Zastosowanie metody real-time RT-PCR do oznaczania ekspresji
advertisement
MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2014, 66: 17 - 22 Zastosowanie metody real-time RT-PCR do oznaczania ekspresji genów receptorów Toll-like na poziomie mRNA The use of real-time RT-PCR method for the determination of Toll-like genes expression at mRNA level Agnieszka Częścik, Agnieszka Trzcińska, Milena Dunal-Szczepaniak, Joanna Siennicka Zakład Wirusologii, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego – Państwowy Zakład Higieny, ul. Chocimska 24, 00-791 Warszawa W pracy przedstawiono metodykę doświadczenia mającego na celu optymalizację warunków stymulacji komórek PBMC i walidację metody real-time RT-PCR stosowanej do oznaczania ekspresji na poziomie mRNA receptorów Toll-like w tych komórkach. Słowa kluczowe: receptory Toll-like, ekspresja, walidacja, real-time RT-PCR ABSTRACT Introduction: Toll-like receptors (TLRs) are an important component of a innate immune system. Stimulation of TLRs, through action with helper T cells, could change Th1/Th2 balance and thus affect adaptive immune response. The aim of this work was to optimize the stimulation of the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and the validation of real-time RT-PCR method for determination of Toll-like gene expression in these cells. Methods: PBMCs from healthy donors were stimulated with measles viruses and ligands for TLR2 and TLR4. For examinations the real time RT-PCR (QuantiFast®Assay, Qiagen) was used. Fold change of TLRs expression was normalized to GAPDH and estimated by 2-∆∆Ct method. Validation of real-time RT-PCR method was performed for repeatability and efficiency. Results: The level of gene expression varies between individuals and was dose and time of incubation dependent. The efficiency of real-time RT-PCR was 90.4% ± 10.2 for GAPDH, 87.0% ± 8.2 for TLR2 and 44.5% ± 9.2 for TLR4. Repeatability, expressed as relative standard deviation (RSD) for Ct values was less than 0.70% for GAPDH, <3.2% for TLR2 and <2.84% for TLR4. Conclusions: Based on obtained results, the optimal conditions for stimulation were: 10 μg/ml/24h for LPS, 1μg/ml/6h for Pam3CSK4 and 1250 MeV infectious particles/24h. Key words: Toll-like receptors, expression, validation, real-time RT-PCR 18 A. Częścik i inni Nr 1 WSTĘP Receptory Toll-like (TLR) są ważnym elementem reakcji odpornościowej. Stanowią pomost pomiędzy odpowiedzią wrodzoną (innate response) a nabytą (adoptive response). Przy udziale TLRs rozpoznawane są pewne struktury charakterystyczne dla patogenów (PAMP – pathogen associated molecular patterns). W odróżnieniu od odpowiedzi nabytej, związanie receptora nie pociąga za sobą uruchomienia procesów pamięci immunologicznej (4, 5). Pobudzenie receptorów TLR skutkuje między innymi indukcją syntezy cytokin i na tej drodze wpływa na modyfikację odpowiedzi nabytej. Dzieje się tak poprzez oddziaływanie na limfocyty pomocnicze i ukierunkowywanie ich bądź w stronę Th1 (przewagi cytotoksyczności), bądź Th2 (przewagi odpowiedzi humoralnej) (6, 7). Skuteczność reakcji odpornościowej indukowanej szczepieniem warunkowana jest zarówno czynnikami związanymi z konstrukcją szczepionki (w tym jej składem antygenowym) jak i czynnikami leżącymi po stronie organizmu. Pierwszymi elementami odpowiedzi immunologicznej aktywowanymi w wyniku kontaktu z wirusem odry (MeV) są te związane z odpowiedzią nieswoistą: interferonami (IFN), układem dopełniacza, komórkami NK oraz pobudzeniem receptorów Toll-like (TLR). Dostępne dane wskazują, że spośród wszystkich znanych receptorów TLR, na kształtowanie reakcji odpornościowej indukowanej przez MeV największe znaczenie ma aktywacja TLR2 oraz TLR4 (1, 2, 3). Celem pracy była optymalizacja warunków stymulacji komórek PBMC i walidacja metody real-time RT-PCR stosowanej do oznaczania ekspresji genów receptorów Toll-like w tych komórkach. MATERIAŁ I METODY K o m ó r k i P B M C. Od zdrowych ochotników pobierano 10 ml krwi obwodowej, z której izolowano PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells) przy użyciu LSM (Lymphocyte Separation Medium, MP Biomedicals). Zebrane komórki płukano w PBS, zawieszano w RPMI 1640 (Sigma, R8758) z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej (FBS) i liczono w komorze Bűrkera. Do stymulacji używano zawiesiny 106 PBMC w 4 ml RPMI + 10% FBS. S t y m u l a t o r y. Szczepy wirusa odry – szczep szczepionkowy (E) Edmonston (ATCC, VR-24) i szczep dziki (W), wyizolowany w 2007r. w Polsce w Krajowym Ośrodku Referencyjnym WHO d/s. eliminacji odry/różyczki NIZP-PZH (izolat 2521/07). Ligandy receptorów Toll–like - Pam3CSK (InvivoGen tlrl-pms), syntetyczna trójacetylowana lipoproteina, agonista receptora TLR2 i LPS (InvivoGen tlrl-eblps), lipopolisacharyd uzyskany z E.coli szczepu 0111:B4, agonista receptora TLR4. O p t y m a l i z a c j a w a r u n k ó w s t y m u l a c j i. Komórki PBMC stymulowano zawiesiną zawierającą 2500, 1250 i 625 cząstek zakaźnych wirusa odry szczepu szczepionkowego Edmonston (E) i dzikiego (W) oraz ligandami dla TLR2 i TLR4 w dawkach 0,1, 1,0 i 10 µg/ml w dwóch czasach inkubacji: 6h oraz 24h. Jako kontrolę negatywną stosowano komórki niestymulowane (NS). Doświadczenie przeprowadzono w dwukrotnym powtórzeniu. Nr 1 Real-time RT-PCR do oznaczania receptorów Toll-like 19 O z n a c z a n i e e k s p r e s j i g e n ó w. Z PBMC (stymulowanych i kontrolnych) izolowano mRNA (Qiagen, Oligotex Direct mRNA Mini Kit) i określano poziom ekspresji genów TLR2 i TLR4 wobec genu referencyjnego (GAPDH) metodą real-time RT-PCR z sondą TaqMan. Badania wykonano przy użyciu zestawów QuantiFast®Assay (Qiagen) w cyklerze Rotor-GeneTM 6000 (Corbett Life Science). Wpływ stymulacji na poziom ekspresji oceniano metodą 2-∆∆Ct . M e t o d a r e a l – t i m e R T – P C R. Badania przeprowadzono metodą real-time one-step RT-PCR z jednoczesną detekcją poszukiwanego genu (TLR2 lub TLR4) oraz genu referencyjnego (GAPDH) z wykorzystaniem zastawów: QuantiFast® Probe Assays oraz QuantiFast® Probe RT-PCR Plus Kit (Qiagen, 204482). Zestaw QuantiFast® Probe Assays zawierał indywidualnie projektowane startery oraz sondę TaqMan dla genów TLR2 (Hs_TLR2_FAM_1, QF00005712), TLR4 (Hs_TLR4_ FAM_1; QF00066633) lub genu referencyjnego, dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanu; GAPDH (Hs_GAPDH_MAX_2, QF00531132). Sondy TaqMan posiadały przyłączony na końcu 3’ wygaszacz, a na końcu 5’ fluorofor. Jako wygaszacz zastosowano IBFQ o szerokim spektrum absorbancji (420-620 nm). Jako fluorofor dla genów TLR2 i TLR4 zastosowano FAM (wzbudzenie 494 nm, emisja 518 nm) a dla genu referencyjnego zastosowano MAX (wzbudzenie 524 nm, emisja 557 nm). Zestaw QuantiFast® Probe RT-PCR Plus Kit zawierał zestaw buforów oraz enzymów (odwrotna transkryptaza Omniscript i Sensiscript, HotStarTaq Plus DNA polimeraza) niezbędnych do przeprowadzenia reakcji odwrotnej transkrypcji (mRNA→cDNA) oraz amplifikacji (one-step RT-PCR) jednocześnie dla genu TLR2 lub TLR4 oraz genu referencyjnego GAPDH (format duplex detection) w czasie rzeczywistym (real-time). Zastosowany zestaw zawierał bufor umożliwiający efektywne usunięcie zanieczyszczeń genomowym DNA, które mogłoby generować fałszywie dodatnie odczyty. W a l i d a c j a m e t o d y r e a l – t i m e R T – P C R. Wydajność reakcji real-time RT-PCR określano na podstawie wyników - sześciu dla GAPDH, trzech dla TLR2 i trzech dla TLR4 niezależnych doświadczeń, przeprowadzając reakcje w szeregu dwukrotnych rozcieńczeń próbek mRNA. Powtarzalność wyników reakcji real-time RT-PCR określano na podstawie danych uzyskanych w sześciu niezależnych doświadczeniach, w których badano próbki uzyskane od dwóch osób. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Obserwowano osobniczo różny i zależny od dawki stymulatora poziom ekspresji badanych genów w komórkach PBMC. Po stymulacji szczepem szczepionkowym wirusa odry średni poziom zmiany ekspresji TLR2 i TLR4 normalizowany w stosunku do ekspresji GAPDH wyniósł od 0,79 (E2500) do 5,84 (E625) natomiast po stymulacji szczepem dzikim od 0,54 (W625) do 2,77 (W2500) (rycina 1). Dodanie do zawiesiny komórek PBMC ligandu dla receptora TLR2 skutkowało zmianami ekspresji tego genu, zależnymi w większym stopniu od czasu inkubacji niż dawki (rycina 2). Zakres zmian ekspresji TLR2 w zależności od dawki Pam3CSK4 i czasu inkubacji wyniósł od 0,37 do 1,33. Efektem traktowania PBMC ligandem dla receptora TLR4 była zmiana ekspresji tego genu, zależna od czasu inkubacji i dawki (rycina 2). Podczas gdy inkubowanie komórek w obecności LPS w dawkach o wyż- 20 Nr 1 A. Częścik i inni 8 TLR2-A TLR4-A 7 TLR2-B TLR4-B Względna ekspresja genu 6 5 4 3 2 1 0 Ryc.1. E2500 E1250 E625 W2500 W1250 W625 Względna ekspresja genów TLR2 i TLR4 w komórkach PBMC stymulowanych zawiesiną Ryc.1. Względna ekspresja i TLR4 w komórkach PBMC stymulowanych zawiesiną zawierającą zawierającą 2500, 1250genów i 625TLR2 cząstek zakaźnych wirusa odry szczepu szczepionkowego 2500, 1250 i 625 cząstek zakaźnych wirusa odry szczepu szczepionkowego Edmonston (E) i dzikiego Edmonston (E) i dzikiego (W). Poziom zmiany był normalizowany w stosunku ekspresji (W). Poziom zmiany był normalizowany w stosunku do ekspresji GAPDH. Na wykresiedoprzedstawiono średnie odchylenia standardowe (zaznaczono górny zakres) dlastandardowe wyników z dwóch niezależnych GAPDH. Na oraz wykresie przedstawiono średnie oraz odchylenia (zaznaczono doświadczeń na materiale uzyskanym od dwóch osób przeprowadzonych na górny zakres) dlaprzeprowadzonych wyników z dwóch niezależnych doświadczeń materiale uzyskanym od dwóch osób Względna ekspresja genu 5 4 3 2 1 0 Ryc.2. Względna ekspresja genów TLR2 i TLR4 w komórkach PBMC stymulowanych Pam3CSK4 i LPS w dawkach 0,1, 1,0 i 10 µg/ml przez 6h i 24h. Poziom zmiany był normalizowany w stosunku do ekspresji GAPDH. Na wykresie przedstawiono średnie oraz odchylenia Ryc.2. Względna ekspresja genów TLR2 i TLR4 w komórkach PBMC stymulowanych Pam3CSK4 i LPS w standardowe (zaznaczono górny zakres) dla wyników z dwóch niezależnych doświadczeń dawkach 0,1, 1,0 i 10 µg/ml przez 6h i 24h. Poziom zmiany był normalizowany w stosunku do ekspresji GAPDH. Na wykresie przedstawiono średnie oraz odchylenia standardowe (zaznaczono górny zakres) dla wyników dwóch µg/ml) niezależnych doświadczeń (1,0 µg/ml iz 10,0 przez 6h przy skutkowało w wzrostem aktywności szym stężeniu genu TLR4 (4,55 i 1,04 odpowiednio), to dłuższy czas inkubacji powodował zahamowanie aktywności genu TLR4 (od 0,05 do 0,16). Walidację w zakresie wydajności reakcji real-time RT-PCR przeprowadzono w oparciu o dane generowane przez Rotor-Gene 6000Series software v. 1.7.87 (rycina 3) i określono Nr 1 Real-time RT-PCR do oznaczania receptorów Toll-like 21 Normalizowana wartość fluorescencji Numer cyklu Ryc.3. Przykładowy obraz real-time RT-PCR dla badania wydajności reakcji. Na podstawie oznaczeń sześciu podwójnych rozcieńczeń próbki wydajność reakcji dla GAPDH (yellow fluorescence) w tym doświadczeniu określono na 91% (r2=98,2) Ryc.3. Przykładowy obraz real-time RT-PCR dla badania wydajności reakcji. Na podstawie oznaczeń sześciu Wydajność reakcji real-time RT-PCR [%] podwójnych rozcieńczeń próbki wydajność reakcji dla GAPDH (yellow fluorescence) w tym doświadczeniu określono na 91% (r2=98,2) 120 100 80 60 40 20 0 GAPDH TLR2 TLR4 Wydajność reakcji real-time RT-PCR dla TLR2, TLR4 i GAPDH. Na wykresie przedstawiono średnie odchylenia (zaznaczono i górnyprzedstawiono zakres) dla wyników Ryc.4. Wydajność reakcjioraz real-time RT-PCRstandardowe dla TLR2, TLR4 i GAPDH.dolny Na wykresie średnie oraz odchylenia standardowe (zaznaczono i górny niezależnych zakres) dla wyników z trzech (TLR2 i TLR4) i z trzech (TLR2 i TLR4) i sześciudolny (GAPDH) doświadczeń Ryc.4. sześciu (GAPDH) niezależnych doświadczeń ją na 90,4% ± 10,2 dla GAPDH, 87,0% ± 8,2 dla TLR2 oraz 44,5% ± 9,2 dla TLR4 (rycina 4). Powtarzalność wyrażona jako względne odchylenie standardowe (RSD) dla wartości Ct w przeprowadzonych eksperymentach przeprowadzonych na materiałach pochodzących od dwóch osób była mniejsza niż 0,70% dla GAPDH, <3,2% dla TLR2 oraz <2,84% dla TLR4. 22 Nr 1 A. Częścik i inni 36 34 Wartość Ct 32 30 28 Ryc.3. Wydajność reakcji real-time RT-PCR dla TLR2, TLR$ i GAPDH. Na wykresie przedstawiono średnie 26 standardowe (zaznaczono dolny i górny zakres) dla wyników z trzech (TLR2 i TLR4) i oraz odchylenia sześciu (GAPDH) niezależnych doświadczeń 24 GAPDH-Os2 GAPDH/1 TLR2/1 TLR2-Os2 TLR4/1 GAPDH/2 TLR4-Os2 TLR2/2 TLR4/2 Ryc.5. Powtarzalność reakcji real-time RT-PCR dla TLR2, TLR4 i GAPDH oznaczanych w próbkach mRNA uzyskanych od dwóch osób (1 i 2). Wykresy box-and-whisker reprezentują wyniki sześciu niezależnych doświadczeń Ryc.5. Powtarzalność reakcji real-time RT-PCR dla TLR2, TLR4 i GAPDH oznaczanych w próbkach mRNA PODSUMOWANIE uzyskanych od dwóch osób (1 i 2). Wykresy box-and-whisker reprezentują wyniki sześciu niezależnych doświadczeń Uzyskane wyniki oznaczeń walidacyjnych, w których za akceptowalną wartość dla powtarzalności przyjęto rozrzut wyników poniżej 15% a za akceptowalną wartość wydajności - wynik powyżej 85%, wskazują na przydatność opisanej metody do oznaczania ekspresji na poziomie mRNA receptorów Toll-like. Kierując się uzyskanymi wynikami, za optymalne warunki stymulacji przyjęto: LPS – 10 µg/ml/24h, Pam3CSK4 – 1µg/ml/6h, MeV 1250 cząstek zakaźnych wirusa /24h. PIŚMIENNICTWO 1. Bieback K, Lien E, Klagge IM i inni. Hemagglutinin protein of wild-type measles virus activates toll-like receptor 2 signaling. J Virol 2002; 76: 8729 – 36. 2. Częścik A, Trzcińska A, Siennicka J. Wirus odry – reakcje odpornościowe związane z naturalnym zakażeniem i odpowiedzią poszczepienną. Post Mikrobiol 2011; 50: 235 – 45. 3. Hahm B, Cho JH, Oldstone MB. Measles virus-dendritic cell interaction via SLAM inhibits innate immunity: selective signaling through TLR4 but not other TLRs mediates suppression of IL-12 synthesis. Virology 2007; 358: 251 – 7. 4. Janeway CA Jr, Medzhitov R. Innate immune recognition. Annu Rev Immunol 2002; 20: 197 – 216. 5. Tokarz-Deptuła B, Niedźwiedzka P, Deptuła W. Receptory Toll-podobne – nowe znaczniki w immunologii. Alergia Astma Immunologia 2006; 11: 23 – 8. 6. van Els CA, Nanan R. T cell responses in acute measles. Viral Immunol 2002; 15: 435 – 50. 7. Xu D, Liu H, Komai-Koma M. Direct and indirect role of Toll-like receptors in T cell mediated immunity. Cell Mol Immunol 2004; 1: 239 – 46. Otrzymano: 28 II 2014 r. Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Wirusologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego - PZH [email protected]
