP białko ABC oraz permeazę YaeE, które
razem
20
tworzą
methionine
układ
uptake
poboru
metioniny
system),
dla
MetD2
(ang.
peryplazmatycznego
białka wiążącego Yaec.
[0012]
Atenuacja, a w szczególności deaktywacja,
jednego lub wielu, genów yaeC, abc i yaeE kodujących
układ poboru metioniny MetD2 poprawia wytwarzanie L25
metioniny
w
odpowiednich
bakteriach
coryneform
w
porównaniu z wyjściowymi organizmami bez atenuowanych
lub deaktywowanych tych genów.
[0013]
Przedmiotem
wynalazku
jest
sposób
fermentacyjnego wytwarzania L-metioniny z zastosowaniem
30
rekombinowanych
szczególności
bakterii
już
coryneform,
wytwarzają
które
L-aminokwasy,
w
które
6
pobierają mniej metioniny niż organizmy wyjściowe albo
nie pobierają metioniny wcale z otaczającej pożywki, i
w
których
jedna
nukleotydowa
sekwencja
lub
wiele
sekwencji nukleotydowych yaeC, abc i yaeC kodujących
5
układ poboru metioniny MetD2 jest atenuowanych albo w
szczególności
deaktywowanych
lub
eksprymowanych
na
niższym poziomie.
[0014]
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób
fermentacyjnego
10
wytwarzania
L-metioniny,
w
którym
przeprowadza się następujące etapy:
(a)
fermentacji
metioninę
wytwarzających
rekombinowanych
bakterii
aminokwas
L-
coryneform
w
pożywce, które pobierają mniej metioniny niż wyjściowe
organizmy
15
albo
wcale
nie
pobierają
metioniny
z
otaczającej pożywki, i w których co najmniej jeden z
genów
yaeE,
metioniny
abc
MetD2
i
jest
yaeC
kodujących
atenuowany,
a
w
układ
poboru
szczególności
deaktywowany albo eksprymowany na niższym poziomie,
(b)
20
wzbogacania
L-metioniny
w
pożywce
albo
komórkach bakterii,
(c)
izolacji
ewentualnie,
pożądanej
składniki
L-metioniny,
bulionu
przy
czym,
fermantacyjnego
i/lub
biomasy pozostają w częściach (> 0 do 100 %) albo w
całkowitych ilościach w produkcie końcowym.
25
[0015]
Bakterie coryneform wytwarzają L-metioninę,
korzystnie już przed atenuacją albo deaktywacją poboru
metioniny
należy
z
otaczającej
uzyskać
poprzez
pożywki,
którą
atenuację
albo
na
przykład
dektywację
jednego lub wielu genów yaeE, abc i yaeC.
30
[0016]
bakterie
Stwierdzono, że drobnoustroje, korzystnie
coryneform,
które
z
otaczającej
pożywki
7
pobierają
niewiele
metioniny
albo
nie
pobierają
jej
wcale, co osiąga się poprzez atenuację albo deaktywację
jednego lub wielu genów yaeE, abc i yaeC kodujących
układ poboru metioniny MetD2, zwiększają wytwarzanie L5
aminokwasów, w szczególności L-metioniny.
[0017]
Wspomniane
corynebacterium
stanie
sekwencje
glutamicum
techniki
i
można
są
nukleotydowe
znane
zacytować
w
genów
najświeższym
wiele
zgłoszeń
patentowych, wraz z bankiem danych National Center for
10
Biotechnology Information (NCBI) w National Library of
Medicine (Bethesda, MD, USA).
Geny yaeC:
[0018]
15
Oznaczenie: Perymplazamtyczne białko wiążące YaeC
Funkcja: Część układu poboru metioniny MetD2
Odesłania: Sekwencje 7061 i 709 z EP 1108790
Nr dostępu: AX127145 i AX120793.
20
Geny abc:
[0019]
Oznaczenie: Wiążące ATP białko ABC
Funkcja: Część układu poboru metioniny MetD2
Odesłania: Sekwencje 7061, 708, 7060 i 707 z EP
25
1108790; Sekwencja 363 z WO 0100805; Sekwencja 509 z WO
010084
Nr
dostępu:
AX127145;
AX120791; AX066781; AX065383.
30
AX120792;
AX127144;
8
Geny yaeE:
[0020]
Oznaczenie: Permeaza YaeE
Funkcja: Część układu poboru metioniny MetD2
5
Odesłania:
Sekwencje
7060,
7061
i
706
z
EP
0100805; Sekwencja 365 z WO 0100805
Nr
dostępu:
AX127144;
AX127145;
AX120790;
AX066783.
[0021]
10
Zgodnie
niniejszym
wynalazkiem
można
zastosować sekwencje kodujące genów yaeC, abc i yaeE
opisane
w
Ponadto,
zastosować
allelics)
podanych
lokalizacjach
można
wspomnianego
degeneracyjnego
15
z
odmiany
genu,
charakteru
kodu
literaturowych.
alleliczne
które
(ang.
wynikają
genetycznego,
z
albo
funkcjonalnie obojętne "mutacje sensowne”.
[0022]
Korzystne postaci realizacji można znaleźć w
zastrzeżeniach.
[0023]
tym
20
Określenie "atenouwanie" lub "atenuować" w
kontekście
opisuje
obniżanie
lub
deaktywację
wewnątrzkomórkowej aktywności jednego lub wielu układów
enzymatycznych, albo białek w drobnoustroju, które są
kodowane przez odpowiedni DNA, w którym wykorzystuje
się na przykład słaby promotor albo gen albo odmianę
alleliczną,
25
która
koduje
odpowiedni
enzym
o
niższej
aktywności, albo odpowiedni gen albo enzym albo białko
inaktywuje, i jeżeli to wskazane łączy, te cechy.
[0024]
Poprzez
etapy
atenuowania
zmniejsza
się
generalnie aktywność albo stężenie odpowiednich białek
od 0 do
30
[0025]
75 %, 0 do 50 %, 0 do 25 %, 0 do 10 % lub 0
do 5 % aktywności albo stężenia białka dzikiego typu,
9
albo
aktywności
albo
stężenia
białka
w
wyjściowym
drobnoustroju.
[0026]
Informacja "mniej" dotyczy takich samych
odsetków stwierdzanych pod względem zdolności poboru
5
rekombinowanych
wyjściowymi
drobnoustrojów,
drobnoustrojami
w
bez
porównaniu
atenuowanego
z
albo
deaktywowanego układu poboru metioniny MetD2.
Obniżanie stężenie białka można wykrywać za
[0027]
pomocą
10
1-
i
2-kierunkowego
powszechnie
stosowanego
rozdziału białek i następnie optycznej identyfikacji
stężenia
białka
oprogramowania
sposobem
w
z
żelu
do
użyciem
oceny.
preparatyki
odpowiedniego
Powszechnie
białkowych
żeli
stosowanym
dla
bakterii
coryneform oraz do identyfikacji białek jest strategia
15
opisana w publikacji Hermann i wsp. (Electrophoresis,
22: 1712-23 (2001)). Stężenie białka można w podobny
sposób analizować za pomocą hybrydyzacji typu WesternBlot
z
użyciem
potwierdzenia
20
specyficznego
białka
przeciwciała
(Sambrook
i
wsp.,
w
celu
Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Wyd. 2-gie, Cold Spring
Harbor
Laboratory
optyczną
Press,
interpretację
NY,
z
(1989)),
użyciem
a
następnie
odpowiedniego
oprogramowania do określania stężenia (Lohaus i Meyer
(1998)
25
Chemie
Biospektrum
111:
wiążących
5:
32-39;
2630-2647
DNA
można
Lottspeich,
(1999)).
mierzyć
z
Angewandte
Aktywność
zastosowaniem
białek
testów
przesunięcia prążka DNA (ang. DNA Band Shift Assays)
(określanych także jako testy opóźnienia w żelu) jakie
opisano
30
na
przykład
w
podręczniku
"Bioanalytik"
(Lottspeich/Zorbas, Spektrum Akademischer Verlag GmbH,
Heidelberg,
Niemcy,
1998)
i
jakie
były
wykorzystane
10
przez
Wilson
i
wsp.
(J.
Bacteriol.
183:
2151-2155
(2001)). Wpływ białek wiążących DNA na ekspresję innych
genów można udowodnić z zastosowaniem różnych dobrze
opisanych metod z użyciem genów reporterowych (Sambrook
5
i wsp., Molecular Cloning; a Laboratory Manual, Wydanie
2-gie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY, 1989).
[0028]
Drobnoustroje,
niniejszego
10
wynalazku
mogą
które
są
wytwarzać
przedmiotem
aminokwasy
z
glukozy, sacharozy, laktozy, fruktozy, maltozy, skrobi,
celulozy, albo z glicerolu i etanolu. Jako środek mogą
być zastosowane bakterie coryneform, w szczególności
rodzaj
corynebacterium.
corynebacterium
15
należy
W
przypadku
wspomnieć
rodzaju
corynebacterium
glutamicum, która jest znana specjalistom ze względu na
swą zdolność do wytwarzania L-aminokwasów.
[0029]
zwłaszcza
Odpowiednie szczepy rodzaju corynebacterium,
corynebacterium
typu
glutamicum
są
w
szczególności szczepami dzikimi.
20
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
25
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, i
Brevibacterium divaricatum ATCC14020,
albo jak na przykład wytwarzający L-metioninę szczep
Corynebacterium glutamicum ATCC21608.
11
[0030]
Szczepy z oznaczeniem "ATCC" można otrzymać z
kolekcji American Type Culture Collection) (Manassas,
VA, USA).
[0031]
5
Szczepy z oznaczeniem "FERM" można otrzymać z
instytutu
National
Institute
of
Advanced
Industrial
Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1
Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japonia). Wspomniany szczep
corynebacterium
thermoaminogenes
(FERM
BP-1539)
jest
opisany w Patencie U.S.A. 5,250,434.
10
[0032]
W
celu
uzyskania
atenuacji
poddać
można
degradacji lub deaktywacji albo ekspresję
genu, albo
katalityczne właściwości białek enzymatycznych. Jeżeli
jest to wskazane oba środki można połączyć.
[0033]
15
odpowiednie
genetyczną
genu.
20
genu
Ekspresję
prowadzenie
(mutację)
Struktury
można
hodowli
struktur
sygnałowe
przykład,
geny
operatory,
promotory,
albo
ekspresji
kodon
start
i
dziedzinie
może
znaleźć
zgłoszeniu
patentowym
terminatory.
WO
na
wiązania
Specjalista
do
96/15246,
to,
aktywatorowe,
miejsca
informację
zmianę
ekspresji
genu
geny
atenuatory,
przez
poprzez
sygnałowych
represorowe,
rybosomów,
zmniejszyć
tego
w
celu
w
w
publikacjach
autorstwa Boyd i Murphy (Journal of Bacteriology 170:
25
5949-5952
(1988),
Research
26:
Vosuil
i
3584-3590
(Microbiology
142:
Biotechnology
104:
Chambliss
(1998),
1297-309
311-323
(1996)
(2003))
(Nucleic
Patek
i
Acids
i
wsp.
Journal
oraz
w
of
znanych
podręcznikach genetyki i biologii molekularnej, takich
jak,
30
na
przykład,
podręcznik
autorstwa
Knippers
"Moleculare Genetik" (Molecular Genetics), wydanie 6te, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Niemcy, 1995), albo
12
autorstwa
Winnacker
Clones),
VCH
("Gene
und
Klone"
Verlagsgesellschaft,
(Genes
Weinheim,
and
Niemcy
(1990)).
[0034]
5
Przykładem pożądanej regulacji ekspresji genu
jest klonowanie genów, które mają być poddane atenuacji
pod
kontrolą
promotorów
zamkniętych
indukowalnych
ilości
IPTG
przez
dodanie
(izopropylo-β-D-
tiogalaktopiranozyd), takich jak na przykład promotor
trc albo promotor tac. Do tego celu odpowiednie są
10
wektory, takie jak wektor ekspresyjny escherichia coli
pXK99E
(WO
0226787;
Budapesztańskim
DH5alpha/pXK99E
w
złożone
dniu
jako
zgodnie
31
DSM14440
lipca
w
z
Traktatem
2001
kolekcji
jako
German
Association for Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ,
15
Braunschweig,
Niemcy)
albo
pVWEx2
(Wendisch,
Ph.
D
thesis Reports of the Jülich Research Center, Jül-3397,
ISSN 0994-2952, Jülich, Niemcy (1997)), który umożliwia
zależną
od
IPTG
ekspresję
klonowanego
genu
w
corynebacterium glutamicum.
20
[0035]
Metoda ta została, na przykład, zawarta w
patencie WO 0226787 w celu regulowanej ekspresji genu
deaD poprzez integrację wektora pXK99EdeaD do genomu
corynebacterium glutamicum i w publikacji Simic i wsp.
(Applied and Environmental Microbiology 68: 3321-3327
25
(2002)) w celu regulowanej ekspresji genu glyA poprzez
integrację
wektora
pK18mobglyA
do
corynebacterium
glutamicum.
[0036]
Kolejną
metodą
specyficznego
obniżania
ekspresji genu jest technologia antysensowna, w której
30
do
syntezy
dłuższego
antysensownego
RNA
w
komórkach
13
docelowych
wykorzystuje
się
krótkie
oligodeoksynukleotydy albo wektory.
[0037]
Tam antysensowny RNA może wiązać się do
komplementarnych segmentów specyficznego mRNA i obniżać
5
ich stabilność albo blokować ich zdolność do blokowania
zdolności
może
do
translokacji.
znaleźć
tego
Specjalista
dotyczący
przykład
w
dziedzinie
w
publikacji
Srivastava i wsp. (Applied Environmental Microbiology,
październik 2000; 66 (10): 4366-4371).
10
[0038]
Mutacje,
które
prowadzą
do
zmiany
albo
obniżenia właściwości katalitycznych są znane w stanie
techniki; przykłady zostały wymienione w pracach Qiu i
Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617
(1997)), Sugimoto i wsp. (Bioscience Biotechnology and
15
Biochemistry
przez
61:
Möckel
1760-1762
(Ph.D
Forschungszentrums
Reports),
(1994).
20
thesis,
Jülich
Jül-2906,
Podsumowujące
(1997))
(Jülich
ISSN09442952,
prezentacje
oraz
wspomniane
Berichte
des
Research
Center
Jülich,
Niemcy
można
znaleźć
w
znanych podręcznikach genetyki i biologii molekularnej,
takich
jak,
na
przykład,
autorstwa
Hagemann
("Allgemeine Genetik"(General Genetics), Gustav Fischer
Verlag, Stuttgart (1986).
[0039]
25
tranzycje,
Jako
mutacje
transwersje,
należy
insercje
wziąć
i
pod
uwagę
delecje.
W
zależności od wpływu wymiany aminokwasów na aktywność
enzymatyczną mówi się o mutacjach zmiany sensu (ang.
missence mutations) albo mutacjach nonsensownych (ang.
nonsense mutations).
30
[0040]
Insercje albo delecje co najmniej jednej pary
zasad w genie prowadzą do mutacji przesunięcia ramki
14
odczytu (ang. frame shift mutations), w konsekwencji
której tworzone są fałszywe aminokwasy albo translacja
białka ulega przedwczesnej terminacji. Delecje wielu
kodonów prowadzą zazwyczaj do całkowitego zniszczenia
5
aktywności enzymatycznej.
[0041]
Instrukcje
mutacji
znajdują
znaleźć
w
w
stanie
znanych
mikrobiologii,
10
sie
dotyczące
otrzymywania
techniki
podręcznikach
takich
jak,
na
i
takich
można
genetyki
przykład,
je
i
autorstwa
Knippers ("Molekulare Genetik") (Molecular Genetics),
wydanie 6-te, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Niemcy,
1995),
albo
autorstwa
Winnacker
("Gene
und
Klone"
(Genes and Clones), VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim,
Niemcy
15
(1990),
Genetik"
albo
(General
autorstwa
Genetics),
Hagemann
Gustav
("Allgemeine
Fischer
Verlag,
Stuttgart (1986).
[0042]
Powszechnie stosowaną metodą mutacji genów c.
glutamicum
jest
metoda
przerywania
genu
(ang.
gene
disruption) i zastępowania genu (ang. gene replacement)
20
opisana w publikacji Schwarzer i Pühler (Bio/Technology
9, 84-87 (1991).
[0043]
centalną
W metodzie przerywania genu, na przykład,
część
przedmiotem
25
regionu
kodującego
zainteresowania
klonuje
genu
się
w
będącego
wektorze
plazmidowym, który w jednym gospodarzu (zazwyczaj E.
coli) może replikować, ale nie może w c. glutamicum.
Wektory, które warto wziąć pod uwagę to, na przykład,
pSUP301
(1983)),
30
(Simon
pK18
i
wsp.,
mob,
Bio/Technology
pK19mob,
1,
pk18mobsacB
784-791
albo
pK19mobsacB (Schäfer i wsp., Gene 145, 69-73 (1994)),
pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA, pCR2.1-
15
TOPO
(Invitrogen,
Groningen,
Netherlands);
Shuman
(1994), Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84,
Patent
U.S.A.
Groningen,
5
5,487,993,
Holandia);
Molecular
Biology,
pCR®Blunt
Bernard
234:
i
(Invitrogen,
wsp.,
534-541
Journal
(1993)
albo
of
pEM1
(Schrumpf i wsp., 1991, Journal of Bacteriology 173
4510-4516). Wektor plazmidowy, który zawiera centralny
obszar regionu kodującego genu, przenosi się następnie
poprzez koniugację albo transformację
10
do pożądanego
szczepu c. glutamicum. Metoda koniugacji opisana jest
na przykład w publikacji Schäfer i wsp. (Journal of
Bacteriology
172:
1663-1666
(1990)
oraz
Applied
and
Environmental Microbiology 60: 756-759(1994).
[0044]
15
Metody transformacji są opisane na przykład w
publikacji Thierbach i wsp. (Applied Microbiology and
Biotechnology
29,
356-362
(1988),
Duncan
i
Shivnan
(Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) oraz Tauch i wsp.
(FEMS Microbiolgical Letters 123, 343-347 (1994)). Po
homologicznej rekombinacji z wykorzystaniem zdarzenia
20
krzyżowania (ang. cross-over) region kodujący danego
genu jest przerywany i otrzymuje się dwie niekompletne
odmiany alleliczne, przy czym każdej brakuje końców 3'
albo 5'. Metoda ta była stosowana na przykład przez
25
Fitzpatrick
i
wsp.
Biotechnology
42,
(Applied
575-580
(1994)
Microbiology
w
celu
and
deaktywacji
genu recA c. glutamicum.
30
[0045]
Wektory, które zawierają co najmniej 15,
korzystnie
co
centralnej
części
najmniej
25,
regionu
kolejnych
kodującego
nukleotydów
co
najmniej
jednego spośród genów yaeD, abc, albo yaeE są podobnie
przedmiotem niniejszego ujawnienia.
16
[0046]
W metodzie zastępowania genu mutację, taką
jak, na przykład, delecja, insercja albo zastąpienie
zasady,
otrzymuje
się
w
genie
będącym
przedmiotem
zainteresowania in vitro. Otrzymaną odmianę alleliczną
5
z jednej strony klonuje się w wektorze nieulegającym
replikacji
w
następnie
c.
glutamicum
poprzez
i
przekształca
transformację
albo
się
koniugację
ją
w
pożądanego gospodarza c. glutamicum. Po homologicznej
rekombinacji z wykorzystaniem pierwszego, powodującego
10
intergrację
zdarzenia
krzyżowania
i
odpowiedniego
drugiego, powodującego wycięcie zdarzenia krzyżowania w
docelowym genie albo w zamierzonej sekwencji uzyskuje
się
15
zatrzymanie
mutacji
Metoda
ta
została
opisana
Pühler
Bio/Technology
9:
albo
odmiany
w
publikacji
84-87
(1991)
allelicznej.
Scharzer
i
i
została
wykorzystana na przykład przez Peters-Windisch i wsp.
(Microbiology 144, 915-927 (1998) w celu deaktywacji
genu
pyc
c.
glutamicum
poprzez
delecję,
albo
przez
Wehmeier i wsp. (Microbiology 144: 1853-1862 (1998) w
20
celu insercji delecji w genie rel c. glutamicum.
[0047]
Kirchner i Tauch (Journal of Biotechnology
104: 287-299 (2003)) zamieścili przegląd rożnych metod
genetycznych znajdujących zastosowanie w odniesieniu do
c. glutamicum.
25
[0048]
zasad
W ten sposób delecję, insercję albo wymianę
można
wbudować
do
jednego
lub
wielu
genów
wybranych z grupy yaeC, abc, i yaeE.
[0049]
Ponadto, w celu wytwarzania L-aminokwasów
korzystne może być, oprócz obniżania importu metioniny
30
z
otaczającej
pożywki,
do
uzyskania,
zgodnie
z
wynalazkiem, przez atenuację jednego albo wielu genów
17
wybranych z grupy yaeC, abc i yaE, wzmocnienie albo
atenuacja,
zwłaszcza
ekspresji,
jednego
deaktywacja
lub
więcej
albo
zmniejszenie
genów
odpowiednich
szlaków biosyntezy, glikolizy, anaplerotycznych, cyklu
5
kwasu cytrynowego, cyklu fosforanu pentozy, eksportu
aminokwasów,
i
jeżeli
jest
to
wskazane,
białek
regulatorowych.
W związku z tym, określenie "wzmacnianie"
[0050]
albo
10
"wzmacniać"
opisuje
wzrost
wewnątrzkomórkowej
aktywności albo stężenia jednego lub wielu enzymów lub
białek
w
drobnoustroju,
które
kodowane
są
przez
odpowiedni DNA w którym, na przykład, zwiększona jest
liczba kopii genu lub genów, wykorzystany jest silny
promotor, albo gen lub odmiana alleliczna, która dla
15
odpowiedniego
enzymu
lub
białka
koduje
wyższą
aktywność, i jeżeli to wskazane łączy się te środki.
[0051]
Za
nadekspresji,
pomocą
wzmacniania,
aktywność
albo
w
szczególności
stężenie
odpowiedniego
białka zwiększa się ogólnie o co najmniej 10 %, 25 %,
20
50 %, 75 %, 100 %, 150 % 200 %, 300 %, 400 % lub 500 %,
maksymalnie
do
1000
%
lub
2000
%
względem
białka
dzikiego typu, albo aktywności albo stężenia białka w
wyjściowym drobnoustroju.
[0052]
25
Ogólnie korzystne jest zastosowanie genów
endogennych.
[0053]
Przez
"endogenne
genów
albo
określenia
sekwencje
"geny
nukleotydowe"
sekwencji
nukleotydowych
endogenne"
rozumie
albo
się
typ
występujących
w
populacji.
30
[0054]
metioniny,
Zatem, na przykład, w celu wytwarzania Loprócz
obniżania
importu
metioniny
z
18
otaczającej pożywki, do uzyskania, zgodnie z niniejszym
wynalazkiem, przez atenuację jednego lub wielu genów
wybranych z grupy yaeC, abc i yaeE, wzmacnia się, w
szczególności
5
poddaje
nadekspresji,
jeden
lub
wiele
genów wybranych z grupy genów lub odmian allelicznych
genów
wytwarzania
metioniny.
Przez
określenia
"geny
albo odmiany alleliczne genów wytwarzania metioniny"
należy rozumieć, łącznie, korzystnie endogenne, otwarte
ramki odczytu, geny albo odmiany alleliczne, których
10
wzmacnianie/nadeksprasja
może
prowadzić
do
poprawy
wytwarzania metioniny.
[0055]
Do
tego
celu
nadają
się,
wśród
innych,
następujące ramki odczytu, geny lub odmiany alleliczne:
accBC, accDA, aecD, cstA, cysD, cysE, cysH, cysK, cysN,
15
cysQ, dps, eno, fda, gap, gap2, gdh, gnd, glyA, hom,
homFBR,
lysC,
lySCFBR,
metA,
metB,
metE,
metH,
metY,
msiK, opcA, oxyR, ppc, ppcFBR, pgk, pknA, pknB, pknD,
pknG, ppsA, ptsH, ptsI, ptsM, pyc, pyc P458S, sigC,
sigD, sigE, sigH, sigM, tal, thyA, tkt, tpi, zwal, zwf
20
i zwf A213T. Podsumowane są one i wyjaśnione w Tabeli
1.
Tabela 1
Geny i odmiany alleliczne w wytwarzaniu metioniny
Nazwa Oznaczenie
kodowanych Odesłanie
Numer
enzymów lub białek
accBC
Karboksylaza acylo-CoA
(Acyl-CoA Carboxylase)
EC 6.3.4.14
dostępu
Jäger
i
Archives
wsp. U35023
of AX123524
Microbiology
(1996) 166:76-82
AX066441
19
Geny i odmiany alleliczne w wytwarzaniu metioniny
Nazwa Oznaczenie
kodowanych Odesłanie
Numer
enzymów lub białek
dostępu
(karboksylaza acylo-CoA)
EP1108790;
(acyl-CoA carboxylase)
WO0100805
accDA Karboksylaza
acetylo-CoA EP1055725
(Acetyl-CoA Carboxylase)
EP1108790
EC 6.4.1.2
WO0100805
AX121013
AX066443
(karboksylaza acetylo-CoA)
(acetyl-CoA carboxylase)
aecD
cstA
Beta-liaza cystationiny
Rossol
i
wsp., M89931
(Cystathionin beta-Lyase)
Journal
EC 4.4.1.8
Bacteriology
(beta-liaza cystationiny)
174:2968-2977
(cystathionine beta-lyase)
(1992)
Białko głodu węglowego A
EP1108790
AX120811
(Carbon Starvation Protein A)
WO010080
AX066109
EP1108790
AX123177
of
(białko głodu węglowego A)
(carbon starvation protein A)
cysD
Adenylilotransferaza siarczanowa
Podjednostka II
(Sulfat-Adenylyltransferase
Untereinheit II)
EC 2.7.7.4
(adenylilotransferaza
siarczanowa
krótkołańcuchowa)
(sulfate
chain)
adenylyltransferase
small
20
Geny i odmiany alleliczne w wytwarzaniu metioniny
Nazwa Oznaczenie
kodowanych Odesłanie
enzymów lub białek
cysE
Numer
dostępu
Acetylotransferaza serynowa
EP1108790
AX122902
(Serinacetyltransferase)
WO0100843
AX063961
EC 2.3.1.30
(acetylotransferaza serynowa)
(serine acetyltransferase)
cysH
Reduktaza 3'-fosfoadenylosiarczanowa EP1108790
AX123178
(3'-Phosphoadenylsulfat Reduktase)
WO0100842
AX066001
Syntaza cysteinowa
EP1108790
AX122901
(Cystein-Synthase)
WO0100843
AX063963
EP1108790
AX123176
EC 1.8.99.4
(Reduktaza
3'-fosfoadenozyno-5'-
fosfosiarczanowa)
(3'-phosphoadenosine
5'-
phosphosulfate reductase)
cysK
EC 4.2.99.8
(syntaza cysteinowa)
(cysteine synthase)
cysN
Adenylilotransferaza siarczanowa
Podjednostka I
(Sulfat-Adenylyltransferase
Untereinheit I)
EC 2.7.7.4
(adenylilotransferaza siarczanowa)
(sulfate adenylyltransferase)
AX127152
21
Geny i odmiany alleliczne w wytwarzaniu metioniny
Nazwa Oznaczenie
kodowanych Odesłanie
Numer
enzymów lub białek
cysQ
dostępu
Białko transportowe CysQ
EP1108790
AX12714
(Transportprotein CysQ)
WO0100805
5AX066423
EP1108790
AX127153
Enolaza
EP1108790
AX127146
(Enolase)
WO0100844
AX064945
EC 4.2.1.11
EP1090998
AX136862
(enolaza)
Hermann i wsp.,
(enolase)
Electrophores
(transporter cysQ)
(transporter cysQ)
dps
Białko ochronne DNA
(DNA-Protection Protein)
(białko ochronne podczas głodzenia)
(protection during starvation protein)
eno
19:3217-3221
(1998)
fda
Aldolaza fruktozobisfosforanowa
van
der
Osten X17313
(Fruktose Bisphosphat Aldolase)
i wsp.,
EC 4.1.2.13
Molecular
(aldolaza fruktozobisfosforanowa)
Microbiology
(fructose bisphosphate aldolase)
3:1625-1637
(1989)
gap
Dehydrogenaza
EP1108790
AX127148
gliceraldehydo-3-fosforanowa
WO0100844
AX064941
(Glyceraldehyd-3-Phosphat
Eikmanns i wsp.,
X59403
Dehydrogenase)
Journal
of
22
Geny i odmiany alleliczne w wytwarzaniu metioniny
Nazwa Oznaczenie
kodowanych Odesłanie
enzymów lub białek
Numer
dostępu
EC 1.2.1.12
Bacteriology 174 :
(dehydrogenaza
6076-6086(1992)
gliceraldehydo-3-fosforanowa)
(glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase)
gap2
Dehydrogenaza
EP1108790
AX127146
gliceraldehydo-3-fosforanowa
WO0100844
AX064939
Dehydrogeneza glutaminianowa
EP1108790
AX127150
(Glutamat Dehydrogenase)
WO0100844
AX0638
EC 1.4.1.4
Boermann i wsp,
X59404
(dehydrogeneza glutaminianowa)11
Molecular
X72855
(glutamate dehydrogenase) 11
Microbiology
(Glyceraldehyd-3-Phosphate
Dehydrogenase)
EC 1.2.1.12
(dehydrogenaza
gliceraldehydo-3-fosforanowa 2)
(glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase 2)
gdh
6:317-326 (1992)
glyA
Hydroksymetylotransferaza
glicynowa/serynowa
(Glycine/Serin
Hydroxymethyltransferase)
EC 2.1.2.1
EP1108790
AX1271 46
AX1211 94
23
Geny i odmiany alleliczne w wytwarzaniu metioniny
Nazwa Oznaczenie
kodowanych Odesłanie
Numer
enzymów lub białek
dostępu
(hydroksymetylotransferaza
glicynowa/serynowa)
(glycine/serine
hydroxymethyltransferase)
gnd
Dehydrogenaza 6-fosfoglukonianowa
EP1108790
AX1271 47
(6-Phosphogluconat Dehydrogenase)
WO0100844
AX1216 89
EC 1.1.1.44
AX0651 25
(dehydrogenaza 6-fosfoglukonianowa)
(6-phosphogluconate dehydrogenase)
hom
Dehydrogenaza homoserynowa
Peoples
(Homoserin Dehydrogenase)
al.,
EC 1.1.1.3
Microbiology
(dehydrogenaza homoserynowa)
2:63-72
(homoserine dehydrogenase)
(1988)
homFBR Dehydrogenaza homoserynowa
et Y00546
Molecular
Reinscheid i wsp.,
oporna na sprzężene zwrotne (fbr)
Journal
(Homoserin Dehydrogenase
of
feedback resistent (fbr)
173:3228-30
EC 1.1.1.3
(1991)
Bacteriology
(dehydrogenaza homoserynowa fbr)
(homoserine dehydrogenase fbr))
lysC
Kinaza asparaginianowa
EP1108790
AX1203 65
(Aspartatkinase)
WO0100844
AX0637
EC 2.7.2.4
Kalinowski
i 43 X57226
wsp.,
Molecular
24
Geny i odmiany alleliczne w wytwarzaniu metioniny
Nazwa Oznaczenie
kodowanych Odesłanie
Numer
enzymów lub białek
dostępu
(kinaza asparaginianowa)
Microbiology
(aspartate kinase)
5:1197-204
(1991)
lysCFBR Kinaza asparaginianowa oporna na Patrz Tabela 2
sprzężenie zwrotne (fbr)
(Aspartatkinase
feedback
resistent
(fbr))
EC 2.7.2.4
(kinaza asparaginianowa fbr)
(aspartate kinase fbr)
metA
Acetylotransferaza homoserynowa
Park
i
wsp., AF052652
(Homoserin Acetyltransferase)
Molecular
EC 2.3.1.31
8:286-
(acetylotransferaza homoserynowa)
94 (1998)
Cells
(homoserine acetyltransferase)
metB
γ-Liaza cystationiny
Hwang
i
(Cystahionin γ-Lyase)
Molecular
EC 4.4.1.1
9:300-
(gamma-syntaza cystationiny)
308 (1999)
wsp., AF126953
Cells
(cystathionine gamma-synthase)
metE
Metylotransferaza homocysteinowa
(Homocystein-Methyltransferase)
EC 2.1.1.14
(metylotransferaza homocysteinowa)
(homocysteine methyltransferase)
EP1108790
AX1271 46
AX1213 45
25
Geny i odmiany alleliczne w wytwarzaniu metioniny
Nazwa Oznaczenie
kodowanych Odesłanie
enzymów lub białek
metH
Metylotransferaza
Numer
dostępu
homocysteinowa EP1108790
(zależna od witaminy B12)
AX1271 48
AX1217 47
(Homocystein-Methyltransferase
(Vitamin B12 abhängig))
EC 2.1.1.14
(metylotransferaza homocysteinowa)
(homocysteine methyltransferase)
metY
Sulfohydrolaza acetylohomoseryny
EP1108790
(Acetylhomoserin Sulfhydrolase)
AX1208 10
AX1271 45
(sulfohydrolaza
acetylohomoserynowa)
(acetylhomoserine sulfhydrolase)
msiK
Importer cukrów
EP1108790
AX1208 92
(Zuckerimporter)
(złożone białko importu cukrów)
(multiple sugar import protein)
opcA
Dehydrogenaza
glukozo-6- WO0104325
fosforanowa
(Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase)
(podjednostka
dehydrogenazy
glukozo-6-fosforanowej)
(subunit
of
dehydrogenase)
glucose-6-phosphate
AX0762 72
26
Geny i odmiany alleliczne w wytwarzaniu metioniny
Nazwa Oznaczenie
kodowanych Odesłanie
enzymów lub białek
oxyR
Numer
dostępu
Regulator transkrypcyjny
EP1108790
(Transcriptionsregulator)
AX1221 98
AX1271 49
(regulator transkrypcyjny)
(transcriptional regulator)
ppcFBR Karboksylaza
EP0723011
fosfoenolopirogronianowa
WO0100852
oporna na sprzężenie zwrotne
(Phosphoenolpyruvat
Carboxylase
feedback resistant)
EC 4.1.1.31
(karboksylaza
fosfoenolopirogronianowa oporna na
sprzężenie zwrotne)
(phosphoenolpyruvate
carboxylase
feedback resistant)
ppc
Karboksylaza
EP1108790
AX1271 48
fosfoenolopirogronianowa
O'Reagan i wsp., AX123554
(Phosphoenolpyruvat Carboxylase)
Gene
EC 4.1.1.31
251(1989)
77(2):237- M25819
(karboksylaza
fosfoenolopirogronianowa)
(phosphoenolpyruvate carboxylase)
pgk
Kinaza fosfoglicerynianowa
EP1108790
AX1218 38
(Phosphoglycerat Kinase)
WO010084
AX1271 48
EC 2.7.2.3
Eikmanns, Journal AX0649 43
of
Bacteriology X59403
27
Geny i odmiany alleliczne w wytwarzaniu metioniny
Nazwa Oznaczenie
kodowanych Odesłanie
enzymów lub białek
pknA
Numer
dostępu
(kinaza fosfoglicerynianowa)
174:6076-6086
(phosphoglycerate kinase)
(1992)
Kinaza białkowa A
EP1108790
(Protein kinase A)
AX1201 31
AX1200 85
(kinaza białkowa A)
(protein kinase A)
pknB
Kinaza białkowa B
EP1108790
(Protein kinase B)
AX1201 30
AX1200 85
(kinaza białkowa B)
(protein kinase B)
pknD
Kinaza białkowa D
EP1108790
AX1271 50
(Protein kinase D)
AX1224 69
(kinaza białkowa D)
AX1224 68
(protein kinase D)
pknG
Kinaza białkowa G
EP1108790
(Protein kinase G)
AX1271 52
AX1231 09
(kinaza białkowa G)
(protein kinase G)
ppsA
Syntaza fosfoenolopirogronianowa
EP1108790
AX1271 44
(Phosphoenolpyruvat-Synthase)
AX1207 00
EC 2.7.9.2
AX1224 69
(syntaza fosfoenolopirogronianowa)
(phosphoenolpyruvate synthase)
28
Geny i odmiany alleliczne w wytwarzaniu metioniny
Nazwa Oznaczenie
kodowanych Odesłanie
Numer
enzymów lub białek
ptsH
Białko
H
układu
dostępu
fosfotransferazy EP1108790
AX1222 10
(Phosphotransferase System Protein H) WO0100844
AX1271 49
EC 2.7.1.69
AX0691 54
(składnik H układu fosfotransferazy)
(phosphotransferase system
component H)
ptsI
Enzym
I
układu
fosfotransferazy EP1108790
AX1222 06
(Phosphotransferase System Enzym I)
AX1271 49
EC 2.7.3.9
(enzym I układu fosfotransferazy)
(phosphotransferase system enzyme I)
ptsM
Swoisty dla glukozy enzym II układu Lee
fosfotransferazy
FEMS
(Glukose
spezifisches Microbiology
Phosphotransferase System Enzym II) Letters
EC 2.7.1.69
(enzym
wsp., L18874
i
119(1-
2):137-145 (1994)
II
układu
glukozo-
fosfotransferazy)
(glucose-phosphotransferase-system
enzyme II)
pyc
Karboksylaza pirogronianowa
WO9918228
(Pyrvat-Carboxylase)
Peters-Wendisch i Y09548
EC 6.4.1.1
wsp,
(karboksylaza pirogronianowa)
Microbiology
(pyrvate carboxylase)
144:915-927
(1998)
A97276
29
Geny i odmiany alleliczne w wytwarzaniu metioniny
Nazwa Oznaczenie
kodowanych Odesłanie
enzymów lub białek
pyc
Karboksylaza
P458S
(Pyrvat-Carboxylase)
Numer
dostępu
pirogronianowa EP1108790
EC 6.4.1.1
(karboksylaza pirogronianowa)
(pyrvate carboxylase)
(Wymiana aminokwasu P458S)
(Amino acid exchange P458S)
sigC
Czynnik sigma C
EP1108790
(Sigmafaktor C)
AX120368
AX120085
EC 2.7.7.6
(alternatywny czynnik sigma C funkcji
poza cytoplazmatycznej)
(extracytoplasmic
function
alternative sigma factor C)
sigD
Czynnik sigma D polimerazy RNA
EP1108790
(RNA Polymerase Sigmafaktor D)
AX120753
AX127144
EC 2.7.7.6
(czynnik sigma D polimerazy RNA)
(RNA polymerase sigma factor)
sigE
Czynnik sigma E
(Sigmafaktor E)
EC 2.7.7.6
(alternatywny czynnik sigma E funkcji
poza cytoplazmatycznej)
(extracytoplasmic function alternative
sigma factor E)
EP1108790
AX127146
AX121325
30
Geny i odmiany alleliczne w wytwarzaniu metioniny
Nazwa Oznaczenie
kodowanych Odesłanie
enzymów lub białek
sigH
Czynnik sigma H
Numer
dostępu
EP1108790
(Sigmafaktor H)
AX127145
AX120939
EC 2.7.7.6
(czynnik sigma SigH)
(sigma factor SigH)
sigM
Czynnik sigma M
EP1108790
(Sigmafaktor M)
AX123500
AX127153
EC 2.7.7.6
(czynnik sigma SigM)
(sigma factor SigM)
tal
Transaldolaza
WO0104325
AX076672
EP1108790
AX121026
(Transaldolase)
EC 2.2.1.2
(transaldolaza)
(transaldolase)
thyA
Syntaza tymidylanowa
(Thymidylat Synthase)
AX1271 45
EC 2.1.1.45
(syntaza tymidylanowa)
(thymidylate synthase)
tkt
Transketolaza
Ikeda
(Transketolase)
NCBI
EC 2.2.1.1
i
wsp., AB023377
31
Geny i odmiany alleliczne w wytwarzaniu metioniny
Nazwa Oznaczenie
kodowanych Odesłanie
enzymów lub białek
Numer
dostępu
(transketolaza)
(transketolase)
tpi
Izomeraza triozo-fosforanowa
Eikmanns, Journal
(Triose-phosphat Isomerase)
of
EC 5.3.1.1
174:6076-6086
(izomeraza triozo-fosforanowa)
(1992) X59403
Bacteriology
(triose-phosphate isomerase)
zwa1
Czynnik wzrostu komórek 1
EP1111062
AX1337 81
glukozo-6- EP1108790
AX127148
(Glukose-6-phosphat-1- WO010432
AX121827
(Zellwachstumsfaktor 1)
(czynnik wzrostu 1)
(growth factor 1)
zwf
Dehydrogenaza
fosforanowa
Dehydrogenase)
AX0762 72
EC 1.1.1.49
(dehydrogenaza
glukozo-6-
fosforanowa)
(glucose-6-phosphate-1dehydrogenase)
zwf
Dehydrogenaza
A213T fosforanowa
(Glukose-6-phosphat-1Dehydrogenase)
EC 1.1.1.49
glukozo-6- EP1108790
32
Geny i odmiany alleliczne w wytwarzaniu metioniny
Nazwa Oznaczenie
kodowanych Odesłanie
Numer
enzymów lub białek
dostępu
(dehydrogenaza
glukozo-6-
fosforanowa)
(glucose-6-phosphate-1dehydrogenase)
(wymiana aminokwasów? A213T)
(amino acid exchange ? A213T)
[0056]
może
Ponadto do wytwarzania L-metioniny korzystne
być,
oprócz
otaczającej
5
obniżania
pożywki,
do
importu
uzyskania
metioniny
przez
z
atenuację
jednego lub wielu genów wybranych z grupy yaeC, abc i
yaeE, atenuację w tym samym czasie jednego lub wielu
genów wybranych z grupy genów lub odmian allelicznych,
które nie są niezbędne dla wzrostu albo wytwarzania
metioniny,
10
a
w
szczególności
przez
deaktywację
lub
obniżenie ekspresji.
[0057]
Do
tego
celu
nadają
się,
wśród
innych,
następujące ramki odczytu, geny lub odmiany alleliczne:
brnQ, ccpA1, ccpA2, citA, citB, citE, ddh, gluA, gluB,
gluC,
15
gluD,
luxR,
luxS,
lysR2,
lysR3,
menE,
metD, metK, pck, pgi, poxB i zwa2. Podsumowane są one i
wyjaśnione w Tabeli 2.
20
lysR1,
33
Tabela 2
Geny i odmiany alleliczne, które nie są niezbędne do wytwarzania metioniny
Nazwa Oznaczenie kodowanych Enzymów Odesłanie
Numer
genu
lub białek
dostępu
brnQ
Białko nośnikowe rozgałęzionych Tauch i wsp., Archives M89931
aminokwasów
(Carrier-Protein
of
verzweigtkettiger 169(4):303-12 (1998)
nośnikowe
transportu
AX127150
W00100805
Aminosäuren)
(Białko
Microbiology AX066841
układu EP1108790
rozgałęzionych
aminokwasów)
(branched-chain
amino
acid
transport system carrier protein)
ccpA1
Białko kontroli katabolicznej
W00100844
AX065267
(Katabolit-Kontroll-Protein)
EP1108790
AX127147
Białko kontroli katabolicznej
WO0100844
AX065267
(Katabolit-Kontroll-Protein)
EP1108790
AX121594
EP1108790
AX120161
EP1108790
AX120163
(białko kontroli katabolicznej A1)
(catabolite control protein A1)
ccpA2
(białko kontroli katabolicznej A2)
(catabolite control protein A2)
citA
Kinaza sensorowa CitA
(Sensor-Kinase CitA)
(kinaza sensorowa CitA)
(sensor kinase CitA)
citB
Regulator transkrypcyjny CitB
(Transkriptionsregulator CitB)
(regulator transkrypcyjny CitB)
(transcription regulator CitB)
34
Geny i odmiany alleliczne, które nie są niezbędne do wytwarzania metioniny
Nazwa Oznaczenie kodowanych Enzymów Odesłanie
Numer
genu
lub białek
dostępu
citE
Liaza cytrynianowa
WO010084
AX065421
(Citrat-Lyase)
EP1108790
AX127146
EC 4.1.3.6
(liaza cytrynianowa)
(citrate lyase)
ddh
Dehydrogenaza
Ishino i wsp., Nucleic S07384
diaminopimelinianowa
Acids
(Diaminopimelat-Dehydrogenase)
3917
EC 1.4.1.16
EP1108790
Research
15: AX127152
(1987)
(dehydrogenaza
diaminopimelinianowa)
(diaminopimelate dehydrogenase)
gluA
Wiążące ATP białko transportu Kronemeyer i wsp., X81191
glutaminianu
(Glutamat-Transport
Journal
of
ATP- Bacteriology
bindendes Protein)
177(5):1152-8 (1995)
(wiążące ATP białko transportu
glutaminianu)
(glutamate transport ATP- binding
protein)
gluB
Białko wiążące glutaminian
Kronemeyer i wsp., X81191
(Glutamat-bindendes Protein)
Journal
(białko wiążące glutaminian)
Bacteriology
(glutamate binding protein)
177(5):1152-8
(1995)
of
35
Geny i odmiany alleliczne, które nie są niezbędne do wytwarzania metioniny
Nazwa Oznaczenie kodowanych Enzymów Odesłanie
Numer
genu
lub białek
dostępu
gluC
Permeaza transportu glutaminianu
Kronemeyer i wsp., X81191
(Glutamat-Transport Permease)
Journal
(permeaza
układu
transportu Bacteriology
glutaminianu )
(glutamate
of
177(5):1152-8 (1995)
transport
system
permease)
gluD
Permeaza transportu glutaminianu
Kronemeyer i wsp., X81191
(Glutamat-Transport Permease)
Journal
(permeaza
układu
transportu Bacteriology
glutaminianu)
(glutamate
of
177(5):1152-8 (1995)
transport
system
permease)
luxR
Regulator transkrypcyjny LuxR
W00100842
AX065953
(Transkriptionsregulator LuxR)
EP1108790
AX123320
EP1108790
AX123323
(regulator transkrypcyjny LuxR)
(transcription regulator LuxR)
luxS
Kinaza histydynowa LuxS
(Histidin-Kinase LuxS)
AX127153
(Kinaza histydynowa LuxS)
(histidine kinase LuxS)
lysR1
Regulator transkrypcyjny LysR1
(Transkriptionsregulator LysR1)
(Regulator transkrypcyjny LysR1)
(transcription regulator LysR1)
EP1108790
AX064673
AX127144
36
Geny i odmiany alleliczne, które nie są niezbędne do wytwarzania metioniny
Nazwa Oznaczenie kodowanych Enzymów Odesłanie
Numer
genu
lub białek
dostępu
lysR2
Aktywator transkrypcyjny LysR2
EP1108790
AX123312
Regulator transkrypcyjny LysR3
WO0100842
AX065957
(Transkriptionsregulator LysR3)
EP1108790
AX127150
Ligaza O-sukcynylobezoesan-CoA
WO0100843
AX064599
(O-Succinylbenzoesäure-CoA-
EP1108790
AX064193
(Transkriptionsaktivator LysR2)
(regulator transkrypcyjny LysR2)
(transcription regulator LysR2)
lysR3
(Regulator transkrypcyjny LysR3)
(transcription regulator LysR3)
menE
Ligase)
AX127144
EC 6.2.1.26
(Ligaza
O-sukcynylobezoesan-
CoA)
(O-succinylbenzoate-CoA ligase)
metD
Regulator transkrypcyjny MetD
EP1108790
(Transkriptionsregulator MetD)
AX123327
AX127153
(regulator transkrypcyjny MetD)
(transcription regulator MetD)
metK
Adenozylotransferaza metioniny
WO0100843
AX063959
(Methionin-Adenosyl-Transferase)
EP1108790
AX127148
EC 2.5.1.6
(syntetaza S-adenozylometioniny)
(S-adenosylmethionine synthetase)
37
Geny i odmiany alleliczne, które nie są niezbędne do wytwarzania metioniny
Nazwa Oznaczenie kodowanych Enzymów Odesłanie
Numer
genu
lub białek
dostępu
pck
Karboksykinaza
WO0100844
AJ269506
fosfoenolopirogronianowa
AX065053
(PhosphoenolpyruvatCarboxykinase)
(karboksykinaza
fosfoenolopirogronianowa)
(phosphoenolpyruvate
carboxykinase)
pgi
Izomeraza glukozo-6-fosforanowa
EP1087015
AX136015
(Glucose-6-Phosphat-Isomerase)
EP1108790
AX127146
Oksydaza pirogronianowa
W00100844
AX064959
(Pyruvat-Oxidase)
EP1096013
AX137665
Komórkowy czynnik wzrostu 2
EP1106693
AX113822
(Zellwachstumsfaktor 2)
EP1108790
AX127146
EC 5.3.1.9
(izomeraza glukozo-6-fosforanowa)
(glucose-6-phosphate isomerase)
poxB
EC 1.2.3.3
(oksydaza pirogronianowa)
(pyruvate oxidase)
zwa2
(czynnik wzrostu 2)
(growth factor 2)
[0058]
zwłaszcza
Ostatecznie, w celu wytwarzania aminokwasów,
L-metioniny,
korzystne
może
być,
oprócz
zmniejszania importu metioniny z otaczającej pożywki,
38
na przykład, do uzyskania poprzez atenuację jednego lub
wielu
genów
wybranych
z
grupy
yaeC,
abc
i
yaeE,
zapobieganie niepożądanym reakcjom ubocznym (Nakayama:
"Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms" in:
5
Overproduction
of
Microbial
Products,
Krumphanzl,
Sikyta, Vanek (wyd.) Academic Press, London, UK, 1982).
[0059]
Drobnoustroje
wytworzone
zgodnie
z
wynalazkiem także są przedmiotem wynalazku i w celu
wytwarzania L-aminokwasów mogą być hodowane w sposób
10
ciągły
albo
nieciągły
w
procesach
okresowych
albo
okresowych z zasilaniem, albo powtarzanych procesach
okresowych z zasilaniem. Podsumowanie znanych sposobów
hodowli
opisano
w
podręczniku
(Bioprozesstechnik
15
1.
Bioverfahrenstechnik),
autorstwa
Einführung
(Bioprocess
Chmiel
in
die
Technology
1.
Introduction to Bioprocess Technology) (Gustav Fischer
Verlag, Stuttgart (1991), albo podręczniku autorstwa
Lehrbuch
von
Storhas,
Bioreactoren
und
Periphere
Einrichtungen (Textbook by Storhas, (Bioreactors and
20
Ancillary
Equipment)
(Viewweg
Publishers,
Braunschweig/Wiesbaden (1994)).
[0060]
Pożywka hodowlana, która ma być zastosowana
musi spełniać w odpowiedni sposób wymogi odpowiednich
szczepów.
25
Opisy
pożywek
hodowlanych
dla
różnych
drobnoustrojów zawarto w podręczniku "Manual of Methods
for
General
Bacteriology"
Amerykańskiego
Towarzystwa
Bakteriologicznego (American Society for Bacteriology)
(Washington D.C., USA, (1981)).
[0061]
30
węglowodany,
Jako
takie
źródło
węgla
jak
glukoza,
stosuje
się
sacharoza,
cukry
i
laktoza,
fruktoza, maltoza, molasy, skrobia i celuloza; oleje i
39
tłuszcze, takie jak olej sojowy, olej słonecznikowy,
olej
z
orzeszków
ziemnych
i
olej
kokosowy;
kwasy
tłuszczowe, takie jak kwas palmitynowy, kwas stearynowy
i kwas linolowy; alkohole, takie jak glicerol i etanol
5
oraz kwasy organiczne, takie jak kwas octowy. Materiały
te można stosować oddzielnie albo jako mieszaniny.
[0062]
Jako źródła azotu można stosować związki
zawierające azot organiczny, takie jak pepton, ekstrakt
drożdżowy,
10
ekstrakt
mięsny,
ekstrakt
słodowy,
woda
kukurydziana (ang. maize water), mąka sojowa i mocznik,
albo związki nieorganiczne, takie jak siarczan amonu,
chlorek amonu, fosforan amonu, węglan amonu i azotan
amonu.
[0063]
15
Jako źródło fosforu można zastosować kwas
fosforowy, wodorofosforan potasowy albo wodorofosforan
dipotasowy,
albo
odpowiednie
sole
zawierające
sód.
Pożywka hodowlana musi ponadto zawierać sole metali,
które
są
magnezu
20
niezbędne
albo
dla
siarczan
wzrostu,
żelaza.
takie
jak
siarczan
Ostatecznie,
oprócz
materiałów wspomnianych powyżej, dodaje się materiały
wzrostowe, takie jak aminokwasy i witaminy. Do pożywki
hodowlanej
można
też
dodać
odpowiednie
prekursory.
Materialy dodatkowe można dodawać do hodowli w postaci
pojedynczych wsadów albo można nimi zasilać hodowlę w
25
odpowiedni sposób podczas sposobu hodowli.
[0064]
odpowiedni
W celu kontroli pH hodowli można zastosować w
sposób
związki
zasadowe,
takie
jak
wodorotlenek sodowy, wodorotlenek potasowy, amoniak lub
woda amoniakalna, albo związki kwasowe, takie jak kwas
30
fosforowy albo kwas siarkowy. W celu kontroli pienienia
stosuje się środki przeciwpienne, takie jak na przykład
40
estry
poliglikolowe
utrzymania
dodawać
stabilności
selektywnie
antybiotyki.
5
kwasów
W
tłuszczowych.
plazmidu
działające
celu
do
W
pożywki
materiały,
utrzymania
celu
można
takie
warunków
jak
aerobowych
hodowlę można zasilać tlenem albo mieszaninami gazów
zawierającymi tlen, takimi jak powietrze. Temperatura
hodowli
wynosi
korzystnie
pomiędzy
kontynuuje
10
zazwyczaj
się
aż
25
do
pomiędzy
a
40
20
°C.
wytworzenia
a
45°C,
Sposób
a
hodowli
maksymalnej
ilości
pożądanego produktu.
[0065]
Cel
ten
zostanie
osiągnięty
zazwyczaj
w
przeciągu 100 do 160 godzin.
[0066]
Za pomocą sposobów według wynalazku wydajność
produkcyjna
15
bakterii
albo
procesu
fermentacji
w
odniesieniu do stężenia produktu (produkt na jednostkę
objętości), wydajności wytwarzania produktu (wytworzony
produkt
na
wykorzystane
węgla),
źródło
wytwarzania
produktu (wytworzony produkt na jednostkę objętości w
czasie),
20
albo
kombinacji
innych
można
parametrów
poprawić
o
co
procesu
najmniej
i
0,5
ich
%,
co
najmniej 1 %, albo co najmniej 2 %.
[0067]
Sposobu oznaczania L-aminokwasów są znane w
dziedzinie. Analizy można przeprowadzić tak jak opisano
w publikacji Spackmann i wsp. (Analytical Chemistry,
25
30,
(1958),
1185-1190)
za
pomocą
chromatografii
anionowymiennej, a następnie derywatyzacji ninhydryną,
albo można je przeprowadzić za pomocą HPLC z odwróconą
fazą
jak
(Analytical
30
opisano
w
Chemistry
publikacji
(1979)
Lindroth
51:
i
wsp.
1167-1174).
Specjaliści w dziedzinie znajdą również informacje na
ten temat w publikacji Ashman i wsp. (in Tschesche
41
(Hrsg), Modern Methods in Protein Chemistry, 155-172,
de Gruyter, Berlin 1985).
[0068]
Sposób według wynalazku służy do wytwarzania
L-metioniny poprzez fermentację.
5
[0069]
można,
Stężenie L-metioniny w produkcie końcowym
jeżeli
jest
to
konieczne,
uzupełnić
dodanie L-metioniny do pożądanego poziomu.
10
15
20
25
30
poprzez
42
Zastrzeżenia patentowe
5
1.
Sposób
fermentację
których
wytwarzana
rekombinowanych
jeden
albo
wiele
L-metioniny
bakterii
genów
przez
coryneform,
yaeC,
abc
i
w
yaeE,
kodujących układ absorpcji metioniny MetD2 poddaje się
atenuacji, przy czym gen yaeC koduje peryplazmatyczne
10
białko wiążące YaeC; gen abc koduje wiążące ATP białko
ABC, a gen yaeE koduje permeazę YaeE.
2.
Sposób ferentacyjnego wytwarzania L-metiony
według zastrz. 1, obejmujący następujące etapy:
a)
15
wzbogacania
L-metioniny
w
pożywce
albo
w
komórkach bakteryjnych, i
b)
izolacji
ewentualnie,
wspomnianego
składniki
bulionu
aminokwasu,
przy
fermentacyjnego
czym
i/lub
biomasy pozostają albo w całości, albo w częściach w
produkcie końcowym.
20
3.
tym,
Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny
obniża
że
się
polinukleotydu(polinukleotydów),
25
który
kodują)
składniki
poboru
metioniny
pożywki,
wybranych
spośród
genów
koduje(które
z
yaeC,
otaczającej
abc
i
yale,
kodujących układ poboru metioniny.
4.
tym,
że
Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny
zmniejsza
katalityczne
które
30
ekspresję
yaeE.
się
właściwości
polipeptydów
kodowane
są
przez
(białek
regulacyjne
i/lub
enzymatycznych),
polinukleotydy
yaeC,
abc
i
43
5.
tym,
Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny
że
coryneform
samym
5
w
celu
poddaje
czasie
wytwarzania
się
L-metioniny
fermentacji,
wzmacnia
się,
w
bakterie
której
zwłaszcza
w
tym
poddaje
nadekspresji, jeden lub wiele genów wybranych z grupy
wymienionej w Tabeli 1:
Nazwa Oznaczenie kodowanych enzymów lub białek
accBC Karboksylaza acylo-CoA
(Acyl-CoA Carboxylase)
EC 6.3.4.14
(karboksylaza acylo-CoA)
(acyl-CoA carboxylase)
accDA Karboksylaza acetylo-CoA
(Acetyl-CoA Carboxylase)
EC 6.4.1.2
(karboksylaza acetylo-CoA)
(acetyl-CoA carboxylase)
aecD
Beta-liaza cystationiny
(Cystathionin beta-Lyase)
EC 4.4.1.8
(beta-liaza cystationiny)
(cystathionine beta-lyase)
cstA
Białko głodu węglowego A
(Carbon Starvation Protein A)
(białko głodu węglowego A)
(carbon starvation protein A)
44
Nazwa Oznaczenie kodowanych enzymów lub białek
cysD
Adenylilotransferaza siarczanowa podjednostka II
(Sulfat-Adenylyltransferase Untereinheit II)
EC 2.7.7.4
(adenylilotransferaza siarczanowa krótkołańcuchowa)
(sulfate adenylyltransferase small chain)
cysE
Acetylotransferaza serynowa
(Serinacetyltransferase)
EC 2.3.1.30
(acetylotransferaza serynowa)
(serine acetyltransferase)
cysH
Reduktaza 3'-fosfoadenylosiarczanowa
(3'-Phosphoadenylsulfat Reduktase)
EC 1.8.99.4
(Reduktaza 3'-fosfoadenozyno-5'-fosfosiarczanowa)
(3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate reductase)
cysK
Syntaza cysteinowa
(Cystein-Synthase)
EC 4.2.99.8
(syntaza cysteinowa)
(cysteine synthase)
cysN
Adenylilotransferaza siarczanowa podjednostka I
(Sulfat-Adenylyltransferase Untereinheit I)
EC 2.7.7.4
(adenylilotransferaza siarczanowa)
(sulfate adenylyltransferase)
cysQ
Białko transportowe CysQ
(Transportprotein CysQ)
45
Nazwa Oznaczenie kodowanych enzymów lub białek
(transporter cysQ)
(transporter cysQ)
dps
Białko ochronne DNA
(DNA-Protection Protein)
(białko ochronne podczas głodzenia)
(protection during starvation protein)
eno
Enolaza
(Enolase)
EC 4.2.1.11
(enolaza)
(enolase)
fda
Aldolaza fruktozobisfosforanowa
(Fruktose Bisphosphat Aldolase)
EC 4.1.2.13
(aldolaza fruktozobisfosforanowa)
(fructose bisphosphate aldolase)
gap
Dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanowa
(Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase)
EC 1.2.1.12
(dehydrogenaza
gliceraldehydo-3-fosforanowa)
(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)
gap2
Dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanowa
(Glyceraldehyd-3-Phosphate Dehydrogenase)
EC 1.2.1.12
46
Nazwa Oznaczenie kodowanych enzymów lub białek
(dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanowa 2)
(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 2)
gdh
Dehydrogeneza glutaminianowa
(Glutamat Dehydrogenase)
EC 1.4.1.4
(dehydrogeneza glutaminianowa)11
(glutamate dehydrogenase) 11
glyA
Hydroksymetylotransferaza glicynowa/serynowa
(Glycine/Serin Hydroxymethyltransferase)
EC 2.1.2.1
(hydroksymetylotransferaza glicynowa/serynowa)
(glycine/serine hydroxymethyltransferase)
gnd
Dehydrogenaza 6-fosfoglukonianowa
(6-Phosphogluconat Dehydrogenase)
EC 1.1.1.44
(dehydrogenaza 6-fosfoglukonianowa)
(6-phosphogluconate dehydrogenase)
hom
Dehydrogenaza homoserynowa
(Homoserin Dehydrogenase)
EC 1.1.1.3
(dehydrogenaza homoserynowa)
(homoserine dehydrogenase)
homFBR Dehydrogenaza homoserynowa oporna na sprzężene zwrotne (fbr)
(Homoserin Dehydrogenase feedback resistent (fbr)
EC 1.1.1.3
(dehydrogenaza homoserynowa fbr)
(homoserine dehydrogenase fbr))
47
Nazwa Oznaczenie kodowanych enzymów lub białek
lysC
Kinaza asparaginianowa
(Aspartatkinase)
EC 2.7.2.4
(kinaza asparaginianowa)
(aspartate kinase)
lysCFBR Kinaza asparaginianowa oporna na sprzężenie zwrotne (fbr)
(Aspartatkinase feedback resistent (fbr))
EC 2.7.2.4
(kinaza asparaginianowa fbr)
(aspartate kinase fbr)
metA
Acetylotransferaza homoserynowa
(Homoserin Acetyltransferase)
EC 2.3.1.31
(acetylotransferaza homoserynowa)
(homoserine acetyltransferase)
metB
γ-Liaza cystationiny
(Cystahionin γ-Lyase)
EC 4.4.1.1
(gamma-syntaza cystationiny)
(cystathionine gamma-synthase)
metE
Metylotransferaza homocysteinowa
(Homocystein-Methyltransferase)
EC 2.1.1.14
(metylotransferaza homocysteinowa)
(homocysteine methyltransferase)
metH
Metylotransferaza homocysteinowa (zależna od witaminy B12)
(Homocystein-Methyltransferase (Vitamin B12 abhängig))
48
Nazwa Oznaczenie kodowanych enzymów lub białek
EC 2.1.1.14
(metylotransferaza homocysteinowa)
(homocysteine methyltransferase)
metY
Sulfohydrolaza acetylohomoseryny
(Acetylhomoserin Sulfhydrolase)
(sulfohydrolaza acetylohomoserynowa)
(acetylhomoserine sulfhydrolase)
msiK
Importer cukrów
(Zuckerimporter)
(złożone białko importu cukrów)
(multiple sugar import protein)
opcA
Dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa
(Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase)
(podjednostka dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej)
(subunit of glucose-6-phosphate dehydrogenase)
oxyR
Regulator transkrypcyjny
(Transcriptionsregulator)
(regulator transkrypcyjny)
(transcriptional regulator)
ppcFBR Karboksylaza fosfoenolopirogronianowa oporna na sprzężenie zwrotne
(Phosphoenolpyruvat Carboxylase feedback resistant)
EC 4.1.1.31
(karboksylaza fosfoenolopirogronianowa oporna na sprzężenie zwrotne)
(phosphoenolpyruvate carboxylase feedback resistant)
ppc
Karboksylaza fosfoenolopirogronianowa
(Phosphoenolpyruvat Carboxylase)
EC 4.1.1.31
49
Nazwa Oznaczenie kodowanych enzymów lub białek
(karboksylaza fosfoenolopirogronianowa)
(phosphoenolpyruvate carboxylase)
pgk
Kinaza fosfoglicerynianowa
(Phosphoglycerat Kinase)
EC 2.7.2.3
(kinaza fosfoglicerynianowa)
(phosphoglycerate kinase)
pknA
Kinaza białkowa A
(Protein kinase A)
(kinaza białkowa A)
(protein kinase A)
pknB
Kinaza białkowa B
(Protein kinase B)
(kinaza białkowa B)
(protein kinase B)
pknD
Kinaza białkowa D
(Protein kinase D)
(kinaza białkowa D)
(protein kinase D)
pknG
Kinaza białkowa G
(Protein kinase G)
(kinaza białkowa G)
(protein kinase G)
ppsA
Syntaza fosfoenolopirogronianowa
(Phosphoenolpyruvat-Synthase)
EC 2.7.9.2
50
Nazwa Oznaczenie kodowanych enzymów lub białek
(syntaza fosfoenolopirogronianowa)
(phosphoenolpyruvate synthase)
ptsH
Białko H układu fosfotransferazy
(Phosphotransferase System Protein H)
EC 2.7.1.69
(składnik H układu fosfotransferazy)
(phosphotransferase system component H)
ptsI
Enzym I układu fosfotransferazy
(Phosphotransferase System Enzym I)
EC 2.7.3.9
(enzym I układu fosfotransferazy)
(phosphotransferase system enzyme I)
ptsM
Swoisty dla glukozy enzym II układu fosfotransferazy
(Glukose spezifisches Phosphotransferase System Enzym II)
EC 2.7.1.69
(enzym II układu glukozo-fosfotransferazy)
(glucose-phosphotransferase-system enzyme II)
pyc
Karboksylaza pirogronianowa
(Pyrvat-Carboxylase)
EC 6.4.1.1
(karboksylaza pirogronianowa)
(pyrvate carboxylase)
pyc
Karboksylaza pirogronianowa
P458S
(Pyrvat-Carboxylase)
EC 6.4.1.1
(karboksylaza pirogronianowa)
(pyrvate carboxylase)
51
Nazwa Oznaczenie kodowanych enzymów lub białek
(Wymiana aminokwasu P458S)
(Amino acid exchange P458S)
sigC
Czynnik sigma C
(Sigmafaktor C)
EC 2.7.7.6
(alternatywny czynnik sigma C funkcji poza cytoplazmatycznej)
(extracytoplasmic function alternative sigma factor C)
sigD
Czynnik sigma D polimerazy RNA
(RNA Polymerase Sigmafaktor D)
EC 2.7.7.6
(czynnik sigma D polimerazy RNA)
(RNA polymerase sigma factor)
sigE
Czynnik sigma E
(Sigmafaktor E)
EC 2.7.7.6
(alternatywny czynnik sigma E funkcji poza cytoplazmatycznej)
(extracytoplasmic function alternative sigma factor E)
sigH
Czynnik sigma H
(Sigmafaktor H)
EC 2.7.7.6
(czynnik sigma SigH)
(sigma factor SigH)
sigM
Czynnik sigma M
(Sigmafaktor M)
EC 2.7.7.6
(czynnik sigma SigM)
(sigma factor SigM)
52
Nazwa Oznaczenie kodowanych enzymów lub białek
tal
Transaldolaza
(Transaldolase)
EC 2.2.1.2
(transaldolaza)
(transaldolase)
thyA
Syntaza tymidylanowa
(Thymidylat Synthase)
EC 2.1.1.45
(syntaza tymidylanowa)
(thymidylate synthase)
tkt
Transketolaza
(Transketolase)
EC 2.2.1.1
(transketolaza)
(transketolase)
tpi
Izomeraza triozo-fosforanowa
(Triose-phosphat Isomerase)
EC 5.3.1.1
(izomeraza triozo-fosforanowa)
(triose-phosphate isomerase)
zwa1
Czynnik wzrostu komórek 1
(Zellwachstumsfaktor 1)
(czynnik wzrostu 1)
(growth factor 1)
zwf
Dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa
(Glukose-6-phosphat-1-Dehydrogenase)
EC 1.1.1.49
53
Nazwa Oznaczenie kodowanych enzymów lub białek
(dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa)
(glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase)
zwf
Dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa
A213T (Glukose-6-phosphat-1-Dehydrogenase)
EC 1.1.1.49
(dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa)
(glucose-6-phosphate-1-dehydrogenase)
(wymiana aminokwasów? A213T)
(amino acid exchange ? A213T)
6.
tym,
że
Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny
w
celu
wytwarzania
L-metioniny
poddaje
się
fermentacji drobnoustroje coryneform, w których w tym
5
samym
czasie
poddaje
się
atenuacji
jeden
lub
wiele
genów wybranych z grupy wymienionej w Tabeli 2:
Geny i odmiany alleliczne, które nie są niezbędne do wytwarzania metioniny
Nazwa genu Oznaczenie kodowanych Enzymów lub białek
brnQ
Białko nośnikowe rozgałęzionych aminokwasów
(Carrier-Protein verzweigtkettiger Aminosäuren)
(Białko nośnikowe układu transportu rozgałęzionych aminokwasów)
(branched-chain amino acid transport system carrier protein)
ccpA1
Białko kontroli katabolicznej
(Katabolit-Kontroll-Protein)
(białko kontroli katabolicznej A1)
(catabolite control protein A1)
54
Geny i odmiany alleliczne, które nie są niezbędne do wytwarzania metioniny
Nazwa genu Oznaczenie kodowanych Enzymów lub białek
ccpA2
Białko kontroli katabolicznej
(Katabolit-Kontroll-Protein)
(białko kontroli katabolicznej A2)
(catabolite control protein A2)
citA
Kinaza sensorowa CitA
(Sensor-Kinase CitA)
(kinaza sensorowa CitA)
(sensor kinase CitA)
citB
Regulator transkrypcyjny CiB
(Transkriptionsregulator CitB)
(regulator transkrypcyjny CitB)
(transcription regulator CitB)
citE
Liaza cytrynianowa
(Citrat-Lyase)
EC 4.1.3.6
(liaza cytrynianowa)
(citrate lyase)
ddh
Dehydrogenaza diaminopimelinianowa
(Diaminopimelat-Dehydrogenase)
EC 1.4.1.16
(dehydrogenaza diaminopimelinianowa)
(diaminopimelate dehydrogenase)
gluA
Wiążące ATP białko transportu glutaminianu
(Glutamat-Transport ATP-bindendes Protein)
(wiążące ATP białko transportu glutaminianu)
(glutamate transport ATP- binding protein)
55
Geny i odmiany alleliczne, które nie są niezbędne do wytwarzania metioniny
Nazwa genu Oznaczenie kodowanych Enzymów lub białek
gluB
Białko wiążące glutaminian
(Glutamat-bindendes Protein)
(białko wiążące glutaminian)
(glutamate binding protein)
gluC
Permeaza transportu glutaminianu
(Glutamat-Transport Permease)
(permeaza układu transportu glutaminianu)
(glutamate transport system permease)
gluD
Permeaza transportu glutaminianu
(Glutamat-Transport Permease)
(permeaza układu transportu glutaminianu)
(glutamate transport system permease)
luxR
Regulator transkrypcyjny LuxR
(Transkriptionsregulator LuxR)
(regulator transkrypcyjny LuxR)
(transcription regulator LuxR)
luxS
Kinaza histydynowa LuxS
(Histidin-Kinase LuxS)
(Kinaza histydynowa LuxS)
(histidine kinase LuxS)
lysR1
Regulator transkrypcyjny LysR1
(Transkriptionsregulator LysR1)
(Regulator transkrypcyjny LysR1)
(transcription regulator LysR1)
lysR2
Aktywator transkrypcyjny LysR2
(Transkriptionsaktivator LysR2)
56
Geny i odmiany alleliczne, które nie są niezbędne do wytwarzania metioniny
Nazwa genu Oznaczenie kodowanych Enzymów lub białek
(regulator transkrypcyjny LysR2)
(transcription regulator LysR2)
lysR3
Regulator transkrypcyjny LysR3
(Transkriptionsregulator LysR3)
(Regulator transkrypcyjny LysR3)
(transcription regulator LysR3)
menE
Ligaza O-sukcynylobezoesan-CoA
(O-Succinylbenzoesäure-CoA-Ligase)
EC 6.2.1.26
(Ligaza O-sukcynylobezoesan-CoA)
(O-succinylbenzoate-CoA ligase)
metD
Regulator transkrypcyjny MetD
(Transkriptionsregulator MetD)
(regulator transkrypcyjny MetD)
(transcription regulator MetD)
metK
Adenozylotransferaza metioniny
(Methionin-Adenosyl-Transferase)
EC 2.5.1.6
(syntetaza S-adenozylometioniny)
(S-adenosylmethionine synthetase)
pck
Karboksykinaza fosfoenolopirogronianowa
(Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase)
(karboksykinaza fosfoenolopirogronianowa)
(phosphoenolpyruvate carboxykinase)
pgi
Izomeraza glukozo-6-fosforanowa
(Glucose-6-Phosphat-Isomerase)
57
Geny i odmiany alleliczne, które nie są niezbędne do wytwarzania metioniny
Nazwa genu Oznaczenie kodowanych Enzymów lub białek
EC 5.3.1.9
(izomeraza glukozo-6-fosforanowa)
(glucose-6-phosphate isomerase)
poxB
Oksydaza pirogronianowa
(Pyruvat-Oxidase)
EC 1.2.3.3
(oksydaza pirogronianowa)
(pyruvate oxidase)
zwa2
Komórkowy czynnik wzrostu 2
(Zellwachstumsfaktor 2)
(czynnik wzrostu 2)
(growth factor 2)
7.
Sposób według jednego lub więcej z zastrz.
1 do 6, znamienny tym, że stosuje się drobnoustroje
typu corynebacterium glutamicum.
5
8.
Rekombinowane
bakterie
coryneform,
w
których jeden lub wiele genów, wybranych z grupy yaeC,
abc i yaeE, które kodują pobór metioniny z otaczającej
pożywki,
kodujących
układ
poboru
metioniny
MetD2,
poddany jest (poddane są) atenuacji, w porównaniu z
10
wyjściowym organizmem bez atenuowanego układu poboru
metioniny
MetD2,
przy
czym
gen
yaeC
koduje
peryplazmatyczne białko wiążące YaeC, gen abC koduje
wiążące ATP białko ABC, a gen yaeE koduje permeazę
YaeE.
15
Evonik Degussa GmbH
Pełnomocnik: