Zasadniczo czysta sekwencja DNA, cząsteczka rekombinowanego

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12) OPIS PATENTOWY (19)PL (11) 188102
(13) B1
(21 ) Numer zgłoszenia:
331583
(22) Data zgłoszenia:
07 .08.1997
(51) IntCl7:
C12N 15/28
(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej Polskiej
07.08.1997, PCTAJS97/13945
(87) Data i numer publikacji zgłoszenia
międzynarodowego:
12.02.1998, WO98/05783,
PCT Gazette nr 06/98
C07K 14/525
G01N 33/68
A61K 39/395
A61K 48/00
C07K 16/24
Opis patentowy
przedrukowano ze względu
na zauważone błędy
4
Zasadniczo
()5
czysta sekwencja DNA, cząsteczka rekombinowanego DNA, komórki
gospodarza transformowane cząsteczką rekombinowanego DNA, zasadniczo czysty
polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, sposoby
wytwarzania tego polipeptydu, kompozycje farmaceutyczne, zastosowania polipeptydu
Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, fragment rozpuszczalny
polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, sposób wytwarzania
przeciwciała skierowanego przeciwko polipeptydowi Liganda Pokrewnego z Czynnikiem
Martwicy Nowotworu, sposób identyfikowania receptora dla polipeptydu Liganda
Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, sposób wyrażania tego polipeptydu,
zastosowanie wektora obejmującego sekwencje DNA kodujące ten polipeptyd
i zastosowania czynnika zdolnego do interferowania z wiązaniem polipeptydu Liganda
Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu
(30) Pierwszeństwo:
07.08.1996,US,60/023,541
18.10.1996,US,60/028,515
18.03.1997,US,60/040,820
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
19.07.1999 BUP 15/99
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
31.12.2004 WUP 12/04
B1
188102
BIOGEN, INC., Cambridge, US
THE FACULTY OF MEDICINE OF THE
UNIVERSITY OF GENEVA, Geneva, CH
(72) Twórcy wynalazku:
Yves Chicheportiche, Chene-Bougeries, CH
Jeffrey L. Browning, Brookline, US
(74) Pełnomocnik:
Kossowska Janina, PATPOL Sp z o.o.
(57)1. Zasadniczo czysta sekwencja DNA obejmująca następujące po sobie nukleotydy, kodujące polipeptyd
iganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, która zasadniczo składa się z sekwencji według
Id. Sekw. nr 1 albo Id. Sekw. nr 3.
6. Sposób wytwarzania zasadniczo czystego polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy
Nowotworu o sekwencji Id. Sekw. nr 2 lub Id. Sekw. nr 4 lub jego rozpuszczalnego fragmentu, znamienny
tym, że obejmuje etap hodowania jednokomórkowego gospodarza transformowanego cząsteczką rekombinowanego DNA, która obejmuje sekwencję DNA kodującą polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem
Martwicy Nowotworu funkcjonalnie połączoną z sekwencją kontrolującą ekspresję, a ta sekwencja DNA
hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją o Id. Sekw. nr 1 albo o Id. Sekw. nr 3, przy czym te ostre
warunki obejmują etapy przemywania przy użyciu 2x SSC, 0,1% SDS przy 65°C.
8. Sposób wytwarzania zasadniczo czystego polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy
Nowotworu, znamienny tym, że obejmuje etap hodowania komórki jednokomórkowego gospodarza transformowanej cząsteczką rekombinowanego DNA, a ta cząsteczka obejmuje sekwencję DNA funkcjonalnie
połączoną z sekwencją kontrolującą ekspresję, przy czym ta sekwencja DNA obejmuje kolejne nukleotydy,
które kodują polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, który obejmuje konserwatywne substytucje, zmiany, lub delecje sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw. nr 2 albo Id. Sekw. nr 4,
które nie znoszą biologicznej aktywności polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu.
9. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że obejmuje skuteczną terapeutycznie ilość peptydu
Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, który ma sekwencję wybraną z sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw. nr 2 lub Id. Sekw. nr 4 i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
10. Zastosowanie polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu określonego
w zastrz. 4 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania i zmniejszania stopnia zaawansowania choroby autoimmunizacyjnej u pacjenta.
L
PL
(73) Uprawniony z patentu:
2
188 102
Zasadniczo czysta sekwencja DNA, cząsteczka rekombinowanego DNA,
komórki gospodarza transformowane cząsteczką rekombinowanego DNA,
zasadniczo czysty polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy
Nowotworu, sposoby wytwarzania tego polipeptydu, kompozycje
farmaceutyczne, zastosowania polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem
Martwicy Nowotworu, fragment rozpuszczalny polipeptydu Liganda
Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, sposób wytwarzania
przeciwciała skierowanego przeciwko polipeptydowi Liganda Pokrewnego
z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, sposób identyfikowania receptora dla
polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu,
sposób wyrażania tego polipeptydu, zastosowanie wektora obejmującego
sekwencje DNA kodujące ten polipeptyd i zastosowania czynnika zdolnego
do interferowania z wiązaniem polipeptydu Liganda Pokrewnego
z Czynnikiem Martwicy Nowotworu
Z astrzeżenia patentow e
1. Zasadniczo czysta sekwencja DNA obejmująca następujące po sobie nukleotydy, kodujące polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, która zasadniczo składa się z sekwencji według Id. Sekw. nr 1 albo Id. Sekw. nr 3.
2. Cząsteczka rekombinowanego DNA obejmująca sekwencję DNA określonego
w zastrz. 1, która jest połączona funkcjonalnie z sekwencją kontrolującą ekspresję.
3. Komórka jednokomórkowego gospodarza transformowana cząsteczką rekombinowanego DNA określoną w zastrz. 2.
4. Zasadniczo czysty polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu mający biologicznie funkcjonalną sekwencję wybraną z sekwencji aminokwasowej
o Id. Sekw. nr 2 albo Id. Sekw. nr 4.
5. Sposób wytwarzania zasadniczo czystego polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, znamienny tym, że obejmuje etap hodowania jednokomórkowego gospodarza określonego w zastrz. 3 i izolowania polipeptydu Liganda Pokrewnego
z Czynnikiem Martwicy Nowotworu z tej stransformowanej komórki gospodarza.
6. Sposób wytwarzania zasadniczo czystego polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu o sekwencji Id. Sekw. nr 2 lub Id. Sekw. nr 4 lub jego
rozpuszczalnego fragmentu, znamienny tym, że obejmuje etap hodowania jednokomórkowego gospodarza transformowanego cząsteczką rekombinowanego DNA, która obejmuje sekwencję DNA kodującą polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu
funkcjonalnie połączoną z sekwencją kontrolującą ekspresję, a ta sekwencja DNA hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją o Id. Sekw. nr 1 albo o Id. Sekw. nr 3, przy czym te ostre
warunki obejmują etapy przemywania przy użyciu 2x SSC, 0,1% SDS przy 65°C.
7. Sposób według zastrz.6, znamienny tym, że polipeptyd Liganda Pokrewnego
z Czynnikiem Martwicy Nowotworu jest zdolny do wiązania z komórką wybraną z grupy
składającej się z:
a) komórki promielocytowej K562,
b) komórki białaczki monocytowej THP-1,
c) komórki gruczolakoraka jelita HT29,
d) komórki zarodkowej nerki 293; i
e) komórki fibroblastów nerki COS.
188 102
3
8. Sposób wytwarzania zasadniczo czystego polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, znamienny tym, że obejmuje etap hodowania komórki
jednokomórkowego gospodarza transformowanej cząsteczką rekombinowanego DNA, a ta
cząsteczka obejmuje sekwencję DNA funkcjonalnie połączoną z sekwencją kontrolującą ekspresję, przy czym ta sekwencja DNA obejmuje kolejne nukleotydy, które kodują polipeptyd
Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, który obejmuje konserwatywne
substytucje, zmiany, lub delecje sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw. nr 2 albo Id. Sekw. nr
4, które nie znoszą biologicznej aktywności polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem
Martwicy Nowotworu.
9. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że obejmuje skuteczną terapeutycznie ilość peptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, który ma sekwencję wybraną z sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw. nr 2 lub Id. Sekw. nr 4 i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
10. Zastosowanie polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu określonego w zastrz. 4 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania
i zmniejszania stopnia zaawansowania choroby autoimmunizacyjnej u pacjenta.
11. Zastosowanie polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu określonego w zastrz. 4 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania
i zmniejszania nasilenia reakcji odpornościowej na przeszczep tkankowy u pacjenta.
12. Zastosowanie polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu określonego w zastrz. 4 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do stymulowania
odpowiedzi odpornościowej u pacjenta.
13. Zastosowanie polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu określonego w zastrz. 4 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do tłumienia układu
odpornościowego u pacjenta.
14. Zastosowanie polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu określonego w zastrz. 4 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia raka
u pacjenta.
15. Sposób identyfikowania receptora dla polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, znamienny tym, że obejmuje etapy:
a) dostarczania polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu
określonego w zastrz. 4 lub jego fragmentu;
b) znakowania tego polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu lub jego fragmentu wykrywalnym znacznikiem; i
c) przeszukiwania kompozycji do wykrywania receptorów, które wiążą się z wykrywalnie znakowanym polipeptydem Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu lub
jego fragmentem z etapu b.
16. Fragment rozpuszczalny polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy
Nowotworu, który wykazuje biologiczną aktywność polipeptydu Liganda Pokrewnego
z Czynnikiem Martwicy Nowotworu i obejmuje koniec aminowy, który rozpoczyna się pomiędzy aminokwasami numer 22 i 80 Id. Sekw. nr 2 lub aminokwasami numer 81 i 139 Id.
Sekw. nr 4.
17. Sposób wytwarzania przeciwciała skierowanego przeciw polipeptydowi Liganda
Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu określonemu w zastrz. 4, znamienny tym,
że obejmuje etapy immunizowania zwierzęcia tym polipeptydem lub jego antygenowym fragmentem i izolowania tego przeciwciała od tego zwierzęcia.
18. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że obejmuje skuteczną terapeutycznie ilość przeciwciała skierowanego przeciw polipeptydowi Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu określonego w zastrz. 4, wytworzonego sposobem obejmującym
etapy immunizowania zwierzęcia polipeptydem Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy
Nowotworu lub jego antygenowym fragmentem i izolowania tego przeciwciała od tego zwierzęcia i ewentualnie, dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
19. Sposób wyrażania polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu in vitro w zwierzęcej hodowli komórkowej, znamienny tym, że obejmuje:
4
188102
a) wprowadzenie wektora obejmującego sekwencję DNA mającą następujące po sobie
nukleotydy, które kodują ten polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu do tej hodowli komórkowej, przy czym ten polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu obejmuje sekwencję aminokwasową Id. Sekw. nr 2 lub Id. Sekw.
nr 4 lub ich fragment; i
b) utrzymanie tej hodowli komórkowej w stanie żywym w warunkach, w których wyrażana jest w niej wymieniona sekwencja DNA.
20. Zastosowanie wektora obejmującego sekwencję DNA mającą następujące po sobie
nukleotydy, które kodują polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu o sekwencji wybranej z sekwencji aminokwasowej Id. Sekw. nr 2 lub Id. Sekw. nr 4 do
wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia zaburzeń mających związek
z polipeptydem Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu u ssaków.
21. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że ssakiem jest człowiek.
22. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że wektorem jest wirus.
23. Zastosowanie czynnika zdolnego do interferowania z wiązaniem polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu określonego w zastrz. 4 z receptorem, do
wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do indukowania śmierci komórki u pacjenta.
24. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że kompozycja farmaceutyczna
obejmuje interferon-y.
25. Zastosowanie czynnika zdolnego do interferowania z połączeniem pomiędzy polipeptydem Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu określonym w zastrz. 4
a jego receptorem, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia, tłumienia lub
zmieniania odpowiedzi odpornościowej obejmującej ścieżkę sygnałową pomiędzy polipeptydem Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu i jego receptorem u pacjenta.
26. Zastosowanie według zastrz. 25, znamienne tym, że odpowiedź odpornościowa
obejmuje komórki ludzkiego gruczolakoraka.
* * *
Przedmiotem wynalazku są zasadniczo czysta sekwencja DNA, cząsteczka rekombinowanego DNA, komórka, zasadniczo czysty polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem
Martwicy Nowotworu, sposoby wytwarzania tego polipeptydu, kompozycje farmaceutyczne,
zastosowanie polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, sposób
identyfikowania receptora dla polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, fragment rozpuszczalny polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy
Nowotworu, sposób wytwarzania przeciwciała przeciw polipeptydowi Liganda Pokrewnego
z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, sposób wyrażania tego polipeptydu, zastosowanie wektora i zastosowanie czynnika zdolnego do interferowania z wiązaniem polipeptydu Liganda
Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu.
Opisany tu wynalazek został dokonany częściowo w trakcie pracy ufundowanej przez
Swiss National Found dla Irene Garcia grantem nr #31-42275.94 i 32-41729.94. Zachowane
są prawa opisane w paragrafie #28 i #29 statutu Swiss National Found.
Cytokiny pokrewne z czynnikiem martwicy nowotworu (TNF) są mediatorami obrony
gospodarza i regulacji odporności. Członkowie tej rodziny występują w postaci zakotwiczonej
w błonie, działając miejscowo przez kontakt międzykomórkowy, albo w postaci białek wydzielniczych zdolnych do dyfuzji do bardziej odległych celów. Równoległa rodzina receptorów sygnalizuje obecność tych cząsteczek prowadząc do zapoczątkowania śmierci komórkowej albo proliferacji i różnicowania docelowej tkanki. Obecnie, rodzina ligandów i receptorów TNF obejmuje 9 rozpoznanych par receptor-ligand, w tym: TNF:TNF-R; LT-a:TNF-R;
LT-a/p:LT-p-R; FasL:Fas; CD40L:CD40; CD30L:CD30; CD27L:CD27; OX40L:OX40
i 4-lBBL:4-lBB. Sekwencje DNA kodujące te ligandy wykazują jedynie około 25%-30%
188 102
5
identyczność nawet w najbardziej spokrewnionych przypadkach, jakkolwiek pokrewieństwo
aminokwasów wynosi około 50%.
Główna cecha tej rodziny receptorów cytokin spotykana jest w bogatej w cysteinę domenie zewnątrzkomórkowej, wykazanej oryginalnie przez klonowanie dwóch różnych receptorów TNF1. Ta rodzina genów koduje glikoproteiny charakterystyczne dla białek śródbłonowych typu 1, z zewnątrzkomórkową domeną wiążącą ligand, pojedynczym regionem błonowym i regionem śródplazmatycznym związanym z aktywacją funkcji komórkowych. Bogaty
w cysteinę region wiążący ligand wykazuje ściśle splecioną domenę rdzeniową połączoną
wiązaniami disiarczkowymi, która, zależnie od konkretnego członka rodziny powtarza się
wielokrotnie. Większość receptorów posiada cztery domeny, jakkolwiek może ich być tylko
trzy, jak również aż sześć.
Białka rodziny ligandów TNF charakteryzują się krótkim ciągiem końca N krótkich
aminokwasów hydrofilowych, często zawierających kilka reszt lizyny albo argininy, które są
uważane za sekwencje zatrzymujące przenoszenie. Następnie, występuje region śródbłonowy
oraz region zewnątrzkomórkowy o różnej długości, który oddziela koniec C domeny wiążącej
ligand receptora od błony. Region ten określa się często jako „stalk”. Region wiążący końca C
obejmuje większość białka i często, choć nie zawsze, miejsca glikozylacji. Geny te pozbawione są sekwencji sygnałowych charakterystycznych dla białek błonowych typu I, posiadając
budowę białek błonowych typu II z końcem C leżącym na zewnątrz komórki, oraz krótkim
końcem N leżącym w cytoplazmie. W niektórych przypadkach, np. TNF i LT-a, podczas obróbki białka może nastąpić odcięcie regionu „stalk” i ligand spotyka się głównie w postaci
wydzielniczej. Większość ligandów jednakże występuje w postaci związanej z błoną, pośrednicząc w sygnalizacji miejscowej.
Budowę tych ligandów dobrze określono przy użyciu analiz krystalograficznych TNF,
LT-a i CD40L. TNF i limfotoksyna-a (LT-a) zbudowane są jako „kanapka” dwóch anty-równoległych płacht P o topologii typu Jelly roli” albo klucza greckiego . Odchylenie rms
pomiędzy resztami nici Ca i p wynosi 0,61 C, co sugeruje wysoki stopień podobieństwa ich
topografii molekularnej. Cechą strukturalną wynikającą z badań molekularnych CD40L, TNF
i LT-a jest skłonność do łączenia się w oligomeryczne kompleksy. Powoduje to w oligomerycznych strukturach powstanie miejsc wiązania receptora na styku pomiędzy sąsiadującymi
podjednostkami tworzącymi multimerowy ligand. Przez analizę krystalograficzną wykazano,
że TNF, CD40L i LT-a występują w swej czwartorzędowej strukturze jako trimery. Wiele
spośród aminokwasów zakonserwowanych w różnych ligandach stanowi ciągi zrębowe płacht
p. Jest prawdopodobne, że podstawowa struktura kanapkowa jest zachowana we wszystkich
spośród tych cząsteczek, ponieważ części tych struktur zrębowych są zakonserwowane wśród
różnych członków rodziny. Podobnie możliwe jest, że struktura czwartorzędowa może być
również zachowana z powodu konformacji podjednostki.
Członków rodziny TNF można opisać jako główne przełączniki układu odpornościowego, kontrolujące zarówno przeżycie jak i różnicowanie. Obecnie, jedynie TNF i LT-a są uważane za cytokiny wydzielnicze, w przeciwieństwie do innych głównie zakotwiczonych
w błonie białek rodziny TNF. O ile dobrze scharakteryzowano postać błonową TNF i jest
możliwe, że posiada unikalną rolę biologiczną, wydzielniczy TNF działa jako ogólny sygnał
alarmowy działając na komórki odległe od miejsca zjawiska wyzwalającego. Tak więc wydzielenie TNF może zwielokrotnić zjawisko prowadzące do dobrze opisanych zmian w wyściółce naczyń oraz stanie zapalnym komórek. W przeciwieństwie, zakotwiczeni w błonie
członkowie rodziny wysyłają sygnały przez receptor TNF jedynie do komórek znajdujących
się w bezpośrednim kontakcie. Przykładowo, limfocyty T udzielają „pomocy" za pośrednictwem CD40 jedynie tym limfocytom B, które znajdują się w bezpośrednim kontakcie dzięki
oddziaływaniu przez TCR. Podobne ograniczenie do kontaktu międzykomórkowego dotyczy
zdolności do wywoływania śmierci komórkowej w dobrze poznanym układzie Fas.
Zdolność do wywoływania programowanej śmierci komórkowej jest istotną i dobrze
badaną cechą kilku członków rodziny TNF. Apoptoza za pośrednictwem Fas jak się wydaje,
odgrywa rolę w regulacji limfocytów autoreaktywnych na obwodzie i prawdopodobnie
w grasicy (Castro i in., 1996), zaś ostatnie wyniki powiązały układy TNF i CD30 z przeżywa-
6
188 102
niem linii limfocytów T i wielkokomórkowych chłoniaków anaplastycznych (Amakawa i in.,
1996; Gruss i in., 1994; Sytwu i in., 1996; Zheng i in., 1995). Twórcy wynalazku i inni autorzy wykazali uprzednio, że śmierć tych linii w reakcji na sygnalizację przez receptor TNF, Fas
albo LT-ß wykazuje cechy apoptozy (Abreu-Martin i in., 1995; Browning i in., 1996).
Wydaje się, że można podzielić ligandy TNF na trzy grupy, w oparciu o ich zdolność do
wywoływania śmierci komórkowej (tabela lit). Po pierwsze, TNF, ligand Fas i TRATT. potrafią skutecznie wywoływać śmierć komórkową w wielu liniach, zaś ich receptory w większości
posiadają dobrą zgodność domen śmierci komórkowej. Prawdopodobnie, ligand DR-3
(TRAMP/WSL-1) powinien również należeć do tej kategorii. Następnie, istnieją ligandy, które wyzwalają słaby sygnał śmierci komórkowej ograniczony do kilku rodzajów komórek, zaś
przykładami w tej grupie są TRELL, ligand CD30 i LTalb2. Interesującą kwestią jest sposób,
za pomocą którego grupa ta jest zdolna do wyzwolenia śmierci komórkowej pod nieobecność
domen śmierci, co może sugerować, że istnieje osobny słabszy mechanizm sygnalizacji
śmierci. Ostatnią grupę stanowią członkowie, którzy nie potrafią skutecznie dostarczać sygnału śmierci. Prawdopodobnie, wszystkie grupy wywołują działanie antyproliferacyjne wobec
niektórych rodzajów komórek w następstwie wywoływania różnicowania komórek, np. CD40
(Funakoshi i in., 1994).
Rodzina TNF urosła dramatycznie w ostatnich latach obejmując przynajmniej 11 różnych szlaków sygnalizacji dotyczących regulacji układu odpornościowego. Wzorzec ekspresji
TRELL i TRADL wskazuje, że w rodzinie tej wciąż istnieje nie odkryta zmienność funkcjonalna. Aspekt ten jest szczególnie widoczny w świetle ostatniego odkrycia dwóch receptorów,
które wpływają na zdolność do replikacji wirusa mięsaka Rous'a i opryszczki pospolitej, jak
również historycznych obserwacji, że TNF wykazuje aktywność przeciwwirusową, zaś wirusy
ospy kodują wabikowe receptory TNF (Brojatsch i in., 1996; Montgomery i in., 1996; Smith
1994; Vassalli 1992). Wytworzenie rozpuszczalnego TRELL i identyfikacja receptorów
TRELL powinna dostarczyć narzędzi do wyjaśnienia działania biologicznego tego interesującego białka.
TNF jest mediatorem wstrząsu septycznego i kacheksji, i jest związany z regulacją rozwoju układu krwiotwórczego. Wydaje się, że odgrywa główną rolę jako mediator stanu zapalnego i obrony przed zakażeniami bakteryjnymi, wirusowymi i pasożytniczymi, jak również
wykazuje działanie przeciwnowotworowe. TNF jest również związany z różnymi chorobami
autoagresyjnymi. TNF może być również wytwarzany przez kilka rodzajów komórek, w tym
przez makrofagi, fibroblasty, limfocyty T i naturalne komórki niszczące. TNF wiąże się
z dwoma różnymi receptorami, z których każdy działa przez swoiste cząsteczki wewnątrzkomórkowe, powodując różne działania TNF. TNF może występować w postaci związanej
z błoną albo jako rozpuszczalna cytokina wydzielnicza.
LT-a wykazuje wiele wspólnych aktywności z TNF, tj. wiąże się z receptorami TNF, ale
w przeciwieństwie do TNF wydaje się być głównie wydzielana przez aktywowane limfocyty
T i niektóre nowotwory ß-limfoblastoidalne. Kompleks heteromeryczny LT-a i LT-ß jest
kompleksem związanym z błoną, który wiąże się z receptorem LT-ß. Układ LT (LTs albo
LT-R) wydaje się być związany z rozwojem obwodowych narządów limfatycznych, ponieważ genetyczne zniszczenie LT-ß prowadzi do dezorganizacji limfocytów T i B w śledzionie
i brak węzłów chłonnych. Układ LT-ß jest również związany ze śmiercią komórkową niektórych linii komórkowych gruczolakoraków.
Fas-L, inny członek rodziny TNF, ulega głównie ekspresji na aktywowanych limfocytach T. Wywołuje on śmierć komórek niosących receptor dla niego, w tym komórek nowotworowych i zakażonych HIV, w mechanizmie znanym jako programowana śmierć komórkowa albo apoptoza. Ponadto, niedobory Fas albo Fas-L mogą prowadzić do chorób limfoproliferacyjnych, potwierdzając rolę układu Fas w regulacji reakcji odpornościowej. Układ Fas jest
również związany ze zniszczeniem wątroby w wyniku przewlekłego zapalenia wątroby oraz
z autoagresją u pacjentów zakażonych HIV. Układ Fas jest również związany ze zniszczeniem
limfocytów T u pacjentów z HIV. TRAEL, inny członek tej rodziny wydaje się być związany
ze śmiercią wielu rodzajów transformowanych linii komórkowych różnego pochodzenia.
188102
7
CD40-L, inny członek rodziny TNF, ulega ekspresji na limfocytach T i wywołuje regulację limfocytów B niosących CD40. Ponadto, zmiany w genie CD40-L powodują chorobę
znaną jako zespół hiper-IgM sprzężony z chromosomem X. Układ CD40 jest również związany z różnymi chorobami autoagresyjnymi, zaś CD40-L wykazuje działanie przeciwwirusowe.
Jakkolwiek, układ CD40 związany jest z ratowaniem apoptotycznych limfocytów B,
w komórkach poza układem odpornościowym wywołuje apoptozę. Wiele innych limfocytarnych członków rodziny TNF związanych jest również z ko-stymulacją.
Ogólnie, członkowie rodziny TNF odgrywają fundamentalną rolę regulacyjną w kontrolowaniu układu odpornościowego i aktywacji układów ostrej odporności gospodarza.
Wziąwszy pod uwagę współczesny postęp w manipulowaniu rodziną TNF w celach terapeutycznych, możliwe jest, że członkowie tej rodziny mogą zapewnić unikalne możliwości kontrolowania choroby. Niektóre ligandy tej rodziny mogą bezpośrednio wywoływać śmierć
z apoptozy w wielu komórkach transformowanych, np. LT, TNF, ligandem Fas i TRAIL (Nagata, 1997). Aktywacja receptorów Fas i prawdopodobnie TNF i CD30 może wywołać śmierć
komórkową w nietransformowanych limfocytach, co może odgrywać rolę immunoregulacyjną
(Amakawa i in., 1996; Nagata 1997; Sytwu iin., 1996; Zheng iin., 1995). Ogólnie, śmierć
jest wyzwalana w wyniku agregacji domen śmierci komórkowej, które znajdują się po cytoplazmatycznej stronie receptorów TNF. Domena śmierci kieruje łączeniem się różnych składników przekaźnictwa sygnałów, co powoduje aktywację kaskady (Nagata 1997). Niektórym
receptorom brak domen śmierci, np. receptorowi LTb i CD30 (Browning i in., 1996; Lee i in.,
1996), mimo to mogą wywoływać śmierć komórkową ale znacznie słabiej. Możliwe jest, że
receptory te działają głównie wywołując różnicowanie komórek, zaś śmierć jest wynikiem
zaburzeń w niektórych transformowanych liniach komórkowych, jakkolwiek obraz ten jest
niejasny ponieważ badania na myszach pozbawionych CD30 wskazują na rolę śmierci
w selekcji negatywnej w grasicy (Amakawa i in., 1996). I odwrotnie, sygnalizacja przez inne
szlaki jak CD40 jest konieczna do zachowania przeżywania komórek. Tak więc, istnieje potrzeba identyfikacji i charakteryzacji innych cząsteczek będących członkami rodziny TNF,
dostarczając w ten sposób dodatkowych sposobów kontrolowania choroby i manipulacji układem odpornościowym.
Wynalazek dotyczy polipeptydu, liganda pokrewnego z czynnikiem martwicy nowotworu, zwanego TRELL, który zasadniczo rozwiązuje jeden albo wiele problemów spowodowanych ograniczeniami i niedogodnościami stanu techniki. Wynalazek dostarcza nowego przedstawiciela rodziny cytokin TNF i określa sekwencję aminokwasową białka ludzkiego i mysiego, jak również sekwencje DNA kodujące te białka. Wynalazek można zastosować do identyfikacji nowych środków diagnostycznych i terapeutycznych w wielu chorobach i stanach jak
omówione szczegółowo powyżej, jak również w celu uzyskania informacji o układzie odpornościowym, zachodzących w nim procesach i możliwości manipulacji.
Dodatkowe cechy i zalety wynalazku zostaną podane niżej w poniższym opisie oraz
częściowo staną się oczywiste w oparciu o opis, albo mogą być wywnioskowane przez przeprowadzenie wynalazku. Cele i inne korzyści wynikające z wynalazku zostaną zrealizowane
i osiągnięte dzięki kompozycjom i sposobom szczegółowo przedstawionym w opisie i zastrzeżeniach, jak również w dołączonych rysunkach.
Tak więc, w celu uzyskania tych i innych korzyści oraz zgodnie z celem wynalazku, jak
to szeroko opisano, wynalazek obejmuje zasadniczo czystą sekwencję DNA kodującą polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu dalej określanego jako
TRELL, która zasadniczo składa się z sekwencji według Id. Sekw. nr 1 albo Id. Sekw. nr 3.
Sekwencja przedstawiona w Id Sekw. nr 1 jest sekwencją mysiego TRELL (mTRELL), zaś
sekwencja przedstawiona w id. Sekw. nr 3 jest sekwencją ludzkiego TRELL (hTRELL).
W zakres wynalazku wchodzi też cząsteczka rekombinowanego DNA obejmująca sekwencję
DNA określoną powyżej, która jest połączona funkcjonalnie z sekwencją kontrolującą ekspresję oraz komórka jednokomórkowego gospodarza transformowana tą cząsteczką rekombinowanego DNA.
W wynalazku jest przydatna dowolna odpowiednia sekwencja kontrolująca ekspresję,
która może być łatwo wybrana przez specjalistę.
8
188102
W wynalazku, może być zastosowany dowolny odpowiedni gospodarz, który może być
łatwo wybrany przez specjalistę bez nadmiernego eksperymentowania.
Wynalazek obejmuje zasadniczo czysty TRELL mający biologicznie funkcjonalną sekwencję wybraną z sekwencji aminokwasowej o Id Sekw. nr 2 albo Id. Sekw. nr 4 również
w postaci fragmentów albo homologów. W różnych wykonaniach, sekwencja aminokwasowa
i/lub DNA TRELL może obejmować konserwatywne insercje, delecje i substytucje, jak dalej
określone albo może obejmować fragmenty takich sekwencji.
Wynalazek dotyczy także sposobów wytwarzania zasadniczo czystego TRELL, obejmujących etap hodowania transformowanego gospodarza jednokomórkowego określonego powyżej, oraz TRELL zasadniczo wolnego od normalnie towarzyszących białek zwierzęcych.
Jeden ze sposobów objętych wynalazkiem obejmuje etap hodowania jednokomórkowego gospodarza transformowanego cząsteczką rekombinowanego DNA, przy czym cząsteczka
ta obejmuje sekwencję DNA funkcjonalnie połączoną z sekwencją kontrolującą ekspresję, a ta
sekwencja DNA hybrydyzuje w surowych warunkach z sekwencją o Id. Sekw. nr 1 albo o Id.
Sekw. nr 3, przy czym te surowe warunki obejmują etapy przemywania przy użyciu 2x SSC,
0,1% SDS przy 65°C, a ta sekwencja DNA koduje polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu o sekwencji Id. Sekw. nr 2 lub Id. Sekw. nr 4 lub jego
rozpuszczalny fragment, zdolny do wiązania z komórką wybraną z grupy składającej się z:
a) komórki promielocytowej K562,
b) komórki białaczki monocytowej THP-1,
c) komórki gruczolakoraka jelita HT29,
d) komórki zarodkowej nerki 293; i
e) komórki fibroblastów nerki COS.
Inny sposób według wynalazku obejmuje etap hodowania komórki jednokomórkowego
gospodarza transformowanej cząsteczką rekombinowanego DNA, a ta cząsteczka obejmuje
sekwencję DNA funkcjonalnie połączoną z sekwencją kontrolującą ekspresję, przy czym ta
sekwencja DNA obejmuje kolejne nukleotydy, które kodują polipeptyd Liganda Pokrewnego
z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, który obejmuje konserwatywne substytucje, zmiany, lub
delecje sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw. nr 2 albo Id. Sekw. nr 4, które nie znoszą biologicznej aktywności polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu.
Wynalazek dotyczy też kompozycji farmaceutycznej, która obejmuje skuteczną terapeutycznie ilość peptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, któiy ma
sekwencję wybraną z sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw. nr 2 lub Id. Sekw. nr 4 i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik. Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą ewentualnie obejmować dopuszczalne farmaceutycznie adiuwanty, wypełniacze albo inne kompozycje farmaceutyczne oraz mogą być podawane również znanymi drogami.
W zakres wynalazku wchodzi także zastosowanie polipeptydu Liganda Pokrewnego
z Czynnikiem Martwicy Nowotworu określonego powyżej, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zapobiegania i zmniejszania stopnia zaawansowania choroby autoimmunizacyjnej u pacjenta, do zapobiegania i zmniejszania nasilenia reakcji odpornościowej na przeszczep tkankowy u pacjenta, do stymulowania odpowiedzi odpornościowej u pacjenta, do
tłumienia układu odpornościowego u pacjenta, do leczenia raka u pacjenta.
Wynalazek dotyczy również sposobu identyfikowania receptora dla polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, który obejmuje etapy:
a) dostarczania polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu
mającego biologicznie fbnkcjonalną sekwencję wybraną z sekwencji aminokwasowej o Id.
Sekw. nr 2 albo Id. Sekw. nr 4 lub jego fragmentu;
b) znakowania tego polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu lub jego fragmentu; i
c) poszukiwanie kompozycji do wykrywania receptorów, które wiążą się z wykrywalnie
znakowanym polipeptydem Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu lub
jego fragmentem z etapu b.
Wynalazek dotyczy również fragmentu rozpuszczalnego polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu, który wykazuje biologiczną aktywność polipepty-
188 102
9
du Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu i obejmuje koniec aminowy,
który rozpoczyna się pomiędzy aminokwasami numer 22 i 80 Id. Sekw. nr 2 lub aminokwasami numer 81 i 139 Id. Sekw. nr 4.
Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania przeciwciała skierowanego przeciw
polipeptydowi Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu mającemu biologicznie funkcjonalną sekwencję wybraną z sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw. nr 2 albo
Id. Sekw. nr 4, przy czym sposób ten obejmuje etapy immunizowania zwierzęcia tym polipeptydem lub jego antygenowym fragmentem i izolowania tego przeciwciała od tego zwierzęcia.
Wynalazek dotyczy także kompozycji farmaceutycznej obejmującej skuteczną terapeutycznie ilość przeciwciała skierowanego przeciwko polipeptydowi Liganda Pokrewnego
z Czynnikiem Martwicy Nowotworu lub jego antygenowemu fragmentowi i ewentualnie dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
Wynalazek dotyczy również sposobu wyrażania polipeptydu Liganda Pokrewnego
z Czynnikiem Martwicy Nowotworu in vitro w zwierzęcej hodowli komórkowej, obejmującego:
a) wprowadzenie wektora obejmującego sekwencję DNA mającą następujące po sobie
nukleotydy, które kodują ten polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu do tej hodowli komórkowej, przy czym ten polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu obejmuje sekwencję aminokwasową Id. Sekw. nr 2 lub Id. Sekw.
nr 4 lub ich fragment; i
b) utrzymanie tej hodowli komórkowej w stanie żywym w warunkach, w których wyrażana jest w niej wymieniona sekwencja DNA.
Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania wektora obejmującego sekwencję DNA mającą następujące po sobie nukleotydy, które kodują polipeptyd Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu o sekwencji wybranej z sekwencji aminokwasowej Id. Sekw. nr
2 lub Id. Sekw. nr 4 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia zaburzeń
mających związek z polipeptydem Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu
u ssaków, korzystnie u człowieka. Korzystnie wektorem jest wirus.
Wynalazek dotyczy również zastosowania czynnika zdolnego do interferowania z wiązaniem polipeptydu Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu mającego
biologicznie fUnkcjonalną sekwencję wybraną z sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw. nr 2
albo Id. Sekw. nr 4 z receptorem do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do indukowania śmierci komórki u pacjenta, korzystnie kompozycja ta obejmuje interferon-y.
Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania czynnika zdolnego do interferowania z połączeniem pomiędzy polipeptydem Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu
mającego biologicznie funkcjonalną sekwencję wybraną z sekwencji aminokwasowej o Id.
Sekw. nr 2 albo Id. Sekw. nr 4 a jego receptorem do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia, tłumienia lub zmieniania odpowiedzi odpornościowej obejmującej ścieżkę
sygnałową pomiędzy polipeptydem Liganda Pokrewnego z Czynnikiem Martwicy Nowotworu
i jego receptorem u pacjenta. Korzystnie odpowiedź odpornościowa obejmuje komórki ludzkiego gruczolaka.
W niniejszym wynalazku opisano też rozpuszczalne konstrukty TRELL, które można
zastosować do bezpośredniego wyzwalania zjawisk farmakologicznych związanych z TRELL.
Takie zjawiska mogą dawać korzyści przydatne terapeutycznie w leczeniu raka albo w manipulowaniu układem odpornościowym w leczeniu chorób autoimmunologicznych. Rozpuszczalne postaci TRELL można konstruować genetycznie tak, aby obejmowały łatwo rozpoznawalny znacznik, ułatwiając w ten sposób identyfikację receptorów TRELL. TRELL według wynalazku może być zastosowany w terapii genowej.
Należy rozumieć, że zarówno powyższy opis ogólny, jak również poniższy opis szczegółowy mają służyć za przykład i wyjaśnienie, i w zamierzeniach dostarczają dalszego wyjaśnienia zastrzeganego wynalazku.
Towarzyszące rysunki są włączone w celu dostarczenia dalszego wyjaśnienia wynalazku, oraz są włączone do, i stanowią część tego opisu, ilustrując kilka wykonań wynalazku
i wraz z opisem służą do wyjaśnienia zasad wynalazku.
Figura 1 pokazuje porównanie sekwencji aminokwasowej ludzkiego i mysiego TRELL.
10
188 102
Figura 2A i 2B pokazuje porównanie sekwencji aminokwasowej ludzkich członków rodziny TNF.
Figura 3 jest analizą metodą northem ekspresji mRNA TRELL w różnych mysich liniach komórkowych i tkankach. Ścieżki są powtórzone i zawierają RNA z (1) makrofagów
otrzewnowych indukowanych tioglikolanem; (2) szpiku; (3) śledziony i (4) wątroby.
Figura 4 pokazuje analizę northem ekspresji mRNA TRELL w różnych tkankach ludzkich.
Figura 5: SDS-PAGE rekombinowanego TNF, LTa i TRELL w warunkach redukujących i nie redukujących.
Figura 6: TRELL jest cytotoksyczny dla ludzkiej linii gruczolakoraka HT29.
A. Zdolność TNF, TRELL, LTa/p i przeciwciała przeciwko Fas do blokowania wzrostu
linii HT29 w obecności ludzkiego interferonu-y. Komórki hodowano przez 4 dni w obecności
różnych czynników i oceniano wzrost testem MTT.
B. Morfologia komórek ulegających śmierci komórkowej. Komórki hodowano przez 2
dni, a następnie traktowano przez 24 godziny 80 U/ml interferonu-y i A. pozostawiano bez
dalszych dodatków, B. 100 ng/ml utrwalano etanolem i badano pod mikroskopem kontrastującym fazy na górnym panelu (powiększenie 400x) i barwiono barwnikiem Hoechst 1 M-g/ml
w celu wykrywania jąder w dolnym panelu. Typowe komórki ze skondensowanymi jądrami
charakterystycznymi dla apoptozy zaznaczono strzałkami.
Poniżej odniesiono się szczegółowo do konkretnych korzystnych wykonań wynalazku.
Wynalazek dotyczy sekwencji DNA, które kodują ludzki albo mysi TRELL, jego fragmenty
i homologi, oraz ekspresji tych sekwencji DNA w gospodarzu transformowanym nimi. Wynalazek dotyczy zastosowania tych sekwencji DNA i kodowanych przez nie peptydów. Oprócz
tego, wynalazek obejmuje zarówno ludzkie jak i mysie sekwencje aminokwasowe TRELL,
albo ich fragmenty, jak również kompozycje farmaceutyczne obejmujące je albo pochodzące
z nich.
A. Definicje
„Homologiczne” w znaczeniu tu zastosowanym, dotyczy podobieństwa sekwencji pomiędzy sekwencjami porównywanych cząsteczek. Jeżeli pozycja w obu porównywanych sekwencjach zajmowana jest przez tę samą zasadę albo aminokwas, np. jeżeli pozycja w dwóch
porównywanych cząsteczkach DNA zajmowana jest przez adeninę, to cząsteczki są homologiczne w tej pozycji. Procent homologii pomiędzy dwiema sekwencjami jest funkcją liczby
pozycji pasujących albo homologicznych w obu sekwencjach podzielonej przez liczbę porównywanych pozycji xl00. Przykładowo, jeżeli 6 spośród 10 pozycji w dwóch sekwencjach jest
zgodnych albo homologicznych, to dwie sekwencje są w 60% homologiczne. Przykładowo,
sekwencje DNA ATTGCC iTATGGC wykazują 50% homologię. Ogólnie, porównania
dokonuje się gdy dwie sekwencje przyrównane są w sposób zapewniający maksymalną
homologię.
„Oczyszczony preparat” albo „zasadniczo czysty preparat” polipeptydu w znaczeniu tu
zastosowanym oznacza polipeptyd, który oddzielono od innych białek, lipidów i kwasów nukleinowych, które występują z nim w naturze. Korzystnie, polipeptyd jest również oddzielany
od innych substancji, np. przeciwciał, matryc, itp. które zastosowano do jego oczyszczania.
„Transformowany gospodarz” w znaczeniu tu zastosowanym oznacza dowolnego gospodarza, ze stabilnie zintegrowaną sekwencją, tj. sekwencją TRELL, wprowadzoną do jego
genomu albo gospodarza posiadającego sekwencję, tj. elementy episomalne kodujące TRELL.
„Leczenie” w znaczeniu tu zastosowanym oznacza dowolne terapeutyczne postępowanie np. podawanie środka terapeutycznego albo substancji np. leku.
„Zasadniczo czysty kwas nukleinowy”, np. zasadniczo czysty DNA, jest kwasem nukleinowym, który jest: nie bezpośrednio ciągły z jedną albo obiema sekwencjami np. sekwencjami kodującymi, z którymi jest bezpośrednio ciągły (tj. jedną na końcu 5' i drugą na końcu
3') w naturalnie występującym genomie organizmu, z którego pochodzi kwas nukleinowy;
albo (2), który jest zasadniczo wolny od sekwencji kwasu nukleinowego, z którymi występuje
w organizmie z którego pochodzi kwas nukleinowy. Określenie obejmuje, przykładowo, rekombinowany DNA, który jest włączony do wektora, np. do autonomicznie replikującego
188 102
11
plazmidu albo wirusa, albo do genomowego DNA prokariota albo eukariota, albo który występuje jako osobna cząsteczka (np. cDNA albo fragment genomowego DNA wytworzony
przez PCR albo traktowanie endonukleazami restrykcyjnymi) niezależnie od innych sekwencji
DNA. Zasadniczo czysty DNA obejmuje również rekombinowany DNA, który jest częścią
genu hybrydowego kodującego TRELL.
Określenia „peptydy”, „białka” i „polipeptydy” stosowane są tu zamiennie.
„Biologicznie czynne” w znaczeniu tu zastosowanym, oznacza posiadające działanie
in vivo albo in vitro, które może się wyrażać bezpośrednio albo pośrednio. Biologicznie czynne fragmenty TRELL mogą mieć, przykładowo, 70% homologię aminokwasową z miejscem
aktywnym TRELL, korzystniej przynajmniej 80%, zaś najkorzystniej przynajmniej 90% homologię. Identyczność albo homología w odniesieniu do TRELL określona jest jako procent
reszt aminokwasowych potencjalnej sekwencji, które są identyczne z resztami TRELL w Id.
Sekw. nr 2 albo 4.
W realizacji wynalazku stosuje się, o ile nie zaznaczono inaczej, konwencjonalne techniki biologii komórkowej, hodowli komórkowej, biologii molekularnej, biologii transgenicznej, mikrobiologii, rekombinacji DNA i immunologii, które są znane specjalistom. Techniki
takie opisano w literaturze.
B. Sekwencje DNA według wynalazku
Jak to tu opisano, jeden z aspektów wynalazku stanowi zasadniczo czysty (albo rekombinowany) kwas nukleinowy, który obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd
TRELL, taki jak DNA opisany w Id. Sekw. nr 1 albo 3 i/lub zamienniki takich kwasów nukleinowych. Określenie kwas nukleinowy w znaczeniu tu zastosowanym może obejmować fragmenty i zamienniki takie jak, przykładowo, sekwencje kodujące peptydy zamienne funkcjonalnie. Zamienne sekwencje nukleotydowe mogą obejmować sekwencje, które różnią się jedną albo wieloma substytucjami, addycjami albo delecjami, takie jak odmiany alleliczne, mutacje itp. i obejmują sekwencje, które różnią się od sekwencji nukleotydowej kodującej TRELL
pokazanej na Id. Sekw. nr 1 albo 3 z powodu degeneracji kodu genetycznego. Wynalazcy zsekwencj onowali ludzki DNA wielkości 1936 bp, który zawierał otwartą ramkę odczytu kodującą polipeptyd TRELL, o sekwencji 248 aminokwasów, jak to pokazano na Id. Sekw. nr 4.
Wynalazca opisuje tu sekwencje ludzkie i mysie; wynalazek opisany zostanie ogólnie
w odniesieniu do sekwencji ludzkich, jednakże specjalista zrozumie, że włączone tu są również sekwencje mysie. Uderzającą cechą TRELL jest silne zakonserwowanie sekwencji domeny wiążącej receptora pomiędzy myszą i człowiekiem; jedynie ligand Fas zbliża się do tego
poziomu zakonserwowania. Zarówno mysie, jak i ludzkie białka TRELL posiadają cechy charakterystyczne rodziny TNF, tj. organizację białka błonowego typu II i zakonserwowanie motywów sekwencji związanych z fałdowaniem białka w postaci struktury przeciw-równoległych
płacht (3 TNF.
Sekwencja nukleotydową dla mTRELL podana jest w Id. Sekw. nr 1; sekwencja aminokwasowa dla mTRELL opisana jest w Id. Sekw. nr 2. Sekwencje DNA i aminokwasowa dla
hTRELL podane są, odpowiednio, w Id. Sekw. nr 3 i 4.
Sekwencje według wynalazku można zastosować do wytworzenia szeregu sond DNA,
które są przydatne do badania przesiewowego różnych kolekcji naturalnych i syntetycznych
DNA, na obecność sekwencji DNA, które kodują TRELL albo ich fragmenty albo pochodne.
Specjalista zauważy, że określenie „TRELL” w znaczeniu tu zastosowanym dotyczy ich biologicznie czynnych pochodnych, fragmentów albo homologów.
Sekwencje DNA kodujące TRELL według wynalazku można zastosować do wytworzenia peptydów TRELL przez ekspresję różnych gospodarzy prokariotycznych i eukariotycznych transformowanych tymi sekwencjami. Te peptydy TRELL można zastosować przeciwnowotworowo albo do regulacji odporności. Ogólnie, obejmuje to etapy hodowania gospodarza transformowanego cząsteczką DNA zawierającą sekwencję kodującą TRELL, połączoną
funkcjonalnie z sekwencją kontrolującą ekspresję.
Sekwencje DNA i rekombinowane cząsteczki DNA według wynalazku można wyrażać stosując wiele różnych kombinacji gospodarz/wektor. Przykładowo, przydatne wektory
mogą obejmować segmenty sekwencji chromosomalnych, nie chromosomalnych albo synte-
12
188 102
tycznego DNA. Wektory ekspresyjne według wynalazku charakteryzują się przynajmniej
jedną sekwencją kontrolującą ekspresję, które można połączyć funkcjonalnie z sekwencją
DNA TRELL wprowadzoną do wektora, w celu kontrolowania i regulowania ekspresji sekwencji DNA.
Ponadto, w każdym wektorze ekspresyjnym, do wprowadzenia sekwencji TRELL według wynalazku można wybrać różne miejsca. Miejsca te zazwyczaj są skonstruowane w celu
cięcia ich przez enzymy restrykcyjne, zaś miejsca te i endonukleazy są dobrze znane specjalistom. Należy oczywiście rozumieć, że wektor ekspresyjny przydatny według wynalazku nie
musi mieć miejsca restrykcyjnego endonukleazy do wprowadzenia pożądanego fragmentu
DNA. Zamiast tego, wektor można klonować alternatywnymi sposobami. Wektor ekspresyjny, zaś w szczególności miejsce wybrane do wprowadzenia wybranego fragmentu DNA, oraz
funkcjonalne połączenie z sekwencją kontrolującą ekspresję określa się różnymi czynnikami.
Czynniki te obejmują, choć nie są ograniczone do wielkości wyrażanego białka, podatności
pożądanego białka na rozkład proteolityczny przez enzymy komórki gospodarza, liczbę
miejsc podatnych na konkretny enzym restrykcyjny, zanieczyszczenia albo wiązanie wyrażanego białka przez białka komórki gospodarza, co może powodować trudności w usunięciu
podczas oczyszczania. Dodatkowe czynniki, które należy uwzględnić obejmują charakterystykę ekspresji taką jak położenie kodonów start i stop względem sekwencji wektora oraz innych
czynników, które są znane specjalistom. Wybór wektora i miejsca wprowadzenia dla zastrzeganych sekwencji DNA określa się przez uwzględnianie tych czynników, przy czym nie każdy
wybór jest równie skuteczny dla pożądanego zastosowania. Jednakże, rutyną wśród specjalistów jest analiza tych parametrów i wybór odpowiedniego układu zależnie od konkretnego
zastosowania.
Specjalista może łatwo dokonać odpowiednich modyfikacji w sekwencjach kontrolujących ekspresję, w celu uzyskania wyższych poziomów ekspresji białka, tj. przez zastąpienie
kodonów, albo wybór kodonów dla konkretnych aminokwasów, które są korzystnie wykorzystywane przez konkretne organizmy, w celu minimalizacji proteolizy albo w celu zmiany
składu glikozylacji. Podobnie, można zamienić cysteiny na inne aminokwasy w celu ułatwienia wytwarzania, fałdowania albo zwiększenia stabilności.
Tak więc, nie wszystkie kombinacje gospodarzy/wektorów ekspresyjnych mają równoważną skuteczność w wyrażaniu sekwencji DNA według wynalazku. Jednakże, konkretny
wybór kombinacji gospodarza/wektora ekspresyjnego może być dokonany przez specjalistę.
Czynniki, które można uwzględnić, obejmują, przykładowo, zgodność gospodarza i wektora,
toksyczność białek kodowanych przez sekwencję DNA dla gospodarza, łatwość odzyskiwania
pożądanego białka, charakterystykę ekspresji sekwencji DNA i sekwencji kontrolujących ekspresję połączonych funkcjonalnie, bezpieczeństwo biologiczne, koszty oraz fałdowanie, formowanie albo inne konieczne modyfikacje potranslacyjne pożądanego białka.
TRELL i jego homologi wytworzone przez gospodarzy transformowanych sekwencjami
według wynalazku, jak również oczyszczony natywny TRELL albo wytworzony z zastrzeganych sekwencji aminokwasowych, są przydatne w wielu kompozycjach i sposobach do
zastosowań przeciwnowotworowych i immunoregulacyjnych. Są one również przydatne
w leczeniu i sposobach dotyczących innych chorób.
Ujawnione tu sekwencje DNA mogą być wykorzystane do ekspresji TRELL w nienormalnych warunkach, tj. w terapii genowej. TRELL można wyrażać w komórkach nowotworowych pod kierunkiem promotorów odpowiednich dla takich zastosowań. Taka ekspresja
może zwiększyć reakcje odpornościowe przeciwko nowotworom albo bezpośrednio zakłócać
przeżywanie nowotworów. Cytokiny, takie jak TRELL mogą również wpływać na przeżycie
przeszczepów narządowych przez zmianę lokalnej reakcji odpornościowej. W tym przypadku,
sam przeszczep albo otaczające komórki można modyfikować zmienionym genem TRELL.
Izolowany kwas nukleinowy kodujący TRELL może być zastosowany w terapii „antysensownej”. W znaczeniu tu zastosowanym, „terapia antysensowna” dotyczy podawania albo
wytwarzania in situ oligonukleotydów albo ich pochodnych, które swoiście hybrydyzują
w warunkach komórkowych z komórkowym mRNA i/lub DNA kodującym TRELL, w taki
188 102
13
sposób, że hamują ekspresję kodowanego białka, tj. przez zahamowanie transkrypcji i/lub
translacji. Wiązanie może zachodzić przez konwencjonalne parowanie zasad albo, przykładowo, w przypadku wiązania dupleksów DNA, przez swoiste oddziaływanie w rowku większym podwójnej helisy. Ogólnie, terapia antysensowna oferuje szereg technik ogólnie stosowanych w technice i obejmuje dowolną terapię, która polega na swoistym wiązaniu sekwencji
oligonukleotydowych.
Konstrukt antysensowny można dostarczyć, przykładowo, jako plazmid ekspresyjny,
który podczas transkrypcji w komórce wytwarza RNA, który jest komplementarny
z przynajmniej częścią komórkowego mRNA, który koduje TRELL. Alternatywnie, konstrukt
może być sondą oligonukleotydową, która jest wytwarzana ex vivo. Takie sondy oligonukleotydowe są korzystnie modyfikowanymi oligonukleotydami, które są odporne na endogenne
nukleazy i w ten sposób są stabilne in vivo. Przykładowe cząsteczki kwasów nukleinowych do
zastosowania jako Oligonukleotydy antysensowne są analogami fosfoamidynowymi, tiofosforanowymi i metylofosforanowymi DNA (patrz, np. 5,176,996; 5,264,564 i 5,256,775).
Oprócz tego, ogólne podejścia do konstruowania oligonukleotydów przydatnych w terapii
antysensownej opisano, przykładowo, przez Van Der Kroi i in., (1988) Biotechniques 6:958-976 oraz Stein i in., (1988) Cancer Res. 48:2659-2668, załączone tu jako odnośniki.
C. TRELL i jego sekwencje aminokwasowe
Białko pokrewne z rodziną czynnika martwicy nowotworu (TRELL) według wynalazku,
jak to opisano wyżej, jest członkiem rodziny TNF. Białko, jego fragmenty albo homologi mogą mieć szerokie zastosowanie terapeutyczne i diagnostyczne.
TRELL występuje w wielu tkankach, z wzorcem, który jest względnie unikalny wśród
członków rodziny TNF. Ponieważ rodzina TNF jest związana z regulowaniem śmierci komórkowej i przeżywania oraz różnicowaniem komórek, możliwe jest, że TRELL jest również
związany z przeżywaniem, różnicowaniem i naprawą w różnych tkankach.
Jakkolwiek nie jest znana dokładna budowa trójwymiarowa TRELL, uważa się, że jako
członek rodziny TNF może posiadać wspólne cechy strukturalne z innymi członkami rodziny.
Ujawniony jest tu zarówno mysi jak i ludzki TRELL. Mysi TRELL, jak można wywnioskować z istniejącej sekwencji cDNA, obejmuje ciąg przynajmniej 21 aminokwasów hydrofobowych, które prawdopodobnie działają jako domeny zakotwiczone w błonie dla białka błonowego typu II. Sekwencję aminokwasową mTRELL opisano w Id. Sekw. nr 2.
Ludzki TRELL obejmuje N-końcową domenę cytoplazmatyczną, około 27 aminokwasów hydrofobowych, śródbłonową domenę typu II i 204-aminokwasową domenę zewnątrzkomorkową. Sekwencja aminokwasową hTRELL opisana jest w Id. Sekw. nr 4.
Figura 1 przedstawia porównanie sekwencji aminokwasowej ludzkiego i mysiego
TRELL.
O
ile na podstawie otwartej ramki odczytu w klonie cDNA można przewidzieć
52-aminokwasowy region końca N, nie można przewidzieć dokładnie początkowej metioniny.
Met-36 posiada sensowną sekwencję zgodności Kozak'a, co może czynić ją korzystnym kodonem start. Porównanie sekwencji TRELL z innymi członkami ludzkiej rodziny TNF wykazuje istotne podobieństwo strukturalne. Przykładowo, jak widać na figurach 2A i 2B, wszystkie białka przypominają białka błonowe typu II i posiadają kilka wspólnych regionów zakonserwowania sekwencji w domenie zewnątrzkomórkowej. Regiony z kreskami nad sekwencją
wskazują sekwencje w TNF i LTa związane z organizacją ciągów p cząsteczek. Podkreślono
domniemane miejsca glikozylacji końca N. Gwiazdki oznaczają cysteiny związane z wiązaniami disiarczkowymi w TNF. Domeny zakonserwowane są prawdopodobnie związane z oddziaływaniem pomiędzy podjednostkami i organizacją płacht.
Poszukiwanie EST ujawniło ludzki klon o długości 345 zasad, które były wysoce homologiczne z mysim TRELL. Sekwencja aminokwasowa ludzkiego TRELL podana jest na Id.
Sekw. nr 4. Otwarte ramki odczytu kodowane przez EST nie zawierają motywów sekwencji,
które umożliwiałyby charakteryzację tej sekwencji jako członka rodziny ligandów TNF, np.
motywu zastosowanego przez Wiley'a i in., do identyfikacji EST TRAIL w istniejącej bazie
danych.
14
188 102
Nowe polipeptydy ujawnione w opisie swoiście oddziałują z receptorem, który nie został jeszcze zidentyfikowany. Jednakże, ujawnione tu peptydy i metody umożliwiają identyfikację receptorów, które swoiście oddziałują z TRELL albo jego fragmentami.
W opisie ujawniono peptydy pochodzące z TRELL, które mają zdolność do wiązania się
z receptorami TRELL. Fragmenty TRELL można wytworzyć kilkoma sposobami, np. rekombinacyjnie, przez PCR, trawienie proteolityczne albo syntezę chemiczną. Fragmenty wewnętrzne albo końcowe polipeptydu można wytworzyć przez usunięcie jednego albo wielu
nukleotydów z końca albo obu końców kwasu nukleinowego, który koduje polipeptyd. Ekspresja mutagenizowanego DNA daje fragmenty polipeptydowe. Trawienie endonukleazami
„endnibbling” (wytrawiającymi końce) może dać DNA, które kodują różne fragmenty. DNA,
które kodują fragmenty białka można również wytworzyć przez losowe rozrywanie, trawienie
restrykcyjne albo kombinację dyskutowanych wyżej sposobów.
Fragmenty polipeptydowe można również syntetyzować chemicznie stosując znane
techniki, takie jak konwencjonalna reakcja Merrifielda na podłożu stałym f-moc albo t-boc.
Przykładowo, peptydy i sekwencje DNA według wynalazku można arbitralnie podzielić na
fragmenty o pożądanej długości bez nakładania się fragmentów, albo podzielić na fragmenty
nakładające się o pożądanej długości. Sposoby takie jak te są opisane szczegółowo poniżej.
D. Wytwarzanie rozpuszczalnego TRELL
Rozpuszczalne postaci Liganda mogą często skutecznie przekazywać sygnał, a stąd mogą być podawane jako lek w celu naśladowania naturalnej postaci błonowej. Możliwe jest, że
TRELL jest wydzielany w naturze jako cytokina rozpuszczalna, jednakże, jeżeli tak nie jest,
to można skonstruować gen wymuszający takie wydzielenie. W celu wytworzenia rozpuszczalnej postaci wydzielniczej TRELL, można usunąć na poziomie DNA regiony śródbłonowe
końca N oraz część regionu „stalk” i zastąpić je sekwencją liderową typu I albo alternatywnie
sekwencją liderową typu II, która umożliwia skuteczne proteolityczne odcięcie w wybranym
układzie ekspresyjnym. Specjalista może zmieniać wielkość pozostawionego regionu „stalk”
wydzielniczym konstrukcie ekspresyjnym w celu optymalizacji właściwości wiązania receptora i skuteczności wydzielania. Przykładowo, konstnikty zawierające wszystkie możliwe długości „stalk”, tj. okrojone na końcu N, można wytworzyć w taki sposób, że powstaną białka
rozpoczynające się od aminokwasów 81 do 139. Sekwencja „stalk” optymalnej długości powinna powstać w wyniku takiej analizy.
E. Wytwarzanie przeciwciał reagujących z TRELL
W opisie opisano również przeciwciała swoiście reagujące z TRELL albo jego receptorem. Surowice odpornościowe albo przeciwciała monoklonalne przeciwko białku/przeciwko
peptydowi można wytworzyć protokołem standardowym, (patrz, np. Antibodies: A Laboratory Manuał, wyd. Harlow i Lane (Cold Spring Harbor Press, 1988). Ssaka takiego jak mysz,
chomik albo królik można immunizować immunogenną postacią peptydu. Techniki zapewniania immunogenności białku albo peptydowi obejmują sprzęganie z nośnikami albo inne
znane techniki.
Immunogenną część TRELL albo jego receptora można podawać w obecności adiuwanta. Postęp immunizacji można śledzić przez wykrywanie miana przeciwciał w osoczu albo
surowicy. Standardowy test ELISA albo inne testy immunologiczne można zastosować
z immunogenem jako antygenem w celu określenia poziomu przeciwciał.
W najkorzystniejszym wykonaniu, przeciwciała są immunospecyficzne wobec determinant TRELL albo jego receptora, np. determinant antygenowych polipeptydu o Id. Sekw. nr 2
albo 4, albo blisko spokrewnionego homologa ludzkiego albo ssaka nie będącego człowiekiem (np. 70, 80 albo 90 procent homologii, korzystnie przynajmniej 95% homologii).
W jeszcze innym korzystnym wykonaniu wynalazku, przeciwciała przeciwko TRELL albo
przeciwko receptorowi TRELL zasadniczo nie reagują krzyżowo (tj. reagują swoiście)
z białkiem, które jest np. mniej niż w 80% homologiczne z Id. Sekw. nr 2 albo 4, korzystnie
mniej niż w 90% homologiczne z Id. Sekw. nr 2 albo 4. Przez określenie „zasadniczo nie reaguje” rozumie się, że przeciwciało ma powinowactwo wiązania do białek nie homologicznych mniejsze niż 10%, korzystnie mniejsze niż 5%, zaś jeszcze korzystniej mniej niż 1%
powinowactwa wiązania z białkiem o Id. Sekw. nr 2 albo 4.
188 102
15
Określenie „przeciwciało” w znaczeniu tu zastosowanym obejmuje jego fragmenty, które również swoiście reagują z TRELL albo receptorem TRELL. Przeciwciała można poddać
fragmentacji stosując techniki konwencjonalne, zaś fragmenty badać przesiewowo w kierunku
ich przydatności w sposób analogiczny jak opisany wyżej dla przeciwciał pełnych. Przykładowo, fragmenty F(ab')2 można wytworzyć przez traktowanie przeciwciała pepsyną. Powstałe
fragmenty F(ab')2 można traktować w celu redukcji wiązań disiarczkowych z wytworzeniem
fragmentów Fab'. Przeciwciała według wynalazku dalej obejmują cząsteczki o podwójnej
swoistości i chimeryczne wykazujące aktywność przeciwko TRELL i przeciwko receptorowi
TRELL. Tak więc, zarówno przeciwciała (Ab) monoklonalne, jak i poliklonalne skierowane
przeciwko TRELL i jego receptorowi oraz przeciwciała takie jak Fab1 i F(ab')2 można zastosować do blokowania działania TRELL i jego receptora.
Różne postaci przeciwciał można również wytworzyć stosując standardowe techniki rekombinacji DNA (Winter i Milstein, Nature 349:293-299 (1991) załączone tu jako odnośnik).
Przykładowo, można skonstruować przeciwciała chimeryczne, w których domena wiążąca
antygen z przeciwciała zwierzęcego połączona jest z ludzką domeną stałą (np. Cabilly i in.,
Patent USA 4,816,567). Przeciwciała chimeryczne mogą zmniejszyć obserwowaną reakcję
odpornościową wywołaną przez przeciwciała zwierzęce zastosowane do leczenia ludzi.
Oprócz tego, można syntetyzować rekombinowane „przeciwciała humanizowane”, które
rozpoznają TRELL albo jego receptor. Przeciwciała humanizowane są chimerami obejmującymi większość sekwencji ludzkich IgG do których wprowadzono regiony odpowiedzialne za
swoiste wiązanie antygenu. Zwierzęta immunizuje się pożądanym antygenem, izoluje się odpowiednie przeciwciała i usuwa się część sekwencji regionu zmiennego odpowiedzialną za
wiązanie antygenu. Regiony wiążące antygen, pochodzące od zwierzęcia klonuje się
w odpowiednim położeniu genów ludzkich przeciwciał, z których usunięto regiony wiążące
antygen. Przeciwciała humanizowane minimalizują zastosowanie heterologicznych (tj. obcogatunkowych) sekwencji w przeciwciałach ludzkich, a stąd z mniejszym prawdopodobieństwem wywołają reakcje odpornościowe u leczonego osobnika.
Konstruowanie różnych klas rekombinowanych przeciwciał można również osiągnąć
przez wytwarzanie przeciwciał chimerycznych albo humanizowanych, obejmujących domeny
zmienne i ludzkie domeny stałe (CHI, CH2, CH3) wyizolowane z różnych klas immunoglobulin. Przykładowo, przeciwciała o rosnących wartościowościach wiążących antygen można
wytworzyć rekombinacyjnie przez klonowanie miejsca wiązania antygenu do wektorów niosących ludzkie regiony łańcuchów stałych (Arulanandam i in., J. Exp. Med. 177:1439-1450
(1993)).
Oprócz tego, standardowe techniki rekombinacji można zastosować w celu zmienienia
powinowactwa wiązania przeciwciał rekombinowanych z ich antygenami, przez zmianę reszt
aminokwasowych w sąsiedztwie miejsc wiązania antygenu. Powinowactwo wiązania antygenu przeciwciała humanizowanego można zwiększyć przez mutagenezę opartą na modelowaniu cząsteczkowym (Queen i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-33 (1989)).
F. Wytwarzanie analogów: Wytworzenie zmienionych sekwencji DNA i peptydowych
Analogi TRELL mogą różnić się od naturalnie występującego TRELL sekwencją aminokwasową albo w sposób nie obejmujący sekwencji, albo obydwoma sposobami. Modyfikacje niezwiązane z sekwencją obejmują derywatyzację chemiczną TRELL in vitro i in vivo.
Modyfikacje nie dotyczące sekwencji obejmują, choć nie są ograniczone do zmian w acetylacji, metylacji, fosforylacji, karboksylacji albo glikozylacji.
Korzystne analogi obejmują TRELL albo jego fragmenty biologicznie czynne, których
sekwencje różnią się od sekwencji podanych w Id. Sekw. nr 2 albo 4, przez substytucję jednego albo wielu aminokwasów zakonserwowanych, albo przez jedną albo wiele substytucji,
delecji albo insercji aminokwasów nie konserwatywnych, co nie powoduje zniesienia aktywności TRELL. Substytucje zakonserwowane zwykle obejmują zastąpienie jednego aminokwasu innym o podobnej charakterystyce, np. substytucje w obrębie następujących grup: walina,
glicyna; glicyna, alanina; walina, izoleucyna, leucyna; kwas asparaginowy, kwas glutaminowy; asparagina, glutamina; seryna, treonina; lizyna, arginina; i fenyloalanina, tyrozyna.
16
188 102
Tabela I
Konserwatywne zastąpienia aminokwasowe
Aminokwas
Kod
Zastępowany przez:
Alanina
A
D-Ala, Gly, Beta-Ala, L-Cys, D-Cys
Arginina
R
D-Arg, Lys, D-Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met,
Ile, D-Met, D-Ile, Om, D-Orn
Asparagina
N
D-Asn, Asn, D-Asp, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln
Kwas asparaginowy
D
D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln
Cysteina
C
D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr
Glutamina
Q
D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
Kwas glutaminowy
E
D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gln, D-Gln
Glicyna
G
Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Ala, Acp
Izoleucyna
I
D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Leucyna
L
D-Leu, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Lizyna
K
D-Lys, Arg, D-Arg, Homo-Arg, D-homo-Arg, Met,
D-Met, Ile, D-Ile, Orn, D-Orn
Metionina
M
D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val,
DOVal
Fenyloalanina
F
D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp,
D-Trp, Trans-3, 4 albo 5-fenyloprolina, cis-3, 4
albo 5-fenyloprolina
Prolina
P
D-Pro, kwas L-1-tiazolidyno-4-karboksylowy, kwas
D- albo L-1-okasazolidyno-4-karboksylowy
Seryna
S
D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Met, D-Met, Met (O),
D-Met(O), L-Cys, D-Cys
Treonina
T
D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Met (O),
D-Met (O), Val, D-Val
Tyrozyna
Y
D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His
Walina
V
D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met
188 102
17
Metody przydatne do mutagenezy obejmują mutagenezę przez PCR i mutagenezę wysycającą, jak to dyskutuje się niżej. Bibliotekę losowych odmian sekwencji aminokwasowych
można również wytworzyć przez syntezę zestawu zdegenerowanych sekwencji oligonukleotydowych.
- Mutageneza przez PCR
W mutagenezie przez PCR, w celu wprowadzenia losowych mutacji do klonowanego
fragmentu DNA można zastosować polimerazę Taq o zmniejszonej wierności (Leung i in.,
1989, Technique 1:11-15). Jest to potężna i względnie szybka metoda wprowadzania losowych mutacji. Region mutagenizowanego DNA można amplifikować stosując reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) w warunkach, które zmniejszają wierność syntezy DNA przez polimerazę DNA Taq, np. przez zastosowanie stosunku dGTP/dATP równego pięć i dodanie
Mn2+ do reakcji PCR. Pulę amplifikowanych fragmentów DNA można wprowadzić do odpowiedniego wektora klonującego w celu zapewnienia biblioteki losowych mutantów.
- Mutageneza wysycająca
Mutageneza wysycająca umożliwia szybkie wprowadzenie znacznej liczby zastąpień
pojedynczych zasad w klonowanych fragmentach DNA (Mayers i in., 1985, Science 229:242).
Technika ta obejmuje wytworzenie mutacji np. przez traktowanie chemiczne albo napromieniowanie jednoniciowych DNA in vitro i syntezę komplementarnej nici DNA. Częstość mutacji można modulować przez modulowanie siły traktowania i można otrzymać zasadniczo
wszystkie możliwe zastąpienia zasad. Ponieważ procedura ta nie obejmuje selekcji genetycznej zmutowanych fragmentów, można wytworzyć zarówno obojętne substytucje, jak również
można wytworzyć białko przez mutagenezę losową DNA, która zmienia funkcje. Rozmieszczenie mutacji punktowych nie jest ukierunkowane na zakonserwowane elementy sekwencji.
- Oligonukleotydy zdegenerowane
Bibliotekę homologów można również wytworzyć z zestawu zdegenerowanych sekwencji oligonukleotydowych. Syntezę chemiczną zdegenerowanych sekwencji można przeprowadzić na automatycznym syntezatorze DNA, zaś syntetyczne geny poddać ligacji do odpowiedniego wektora ekspresyjnego. Synteza zdegenerowanych oligonukleotydów jest znana.
Techniki takie zastosowano w kierowanej ewolucji innych białek.
Techniki mutagenezy nie losowej, czyli ukierunkowanej można zastosować w celu dostarczenia konkretnych sekwencji albo mutacji w określonych regionach. Techniki te można
zastosować w celu wytworzenia odmian, które obejmują np. delecje, insercje albo substytucje
reszt znanej sekwencji aminokwasowej białka. Miejsca mutacji można modyfikować indywidualnie albo seriami np. przez (1) substytucję najpierw zakonserwowanych aminokwasów,
a następnie bardziej radykalnym wyborem zależnie od uzyskanego wyniku, (2) delecję docelowej reszty, albo (3) insercje reszt tej samej albo różnej klasy stycznie do określonego miejsca albo przez kombinację opcji 1-3.
- Mutageneza przez skanowanie alaniną
Mutageneza przez skanowanie alaniną jest przydatną metodą identyfikacji konkretnych
reszt albo regionów pożądanego białka, które są korzystnymi położeniami albo domenami do
mutagenezy (Cunningham i Wells (Science 244:1081-1085, 1989)). Podczas skanowania alaniną, identyfikuje się resztę albo grupę reszt docelowych (np. reszty naładowane takie jak Arg,
Asp, His, Lys albo Glu) i zastępuje neutralnym albo naładowanym ujemnie aminokwasem
(najkorzystniej alaniną albo polialaniną). Zastąpienie aminokwasu może zakłócić oddziaływanie aminokwasów z otaczającym środowiskiem wodnym w komórce albo na zewnątrz.
Domeny, które wykazują funkcjonalną wrażliwość na zastąpienia można następnie dalej badać, przez wprowadzenie dalszych albo innych odmian w miejscu zastąpienia. Tak więc, o ile
miejsce wprowadzenia odmiany sekwencji aminokwasowej jest z góry określone, nie ma konieczności przewidzenia natury samej mutacji. Przykładowo, w celu optymalizacji prowadzenia mutacji w danym miejscu, można przeprowadzić skanowanie alaniną albo mutagenezę
losową w docelowym kodonie albo regionie i badać przesiewowo wyrażone odmiany podjednostek białka w kierunku optymalnej kombinacji pożądanej aktywności.
18
188102
- Mutageneza za pośrednictwem oligonukleotydu
Mutageneza za pośrednictwem oligonukleotydu jest przydatną metodą wytwarzania
odmian substytucyjnych, delecyjnych albo insercyjnych DNA, np. Adelman i in., (DNA
2:183, 1983). Pokrótce, pożądany DNA można zmienić przez hybrydyzację oligonukleotydu
kodującego mutację z matrycą DNA, przy czym matryca jest w postaci jednoniciowej plazmidu albo bakteriofaga zawierającego niezmienioną albo natywną sekwencję DNA pożądanego
białka. Po hybrydyzacji, w celu syntezy całej nici komplementarnej stosuje się polimerazę
DNA, która włącza w ten sposób starter oligonukleotydowy i koduje wybraną zmianę
w pożądanym DNA białka. Ogólnie, stosuje się Oligonukleotydy o długości przynajmniej 25
nukleotydów. Optymalny oligonukleotyd ma od 12 do 15 nukleotydów, które są całkowicie
komplementarne z matrycą po obu stronach nukleotydu(ów) kodującego(ych) mutację. Zapewnia to, że oligonukleotyd będzie hybiydyzował prawidłowo z jednoniciową cząsteczką
matrycy DNA. Oligonukleotydy można łatwo syntetyzować stosując znane techniki, które
opisano np. przez Crea i in., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:5765 (1978)).
- Mutageneza kasetowa
Innym sposobem wytwarzania odmian, mutageneza kasetowa, oparta jest na technice
opisanej przez Wells'a i in., (Gene 34:315 (1985)). Materiałem wyjściowym może być plazmid (albo inny wektor), który obejmuje mutowany DNA podjednostki białka. Identyfikuje
się kodon(y) w mutowanym DNA podjednostki białka. Po obu stronach zidentyfikowanego
miejsca muszą występować unikalne miejsca endonukleaz restrykcyjnych. Jeżeli takie miejsca
nie występują, można je wytworzyć stosując opisaną wyżej metodę mutagenezy za pośrednictwem oligonukleotydu w celu wprowadzenia ich w odpowiednie położenie w pożądanym
DNA podjednostki białka. Po wprowadzeniu do plazmidu miejsc restrykcyjnych, plazmid tnie
się w tych miejscach w celu linearyzacji. Dwuniciowy oligonukleotyd, kodujący sekwencję
DNA pomiędzy miejscami restrykcyjnymi, ale zawierający pożądaną mutację syntetyzuje się
stosując techniki standardowe. Ten dwuniciowy oligonukleotyd określany jest jako kaseta.
Kaseta ta jest skonstruowana w taki sposób, że posiada koniec 3' i 5', które są kompatybilne
z końcami linearyzowanego plazmidu tak, że może być bezpośrednio wprowadzona do plazmidu. Plazmid ten zawiera obecnie zmutowaną sekwencję DNA podjednostki białka.
- Mutageneza kombinatoryjna
Mutagenezę kombinatoryjną można również zastosować do wytworzenia mutantów.
Przykładowo, sekwencje aminokwasowe dla grupy homologów albo innych pokrewnych białek przyrównuje się, korzystnie umożliwiając najwyższą możliwą homologię. Wszystkie aminokwasy, które pojawiają się wdanej pozycji przyrównanych sekwencji można wybrać do
stworzenia zdegenerowanego zestawu sekwencji kombinatoiyjnych. Zmienną bibliotekę odmian wytwarza się przez mutagenezę kombinatoryjną na poziomie kwasu nukleinowego
i kodowaną przez bibliotekę zmiennych genów. Przykładowo, mieszaninę syntetycznych oligonukleotydów można połączyć enzymatycznie z sekwencjami genu w taki sposób, że zdegenerowany zestaw potencjalnych sekwencji jest możliwy do wyrażenia jako indywidualne peptydy albo alternatywnie, jako zestaw większych białek fiuzyjnych zawierających zestaw
sekwencji zdegenerowanych.
Znane są różne techniki badań przesiewowych produktów wytworzonych przez zmutowane geny. Techniki badania przesiewowego wielkich bibliotek genów często obejmują klonowanie biblioteki genu do replikujących wektorów ekspresyjnych, transformowanie odpowiednich komórek gospodarza powstałą biblioteką wektorów i wyrażanie genów w warunkach, w których wykrywanie pożądanej aktywności np. w tym przypadku wiązania z TRELL
albo jego receptorem ułatwia względnie łatwą izolację wektora kodującego gen, którego produkt jest wykiywany. Każda z technik opisanych niżej jest możliwa do zastosowania w wielkoprzepustowej analizie do badania przesiewowego znacznych liczb wytworzonych
sekwencji, np. technikami losowej mutagenezy.
Wynalazek umożliwia również zmniejszenie domen wiążących TRh białka polipeptydów TRELL albo ich receptorów, w celu wytworzenia mimetyków np. peptydowych albo nie
peptydowych. Mimetyki peptydowe są zdolne do rozerwania wiązania pomiędzy TRELL
i jego receptorem. Kluczowe reszty TRELL związane z rozpoznawaniem molekularnym poli-
188 102
19
peptydu receptora albo białka wewnątrzkomórkowego można określić i zastosować w celu
wytworzenia TRELL albo peptydomimetyków pochodzących z jego receptora, które kompetycyjnie albo nie kompetycyjnie hamują wiązanie TRELL z jego receptorem (patrz, przykładowo europejskie zgłoszenie patentowe EP-412,762A i EP-B31,080A).
G. Kompozycje farmaceutyczne
Przez dostarczenie oczyszczonych i rekombinowanych TRELL, wynalazek dostarcza testów, które można zastosować do badania przesiewowego w kierunku leków, które są agonistami albo antagonistami normalnych czynności komórkowych, w tym przypadku TRELL
albo jego receptora. W jednym wykonaniu, test bada zdolność związku do modulowania wiązania pomiędzy TRELL i jego receptorem. Różne formaty testów powinny być odpowiednie,
zaś w świetle wynalazku, powinny być znane specjaliście.
W wielu programach badań przesiewowych leków, które badają biblioteki związków
albo naturalnych ekstraktów, pożądane są testy wielkoprzepustowe, w celu maksymalizacji
liczby związków poddanych badaniu w danej jednostce czasu. Testy, które przeprowadza się
w układach bezkomórkowych mogą opierać się na białkach oczyszczonych albo na wpół
oczyszczonych, są często korzystne jako „wstępne” badania, ponieważ mogą być przeprowadzone w celu umożliwienia szybkiego opracowania i względnej łatwości wykrywania zmian
w celach cząsteczkowych, za pośrednictwem badanego związku.
Ponadto, efekty komórkowej toksyczności i/lub dostępności biologicznej badanych
związków można generalnie zignorować w układzie in vitro, ponieważ test skupia się głównie
na wpływie leku na cel cząsteczkowy, co może objawiać się zmianą powinowactwa wiązania
z innymi białkami albo zmianą właściwości enzymatycznych celu cząsteczkowego.
Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą obejmować skuteczną terapeutycznie ilość TRELL albo receptora TRELL, albo ich fragmentów albo mimetyków i ewentualnie, mogą obejmować nośniki dopuszczalne farmaceutycznie. Kompozycje farmaceutyczne
zawierające TRELL mogą być stosowane do leczenia raka oraz pobudzania, zaś w niektórych
przypadkach hamowania układu odpornościowego, albo jego części przez podawanie skutecznej farmaceutycznie ilości związku według wynalazku albo jego dopuszczalnych farmaceutycznie soli albo pochodnych. Należy oczywiście rozumieć, że kompozycje i sposoby według wynalazku można zastosować w kombinacji z innymi terapiami dla różnych schematów
postępowania.
Kompozycje mogą mieć postać odpowiednią dla różnych dróg podawania, w tym podawania układowego albo miejscowego. Do podawania układowego korzystne jest wstrzyknięcie, w tym domięśniowe, dożylne, dootrzewnowe i podskórne; kompozycje do wstrzyknięć,
według wynalazku, można formułować w roztworach wodnych, korzystnie w buforze zgodnym fizjologicznie takim jak roztwór Hank'a albo Ringer'a. Oprócz tego kompozycje można
formułować w postaci stałej i ewentualnie rozpuszczanej albo zawieszanej bezpośrednio
przed zastosowaniem. Postaci liofilizowane są również objęte wynalazkiem.
Kompozycje można podawać doustnie, albo metodami przezśluzówkowymi albo przezskómymi. Do podawania przezśluzowkowego albo przezskómego do kompozycji stosuje się
środki penetrujące odpowiednie do pokonywanej barieiy. Takie środki penetrujące są znane
i obejmują przykładowo, do podawania przezśluzowkowego, sole żółciowe, pochodne kwasu
fusydowego i detergenty. Podawanie przezśluzówkowe można prowadzić przez rozpylacze
donosowe albo czopki. Do podawania doustnego, kompozycje formułuje się w konwencjonalne postaci takie jak kapsułka, tabletki i toniki. Do podawania miejscowego kompozycje
według wynalazku formułuje się w postaci maści, żelów albo kremów.
Korzystnie, kompozycje według wynalazku są w postaci dawki jednostkowej i mogą
być podawane raz albo kilka razy dziennie. Ilość podawanego składnika czynnego w czasie
trwania leczenia zależy od wielu czynników. Przykładowo, wieku i wielkości osobnika, zaawansowania i przebiegu leczonej choroby, sposobu i postaci podawania oraz oceny lekarza
prowadzącego. Jednakże, skuteczna dawka może mieścić się w zakresie od około 0,005 do
około 5 mg/kg/dzień, korzystnie od około 0,05 do około 0,5 mg/kg/dzień. Specjalista zauważy, że przydatne mogą być niższe i wyższe dawki.
20
188 102
Ujawnione w wynalazku konstrukty genowe można również zastosować jako część protokołu terapii genowej w celu dostarczenia kwasów nukleinowych kodujących agonistyczną
albo antagonistyczną postać polipeptydu TRELL. Konstrukty ekspresyjne TRELL można podawać w dowolnym skutecznym biologicznie nośniku, np. dowolnej formulacji albo kompozycji zdolnej do skutecznego dostarczenia genu dla TRELL do komórek in vivo. Podejścia
obejmują wprowadzanie genu do wektorów wirusowych, które potrafią bezpośrednio transfekować komórki albo dostarczać plazmidowy DNA przy użyciu, np. liposomów albo nośników
wewnątrzkomórkowych, jak również przez bezpośrednie wstrzyknięcie konstruktu genowego.
Korzystne są sposoby transferu przez wektor wirusowy.
Kompozycja farmaceutyczna obejmująca konstrukt do terapii genowej może obejmować
zasadniczo układ dostarczania genów w dopuszczalnym rozcieńczalniku albo może obejmować matrycę do powolnego uwalniania, w które zatopiony jest nośnik dostarczający gen. Alternatywnie, gdzie można wytworzyć kompletny układ dostarczania genu pozbawiony rekombinowanych komórek, np. wektor retrowirusowy, kompozycja farmaceutyczna może obejmować jedną albo wiele komórek, które wytwarzają układ dostarczania genu.
Oprócz zastosowania w terapii, oligomery według wynalazku można zastosować jako
reagenty diagnostyczne do wykrywania obecności albo nieobecności sekwencji docelowego
DNA, RNA albo białka, z którymi wiążą się swoiście. W innym aspekcie, wynalazek można
zastosować do badania cząstek chemicznych pod względem ich zdolności do oddziaływania z,
np. wiązania albo łączenia się fizycznie z polipeptydem TRELL albo jego fragmentem. Sposób obejmuje doprowadzenie do kontaktu cząsteczki chemicznej z polipeptydem TRELL
i badanie zdolności cząsteczki do oddziaływania z TRELL. Oprócz tego, TRELL według wynalazku można zastosować w sposobach badania naturalnie występujących ligandów albo
receptorów TRELL, jak również do badania cząsteczek chemicznych, które łączą się albo
wiążą z receptorem TRELL. W pewnych aspektach, wynalazek dostarcza sposobu badania
cząsteczek chemicznych pod względem ich zdolności do modulowania oddziaływania pomiędzy TRELL i jego receptorem. Sposób obejmuje łączenie receptora TRELL i TRELL w warunkach w których para jest zdolna do oddziaływania, dodawanie badanej cząsteczki chemicznej i wykrywanie tworzenia się albo dysocjacji kompleksów. Te czynniki modulujące
można dalej badać in vitro, np. przez badanie ich aktywności w układzie bezkomórkowym
a następnie, ewentualnie, podawać związek komórkom albo zwierzętom i badać efekty.
H. Przykłady
I. Izolowanie cDNA TRELL
a) Klonowanie mysiego TRELL
cDNA kodujący mTRELL wyizolowano przez PCR z biblioteki cDNA z mysich makrofagów otrzewnowych. Sekwencja aminokwasowa i położenie regionu śródbłonowego są typowe dla białka błonowego. Sekwencja aminokwasowa mTRELL podana jest na Id. Sekw.
nr 2 zaś sekwencja DNA na Id. Sekw. nr 1.
Makrofagi otrzymano z myszy Balb/c przez płukanie jamy otrzewnej, zaś komórek, które przylgnęły do plastiku przez godzinę poddano lizie i ekstrahowano z nich RNA. Syntetyzowano antysensowny starter oligonukleotydowy z sekwencji mysiej erytropoetyny:
5'GTTCCAGGCCAGCCTGGG3' (Shoemaker iMistock, Mol. Cell. Biol. 6:849 (1986)).
Starter ten zastosowano w protokole 5'RACE według instrukcji producenta (5'RACE System
z firmy BRL) w połączeniu ze starterem kotwiczącym zaprojektowanym przez BRL. Pierwszą
nić cDNA wytworzono z RNA z przylegających przez godzinę makrofagów otrzewnowych.
Amplifikację przeprowadzono w urządzeniu Perkin Elmer DNA Thermal Cycler z polimerazą
DNA Taq z Perkin Elmer. Po denaturacji przez 5 minut w 94°C zastosowano następujące warunki: 35 cykli po 30 sekund w 94°C, 30 sekund w 55°C i 3 minuty w 72°C. Przeprowadzono
dodatkowe wydłużanie w 72°C i zatrzymano reakcję w 4°C. Analiza doświadczenia PCR na
żelu agarozowym wykazała 2 amplifikowane fragmenty po 650 bp i 500 bp. 2 fragmenty wycięto z żelu, wprowadzono do wektorów pBS-T i sekwencjonowano. Obie wstawki były inne.
Obie posiadały na końcach te same startery oligonukleotydowe swoiste dla erytropoetyny zastosowane do zapoczątkowania reakcji PCR. Hybrydyzacja metodą northern z fragmentami
losowo znakowanymi P wykazała, że hybrydyzowały z różnymi RNA, fragment 500 bp hy-
188 102
21
brydyzował z RNA wielkości 1,4 kb w makrofagach. Znakowane 32P sondy rybonukleinowe
zastosowane w obu kierunkach użyto w hybrydyzacji northern w celu określenia kierunku
cDNA.
Z oznaczonych kierunków i sekwencji, uzyskano dwa startery wewnętrzne dla mRNA
wielkości 1,4 kb. Zastosowano je w, odpowiednio 3' i 5'RACE-PCR. Doświadczenie 3'RACE
wykazało fragment wielkości 750 bp, który wprowadzono do wektora pBS-T i sekwencjono
wano. Odpowiadał on końcowi 3' RNA 1,4 kb, ponieważ sekwencja zawierała dodatek sygnału poliA AATAAA bezpośrednio przed ciągiem poliA. 5'RACE nie wykazała żadnego prążka.
W celu wytworzenia biblioteki cDNA z przylegających przez godzinę makrofagów zastosowano zestaw do amplifikacji cDNA Clontech Marathon. Zastosowano fragment PCR wielkości 1040 bp, wyizolowany przez PCR z sensownym i antysensownym starterem
oligonukleotydowym, oraz starterem uniwersalnym z zestawu. Umożliwiło to izolację fragmentu większej wielkości niż oryginalny fragment 1040 bp. Nowy fragment, który sekwen
cjonowano dodał 60 bp do sekwencji 5’ (Id. Sekw. nr 1).
RNA ekstrahowano z mysich makrofagów otrzewnowych indukowanych tioglikolanem
po 1 godzinnym przyleganiu. Przeprowadzono hybrydyzację z cDNA TRELL znakowanym
32P. Figura 3 pokazuje analizę metodą northern ekspresji mRNA TRELL w mysich makrofagach otrzewnowych i innych mysich tkankach.
Pierwsze 21 aminokwasów stanowi hydrofobową domenę śródbłonową. Nie stwierdzono identycznych sekwencji na poziomie nukleotydowym i aminokwasowym w dostępnych
bazach danych. Stosując program PROSITE oraz sekwencję 225 aminokwasów stwierdzono,
że sekwencja należy do białek rodziny TNF. Białko posiadało również różne domeny opisane
dla LTα i innych członków tej rodziny (Browning i in., Cell 72:847 (1993); Ware i in., „The
ligands and receptors of the lymphotoxin system; w Pathways for Cytolysis, Griffith
i Tschopp (wyd.) Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, str. 175-218 (1995)). Sekwencja ta jest
unikalna. Na poziomie nukleotydowym albo aminokwasowym obserwowano słabą identyczność albo podobieństwo z innymi członkami rodziny TNF oraz innymi sekwencjami. Przeszukując bazy danych EST, 1 sekwencja ludzka wykazywała homologię z sekwencją mysią.
Klon 154742,5' (numer dostępu GenBank R55379) z biblioteki sutka wykonanej przez Soares,
Washington University, posiadał sekwencję 345 par zasad o 89% homologii z mysim TRELL.
Żadna z ludzkich sekwencji w dostępnych bazach danych nie pasowała do dostępnego końca
5' DNA mTRELL.
b) Klonowanie ludzkiego TRELL
i) Wytworzenie sond oligonukleotydowych i starterów PCR
Sekwencją ludzkiego EST R55379, który wykazywał homologię z mysim TRELL
zastosowano jako podstawę do syntezy starterów oligonukleotydowych. Syntetyzowano dwa
sensowne ciągi oligonukleotydowe po 20 zasad:
LTB-065 5'CCCTGCGCTGCCTGGAGGAA (NT 70-89 z R55379):
LTB-066 5'TGATGAGGGGAAGGCTGTCT (NT 14-33 z R55379) oraz jeden 20-mer
antysensowny:
LTB-067 5'AGACCAGGGCCCCTCAGTGA (NT 251-270 z R55379).
ii) Identyfikacja źródła mRNA i cDNA do klonowania hTRELL.
PoliA+ mRNA z ludzkiej wątroby (nr kat 6510-1), śledziony (nr kat. 6542-1) i węzła
chłonnego (nr kat. 6594-1 zakupiono z Clontech. PoliA+ mRNA z ludzkich linii komórkowych THP-1, U937 i 11-23 wytworzono w Biogen, Cambridge, MA. Bibliotekę cDNA ludzkiego migdałka w lambda gt10 oraz DNA z biblioteki migdałka również wytworzono w Biogen. Przeprowadzono RT-PCR na sześciu próbkach RNA. Każda mieszanina reakcyjna
cDNA zawierała 1 μg poliA+mRNA, 50 mM Tris pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM
DTT, 250 μM dNTP, 50 ng losowych heksamerów (50 ng/μl) i 400 jednostek odwrotnej tran
skryptazy Super-ScriptII (Gibco BRL nr kat. 6542-1) w objętości końcowej 40 μl. Mieszaninę
reakcyjną inkubowano w 20°C przez 20 minut, 42°C przez 50 minut i 99°C przez 5 minut. Do
PCR, zastosowano 1/50 każdej z mieszanin reakcyjnych cDNA albo 100-1000 ng DNA biblioteki cDNA. Nastawiono dwie reakcje PCR dla każdej próbki, jedną z parą starterów LTB-065 i LTB-067, co dało produkt PCR wielkości 201 bp i drugą z parą starterów LTB-066
22
188 102
i LTB-067, co dało produkt 257 bp jeżeli transkrypcja zachodziła w próbce. Reakcje PCR
przeprowadzono w 10 mM Tris pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,01% żelatynie, 10%
DMSO, 100 μM dNTP, 30 pmoli każdego ze starterów oraz 5 jednostek AmpliTaq (Perkin
Elmer nr. kat. N801-0060). PCR prowadzono w urządzeniu Perkin Eimer Cetus DNA Thermal Cycler Model 480. Warunkami reakcji były: 1 minuta w 95°C, 1 minuta w 60°C i 1 minuta w 72°C przez 35 cykli.
Prawidłowej wielkości produkty PCR otrzymano z wątroby, śledziony, węzła chłonnego, THP-1 i migdałka, ale nie z U937 albo 11-23. Produkt PCR 201 bp wytworzony z wątroby
oczyszczono w celu zastosowania jako sondy do badania przesiewowego cDNA.
iii) Badanie przesiewowe biblioteki cDNA
Wiedząc, dzięki PCR, że biblioteka migdałków zawiera TRELL, jeden milion jednostek
tworzących łysinki (pfu) z biblioteki cDNA ludzkiego migdałka w Lambda gt10 wysiano
w gęstości 1x 105 pfu/płytkę NUNC™. Na filtrach Schlecher&Schuell BS-S85 Optitran™ 20
x20 cm wykonano odbitki. Produkt PCR wielkości 201 bp znakowano losowymi starterami
P32 (Feinberg i Vogelstein, Anal. Biochem. 137:266-267, 1984). Filtry hybrydyzowano przez
noc w 65°C w 400 ml buforu do badania przesiewowego (50 mM Tris pH 7,5, IM NaCl,
0,1% pirofosforan sodu, 0,2% PVP i 0,2% Ficoll) zawierającego 10% siarczan dekstranu,
100 μg/ml tRNA i 6x105 cpm/ml sondy. Płukano je dwukrotnie buforem i dwukrotnie 2xSSC,
0,1% SDS w 65°C i umieszczono z filmem w -70°C z ekranem wzmacniającym przez
40 godzin.
Podwójnie pozytywne łysinki pobrano z płytek głównych w SM (100 mM NaCl, 10 mM
MgSO4, 50 mM Tris pH 7,5) z żelatyną. Oczyszczono 12 spośród pozytywnych łysinek. Mi
nipreparat DNA Lambda z 12 oczyszczonych łysinek trawiono Notl, poddano elektroforezie
na 1% żelu agarozowym, przeprowadzono transfer metodą Southema i hybrydyzowano
z sondą 201 bp. Klony o większych wstawkach (około 2 kb), które hybrydyzowały z sondą
wybrano do oczyszczania DNA na wielką skalę i sekwencjonowania DNA. Wstawkę
z każdego z tych klonów subklonowano do miejsca Notl pBluescriptSK+ (Stratagene nr
212205). Sekwencję DNA otrzymano z DNA Lambda i plazmidowego DNA. Klon F 1a, który
zawierał wstawkę cDNA wielkości 2006 bp posiadał na końcu regionu kodującego 5' wstawkę i nie zawierał kompletnej ramki odczytu. Klon C2a, zwany również PB 133 zawierał
wstawkę cDNA wielkości 1936 bp. Klon ten zawierał nie ulegający translacji region 5' wielkości 543 bp, otwartą ramkę odczytu wielkości 852 bp i nie ulegający translacji region 3', ale
nie zawierał sygnału poliadenylacji ani ogona poliA.
Sekwencja nukleotydową kodująca ramkę odczytu cDNA hTRELL klonu A2a podana
jest jako Id. Sekw. nr 3. Wywnioskowana sekwencja aminokwasowa 284 aminokwasów
podana jest na Id. Sekw. nr 4. Druga metionina w pozycji 36 może być kodonem startu translacji ponieważ lepiej odpowiada wymaganiom startu określonym przez Kozak'a.
Stosując zidentyfikowane sekwencje, określono sekwencje cDNA kodujących TRELL.
Z opisanych wyżej sekwencji DNA (tj. Id. Sekw. nr 3) wywnioskowano sekwencje aminokwasowe TRELL (Id. Sekw. nr 4). Należy wyjaśnić, że znając obecny stan techniki inżynierii
białek, specjalista może dokonać odpowiednich zmian, insercji albo delecji w tych sekwencjach aminokwasowych i otrzymać różne cząsteczki wykazujące zasadniczo tę samą aktywność biologiczną albo immunologiczną co cząsteczki opisane tutaj.
iv) analiza metodą northem ekspresji ludzkiego TRELL
Fragment PpuM1/BstXI wielkości 440 bp ludzkiego klonu cDNA 2a znakowano 32P losowymi starterami i stosowano jako sondę do dostępnych w handlu membran northem zawierających RNA z różnych tkanek ludzkich. Analiza metodą northern wykazała, że fragment
hTRELL hybrydyzował z pojedynczym rodzajem mRNA wielkości od 1,4 do 1,6 kb. Ludzki
TRELL ulega ekspresji w większości narządów układu odpornościowego, tj. śledzionie, limfocytach krwi obwodowej (PBL), węzłach chłonnych, wyrostku robaczkowym, ale jest go
względnie mało w grasicy, wątrobie płodowej (źródle komórek macierzystych limfocytów)
i szpiku (figura 4). Stąd, głównie wtórne narządy limfatyczne wyrażają TRELL. Ekspresję
wykryto również w jajniku, prostacie, jelicie cienkim, okrężnicy, sercu, mózgu, łożysku, wątrobie mięśniach szkieletowych, nerce i trzustce. Ekspresja była względnie niska w jądrach,
188 102
23
wątrobie, nerkach i grasicy. Ten wzorzec wskazuje na rozpowszechnioną ekspresję ściśle
przypominającą ligand TRAIL, z takim wyjątkiem, że TRAIL ulega słabej ekspresji w sercu
i mózgu.
c) Izolacja receptora wiążącego ligand TRELL
Ligandy rodziny TNF można zastosować do identyfikacji i klonowania receptorów.
Z opisaną sekwencją TRELL, można poddać fuzji koniec 5' domeny zewnątrzkomórkowej
liganda TRELL, który stanowi sekwencję wiążącą receptor z sekwencją znacznikową i dodać
sekwencję liderową, która wymusi wydzielenie liganda w dowolnym spośród układów ekspresyjnych. Przykład takiej technologii został opisany przez Browning i in., (1996) (JBC 271,
8618-8626) gdzie Ugand LTβ wydzielono w podobny sposób. Sekwencję liderową VCAM
połączono z krótkim znacznikiem peptydowym myc, po którym następowała domena ze
wnątrzkomórkowa LT-β. Sekwencję VCAM zastosowano do wymuszenia wydzielania normalnie związanej z błoną cząsteczki LT-β. Wydzielane białko zachowuje znacznik myc na
końcu N, który nie zakłóca zdolności do wiązania receptora. Takie białko wydzielnicze można
wyrażać w przejściowo transfekowanych komórkach Cos albo w podobnym układzie, np.
wektorach pochodzących z EBNA, komórkach owadów/bakulowirusach, pichia itp. Nie
oczyszczony nadsącz można zastosować jako źródło znakowanego liganda.
Komórki wyrażające receptor można identyfikować przez eksponowanie ich na znakowany ligand. Komórki ze związanym Iigandem identyfikuje się w analizie FACS przez znakowanie znacznika myc przeciwciałem przeciwko myc (9E10), a następnie znakowanym fi
koerytryną (albo podobnym znacznikiem) przeciwciałem przeciwko mysim immunoglobuli
nom. Komórki pozytywne w analizie FACS można łatwo identyfikować i mogą służyć jako
źródło RNA kodującego receptor. Następnie można wytworzyć bibliotekę ekspresyjną z RNA
metodą standardową i podzielić na pule. Pule klonów transfekuje się do odpowiedniej komórki gospodarza i określa się wiązanie znakowanego liganda z komórkami transfekowanymi
zawierającymi receptor przy użyciu mikroskopu, po znakowaniu związanego znacznika myc
przeciwmysim przeciwciałem znakowanym enzymem, tj. przeciwciałem znakowanym galak
tozydazą, fosfatazą alkaliczną albo lucyferazą. Gdy zidentyfikuje się pulę pozytywną, można
zmniejszać jej wielkość dopóki identyfikuje się cDNA kodujące receptor. Procedurę tę można
przeprowadzić z mysim albo ludzkim TRELL, ponieważ jeden z nich może łatwiej doprowadzić do receptora.
2. Komórki i Reagenty
Wszystkie komórki pochodziły z American Type Culture Collection (ATCC, Rockville,
Maryland, USA) z wyjątkiem klonu 13 WEHI 164, który otrzymano od dr Kawashima (Geneva Biomedical Research Institute, Genewa, Szwajcaria). Klon HT29 (HT29-14) opisano
uprzednio (Browning i in., 1996), zaś wrażliwy na TNF klon ME 180 otrzymano od dr Carl
Ware. Linia komórkowa hybrydoma 11-23 została opisana (Browning i in., 1991). Myszom
Balb/c wstrzyknięto dootrzewnowo 3 dni przed zabiciem po 1,5 ml brzeczki tioglikolanowej
(Difco Lab., MI). Komórki pobrano z jamy otrzewnej i hodowano przy gęstości 106 komórek/ml przez godzinę w DMEM (Gibco Lab.). Nie przylegające komórki wypłukano z płytek,
zaś komórki przylegające, w większości makrofagi poddano lizie w Tri-Reagent (Molecular
Research Center Inc.) i poddano ekstrakcji RNA.
Rekombinowane ludzkie TNF, LTα, Ltα1β2, przeciwciała przeciwko tym białkom
i białka fuzyjne receptora-Ig opisano uprzednio (Browning i in., 1995). Opisano przeciwciało
5C8 przeciwko CD40L. Poliklonalną surowicę przeciwko hTRELL wytworzono przez
wstrzyknięcie do węzła chłonnego czystego rekombinowanego hTRELL w CFA, jak to opisano uprzednio (Browning i Ribolini, 1989). Po 2 miesiącach obserwowano reakcję przeciwko
hTRELL i oczyszczono przeciwciała stosując Białko A-Sepharose.
Klonowanie mysiego TRELL
Antysensowny starter oligonukleotydowy z sekwencji mysiej erytropoetyny:
5'GTTCCAGGCCAGCCTGGG3' zastosowano w protokole 5'RACE według instrukcji producenta (5HACE System z firmy BRL) w połączeniu ze starterem kotwiczącym zaprojektowanym przez BRL. Pierwszą nić cDNA wytworzono z RNA z przylegających przez godzinę
makrofagów otrzewnowych. Amplifikację przeprowadzono w urządzeniu Perkin Elmer DNA
24
188 102
Thermal Cycler z polimerazą DNA Taq z Perkin Elmer. Po denaturacji przez 5 minut w 94°C
zastosowano następujące warunki: 35 cykli po 30 sekund w 94°C, 30 sekund w 55°C i 3 minuty w 72°C. Przeprowadzono dodatkowe wydłużanie w 72°C i zatrzymano reakcję w 4°C.
Analiza doświadczenia PCR na żelu agarozowym wykazała 2 amplifikowane fragmenty po
650 bp i 500 bp. 2 fragmenty wycięto z żelu, wprowadzono do wektorów pBS-T i sekwencjo
nowano. Obie wstawki były inne. Obie posiadały na końcach te same startery swoiste dla ery
tropoetyny zastosowane do zapoczątkowania reakcji PCR. Hybrydyzacja metodą northem
z fragmentami losowo znakowanymi 32P wykazała, że hybrydyzowały z różnymi RNA, fragment 500 bp hybrydyzował z RNA wielkości 1,4 kb w makrofagach. Znakowane 32P sondy
rybonukleinowe zastosowane w obu kierunkach zastosowano w hybrydyzacji northem w celu
określenia kierunku cDNA.
Z oznaczonych kierunków i sekwencji, uzyskano dwa startery wewnętrzne dla mRNA
wielkości 1,4 kb:
5'TCAGGTGCACTTTGATGAGG3' i 5'CTGTCAGCTCCTCCTGAG3', które zastosowano odpowiednio w 3'RACE i 5'RACE. Doświadczenie 3'RACE wykazało fragment wielkości 750 bp, który wprowadzono do wektora pBS-T i sekwencjonowano. Odpowiadał on
końcowi 3' RNA 1,4 kb, ponieważ sekwencja zawierała dodatek sygnału poliA bezpośrednio
przed ciągiem poliA. 5'RACE nie wykazała żadnego prążka. W celu wytworzenia biblioteki
cDNA z przylegających przez godzinę makrofagów zastosowano zestaw do amplifikacji
cDNA Clontech Marathon. Zastosowano fragment PCR wielkości 1040 bp, wyizolowany
przez PCR z sensownym i antysensownym starterem oligonukleotydowym (5'AGCAGGAGCCTTCTCAGGAG3' i 5'GATCCAGGGAGGAGCTTGTCC3') oraz starterem uniwersalnym
z zestawu. Umożliwiło to izolację fragmentu większej wielkości niż oryginalny fragment
1040 bp. Nowy fragment, który zsekwencjonowano dodał 60 bp do sekwencji 5'.
Klonowanie ludzkiego TRELL
Przeszukiwanie bazy danych EST dało 1 klon ludzki silnie homologiczny z sekwencją
mysią. Klon 154742 (numer dostępu GenBank R55379) posiadał sekwencję 345 bp w 89%
homologiczną z mysim cDNA. Do przeszukiwania przez RT-PCR różnych tkanek i bibliotek
na
obecność
transkryptów
TRELL
zastosowano
dwa
startery
z EST
(5'CCCTGCGCTGCCTGGAGGAA3' i 5TGATGAGGGGAAGGCTGTCT3'). Produkty
o prawidłowej wielkości otrzymano z mRNA wątroby, śledziony, węzłów chłonnych, THP-1
i migdałków, ale nie z U937. Produkt wielkości 201 bp klonowano i zastosowano do przeszukiwania biblioteki cDNA ludzkiego migdałka w lambda gt10. 105 jednostek tworzących ły
sinki wysiano przy gęstości 105 pfu/płytkę. Na filtrach nitrocelulozowych 20x20 cm wykonano odbitki. Filtry hybrydyzowano przez noc w 65°C w 400 ml buforu do badania przesiewowego (50 mM Tris pH 7,5, 1M NaCl, 0,1% pirofosforan sodu, 0,2% PVP i 0,2% Ficoll) zawierającego 10% siarczan dekstranu, 100 μg/ml tRNA i 6x105 cpm/ml sondy. Płukano je
dwukrotnie buforem i dwukrotnie 2xSSC, 0,1% SDS w 65°C. Minipreparaty DNA Lambda
wytworzono z pozytywnych kolonii i klony o największych wstawkach wybrano do oczyszczania DNA na dużą skalę i sekwencjonowania. Wstawki klonowano do miejsca Notl pBluescriptSK+.
Stwierdzono, że jedna ludzka EST (R55379) koduje część sekwencji ludzkiego TRELL.
Analiza RNA
Fragment PpuMl/BstXI wielkości 0,45 kb albo fragment Narl/NotI wielkości 1,25
cDNA hTRELL znakowano losowymi starterami i zastosowano do sondowania membran
northem myszy i człowieka zakupionych w Clontech. Tkanki i komórki mysie ekstrahowano
w celu uzyskania RNA stosując TRI-Reagent. Analizę northem przeprowadzono zasadniczo
jak to już opisano (Chicheportiche i Vassalli, 1994) z 4 μg całkowitego RNA i znakowanego
P losowymi starterami cDNA mTRELL.
Przyporządkowanie chromosomalne
Panel cDNA z mikrochromosomalnych hybryd komórkowych (HGMP Resource Centre,
Hinxton, Cambridge, UK) zastosowano do amplifikacji przez PCR fragmentu 340 bp starterami wybranymi w nie ulegającym translacji regionie 3', który nie jest homologiczny z sekwencją mysią (5'AGTCGTCCCAGGCTGCCGGCT3' i 5'CCTGAAGTGGGGTCT-
188 102
25
-TCTGGA3'). Przeprowadzono amplifikację przez 40 cykli po 30 sekund w 94°C, 90 sekund
w 65°C i 90 sekund w 72°C. Wykrywanie przeprowadzono na żelu agarozowym barwionym
bromkiem etydyny.
Ekspresja rekombinowanego białka TRELL
Rozpuszczalny konstrukt ekspresyjny obejmował sekwencję liderową VCAM, znacznik
peptydowy myc oraz domena zewnątrzkomórkowa hTRELL podobna do opisanej dla limfo
toksyny-b (ref) w sposób podobny do opisanego dla Ltb (Browning i in., 1996). Wyizolowano
następujące fragmenty DNA: fragment NotI/tępy kodujący sekwencję liderową VCAM i parę
oligonukleotydów kodujących znacznik myc (tępy 5', PpuM1 3'), które opisano, fragment 0,45
PpuM1/BstXI TRELL oraz 0,65 BstXI/NotI TRELL. Cztery fragmenty poddano ligacji do
wektora pBluescript NotI/fosforylowany. Wstawkę NotI z tego wektora przeniesiono do wektora pFastBac1 (GibcoBRL) i zastosowano do wytwarzania rekombinowanych baculowiru
sów. Rozpuszczalny TRELL wytworzono przez zakażenie komórek owadzich HiFiveTM
w MOI równej 10 i zebrano pożywkę po 2 dniach. Do pożywki dodano następujące składniki:
bufor HEPES w stężeniu końcowym 25 mM, pH 7,4, 1 mM AEBSF (Pierce) i 1 mg/ml pep
statyny. Pożywkę filtrowano i zatężano 10-krotnie przez ultrafiltrowanie nad filtrem Amicon
o ciężarze odcięcia równym 10 kDa. Zatężoną pożywkę zawierającą TRELL wprowadzono do
kolumny SP Sepharose Fast Flow i płukano 25 mM HEPES pH 7,0, zawierającym 0,4 M
NaCl. TRELL eluowano tym samym buforem z 0,6 M NaCl. Oczyszczony TRELL poddano
analizie wielkości poprzez chromatografię wykluczania w żelu.
Analiza wydzielania
Skonstruowano wektory ekspresyjne opartej na EBNA z użyciem wektor CH269, który
jest zmodyfikowaną wersją pEBVHis ABC (InVitrogen), w którym usunięto gen EBNA
i znacznik histydynowy. Fragment 0,71 hTNF w wektorze pFasrBac dostarczył dr Pescamento
i dr Goldfeld. Wstawkę SnaBI/XhoI poddano ligacji w miejsce PvuII/XhoI CH269. Genomo
wa wstawka hTNF zawierająca delecję miejsca przecięcia 1-12 była ofiarowana przez dr Kol
lias i wprowadzona do wektora CH269 przez dr Goldfeld.
Wstawka Notl wielkości 1,8 kb klonu A2A TRELL, fragment cDNA Notl wielkości
0,98 kb zawierający hCD40L dostarczony przez dr Garber oraz wstawka NotI wielkości
1,46 kb zawierająca hLTa (Browning i in., 1995) poddano ligacji w miejsce Notl CH269.
Wstawkę HindIII 0,81 kb zawierającą region kodujący hLTb ze zmodyfikowanym miejscem
startu (Browning i in., 1995) poddano ligacji w miejscu HindIII CH269. Komórki EBNA-293
transfekowano różnymi wektorami CH269 wraz z wektorem GFP stosując lipofectaminę
i pobierano w PBS z dodatkiem 5 mM EDTA do analizy FACS albo po 2 dniach komórki
poddawano znakowaniu metabolicznemu. Obie procedury wykorzystywały następujące przeciwciała, frakcję króliczych poliklonalnych Ig przeciwko hTRELL, mAb przeciwko hTNF
104c, mAb przeciwko hLTa AG9, mAb przeciwko Lta1/b2 B9 i mAb przeciwko CD40L 5C8.
Analizę FACS przeprowadzono w pożywce RPMI zawierającej 10% FCS i 50 μg/ml agregowanych ciepłem ludzkich IgG w ilości 5 μg/ml. W celu wykrywania wiązania przeciwciał
zastosowano przeciw-mysie albo przeciw-królicze IgG znakowane fikoerytiyną (Jackson Im
munoResearch). Do bramkowania zastosowano żywe komórki transfekowane pustym GFP.
Do immunopreecypitacji komórki w 2 dni po transfekcji płukano PBS i przenoszono do MEM
bez met/cys zawierającej 200 μCi/ml TranSlabel (ICN). Po 3 godzinach nadsącz pobierano
i poddawano immunoprecypitacji jak to opisano (Browning i in., 1995).
Testy cytotoksyczności
Testy wzrostu komórek przeprowadzono jak to opisano uprzednio (Browning i Ribolini,
1989). Do mikroskopii komórki HT29-14 wysiano do płytek 12-studzienkowych przy gęstości
200000 komórek/studzienkę i hodowano przez 2 dni. Ludzki TRELL, TNF, limfotoksynęalb2 (Browning i in., 1996) albo anti-fas (CH11, Kamaya) dodano wraz z 80 jednostkami/ml
ludzkiego interferonu-g. Po 26 godzinach, pożywkę usunięto. Pozostałe komórki utrwalono
80% etanolem i płukano PBS zawierającym 1 mg/ml barwnika Hoechst. Po 2 minutach barwnik usunięto, komórki płukano w PBS i badano w mikroskopie fluorescencyjnym.
26
188 102
1. Smith et al. 1990; Kohno et al 1990; Loetscher et al 1990; Schall et al 1990.
2. See Jones et al., 1989; Eck et al., 1992.
3. K. Tracey, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in
Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 255 (1992)); A. Waage, in Tumor Necrosis
Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven Press,
NY, p 275 (1992).
4. G. D. Roodman, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role
in Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 117 (1992).
5. A. Nakane, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in
Medicine. B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 285 (1992); I. A. Clark et al., in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven
Press, NY, p 303 (1992); G. E. Grau et al., in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and
Their Emerging Role in Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 329 (1992); P-F.
Piguet, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine.
B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 341 (1992); G. H. Wong et al., in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven Press,
NY, p 371 (1992).
6. S. Malik, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in
Medicine, B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 407 (1992).
7. D. A. Fox. Am. J. Med.. 99, 82 (1995).
8. D. Goeddel et al., Cold Spring Harbor Symposium Quant. Biol.. 51, 597 (1986);
G. Trinchieri, in Tumor Necrosis Factors. The Molecules and Their Emerging Role in Medi
cine, B. Beutler (Ed.), Raven Press, NY, p 515 (1992).
9. L. A. Tartaglia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 9292 (1991); L.A. Tartaglia and
D. V. Goeddel, Immunol. Today. 13,151 (1992).
10. B. Luettig et al., J. Immunol.. 143,4034 (1989); M. Kriegler et al., Cell. 53,45
(1988).
11. C. F. Ware et al., in Pathways for Cytolysis. G. M. Griffiths and J. Tschopp (Eds.),
Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, p 175-218 (1995).
12. N. Paul et al., Ann. Rev. Immunol.. 6 , 407 (1988).
13. P.D. Crowe et al., Science. 264, 707 (1994). (J. Browning et al., Cell 72, 847 (1993);
J. Browning et al., J. Immunol.. 154,33 (1995).
14. P. De Togni et al., Science. 264,703 (1993); T.A. Banks et al., J. Immunol., 155,
1685 (1995).
15. J. Browning and A. Ribolini, J. Immunol.. 143.1859 (1989): J. Browning et al.,
I E x p .Med. 183, 867 (1996).
16. T. Suda et al., J. Immunol., 154, 3806 (1995) (T. Suda et al., J. Immunol.. 154, 3806
(1995).
17. B.C. Trauth et al., Science. 245, 301 (1989); S. Yonehara et al., J. Exp. Med.. 169,
1747 (1989); S. Nagata and P. Goldstein, Science. 267,1449 (1995); M. H. Falk et al., Blood..
79,3300(1992).
18. F. Rieux-Laucat et al., Science. 268, 1347 (1995); T. Takahashi et al., Cell, 76, 969
(1994); R. Watanabe-Fukunaga et al., Nature, 356, 314 (1992).
19. P. R. Galle and al., J. Exp. Med.. 182,1223 (1995).
20. F. Silvestris and al., Clin. Immunol. Immunopathol., 75, 197 (1995).
21. P.D. Katsikis et al., J. Exp. Med., 181. 2029 (1995); A. D. Badley et al., J. Virol..
70. 199 (1996).
22. S. Wiley et al., Immunity, 3,673 (1995).
23. J. F. Gauchat et al., FEBS Lett., 315, 259 (1993); S. Funakoshi et al., Blood. 83,
2787 (1994).
24. R. C. Allen et al., Science. 259, 990 (1993).
25. L. Biancone et al., Kidney-Int., 48. 458 (1995); C. Mohan et al., J. Immunol.. 154,
1470(1995).
26. J. Ruby and al., Nature Medicine, 1, 437 (1995).
188 102
27
27. Z. Wang et al., J. Immunol.. 155, 3722 (1995); A. M. Cleary and al., J. Immunol..
155,3329(1995).
28. S. Hess and H. Engelman, J. Exp. Med.. 183. 159 (1996).
29. R. G. Goodwin et al, Cell. 73,447 (1993); Goodwin et al, Eur. J. Immunol.. 23, 2631
(1993); C. A. Smith et al., Cell 73, 1349 (1993).
30. See, for example, Molecular Cloning A Laboratory Manual. 2nd Ed., ed. by Sam
brook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning.
Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984);
Mullis et al. U.S. Patent No: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J.
Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984);
Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And
Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the
treatise, Methods In Enzvmology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For
Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory);
Methods In Enzvmology. Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In
Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987);
Handbook Of Experimental Immunology. Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell,
eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, N. Y., 1986).
31. See for example, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1981) Recombinant DNA. Proc 3rd Cleveland Svmpos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984)
Science 198:1056; Ike e t al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477.
32. See, for example, Scott et al. (1990) Science 249:386-390; Roberts et al. (1992)
PNAS 89:2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al. (1990) PNAS
87: 6378-6382; as well as U.S. Patents Nos. 5,223,409, 5,198,346, and 5,096,815.
33. M.T. Abreu-Martin, A. Vidrich, D.H. Lynch and S.R. Targan. Divergent induction
of apoptosis and IL-8 secretion in HT-29 cells in response to TNF-" and ligation of Fas ligand.
J. Immunol. 155:4147-4154,1995.
34. K. Agematsu, T. Kobata, F.-C. Yang, T. Nakazawa, K. Fukushima, M. Kitahara, T.
Mori, K. Sugita, C. Morimoto and A. Komiyama. CD27/CD70 interaction directly drives B
cell IgG and IgM synthesis. Eur. J. Immunol. 25: 2825-2829, 1995.
35. R. Amakawa, A. Hakem, T.M. Kundig, T. Matsuyama, J.J.L. Simard, E. Timms, A.
Wakeham, H.-W. Mittruecker, H. Griesser, H. Takimoto, R. Schmits, A. Shahinian, P.S. Ohashi, J.M. Penninger and T. W. Mak. Impaired negative selection of T cells in Hodgkin=s disease antigen CD30-deficient mice. Cell 84:551-562,1996.
36. J.-L. Bodmer, K. Burens, P. Schneider, K. Hofmann, V. Steiner, M. Thome, T. Bornand, M. Hahne, M. Schroeter, K. Becker, A. Wilson, L.E. French, J.L. Browning, H.R.
MacDonald, and J. Tschopp. TRAMP, a novel apoptosis-mediating receptor with sequence
homology to tumor necrosis factor receptor 1 and fas (apo-l/CD95). Immunity 6: 79-88,1997.
37. J. Brojatsch, J. Naughton, M.M. Rolls, K. Zingler and J.A.T. Young. Carl, a TNFRrelated protein is a cellular receptor for cytopathic avian lleukosis-sarcoma viruses and mediates apoptosis. Cell 87: 845-855,1996.
38. J.L. Browning, M.J. Androlewicz and C.F. Ware. Lymphotoxin and an associated
33- kDa glycoprotein are expresed on the surface of an activated human T cell hybridoma.
J. Immunol. 147: 1230-7, 1991.
39. J.L. Browning, K. Miatkowski, D.A. Griffiths, P.R.Bourdon, C. Hession, C.M.
Ambrose and W. Meier. Preparation and characterization of soluble recombinant heterotrimeric complexes of human lymphotoxins alpha and beta. J. Biol. Chem. 271: 8618-26,
1996.
40. J.E. Castro, J.A. Listman, B.A. Jacobson, Y. Wang, P.A. Lopez, S. Ju, P. W. Finn
and D.L. Perkins. Fas Modulation of apoptosis during negative selection of thymocytes.
Immunity 5: 617-627, 1996.
28
188 102
41. C.-Y.A. Chen and A.-B. Shyu. AU-rich elements: characterization and importance
in mRNA degradation. Trends in Biol. Sci. 20:465-470, 1995.
42. Y. Chicheportiche, C. Ody and P. Vassalli. Identification in mouse macrophages of
a new 4 kb mRNA present in hematopoietic tissue which shares a short nucleotide sequence
with erythropoietin mRNA. Biochim. Biophvs. Res. Comm. 209: 1076 - 1081, 1995.
43. A.M. Chinnaiyan, K. O=Rourke, G.-L. Yu, R.H. Lyons, M. Garg, D.R. Duan,
L.Xing, R. Gentz, J. Ni and V.M. Dixit. Signal transduction by DR3 a death-domaincontaining receptor related to TNFR-1 and CD95. Science 274: 990-992, 1996.
44. P. DeTogni et al. Abnormal development of peripheral lymphoid organs in mice deficient in lymphotoxin. Science 264: 703-7, 1994.
45. M.A. DeBenedette, N.R. Chu, K.E. Pollok, J. Hurtako, W.F. Wade, B.S. Kwon and
T.H.Watts. Role of 4-1BB ligand in costimulation of T lymphocyte growth and its upregulation on M l2 B lymphomas by cAMP. J. Exp. Med. 181: 985-992,1995.
46. M. Degli-Esposti, T. Davis-Smith, W.S. Din, PJ. Smolak, R.G. Goodwin and C.A.
Smith. Activation of the lymphotoxin-p receptor by cross-linking induces chemokine production and growth arrest in A375 melanoma cells. J. Immunol. 158:1756-1762, 1997.
47. T.M. Foy, A. Aruffo, J. Bajorath, J.E. Buhlmann and R.J. Noelle. Immune regulationby CD40 and its ligand gp39. Ann. Rev. Immunol. 14: 591-617, 1996.
48. H. J. Gruss, N. Boiani, D.E. Williams, R. J. Armitage, C. A. Smith and R.G. Goodwin. Pleiotropic effects of the CD30 ligand on CD30-expressing cells and lymphoma cell
lines. Blood 83:2045-56,1994.
49. H.J. Gruss and S.K. Dower. Tumor necrosis factor ligand superfamily: involvement
in the patnology of malignant lymphomas. Blood 85: 3378-404,1995.
50. J. Kitson, T. Raven, Y.-P. Jiang, D.V. Goeddel, K.M. Giles, K.-T. Pun, C.J. Grinham, R.Brown and S.N. Farrow. A death domain-containing receptor that mediates apoptosis.
Nature 384: 372-375, 1996.
51. S.Y. Lee, C.G. Park and Y. Choi. T cell receptor-dependent cell death of T cell hy
bridomas mediated by the CD30 cytoplasmic domain in association with tumor necrosis factor
receptor-associated factors. J. Exp. Med. 183:669-674,1996.
52. R.I. Montgomery, M.S. Warner, B.J. Lum and P.G. Spear. Herpes simplex virus-1
entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. Cell 87: 427436,1996.
53. S.Nagata. Apoptosis by death factor. Cell 88:355-365,1997.
54. R.M. Pitti, S.A. Marsters, S. Ruppert, C.J. Donahue, A. Moore and A. Ashkenazi.
Induction of apoptosis by Apo-2 ligand, a new member of the tumor necrosis factor cytokine
family. J. Biol.Chem. 1996.
55. C.A. Smith, T. Farrah and R.G. Goodwin. The TNF receptor superfamily of cellular
and viral proteins: activation, costimulation, and death. Cell 76: 959-62,1994.
56. G.L. Smith. Virus strategies for evasion of the host response to infection. Trends in
Microbiol. 3: 81-88, 1994.
57. E.Strueber and W. Strober. The T cell-B cell interaction via OX40-OX40L is necessary for the T cell independent humoral immune response. J. Exp. Med. 183: 979-989, 1996.
58. H.-K. Sytwu, R.S. Liblau and H.O. McDevitt. The roles of Fas/Apo-1 (CD95) and
TNF in antigen-induced programmed cell death in T cell receptor trangenic mice. Immunity 5:
17-30, 1996.
59. P. Vassalli. The pathophysiology of tumor necrosis factors. Ann. Rev. Immunol. 10:
411-452,1992.
60. L. Zheng, G. Fisher, R.E. Miller, J. Peschon, D.H. Lynch and M.J. Lenardo. Induction of apoptosis in mature T cells by tumour necrosis factor. Nature 377: 348-351,1995.
188 102
LISTA SEKWENCJI
(1) INFORMACJE OGÓLNE:
(i) ZGŁASZAJĄCY:
Chicherportiche, Yves
Browning, Jeffrey L.
(iv) Adres do korespondencji
(A) NAZWA: Biogen Inc.
(B) ULICA: 14 Cambridge Center
(C) MIASTO: Cambridge
(E) KRAJ: MA
(F) KOD POCZTOWY (ZIP): 02142
(ii) t y t u ł w y n a l a z k u : Ligand pokrewny z czynnikiem martwicy
nowotworu
(iii) LICZBA SEKWENCJI: 4
(iv) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:
(A) RODZAJ NOŚNIKA: Floppy disk
(B) KOMPUTER: IBM PC compatible
(C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS
(D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPO)
(vi) DANE DOT. OBECNEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA:
(B) DATA ZGŁOSZENIA: 07-LUT-1999
(2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 1:
(i)
(A)
(B)
(C)
(D)
CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
DŁUGOŚĆ: 1168 par zasad
RODZAJ: kwas nukleinowy
NICIOWOŚĆ: podwójna
TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA
(iii) HYPOTETYCZNA: Nie
29
188 102
30
(ix ) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:
(A) ORGANIZM: Białko pokrewne z rodziną TNF
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ:CDS
(B) POŁOŻENIE: 2..676
(xi) OPIS SEKWENCJI:
ID. SEKW. NR 1:
G GTG CTG AGC CTG GGC CTG GCGCTG GCC TGC CTT GGC CTC CTG
Val Leu Ser Leu Gly Leu Ala
Leu
AlaCys Leu
Gly
1
5
10
CTG
Leu
15
LeuLeu
46
GTC GTG
Val Val
GTCAGC CTG GGG AGC TGG GCA ACG CTG TCT GCC CAG GAG CCT
ValSer Leu Gly Ser Trp Ala Thr Leu Ser Ala Gln Glu Pro
20
25
30
94
TCT CAG
Ser Gln
GAGGAG CTG ACA GCA GAG GAC CGC CGG GAG CCC CCT GAA CTG
GluGlu Leu Thr Ala Glu Asp Arg Arg Glu Pro Pro Glu Leu
35
40
45
142
AAT CCC
Asn Pro
CAGACA GAG GAA AGC CAG GAT GTG GTA CCT TTC TTG GAA CAA
GlnThr Glu Glu Ser Gln Asp Val Val Pro Phe Leu Glu Gln
50
55
60
190
CTA GTC
Leu Val
65
CGGCCT CGA AGA AGT GCT CCT AAA GGC CGG AAG GCG CGG CCT
Arg Pro Arg Arg Ser Ala Pro Lys Gly Arg Lys Ala Arg Pro
70
75
238
CGC CGA
Arg Arg
80
GCTATT GCA GCC CAT TAT GAG GTT CAT CCT CGG CCA GGA CAG
Ala Ile Ala Ala His Tyr Glu Val His Pro Arg Pro Gly Gln
85
90
95
286
GAT GGA
Asp Gly
GCACAA GCA GGT GTG GAT GGG ACA GTG AGT GGC TGG GAA GAG
AlaGln Ala Gly Val Asp Gly Thr Val Ser Gly Trp Glu Glu
100
105
110
334
ACC AAA
Thr LyB
ATCAAC AGC TCC AGC CCT CTG CGC TAC GAC CGC CAG ATT GGG
IleAsn Ser Ser Ser Pro Leu Arg Tyr Asp Arg Gln Ile Gly
115
120
125
382
GAA TTT
Glu Phe
ACAGTC ATC AGG GCT GGG CTC TAC TAC CTG TAC TGT CAG GTG
Thr Val Ile Arg Ala Gly Leu Tyr Tyr Leu Tyr Cys Gln Val
130
135
140
430
31
188 102
CAC TTT
His Phe
145
GAT GAG GGA AAG GCT GTC TAC CTG AAG CTG GAC TTG CTG
Asp Glu Gly Lys Ala Val Tyr Leu Lys Leu Asp Leu Leu
150
155
GTG
Val
478
AAC GGT
Asn Gly
160
GTG CTG GCC CTG CGC TGC CTG GAA GAA TTC TCA GCC ACA GCA
Val Leu Ala Leu Arg Cys Leu Glu Glu Phe Ser Ala Thr Ala
165
170
175
526
GCA AGC
Ala Ser
TCT CCT GGG CCC
Ser Pro Gly Pro
180
574
TTG CCG
Leu Pro
CTG CGG CCA GGG TCT TCC CTT CGG ATC CGC ACC CTC CCC
Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu Arg Ile Arg Thr Leu Pro
195
200
205
GCT CAT
Ala His
CAG CTC CGT TTG TGC CAG GTG TCT GGG CTG
Gln Leu Arg Leu Cys Gln Val Ser Gly Leu
185
190
CTT AAG GCT GCC
Leu Lys Ala Ala
210
TGG
Trp
622
CCC TTC CTA ACC TAC TTT GGA CTC TTT CAA
Pro Phe Leu Thr Tyr Phe Gly Leu Phe Gln
215
220
670
GTT CAC TGAGGGGCCT TGCTCTCCCA GATTCCTTAA ACTTTCCCTG GCTCCAGGAG
Val His
225
726
CATCACCACA CCTCCCTACC
CCACCCCCACTCCTCCACCC CCTCGCTGCT CCTTGGTCCA
786
GTCCTGTCTC TCCTCAAAGG
CAGCCAGAGCTTGTTCACAT GTTTCCATTC CACAGACGTA
846
TCCTTGCTCT TCTTAACATC
CCATCCCACCACAACTATCC ACCTCACTAG CTCCCAAAGC
906
CCCTACTTAT CCCTGACTCC
CCCACCCACTCACCCGACCA CGTGTTTATT GACTTTGTGC
966
ACCAGGCACT GAGATGGGCT
GGACCTGGTGGCAGGAAGCC AGAGAACCTG GGACTAGGCC
1026
AGAAGTTCCC AACTGTGAGG
GGGAAGAGCTGGGGACAAGC TCCTCCCTGG ATCCCTGTGG
1086
ATTTTGAAAA GATACTATTT
TTATTATTATTGTGACAAAA TGTTAAATGG ATATTAAAGA
1146
3AATAAATCA TGATTTCTCT TC
(2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 2:
(i)
(A)
(B)
(D)
CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
DŁUGOŚĆ: 225 aminokwasów
RODZAJ: aminokwas
TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko
(xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR 2:
1168
188 102
32
Val Leu Ser Leu
1
5
Gly Leu
Ala LeuAla Cys
10
Leu GlyLeuLeu LeuVal
15
Val Val Ser Leu
20
Gly Ser
Trp AlaThr Leu
25
Ser AlaGlnGlu ProSer
30
Gln Glu GluLeu Thr Ala Glu Asp Arg Arg Glu Pro Pro Glu Leu Asn
35
40
45
Pro Gln
50
Thr Glu
Glu
Val Arg
65
Pro Arg
ArgSer Ala
70
ProLysGlyArg Lys Ala Arg Pro
75
Arg Ala
Ile Ala
AlaHis Tyr
GluValHisPro Arg Pro Gly Gln Asp
90
95
85
Ser
55
Gly Ala Gln AlaGly Val Asp Gly
100
Arg
80
Thr Val Ser Gly Trp Glu- Glu Thr
105
110
Lys Ile Asn Ser
115
Ser
Phe Thr
130
Val Ile
Arg
Phe Asp
145
Glu Gly
LysAla Val
150
TyrLeuLysLeu Asp Leu Leu Val
155
Gly Val
Leu Ala
LeuArg Cys
LeuGluGluPhe Ser Ala Thr Ala Ala
170
175
Pro Gln
Leu ArgLeu Cys
185
Ser Ser Pro Gly
180
165
Ser
120
Gln AspValValProPheLeuGluGln Leu
60
Ala
135
Pro
Leu Arg
Lys Ala
Ala
Pro
215
Tyr AspArgGlnIleGly Glu
Gly LeuTyrTyrLeuTyrCyeGlnVal His
140
Pro Leu ArgPro Gly Ser Ser Leu Arg Ile Arg
195
200
His Leu
210
125
Asn
160
Gln ValSerGly LeuLeu
190
Thr Leu Pro Trp Ala
205
Phe LeuThrTyrPheGlyLeuPheGln Val
220
His
225
(2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1373 pary zasad
(B) RODZAJ: kwas nukleinowy
33
188 102
(C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA
(iii) HYPOTETYCZNA: Nie
(iii) ANTYSENS: Nie
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ:CDS
(B) POŁOŻENIE: 1..852
(vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:
(A) ORGANIZM: białko pokrewne z rodziną TNF
(xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR 3:
ATG TCA TTG TTA GAC TTT
Met Ser Leu Leu Asp Phe
1
5
GAA ATT TCC GCC CGC CGG CTC CCC-CTC CCC
Glu Ile Ser Ala Arg Arg Leu Pro Leu Pro
10
15
48
CGA TCC CTC GGG TCC CGG
Arg Ser Leu Gly Ser Arg
20
GAT GGG GGG GCG GTG AGG CAG GCA CAG CCC
Asp Gly Gly Ala Val Arg Gln Ala Gln Pro
25
30
96
CCC GCC CCC ATG GCC GCC
Pro Ala Pro Met Ala Ala
35
CGT CGG AGC CAG AGG CGG AGG GGG CGC CGG
Arg Arg Ser Gln Arg Arg Arg Gly Arg Arg
40
45
144
GGG GAG CCG GGC ACC GCC
Gly Glu Pro Gly Thr Ala
50
CTG CTG GTC CCG CTC GCG CTG GOC CTG GGC
Leu Leu Val Pro Leu Ala Leu Gly Leu Gly
55
60
192
CTG GCG CTG GCC TGC CTC
Leu Ala Leu Ala Cys Leu
65
70
GGC CTC CTG CTG GCC GTG GTC AGT TTG GGG
Gly Leu Leu Leu Ala Val Val Ser Leu Gly
75
80
240
AGC CGG GCA TCG CTG TCC
Ser Arg Ala Ser Leu Ser
85
GCC CAG GAG CCT GCC CAG GAG GAG CTG GTG
Ala Gln Glu Pro Ala Gln Glu Glu Leu Val
90
95
288
GCA GAG GAG GAC CAG GAC
Ala Glu Glu Asp Gln Asp
100
CCG TCG GAA CTG AAT CCC CAG ACA GAA GAA
Pro Ser Glu Leu Asn Pro Gln Thr Glu Glu
105
110
336
AGC CAG GAT CCT GCG CCT
Ser Gln Asp Pro Ala Pro
115
TTC CTG AAC CGA CTA GTT CGG CCT COC AGA
Phe Leu Asn Arg Leu Val Arg Pro Arg Arg
120
125
384
188 102
34
AST GCA CCT AAA GGC
Ser Ala Pro Lys Gly
130
CGG AAA ACA CGG GCTCGA AGA GCG ATC GCA GCC
Arg Lys Thr Arg AlaArg Arg Ala Ile Ala Ala
135
140
432
CAT TAT GAA GTT CAT CCA CGA CCT GGA CAGGAC GGA GCG CAG GCA GGT
His Tyr Glu Val His
Pro Arg Pro Gly GlnAsp Gly Ala Gln Ala Gly
145
150
155
160
480
GTG GAC GGG ACA GTG
Val Asp Gly Thr Val
165
AGT GGC TGG GAG GAAGCC AGA ATC AAC AGC TCC
Ser Gly Trp Glu GluAla Arg Ile Asn Ser Ser
170
175
528
AGC CCT CTG CGC TAC
Ser Pro Leu Arg Tyr
180
AAC CGC CAG ATC GGGGAG TTT ATA GTC ACC CGG
Asn Arg Gln Ile GlyGlu Phe Ile Val Thr Arg
185
190
576
GCT GGG CTC TAC TAC
Ala Gly Leu Tyr Tyr
195
CTG TAC TGT CAG GTGCAC TTT GAT GAG GGG AAG
Leu Tyr Cys Gln ValHis Phe Asp Glu Gly Lys
200
205
624
GCT GTC TAC CTG AAG
Ala Val Tyr Leu Lys
210
CTG GAC TTG CTG GTGGAT GGT GTG CTG GCC CTG
Leu Asp Leu Leu ValAsp Gly Val Leu Ala Leu
215
220
672
CGC TGC CTG GAG GAA
TTC TCA GCC ACT GCGGCC AGT TCC CTC GGG CCC
Arg Cys Leu Glu Glu
Phe Ser Ala Thr AlaAla Ser Ser Leu Gly Pro
225
230
235
240
720
CAG CTC CGC CTC TGC
Gln Leu Arg Leu Cys
245
CAG GTG TCT GGG CTGTTG GCC CTG CGG CCA GGG
Gln Val Ser Gly LeuLeu Ala Leu Arg Pro Gly
250
255
768
TCC TCC CTG CGG ATC
Ser Ser Leu Arg Ile
260
CGC ACC CTC CCC TGGGCC CAT CTC AAG GCT GCC
Arg Thr Leu Pro TrpAla His Leu Lys Ala Ala
265
270
816
CCC TTC
Pro Phe
CTC ACC
Leu Thr
275
TAC
Tyr
TTCGGACTC
PheGlyLeu
280
TTC
Phe
CAG
Gln
GTT
Val
CAC TGAGGGGCCC862
His
TGGTCTCCCC ACAGTCGTCC
CAGGCTGCCGGCTCCCCTCG ACAGCTCTCT GGGCACCCGG
922
TCCCCTCTGC CCCACCCTCA
GCCGCTCTTTGCTCCAGACC TGCCCCTCCC TCTAG AGGCT
982
GCCTGGGCCT GTTCACGTGT
TTTCCATCCCACATAAATAC AGTATTCCCA CTCTTATCTT
1042
ACAACTCCCC CACCGCCCAC
TCTCCACCTCACTAGCTCCC CAATCCCTGA CCCTTTGAGG
1102
CCCCCAGTGA TCTCGACTCC
CCCCTGGCCACAGACCCCCA GGGCATTGTG TTCACTGTAC
1162
TCTGTGGGCA AGGATGGGTC
CAGAAGACCCCACTTCAGGC ACTAAGAGGG GCTGGACCTG
1222
188 102
35
GCGGCAGGAA GCCAAAGAGA CTGGGCCTAG GCCAGGAGTT CCCAAATGTG AGGGGCGAGA
1282
AACAAGACAA GCTCCTCCCT TGAGAATTCC CTGTGGATTT TTAAAACAGA TATTATTTTT
1342
ATTATTATTG TGACAAAATG TTGATAAATG G
1373
(2)
INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 4:
(i ) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 284 aminokwasy
(B) RODZAJ: aminokwas
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko
(xi) OPIS
SEKWENCJI: ID. SEKW.
NR
4:
Met Ser Leu Leu Asp Phe Glu
1
5
Ile Ser Ala Arg Arg Leu Pro
10
Arg Ser Leu Gly Ser Arg Asp
20
Gly Gly Ala Val Arg Gln Ala Gln Pro
25
30
Pro Ala
Arg Ser Gln Arg
40
Gly Glu
50
Pro Met Ala Ala Arg
35
Leu Pro
15
Arg Arg Gly Arg Arg
45
Pro Gly Thr Ala Leu Leu Val Pro Leu Ala Leu Gly Leu Gly
55
60
Leu Ala Leu Ala Cys Leu Gly Leu Leu Leu
65
70
Ala Val Val Ser Leu
75
Gly
80
Ser Arg Ala Ser Leu Ser Ala Gln Glu Pro Ala Gln Glu Glu Leu Val
85
90
95
Ala Glu Glu Asp Gln Asp Pro
100
Ser Glu Leu Asn Pro Gln Thr Glu Glu
105
110
Ser Gln
Leu Asn Arg Leu
120
Ser Ala
130
Asp Pro Ala Pro Phe
115
Val Arg Pro Arg Arg
125
Pro Lys Gly Arg Lys Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ile Ala Ala
135
140
His Tyr Glu Val His Pro Arg Pro Gly Gln
145
150
Asp Gly Ala Gln Ala
155
Gly
160
Val Asp Gly Thr Val Ser Gly Trp Glu Glu Ala Arg Ile Asn Ser
Ser
165
170
175
188 102
36
Ser Pro
Leu Arg Tyr
Asn
Arg
GlnIle
Gly Glu
Ala Gly
Leu Tyr Tyr
Leu
Tyr
CysGln
Ala Val
Tyr Leu Lys
Leu
Asp
Leu
Leu
Arg Cys
Leu Glu Glu
Phe
Ser
Ala
Gln Leu
Arg Leu Cys
Gln
Val
Ser
Ser Ser
Leu Arg Ile
Arg
Thr
210
225
180
1 95
23 0
245
260
Pro PheLeu Thr Tyr
27 5
215
20 0
Phe Gly Leu
28 0
Phe
IleValThrArg
Val His
Phe
AspGluGlyLys
Val
Asp
Gly
Val
Leu
AlaLeu
Thr
Ala
Ala
Ser
Ser
Leu
GlyPro
Gly
Leu
Leu
Ala
Leu
Arg
ProGly
His
LeuLysAlaAla
185
250
20 5
235
LeuPro
26 5
19 0
220
Trp Ala
Phe Gln Val His
270
25 5
240
188 102
FIG. 1
37
188 102
FIG. 2A
38
39
FIG. 2B
188 102
40
188 102
FIG. 3
188 102
F IG . 4
41
42
188 102
FIG. 5
188 102
FIG. 6A
43
188 102
FIG. 6B
44
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.
Cena 6,00 zł.