1. metody fizyczne – zastosowanie promieniowania (uv, x, gamma)
advertisement
Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka Ćwiczenie 14 Część teoretyczna: KOLOKWIUM 3 I. OKREŚLANIE WPŁYWU ŚRODKÓW KONSERWUJĄCYCH NA DROBNOUSTROJE I DEZYNFEKCJA 1. METODY FIZYCZNE – ZASTOSOWANIE PROMIENIOWANIA (UV, X, GAMMA) W praktyce mikrobiologicznej wykorzystuje się najczęściej hamujące lub zabójcze działanie na mikroorganizmy nadfioletowej części widma słonecznego o długości fali 250-260 nm, a więc tą część widma, która jest najsilniej absorbowana przez kwasy nukleinowe. Źródłem promieniowania są lampy kwarcowe, wypełnione oparami rtęci, emitujące w 95% promieniowanie o długości fali 258 nm. Promieniowanie UV jest wykorzystywane do niszczenia mikroorganizmów występujących w powietrzu i na odkrytych powierzchniach zamkniętych pomieszczeń o niewielkim zapyleniu (silosów, magazynów, chłodni, ładowni statków, laboratoriów, kamer). Ponieważ charakteryzuje się słabą przenikliwością – nie przenika przez zwykłe szkło, stąd promieniowanie UV nie jest wykorzystywane do wyjaławiania szkła i podłoży agarowych w szklanych naczyniach. Efekt biobójczy promieniowania zależy między innymi od objętości napromienianego powietrza, wielkości powierzchni, odległości i ustawienia lamp UV. Czas emisji promieniowania nie powinien być krótszy niż 30 min, odległość lampy od sterylizowanej powierzchni nie może przekraczać 3 m, a lampy winny być ustawione prostopadle do powierzchni. Do sterylizacji sprzętu medycznego jednorazowego użytku, surowców i preparatów farmaceutycznych oraz utrwalania produktów spożywczych (świeżych i suszonych owoców i warzyw, mięsa drobiowego, ryb, przypraw i ziół, a zwłaszcza do niszczenia mikroorganizmów w zamkniętych pojemnikach, np. w konserwach) wykorzystuje się niekiedy promieniowanie jonizujące (X, gamma), które charakteryzuje się bardzo dużą przenikliwością, energią i aktywnością biologiczną. Ponieważ stosowanie dawek promieniowania pow. 10 kGy (radiopasteryzacja, radiosterylizacja) powoduje zmiany właściwości organoleptycznych, odżywczych i zdrowotnych produktów, stąd do ich sterylizacji stosuje się dawki promieniowania nie przekraczające tej wartości (raduryzacja, radycydacja). Raduryzacja to zmniejszenie ogólnej liczby mikroorganizmów i zahamowanie rozwoju form przeżywających ten zabieg; radycydacja – zmniejszenie liczebności populacji mikroorganizmów patogennych (np. Clostridium, Salmonella) i zahamowanie produkcji toksyn bakteryjnych (np. jadu kiełbasianego przez Clostridium botulinum). Stosowanie tych metod jest dozwolone tylko w niektórych krajach UE. 2. METODY MECHANICZNE 2.1. FILTROWANIE Zabieg ten stosujemy w przypadku, gdy mamy do czynienia z materiałami, które w podwyższonej temperaturze ulegają zmianom fizycznym i chemicznym. Są to zwykle pożywki zawierające witaminy, aminokwasy, surowicę, mocznik i termolabilne składniki dodawane do podłoży. Do wyjaławiania używa się najczęściej filtry membranowe o porach od 0,20-0,40 (0,75) µm średnicy. Ponieważ pory są mniejsze od wymiarów bakterii, odfiltrowane drobnoustroje osadzają się na filtrze, a uzyskany filtrat jest jałowy. Stosowane są: filtry z ziemi okrzemkowej filtry ze szkła spiekanego filtry azbestowe filtry membranowe 2.2. WIROWANIE 1 Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka Jest zabiegiem dzięki któremu następuje oddzielanie komórek mikroorganizmów od zawiesiny. Wykonujemy je w wirówkach z regulowanymi obrotami i czasem działania, a materiał wirowany umieszcza się w specjalnie przygotowanych pojemnikach. 3. METODY CHEMICZNE Do sterylizacji podłóg, ścian i powierzchni roboczych, linii technologicznych, czy też maszyn lub ich części stosuje się także (zgodnie z zaleceniami producenta) różne środki dezynfekcyjne. Różnią się one aktywnością biologiczną i mechanizmami działania. Aktywność biologiczna środków dezynfekcyjnych zależy od rodzaju związku chemicznego; gatunku mikroorganizmów, ich wieku i liczebności populacji; czynników środowiskowych - temperatura, kwasowość podłoża i obecność w nim innych związków chemicznych, zwłaszcza organicznych. 3.1. WAŻNIEJSZE GRUPY ZWIĄZKÓW Fenol i pochodne Czwartorzędowe związki amoniowe Związki chloru Związki jodu Alkohole Aldehydy Związki rtęci Związki srebra Barwniki Czwartorzędowe sole amoniowe Charakteryzuje je szerokie spektrum działania (bakterie G+ i G-, grzyby pleśniowe, drożdże, wirusy), długotrwały efekt sterylizacyjny i przyjemny zapach. Ujemną stroną tych preparatów jest silna presja selekcyjna i możliwość uodpornienia się bakterii G- (np. Proteus vulgaris i Serratia marcescens), co wymusza konieczność przemiennego ich stosowania z preparatami o odmiennych mechanizmach działania (związkami nadtlenowymi, podchlorynem). Ich aktywność ulega osłabieniu w obecności białka, tłuszczu, mleka i mydła. Najważniejsze to Sterinol (10% bromek benzylododecylo-dwumetyloamoniowy – używany jako środek dezynfekcyjno-myjący) i Laurosept (25% bromek dwumetylaurylobenzylo-amoniowy). Obecnie ogranicza się stosowanie tych preparatów ze względu na istnienie wielu szczepów opornych. Inne preparaty to np. Zephirol, Dezogen, Bradosol, Cetavlon, Asepsol. Względnie mały zakres działania i właściwości prowadzące do powstawania opornych szczepów pałeczek gramujemnych, ograniczają ich stosowanie w szpitalach. Związki nadtlenowe Należą tu m.in. kwas nadoctowy, nadtlenek wodoru, nadsiarczan potasowy. Najpowszechniej stosowany kwas nadoctowy jest aktywny w stosunku do form wegetatywnych i przetrwalnych bakterii. Ponieważ związek ten nie wykazuje właściwości korozyjnych i łatwo ulega rozkładowi na produkty nieszkodliwe (woda, tlen, kwas octowy) dla produktów spożywczych, może być stosowany do dezynfekcji systemów zamkniętych (np. w browarnictwie i winiarstwie) bez konieczności przepłukiwania ich wodą. Taka procedura zapobiega powtórnemu skażeniu systemu, gdy jakość mikrobiologiczna będącej do dyspozycji wody nie jest najlepsza. Ponadto związek ten może być użyty do sterylizacji przedmiotów termowrażliwych i dezynfekcji rąk. Związki nadtlenowe (kwas nadoctowy, nadboran sodu, nadsiarczan potasu) – są wrażliwe na obecność substancji organicznych. Kwas nadoctowy może działać sporobójczo. Alkohole (etanol, izopropanol). Charakteryzuje je szerokie działanie biobójcze (formy wegetatywne bakterii G+ i G-) uwarunkowane obecnością wody. Z tego też względu działają najsilniej jako 50-70% roztwór wodny. Aktywność alkoholi wzrasta wraz ze wzrostem liczby molowej i liczby C w łańcuchu, a maleje w obecności substancji organicznej. Są wykorzystywane do dezynfekcji systemów zamkniętych bez konieczności płukania wodą, powierzchni roboczych, sprzętu i rąk. Alkohole etylowy, propylowy, działają bakteriobójczo również na 2 Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka prątki gruźlicy oraz niektóre wirusy. Mają słabą zdolność ścinania białka i zdolność penetracji dlatego mogą być stosowane tylko do czystych powierzchni. Stosowane również do dezynfekcji rąk. Związki chloru Najczęściej stosowany jest podchloryn sodowy (NaOCl), którego aktywność zależy od równowagi w roztworze pomiędzy HClO/OCl-. Kwas podchlorawy jest 10-20 razy możniejszym czynnikiem dezynfekującym niż postać anionowa. Najsilniejsze działanie wykazują w środowisku kwaśnym.(pH 5.06.0). Wykorzystywany jest przy dezynfekcji ścian, powierzchni chłodni i komór przechowalniczych. W zetknięciu z komórkami drobnoustrojów wydziela zjonizowany tlen, który denaturuje białka, niszczy błonę plazmatyczną oraz inaktywuje enzymy z grupami –SH. Działa biobójczo w stosunku do bakterii, drożdży, grzybów i wirusów. Oprócz podchlorynu sodowego stosowana jest także chloramina T, najaktywniej działająca w środowisku o pH 6.0-6.2. Do dezynfekcji rąk stosuje się roztwory 0,5-1%, natomiast do ścian, sufitów, podłóg czy stołów 5%. Jodofory To kompleksowe połączenia jodu z polimerami, biopolimerami lub związkami powierzchniowo czynnymi spełniającymi rolę nośników. Ich aktywność bójcza polega na uwalnianiu jodu, który utlenia grupy SH oraz wytwarza kompleksy z białkami błony cytoplazmatycznej. Maksymalną aktywność wykazują w pH 2.0-4.0. Wykazują szerokie spektrum działania, niszczą bakterie, grzyby pleśniowe, drożdże i wirusy już przy stężeniach 12-25 ppm. Ze względu na wywoływanie korozji metali oraz przebarwianie tworzyw sztucznych zastosowanie jodoforów w przemyśle spożywczym i biotechnologicznym jest ograniczone do dezynfekcji powierzchni nie mających kontaktu z żywnością. Aldehydy Jako środki dezynfekujące wykorzystywane są aldehyd mrówkowy i glutarowy (aktywny w pH 7.5-8.5, bójczy wobec bakterii, wirusów, grzybów i prątków gruźlicy), jednak ze względu na toksyczność nie mogą być wykorzystywane do dezynfekcji powierzchni mających kontakt z żywnością. Dość powszechnie stosowanym preparatem jest formalina (wodny lub alkoholowy 3-20% roztwór formaldehydu). Działa na formy wegetatywne i przetrwalne bakterii, grzyby i wirusy. Sole metali ciężkich To przede wszystkim sole srebra. Tworzą one połączenia z grupami SH enzymów i białek strukturalnych komórki. W aseptyce znajdują zastosowanie azotany, cytryniany i mleczany srebra. Barwniki Są stosowane głównie jako łagodne antyseptyki, np. fiolet krystaliczny, zieleń malachitowa i brylantowa, barwniki akrydynowe. Jako związki zasadowe łatwo przenikają przez błony i reagują z kwasami nukleinowymi powodując zahamowanie syntezy DNA i śmierć komórki. UWAGA: Wykorzystanie takich środków dezynfekcyjnych, jak: aldehydy (mrówkowy, glutarowy, formalina), związki fenolowe i pochodne fenoli (fenol, lizol, kwas karbolowy), związki chloru (podchloryn sodowy, chloramina T), jodofory (połączenia jodu z polimerami lub SPC), związki azotu (pochodne biguanidyny kw. glutaminowego i pirydyny), metale ciężkie, jest bardzo często ograniczone jedynie do dezynfekcji powierzchni roboczych nie mających kontaktu z żywnością, a w niektórych krajach (zwłaszcza UE) wręcz zakazane. Wynika to z ich toksyczności (alergie, zakłócenia metabolizmu), wywoływania podrażnień skóry i błon śluzowych, słabej biodegradacji, długotrwałego przykrego zapachu, działania korozyjnego, wysokiej presji selekcyjnej i możliwości wykształcenia się form odpornych, uwarunkowania ich aktywności od czynników środowiskowych. Preparaty dezynfekcyjne stosowane w zakładach przemysłu spożywczego i w procesach biotechnologicznych muszą być pozytywnie zaopiniowane przez Państwowy Zakład Higieny, a preparaty aseptyczne mieć certyfikat MZiOS. 3 Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka 4. MECHANIZM DZIAŁANIA Mechanizm działania związany jest w pierwszym rzędzie ze strukturą chemiczną i właściwościami substancji biologicznie czynnej związku. W zależności od tych czynników, a także od stężenia efektem może być zahamowanie wzrostu i rozwoju mikroorganizmów (działanie statyczne) lub w następstwie oddziaływania na zasadnicze struktury lub szlaki metaboliczne ich zabicie (działanie biobójcze). Polegać ono może na: uszkadzaniu lub zmianie przepuszczalności ściany komórkowej i błony cytoplazmatycznej oraz wypływie do środowiska zewnętrznego składników komórki; utlenianiu struktur komórkowych i zakłóceniu procesów metabolicznych mikroorganizmów; tworzeniu kompleksów z białkami - blokowaniu grup funkcyjnych (-NH2, -SH, -COOH); dezaktywacji enzymów; spowodowaniu koagulacji cytoplazmy i denaturacji białek (cytoplazmatycznych, enzymatycznych, kwasów nukleinowych). Metody fizyczne Czynnik działanie wysoką temperaturą "suche gorąco" promieniowanie UV promieniowanie jonizujące (gamma) tlenek etylenu chemiczne alkohole aldehydy chlorowce mechaniczne fenole filtr z porach o Sposób działania denaturacja białek i kwasów nukleinowych, rozerwanie wiązań wodorowych denaturacja białek i kwasów nukleinowych tworzenie się dimerów tyminowych w DNA, działanie mutagenne jonizacja cząsteczek wody reaguje z grupami –NH2, -SH, -COOH i -OH białek, oraz z DNA i z RNA. denaturacja białek, rozpuszczanie lipidów alkilacja, reagują z grupami –NH2, -SH, -COOH w reakcji z wodą tworzą kwas podchlorawy, wydziela się zjonizowany tlen, który denaturuje białka, niszczy błonę cytoplazmatyczną i inaktywuje enzymy z grupami -SH denaturacja białek, rozrywanie błon komórkowych bakterie osadzają się na filtrze 5. OKREŚLANIE SIŁY DZIAŁANIA ŚRODKÓW DEZYNFEKCYJNYCH Siła działania preparatów zależy od wielu czynników, dlatego opracowano metody oceny ich działania. W myśl przepisów przeprowadzenie właściwej oceny badanego preparatu wymaga określenia jego: działania bakteriostatycznego, działania bakteriobójczego, stężenia użytkowego. Przy oznaczaniu przeciwbakteryjnego działania preparatów używane są szczepy: Staphylococcus aureus NCTC1 4163, Escherichia coli NCTC 8196, Proteus vulgaris NCTC 4635 i Pseudomonas aeruginosa NCTC 6749. Działanie przeciwgrzybicze ocenia się używając szczepów Trichophyton gypseum, Microsporum gypseum i Candida albicans. Do oceny antywirusowej nie ustalono dotąd szczepów wzorcowych, najczęściej stosuje się Poliomyelitis typ 1, 2 i 3, wirus VSV, Herpes hominis typ 1 i 2, adenowirusy typ 12 i 14 oraz wirus Vaccini (ospy krowiej). 5.1. OKREŚLANIE DZIAŁANIA BAKTERIOSTATYCZNEGO Celem jest ustalenie najmniejszego stężenia związku lub preparatu hamującego wzrost bakterii. Wartość tę nazywamy MIC (Minimal Inhibitory Concentration). 1 NCTC = The National Collection of Type Cultures 4 Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka W celu oznaczenia działania bakteriostatycznego preparatu, z roztworu wyjściowego przygotowuje się szereg rozcieńczeń w dowolnym stosunku (np. 1:10, 1:15, 1:20, 1:25 itd.). Roztwory przygotowuje się w jałowej wodzie destylowanej. Następnie do szeregu probówek zawierających po 9 ml podłoża bulionowego przenosi się po 1 ml każdego rozcieńczenia (rys. 5.) i po 0,05 ml odpowiednio rozcieńczonej 24-godziennej hodowli bulionowej szczepu wzorcowego. Hodowle inkubuje się w 37ºC przez 72 h. Probówkę zawierającą największe rozcieńczenie preparatu, w której nie wystąpił wzrost, przyjmuje się za graniczną, a stężenie środka za najmniejsze hamujące wzrost dla danego stosunku rozcieńczeń. Można następnie tę wartość uściślić wykonując kolejny szereg rozcieńczeń (np. 1:10, 1:11, 1:12, 1:13 itd.). Jeśli preparat powoduje zmętnienie bulionu i uniemożliwia ocenę wizualną, należy wysiać ezą z każdej probówki na podłoże stałe i ocenę po 48-godzinnej inkubacji w 37ºC. Rys. 5. Wyznaczanie zawiesinową wartości MIC metodą 5.2. OKREŚLANIE DZIAŁANIA BAKTERIOBÓJCZEGO Polega na ustaleniu najmniejszego stężenia preparatu lub związku dezynfekującego działającego bakteriobójczo. Najmniejsze stężenie bakteriobójcze oznacza się jako MBC (Minimal Bactericidal Concentration). Wartość MBC ustala się po określeniu MIC. W badaniach używa się 2 z 4 szczepów wzorcowych, dla których wartości MIC były największe. Oceniając wartości MBC dla badanego preparatu, zawsze porównuje się je z wartościami MBC dla preparatu standardowego (dla tych samych szczepów), i tak dla pochodnych fenolowych jest to fenol, dla związków chloru – podchloryn sodowy i chloramina o znanym stężeniu. Do badania używa się 24-godzinnej hodowli szczepów standardowych w podłożu bulionowym. Z preparatu wzorcowego (o znanej zawartości związku czynnego) oraz z preparatu badanego sporządza się szereg rozcieńczeń. Probówki z rozcieńczeniami wzorca oraz badanego środka dezynfekującego (po 5 ml) oraz probówki z hodowlami bulionowymi mikroorganizmu umieszcza się w łaźni wodnej o temperaturze 20ºC. Po upływie 15 minut do pierwszej probówki z wzorcem lub badanym środkiem dodaje się 0,5 ml hodowli bulionowej, miesza przez wirowanie i dokładnie po 30 sekundach dokonuje się posiewu do drugiej, a następnie w odstępach 30 sekundowych do kolejnych probówek. Po upływie 5 minut od posiania I probówki wstrząsa się jej zawartością i posiewa 1 oczko ezy do probówki zawierającej 5 ml jałowego bulionu (z odpowiednim inaktywatorem). W 30-sekundowych odstępach analogicznie wykonuje się następne posiewy. Całą serię posiewów powtarza się po 10 i 15 minutach. Probówki z posiewami umieszcza się w cieplarce o temp. 37ºC i inkubuje 48 h. Odczyt wyników polega na wizualnej ocenie wzrostu bakterii w podłożu (+) lub stwierdzeniu braku wzrostu (-). Przykład zestawienia wyników podano w tabeli 2. Wyniki uzyskane przy oznaczaniu wartości MBC dla preparatu wzorcowego i badanego pozwalają obliczyć tzw. współczynnik aktywności, za pomocą którego można obliczyć, ile razy badany preparat jest słabszy lub silniejszy od środka przyjętego jako wzorcowy. 5 Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka Tabela 2. Zapis wyników przy określaniu MBC Środek Stężenie środka dezynf. dezynfekcyjny [mg lub %] związek wzorcowy 5 10 15 20 związek badany 5 10 15 20 25 30 35 Czas działania [min] 5 10 15 + + + + + + + + + + + + + + + + + + - Obliczając ten współczynnik dzieli się najmniejsze stężenie preparatu wzorcowego nie niszczące bakterii w czasie 5 minut, ale zabijające drobnoustroje w czasie 10 min, przez najmniejsze stężenie preparatu badanego o takim samym działaniu. Dla danych z tabeli współczynnik będzie wynosił: wspól. preparatuwzorcowego 15 0,6 wspól. preparatubadanego 25 Otrzymana wartość 0,6 oznacza, że badany środek dezynfekcyjny ma aktywność równą 60% aktywności preparatu wzorcowego, czyli działa o 40% słabiej. Jeśli wartość wyliczonego współczynnika byłaby >1, tzn. że badany preparat działa tylokrotnie silniej od preparatu wzorcowego. 5.3. USTALANIE STĘŻENIA UŻYTKOWEGO Najczęściej stosowana jest metoda nośnikowa, w której używa się cylinderków (metalowych, szklanych lub porcelanowych), stosowanych także do oznaczania mocy antybiotyków. Cylinderki zanurza się w 0,1% roztworze asparaginy i wyjaławia przez 20 minut. Na powstałej błonce asparaginy łatwo przyczepiają się drobnoustroje. 20 takich jałowych, ostudzonych cylinderków przenosi się do 20 ml 48-godzinnych hodowli bulionowych odpowiednich szczepów. Po 15 minutach jałowo przenosi się je na szalki Petriego wyłożone krążkami jałowej bibuły filtracyjnej i umieszcza całość w cieplarce na 37ºC na 45 minut w celu osuszenia. Następnie po jednym cylinderku przekłada się do probówek z 10 ml danego rozcieńczenia badanego środka dezynfekcyjnego. Działanie każdego rozcieńczenia powinno być badane przy użyciu 10 cylinderków. Po upływie 10 minut cylinderki przenosi się do osobnych probówek zawierających podłoże bulionowe ze środkiem unieczynniającym i inkubuje się 48 h w 47ºC. Największe rozcieńczenie środka, w którym w żadnej z 10 probówek nie wystąpi wzrost, stanowi stężenie użytkowe, to jest takie, które użyte w praktyce spowoduje zniszczenie drobnoustrojów. Jeśli uzyskuje się wyniki odmienne dla różnych szczepów, za stężenie użytkowe przyjmuje się największe rozcieńczenie działające jeszcze bakteriobójczo na najbardziej oporny szczep użyty do badania. Oprócz tej próby laboratoryjnej, zwykle przeprowadza się jeszcze badania w warunkach, w których ma być wykonana dezynfekcja. 5.4. OCENA SKUTECZNOŚCI PROCESÓW WYJAŁAWIANIA W celu sprawdzenia skuteczności procesów wyjaławiania stosuje się kilka metod: Do procesów wyjaławiania termicznego wykorzystuje się głównie metody fizykochemiczne. Polegają one na określeniu stopienia się czystej substancji chemicznej umieszczonej w kapilarze (w komorze autoklawu) bądź na użyciu substancji chemicznych zmieniających zabarwienie po osiągnięciu odpowiedniej temperatury w danym procesie wyjaławiania (rys. 6.). 6 Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka Rys. 6. Taśma impregnowana z napisem AUTOCLAVED pojawiającym się po 15 minutach ekspozycji na temperaturę 121ºC w parze wodnej w autoklawie. Metody biologiczne polegają na użyciu próbek odpowiednio przygotowanych przetrwalników drobnoustrojów z rodzaju Bacillus lub Clostridium. Probówki zawierające przetrwalniki sterylizuje się razem z innymi produktami poddanymi temu procesowi. Po zakończeniu sterylizacji przetrwalniki zalewa się pożywką bulionową i hoduje w termostacie. Wzrost bakterii na pożywce dowodzi nieprawidłowości procesu wyjaławiania. Handlowo dostępne są testy Sporal A i Sporal S. Pierwszy zawiera przetrwalniki Bacillus stearothermophilus w papierowych torebkach, służy do kontroli procesu wyjaławiania w gorącej parze wodnej pod ciśnieniem. Sporal A ulega wyjałowieniu tylko wtedy gdy temperatura autoklawu wynosi minimum 121ºC przez 20 minut. Sporal S służy do kontroli suchego wyjaławiania, wymaga by temperatura suszarki utrzymywała się przez 2 h na poziomie 160ºC lub odpowiednio 2,5 h – 150ºC, 3 h – 140ºC. Metoda posiewu – polega na wysianiu próbki sterylizowanych produktów na pożywki, brak wzrostu w ciągu określonego czasu świadczy o jałowości badanych prób. Metoda termostatowa – polega na umieszczeniu wyjałowionych produktów w temp. 37ºC przez 110 dni, ujemny wynik próby (brak wzrostu) potwierdza prawidłowość procesu wyjaławiania Kontrola przepuszczalności filtrów – podczas mycia i innych czynności porowata struktura filtra może ulec uszkodzeniu, powodując że filtr przestaje zatrzymywać drobnoustroje. Kontrola polega na przesączeniu przez badany filtr odpowiednio rozcieńczonej zawiesiny hodowli bulionowej małej pałeczki Serratia marcescens. Jałowość przesączu świadczy o zatrzymaniu komórek przez filtr. 6. ŹRÓDŁA ZAKAŻEŃ W PRZEMYŚLE SPOŻYWCZYM Zakażenia pierwotne – pochodzące spoza zakładu przemysłowego, przyczynami są; o surowce o woda o powietrze Zakażenia wtórne – wewnątrzzakładowe, wywołane przez: o sprzęt technologiczny i aparaturę, przewody, węże, filtry i materiały filtracyjne, maszyny do rozlewu i formowania, prasy i wagi o powietrze w pomieszczeniach o odzież i obuwie pracowników o brudne ręce pracowników 6.1. KONTROLA CZYSTOŚCI W ZAKŁADACH PRZEMYSŁOWYCH Pracownicy zakładu mogą być źródłem zakażenia na skutek choroby lub nosicielstwa, mogą też przenosić drobnoustroje chorobotwórcze na swojej odzieży i skórze. Zapobieganie tym zakażeniom polega na: przestrzeganiu higieny osobistej personelu wykonywaniu badań lekarskich przed przyjęciem do pracy (3-krotne badania kału na nosicielstwo drobnoustrojów jelitowych, RTG klatki piersiowej, odczyn Wasermanna, badania w kierunku schorzeń skórnych, górnych dróg oddechowych i ogólnego stanu zdrowia) 7 Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka badania okresowe co pół roku 6.2. HIGIENA PERSONELU Elementy codziennej higieny osobistej: pozostawienie odzieży w szatni, w wydzielonych szafkach i założenie odzieży ochronnej (fartuch lub kombinezon, nakrycie głowy, obuwie) zmiana odzieży ochronnej co najmniej co 2-3 dni (lub codziennie) i dostosowanie jej do charakteru pracy (rodzaj, długość, dokładność zapięcia itp.) stała troska pracownika o higienę rąk (krótkie paznokcie, dokładne i częste mycie), używanie środka dezynfekującego, suszarki lub jednorazowych ręczników używanie gumowych rękawiczek przy niektórych pracach, skaleczeniach lub chorobach skórnych unikanie dotykania żywności bezpośrednio dłonią, zasłanianie ust i nosa przy kaszlu i kichaniu zdejmowanie fartucha przed wejściem do ubikacji niepalenie tytoniu w pomieszczeniach produkcyjnych 6.3. HIGIENA POMIESZCZEŃ PRODUKCYJNYCH Urządzenia, aparatura i sprzęt powinny być wykonane z materiałów nieszkodliwych (w kontakcie z żywnością) i łatwych do utrzymania w czystości Zabiegi mycia i odkażania powinny być traktowane jako jeden z etapów technologii produkcji (środki, czas, odpowiedzialny i przeszkolony pracownik) Odpowiedni sprzęt i środki chemiczne do mycia i dezynfekcji Zapewniona w wystarczającej ilości woda o odpowiednich parametrach Część praktyczna Wszystkie doświadczenia wykonać w warunkach jałowych! 1. Odczyty posiewów z mikroflory surowców pochodzenia zwierzęcego i roślinnego a) policzyć ilość kolonii na szalkach Petriego (jeżeli będą policzalne), albo opisać zmiany, obserwacje umieścić w tabeli zbiorczej (na ćwiczeniach) b) omówić wyniki w grupach i zreferować kolegom oraz prowadzącemu. 2. Ocena wrażliwości bakterii Escherichia coli na różne środki dezynfekujące – test płytkowo-dyfuzyjny Badane preparaty woda destylowana (kontrola) 30% nadtlenek wodoru NaOH Flash, Domestos? 96% alkohol etylowy 1:50 1:2 Np. Flash 1:20 1:10 Wykonanie oznaczenia 1. Przygotować rozcieńczenia badanych środków dezynfekujących (1:2, 1:10, 1:20, 1:50) w jałowej wodzie destylowanej. 2. Na powierzchnię 4 płytek Petriego z agarem odżywczym wysiać powierzchniowo 0,5 cm3 24godzinnej hodowli bakterii E. coli. Zawiesinę bardzo dokładnie rozprowadzić głaszczką po powierzchni podłoża. 3. Po 10 minutach na powierzchni podłoża rozłożyć, w mniej więcej równej odległości od siebie, 4 krążki bibułowe nasączone różnymi stężeniami badanego środka dezynfekującego – 1 płytka jeden badany preparat. Na denku płytki zaznaczyć stężenie i rodzaj środka. Pamiętać o zachowaniu jałowości podczas zanurzania i nakładania krążków bibuły. 4. Płytki inkubować w cieplarce (37ºC) przez 3-5 dni. 8 Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka 5. Odczytać wyniki i zapisać w tabeli. Określić wrażliwość drobnoustroju na poszczególne środki dezynfekcyjne przez pomiar wielkości strefy zahamowania wzrostu przy poszczególnych krążkach. Wyciągnąć wnioski. Strefa zahamowania wzrostu w zależności od środka dezynfekującego Rodzaj środka dezynfekcyjnego Rozcieńczenie Strefy zahamowania wzrostu (średnica w mm) 1:2 1:10 96% etanol 1:20 1:50 1:2 1:10 30% nadtlenek wodoru 1:20 1:50 Flash (kwas chlorowy) 1:2 1:10 1:20 1:50 Kontrola (woda destylowana) 3. Ocena aktywności bakteriostatycznej fenolu 1. W celu oznaczenia działania bakteriostatycznego preparatu, z przygotowanego szeregu rozcieńczeń 5% fenolu (nie rozcieńczony oraz rozcieńczony w stosunku 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20 i 1:50 w jałowej wodzie destylowanej) pobrać po 1 ml zawiesiny i kolejno dodać do probówek zawierających po 9 ml podłoża bulionowego. 2. Do każdej probówki przenieść po 0,05 ml 24-godzinnej hodowli bulionowej E. coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae lub Aspergillus niger.. 3. Hodowle inkubować w 37ºC przez 30 min. 4. 2 płytki Petriego z zestalonym agarem odżywczym podzielić na ćwiartki (zaznaczyć pola pisakiem od spodu płytki i podpisać odpowiednim rozcieńczeniem i mikroorganizmem). Na każdej ćwiartce wysiać po 1 oczku ezy z kolejnej probówki. Płytki inkubować w 37ºC przez 24-73 h. 5. Odczytać wyniki i narysować obraz płytek z wyrosłymi lub nie koloniami bakterii. Wyznaczyć MIC – najmniejsze stężenie preparatu hamujące wzrost bakterii, czyli największe rozcieńczenie preparatu, w którym nie wystąpił wzrost. Wyciągnąć wnioski. Na przykład: 1:50 1:100 1:10 1:5 1:20 1:15 1:2 1:1 9 Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka 4. Ocena skuteczności jałowienia za pomocą lamp UV 1. Na powierzchnię 8 płytek Petriego z agarem odżywczym wysiać powierzchniowo 0,5 cm3 24godzinnej hodowli bakterii Escherichia coli. Zawiesinę bardzo dokładnie rozprowadzić głaszczką po powierzchni podłoża. 2. Podpisać płytki: kontrola, 1’, 5’, 10’ i 15’ otwarta, 20’ zamknięta, 20’ osłonięta do połowy folią aluminiową. 3. Po 10 minutach zachowując warunki aseptyki otwarte lub zamknięte (w zależności od próby) płytki Petriego ustawić pod lampą UV na odpowiedni czas. Promienie UV powinny padać prostopadle do powierzchni płytki. 4. Po naświetleniu płytki zamknąć i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37ºC. 5. Wyniki obserwacji (intensywność wzrostu oceniana od + do +++++) umieścić w tabeli: Zależność pomiędzy czasem naświetlania a intensywnością wzrostu Próbka badana Czas [min] Intensywność wzrostu 1. Płytka kontrolna 0 2. Płytka otwarta 1 5 3. Płytka otwarta 10 4. Płytka otwarta 20 5. Płytka otwarta 30 6. Płytka zamknięta 40 7. Płytka osłonięta folią (połowa) 40 6. Wyciągnąć wnioski na temat skuteczności jałowienia promieniowaniem UV 10
