Wpływ stymulacji wirusem odry na ekspresję receptorów Toll

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2015, 67: 189 - 194
Wpływ stymulacji wirusem odry na ekspresję receptorów Toll-like
w komórkach PBMC
Measles virus stimulation effect on the expression of Toll-like
receptors in PBMC
Agnieszka Częścik, Agnieszka Trzcińska, Milena Dunal-Szczepaniak, Joanna Siennicka
Zakład Wirusologii, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego
– Państwowy Zakład Higieny w Warszawie
W pracy opisano wpływ stymulacji wirusem odry komórek PBMC izolowanych od zdrowych osób szczepionych przeciwko odrze (seropozytywnych
i seronegatywnych), na ekspresję receptorów Toll-like. Oceniano ekspresje
receptorów TLR2 i TLR4 w odpowiedzi na stymulację ligandami dla tych
receptorów (Pam3CSK i LPS) a także w odpowiedzi na stymulację szczepem
szczepionkowym (E) i dzikimi (W1 i W2) wirusa odry.
Słowa kluczowe: receptory Toll-like, ekspresja, real-time RT-PCR
ABSTRACT
Introduction: Toll-like receptors (TLRs) are an important component of a innate immune system. Stimulation of TLRs, through action with helper T cells, could change Th1/Th2 balance
and thus affect adaptive immune response. Receptors TLR2 and TLR4 play important role
in immune response to measles virus. The aim of this work was stimulation of the peripheral
blood mononuclear cells (PBMC) and determination of Toll-like gene expression in these cells.
Methods: PBMCs from 20 healthy donors were stimulated with measles viruses and ligands
for TLR2 and TLR4. For examinations the real time RT-PCR (QuantiFast®Assay, Qiagen)
was used. The expression of Toll-like receptors was determined on mRNA level, using real-time one step RT-PCR (QuantiFast®Assay, Qiagen) with simultaneous detection of TLR2
and TLR4 genes and housekeeping gene (GAPDH).
Results: Virus-specific influence of wild measles virus strains activity on PBMC derived from
vaccinated seronegative individuals manifested in higher level of expression of TLR2 and
TLR4 genes in compare to the expression of these genes in PBMC of seropositive individuals.
Conclusions: Toll-like receptors participate in the development of immune response to
measles virus.
190
A. Częścik i inni
Nr 3 - 4
Key words: Toll-like receptors, expression, real-time RT-PCR
WSTĘP
Receptory Toll-like (TLR) zostały odkryte stosunkowo niedawno a po raz pierwszy
opisane u muszki owocowej Drosophila, u której warunkują odpowiedź przeciwgrzybiczą.
Struktury te są ważnym elementem reakcji odpornościowej, stanowią pomost pomiędzy
odpowiedzią wrodzoną (innate response) a nabytą (adoptive response). Przy udziale TLRs
rozpoznawane są pewne struktury charakterystyczne dla patogenów (PAMP – pathogen
associated molecular patterns). W odróżnieniu od odpowiedzi nabytej, związanie receptora
nie pociąga za sobą uruchomienia procesów pamięci immunologicznej (5, 6). Pobudzenie
receptorów TLR skutkuje między innymi indukcją syntezy cytokin i na tej drodze wpływa
na modyfikację odpowiedzi nabytej. Dzieje się tak poprzez oddziaływanie na limfocyty
pomocnicze i ukierunkowywanie ich bądź w stronę Th1 (przewagi cytotoksyczności), bądź
Th2 (przewagi odpowiedzi humoralnej) (7, 8).
Pierwszymi elementami immunologicznej odpowiedzi aktywowanymi w wyniku kontaktu
z wirusem odry (MeV) są te związane z odpowiedzią nieswoistą: interferonami (IFN), układem
dopełniacza, komórkami NK oraz pobudzeniem receptorów Toll-like. Dostępne dane wskazują,
że spośród wszystkich znanych receptorów TLR, na kształtowanie reakcji odpornościowej
indukowanej przez MeV największe znaczenie ma aktywacja TLR2 oraz TLR4 (1, 2, 4).
W pracy Bieback i wsp. (1) przedstawiono, że dzikie szczepy wirusa odry, ale nie szczepy
szczepionkowe, aktywuje limfocyty T zarówno mysie jak i ludzkie poprzez receptor TLR2,
a właściwość ta jest związana jest z obecnością hemaglutyniny.
Celem pracy było określenie ekspresji receptorów TLR 2 i TLR 4 pod wpływem stymulacji wirusem odry, oraz udziału receptorów w kształtowaniu odpowiedzi poszczepiennej.
MATERIAŁ I METODY
W badaniu uczestniczyło 20 zdrowych ochotników szczepionych przeciwko odrze
o znanym statusie serologicznym: seronegatywnych pomimo szczepienia (NEG, n=8),
seropozytywnych w wyniku szczepienia (POS, n=12), od których pobierano 10 ml krwi
żylnej, celem izolacji komórek PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells). Komórki
PBMC izolowano przy użyciu LSM (Lymphocyte Separation Medium, MP Biomedicals).
Zebrane PBMC płukano w PBS, zawieszano w RPMI 1640 (Sigma, R8758) z dodatkiem
10% płodowej surowicy cielęcej (FBS) i liczono w komorze Bűrkera. Próbki zawierające
106 PBMC w 4 ml zawiesiny stymulowano dodając niżej wymienione stymulatory i stosując
odpowiedni czas i temperaturę stymulacji:
1. 200 µl LPS (10 µg/ml), czas stymulacji 24h w 37°C
2. 200 µl Pam3CSK (1 µg/ml), czas stymulacji 6h w 37°C
3. 200 µl zawiesiny wirusa odry szczep Edmonston (E), zawierającą 1250 cząstek zakaźnych wirusa, czas stymulacji 24h w 37°C
4. 200 µl zawiesiny wirusa odry izolat 2281/3/2006 (W1) zawierającą 1250 cząstek zakaźnych wirusa, czas stymulacji 24h w 37°C
Nr 3 - 4
Ekspresja receptorów Toll-like w komórkach PBMC
191
5. 200 µl zawiesiny wirusa odry izolat 2521/3/2007 (W2) zawierającą 1250 cząstek zakaźnych wirusa, czas stymulacji 24h w 37°C
6. 200 µl PBS, czas stymulacji 24h w 37°C
Warunki stymulacji określono w doświadczeniu opisanym w pracy opublikowanej
uprzednio (3). Po etapie inkubacji próbki wirowano (250g, 10 minut, 20°C), nadsącz odciągano, osad worteksowano, przenoszono do probówek typu eppendorf i przechowywano
w temperaturze -70°C do czasu izolacji mRNA.
Z komórek PBMC mRNA izolowano przy użyciu zestawu Oligotex Direct mRNA Mini
Kit (QIAGEN, 70022). Proces izolacji przeprowadzono zgodnie z procedurą podaną przez
producenta testu. Zgodnie z informacją producenta zestawu, odzysk mRNA izolowanego
wg tej procedury wynosił ponad 90%. Izolat mRNA do dalszych analiz przechowywano
w temperaturze -70°C.
Poziom ekspresji receptorów Toll-like na poziomie mRNA oznaczono metodą Real-time RT-PCR z jednoczesną detekcją poszukiwanego genu (TLR2 lub TLR4) oraz genu
referencyjnego (GAPDH) z wykorzystaniem zestawów:
- QuantiFast® Probe Assays (QIAGEN) zawierającego indywidualnie projektowane startery oraz sondę TaqMan (sonda hydrolizująca) dla genów TLR2 (Hs_TLR2_FAM_1,
QF00005712), TLR4 (Hs_TLR4_FAM_1; QF00066633) lub genu referencyjnego – dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanu; GAPDH (Hs_GAPDH_MAX_2,
QF00531132).
- QuantiFast® Probe RT-PCR Plus Kit (QIAGEN, 204482) zawierającego zestaw buforów oraz enzymów (odwrotna transkryptaza Omniscript i Sensiscript, HotStarTaq Plus
DNA polimeraza) niezbędnych do przeprowadzenia reakcji odwrotnej transkrypcji
(mRNA→cDNA) oraz amplifikacji (one-step RT-PCR) jednocześnie dla genu TLR2
lub TLR4 oraz genu referencyjnego GAPDH (format duplex detection) w czasie rzeczywistym (real-time). Zastosowany zestaw zawierał bufor umożliwiający efektywne
usunięcie zanieczyszczeń genomowym DNA, które mogłoby generować fałszywie
dodatnie odczyty.
Reakcję Real-time PCR przeprowadzono zgodnie z procedurą podaną przez producenta
zestawów, przy użyciu cyklera Rotor-GeneTM 6000 (Corbett Life Science).
Na podstawie wyników wygenerowanych przez program Rotor-Gene 6000Series software v. 1.7.87. wyznaczono względny poziom ekspresji badanych genów Toll-like (TLR2
i TLR4) względem genu referencyjnego (GAPDH) stosując metodę Pfaffla.
WYNIKI I ICH OMÓWIENIE
W grupie 20 osób szczepionych przeciwko odrze, wykazujących różny poziom poszczepiennej odpowiedzi humoralnej: seronegatywnych pomimo szczepienia (NEG, n=8)
i seropozytywnych w wyniku szczepienia (POS, n=12) oceniano względną ekspresję genów
TLR2 i TLR4. Oceny dokonywano przy zastosowaniu metody Pfaffla wobec genu referencyjnego (GAPDH) po inkubacji z zawiesiną zawierającą cząstki wirusa odry szczepu
szczepionkowego (E), szczepów dzikich (W1 i W2) oraz ligandów dla TLR2 i TLR4 –
Pam3CSK i LPS, odpowiednio.
192
Nr 3 - 4
A. Częścik i inni
Względna
Względna
ekspresja
ekspresja
genu genu
TLR2/Pam3CSK
TLR2/Pam3CSK
1
0,8
1
0,6
0,8
0,4
0,6
0,2
0,4
0
0,2
0
NEG
POS
Anty-MeV IgG
NEG
POS
Względna
Względna
ekspresja
ekspresja
genu genu
TLR4/LPS
TLR4/LPS
Anty-MeV IgG
12
10
12
8
10
6
8
4
6
2
4
0
2
0
Ryc.1.
NEG
NEG
POS
Anty-MeV IgG
POS
Względna ekspresja genów dla TLR2 (wykres górny) i TLR4 (wykres dolny) po inkubacji
Anty-MeV
IgGgórny)odrze,
z Pam3CSK
i LPSekspresja
w PBMCgenów
osób szczepionych
przeciwko
seronegatywnych
(NEG)
Ryc.1.
Względna
dla TLR2
(wykres
i TLR4
(wykres dolny) po
inkubacji z
Pam3CSK
i
LPS
w
PBMC
osób
szczepionych
przeciwko odrze, seronegatywnych (NEG) i
i seropozytywnych (POS).
seropozytywnych (POS).
Ryc.1. Względna ekspresja genów dla TLR2 (wykres górny) i TLR4 (wykres dolny) po inkubacji z
Nie obserwowano
statystycznie
różnic (p>0,05)
w poziomie
ekspresji TLR2
Pam3CSK i LPS
w PBMC istotnych
osób szczepionych
przeciwko
odrze, seronegatywnych
(NEG) i
(POS).
i TLR4 w seropozytywnych
komórkach PBMC
pochodzących od osób seropozytywnych i seronegatywnych
w stosunku do wirusa odry w odpowiedzi na działanie ligandów, które to poziomy wyniosły
w grupie osób seronegatywnych i seropozytywnych, odpowiednio: 6,16±2,90 i 4,44±2,50
dla TLR2 po inkubacji z Pam3CSK, oraz 0,45±0,30 i 0,48±0,27 dla TLR4 po inkubacji
z LPS (rycina 1).
Poziom ekspresji badanych genów po inkubacji z zawiesinami zawierającymi różne
szczepy wirusa odry wykazywał znacznie większe zróżnicowanie osobnicze niż po inkubacji
z ligandami tych receptorów. Przeprowadzona analiza ujawniła istnienie wśród badanej grupy
5 osób, których wyniki znacznie odbiegały od średniej (ang. outliers). Wyniki wykraczające
poza zakres (interquantile range dla współczynnika k=3) pominięto w dalszej analizie.
Po wirusowo-swoistej stymulacji, wyższy poziom ekspresji badanych genów wykazywały komórki PBMC pochodzące od osób seronegatywnych (rycina 2). Dotyczyło to jednak
tylko stymulacji szczepami dzikimi: dla TLR2 1,53±0,53 versus 1,16±0,57 po inkubacji ze
szczepem W1 i 1,24±0,83 versus 0,59±0,59 po inkubacji ze szczepem W2, oraz dla TLR4
1,09±0,78 versus 1,05±0,66 po inkubacji ze szczepem W1 i 7,10±9,50 versus 3,54±7,09
po inkubacji ze szczepem W2. Po inkubacji ze szczepem szczepionkowym wirusa odry
obserwowano sytuację odwrotną – poziomy względnej ekspresji genów u osób serone-
Nr 3 - 4
Ryc.2.
Ekspresja receptorów Toll-like w komórkach PBMC
193
Względna ekspresja genów TLR2 (wykres górny) i TLR4 (wykres dolny) przedstawiona jako
średnia ± SD wyników uzyskanych w grupie osób szczepionych przeciwko odrze, wykazujących różny poziom odpowiedzi humoralnej: NEG (seronegatywni pomimo szczepienia) i
POS (seropozytywni w wyniku szczepienia). PBMC inkubowano z zawiesiną zawierającą
wirus odry szczepu szczepionkowego (E) i dwóch szczepów dzikich (W1 i W2).
gatywnych były niższe od stwierdzonych u osób seropozytywnych: dla TLR2 1,00±0,31
versus 1,07±0,34 oraz dla TLR4 0,93±0,40 versus 1,28±0,49. Obserwowane różnice jedynie
w przypadku ekspresji TLR4 po inkubacji ze szczepem W2 były istotne statystycznie (test
Kruskal-Wallis, p=0,049).
W przedstawionej pracy badano wpływ stymulacji szczepem szczepionkowym wirusa
odry i szczepami dzikimi na ekspresję receptorów Toll-like u osób szczepionych przeciwko
odrze. Otrzymane wyniki potwierdzają, że szczep dziki wirusa odry aktywuje receptor TLR2.
Ponadto wykazano, że wyższy poziom ekspresji genów dla receptorów TLR obserwowano
u osób seronegatywnych pomimo szczepienia.
194
A. Częścik i inni
Nr 3 - 4
PODSUMOWANIE
Receptory Toll-like wydają się być istotnym elementem wpływającym na kształtowanie odpowiedzi poszczepiennej, w szczególności u osób szczepionych seronegatywnych,
które wykazują wyższy poziom ekspresji receptorów TLR. Nie mniej jednak z uwagi na
niedużą liczebność grupy badanej konieczne jest przeprowadzenie badań na większą skalę
z uwzględnieniem dużej grupy osób szczepionych seronegatywnych.
PIŚMIENICTWO
1. Bieback K, Lien E, Klagge IM i inni. Hemagglutinin protein of wild-type measles virus activates
toll-like receptor 2 signaling. J Virol 2002; 76: 8729 – 36.
2. Częścik A, Trzcińska A, Siennicka J. Wirus odry – reakcje odpornościowe związane z naturalnym
zakażeniem i odpowiedzią poszczepienną. Post Mikrobiol 2011; 50: 235 – 45.
3. Cześcik A, Trzcińska A, Dunal-Szczepaniak M, Siennicka J. The use of real-time RT-PCR method
for the determination of Toll-like genes expression at mRNA level. Med Dosw Mikrobiol 2014;
66:17-22.
4. Hahm B, Cho JH, Oldstone MB. Measles virus-dendritic cell interaction via SLAM inhibits innate
immunity: selective signaling through TLR4 but not other TLRs mediates suppression of IL-12
synthesis. Virology 2007; 358: 251 – 7.
5. Janeway CA Jr, Medzhitov R. Innate immune recognition. Annu Rev Immunol 2002; 20: 197 –
216.
6. Tokarz-Deptuła B, Niedźwiedzka P, Deptuła W. Receptory Toll-podobne – nowe znaczniki w immunologii. Alergia Astma Immunologia 2006; 11: 23 – 8.
7. van Els CA, Nanan R. T cell responses in acute measles. Viral Immunol 2002; 15: 435 – 50.
8. Xu D, Liu H, Komai-Koma M. Direct and indirect role of Toll-like receptors in T cell mediated
immunity. Cell Mol Immunol 2004; 1: 239 – 46.
Otrzymano: 29 X 2015 r.
Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Wirusologii,
Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego – Państwowy Zakład Higieny