Zmienność genomu2

Zmienność genomu
Przyczyny, skutki i sposoby kontroli
Zmienność genomu
• Przez zmienność genomu (polimorfizm) rozumiemy
różnice w sekwencji DNA genomowego pomiędzy
osobnikami jednego gatunku.
• Wyróżniamy:
– Polimorfizm prosty – występuje, jeśli w danym miejscu
genomy 2 osobników różnią się pojedynczym nukleotydem
(single nucleotide polymorphism – SNP). Ocenia się, że
pomiędzy dwojgiem ludzi różnice dotyczą jednego
nukleotydu na 400.
– Polimorfizm złożony – występuje, jeśli w danym miejscu
genomy 2 osobników różnią się większym fragmentem
sekwencji nukleotydów.
1
Przyczyny zmienności genomu
• Spontaniczne
– Błędy przy replikacji DNA
• Nieprawidłowe wbudowywanie nukleotydów
• „Poślizg” polimerazy DNA
– Spontaniczne przemiany chemiczne zasad
azotowych (pod wpływem H2O)
• Cytozyna -> uracyl
• Guanina -> ksantyna
• Adenina -> hipoksantyna
Anormalna inkorporacja nukleotydu
TAGCATCGA Pol
ATCGTAGCTGACGAATGC
TAGCATCGA Pol
ATCGTAGCTGACGAATGC
TAGCATCGACTGC Pol
ATCGTAGCTGACGAATGC
TAGCATCGACTAC Pol
ATCGTAGCTGACGAATGC
Rzadka forma
tautomeryczna C tworzy
stabilna parę z A
1 błąd/104-105 nukl.
2
Anormalna inkorporacja nukleotydu
„Poślizg” polimerazy DNA
3
Spontaniczne przemiany
nukleotydów
100/dz./kom.
5000/dz./kom.
Spontaniczne
przemiany
nukleotydów
4
Spontaniczne
przemiany
nukleotydów
Typy mutacji
5
Przyczyny zmienności genomu
• Indukowane
– Czynniki fizyczne
• Promieniowanie UV,
• promieniowanie jonizujące
– Czynniki chemiczne
• Modyfikacja zasad azotowych
• Addukty DNA
– Czynniki biologiczne
• Niektóre wirusy
• Transpozony
• Retrotranspozony
Wpływ promieniowania UV
6
Wpływ promieniowania jonizującego
• Bezpośrednie działanie na cząsteczki nukleotydów
– Cząstki wysokoenergetyczne (neutrony, cząsteczki alfa)
zderzając się z atomami cząsteczek nukleotydów powoduja
ich zniszczenie, lub przemianę do cząsteczek o innej
budowie, np. o otwartych pierścieniach zasad azotowych.
• Działanie radiochemiczne
– Czasteczki (elektrony), lub kwanty (gamma) promieniowania
doprowadzają do rozpadu cząsteczek wody, lub/i tlenu, z
wutworzeniem wysoce reaktywnych wolnych rodników, np..
Rodników hydroksylowych HO•, lub nadtlenowodorowych
H2O2•, reagujących z czasteczkami zasad azotowych, co
prowadzi do ich modyfikacji.
Wpływ czynników
chemicznych
(alkilacja zasad azotowych
przez metylosiarczan
etylowy – EMS)
7
Powstawanie
adduktów
DNA
Powstawanie adduktów DNA
8
Powstawanie adduktów DNA
Cis-platyna
Addukty DNA
Addukty 8-metylopsoralenu z
DNA w komórkach naskórka
Addukty policyklicznych
węglowodorów z DNA w kom.
raka sutka
9
Rzeczywista częstotliwość mutacji
wynosi 1 nukleotyd an 109
Jesto ona tak niska dzięki istnieniu
mechanizmów naprawczych
usuwających mutacje w DNA
Naprawa mutacji w DNA
• Błędnie wbudowane nukleotydy nie tworzą par
Watsona-Cricka.
• Mutacje doprowadzają do powstania nietypowych
zasad azotowych nie tworzących par Watsona-Cricka
(ksantyna, hipoksantyna).
• Mutacje powodują powstanie zasad azotowych nie
występujących w DNA (uracyl, ksantyna,
hipoksantyna).
• Mutacje występują zwykle tylko w jednym łańcuchu
DNA.
• Drugi łańcuch DNA zawiera prawidłową informację
genetyczną.
• Po replikacji łańcuchy – stary i nowy – różnią się
stopniem metylacji.
10
Korekcja błędnie wbudowanych
nukleotydów
TAGCATCGA Pol
ATCGTAGCTGACGAATGC
Korekcja błędów w czasie
replikacji DNA odbywa się
dzięki posiadanej przez
polimerazę DNA aktywności
3’-5’ egzonukleazy!
TAGCATCGACTA Pol
ATCGTAGCTGACGAATGC
Powoduje to 10-krotne
zmniejszenie liczby błędów.
TAGCATCGACT Pol
ATCGTAGCTGACGAATGC
TAGCATCGACTG Pol
ATCGTAGCTGACGAATGC
Naprawa uszkodzeń w DNA
Deaminacja
cytozyny
11
Naprawa uszkodzeń w DNA
Glikozydaza
(6 rodzajów)
Wycięcie
nieprawidłowej
zasady
azotowej
Naprawa uszkodzeń w DNA
Miejsce AP
Wycięcie
cząsteczki 2deoksyrybozy
przez
endonukleazę
AP
12
Naprawa uszkodzeń w DNA
Luka w
łańcuchu
DNA
Naprawa luki
przez
polimeraze
DNA III i ligazę
Naprawa
DNA
System UVR ABCD
13
System UVR ABCD
System UVR ABCD
14
System UVR ABCD
Zaburzenia naprawy DNA
• Ataxia telangiectasia
– Czynnik: promieniowanie gamma
– Nowotwory: limfoma
– Objawy: niezborność ruchów (ataksja), rozszerzenie naczyń
krwionosnych w skórze i oczach, aberracje chromosomowe,
niedobór odporności.
15
Zaburzenia naprawy DNA
• Xeroderma pigmentosum
– Czynnik: promieniowanie UV, mutageny chemiczne
– Nowotwory: raki skóry, czerniaki
– Objawy: rogowacenie skóry, wrażliwość skóry i oczu na
światło słoneczne
Zaburzenia naprawy DNA
• Syndrom Blooma
– Czynnik: czynniki alkilujące
– Nowotwory: raki, limfomy, białaczki
– Objawy: Wrażliwość na światło, rozszerzenie naczyń w
skórze twarzy, aberracje chromosomowe
• Anemia Fanconiego
– Czynnik: czynniki sieciujące
– Nowotwory: białaczki
– Objawy: anemia hypoplastyczna, zaburzenia rozwojowe
• Zespół Cockayne’a
– Czynnik: promieniowanie UV
– Nowotwory: różne
– Objawy: karłowatość, zanik siatkówki, wrażliwość na światło,
progeria, głuchota
16
Rekombinacja
Rekombinacja niehomologiczna
17
Transpozony
Transpozycja
18
Transpozycja
Skutki
transpozycji
19
Retrotranspozony (LINE)
LINE (long interspersed element – długi element rozproszony)
Retrotranspozony (SINE)
Element Alu (nazwa pochodzi od znajdującej się w sekwencji
retrotranspozonu sekwencji nukleotydów rozpoznawanej przez
enzym restrykcyjny AluI)
20
Retrotranspozony
Retrotranspozony wirusowe
21
Retrotranspozony wirusowe
Rekombinacja homologiczna
22
Rekombinacja
homologiczna
Figura Halliday’a
23
Rekombinacja
homologiczna
Białka rec ABCD
24
Białka rec ABCD
Polimorficzne sekwencje w DNA
25
Powtarzalne sekwencje w DNA
• Sekwencje mikrosatelitarne (STR – short tandem
repeats)
– Motyw o długości 1-6 nukleotydów
• (AGAT)8, (AT)4(GC)7(AT)5, (AGC)5TGG(AGC)7
–
–
–
–
–
–
Liczba powtórzeń motywu: 10-50 razy
Długość odcinka: do 100 nukleotydów
Występują w genomach z dużą częstością
Ich rozmieszczenie w genomach jest równomierne
Występują również w egzonach genów
Sekwencja (CA)n jest sekwencją najczęściej powtarzającą
się w genomie człowieka – 1 element na 30 tysiecy
nukleotydów
– Duży polimorfizm polegający na zmiennej liczbie powtórzeń
Sekwencje
mikrosatelitarne
26
Przykład polimorficznej sekwencji STR
• FGA (3 intron ludzkiego genu alfa-fibrynogenu)
– 4 chromosom (4q28)
– [TTTC]3TTTTTTCT[CTTT]nCTCC[TTCC]2
– Zestaw starterów:
• 5'-GCCCCATAGGTTTTGAACTCA-3' (CTTT strand)
• 5'-TGATTTGTCTGTAATTGCCAGC-3' (GAAA strand)
– Liczba alleli: 98
– Wielkość produktu PCR: 158-314 par nukleotydów
– Przykłady alleli:
• 16.1 [TTTC]3TTTTTTCT[CTTT]5T[CTTT]3CTCC[TTCC]2 (173 pn)
• 26.2 [TTTC]3TTTTTT [CTTT]19CTCC[TTCC]2 (214 pn)
Baza danych sekwencji STR
•
www.cstl.nist.gov/biotech/str
base/
27
Analiza STR
Powtarzalne sekwencje w DNA
• Sekwencje minisatelitarne (VNTR – variable number
of tandem repeats)
– Długość motywu: 9-80 nukleotydów
– Długość odcinka: od kilkuset do 20 tysięcy nukleotydów
– Jednostki powtarzające się mogą się nieznacznie różnić
sekwencją
– Duży polimorfizm polegający na zmiennej liczbie powtorzeń
– Rozmieszczenie w genomie jest nierównomierne – są
zgrupowane w odcinkach końcowych chromosomów
28
Sekwencje minisatelitarne
Sekwencje minisatelitarne
Sekwencja konsensusowa - AGGATTTT
29
Polimorfizm
sekwencji
minisatelitarnych
Polimorfizm sekwencji mikrosatelitarnych
30
Loci STR używane przez FBI
Analiza STR
31
Elektroforeza płytowa
Przykład odczytu
(człowiek)
32
Elektroforeza kapilarna
Polimorfizm
sekwencji
mikrosatelitarnych
33
Przykład odczytu (bydło)
Analiza STR
34
Centralne Laboratorium Kryminalistyczne
Centralne Laboratorium Kryminalistyczne
35
Centralne Laboratorium Kryminalistyczne
Polimorfizm sekwencji mikrosatelitarnych
36