(11) PL/EP 1851239 PL/EP 1851239 T3

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12)
(96)
TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO
Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:
10.02.2006 06706871.8
(97)
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej
Polskiej
(19)
PL
(11)
PL/EP 1851239
(13)
T3
(51) Int. Cl.
C07K14/115
C12N15/86
A61K48/00
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono:
21.01.2009 Europejski Biuletyn Patentowy 2009/04
EP 1851239 B1
(54) Tytuł wynalazku:
Wirusy RNA defektywne pod względem replikacji
(30) Pierwszeństwo:
DE200510006388
11.02.2005
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
07.11.2007 Europejski Biuletyn Patentowy 2007/45
(45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:
31.07.2009 Wiadomości Urzędu Patentowego 07/2009
(73) Uprawniony z patentu:
MAX-PLANCK-GESELLSCHAFT ZUR FÖRDERUNG DER WISSENSCHAFTEN E.V., München, DE
(72) Twórca (y) wynalazku:
PL/EP 1851239
T3
NEUBERT Wolfgang J., Greifenberg, DE
BOSSOW Sascha, Augsburg, DE
SCHLECHT Sabine, München, DE
(74) Pełnomocnik:
Przedsiębiorstwo Rzeczników Patentowych Patpol Sp. z o.o.
rzecz. pat. Kossowska Janina
02-770 Warszawa 130
skr. poczt. 37
Uwaga:
W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw
dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą
wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
EP 1851 239 B1
Opis
[0001] Niniejszy wynalazek dotyczy wirusa RNA zawierającego RNA z nicią o ujemnej polarności z
defektywną replikacją i kompetentnego pod względem transkrypcji, który może być stosowany do ekspresji
transgenów, a szczególnie w dziedzinie opracowania szczepionek.
[0002] Immunizacje żywymi szczepionkami przypominają naturalne zakażenie i wywołują rozległą
odpowiedź immunologiczną. Do szczepienia stosowane są osłabione, ale żywotne wirusy. Namnażanie się
wirusów ze szczepionki musi zachodzić tak powoli, że możliwa jest odpowiedź immunologiczna i w ten
sposób kontrola rozmnażania i/lub eliminacja wirusa. Koncepcja żywej szczepionki wielokrotnie sprawdziła
się u różnych grup wiekowych. Jednak istnieją ważne grupy docelowe, u których szczepienia żywymi
szczepionkami są problematyczne i wymagają dodatkowych środków bezpieczeństwa: przeciwciała matki
chronią niemowlęta w pierwszych miesiącach życia. Stanowią równocześnie barierę, która musi być
przezwyciężona przy immunizacji żywą szczepionką jednak bez dopuszczenia do nadmiernego namnażania
się wirusa ze szczepionki i związanych z tym niepożądanych efektów szczepienia. Kolejną grupę docelową
stanowią osoby starsze, których układ odpornościowy nie jest już tak sprawny, tak że może dojść do
przeciążenia przez szczepienie, a zwiększone namnażanie się wirusa szczepionkowego może prowadzić do
niepożądanych konsekwencji. Powstaje więc problem, jak znakomite pod względem immunologicznym żywe
szczepionki uczynić jeszcze bezpieczniejszymi w określonych grupach docelowych, ale także by polepszyć
profil bezpieczeństwa przy ogólnych zastosowaniach.
[0003] Wirusy zawierające RNA z nicią o ujemnej polarności, takie jak wirus wścieklizny lub wirus Sendai
(SeV) od wielu lat można celowo zmieniać za pomocą odwrotnej inżynierii genetycznej. W EP-A-0 702 085
opisano przygotowanie zrekombinowanych, zakaźnych replikujących niesegmentalnych wirusów
zawierających RNA o ujemnej polarności ze sklonowanego cDNA. EP-A-0 863 202 opisuje zrekombinowany
wirus Sendai, w którego genomie wstawiono heterologiczny gen albo wydeletowano lub inaktywowano gen,
u którego jednak replikacja genomu jest nadal nienaruszona.
[0004] Jako podstawa szczepionki szczególnie odpowiednie są wirusy zawierające RNA o ujemnej
polarności, ponieważ ich namnażanie zachodzi w cytoplazmie na poziomie RNA i łatwo jest wymienić geny
w obrębie genomu wirusa. Udało się już z powodzeniem wytworzenie zrekombinowanych wirusów z białkami
powierzchniowymi różnych typów wirusów i zastosowanie ich jako szczepionek w badaniach na zwierzętach
(Schmidt i wsp., J. Virol. 75(2001), 4594-4603 i WO 01/42445). Przez wbudowanie technikami rekombinacji
białek F i HN ludzkiego wirusa paragrypy typ 3 (HPIV 1)i białek G lub F wirusa syncytium oddechowego
(Respiratory Syncytial Virus (RSV)) w wektorze na podstawie bydlęcego wirusa paragrypy typu 3 (BPIV 3)
udało się, po zastosowaniu u chomików, wykazać odpowiedź immunologiczną śluzówek przeciw HPIV 3 i
RSV. W ten sposób już uzyskano biwalentną antygenowość tej testowanej u zwierząt żywej szczepionki.
[0005] Ze względu na włączenie bariery gatunkowej ten bydlęcy wirus paragrypy z antygenami
powierzchniowymi PIV 3 i RSV powinien już być wystarczająco atenuowany do zastosowania u ludzi. Nie
oczekuje się rewersji do typu dzikiego, ponieważ wymieniono całe geny dla białek powierzchniowych wirusa.
Rozpoczęto już próby kliniczne szczepionki.
[0006] Ponieważ opisane mutanty wirusów są jednak kompetentne pod względem replikacji, u osoby
szczepionej na pewno zachodzi namnażanie wirusów, którego intensywność jest wprawdzie osłabiona, ale
1
EP 1851 239 B1
nie całkowicie wyłączona. Siła oczekiwanej wiremii i przez to obciążenie osoby szczepionej działaniami
niepożądanymi zależą przy tym od indywidualnych czynników.
[0007] W zakresie niniejszego wynalazku zostanie podjęta próba znaczącego zmniejszenia zagrożenia
szczepień żywymi szczepionkami, w szczególności zagrożenia dla szczepionych osób z określonych grup
docelowych.
[0008] Jedno podejście, polega na supresji replikacji genomu wirusa po zastosowaniu szczepionki. W ten
sposób niezależnie od immunologicznych możliwości osoby szczepionej, nie dojdzie do namnażania wirusa
i odpowiednich zmian po szczepieniu.
[0009] W tym podejściu podstawowa trudność polega na tym, że wirusowa polimeraza RNA ma dwie role,
syntezę wirusowego mRNA i namnażanie genomów wirusa. To połączenie musi być zniesione w nowej
szczepionce, ponieważ szczepionka powinna być tylko w stanie prowadzić syntezę wirusowego mRNA.
[0010] Dalszy problem polega na tym, że zrekombinowany wirus musi przeprowadzać wydajną syntezę
wirusowego mRNA, aby w ogóle był odpowiedni jako żywa szczepionka. Istnieją dwa podstawowe
wzajemnie sprzeczne wymagania, w wyniku których można oczekiwać znacznych trudności przy
wytwarzaniu bezpiecznych, ale wydajnych żywych szczepionek na podstawie wirusów zawierających RNA o
ujemnej polarności.
[0011] Shoji i wsp. (Virology 318 (2004), 295-305) opisują wytwarzanie i charakterystykę wirusa wścieklizny
pozbawionego genu P. Wytworzenie wirusa odbywa się za pomocą komórek pomocniczych wyrażających
białko P. Wirusy bez syntezy de novo białka P są zdolne wyłącznie do pierwotnej transkrypcji. Niska
ekspresja genu wirusa jest widoczna przez bardzo słaby sygnał dla białka N w immunofluorescencji i tylko w
bardzo niewielu komórkach, a przekonujące wykazanie tej niskiej ekspresji genu wirusa przeprowadza się za
pomocą analizy PCR. Zastosowanie tego mutanta wirusa w próbie prowokacji w modelu mysim ma
wykazywać ochronę, ale brakuje eksperymentu kontrolnego z nieaktywnym transkrypcyjnie wirusem i
przedział czasowy dla prowokacji wirusem jest zbyt krótki. Nie badano czasu trwania przypuszczalnej
ochrony. Zastosowanie takich mutantów wirusa dla opracowania atenuowanej szczepionki przeciwko
wściekliźnie wydaje się więc mało obiecujące.
[0012] W zakresie badań, które doprowadziły do niniejszego wynalazku , stwierdzono, że u
paramyksowirusów rozdzielenie funkcji replikacji i transkrypcji można uzyskać przez częściowe usunięcie
składników polimerazy, które są istotne dla funkcji replikacji genomu. Może to obejmować wirusowe białko P
lub specjalną domenę funkcjonalną takiego białka.
[0013] Zadziwiająco stwierdzono, że przez mutacje, w których funkcja białek kodowanych przez wirusowy
gen P jest wydeletowana częściowo a nie całkowicie, można wytworzyć wirusy RNA z defektywną replikacją,
które mają wystarczającą funkcję transkrypcji, aby być odpowiednie do wytworzenia żywych szczepionek.
[0014] Jednym przedmiotem niniejszego wynalazku jest więc zrekombinowany wirus zawierający RNA o
ujemnej polarności, który jest defektywny pod względem replikacji i kompetentny pod względem transkrypcji.
Wirus według wynalazku zawiera genom wirusa z mutacją w genie P, przy czym mutacja prowadzi do utraty
replikacji genomu bez utraty zdolności do wtórnej transkrypcji.
[0015] Wirus według wynalazku jest punktem wyjścia do produkcji żywych szczepionek, w szczególności do
wytworzenia żywych szczepionek z podwyższonym profilem bezpieczeństwa, które są szczególnie
odpowiednie do stosowania u pacjentów z grup wysokiego ryzyka ze słabym lub uszkodzonym układem
odpornościowym.
2
EP 1851 239 B1
[0016] Wynalazek dotyczy także nukleokapsydu zrekombinowanego wirusa, obejmującego nić wirusowego
RNA o ujemnej polarności, skompleksowaną z białkami N, L i P jak i nić RNA o ujemnej polarności
zrekombinowanego wirusa w postaci izolowanej.
[0017] Dalszym przedmiotem wynalazku jest cDNA, który koduje RNA z nicią o ujemnej polarności według
wynalazku, w szczególności wirusowy RNA i/lub RNA do niego komplementarny.
[0018] Jeszcze kolejnym przedmiotem jest linia komórkowa do namnażania zrekombinowanego wirusa
zawierającego RNA o ujemnej polarności według wynalazku.
[0019] Wirus zawierający RNA o ujemnej polarności według wynalazku można uzyskać przez mutację
wirusa wyjściowego w genie P. Wirus wyjściowy może być naturalnym wirusem zawierającym RNA o
ujemnej polarności, w szczególności z rodzin Paramyxoviridae lub Rhabdoviridae lub ich zrekombinowanymi
wariantami. Szczególnie korzystnymi przedstawicielami są Paramyksowirusy, np. wirus Sendai, ludzki lub
bydlęcy wirus paragrypy, np. ludzki wirus paragrypy (hPIV) typ 1, 2, 3, 4a lub 4b, wirus choroby Newcastle,
wirus świnki, wirus odry lub wirus ludzkiego syncytium oddechowego (hRSV), lub Rhabdowirusy, np. wirus
pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV). Szczególnie korzystnie wirus jest wirusem Sendai, np.
szczep Fushimi (ATCC VR105). Dalej wynalazek objmuje także zrekombinowane warianty wymienionych
wirusów, jak np. opisano w EP-A 702 085, EP-A-0 863 202 lub WO 01/42445.
[0020] Dalsze korzystne wirusy zawierające RNA o ujemnej polarności są przedstawicielami Rhabdoviridae,
Filoviridae, Bomaviridae, Arenaviridae lub Bunyaviridae, np. VSV.
[0021] Wirus Sendai jest – podobnie jak inne paramyksowirusy – wirusem z otoczką z helikalnym
nukleokapsydem (Fig. 1). Otoczka składa się z membrany lipidowej, która pochodzi z błony plazmatycznej
komórki gospodarza, z której był uwolniony wirus. W otoczce wirusa są zakotwiczone glikoproteiny
transbłonowe, a mianowicie białko fuzji (F) i hemaglutynina-neuramidaza (HN). Białko macierzy (M) pokrywa
wewnętrzną stronę membrany. Zawarty w otoczce nukleokapsyd składa się z jednoniciowego DNA w
kompleksie z nukleoproteiną (N), przy czym po 6 nukleotydów RNA jest wiązanych przez jedno białko N,
zależną od RNA polimerazę RNA (L) i kofaktor fosfobiałka (P).
[0022] Genom RNA o ujemnej polarności wirusa Sendai zawiera geny 6 białek strukturalnych w kolejności:
3’-N-P/C-M-F-HN-L-5’ (Fig. 2). Gen P/C koduje w sumie 8 białek, strukturalne fosfobiałko i wszystkie
dotychczas poznane białka nie będące białkami strukturalnymi.
[0023] Białka P, N i L są istotne dla funkcjonalnej transkrypcji i replikacji (Lamb i wsp., Paramyxoviridae:
The Viruses and their Replication. Fields Virology. wydanie 4 (2001), Lippincott, Williams & Wilkins,
Filadelfia, 1305-1340).
[0024] Zrekombinowany wirus zawierający RNA o ujemnej polarności według wynalazku zawiera mutację w
genie P. Mutacja może być delecją, podstawieniem i/lub insercją w genie P, która powoduje defektywną
replikację wirusa, ale nie niszczy zdolności do transkrypcji. Mutacja dotyczy korzystnie częściowej sekwencji
białka kodowanego przez gen P, które jest potrzebne do replikacji, podczas gdy inne częściowe sekwencje
niezbędne do transkrypcji pozostają zachowane.
[0025] W wynalazku zrekombinowany wirus wykazuje mutację w genie P, mianowicie w N-końcowej części
sekwencji genu P. Mutacja dotyczy korzystnie przynajmniej regionu aminokwasów 33-41 białka P, które są
istotne dla zdolności do replikacji. Dalej jest korzystne, żeby region C-końcowy (od aminokwasu 320) nie
wykazywał mutacji uszkadzających funkcję transkrypcji. Szczególnie korzystna jest mutacja w regionie
aminokwasów 2-77 prowadząca do utraty zdolności do replikacji, na przykład delecja (a)aminokwasów 2-77
3
EP 1851 239 B1
kodowanego przez gen P białka lub (b) części sekwencji (a) wystarczającej do utraty zdolności do replikacji.
Odpowiednie mutacje mogą być też wprowadzane w białkach P innych wirusów zawierających RNA o
ujemnej polarności, np. innych paramyksowirusów, np. hPIV3.
[0026] Zrekombinowany wirus według wynalazku jest defektywny pod względem replikacji i kompetentny
pod względem transkrypcji. Utrata zdolności do replikacji oznacza, że w komórce docelowej (komórce, która
nie zapewnia żadnych wydeletowanych przez mutację funkcji w trans) nie stwierdzono wykrywalnego
namnażania się genomu wirusa, a w odróżnieniu od zmniejszonej lub warunkowej defektywności replikacji
także nie istnieją żadne warunki permisywne, w których mogłaby zachodzić replikacja. Utratę zdolności do
replikacji można oznaczyć, jak opisano w Przykładzie 8. Wirus według wynalazku jest jednak w stanie po
zakażeniu transkrybować w komórce docelowej kodowane przez niego produkty genów tak, że zachodzi
ekspresja białek wirusa obejmujących jeden lub więcej heterologicznych produktów genu w komórce
docelowej. Jest istotne, że zrekombinowany wirus według wynalazku posiada zdolność do transkrypcji
wtórnej, to znaczy produkty genów wirusowych, które powstają w wyniku pierwotnej transkrypcji ze
składnikami białkowymi oryginalnie zawartymi w nukleokapsydzie, są same w stanie przeprowadzić i/lub
podtrzymywać wtórną transkrypcję. Wydajność wtórnej transkrypcji prowadzi przy tym do syntezy białka z
korzystnie przynajmniej 1%, przynajmniej 2%, przynajmniej 3%, przynajmniej 4% lub przynajmniej 5% w
stosunku do odpowiedniego wirusa typu dzikiego, tzn. odpowiedniego wirusa typu dzikiego bez mutacji w
genie P. Zdolność do wtórnej transkrypcji może być ograniczona w stosunku do odpowiedniego wirusa typu
dzikiego, korzystnie jednak co najwyżej o czynnik 20, szczególnie korzystnie co najwyżej o czynnik 10.
Zdolność do wtórnej transkrypcji może być określona jak w Przykładzie 7.1 i/lub 7.3 przez ilościowe
określenie ekspresji produktu heterologicznego genu, np. białka reporterowego.
[0027] Oprócz mutacji zrekombinowany wirus według wynalazku zawiera korzystnie przynajmniej jeden
transgen, tzn. przynajmniej jedną sekwencję kodującą heterologiczny produkt genu. Heterologiczny produkt
genu może być białkiem, na przykład białkiem reporterowym, np. białkiem fluoryzującym jak GFP lub jego
pochodna, lub antygenem, przeciw któremu ma być uzyskana odpowiedź immunologiczna, lub białkiem
terapeutycznym, np. białkiem dla terapii przeciw wirusom lub funkcjonalną cząsteczką RNA, np.
antysensownym RNA, rybozymem, lub zdolną do interferencji RNA cząsteczką siRNA. Korzystnie
heterologiczny produkt genu jest antygenem, który pochodzi od patogenu, takiego jak wirus, bakteria, grzyb
lub pierwotniak, antygenem nowotworu lub autoantygenem. Szczególnie korzystnie antygen jest antygenem
wirusa, który pochodzi od heterologicznego wirusa zawierającego RNA o ujemnej polarności, takiego jak
ludzki wirus paragrypy lub RSV, np. hPIV3 F i HN lub F i G hRSV. Wirus według wynalazku może zawierać
jedną lub więcej, np. dwie lub trzy , sekwencje kodujące heterologiczny produkt genu.
[0028] Sekwencje kodujące heterologiczne produkty genów mogą być wstawiane do genomu
zrekombinowanego wirusa. Z drugiej strony, sekwencje kodujące homologiczne produkty genu np. geny F
i/lub HN mogą być także podstawione przez sekwencje, które kodują heterologiczne produkty genu, np.
chimerowe produkty genu. Możliwe są także kombinacje wstawionych i podstawionych transgenów.
[0029] Tak na przykład, sekwencje wirusa Sendai mogą być zastąpione całkowicie lub częściowo przez
heterologiczne sekwencje innych wirusów zawierających RNA o ujemnej polarności, np. przez sekwencje
wirusów paragrypy, np. hPIV3 i/lub przez sekwencje RSV. Szczególnie korzystnie stosowane są sekwencje
chimerowe, tzn. sekwencje obejmujące odcinki genomu wirusa podstawowego i odcinki heterologicznego
genomu wirusowego. Na przykład, do genomu wirusa mogą być wprowadzone chimerowe geny F i/lub HN,
4
EP 1851 239 B1
które składają się z sekwencji genomu wirusa podstawowego, np. wirusa Sendai i sekwencji
heterologicznych, np. z ludzkich wirusów paragrypy, takich jak na przykład hPIV3 i/lub RSV.
[0030] Zrekombinowany wirus może zawierać jeden lub więcej różnych transgenów. Gdy obecnych jest
kilka transgenów, mogą one mieć to samo albo różne pochodzenie, np. mogą pochodzić od pojedynczego
lub kilku różnych patogenów np. wirusów. Tak więc, mogą być obecne transgeny z kilku, np. 2 lub 3, różnych
patogenów, korzystnie wirusów, szczególnie wirusów zawierających RNA o ujemnej polarności.
[0031] Wbudowanie transgenów w paramyksowirusach jest opisane np. w Hasan i wsp. (J. Gen. Virol. 78
(1997), 2813-2820), Bukreyev i wsp. (J. Virol. 70 (1996), 6634-6641), Yu i wsp. (Genes Cells 2 (1997), 457466), Masaki i wsp. (FASEB J. 15 (2001), 1294-1296), Shiotani i wsp. (Gene Therapy 8 (2001), 1043-1050) i
Bitzer i wsp. (Mol. Therapy 7 (2003), 210-217). Korzystnie transgeny wstawia się w regionie 3’ genomu
wirusa. Insercja odbywa się, na przykład, w postaci kaset transkrypcyjnych, przy czym na poziomie wektora
(tzn. na poziomie wektora, np. wektora plazmidowego, który koduje RNA o ujemnej polarności)
bezpośrednio po regionie lidera wprowadza się jedną lub więcej kaset transkrypcyjnych z pojedynczymi
miejscami cięcia przez enzymy restrykcyjne dla integracji odpowiednich ramek odczytu. Integracja kilku
transgenów zachodzi korzystnie w każdym przypadku w odpowiednich niezależnych kasetach
transkrypcyjnych. Kaseta transkrypcyjna zawiera korzystnie sekwencję kodującą heterologiczny produkt
genu funkcjonalnie połączoną z sekwencją startu transkrypcji i sekwencja terminacji transkrypcji i korzystnie
sygnałami translacji.
[0032] Dalszym przedmiotem niniejszego wynalazku jest jednoniciowa lub dwuniciowa cząsteczka DNA, np.
cząsteczka cDNA, która koduje zrekombinowany genom wirusa zawierającego RNA o ujemnej polarności
według wynalazku lub jego prekursor lub antygenom wirusa lub jego prekursor. Termin „prekursor” oznacza
tutaj, że cząsteczka DNA jeszcze nie zawiera sekwencji kodującej heterologiczny produkt genu, ale tylko
miejsce klonowania do wprowadzenia takiej sekwencji. Miejsce klonowania może być miejscem cięcia przez
enzym restrykcyjny, na przykład, pojedynczym lub nie pojedynczym miejscem cięcia przez enzym
restrykcyjny w DNA, lub miejscem do wielokrotnego klonowania zawierającym kilka następujących po sobie
miejsc cięcia przez enzymy restrykcyjne, korzystnie pojedyncze miejsca cięcia. Cząsteczka DNA kodująca
genom wirusa i/lub sekwencję komplementarną jest korzystnie funkcjonalnie połączona z odpowiednimi
sekwencjami kontroli ekspresji.
[0033] Cząsteczka DNA jest korzystnie wektorem na przykład wektorem plazmidowym, który jest odpowiedni
do namnażania w odpowiedniej komórce gospodarza, tzn. w komórce do namnażania wektora lub plazmidu,
korzystnie w komórce prokariotycznej, ale także w komórce eukariotycznej, w szczególności komórce ssaka
i zawiera potrzebne do tego elementy genetyczne, takie jak początek replikacji, sekwencje do integracji i/lub
sekwencje markera selekcyjnego.
[0034] Cząsteczka DNA zawiera sekwencję kodującą zrekombinowany wirus lub sekwencję
komplementarną, korzystnie pod kontrolą sygnału transkrypcji, tak, że przy transkrypcji przez polimerazę
RNA zależną od DNA w komórce gospodarza odpowiedniej do początkowego przygotowania wirusa, tzn. w
komórce do przygotowania wirusa może być utworzona nić wirusowego RNA o ujemnej polarności. Sygnał
transkrypcji jest tak wybrany, że umożliwia wydajną transkrypcję DNA w komórce gospodarza stosowanej w
każdym przypadku. Dla poszczególnej komórki może być też stosowany heterologiczny sygnał transkrypcji,
np. promotor bakteriofaga, taki jak promotor T7 lub SP6 wówczas komórka do przygotowania wirusa musi
zawierać także odpowiednią heterologiczną polimerazę RNA zależną od DNA, np. polimerazę RNA T7 lub
5
EP 1851 239 B1
SP6, która przeprowadza transkrypcję. Dalej cząsteczka DNA zawiera oprócz sygnału transkrypcji,
korzystnie na końcu 3’ sekwencji kodującej rekombinowanego wirusa, terminator transkrypcji i sekwencję
rybozymu, która umożliwia przecięcie transkryptu na końcu sekwencji wirusowej. Komórka do przygotowania
wirusa jest korzystnie komórką eukariotyczną i w szczególności komórką ssaka.
[0035] Oprócz DNA kodującego defektywny pod względem replikacji paramyksowirus, komórka do
przygotowania wirusa według wynalazku zawiera ponadto sekwencje pomocnicze, których produkty genów
umożliwiają w trans montaż RNA zrekombinowanego wirusa według wynalazku. W tym celu komórka może,
na przykład, także dodatkowo zawierać jeden lub więcej wektorów, które produkują białko N, białko P i/lub
białko L w trans. W ten sposób umożliwia się montaż nukleokapsdów zrekombinowanego wirusa według
wynalazku w komórce do produkcji.
[0036] Namnażanie zrekombinowanego wirusa pierwotnie montowanego w komórce do produkcji zachodzi
w komórce do namnażania wirusa, która jest zakażona wirusem według wynalazku. Dodatkowo komórka do
namnażania wirusa zawiera sekwencje pomocnicze jak wymieniono powyżej, do wytwarzania białka N i/lub
białka P w trans. Korzystnie stosowana jest komórka do namnażania wirusa, w której zachodzi stabilna
ekspresja sekwencji pomocniczych, np. przez integrację genomową. Komórka do namnażania wirusa jest
korzystnie komórką ssaka. Szczególnie korzystnie komórka do namnażania jest komórką H29 pochodzącą
od komórki 293, pochodzącą z linii komórkowej ludzkich embrionalnych fibroblastów nerki, lub pochodzącą
od nich komórką. Komórka H29 została zdeponowana 05.11.2004 (DSM ACC 2702) zgodnie z ustaleniami
Traktatu Budapeszteńskiego w Deutschen Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,
Brunszwik, Mascheroder Weg. Odpowiednie są również komórki Vero, z linii komórkowej nerki od
afrykańskiego zielonego makaka, lub komórki pochodzące od LLCMK2, z linii komórek nerki od małpy
rezus, które są stabilnie transfekowane odpowiednimi sekwencjami pomocniczymi, np. genami SeV N i P.
[0037] Dalszym przedmiotem wynalazku jest komórka, korzystnie komórka eukariotyczna i szczególnie
korzystnie komórka ssaka, która zawiera (i) cząsteczkę DNA, która koduje genom zrekombinowanego
wirusa według wynalazku i/lub komplementarną do niego sekwencję lub jej prekursor i/lub (ii) zawiera genom
RNA wirusa według wynalazku. Komórka może być komórką do namnażania wektora, komórką do produkcji
wirusa lub komórką do namnażania wirusa, jak wyjaśniono uprzednio.
[0038] Gdy komórka jest komórką do namnażania wektora, np. komórką do namnażania plazmidu, może
być stosowana każda dowolna komórka odpowiednia do namnażania odpowiedniego wektora, np. także
komórka prokariotyczna, taka jak transformowana komórka E. coli.
[0039] Gdy komórka jest komórką do produkcji wirusa lub namnażania wirusa, zawiera ona sekwencje
pomocnicze do produkcji białek wirusa N, P i/lub L w trans. Wprowadzony do komórki do produkcji wirusa
DNA jest korzystnie pod kontrolą heterologicznego sygnału transkrypcji, a komórka korzystnie dodatkowo
zawiera DNA, który koduje heterologiczną zależną od DNA polimerazę RNA, która rozpoznaje
heterologiczny sygnał transkrypcji i przeprowadza transkrypcję dla DNA kodującego zrekombinowany wirus
zawierający RNA o ujemnej polarności.
[0040] Gdy komórka jest komórką do namnażania wirusa, jest ona zakażana genomową cząsteczką
wirusowego RNA, np. w postaci nukleokapsydu i zawiera sekwencje pomocnicze w wyrażanej stabilnie
postaci.
[0041] Jeszcze dalszym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zrekombinowanego wirusa
zawierającego RNA o ujemnej polarności według wynalazku obejmujący etapy: (a) przygotowania komórki
6
EP 1851 239 B1
do wytworzenia wirusa, która jest transfekowana cząsteczką DNA, która koduje genom wirusa
zawierającego RNA o ujemnej polarności, zawierającą mutację w genie P, która prowadzi do utraty
zdolności do replikacji genomu bez utraty zdolności do transkrypcji i ewentualnie przynajmniej jedną
sekwencję kodującą heterologiczny produkt genu, i (b) hodowli komórki gospodarza w warunkach, w których
zachodzi transkrypcja cząsteczki DNA według (a) i początkowo jest tworzony wirus zawierający RNA o
ujemnej polarności. Komórka gospodarza korzystnie jest zdolna do produkcji białka N, białka P i/lub białka L
w trans, np. przez transfekcję odpowiednimi plazmidami pomocniczymi, które zawierają sekwencje kodujące
białka N, P i/lub L.
[0042] Do wytworzenia wielkich ilości nukleokapsydów lub cząstek wirusa korzystnie stosuje się komórkę,
która, konstytutywnie lub po indukcji, wyraża białka N, L i/lub P, korzystnie przynajmniej białko P wirusa
zawierającego RNA o ujemnej polarności, w sposób stabilny. Wynalazek dotyczy więc zarówno sposobu
namnażania zrekombinowanego wirusa zawierającego
RNA o ujemnej polarności według wynalazku
obejmującego etapy (a) przygotowania komórki do namnażania wirusa, która jest zakażona genomem
wirusa zawierającego RNA o ujemnej polarności, zawierającym mutację w genie P, która prowadzi do utraty
zdolności do replikacji genomu bez utraty zdolności do transkrypcji, i ewentualnie przynajmniej jedną
sekwencję kodującą heterologiczny produkt genu, i (b) hodowli komórki gospodarza w warunkach, w których
zachodzi namnożenie wirusa.
[0043] Dalszym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, która zawiera zrekombinowany
wirus zawierający RNA o ujemnej polarności, który jest defektywny pod względem replikacji i kompetentny
pod względem transkrypcji, jak podano uprzednio, lub jego nukleokapsyd jako substancję czynną i
ewentualnie typowe farmaceutyczne podłoża i/lub substancje pomocnicze. Kompozycja farmaceutyczna jest
odpowiednia do stosowania w medycynie ludzkiej i weterynaryjnej. Może w szczególności służyć jako
szczepionka lub do terapii przeciw nowotworom, w szczególności do stosowania u pacjentów z grup ryzyka,
takich jak dzieci, osoby starsze i/lub osoby z uszkodzonym lub słabym układem odpornościowym.
Kompozycja farmaceutyczna może zawierać wirus zawierający RNA o ujemnej polarności w jego natywnej
otoczce wirusowej.
[0044] Szczególnie korzystne jest zastosowanie jako szczepionka, np. jako szczepionka przeciw
patogenom, takim jak wirusy, bakterie lub pierwotniaki. Gdy zrekombinowany wirus zawiera jeden transgen
lub kilka transgenów o tym samym pochodzeniu, np. z pojedynczego patogenu, jest to
szczepionka
monowalentna. Gdy zrekombinowany wirus zawiera transgeny o rozmaitym pochodzeniu, może być też
stosowany jako szczepionka poliwalentna. Przeciw kilku patogennym wirusom np. biwalentna lub
triwalentna. Na przykład, można wytworzyć szczepionkę poliwalentną przeciw kilku patogennym wirusom np.
zawierającym RNA o ujemnej polarności, takim jak ludzki wirus paragrypy i RSV.
[0045] Szczepionka według wynalazku jest w stanie wywołać odpornościową odpowiedź humoralną,
korzystnie tworzenie neutralizujących przeciwciał, i/lub odpowiedź immunologiczną komórek T. Szczególne
korzystna jest odpowiedź odpornościowa humoralna i odpowiedź odpornościowa komórek T.
[0046] Kompozycja farmaceutyczna może być w postaci roztworu, zawiesiny, liofilizatu lub w każdej innej
odpowiedniej postaci. Oprócz substancji czynnej kompozycja może zawierać środki do ustawienia wartości
pH, bufory, środki do ustawienia toniczności, środki sieciujące, i tym podobne jak i adiuwanty. Może być
podawana zwyczajową drogą, np. doustnie, miejscowo, do nosa, do płuc itp., w postaci aerozoli, cieczy,
proszków itd. Pacjentowi podawana jest terapeutycznie skuteczna dawka wirusa, przy czym ta dawka zależy
7
EP 1851 239 B1
od odpowiedniego zastosowania (do wirusoterapii lub jako szczepionka), typu choroby, stanu zdrowia i wagi
3
7
pacjenta, sposobu podawania i formulacji itp. Typowo na podanie używa się 10 do 10 cząstek wirusa,
szczególnie korzystnie około 104 do 108 cząstek wirusa. Ewentualnie można podawać kilka różnych cząstek
wirusa razem, np. w przypadku szczepionek skojarzonych. Podanie może być jedno lub wielorazowe, w
zależności od potrzeby.
[0047] Korzystnymi dziedzinami zastosowania są np. zapobieganie lub terapia wirusowych chorób dróg
oddechowych.
[0048] Dalej wynalazek będzie wyjaśniony przez następujące figury i przykłady.
Przykłady
1. Ogólne
[0049] Fig. 1 przedstawia morfologię wirusa Sendai (SeV) według Fields (Virology, Lippincottt, Williams i
Wilkins (2001), 4. wydanie, zmienione). Genom składa się z jednoniciowego RNA, który występuje z białkiem
N, P i L w postaci nukleokapsydu . Nukleokapsyd jest otoczony przez błonę, w której obecne są białka HN i
F (każde złożone z odpowiednio podjednostek F1 i F2). Białko M jest związane z wewnętrzną stroną błony i
jest równocześnie związane z komponentami nukleokapsydu.
[0050] Jednoniciowy genom RNA o ujemnej orientacji wirusa Sendai typu dzikiego obejmuje 15384
nukleotydów. Geny 6 białek strukturalnych leżą na nim w kolejności 3’-N-P/C-M-F-HN-L-5’ (Fig. 2). Pomiędzy
genami leżą przejścia z 50-80 nukleotydów, z których każde odpowiednio zawiera silnie konserwowany
region z 22 nukleotydów: sygnał terminacji poprzedzającego genu, sekwencję międzygenową i sygnał start
dla następnego genu. Jednostka obejmująca sygnał start, otwartą ramkę odczytu (ORF), ewentualnie nie
ulegające translacji regiony i sygnał terminacji, jest określana jako kaseta transkrypcyjna. Przed genem N
znajduje się sekwencja lidera o długości 55 nukleotydów (ld), która ulega transkrypcji, ale nie translacji. Za
genem L znajduje się sekwencja trailera (tr) o długości 54 nukleotydów. Regiony ld i tr służą jako genomowe
i antygenomowe promotory dla replikacji genomu lub antygenomu. Wytworzone przez transkrypcję
cząsteczki mRNA są monocistronowe z wyjątkiem P/C mRNA.
[0051] Cykl namnażania wirusa Sendai obejmuje wejście do komórki gospodarza, transkrypcję i translację
jak i replikację i dojrzewanie wirusa z następnym wydzielaniem nowo wytworzonych wirusów. W przebiegu
transkrypcji biorą udział przede wszystkim białka N, P i L, przy czym L jest wirusową polimerazą RNA
zależną od RNA ze wszystkimi aktywnościami katalitycznymi. Ponieważ genom wirusa Sendai jest ułożony z
ujemną polarnością, wirusowy RNA nie może być bezpośrednio przełożony na białka. Najpierw zachodzi
pierwotna transkrypcja do mRNA przez polimerazę RNA, która jest wprowadzana do komórki zasocjowana z
nukleokapsydem.
[0052] Fig. 3 przedstawia schematycznie sposób transkrypcji wirusa Sendai. Kompleks polimerazy
obejmujący białko L i homotetramer z białek P przemieszcza się na RNA upakowanym białkami N w
kierunku końca 5’.
Informacja genetyczna na nici RNA o ujemnej polarności jest odczytywana i
przepisywana na nić mRNA o dodatniej polarności.
[0053] Replikacja genomu obejmuje tworzenie nowych genomów wirusa zawierającego RNA o ujemnej
polarności. W tym celu najpierw są tworzone antygenomy, które następnie służą jako matryce do tworzenia
genomów. Ponieważ transkrypcja zaczyna się od końca 3’ genomu (ld), jest wymagane przełączenie ze
sposobu transkrypcji do sposobu replikacji. To przełączenie jest określane przez ilość wolnego białka N w
komórkach. Dopiero gdy jest wystarczająca ilość białka N po translacji cząsteczek mRNA, może zachodzić
8
EP 1851 239 B1
replikacja. Gdy obecny jest antygenom, który jest skompleksowany na całej swojej długości z białkami N,
może służyć jako matryca do produkcji dalszych genomów. Są one też pakowane z białkami N. Za proces
replikacji znowu są odpowiedzialne białka N, P i L (Fig. 4).
[0054] W czasie replikacji wirusa ze względu na rosnącą liczbę cząsteczek mRNA syntetyzowanych jest
coraz więcej białek wirusa. Następnie kompleksy wirusowego RNA i białek wirusowych (nukleokapsydy) są
transportowane w postaci pęcherzyków wydzielniczych do błony cytoplazmatycznej, gdzie dochodzi do
otoczenia białkami powierzchniowymi i odpączkowania cząstek wirusa.
[0055] W zakresie niniejszego wynalazku są wytworzone zrekombinowane mutanty wirusa, u których funkcje
transkrypcji i replikacji są rozłączone, tzn. wirusy są kompetentne pod względem transkrypcji ale defektywne
pod względem replikacji. Do wytworzenia cząstek wirusa lub ich nukleokapsydów brakująca funkcja
replikacyjna genomu musi być kompensowana przez komórki pomocnicze, które komplementują brakującą
funkcję białka wirusowego w trans. Taką korzystną komórką pomocniczą jest linia komórkowa H29
(Willenbrink i Neubert, J. Virol. 68 (1994) 8413-8417). Ta linia została w ramach tego zgłoszenia
zdeponowana
5.11.2004
pod
numerem
akt
DSM
ACC2702
zgodnie
z
ustaleniami
Traktatu
Budapeszteńskiego. Do produkcji defektywnych pod względem replikacji ale zdolnych do transkrypcji
wirusów, gen kodujący białko P nie został całkowicie usunięty, ale usunięta została jego domena niezbędna
do replikacji genomu. Było wiadome z wcześniejszych prac (Curran, Virology 221 (1996), 130-140; Curran i
wsp., J. Virol. 69 (1995), 849-855), że w systemie in vitro przy delecji aminokwasów 2-77 białka P
hamowana jest replikacja genomu, podczas gdy transkrypcja wirusowa pozostaje aktywna.
[0056] Fig. 5 przedstawia schematycznie białko P z jego domenami N- i C-końcowymi (PNT, PCT), domenę
tetrameryzacji (aminokwasy 320-446), domenę P:L (aminokwasy 411-445) i domenę wiązania P:RNP
(aminokwasy 479-568). Dla wyłączenia funkcji replikacji genomu wirusa przy równoczesnym zachowaniu
zdolności do syntezy wirusowego mRNA wybrano delecję pierwszych 77 aminokwasów białka P. Uzyskano
najpierw odpowiedniego mutanta wirusa Sendai (SeV-P∆2-77), w którym wydeletowano końcowy region 5’
P-ORF. Przez te wirusy mogą być tylko kodowane białka P skrócone na N-końcu. Badania infekcji wykazały,
że mutant wirusa nie jest zdolny do namnażania się w hodowli komórkowej. Za pomocą pomocniczej linii
H29 (DSM ACC2702), która między innymi dostarcza wymagane białko P typu dzikiego, można uzyskać
namnożenie wirusa. Wydajność namnażania wynosi około 45% w porównaniu z wirusami Sendai typu
dzikiego.
[0057] Po zakażeniu mutant wirusa według wynalazku jest w stanie wyrażać kodowane przez wirusa
transgeny w zakażonej komórce. Produkowane przez mutanta wirusa skrócone białko P wystarczająco
podtrzymuje wtórną syntezę wirusowego mRNA. Synteza kodowanych przez wirusa białek trwa w
zakażonych komórkach przez kilka dni i jest obniżona tylko o czynnik około 10 w stosunku do dzikiego typu
wirusa, tak, że przy zastosowaniu mutanta można z pewnością oczekiwać wystarczającej odpowiedzi
odpornościowej.
2. Przygotowanie podstawowych konstruktów dla wektorów wirusa Sendai (SeVV) defektywnych pod
względem replikacji
2.1 Przygotowanie konstruktu cDNA pSeV-X
[0058] Wprowadzono kodującą kasetę transkrypcyjną w region 3’ SeV, szczep Fushimi (ATCC VR105). Przy
wszystkich manipulacjach genomu należy bezwzględnie dbać o to, by całkowita liczba nukleotydów
zrekombinowanego genomu SeV była podzielna przez 6, („rule of six” – reguła sześciu).
9
EP 1851 239 B1
[0059] Wychodząc ze stosowanego jako matryca cDNA pSeV uzyskano dwa fragmenty PCR PCR X I i PCR
X II do przygotowania pSeV-X (Fig. 6).
[0060] PCR X I (370 pz) obejmuje sekwencję promotora T7 (T7-prom.), sekwencję lidera (ld), startu genu N
z 5’-NTR aż do miejsca S przed kodonem start ORF N (Open reading frame – otwarta ramka odczytu).
Przed prawy starter XI (+) (Tabela 3) wprowadzono pojedyncze miejsce restrykcyjne NotI i 24 nukleotydy
sekwencji stop genu N. 24 nukleotydy sekwencji stop genu N PCRX XI, wprowadzone przez mutagenny
starter XI(+), służą w następnym etapie fuzji jako region zachodzący na PCR XII.
[0061] PCR XII (970 pz) składa się z sekwencji start genu N i pierwszej jednej trzeciej ORF N. Za pomocą
lewego startera XII dodano sekwencję 3’-NTR N i sekwencję stop genu N, jak również region międzygenowy
(IR). Prawy starter XII (+) wiąże się w pierwszej jednej trzeciej ORF N tuż za pojedynczym miejscem cięcia
SphI w genomie SeV . Amplikon PCR XI był komplementarny w regionie 3’ do regionu 5’ PCR X II. Przez ten
zachodzący na siebie region możliwa była fuzja obu fragmentów PCR X I i XII. Po zajściu PCR produkt fuzji
(1310 pz) można było wprowadzić przez cięcie enzymami restrykcyjnymi MluI i SphI do wektora pSeV
przeciętego też enzymami MluI i SphI. Z uzyskanych klonów za pomocą preparatyki plazmidu wyizolowano
plazmidowy DNA i sprawdzono za pomocą analizy restrykcyjnej i sekwencjonowania prawidłowe wstawienie
kasety transkrypcyjnej. W ten sposób udostępniony został konstrukt cDNA pSeV-X.
[0062] Aby można było łatwo śledzić uzyskiwanie zrekombinowanych wirusów, wprowadzono gen dla białka
intensywnej zieleni fluorescencyjnej (eGFP) do „pustej” kasety pSeV-X. ORF eGFP
amplifikowano za
pomocą PCR z plazmidu ekspresyjnego pEGFP-N1 (firma Clontech), przy czym dzięki mutagennym
starterom uzyskano zachowanie „reguły sześciu” i wprowadzenie dwóch flankujących miejsc cięcia NotI.
Powstały fragment PCR o wielkości 771 pz przecięto enzymem restrykcyjnym NotI i wyizolowano fragment o
wielkości 738 pz przez elucję z żelu, i wprowadzono go przez miejsce cięcia NotI pSeV-X do jego „pustej”
kasety
transkrypcyjnej
pSeV-X.
Po
transformacji
E.
coli,
preparatyce
plazmidu
i
następnym
sekwencjonowaniu wprowadzonej przez PCR ramki odczytu eGFP, dostępny był konstrukt cDNA pSeVeGFP.
2.2. Przygotowanie konstruktu cDNA pSeV-X-X
[0063] Konstrukt pSeV-X-X miał udostępnić dwie dodatkowe kasety transkrypcyjne, do których mogą być
wbudowane dwa trans geny. Zastosowanie pSeV-X-X jako podstawowego wektora do produkcji wirusa
defektywnego pod względem replikacji powinno umożliwić nadanie wektorowi multiwalentnych, np.
triwalentnych, właściwości.
[0064] pSeV-X-X wytworzono w reakcji PCR, w której jako matryca służył pSeV-X (Fig. 7). Starter XX-lewy
hybrydyzuje z pSeV-X w regionie miejsca cięcia NotI i w 3’NTR drugiej kasety transkrypcyjnej, która ma być
wintegrowana. Wprowadzono pojedyncze miejsce restrykcyjne SgrAI za pomocą startera XX-lewego między
miejscem cięcia NotI i 3’-NTR. Służy ono jako pojedyncze miejsce restrykcyjne dla późniejszego wstawienia
ORF transgenu. W produkcie PCR XX następują kolejno stop dla genu, region międzygenowy (IR), start
genu i 5’-NTR. Za pomocą startera XX(+), który hybrydyzuje z 5’-NTR, wprowadzono pojedyncze miejsca
restrykcyjne FseI i NruI. Miejsce cięcia FseI służy do wbudowania ORF drugiego transgenu. Pojedyncze
miejsce NruI było wklonowane z przewidywaniem, żeby w razie potrzeby móc wintegrować trzecią kasetę
transkrypcyjną. Starter XX(+) hybrydyzuje w regionie 3’ z sekwencją miejsca cięcia NotI pSeV-X. Produkt
PCR XX (220 pz) potraktowano enzymem restrykcyjnym NotI i wyizolowano fragment 144 pz za pomocą
ekstrakcji z żelu. Ten fragment, zaprojektowany przy zachowaniu „reguły sześciu”, można było wbudować do
10
EP 1851 239 B1
plazmidu pSeV-X także traktowanego NotI. Po sprawdzeniu prawidłowej orientacji fragmentu NotI PCR XX i
sprawdzeniu sekwencji był gotowy plazmid pSeV-X-X. W pojedyncze miejsca restrykcyjne SgrAI i FseI mogą
być wbudowane żądane transgeny.
[0065] W celu badań w tej pracy obie kasety transkrypcyjne (X) z pSeV-X-X zaopatrzono w ramki odczytu z
dwóch różnych białek fluorescencyjnych. Do jednego ramkę odczytu dla białka fluorescencyjnego eGFP z
plazmidu ekspresyjnego pEGFP-N1 zamplifikowano za pomocą PCR z zachowaniem „reguły sześciu”, przy
czym za pomocą mutagennych starterów wprowadzono dwa flankujące miejsca SgrAI. Po trawieniu
restrykcyjnym SgrAI i elucji z żelu można było wprowadzić fragment o wielkości około 738 pz do pierwszej
kasety transkrypcyjnej pSeV-X-X (pSeV-eGFP-X). W ten sam sposób do drugiej wstawiono ORF
fluorescencyjnego białka DsRed (z plazmidu „pDsRed”, firma Clontech) przy zachowaniu „reguły sześciu” za
pomocą PCR, z miejscami restrykcyjnymi FseI, DNA przecięto, eluowano z żelu i ten fragment (702 pz)
następnie wprowadzono do drugiej kasety transkrypcyjnej w regionie 3’ pSeV-eGFP-X. W ten sposób
powstał konstrukt genomowego cDNA pSeV-eGFP-DsRed.
3. Przygotowanie wirusów Sendai defektywnych pod względem replikacji (SeVV)
[0066] Wytworzono konstrukty cDNA pSeVV-eGFP-∆P, które kodują wirusy Sendai defektywne pod
względem replikacji, w których gen dla białka P jest wydeletowany. W tym celu musiano przy zachowaniu
reguły sześciu wydeletować ramkę odczytu genu P, przy czym zachowana jest niekodująca kaseta
transkrypcyjna w odpowiedniej pozycji (Fig. 8A).
[0067] Przez wbudowanie miejsca restrykcyjnego zamiast wydeletowanej ORF w konstrukcie pSeVV-eGFP∆P ma być udostępniona dla dalszych zastosowań funkcjonalna kaseta transkrypcyjna, do której w razie
potrzeby można wstawić kolejny transgen.
[0068] Jako kolejny wariant wirusa defektywnego pod względem replikacji SeVV przygotowano mutanta
delecyjnego pSeVV-eGFP-P∆2-77, który koduje białko N skrócone na N-końcu, w którym brakuje
aminokwasów 2 do 77 (Fig. 8B).
[0069] Klonowanie pSeVV-eGFP-∆P będzie dokładnie opisane w następującej części.
3.1 Klonowanie konstruktów cDNA pSeVV-eGFP-∆P i pSeVV-eGFP-P∆2-77
[0070] ORF białka P usunięto z konstruktu cDNA, kompetentnego pod względem replikacji wirusa pSeVeGFP, aby uzyskać nowy cDNA pSeVV-eGFP-∆P, kodujący wektor defektywny pod względem replikacji.
Zamiast ORF P wprowadzono miejsce restrykcyjne dla XhoI.
[0071] Dla klonowania pSeVV-eGFP-∆P przygotowano dwa fragmenty PCR, oznaczone jako PCR -∆P I i
PCR -∆P II i następnie je połączono. Jako matryca dla obu reakcji PCR posłużył pSeV-eGFP. W przypadku
fragmentu PCR -∆P I (1272 pz) uzyskano za pomocą lewego startera ∆P I (= N-578, Tabela 3) hybrydyzację
z matrycą w regionie ORF N przed pojedynczym miejscem restrykcyjnym SphI. Starter prawy ∆P I (+)
hybrydyzuje z matrycą w regionie 5’-NTR genu P aż do miejsca przed kodonem ATG P i wprowadza tam
miejsce restrykcyjne XhoI.
[0072] Fragment PCR ∆P II obejmuje 1938 pz, a jako matryca służy także tutaj pSeV. Lewy starter ∆P II
hybrydyzuje do części 5’-NTR sekwencji P i wprowadza miejsce restrykcyjne XhoI. Prawy starter PCR ∆P II
(+) wiąże się z ORF genu F za pojedynczym miejscem restrykcyjnym Eco47III i dodatkowo ma syntetyczne
miejsce MluI.
11
EP 1851 239 B1
[0073] Oba fragmenty PCR ∆P I i ∆P II połączono przez miejsce XhoI. Produkt fuzji złożony z części
sekwencji ORF N, niekodującej kasety transkrypcyjne P z wprowadzonym miejscem restrykcyjnym XhoI, M i
jednej czwartej ORF F, przecięto enzymami restrykcyjnymi SphI i MluI, sklonowano pośrednio i sprawdzono
przez sekwencjonowanie. Z podklonu z prawidłową sekwencją wycięto fragment SphI-Eco47III o wielkości
3006 pz, który zligowano z tak samo potraktowanym wektorem pSeV-eGFP. Odpowiedni klon pSeVV-eGFP∆P (genomowy cDNA wirusowy) był po sprawdzeniu sekwencji obecnie gotowy do przygotowania
defektywnego pod względem replikacji SeVV-eGFP-∆P (Fig. 9).
[0074] Do konstrukcji mutanta delecyjnego pSeVV-eGFP-P∆2-77 zastosowano PCR z dwoma mutagennymi
starterami. Lewy starter „XhoI P∆2-77” zawiera miejsce XhoI, po którym następuje kodon start ATG i kodony
dla aminokwasów 78-86 białka P. Prawy starter „P∆2-77(+) XhoI” zawiera ostatnie 10 kodonów białka P i
miejsce XhoI. Ramka odczytu skróconego na N-końcu o 76 aminokwasów białka P została uzyskana za
pomocą PCR, wychodząc z matrycy pSeV, z zachowaniem reguły sześciu. Przecięty XhoI fragment o
wielkości 1488 pz wstawiono w dwóch etapach klonowania do niekodującej kasety transkrypcyjnej pSeVVeGFP-∆P w pozycji oryginalnego ORF P. Po sprawdzeniu sekwencji był gotowy klon genomowy cDNA do
produkcji defektywnego pod względem replikacji SeVV-eGFP-P∆2-77.
[0075] Skutkiem delecji kodonów 2 do 77 w ORF P jest, że białka niestrukturalne V i W są też skrócone na
N-końcu i z rodziny C pozostaje jeszcze zakodowany tylko C’ – też skrócony; białka C, Y1 i Y2 ze względu
na brakujące kodony start nie mogą już ulegać translacji ze skróconego mRNA.
[0076] Sekwencje
starterów
do
klonowania
pSeVV-eGFP-∆P
są
wyliczone
ze
stosowanymi
oligonukleotydami DNA (Tabela 3). Otrymane produkty PCR, PCR I i PCR II, połączono i stosując lewy
starter dla PCR I i prawy starter PCR II poddano je amplifikacji. Następnie produkty fuzji PCR przecięto
enzymami restrykcyjnymi, które występują pojedynczo w pSeV-eGFP i pozwalają na wstawianie
odpowiedniego produktu fuzji w pSeV-eGFP (np. NarI przy klonowaniu pSeVV-eGFP-∆N, patrz Tabela 1).
Oczyszczony produkt cięcia wprowadzono przez ligację do wektora także strawionego odpowiednimi
enzymami.
Tabela 1: Przegląd starterów i miejsc cięcia przez enzymy restrykcyjne stosowanych przy klonowaniu
pSeVV-eGFP-∆P
pSeVV-eGFP-∆P
Para starterów PCR I
∆PI, ∆P I (+)
Para starterów PCR II
∆PII, ∆P II (+)
1
XhoI
5
SphI + Eco47III
RSS kasety transkrypcyjnej
RSS klonowania
§
RSS
=
miejsce
cięcia
przez
enzym
restrykcyjny
[0077] Komórki E. coli transformowano częścią mieszaniny ligacyjnej i plazmidowy DNA uzyskanych klonów
wyizolowano za pomocą minipreparatów plazmidów. Po sprawdzeniu prawidłowej sekwencji przez analizę
restrykcyjną i sekwencjonowanie jednego klonu dodatniego przygotowano preparat plazmidu (DNA Maxi
Prep-Kit, Qiagen) i w ten sposób był gotowy pSeVV-eGFP-∆P do wytworzenia zrekombinowanych mutantów
delecyjnych.
4. Wytworzenie mutantów wirusa defektywnych pod względem replikacji
12
EP 1851 239 B1
[0078] Z konstruktów cDNA pSeVV-eGFP-∆P z hodowli komórkowej przygotowano defektywne pod
względem replikacji wektory SeV (SeVV-eGFP-∆X).
4.1 Początkowa produkcja SeVV-eGFP-∆P
[0079] W celu wytworzenia zrekombinowanego SeV z pełnym genomem zakażano zrekombinowanym
wirusem krowianki MVA-T7, który wyraża polimerazę RNA T7 (Sutter i wsp. (1995) FEBS 371, 9-12)
-albo linię komórkową „BSR-T7”, która stabilnie wyraża polimerazę RNA T7 (Buchholz i wsp. (1999) J. Virol.
73, 251-259)
- albo hodowle komórkowe i
-transfekowano cDNA genomu wirusa (pSeV) i kodowanymi przez plazmidy genami N, P i L (pTM-N, -P, -L;
Elroy-Stein i wsp. (1989) PNAS 86, 6126-6130). Polimeraza RNA T7 transkrybuje teraz antygenom wirusa
i/lub komplementarną sekwencję i geny N, P i L. Białko N wyrażane przez pTM-N opakowuje syntetyzowane
wirusowe antygenomowe i/lub komplementarne DNA i ten rdzeń nukleokapsydu (RNP) tworzy razem z
białkami P i L kompleks replikacyjny, przez który z kolei może być produkowany genomowy RNA i może być
pakowany do nukleokapsydów (Leyrer i wsp., J. Virol. Meth. 75 (1998) 47-55). Następnie zachodzi
transkrypcja wszystkich kodowanych przez wirus białek i replikacja kolejnych genomów wirusowych (Fig.
10).
[0080] W odróżnieniu od opisanego wytwarzania zrekombinowanego SeV z pełnym genomem, w
kodowanych przez plazmid cDNA pSeVV-eGFP-∆P brakuje informacji genetycznej o genie P. W efekcie
tego pierwotnie wytworzone nukleokapsydy są tylko w stanie wyrażać geny N i L. Potrzebne do namnażania
nukleokapsydów SeVV-eGFP-∆P ilości brakującego białka muszą być więc dostarczone wyłącznie przez
sterowaną przez promotor T7 ekspresję kodowanego na plazmidzie genu P.
[0081] Wytwarzanie defektywnego pod względem replikacji SeVV-eGFP-∆P było podobne do wytwarzania
kompetentnych pod względem replikacji wariantów SeV w komórkach HeLa (ATCC CCL2) lub komórkach
BSR-T7. Po inkubacji przez 48 godzin komórek HeLa badano, czy cząsteczki wirusa SeVV-eGFP-∆P zostały
wydzielone do supernatantu hodowli i ile powstało pierwotnych mutantów delecyjnych.
4.2 Detekcja wytworzonych na początku SeVV-eGFP-∆P
[0082] Supernatanty komórek HeLa lub komórek BSR-T7, w których powinny być wytworzone początkowo
SeVV-eGFP-∆P, były badane pod kątem obecności tych wektorów wirusowych. SeVV-eGFP-∆P ma, w
przeciwieństwie do zrekombinowanego SeV typu dzikiego, wintegrowany gen reporterowy dla eGFP w
regionie 3’. Ten marker detekcyjny był obecnie wykorzystany, aby zanalizować, ile wytworzono SeVVeGFP-∆P.
[0083] W równoległych próbkach zmieszano 5x105 komórek Vero (ATCC CCL 18) było w każdym przypadku
współzakażanych
1 ml supernatantu hodowli komórkowej komórek HeLa transfekowanych podczas
początkowego wytwarzania SeVV-eGFP-∆P i równocześnie typem dzikiem SeV (MOI = 3) w celu
komplementacji w trans brakującego białka. Jako kontrolę komórki Vero zakażano tylko 1 ml początkowo
wytorzonego SeV-eGFP lub alternatywnie początkowo wytworzonym SeV-eGFP i równocześnie SeV typu
dzikiego (MOI = 3).
[0084] Wynik koinfekcji komórek supernatantami hodowli do przygotowania SeVV-eGFP-∆P i SeV typu
dzikiego pokazuje, że mutant wirusa SeVV-eGFP-∆P można wytworzyć początkowo i po tej początkowej
produkcji jest on też w stanie zakażać komórki, co daje się wykryć za pomocą wykrywalnej ekspresji
13
EP 1851 239 B1
transgenu eGFP. Początkowo można wytworzyć około 13 x 102 SeV-eGFP, 3,2 x 102 SeVV-eGFP-∆P
mutantów wirusa.
5. Namnażanie SeVV-eGFP-∆X
[0085] Badano, czy wektor SeVV-eGFP-∆P jest namnażalny, to znaczy, czy jest funkcjonalny pod względem
biologicznym. Zdolność do replikacji była najpierw badana przez uzyskanie białek z brakującym genem P
przez komplementację w trans przez wirusy SeV.
5.1 Wykazanie zdolności do replikacji SeVV-eGFP-∆X
[0086] Najpierw należało wykazać, że mutanty przy odpowiedniej transkomplementacji przez wirus SeV typu
dzikiego, są w stanie namnażać się i zakażać otaczające komórki. Do badania zdolności SeVV-eGFP-∆P do
namnażania się , znowu jest możliwe wykorzystanie koinfekcji komórek przez SeVV-eGFP-∆P i SeV typu
dzikiego. Komórki w tym badaniu zakażano SeV typu dzikiego z niskim MOI, koinfekowano SeVV-eGFP-∆P i
inkubowano przez kilka dni tak, że rozprzestrzenianie wektorów SeVV-eGFP-∆P można było wykryć przez
zwiększającą się liczbę komórek fluoryzujących.
[0087] Zakażano równocześnie 5 x 105 komórek Vero przez średnio 100 początkowo wytworzonych SeVVeGFP-∆P i SeV typu dzikiego (MOI = 0,2). Jako kontrola pozytywna służyła koinfekcja komórek Vero około
100 cząstkami kompetentnego pod względem replikacji wirusa SeV-eGFP i SeV typu dzikiego. Podczas 48godzinnej fazy inkubacji możliwe było zaobserwowanie namnażania trzech mutantów delecyjnych: na
początku fluoryzowały tylko pojedyncze komórki Vero, które były koinfekowane SeVV-eGFP-∆P i SeV typu
dzikiego. Po około 24 godzinach z tych komórek były uwalniane syntetyzowane de novo cząstki wirusa,
które były w stanie wniknąć do położonych obok komórek. Jeśli te komórki były równocześnie zakażone
SeVV-eGFP-∆P i SeV typu dzikiego, w takich komórkach też pojawiała się widoczna fluorescencja.
Namnażanie się SeVV-eGFP-∆P w koinfekowanych typem dzikim komórkach można było ponadto wykryć
przez „tworzenie ogona” komórek fluoryzujących 48 godzin po zakażeniu i ponad.
[0088] W tym teście ustalono, że genomowe konstrukty cDNA, z których powstał SeVV-eGFP-∆P, są
funkcjonalne we wszystkich regionach. Ponadto możliwe było wykazanie, że namnażanie mutantów wirusa
jest możliwe przy dodaniu brakującego białka wirusowego. Białko (np. P) wytworzone wyłącznie przez wirus
typu dzikiego, jest wystarczające, aby namnażać zarówno typ dziki jak i mutanta delecyjnego, co znaczy, że
nawet możliwie suboptymalna ilość białka P prowadzi do tworzenia funkcjonalnych nukleokapsydów SeV
typu dzikiego i SeVV-eGFP-∆P. Dostarczenie brakującego białka przez partnera transkomplementacji SeV
typu dzikiego doprowadziło do widocznego namnażania SeVV-eGFP-∆P, mierzonego za pomocą przyrostu
fluoryzujących komórek w hodowlach.
5.2 Określenie białek wymaganych do namnażania SeVV-eGFP-∆P
[0089] Następnie badano, które białka, w przypadku namnażania SeVV-eGFP-∆P, mogą być udostępnione
przez komórkę pomocniczą, gdyby białka SeV N, P i L były syntetyzowane niezależnie od siebie nawzajem.
Dla niezależnej syntezy białek SeV N, P i L dostępne były trzy wirusy krowianki (VV) W-N, W-P i W-L, które
wyrażają zrekombinowane białka SeV N, P i L (Graef, H. (1994) Funktionelle Charakterisierung des
rekombinantem Sendai Virus Large (L) Proteins. Rozprawa doktorska, Eberhard-Karls Universitaet,
Tybinga).
6
[0090] Przeprowadzono równoczesną koinfekcję 1 x 10 komórek Vero SeVV-eGFP-∆P lub SeV-eGFP (MOI
= 0,01) i VV. Stosowano W-N, -P i –L pojedynczo lub w kombinacjach (MOI = 0,5). Po jednogodzinnym
14
EP 1851 239 B1
czasie adsorpcji pożywkę zastąpiono DMEM + 10% płodowa surowica cielęca (FCS) + arabinozyd cytozyny
o
(AraC) (100 µg/ml) i komórki inkubowano przez 72 godziny w 33 C, przy czym codziennie zmieniano
pożywkę, aby dodać nowe AraC.
[0091] Propagację SeVV-eGFP-∆P badano przez ekspresję eGFP po 72 godzinach. W tym czasie w
próbkach dodatnich było namnażanie fluoryzujących na zielono komórek z jednej komórki początkowej do
10-30 leżących koło siebie fluoryzujących komórek.
[0092] Wyniki badania, które białka SeV są niezbędne do namnażania SeVV-eGFP-∆P w komórkach Vero,
są przedstawione w Tabeli 2. SeVV-eGFP-∆P może być namnażany w komórkach Vero sam przez
ekspresję białek SeV P z pomocą VV-P.
Tabela 2. Białka SeV wymagane do namnażania SeVV-eGFP-DP
∆
namnażanie in vitro za pomocą VV
P+
SeVV-eGFP-∆P
(N + P)+
[0093] Do namnażania SeVV-eGFP-∆P wystarczała ekspresja białka SeV P w komórce pomocniczej.
5.3 Podtrzymanie amplifikacji SeVV-eGFP-∆P przez komórki pomocnice H29
6
[0094] Do badania namnażania SeVV-eGFP-∆P z pomocą linii komórkowej H29, 1 x 10 komórek H29 w
czterech różnych próbach zakażano każdą około 100 cząstkami wirusa SeVV-eGFP-∆P
pierwotnie
wytworzonymi w komórkach HeLa lub jako kontrolę skutecznego namnażania zdolnego do replikacji wirusa
SeV w komórkach H29, zakażano
około 100 cząstkami wirusa SeV-eGFP. W czasie 1 do 10 dni po
zakażeniu, badanie pod kątem namnażania SeVV-eGFP-∆P oparto na wykazaniu podobnego do ogona
rozprzestrzeniania się fluoryzujących komórek (tworzenie plamek), wychodząc z pierwotnie zakażonej
komórki H29.
[0095] W próbie kontrolnej zaobserwowano namnażanie SeV-eGFP wychodzące z pojedynczych
fluoryzujących komórek 1 dzień po zakażeniu do plamek z do 50 fluoryzujących komórek 3 dni po
zakażeniu. W ten sposób ustalono, że w wybranym eksperymencie dochodzi do namnożenia SeV.
[0096] W próbce z SeVV-eGFP-∆P można było zaobserwować około 100 pierwotnie zakażonych komórek 1
dzień po zakażeniu. 3 dni po zakażeniu około 70% fluoryzujących pojedynczych komórek rozwinęło się do
plamek z do 30 fluoryzujących komórek. W ten sposób można było jednoznacznie wykazać propagację
SeVV-eGFP-∆P na otaczające komórki H29. Oprócz H29 (pochodnej ludzkich komórek nerki 293), także
pochodne komórek Vero ( komórki nerki zielonej małpy afrykańskiej) i pochodne komórek LLCMK2 stabilnie
transfekowane genem P SeV lub genami P i N SeV, są odpowiednie do namnażania wirusa. W ten sposób
stało się po raz pierwszy możliwe namnożenie wektora wirusowego SeV, którego ORF P był wydeletowany.
Charakterystyka namnażania SeVV-eGFP-∆P będzie omówiona w następnym podpunkcie.
5.4 Namnażanie SeVV-eGFP-∆P na komórkach H29
[0097] SeVV-eGFP-∆P może ulec amplifikacji przez białka P SeV produkowane przez komórki pomocnicze
H29. Uwolnione mutanty delecyjne P są w stanie zakazić otaczające komórki H29. Rozprzestrzenianie
SeVV-eGFP-DP powinno więc być zanalizowane w porównaniu z rozprzestrzenianiem kompetentnych pod
względem replikacji SeV-eGFP.
6
[0098] W tym celu 1 x 10 komórek H29 zakażono średnio 100 SeVV-eGFP-∆P lub SeV-eGFP. 3, 5 i 10 dni
po zakażeniu przeprowadzono detekcję komórek fluoryzujących na zielono za pomocą mikroskopu
fluorescencyjnego.
15
EP 1851 239 B1
[0099] Namnożenie SeVV-eGFP-∆P mogło być z powodzeniem przeprowadzone przez komórkowe
udostępnienie białek P SeV. We wszystkich punktach badania było widoczne, że SeVV-eGFP-∆P i SeVeGFP namnażają się wydajnie w komórkach H29.
[0100] W przeciwieństwie do tego, nie można było zaobserwować propagacji SeVV-eGFP-∆P na komórki,
które nie dostarczają brakującego białka P („komórki docelowe”, np. komórki Vero), co potwierdza defekt
replikacji SeVV-eGFP-∆P (patrz punkt 8).
5.5 Ekspresja genów SeVV-eGFP-∆P w zakażonych komórkach docelowych
[0101] Stwierdzono brak namnażania SeVV-eGFP-∆P w typach komórek, które nie dostarczają białka P w
trans. Równocześnie zdolność ekspresji pozostawała znacznie niższa niż oczekiwana.
[0102] Podobnie jak w przypadku mutanta wścieklizny ∆P (Shoji i wsp. (2004) Virology 318, 295-305) tylko
nieliczne zakażone komórki wykazywały słabą fluorescencję eGFP (mniej niż 5%, patrz Fig. 11), choć
statystycznie przy MOI = 1 faktycznie około 70% komórek jest zakażonych jedną cząstką wirusa. Nawet przy
wyższym MOI = 5 można zaobserwować tylko pojedyncze świecące na zielono komórki Vero dzięki SeVVeGFP-∆P (patrz Fig. 12, góra z lewej strony).
[0103] To potwierdza założenie, że po zakażeniu komórki wirusem defektywnym pod względem genu P,
możliwa jest tylko pierwotna transkrypcja przez kompleks polimerazy wprowadzony z cząstki wirusa. W
przypadku mutanta SeV-∆P ponadto widocznie tylko niewielki procent zakażających cząstek jest w stanie to
zrobić, lub
ekspresję genu obserwuje się tylko, gdy równocześnie kilka nukleokapsydów ulegających
transkrypcji jest obecnych w komórce.
[0104] Dla terapeutycznego zastosowania tego defektywnego pod względem replikacji SeVV wydajność
ekspresji wydaje się być za niska lub musi się stosować nieproporcjonalnie wiele cząstek SeVV-∆P na
pacjenta. Dlatego jest pożądane zastosowanie wariantu SeV defektywnego pod względem replikacji, który
także przeprowadza wtórną transkrypcję. Prowadzi to do opracowania dalszych zmodyfikowanych
kompleksów polimerazy, które nie mogą replikować genomu wirusa, ale są w stanie dać podwyższoną
ekspresję terapeutycznego genu lub antygenu.
6. Wytwarzanie zmodyfikowanego konstruktu cDNA SeVV-eGFP-∆P
[0105] Aby ewentualnie poprawić zdolność do transkrypcji defektywnego pod względem genu P SeVV w
komórce docelowej, przygotowano kolejny zrekombinowany konstrukt, który w miejscu oryginalnej ramki
odczytu P koduje skróconą o 76 aminokwasów na N-końcu formę białka P („pSeVV-eGFP-P∆2-77”, patrz
punkt 3.1 i Fig. 8B).
[0106] Cząstki SeVV-eGFP-P∆2-77 były wytworzone i namnażane jak w punkcie 4.1 i 5.4.
6.1 Zachowanie wzrostowe SeVV-eGFP-P∆2-77 w komórkach pomocniczych H29
[0107] W komórkach pomocniczych H29 zakażonych SeVV-eGFP-P∆2-77 H29 produkowane jest kodowane
przez wirus białko PD2-77 skrócone o 76 aminokwasów na N-końcu razem z kodowanym w komórce
białkiem P.
[0108] Aby zbadać wpływ ekspresji skróconego białka P P∆2-77 na replikację wirusa, zakażano komórki
H29 (MOI = 3) SeVV-eGFP-P∆2-77, SeVV-eGFP-∆P lub wirusem kontrolnym SeV-eGFP jak w sposobie
opisanym z odniesieniem do kinetyki wzrostu SeVV-eGFP-∆P. W supernatantach z poszczególnych prób
badano w czasie 120 godzin za pomocą testu dawki infekcji komórek miano potomnych wirusów na
podstawie liczby komórek wyrażających eGFP.
16
EP 1851 239 B1
[0109] Z jednej komórki H29 zakażonej SeV-eGFP (kontrola dodatnia) w czasie 120 godzin uwalniało się
średnio 80 cząstek wirusa, a transkomplementacja białka P w komórkach H29 w tym przypadku nie była
wymagana. SeVV-eGFP-P∆2-77 mógł się namnażać w systemie transkomplementacji H29 z podobną
wydajnością jak SeVV-eGFP-∆P: z zakażonych komórek H29 po 120 godzinach uwolniło się około 20 x 106
cząstek wirusa SeVV-eGFP-∆P lub SeVV-eGFP-P∆2-77, co odpowiada liczbie około 40 uwolnionych
cząstek wirusa mutanta P na komórkę H29.
7. Porównanie ekspresji genów SeVV-eGFP-∆P i SeVV-eGFP-P∆2-77 i ilościowa synteza białka w
zakażonych komórkach docelowych
[0110] Aby zbadać, czy wektor SeVV-eGFP-P∆2-77 wykazuje wzmocnioną ekspresję transgenu w
porównaniu z SeVV-eGFP-∆P w zakażonych komórkach scharakteryzowano szczegółowo kodowaną przez
wirus ekspresję genu reporterowego eGFP i białka HN.
5
[0111] 5 x 10 komórek Vero zakażono SeVV-eGFP-P∆2-77 (MOI = 1) przy czym w dniu 2 po zakażeniu
zaobserwowano około 70% fluoryzujących komórek Vero (nie pokazano). To znaczy, że niemal każdy
kompleks RNP tego wariantu wektora wirusowego jest w stanie indukować mierzalną transkrypcję w
komórce docelowej.
7.1 Ilościowe oznaczenie ekspresji eGFP za pomocą analizy FACS
[0112] Kaseta transkrypcyjna, do której wprowadzono gen reporterowy eGFP w SeVV-eGFP-P∆2-77, ma w
późniejszych zastosowaniach w obszarze medycyny ma kodować antygen patogenu, np. pożądanego
wirusa. Ta ekspresja antygenu musi być wystarczająca, aby wywołać ochronną odpowiedź odpornościową u
pacjentów.
[0113] Aby upewnić się, że każdy nukleokapsyd SeVV-eGFP-P∆2-77, który zakaża komórkę docelową, jest
w stanie przeprowadzić wykrywalną ekspresję transgenu, zakażono tę samą liczbę komórek H29 i Vero tą
samą ilością cząstek wirusa i za pomocą analizy FACS sortowania komórek aktywowanego przez
fluorescencję (fluorescent activated cell sorting) i zastosowania cytometru przepływowego FACS-Calibur
porównywano liczbę wyrażających eGFP komórek H29 lub Vero. Dane oceniano na podstawie histogramu
wygenerowanego przez komputer, gdzie nanoszono sygnały fluorescencji zakażonych komórek w stosunku
do ich całkowitej liczby.
[0114] 2,5 x 105 komórek Vero lub H29 zakażono SeVV-eGFP-P∆2-77 lub defektywnym pod względem
genu P SeVV-eGFP-∆P z MOI = 1. Analizę białek za pomocą FACS przeprowadzono 24 godziny po
zakażeniu. Zakażone komórki wprowadzono do PBS i oznaczono w cytometrze przepływowym liczbę
komórek fluorescencyjnych. Wynik podano na Fig. 11 jako udział (%) fluoryzujących komórek H29 i Vero.
[0115] 24 godz. po zakażeniu komórek pomocniczych H29 SeVV-eGFP-∆P wykryto za pomocą analizy
FACS 86% komórek H29 wyrażających eGFP. Synteza komórkowa białka P podtrzymuje tworzenie nowych
kompleksów P:L i w ten sposób produkcję nowego mRNA, co prowadzi do syntezy białek eGFP w zakażonej
komórce. Gdy natomiast zakażano komórki Vero SeVV-eGFP-∆P, nie wykryto ekspresji białka eGFP ani 24
godziny po zakażeniu ani w późniejszym punkcie czasowym w dalszych próbach. Kompleksy P:L
przenoszone przez nukleokapsydy SeVV-eGFP-∆P, nie są w stanie przy zakażeniu MOI = 1 przeprowadzić
wykrywalnej ekspresji w zakażonych komórkach Vero.
[0116] 24 godz. po zakażeniu SeVV-eGFP-P∆2-77 można natomiast było zidentyfikować przez analizę
FACS prawie 80% komórek H29 wyrażających eGFP i także 75% komórek Vero wyrażających eGFP. Przy
17
EP 1851 239 B1
zakażeniu komórek H29 transkrypcja mRNA eGFP może być podtrzymywana przez komórkową syntezę
białka P i w ten sposób przez nowe kompleksy P:L. Przy zakażeniu komórek Vero SeVV-eGFP-P∆2-77
transkrypcja jest wzmacniana przez nową syntezę skróconego na N-końcu białka P∆2-77.
[0117] Z tych wyników można wysnuć ważne stwierdzenie dotyczące liczby zdolnych do transkrypcji SeVVeGFP-P∆2-77: komórki H29 i Vero zakażano z MOI 1. Teoretycznie występujące wielokrotne zakażenia
komórki są statystycznie równie mało prawdopodobne w obu próbach. 24 godziny po zakażeniu można było
zidentyfikować prawie 80% komórek H29 wyrażających eGFP i około 75% komórek Vero wyrażających
eGFP. Z tego można wywnioskować, że każdy kompleks RNP ze skróconym wariantem P P∆2-77, który jest
zdolny do ekspresji transgenu w komórce pomocniczej P, daje także ekspresję transgenu w komórce
docelowej. W przeciwieństwie do tego wariant SeVV-eGFP-∆P z pełną delecją ORF P nie ma tej
właściwości.
7.2 Test funkcji białka HN wyrażanego w zakażonych komórkach docelowych
[0118] Za pomocą testu adsorpcji hemu (HAD) zbadano skuteczność wiązania ludzkich erytrocytów i w ten
sposób wykryto skuteczność ekspozycji białek wirusa HN na pojedynczej zakażonej komórce (Fig. 12)..
[0119] 5 x 105 komórek Vero zakażono SeVV-eGFP-P∆2-77 przy niskim MOI = 0,5. W przeciwieństwie do
tego, w przypadku SeVV-eGFP-∆P konieczna była infekcja komórek Vero z dziesięciokrotnie wyższym MOI
= 5, aby w ogóle móc zaobserwować nawet pojedyncze fluoryzujące komórki. Po 1-godzinnej adsorpcji
przeprowadzono wymianę pożywki na DMEM + 10% FCS. Następnie komórki inkubowano kilka dni w 33oC.
Ekspresję transgenu obu wariantów wektorów monitorowano przez fluorescencję eGFP. W dniu 5 i 9 po
zakażeniu przeprowadzono szereg testów HAD, aby zanalizować ekspozycję wirusowych białek HN pod
kątem wiązania ludzkich erytrocytów.
[0120] Choć w przypadku SeVV-eGFP-∆P przy MOI = 5 statystycznie 99,3% komórek Vero powinno być
zakażonych, pod mikroskopem udało się zaobserwować zaledwie 0,01% komórek dodatnich względem
eGFP (Fig. 12 z góry z lewej). Natomiast dla SeVV-eGFP-PD2-77 stwierdzono zieloną fluorescencję przy
MOI = 0, 5, zgodnie z oczekiwaniem, w 40% komórek (Fig. 12 z dołu z lewej).
5
[0121] Dwa dni po zakażeniu SeVV-eGFP-∆P tylko połowa komódek eGFP dodatnich (25 z 5 x 10
zakażonych) była w stanie wiązać erytrocyty na swojej powierzchni. (Fig. 12 środek u góry). Po dalszej
inkubacji i kolejnym teście HAD nie zachodziła już adsorpcja erytrocytów na zakażonych komórkach. Z
drugim wariantem SeVV defektywnym pod względem replikacji SeVV-eGFP-P∆2-77 uzyskano znacząco
lepsze wyniki: 5 dni po zakażeniu około 40% zakażonych komórek (MOI = 0,5) było w stanie wiązać
erytrocyty na swojej powierzchni (Fig. 12 na dole środek). W pojedynczych komórkach stwierdzono różną
zdolność do wiązania od 10 do 70 skompleksowanych czerwonych krwinek. W ten sposób wykazano, że
komórki zakażone SeVV-eGFP-P∆2-77 5 dni po zakażeniu są w stanie eksponować białka HN na
powierzchni komórki, i funkcjonalny test HAD może być oceniony jako dodatni. Równocześnie stwierdzono
wydajną ekspresję białek HN w zakażonej komórce na podstawie różnic ilości związanych czerwonych
krwinek.
[0122] Zakażone komórki dalej inkubowano w 33oC, podczas czego aktywność neuramidazy białka HN
powoduje uwolnienie przyłączonych do zakażonych komórek erytrocytów. Komórki przepłukano, aby usunąć
uwolnione erytrocyty i inkubowano przez następne 4 dni w 33oC. W dniu 9 po zakażeniu ponownie
przeprowadzono test HAD. Obecnie można było wykryć około 30% komórek Vero dodatnich dla HAD. Liczba
związanych czerwonych krwinek spadła do 5 do 20 erytrocytów na komórkę.
18
EP 1851 239 B1
[0123] Tak więc, po 9 dniach po zakażeniu funkcjonalne HN nadal było wystarczająco syntetyzowane
przez defektywny pod względem replikacji wirus SeVV-eGFP-P∆2-77. W przeciwieństwie do tego wariant
SeVV-eGFP-∆P z całkowitą delecją ORF P nie ma tych właściwości.
7.3 Ilościowe oznaczenie ekspresji eGFP za pomocą analizy typu Western blot
[0124] Przeprowadzono pół-ilościowe oznaczenie ekspresji
wektora SeV eGFP defektywnego pod
względem replikacji w porównaniu z SeV-eGFP kompetentnym pod względem replikacji za pomocą analizy
typu Western blot stosując seryjne rozcieńczenia całkowitego białka komórkowego.
[0125] 5 x 105 komórek Vero zakażono SeV-eGFP lub SeVV-eGFP-P∆2-77 (MOI = 3). 24 godziny po
zakażeniu rozerwano komórki. Ekstrakty komórkowe rozdzielono w SDS-PAGE w szeregach rozcieńczeń
(1:2) od 20 µg do 2,5 µg całkowitej ilości. Białka przeniesiono na błonę PVDF i wykryto najpierw kodowane
przez wirus białko eGFP (26 kDa) za pomocą analizy typu Western blot (Fig. 13).
[0126] Białko fluorescencyjne eGFP wykryto zarówno w komórkach Vero zakażonych SeV-eGFP jak i w
zakażonych SeVV-eGFP-P∆2-77, za pomocą analizy typu Western blot. Porównanie intensywności
sygnałów eGFP pozwala na stwierdzenie, że ekspresja powodowana przez defektywny pod względem
replikacji SeVV-eGFP-P∆2-77 jest obniżona o czynnik około 16 w porównaniu z kompetentnym pod
względem replikacji SeV-eGFP.
[0127] Zmniejszenie o czynnik 16 jest niewielkie i pozwala na stwierdzenie, że SeVV-eGFP-P∆2-77, mimo
modyfikowanego białka P, może spowodować bardzo wydajną wtórną transkrypcję.
7.4 Oszacowanie ekspresji HN za pomocą analizy typu Western blot
[0128] Białko HN SeV jest, w przeciwieństwie do białka eGFP, białkiem powierzchniowym związanym z
błoną i stanowi ważną determinantę antygenową. Przez względne określenie ilościowe poziomu ekspresji
białka HN w komórkach zakażonych SeVV-eGFP-P∆2-77, można było wyciągnąć wniosek dotyczący
intensywności ekspresji antygenu HN SeV.
[0129] Przeprowadzono pół-ilościową ocenę ekspresji HN u defektywnego pod względem replikacji wektora
SeV w porównaniu do kompetentnego pod względem replikacji SeV-eGFP za pomocą analizy typu Western
blot stosując seryjne rozcieńczenia całkowitego białka komórkowego.
W każdym przypadku 5 x 105 komórek Vero zakażono w dwóch równoległych próbkach SeV-eGFP lub
SeVV-eGFP-P∆2-77 (MOI = 1) i inkubowano przez 24 lub 48 godzin. Następnie
komórki rozerwano.
Ekstrakty komórkowe rozdzielono metodą SDS-PAGE w szeregach rozcieńczeń (1:2) od 16 µg do 2 µg
całkowitej ilości. Białka przeniesiono na błonę PVDF i wykryto kodowane przez wirus białko HN (60 kDa) za
pomocą monoklonalnego przeciwciała anty-HN (Fig. 14).
[0130] Białko HN wykryto w przypadku komórek Vero zakażonych SeV-eGFP po obu czasach inkubacji we
wszystkich ścieżkach (16 µg do 2 µg łącznej ilości białka; ścieżki 2-5 z prawej i lewej). Dla SeVV-eGFP-P∆277 prążek białka HN jest jeszcze widoczny w ścieżkach z łączną ilością białka 16 µg i 8 µg (ścieżka 7, 8)
jednak ze słabą intensywnością. Względne określenie ilościowe ekspresji HN w komórkach Vero
zakażonych SeVV-eGFP-P∆2-77 w stosunku do SeV-eGFP przeprowadzono przez porównanie ścieżek z 16
i 8 µg i z 2 µg (ścieżki 7 i 8 w porównaniu z 5, lewo i prawo) i pozwala to na ocenę zmniejszenia ekspresji
HN o czynnik 8-16 w wariancie delecyjnym P, niezależnie od czasu inkubacji. Można wyciągnąć wniosek, że
tempo transkrypcji w komórkach zakażonych SeVV-eGFP-P∆2-77
jest stosunkowo wysokie i zatem
ekspresja trans genu w wirusowym wektorze defektywnym pod względem replikacji jest na ogół wysoka.
19
EP 1851 239 B1
[0131] Przy uwzględnieniu obu pomiarów białka eGFP i HN można przyjąć przeciętne obniżenie ekspresji o
czynnik 10.
8. Defektywna replikacja SeVV-eGFP-P∆2-77 w komórce docelowej
[0132] Gdy komórki Vero są zakażane kompetentnym pod względem replikacji SeV-eGFP, w dwóch
następujących potem dniach wokół początkowo zakażonej silnie fluoryzującej komórki powstaje plamka z do
tysiąca kolejnych fluoryzujących komórek. Aby wykazać defektywność replikacji SeVV-eGFP-PD2-77 w
komórkach Vero należało potwierdzić brak tego przyrostu w komórkach z zieloną fluorescencją wokół
pierwotnej zakażonej komórki docelowej przy uwzględnieniu naturalnego tempa podziału komórek Vero.
Komórki Vero dzielą się średnio co 24 godziny. Gdy komórki Vero zakazi się SeVV-eGFP-P∆2-77 po około
24 godzinach można zaobserwować widoczną ekspresję eGFP. Zaobserwowano, że po kolejnych 24
godzinach fazy inkubacji z tej pierwotnie zakażonej fluoryzującej komórki Vero na podstawie naturalnego
podziału w niektórych przypadkach powstają dwie (słabiej) fluoryzujące komórki potomne. Ta obserwacja nie
1
4
ma żadnego związku z namnażaniem wirusa, przy którym z zakażonej komórki uwalnianych jest 10 do 10
cząstek wirusa, które mogą zakażać komórki docelowe i wówczas mogą zakażać położone obok komórki. To
naturalne tempo podziału zakażonych komórek nie wpływa jednak na siłę poziomu ekspresji eGFP, która
słabnie z rosnącą liczbą podziałów komórkowych. Ta obserwacja wykazuje, że wektor wirusowy SeVVeGFP-P∆2-77 jest defektywny pod względem replikacji genomu, tak więc nie są syntetyzowane nowe
genomy. Gdy kolejne następujące po sobie podziały komórkowe zakażonej komórki prowadzą do ciągłego
spadku intensywności fluorescencji, aż zostanie ona wygaszona, można w ten sposób wykluczyć
namnażanie wirusa.
[0133] Aby ostatecznie potwierdzić defektywność SeVV-eGFP-P∆2-77 pod względem replikacji w
komórkach docelowych, przeprowadzono ostatnie badanie: około 20 x 106 komórek Vero umieszczono w
kolbie T75. Komórki były wysiane już na początku fazy inkubacji z wysoką gęstością i w efekcie nie dzieliły
się już intensywnie. Te komórki Vero zakażono SeVV-eGFP-P∆2-77 z MOI 0,001. Zmianę podłoża na
DMDM z 5% FCS (dla zmniejszonej aktywności podziałowej) przeprowadzono po inkubacji przez jedną
godzinę i następnie komórki Vero inkubowano w 33oC (P1). Dwa dni po zakażeniu zaobserwowano, co
odpowiadało wybranemu MOI, początkowo kilka tysięcy leżących pojedynczo zakażonych fluoryzujących
komórek Vero. Ze względu na wysoką gęstość komórek w ciągu czterech następujących potem dni inkubacji
w zasadzie nie dochodziło do podziałów komórek, tzn. liczba zakażonych komórek wykrytych za pomocą
fluorescencji pozostała stała. Gdyby w tym czasie tworzyły się cząstki wirusa, mogłyby zakażać położone
obok komórki, co odbiłoby się w zwiększonej fluorescencji. Nawet po 8 dniach można było wykluczyć
propagację wirusowego wektora ze względu na brak nowych zakażeń otaczających komórek. Aby zapewnić
komórkom świeże podłoże, usuwano supernatant i komórki Vero pokrywano nową pożywką. 12 dni po
rozpoczęciu inkubacji komórki Vero odkleiły się od pożywki hodowlanej. Podczas całego czasu trwania
eksperymentu nie zaobserwowano replikacji wektora wirusowego w postaci przyrostu fluoryzujących
komórek. Propagację SeVV-eGFP-P∆2-77 z pierwotnie zakażonych komórek do otaczających komórek Vero
przez produkcję nowych genomów wirusowych jak i cząstek wirusowych może być więc wykluczona.
Dlatego też można określić SeVV-eGFP-P∆2-77 jako wektor wirusowy defektywny pod względem replikacji.
Podsumowanie:
[0134] Podane powyżej wyniki wykazują, że przez celową manipulację genów dla składników kompleksu
polimerazy można doprowadzić do produkcji wirusów defektywnych pod względem replikacji, zawierających
20
EP 1851 239 B1
RNA o ujemnej polarności, które są jeszcze w stanie transkrybować geny kodowane przez wirus, ale nie są
już zdolne do replikacji genomu wirusa.
[0135] Dla wirusa Sendai dokładniej badano dwa szczególne warianty wirusa, u których gen dla
fosfoproteiny będącej kofaktorem polimerazy albo był całkowicie wydeletowany („SeVV-eGFP-∆P”) lub były
usunięte kodony dla aminokwasów 2-77 („SeVV-eGFP-P∆2-77”). Oba wektory SeV są defektywne pod
względem replikacji w komórkach, które nie dostarczają białka P w trans (tzw. komórki docelowe), jednak
różnią się znacznie pod względem swojej ekspresji genów.
[0136] Choć dla SeVV-eGFP-∆P przy MOI = 5 statystycznie tylko 0,7% komórek Vero pozostaje
niezakażonych, 99,3% powinno zawierać przynajmniej jeden kompleks RNP – pod mikroskopem
zaobserwowano tylko 0,01% komórek dodatnich dla eGFP. Z tego można matematycznie wywnioskować, że
dochodzi do widocznej ekspresji transgenu tylko, gdy 15 lub więcej RNP SeVV-eGFP-∆P jest równocześnie
obecnych w zakażonej komórce docelowej.
[0137] Ten defektywny pod względem genu P wariant SeVV wykazuje podobnie słabą ekspresję jak
analogiczny wariant ∆P wścieklizny (Shoji i wsp., powyżej). Oba wektory są zdolne w zakażonej komórce
docelowej tylko do transkrypcji pierwotnej przez kompleks polimerazy dostarczony z cząstki wirusa. Dla
terapeutycznego zastosowania wirusa jest jednak pożądana silniejsza ekspresja kodowanego transgenu lub
antygenu. To wymaganie może być spełnione za pomocą defektywnego pod względem replikacji wariantu
SeVV-eGFP-P∆2-77, który w komórkach docelowych daje ekspresję obniżoną średnio o czynnik 10 w
porównaniu z kompetentnym pod względem replikacji SeV. Dzięki obecności genu dla białka P skróconego
na N-końcu w genomie wektora możliwa jest nie tylko pierwotna, ale także wtórna transkrypcja. Jest to
potwierdzone przez nowopowstałe, zmodyfikowane kompleksy polimerazy, które zawierają kodowane przez
wektor białko P∆2-77; nie podtrzymuje ono jednak działania replikacyjnego polimerazy.
[0138] Za pomocą oznaczenia ilościowego syntezy białka w zakażonych komórkach docelowych wykazano,
że defektywny pod względem replikacji wektor wirusowy SeVV-eGFP-P∆2-77 jest w stanie przeprowadzić
wydajną transkrypcję i ekspresję genów kodowanych przez wirus. Nie tylko transgen położony blisko części
3’ (eGFP) był efektywnie syntetyzowany, ale także gen HN leżący w pozycji 6 genomu był transkrybowany
przynajmniej przez 9 dni po zakażeniu i białko było funkcjonalnie eksponowane na zakażonych komórkach
docelowych.
9. Określenie odpowiedzi immunologicznej indukowanej w modelu mysim przez szczepionkę z RNA
defektywnym pod względem replikacji RNA
[0139] Można było wykazać, że korzystnie przez delecję w genie P („P∆2-77”) powstaje zmieniony kompleks
polimerazy wirusowej, który nie pozwala już na syntezę nowych genomów. Równocześnie po zakażeniu
takimi defektywnymi pod względem replikacji wirusami uzyskana ekspresja genów wirusa w komórce
docelowej jest tylko około 10x słabsza w porównaniu do zakażenia wirusem kompetentnym pod względem
replikacji.
[0140] Aby wykazać wystarczającą immunogenną właściwość defektywnego pod względem replikacji wirusa
zawierającego RNA o ujemnej polarności jako wektora do szczepionek, wprowadzono do genomu wirusa
antygeny lub determinanty antygenowe dwóch heterologicznych wirusów (ludzki wirus paragrypy typ 3,
hPIV3 i wirus syncytium oddechowego, RSV). W tym celu skonstruowano defektywny pod względem
replikacji SeV P∆2-77, w którym wprowadzono geny dla oryginalnych białek powierzchniowych F i HN
zamieniono na geny, które kodują chimerowe białka F i HN SeV/hPIV3. Chimerowe białko F zawiera 558
21
EP 1851 239 B1
aminokwasów i składa się zewnątrzkomórkowej domeny hPIV3 (493 aminokwasy), transbłonowej domeny
SeV (23 aminokwasy) i cytoplazmatycznej domeny SeV (42 aminokwasy). Chimerowe białko HN ma 579
aminokwasów i składa się z domeny cytoplazmatycznej SeV (35 aminokwasów), transbłonowej domeny SeV
(25 aminokwasów) i zewnątrzkomórkową domenę hPIV3 (519 aminokwasów). Sekwencje aminokwasów
chimerowego białka F i chimerowego białka HN są pokazane w liście sekwencji jako SEK ID NR 27 i 28.
[0141] Przez wstawienie chimerowych genów do genomu wirusa powstaje nowa antygenowość i zarazem
wydajne montowanie cząstek szczepionki przy jej produkcji.
[0142] W dodatkowej kasecie ekspresyjnej wprowadzonej między dwoma genami wirusowymi zakodowano
białka powierzchniowe F z RSV, przez co konstrukt został rozszerzony do szczepionki biwalentnej.
[0143] Tę nową szczepionkę testowano w modelu zwierzęcym. Grupy myszy Balb/C immunizowano
donosowo trzykrotnie w odstępach trzech tygodni dwoma różnymi preparatami wirusa (grupa A lub C, po 104
zakaźnych jednostek), grupa kontrolna (B) otrzymała PBS zamiast szczepionki. Po trzeciej immunizacji w
celu analizy odpowiedzi immunologicznej uzyskano płyn z płukania nosa (NW) i z płukania oskrzelików
płucnych (BAL) i wyizolowano surowicę w celu analizy humoralnej odpowiedzi immunologicznej. Za pomocą
ELISA ustalono ilość indukowanych immunoglobulin IgA i IgG swoistych wobec hPIV3 i RSV. Prototyp
szczepionki defektywny pod względem replikacji dał wyraźną indukcję przeciwciał IgA swoistych względem
hPIV3 (Fig. 15A), ale indukcja przeciwciał IgA przeciw RSV była słabsza (nie pokazano). Indukcja
humoralnej odpowiedzi immunologicznej przeciw antygenom powierzchniowym obu wirusów dała
porównywalnie wysokie miana, ilość specyficznej IgG różni się o czynnik 2 (Fig. 15B). Dalej przeprowadzona
analiza IgG anty hPIV3 wykazała, że zaindukowane przeciwciała mają właściwości neutralizujące (miano
1/64). Przeciwnie, jako oczekiwano, w grupach kontrolnych nie stwierdzono indukcji swoistych IgA lub IgG.
[0144] Szczepionka według wynalazku była w stanie indukować specyficzną odpowiedź śluzówkową i
humoralną odpowiedź immunologiczną przeciw heterologicznym antygenom wirusowym. Dodatkowe
eksperymenty wykazały, że limfocyty immunizowanych myszy produkowały interferon γ, podczas gdy nie
wykazano IL-5. Wynik ten wskazuje że biwalentna, defektywna pod względem replikacji szczepionka RNA
jest w stanie wywołać odpowiedź odpornościową komórek T, która jest podstawą do długo utrzymującej się
odporności.
Podsumowanie
[0145] Po infekcji zwierząt doświadczalnych modyfikowanym wektorem, do którego wprowadzono kodujące
sekwencje dla antygenów dwóch heterologicznych wirusów wykazano indukcję neutralizujących przeciwciał.
Wykazuje to potencjał defektywnych pod względem replikacji wirusów zawierających RNA o ujemnej
polarności dla opracowania nowych szczepionek.
10. Lista stosowanych oligonukleotydów DNA
[0146] Stosowane w powyższych przykładach oligonukleotydy DNA przedstawiono w następującej Tabeli 3.
22
EP 1851 239 B1
Tabela 3
Lista sekwencji
[0147]
<110> MAX-PLANCK-GESELLSCHAFT ZUR FÖRDERUNG DER WISSENSCHAFTEN E.V.
<120> Wirusy RNA z defektywną replikacja jako szczepionki
<130> 33778P WO
<150> DE102005006388.8
<151> 2005-02-11
23
EP 1851 239 B1
<160> 28
<170> PatentIn wersja 3.3
<210>
<211>
<212>
<213>
1
19
DNA
sztuczna sekwencja
<220>
<223> oligonukleotyd
<400> 1
ggaaacagct atgaccatg
<210>
<211>
<212>
<213>
19
2
58
DNA
sztuczna sekwencja
<220>
<223> oligonukleotyd
<400> 2 ggatcattag taccttgaag cctcgtagat cgcggccgcg tgaactttgg cagcaaag 58
<210>
<211>
<212>
<213>
3
57
DNA
sztuczna sekwencja
<220>
<223> oligonukleotyd
<400> 3
ggcttcaagg tactaatgat ccgtagtaag aaaaacttag ggtgaaagta ttccacc
<210>
<211>
<212>
<213>
57
4
18
DNA
sztuczna sekwencja
<220>
<223> oligonukleotyd
<400> 4
ggtaggtgtc tatgaggc
<210>
<211>
<212>
<213>
18
5
44
DNA
sztuczna sekwencja
<220>
<223> oligonukleotyd
<400> 5
ggaaggaaaa gcggccgccg gcgggatcat acgaggcttc aagg
24
44
EP 1851 239 B1
<210>
<211>
<212>
<213>
6
57
DNA
sztuczna sekwencja
<220>
<223> oligonukleotyd
<400> 6
cctgtgtttc tgcggccgcc gttcgcgagg ccggcccgtg aactttggca gcaaagc
<210>
<211>
<212>
<213>
7
44
DNA
sztuczna sekwencja
<400> 7
cgcgggcccg gggcggccgc gtcgccacca tggtgagcaa gggc
<210>
<211>
<212>
<213>
44
8
26
DNA
sztuczna sekwencja
<220>
<223> oligonukleotyd
<400> 8
gatgcatgct cgagcggccg ctttac
<210>
<211>
<212>
<213>
26
9
36
DNA
sztuczna sekwencja
<220>
<223> oligonukleotyd
<400> 9
ggattactat cgccggcggt cgccaccatg gtgagc
<210>
<211>
<212>
<213>
57
36
10
38
DNA
sztuczna sekwencja
<220>
<223> oligonukleotyd
<400> 10
cgctaactgt cgccggcgtt tacttgtaca gctcgtcc
38
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
25
EP 1851 239 B1
<213> sztuczna sekwencja
<220>
<223> oligonukleotyd
<400> 11
cggatcaagt ggccggccgt cgccaccatg gtgcgc
<210>
<211>
<212>
<213>
36
12
42
DNA
sztuczna sekwencja
<220>
<223> oligonukleotyd
<400> 12
cgcgaatatc ggccggccaa gtctacagga acaggtggtg gc
<210>
<211>
<212>
<213>
42
17
17
DNA
sztuczna sekwencja
<220>
<223> oligonukleotyd
<400> 17
ccctgacaca ctccttc
<210>
<211>
<212>
<213>
17
18
31
DNA
sztuczna sekwencja
<220>
<223> oligonukleotyd
<400> 18
gcgccgctcg aggcggtaag tgtagccgaa g
<210>
<211>
<212>
<213>
31
19
34
DNA
sztuczna sekwencja
<220>
<223> oligonukleotyd
<400> 19
cctgcgctcg agctcatccc gggtgaggca tccc
<210>
<211>
<212>
<213>
34
20
30
DNA
sztuczna sekwencja
26
EP 1851 239 B1
<220>
<223> oligonukleotyd
<400> 20
ggcgacgcgt cagtctcaca gcctaattcg
<210>
<211>
<212>
<213>
30
21
47
DNA
sztuczna sekwencja
<220>
<223> oligonukleotyd
<400> 21
cccccttttt ctcgagatgt cgacccaaga taatcgatca ggtgagg
<210>
<211>
<212>
<213>
47
22
46
DNA
sztuczna sekwencja
<220>
<223> oligonukleotyd
<400> 22
tttttccccc ctcgagttac tagttggtca gtgactctat gtcctc
<210>
<211>
<212>
<213>
46
27
558
PRT
sztuczna sekwencja
<220>
<223> białko chimerowe
<400> 27
27
EP 1851 239 B1
28
EP 1851 239 B1
29
EP 1851 239 B1
<210>
<211>
<212>
<213>
28
579
PRT
sztuczna sekwencja
<220>
<223>
białko chimerowe
<400>
28
30
EP 1851 239 B1
31
EP 1851 239 B1
32
EP 1851 239 B1
Zastrzeżenia patentowe
1. Zrekombinowany wirus zawierający RNA o ujemnej polarności, zawierający genom wirusa z mutacją w
genie P, która prowadzi do utraty zdolności do replikacji bez utraty zdolności do wtórnej transkrypcji.
2. Wirus według zastrz. 1, znamienny tym, że jest paramyksowirusem.
3. Wirus według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, jest wirusem Sendai.
4. Wirus według
zastrz. 1, znamienny tym, że mutacja dotyczy N-końcowej części sekwencji białka
kodowanego przez gen P.
5. Wirus według zastrz. 4, znamienny tym, że mutacja obejmuje delecję
(a) aminokwasów 2-27 białka kodowanego przez gen P lub
(b) części sekwencji (a) prowadzącej do utraty zdolności do replikacji.
6. Wirus według zastrz. 1 do 5, znamienny tym, że genom wirusa zawiera przynajmniej jedną sekwencję
kodującą heterologiczny produkt genu.
7. Wirus według zastrz. 6, znamienny tym, że heterologiczny produkt genu jest białkiem, rybozymem,
cząsteczką antysensowną lub cząsteczką siRNA.
8. Wirus według zastrz. 6 lub 7, znamienny tym, że heterologiczny produkt genu jest białkiem reporterowym,
antygenem lub białkiem terapeutycznym.
9. Wirus według jednego z zastrz. 6 do 8, znamienny tym, że heterologiczny produkt genu jest antygenem
heterologicznego patogenu, wybranego z wirusów, bakterii i pierwotniaków.
10. Wirus według jednego z zastrz. 6 do 9, znamienny tym, że heterologiczny produkt genu jest antygenem
wirusa.
11. Wirus według zastrz. 10, znamienny tym, że genom wirusa koduje kilka heterologicznych antygenów z
tych samych lub różnych wirusów.
12. Wirus według jednego z zastrz. 6 do 11, znamienny tym, że sekwencja kodująca przynajmniej jeden
heterologiczny produkt genu jest wstawiona do genomu wirusa i/lub zastępuje sekwencje kodujące
homologiczny produkt genu.
13. Wirus według jednego z zastrz. 1 do 12, znamienny tym, że wirus w porównaniu do typu dzikiego
wykazuje zdolność do transkrypcji obniżoną o co najwyżej czynnik 20.
14. Nukleokapsyd wirusa zawierającego RNA o ujemnej polarności według jednego z zastrz. 1 do 13.
15. Genom wirusa zawierającego RNA o ujemnej polarności według jednego z zastrz. 1 do 13.
16. Cząsteczka DNA, która koduje genom i/lub antygenom zrekombinowanego wirusa zawierającego RNA o
ujemnej polarności według jednego z zastrzeżeń 1 do 13.
17. Cząsteczka DNA według zastrz. 16, znamienna tym, że jest funkcjonalnie połączona z sygnałem
transkrypcji.
18. Cząsteczka DNA według zastrz. 17, znamienna tym, że sygnał transkrypcji jest promotorem bakteriofaga
np. promotorem T7 lub SP6.
19. Komórka, która zawiera wirus według jednego z zastrz. 1 do 13, nukleokapsyd według zastrz. 14, genom
według zastrz. 15 lub cząsteczkę DNA według jednego z zastrz. 16 do 18.
20. Komórka według zastrz. 19, znamienna tym, że jest komórką do namnażania wektora.
21. Komórka według zastrz. 19, znamienna tym, że jest komórką do produkcji wirusa.
33
EP 1851 239 B1
22. Komórka według zastrz. 21, znamienna tym, że dalej zawiera heterologiczną cząsteczkę DNA kodującą
heterologiczną polimerazę RNA zależną od DNA, która przeprowadza transkrypcję cząsteczki DNA
kodującej zrekombinowany wirus zawierający RNA o ujemnej polarności.
23. Komórka według zastrz. 19, znamienna tym, że jest komórką do namnażania wirusa.
24. Komórka według jednego z zastrz. 19 do 23, znamienna tym, że ponadto zawiera cząsteczki DNA
kodujące wirusowe białko P.
25. Sposób wytwarzania wirusa zawierającego RNA o ujemnej polarności według jednego z zastrz. 1 do 14,
obejmujący etapy:
(a) wytwarzania komórki, która jest transfekowana cząsteczką DNA, która koduje genom wirusa
zawierającego RNA o ujemnej polarności, zawierającego mutację w genie P, która prowadzi do utraty
zdolności do replikacji genomu wirusowego bez utraty zdolności do transkrypcji i wtórnej i ewentualnie
przynajmniej jedną sekwencję kodującą heterologiczny produkt genu, i
(b) hodowlę komórki w warunkach, w których zachodzi transkrypcja cząsteczki DNA według (a) i jest
tworzony wirus zawierający RNA o ujemnej polarności.
26. Sposób według zastrz. 25 dalej obejmujący wydobycie nukleokapsydu lub genomu wirusowego z wirusa
zawierającego RNA o ujemnej polarności.
27. Sposób namnażania wirusa zawierającego RNA o ujemnej polarności według jednego z zastrz. 1 do 13,
obejmujący etapy:
(a) wytworzenia komórki, która jest zakażona wirusem zawierającym RNA o ujemnej polarności,
zawierającym mutację w genie P, która prowadzi do utraty do zdolności replikacji genomu wirusowego bez
utraty zdolności do transkrypcji wtórnej, i ewentualnie, jeżeli jest to konieczne , przynajmniej jedną
sekwencję kodującą heterologiczny produkt genu, i
(b) hodowli komórki w warunkach, w których zachodzi namnożenie wirusa.
28. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera zrekombinowany wirus zawierający RNA o
ujemnej polarności według jednego z zastrz. 1 do 13, nukleokapsyd według zastrz. 14 lub genom wirusa
według zastrz. 15, jako substancję czynną jak i ewentualnie typowy farmaceutyczny nośnik i/lub substancje
pomocnicze.
29. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 28 do stosowania jako szczepionka.
30. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 29 jako szczepionka mono- lub poliwalentna.
31. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 29 lub 30 jako szczepionka przeciw zakażeniom wirusami,
na przykład jako szczepionka przeciw zakażeniom patogennymi wirusami zawierającymi RNA o ujemnej
polarności.
32. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 28 do zastosowania w terapii przeciw nowotworom.
33. Kompozycja farmaceutyczna według jednego z zastrz. 28 do 32 do stosowania u pacjentów z grup
podwyższonego ryzyka.
34. Kompozycja farmaceutyczna według jednego z zastrz. 28 do 33 obejmująca nukleokapsyd w natywnej
osłonce wirusa.
35. Zastosowanie komórki, która stabilnie wyraża w sposób konstytutywny lub zaindukowany białko P wirusa
zawierającego RNA o ujemnej polarności do wytwarzania lub namnożenia wirusów zawierających RNA o
ujemnej polarności według jednego z zastrz. 1 do 13, nukleokapsydów według zastrz. 14 lub genomów
wirusa według zastrz. 15.
34
EP 1851 239 B1
36. Zastosowanie według zastrz. 35, znamienne tym, że komórka jest komórką ssaka.
37. Zastosowanie według zastrz. 35 lub 36, znamienne tym, że komórka jest wybrana z komórki H29 (DSM
ACC2702) lub pochodzącej od niej komórki.
35
EP 1851 239 B1
5’NTR
3’NTR
5’NTR
regiony genu(nt) całkowity genom: 15384 nt
36
EP 1851 239 B1
37
EP 1851 239 B1
3’NTR
5’NTR
5’NTR
5’NTR
eGFP
5’NTR
3’NTR
5’NTR
3’NTR
5’NTR
3’NTR
5’NTR
5’NTR
dsRED
eGFP
3’NTR
3’NTR
5’NTR
5’NTR
5’NTR
38
EP 1851 239 B1
39
EP 1851 239 B1
40
EP 1851 239 B1
41
EP 1851 239 B1
42
EP 1851 239 B1
IgG anty-hPIV3
43