Autoreferat - Instytut Botaniki PAN
advertisement
załącznik 3 INSTYTUT FIZJOLOGII ROŚLIN im. FRANCISZKA GÓRSKIEGO POLSKIEJ AKADEMII NAUK W KRAKOWIE Autoreferat dr Marta Libik-Konieczny Kraków, kwiecień 2015 I. Imię i Nazwisko: Marta Libik-Konieczny II. Wykształcenie oraz posiadane dyplomy i stopnie naukowe: 1988; matura w I Liceum Ogólnokształcącym im. B. Nowodworskiego w Krakowie. 1989-1994; pięcioletnie studia magisterskie na Wydziale Biologii i Nauk o Ziemi Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie, kierunek biologia. 1994; stopień magistra biologii. Obrona pracy magisterskiej pod tytułem: „Izolowanie gametofitów żeńskich u wybranych gatunków Angiospermae” Promotor: prof. dr hab. Lesław Przywara†. Zakład Cytologii i Embriologii Roślin, Instytut Botaniki, Uniwersytet Jagielloński. 1999; stopień doktora nauk biologicznych w zakresie biologii na Wydziale Biologii i Nauk o Ziemi na podstawie rozprawy doktorskiej pod tytułem „Charakterystyka biochemiczna, lokalizacja i funkcje białka wiążącego wapń-kalretikuliny w kulturach in vitro Daucus carota L.” Promotor: prof. dr hab. Lesław Przywara†. Zakład Cytologii i Embriologii Roślin, Instytut Botaniki, Uniwersytet Jagielloński. Recenzenci: prof. dr hab. Elżbieta Bednarska, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu; prof. dr hab. Stanisław Więckowski† Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński III. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych: 10.1994 - 09.1998; słuchaczka Środowiskowego Studium Doktoranckiego, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi Uniwersytetu Jagiellońskiego. 10.1998 - 07.1999; asystent w Zakładzie Cytologii i Embriologii Roślin, Instytut Botaniki Uniwersytetu Jagiellońskiego. 08.1999 - 03.2005; biolog w Instytucie Fizjologii Roślin im. F. Górskiego, Polska Akademia Nauk. 04.2005 – obecnie; adiunkt w Instytucie Fizjologii Roślin im. F. Górskiego, Polska Akademia Nauk. IV. Wskazanie osiągnięcia naukowego wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.): Tytuł osiągnięcia naukowego: 1 Moje osiągnięcie naukowe, będące podstawą złożonego wniosku o wszczęcie postępowania habilitacyjnego, stanowi monotematyczny cykl 4 publikacji przedstawionych pod wspólnym tytułem: „Udział nadtlenku wodoru i wybranych elementów systemu antyoksydacyjnego w procesie morfogenezy w kulturach in vitro Mesembryanthemum crystallinum L.” V. Wykaz publikacji* wchodzących w skład osiągnięcia naukowego art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.): 1. Libik M*, Konieczny R, Pater B, Ślesak I, Miszalski Z. (2005) Differences in the activities of some antioxidant enzymes and in H2O2 content during rhizogenesis and somatic embryogenesis in callus cultures of the ice plant. PLANT CELL REPORTS 23: 834-841. (IF: 2.8332009-2013; MNiSW: 35 pkt) Mój udział procentowy szacuję na 70%. 2. Libik-Konieczny M*, Konieczny R, Surówka E, Ślesak I, Michalec Ż, Rozpądek P, Miszalski Z. (2012) Pathways of ROS homeostasis regulation in Mesembryanthemum crystallinum L. calli exhibiting differences in rhizogenesis. PLANT CELL TISSUE AND ORGAN CULTURE 110: 123131. (IF: 3.6332012; MNiSW: 30 pkt) Mój udział procentowy szacuję na 65%. * 3. Konieczny R, Banaś AK, Surówka E, Michalec Ż, Miszalski Z, Libik-Konieczny M . (2014) Pattern of antioxidant enzyme activities and hydrogen peroxide content during developmental stages of rhizogenesis from hypocotyl explants of Mesembryanthemum crystallinum L. PLANT CELL REPORTS 33: 165–177. (IF: 2.9362013; MNiSW: 35 pkt) Mój udział procentowy szacuję na 60%. 4. Libik-Konieczny M*, Kozieradzka-Kiszkurno M, Desel Ch, Michalec-Warzecha Ż, Miszalski Z, Konieczny R. (2015) The localization of NADPH oxidase and reactive oxygen species in in vitrocultured Mesembryanthemum crystallinum L. hypocotyls discloses their differing roles in rhizogenesis. PROTOPLASMA 252: 477–487. (IF: 3.1712013; MNiSW: 30 pkt) Mój udział procentowy szacuję na 65% 2 Sumarycznie: IF = 12.573; pkt. wg wykazu MNiSW = 130 * autor korespondencyjny - oświadczenia wszystkich współautorów, określające indywidualny wkład każdego z nich w powstanie danej publikacji przedstawiono w załączniku 6 VI. Omówienie celu naukowego prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania: 1. Wprowadzenie Metody hodowli in vitro stanowią nie tylko podstawowe narzędzie biotechnologiczne wykorzystywane między innymi do mikrorozmnażania, selekcji nowych odmian czy też produkcji biomasy i substancji bioaktywnych na skalę przemysłową. Techniki te są również stosowane w badaniach podstawowych nad fizjologią wzrostu i rozwoju roślin, ze względu na możliwość przeprowadzenia analiz procesów zachodzących w kontrolowanych warunkach, bez udziału mechanizmów działających na poziomie całej rośliny. Podstawą technik in vitro jest ujawnienie się w warunkach hodowli zjawiska totipotencji czyli nieograniczonej zdolności komórek roślinnych do podziału, a następnie odtwarzania (regeneracji) poszczególnych organów i w konsekwencji całego organizmu. Proces morfogenezy in vitro może przebiegać na szlaku prowadzącym do formowania organów (organogeneza) takich jak: pędy (kaulogeneza) czy korzenie (ryzogeneza) lub zarodków somatycznych (embriogeneza somatyczna). Formowanie nowych organów in vitro może odbywać się na drodze bezpośredniej z wyłożonych na pożywce fragmentów rośliny (eksplantat) bądź z zawiesiny komórek lub izolowanych protoplastów. Z kolei organogeneza pośrednia, zawiera etap przejściowy w postaci wytworzenia tkanki kalusowej (kalogeneza), w której następnie tworzą się centra komórek merystematycznych, dające początek nowym organom. Niezależnie od sposobu powstawania i rodzaju formowanych organów w przebiegu morfogenezy in vitro wyróżnia się kilka etapów. Według modelu opracowanego przez Christianson i Warnick (1985) pierwszą fazą jest ujawnienie kompetencji lub uzyskanie kompetencji przez komórkę bądź grupę komórek eksplantatu do odbierania i reagowania na sygnał w postaci różnych czynników stosowanych w kulturach in vitro. W kolejnym etapie następuje indukcja rozwoju komórki kompetentnej w określonym kierunku rozwojowym. Ukierunkowanie rozwoju lub inaczej determinacja wynika z ekspresji specyficznych dla organów genów, odpowiedzialnych za realizację danego programu rozwojowego. Uruchomienie odpowiednich genów pozwala na kontynuowanie procesu rozwojowego niezależnie od czynników indukujących. Ostatnią fazą procesu morfogenezy jest 3 różnicowanie komórek i powstanie wyspecjalizowanych strukturalnie i funkcjonalnie tkanek danego organu. W zdecydowanej większości z danej kompetentnej komórki lub grupy kompetentnych komórek możliwe jest powstanie tylko jednego typu organu. Efektywność procesu morfogenezy uwarunkowana jest wieloma czynnikami endogennymi m.in. genotypem rośliny i jej stanem fizjologicznym, jednakże znaczącą rolę w indukcji tworzenia nowych organów odgrywają czynniki egzogenne. Istotną rolę w przebiegu morfogenezy in vitro odgrywają roślinne regulatory wzrostu (fitohormony), które decydują o uzyskaniu przez komórkę kompetencji oraz wpływają na wydajność procesu morfogenezy. W dużym stopniu o indukcji danego szlaku rozwojowego i regeneracji odpowiedniego typu organu decyduje odpowiednia proporcja między stężeniami egzogennych fitohormonów takich jak auksyny i cytokininy: wyższe stężenie auksyn w stosunku do cytokinin prowadzi do indukcji procesu ryzogenezy, a odwrotne proporcje między wymienionymi grupami fitohormonów powodują indukcję morfogenezy na drodze kaulogenezy, natomiast porównywalne stężenia auksyn i cytokinin w pożywce indukują kalogenezę (Skoog i Miller 1957). Niewątpliwie ważny udział fitohormonów w indukcji morfogenezy nie jest jedynym czynnikiem egzogennym wpływającym na potencjał morfogeniczny eksplantatu. Wiele badań eksperymentalnych wykazało istotną rolę różnych typów stresorów (stres osmotyczny, stres temperaturowy, stres mechaniczny, stres hipoksji, stres metali ciężkich., stres związany ze zmianami pH pożywki, stres wywołany promieniowaniem UV) w indukcji nowych szlaków rozwojowych (Potters i in. 2007). Wspólną reakcją komórek roślinnych na działanie różnych czynników stresowych jest nadprodukcja reaktywnych form tlenu (RFT). Reaktywne formy tlenu są produktami niepełnej redukcji cząsteczki tlenu i powstają w chloroplastach, peroksysomach i mitochondriach, ale również w retikulum endoplazmatycznym, w błonie komórkowej, w cytoplazmie i apoplaście, jako uboczny produkt metabolizmu tlenowego. Do podstawowych RFT zaliczamy cząsteczki o charakterze rodnikowym takie jak: anionorodnik ponadtlenkowy (O2•-) czy też rodnik hydroksylowy (•OH), ale także nadtlenek wodoru (H2O2) i tlen singletowy (1O2), które nie są wolnymi rodnikami (Bartosz 2006). Wysokie stężenie RFT w komórkach wpływa negatywnie na elementy strukturalne komórki prowadząc do ich utlenienia i degradacji, a w konsekwencji do śmierci komórek i całego organizmu. Dlatego też konieczne jest funkcjonowanie obok procesów w których powstają RFT, systemu odpowiedzialnego za usuwanie nadmiaru RFT i utrzymanie homeostazy redoks. W komórkach roślinnych system antyoksydacyjny obejmuje drobnocząsteczkowe związki antyutleniające i enzymy antyoksydacyjne. Każdy przedział komórkowy zawiera własną pulę antyoksydantów, a dla każdego z rodzajów RFT istnieje kilka sposobów jego dezaktywacji (Gechev i in. 2006). Brak równowagi pomiędzy generacją RFT, a zdolnościami antyoksydacyjnymi organizmu określa się, jako stres oksydacyjny. Do najważniejszych enzymatycznych elementów systemu antyoksydacyjnego, zabezpieczającego 4 komórki roślinne przed stresem oksydacyjnym należą: dysmutazy ponadtlenkowe (SOD), katalazy (KAT), peroksydazy (POD). SOD są jedynymi enzymami roślinnymi, które mogą usuwać O2•-. Istnieje kilka form SOD, które różnią się rodzajem metalu przejściowego: Cu/ZnSOD, MnSOD, FeSOD oraz lokalizacją w komórce: Cu/ZnSOD występuje w chloroplastach i cytozolu, MnSOD w mitochondriach i peroksysomach, a FeSOD w chloroplastach (Halliwell 2006). KAT rozkładają nadtlenek wodoru bez udziału dodatkowych reduktorów i występują w największych ilościach w peroksysomach, a także na terenie mitochondriów i chloroplastów. POD rozkładają nadtlenek wodoru przy udziale reduktora takiego jak między innymi askorbinian (peroksydaza askorbinianowa) lub glutation (peroksydaza glutationowa) i działają na terenie chloroplastów, mitochondriów, peroksysomów, retikulum endoplazmatyczengp, cytozolu, a także apoplastu. W przypadku działania czynników stresowych na komórki bardzo często dochodzi do zaburzenia metabolizmu i podwyższenia produkcji RFT na skutek niewystarczającej aktywności elementów systemu antyoksydacyjnego. Dochodzi wtedy do uruchomienia mechanizmów sygnałowych odpowiadających za inicjację odpowiedzi związanej z aklimatyzacją komórek do zmienionych warunków (Bohnert i Sheveleva 1998, Gechev i in. 2006). W ostatnim dziesięcioleciu coraz powszechniej podkreśla się rolę RFT jako cząsteczek sygnałowych uruchamiających różnorodne procesy fizjologiczne roślin w odpowiedzi na indukowany czynnikami abiotycznymi i biotycznymi stres oksydacyjny (Gapper i Dolan 2006). Początkowo główną funkcję sygnałową przypisywano H2O2 z uwagi na dużą stabilność tej cząsteczki i większy zasięg działania dzięki zdolność przenikania przez błony komórkowe. Jednakże, doświadczenia prowadzone w ostatnich latach wykazały, że w systemach transdukcji sygnału biorą również udział: anionorodnik ponadtlenkowy oraz tlen singletowy (Gechev i in. 2006). Regulacyjna rola RFT wynika nie tylko z możliwości bezpośredniego oddziaływania na ekspresję niektórych genów (Breusegem i in. 2008, Gapper i Dolan 2006, Mittler i in. 2004, Vranova i in. 2002), ale także ze współdziałania tych cząsteczek z innymi szlakami sygnałowymi zwłaszcza indukowanymi za pośrednictwem fitohormonów. RFT produkowane w odpowiedzi na działanie stresorów mogą wpływać na modyfikację transportu i/lub zawartości auksyn w komórkach roślinnych, które prowadzą do indukcji reakcji morfogenicznej znanej jako odpowiedź morfogeniczna indukowana przez stres (SIMR, ang. stress induced morphogenic response) (Potters i in. 2007). 2. Omówienie celu naukowego prac i osiągniętych wyników W doświadczeniach, których rezultatem są cztery publikacje prezentowane jako moje główne osiągnięcie naukowe, nadrzędnym celem było zbadanie zależności między poziomem RFT, aktywnością wybranych elementów systemu antyoksydacyjnego, a przebiegiem morfogenezy indukowanej in vitro w hypokotylach Mesembryanthemum crystallinum L. (przypołudnik kryształkowy). W literaturze, którą prześledziłam rozpoczynając eksperymenty, nie można było 5 odnaleźć wiele informacji dotyczących udziału RFT w indukcji morfogenezy i różnicowaniu organów in vitro. Ponadto, publikowane dane były często rozbieżne, np. w badaniach przeprowadzonych przez Papadakis i Roubelakis-Angelakis (2002) stwierdzono, że indukcji totipotencji towarzyszy obniżenie wewnątrzkomórkowego poziomu RFT oraz podwyższenie aktywności enzymatycznych antyoksydantów, podczas gdy w pracy Cui i in. (1999) obserwowano zjawiska przeciwne. W rezultacie rola RFT w procesach morfogenezy in vitro nie była jednoznacznie określona. M. crystallinum jest fakultatywnym halofitem. Jednym z mechanizmów adaptacyjnych tej rośliny do warunków silnego zasolenia gleby i niedoboru wody w podłożu jest zmiana typu metabolizmu z C3 na CAM (ang. crassulacean acid metabolism) (Lüttge 1993, Adams i in. 1998). Gatunek ten jest modelowym obiektem wielu analiz, dotyczących udziału RFT w indukcji zmiany typu fotosyntezy. Roślina ta nie była dotychczas przedmiotem badań nad regulacyjną rolą RFT w indukcji i przebiegu morfogenezy in vitro. W czasie gdy rozpoczynałam swoje doświadczenia, w literaturze dostępne były dwa protokoły opisujące indukcję regeneracji in vitro M. crystallinum na drodze kaulogenezy (Meiners i in. 1991) oraz somatycznej embriogenezy (Cushman i in. 2000). Celem tych doświadczeń było uzyskanie efektywnej regeneracji roślin, a autorzy nie podejmowali prób wyjaśnienia zagadnień związanych z mechanizmami regulującymi proces morfogenezy. Doświadczenia rozpoczęłam od analizy morfologicznej, histologicznej i biochemicznej kalusów uzyskanych z hypokotyli siewek M. crystallinum (poz. V. 1.). W wyniku hodowli eksplantatów na pożywkach MS (Murashige i Skoog 1962) różniących się rodzajem oraz stężeniem auksyn i cytokinin, a także zawartością NaCl, otrzymałam dwa typy morfologiczne kalusów: kalus grudkowaty i kruchy oraz kalus o gładkiej powierzchni i galaretowatej konsystencji. Różnice histologiczne pomiędzy uzyskanymi typami kalusów polegały na obecności licznych grup komórek merystematycznych w kalusie grudkowatym, podczas gdy kalus gładki zbudowany był głównie z komórek parenchymatycznych. Obserwacje te wskazywały, że uzyskane kalusy różnią się pod względem możliwości morfogenicznych. Stwierdziłam, że obecność w pożywce kwasu 2,4- dichlorofenoksyoctowego (2,4-D), kinetyny i NaCl, prowadzi do wytworzenia kalusa, w którym formowane są centra komórek merystematycznych. Ten typ kalusa określiłam jako kalus posiadający potencjał regeneracyjny. Natomiast, zastosowanie w pożywce kombinacji fitohormonów w postaci kwasu 1-naftylooctowego (NAA, ang. 1-naphthaleneacetic acid) i 6- benzyloaminopuryny (BAP), a także brak chlorku sodu, prowadzi do powstania kalusa, w którym nie obserwowałam ugrupowań komórek merystematycznych. Ten typ kalusa określiłam jako kalus nieregenerujący. Do indukcji różnicowania nowych organów z centrów merystematycznych kalusa grudkowatego konieczne było usunięcie auksyny z pożywki. Kontynuując kulturę na pożywce bez 2,4-D obserwowałam głównie różnicowanie korzeni (kalus z rozwijającymi się korzeniami). Na nielicznych kalusach ryzogenicznych formowany był dodatkowo kalus odróżniający się morfologicznie silnie zielonym 6 zabarwieniem. Fragmenty zielonego kalusa, po odseparowaniu od reszty tkanki kalusa ryzogenicznego, w ciągu dalszej kultury tworzyły zarodki somatyczne (kalus z zarodkami somatycznymi). Stwierdziłam również, że w moim modelu eksperymentalnym ryzogeneza jest dominującym typem regeneracji (86% eksplantatów). Proces somatycznej embriogenezy obserwowano tylko na 14% eksplantatów. Należy zaznaczyć, że pomimo tych samych warunków indukujących morfogenezę, dwa typy regeneracji nigdy nie pojawiały się na tym samym eksplantacie, co może wskazywać, że indukcja danego typu morfogenezy u M. crystallinum zależy głównie od czynników endogennych. Dodatkowo, korzenie różnicowały się z komórek merystematycznych położonych głęboko w tkankach kalusa, natomiast zarodki somatyczne rozwijały się z centrów merystematycznych formowanych w peryferycznych warstwach kalusa. Fakt ten może z kolei wskazywać na istnienie w obrębie kalusa gradientu substancji indukujących dany typ morfogenezy. Rozpoczynając badania biochemiczne na uzyskanych typach kalusów założyłam istnienie różnic w poziomie stresu oksydacyjnego wyrażonego stężeniem endogennego nadtlenku wodoru oraz w aktywności enzymatycznych antyoksydantów regulujących poziom H2O2 w badanym materiale. Analizy biochemiczne z wykorzystaniem metod spektrofotometrycznych, elektroforezy natywnej, barwienia żeli poliakrylamidowych na aktywność SOD i KAT oraz metody fluorymetrycznej przeprowadziłam na typach kalusów o rożnym potencjale morfogenicznym (kalus nieregenerujący oraz kalus posiadający potencjał regeneracyjny), a także na kalusach z rozwijającymi się korzeniami lub zarodkami somatycznymi. Stwierdziłam, że uzyskane typy kalusów różniące się zdolnością i sposobem regeneracji wykazują odmienną zawartości H2O2 oraz aktywności SOD i KAT. Najwyższy poziom nadtlenku wodoru obserwowałam w kalusie posiadającym potencjał regeneracyjny, natomiast najniższy poziom tej cząsteczki odnotowałam w komórkach kalusa nieregenerującego i kalusa z zarodkami somatycznymi. Komórki kalusa z rozwijającymi się korzeniami także wykazywały stosunkowo niską zawartość nadtlenku wodoru. Aktywność KAT we wszystkich typach badanego kalusa korelowała z zawartością nadtlenku wodoru: najniższą aktywność tego enzymu zanotowałam w kalusie wykazującym potencjał regeneracyjny, podczas gdy kalus nieregenerujący oraz kalus z rozwijającymi się korzeniami lub zarodkami somatycznymi zaopatrzone były w KAT o stosunkowo wysokiej aktywności, zwłaszcza w przypadku kalusa embriogenicznego. Wizualizacja aktywności SOD na żelach poliakrylamidowych wykazała obecność kilku izoform tego enzymu we wszystkich badanych typów kalusów. Izoformy te zostały zidentyfikowane jako: MnSODII, MnSOD, FeSOD i CuZnSOD. We wszystkich badanych typach kalusów największe różnice w aktywności wykazywała izoforma FeSOD i MnSODII. Najwyższą aktywność FeSOD odnotowano w kalusie nieregenerującym oraz w kalusie z rozwijającymi się zarodkami somatycznymi. We wcześniejszych badaniach przeprowadzonych przez Miszalski i in. (1998) stwierdzono, że izoforma FeSOD zlokalizowana jest 7 głównie w chloroplastach komórek M. crystallinum, gdzie uczestniczy w regulacji poziomu RFT produkowanych w procesie fotosyntezy. Ten rezultat korelował z wynikiem pomiarów aktywności fotosyntetycznej badanych typów kalusów wykonanej za pomocą pomiarów fluorescencji chlorofilu a. Parametr wskazujący na maksymalną wydajność fotosyntetyczną PSII (Fv/Fm) był najwyższy w typach kalusów, w których aktywność FeSOD była również wysoka. Ponadto, w dwóch badanych typach tj. kalusie posiadającym potencjał regeneracyjny oraz w kalusie z rozwijającymi się korzeniami, w których parametr Fv/Fm był niski, zaobserwowałam pojawienie się dodatkowego prążka odpowiadającego aktywności SOD, który oznaczyłam jako MnSODII. We wcześniejszych analizach aktywności SOD w różnych organach M. crystallinum stwierdzono, że obecność tej izoformy ograniczona jest do komórek korzenia roślin rosnących zarówno w warunkach in vivo (Libik i in. 2005, II B5; wykaz opublikowanych prac, załącznik 5) jak i in vitro (Ślesak i Miszalski 2003). Pojawienie się prążka odpowiadającego aktywności MnSODII nie tylko w kalusie z rozwijającymi się korzeniami, ale również w kalusie wykazującym potencjał regeneracyjny może wskazywać, że aktywność tej izoformy jest nie tylko organospecyficzna, lecz związana z typem metabolizmu. Wskazują na to wyniki analizy aktywności fotosyntetycznej PSII. Wartości parametru Fv/Fm były niskie w typach kalusów, w których obserwowano aktywność MnSODII. Wyniki te skłoniły mnie do wysnucia hipotezy, że różnice w aktywności antyoksydacyjnej pomiędzy badanymi typami kalusów mogą wynikać z różnic w ich aktywności metabolicznej. Na uwagę zasługuje fakt, że pomimo kultury w tych samych warunkach oświetlenia oraz stężenia cukru w pożywce komórki analizowanych typów kalusów różniących się potencjałem regeneracyjnym oraz rodzajem morfogenezy realizowały inny typ metabolizmu z przewagą autotrofizmu lub heterotrofizmu. Podsumowując wyniki uzyskane w ramach przeprowadzonych doświadczeń stwierdziłam, że typy kalusów posiadające różny potencjał regeneracyjny charakteryzują się odmienną aktywnością enzymów antyoksydacyjnych regulujących poziom endogennego nadtlenku wodoru. Wysokie stężenie H2O2, niska aktywność KAT, a także indukcja dodatkowej izoformy MnSODII towarzyszy indukcji potencjału regeneracyjnego w komórkach kalusa. Stwierdziłam również, że indukcja danej ścieżki rozwojowej może zależeć od typu metabolizmu, który realizują różnicujące się komórki kalusa: heterotrofizm koreluje z rozwojem korzeni natomiast autotrofizm towarzyszy rozwojowi zarodków somatycznych. W kolejnych doświadczeniach skoncentrowałam się na badaniach mechanizmów regulacji poziomu RFT w komórkach kalusa wykazującego potencjał regeneracyjny, indukowanego z hypokotyli M. crystallinum pod wpływem 2,4D, kinetyny i NaCl (poz. V. 2.). Założyłam, że obecność chlorku sodu odgrywa znaczącą rolę w indukcji stresu oksydacyjnego, którego poziom wyrażony stężeniem H2O2 i regulowany przez aktywność enzymów antyoksydacyjnych odpowiada za indukcję potencjału morfogenicznego. 8 Jedną z adaptacji komórek M. crystallinum do stresu związanego z obecnością NaCl w podłożu jest akumulacja substancji kompatybilnych określanych również mianem metabolitów stresowych, które pozwalają na utrzymanie równowagi osmotycznej pomiędzy wakuolą, w której gromadzone są jony, a cytoplazmą. Jedną z takich substancji jest prolina (Parvaiz i Satyawati 2008). W doświadczeniach przeprowadzonych wcześniej na roślinach M. crystallinum poddanych stresowi zasolenia wykazano, że prolina pełni również funkcje antyoksydacyjne, usuwając anionorodnik ponadtlenkowy (Shevyakova i in. 2009). Ponadto, badania przeprowadzone na gatunkach roślin tolerujących wysokie stężenia NaCl, wykazały, że prolina odgrywa także rolę cząsteczki sygnałowej, wpływającej na ekspresję genów odpowiedzialnych za indukcję szlaków metabolicznych takich jak oksydacyjny szlak pentozofosforanowy, który zabezpiecza komórki przed szkodliwym działaniem stresu (Hare i Cress 1997). Wykazano również, że prolina indukuje podziały komórkowe i różnicowanie w procesie kaulogenezy w kulturach in vitro Arabidopsis thaliana (Hare et al. 2001). W celu weryfikacji tezy dotyczącej roli NaCl w indukcji potencjału regeneracyjnego z kalusa M. crystallinum analizowałam stężenie endogennego nadtlenku wodoru, aktywność wybranych enzymatycznych elementów systemu antyoksydacyjnego, a także zawartości proliny w komórkach kalusów indukowanych na pożywkach różniących się zawartością chlorku sodu. Wykazałam, że indukcji potencjału regeneracyjnego z kalusa na pożywce zawierającej NaCl towarzyszy niski poziom endogennego H2O2, wysoka aktywność SOD, KAT oraz peroksydazy askorbinianowej (APX) i gwajakolowej (POD), a także wysokie stężenie proliny w porównaniu z kalusem którego komórki nie wykazują zdolność do regeneracji, indukowanym na pożywce nie zawierającej chlorku sodu. Ponadto stwierdziłam, że komórki kalusa indukowanego bez udziału NaCl reagują na warunki kultury akumulując znaczne ilości metabolitów wtórnych w postaci betacyjanin. Związki te, nadające komórkom czerwone zabarwienie, należą do betalain charakteryzujących się wysoką aktywnością antyoksydacyjną (Cai i in. 2003). Są one syntetyzowane i akumulowane w zastępstwie antocyjanów w komórkach większości gatunków roślin z rodziny Caryophyllaceae (Goździkowate), do której należy również M. crystallinum (Strack i in. 2003). Pomimo wykazanej zdolności do usuwania RFT, betacyjaniny nie były jak dotychczas przedmiotem wielu badań dotyczących zależności pomiędzy indukcją ich syntezy oraz zmian ich stężenia w odpowiedzi na działanie stresu oksydacyjnego u M. crystallinum. W literaturze dostępne jest jedno doniesienie świadczące o wzmożonej syntezie i akumulacji betacyjanin w komórkach liści M. crystallinum w odpowiedzi na działanie stresu świetlnego (Ibdah i in. 2002). Uzyskane przeze mnie rezultaty wskazują, że w komórkach kalusa hodowanego bez dodatku NaCl, stres oksydacyjny wywołany warunkami hodowli niezależnymi od światła, prowadzi do uaktywnienia mechanizmów adaptacyjnych w postaci zwiększonej akumulacji betacyjanin. Uzyskane wyniki skłoniły mnie do przeprowadzenia doświadczenia polegającego na manipulowaniu poziomem stresu oksydacyjnego poprzez zahamowanie aktywności KAT i SOD za pomocą 9 inhibitorów w postaci odpowiednio aminotriazolu (AT) lub dietyloditiokarbaminianu (DDTC, ang. diethyldithiocarbamate) dodanych do pożywek indukujących rozwój kalusa. Eksperymenty te miały na celu stwierdzenie czy w ten sposób zmieniony poziom stresu oksydacyjnego spowoduje modyfikację odpowiedzi adaptacyjnej w postaci indukcji regeneracji lub syntezy i akumulacji betacyjanin. Wyniki tych doświadczeń wykazały, że zastosowanie inhibitorów KAT lub SOD w hodowlach kalusa w obecności fitohormonów i NaCl powoduje wzrost ilości endogennego nadtlenku wodoru i zablokowanie zdolności regeneracyjnych tych komórek. Na skutek inhibicji aktywności KAT komórki kalusa hodowanego w obecności NaCl tracą możliwości adaptacyjne i degenerują. Natomiast zablokowanie aktywności SOD nie prowadzi do zmian nekrotycznych, a obserwowany wysoki poziom H2O2 może wskazywać na inne niż reakcja dysmutacji anionorodnika ponadtlenkowego źródło nadtlenku wodoru w badanych komórkach. Wykazałam również, że po zahamowaniu aktywności SOD przez DDTC poziom proliny znacznie wzrasta, co dodatkowo świadczy o udziale tego związku w regulacji stężenia O2•-, natomiast wskazuje również, że wzrost stężenia proliny nie jest głównym czynnikiem wpływającym na indukcję potencjału regeneracyjnego. Z drugiej strony, zahamowanie aktywności zarówno SOD jak i KAT w komórkach kalusa hodowanego na pożywce bez dodatku NaCl prowadzi do obniżenia poziomu H2O2. Po zablokowaniu aktywności KAT funkcje usuwania nadtlenku wodoru przejmują APX i POD, których aktywność znacznie wzrasta. W obydwu przypadkach zastosowanych inhibitorów zmniejszone stężenie H2O2 koreluje z obniżeniem stężenia betacyjanin w komórkach kalusa indukowanego na pożywce bez NaCl, co stanowi dodatkowy argument, przemawiający za indukcją syntezy tych metabolitów wtórnych w odpowiedzi na podwyższony poziom RFT. Wyniki uzyskane w tej pracy wskazują na możliwość indukcji różnych procesów adaptacyjnych w hodowanych kalusach M. crystallinum w zależności od warunków kultury indukujących stres oksydacyjny oraz zaangażowania specyficznych elementów systemu antyoksydacyjnego w regulację poziomu RFT. Stresowi oksydacyjnemu wywołany warunkami kultury na pożywce pozbawionej chlorku sodu towarzyszy wysoka aktywnością SOD i KAT oraz niska aktywnością POD i APX, co skutkuje ustaleniem wysokiego poziomu H2O2, wzrostem syntezy i akumulacji betacyjanin oraz brakiem zdolności do regeneracji. Warunki hodowli kalusa na pożywce z dodatkiem NaCl wpływają na aktywację wszystkich badanych enzymatycznych antyoksydantów oraz indukcję akumulacji proliny powodując ustalenie niskiego poziomu H2O2 w porównaniu z kalusem hodowanym na pożywce bez dodatku NaCl. W ten sposób ustalony poziom RFT sprzyja indukcji potencjału regeneracyjnego. Kontynuując badania nad rolą RFT i enzymów antyoksydacyjnych w regulacji procesów morfogenicznych w kulturach in vitro M. crystallinum uznałam za konieczne opracowanie modelu eksperymentalnego, w którym ilość czynników egzogennych stosowanych do indukcji regeneracji 10 byłaby ograniczona, a także regeneracja przebiegałaby bezpośrednio z komórek eksplantatu, z pominięciem etapu formowania kalusa, którego komórki często wykazują niestabilność fizjologiczną i genetyczną. Dlatego też, opracowałam system regeneracji na drodze ryzogenezy bezpośredniej, stosując do hodowli hypokotyli M. crystallinum pożywkę zawierającą tylko auksynę w postaci 2,4-D lub NAA. Obydwa rodzaje fitohormonów należą do auksyn syntetycznych, które różnią się sposobem oddziaływania na komórki: 2,4-D indukuje głównie podziały komórkowe, natomiast NAA wpływa preferencyjnie na wydłużanie komórek (Campanoni i Nick 2005). W przeprowadzonych doświadczeniach nad indukcją ryzogenezy bezpośredniej wykazałam, że indukcja potencjału morfogenicznego nie zależy od rodzaj auksyny. Zarówno w przypadku obecności w pożywce 2,4-D jak i NAA proces ryzogenezy przebiega z taką samą częstotliwością i obejmuje od 80 do 90% eksplantatów (poz. V. 3. i poz. V. 4.). Badania nad ryzogenezą bezpośrednią rozpoczęłam od wyznaczenia najważniejszych etapów tworzenia korzeni takich jak indukcja kompetencji do ryzogenezy, determinacji i różnicowania. W tym celu wykorzystałam eksperyment transferu tkanek według Christiansona i Warnicka (1983) (poz. V. 3.). Wykazałam, że komórki hypokotyli uzyskują kompetencję - czyli zdolność do reagowania na czynnik indukujący ryzogenezę (w moim doświadczeniu egzogenną auksynę –NAA) w trzecim dniu hodowli. Determinacja rozwoju w kierunku tworzenia korzeni następuje natomiast po pięciu dniach ekspozycji na auksynę. Na podstawie analizy histologicznej procesu ryzogenezy stwierdziłam, że indukcja kompetencji zbiega się w czasie z inicjacją podziałów komórkowych w obrębie walca osiowego. W czasie indukcji determinacji z kolei zaobserwowałam wyodrębnianie się grup komórek w peryferycznych rejonach steli, z których tworzyły się centra merystematyczne, a z nich w kolejnych dniach kultury różnicują się zawiązki korzeni, a następnie korzenie. W celu wykazania udziału RFT oraz enzymatycznych antyoksydantów w procesie ryzogenezy bezpośredniej, analizowałam poziom endogennego H2O2 oraz aktywność wybranych enzymatycznych antyoksydantów takich jak SOD, KAT i POD w kolejnych fazach regeneracji. Na podstawie pomiarów spektrofotometrycznych wykazałam, że we wczesnych etapach ryzogenezy następuje wzrost stężenia endogennego H2O2, a jego najwyższy poziom osiągany jest w czasie indukcji kompetencji do regeneracji. Aktywność enzymów rozkładających H2O2 jest w tym okresie znacznie obniżona. Stwierdziłam również, że dodanie do pożywki kwasu askorbinowego, który jest powszechnie znanym drobnocząsteczkowym antyoksydantem powoduje obniżenie stężenia endogennego H2O2 i zahamowanie ryzogenezy. Wykonując pomiary aktywności fotosyntetycznej oraz oddychania komórkowego, wykazałam, że w czasie indukcji kompetencji intensywność podstawowych procesów anabolicznych i katabolicznych jest niewielka. Z danych literaturowych wynika, że jest to jeden z mechanizmów adaptacyjnych do stresowych warunków kultur in vitro poprzedzający wzrost i rozwój nowych organów (Gaspar i in. 2002). Wyniki moich badań pozwoliły 11 na stwierdzenie, że komórki hypokotyli we wczesnych fazach hodowli na pożywce indukującej ryzogenezę przechodzą w stan przypominający anabiozę, polegający na maksymalnym ograniczeniu procesów metabolicznych, oraz ograniczeniu procesów wzrostowych, a większość posiadanej energii wykorzystują do procesów przeorganizowania aktywności genetycznej koniecznej do rozpoczęcia nowych szlaków rozwojowych. Wyniki pomiarów poziomu endogennego nadtlenku wodoru a także eksperymenty z dodaniem kwasu askorbinowego wykazały, że RFT pełnią istotną rolę regulacyjną we wczesnych etapach ryzogenezy, jednak ich źródłem na tym etapie rozwojowym nie są intensywne procesy metabolizmu podstawowego. W procesach różnicowania i wzrostu korzeni zaobserwowałam spadek ilości endogennego nadtlenku wodoru, co korelowało z podwyższona aktywnością KAT i POD. Stwierdziłam również, że hypokotyle wytwarzające korzenie charakteryzują się wysoką aktywnością zarówno fotosyntetyczną jak i oddechową, co potwierdza, że wzrost i różnicowanie to procesy wymagające nakładu energii. Intensywny metabolizm jest źródłem produkcji RFT, których poziom jest regulowany przez KAT o czym świadczy indukcja w fazie wzrostu korzeni dodatkowej izoformy tego enzymu oznaczonej jako KAT2 oraz POD gwajakolowej biorącej udział w syntezie ścian nowo powstających komórek (Molassiotisi in. 2004). Szczególnie interesującym wynikiem, który uzyskałam podczas prowadzenia opisywanych doświadczeń jest zidentyfikowanie aktywności dodatkowej izoformy SOD oznaczonej jako MnSOD2 w komórkach hodowanych hypokotyli. Indukcję aktywności tej izoformy stwierdziłam już we wczesnych etapach ryzogenezy, tj. w piątym dniu hodowli, w którym obserwowałam podwyższenie poziomu H2O2 oraz formowanie centrów merystematycznych. Aktywność MnSOD2 utrzymywała się przez kolejne dni kultury również w czasie różnicowania i wzrostu korzeni. Natomiast w materiale hodowanym na pożywce w obecności kwasu askorbinowego, w którym nie dochodziło do indukcji ryzogenezy, nie zaobserwowałam indukcji aktywności MnSOD2 przez cały okres kultury. We wcześniejszych doświadczeniach indukcję aktywności tej samej izoformy obserwowano w korzeniach roślin M. crystallinum hodowanych zarówno w warunkach in vivo (Libik i in. 2005, II B5; wykaz opublikowanych prac, załącznik 5) jak i in vitro (Ślesak i Miszalski 2003) wnioskując, że jej aktywność jest organospecyficzna. Uzyskane przeze mnie wyniki badań nad indukcją aktywności MnSOD2 w komórkach kalusa wykazującego potencjał regeneracyjny w kierunku ryzogenezy oraz w kalusie z rozwijającymi się korzeniami wskazały na zależność pomiędzy typem metabolizmu, a indukcją aktywności tej izoformy (poz. V. 1.). Wyniki uzyskane w opisywanej tu pracy wskazują dodatkowo, że aktywność MnSOD2 charakteryzuje zarówno komórki wykazujące niską aktywność metaboliczną w czasie indukcji determinacji do ryzogenezy, jak również komórki wykazujące wzrost aktywności oddechowej i fotosyntetycznej w trakcie procesów różnicowania morfologicznego i wzrostu korzeni. Na podstawie tych informacji stwierdziłam, że indukcja aktywności tego białka nie jest bezpośrednio związana z nasileniem 12 procesów metabolizmu podstawowego. Jednakże można uznać, że ekspresja aktywności MnSOD2 może stanowić biochemiczny marker procesu ryzogenezy w hodowlach in vitro hypokotyli M. crystallinum. Dodatkowo, wciąż nie rozwiązanym zagadnieniem dotyczącym MnSOD2 pozostaje biochemiczna natura tego białka. Wcześniejsze rezultaty opublikowane w pracy Ślesak i Miszalski (2003) wskazujące na wysoką masę cząsteczkową MnSOD2 niespotykaną wśród typowych MnSOD w żadnej grupie organizmów, a także negatywne wyniki przeprowadzonej przeze mnie identyfikacji MnSOD2 za pomocą przeciwciał przeciw MnSOD Arabidopsis thaliana (dane nie publikowane) podały w wątpliwość przynależność badanego białka do rodziny MnSOD. Ślesak i Miszalski (2003) sugerowali, że analizowane białko może należeć do grupy tzw. germin i/lub białek „germinopodobnych” (ang. germin-like proteins, GLP), zwłaszcza, że u M. crystallinum zidentyfikowano korzeniowo-specyficzną GLP, której sekwencja aminokwasowa wykazuje duże podobieństwo do germin i GLP o aktywności MnSOD (Michalowski and Bohnert 1992). Jednakże przeprowadzone przeze mnie w opisywanych doświadczeniach analizy ekspresji genu kodującego korzeniowa specyficzną germinę zidentyfikowaną u M. crystallinum nie potwierdziły obecności transkryptu kodowanego przez ten gen w hodowanych in vitro hypokotlach M. crystallinum na żadnym etapie procesu ryzogenezy, co wyklucza możliwość, że białko oznaczone jako MnSOD2 należy do grupy germin i/lub białek „germinopodobnych”. Podsumowując opisane wyniki należy stwierdzić, że podwyższony endogenny poziom RFT wpływa na indukcję kompetencji do ryzogenezy bezpośredniej w komórkach hypokotyli hodowanych na pożywce zawierającej auksynę. Komórki hodowanych explantatów uzyskują kompetencję do regeneracji po trzech dniach ekspozycji na działanie regulatora wzrostu czemu towarzyszy wzrost poziomu nadtlenku wodoru oraz obniżenie aktywności enzymatycznych antyoksydantów. Wzrost ilości H2O2 nie wynika z aktywności procesów metabolizmu podstawowego. Udział RFT w indukcji kompetencji ryzogenicznej potwierdzają obserwacje nad obniżeniem endogennego poziomu H2O2 i zahamowaniem różnicowania korzeni w obecności kwasu askorbinowego. W kolejnych fazach regeneracji tj. w czasie indukcji determinacji oraz różnicowania morfologicznego i wzrostu korzeni następuje obniżenie poziomu endogennego nadtlenku wodoru czemu towarzyszy wzrost aktywności enzymów antyoksydacyjnych takich jak KAT i POD oraz indukcja aktywności metabolicznej. Na podstawie uzyskanych rezultatów szczególną rolę w procesie regeneracji przypisuję zidentyfikowanej formie SOD oznaczonej jako MnSOD2. Ekspresję aktywności tego białka stwierdziłam w czasie indukcji determinacji do ryzogenezy oraz w czasie różnicowania morfologicznego i wzrostu korzeni i na tej podstawie określiłam, że może ono stanowić biochemiczny marker ryzogenezy w hypokotylach M. crystallinum. Biochemiczna natura i funkcje tego białka nie zostały jeszcze wyjaśnione. Wyniki doświadczeń przeprowadzonych w 13 tej pracy wskazują, że MnSOD2 nie należy do grupy tzw. germin i/lub białek „germinopodobnych”. W publikowanych w ostatnich latach rezultatach badań podkreśla się fakt, że specyfikę odpowiedzi komórek na działanie RFT warunkuje nie tylko rodzaj RFT, ale również miejsce ich produkcji. Szczególną rolę w indukcji odpowiedzi adaptacyjnej komórek roślinnych przypisuje się RFT produkowanym w przestrzeni apoplastycznej przez kompleks enzymatyczny błonowej oksydazy NADPH (NOX) (Sagi i Fluhr 2006, Gechev i in. 2006). Powyższe dane literaturowe skłoniły mnie do przeprowadzenia doświadczeń dotyczących udziału NOX oraz różnych rodzajów RFT w regulacji ryzogenezy w komórkach hypokotyli M. crystallinum (poz. V. 4.). W zastosowanym do badań modelu eksperymentalnym wykorzystałam hypokotyle hodowane na pożywce indukującej ryzogenezę w obecności NAA oraz hypokotyle hodowane na tej samej pożywce uzupełnionej dodatkowo chlorkiem difenylenoiodoniowym (DPI ang. diphenylene iodonium), Związek ten jest powszechnie stosowanym inhibitorem NOX (Riganti i in. 2004). Na podstawie obserwacji morfologicznych stwierdziłam, że obecność DPI w pożywce prowadzi do całkowitej inhibicji procesu ryzogenezy. W wyniku analizy histologicznej hypokotyli hodowanych w obecności DPI stwierdziłam nieliczne podziały w obrębie komórek walca osiowego, które prowadziły do powstania grup komórek parenchymatycznych. Badania aktywności NOX przeprowadzone w oparciu o analizę spektrofotometryczną oraz wizualizację prążków odpowiadających aktywności badanego enzymu na żelach poliakrylamidowych, wykazały zablokowanie aktywności NOX pod wpływem zastosowanego w hodowli DPI. Przeciwnie komórki hypokotyli hodowane na pożywce nie zawierającej DPI, charakteryzowały się indukcją aktywności NOX pod wpływem warunków hodowli, która korelowała z wysoką aktywnością mitotyczną komórek w obrębie walca osiowego. Aktywność NOX była najwyższa w trakcie intensywnych podziałów komórek w obrębie walca osiowego hypokotyli prowadzących do powstania merystemoidów, natomiast wraz z rozwojem korzeni aktywność tego enzymu stopniowo obniżała się. Na podstawie tych wyników założyłam, że wzrost aktywność NOX prowadzi do nadprodukcji RFT, które odgrywają znaczącą rolę w indukcji procesów ryzogenezy. Wyniki pomiarów stężenia nadtlenku wodoru, potwierdziły moje założenie i wykazały, że wzrost aktywności NOX koreluje ze wzrostem ilości nadtlenku wodoru w komórkach hypokotyli we wczesnych stadiach indukcji ryzogenezy. Natomiast zahamowanie aktywności NOX koreluje z niskim poziomem nadtlenku wodoru w hodowanych w obecności DPI hypokotylach, które nie wykazują zdolności do ryzogenezy. Na podstawie badań ultrastrukturalnych nad lokalizacją nadtlenku wodoru przeprowadzonych we współpracy z dr hab. Małgorzatą Kozieradzką-Kiszkurno z Katedry Cytologii i Embriologii Roślin Uniwersytetu Gdańskiego, wykazałam, że H2O2 generowany jest głównie w apoplaście intensywnie dzielących się komórkach walca osiowego oraz w komórkach kory pierwotnej hypokotyli 14 wykazujących ryzogenezę, a także hypokotyli nieryzogenicznych hodowanych w obecności DPI. Jednakże zaobserwowałam pewne różnice w rozmieszczeniu elektronowo gęstych precypitatów nadtlenku ceru, powstałych w reakcji chlorku ceru z H2O2, pomiędzy analizowanymi komórkami. W hypokotylach wykazujących ryzogenezę, w obrębie walca osiowego precypitaty, były widoczne po stronie wewnętrznej ściany komórkowej, podczas gdy w komórkach kory pierwotnej ich obecność ograniczona była do blaszki środkowej. W hypokotylach nieryzogenicznych, hodowanych na pożywce z DPI, precypitaty były również widoczne, ale tylko w komórkach kory pierwotnej, gdzie zlokalizowany były głównie w przestrzeniach międzykomórkowych sąsiadujących ze sobą komórek. Te wyniki skłoniły mnie do sformułowania wniosku, że w różnych tkankach hypokotyli M. crystallinum poziom H2O2 jest regulowany przez różne elementy systemu antyoksydacyjnego. W komórkach walca osiowego, w których rozpoczyna się proces ryzogenezy poziom RFT regulowany jest przez NOX, która tym samym jest odpowiedzialna za produkcję RFT biorących udział w procesie ryzogenezy, natomiast w komórkach kory pierwotnej nie uczestniczących w tworzeniu nowych organów regulacyjną role poziomu RFT mogą spełniać peroksydazy związane ze ścianą komórkową. Przemawia za tym fakt, że w hypokotylach nieryzogenicznych hodowanych w obecności inhibitora NOX również obserwowałam obecność licznych precypitatów nadtlenku ceru w komórkach kory pierwotnej. Być może wynika to z odmiennej roli jaką pełnią RFT w badanych komórkach. Komórki kory pierwotnej hypokotyli, narażone są na stres mechaniczny związany z naporem powiększającego się wskutek podziałów walca osiowego. Komórki kory pierwotnej reagują wytwarzając mechanizmy usztywniające ścianę komórkową, w których uczestniczy H2O2, natomiast w komórkach walca osiowego, podlegających licznym podziałom na skutek wysokiej aktywności mitotycznej, indukowane są mechanizmy rozluźniające strukturę ściany komórkowej, w których bierze udział O2•-. Wizualizację rozmieszczenia rodzajów RFT w hodowanych in vitro hypokotylach przeprowadziłam na poziomie histologicznym, wykorzystując barwienie anionorodnika ponadtlenkowego błękitem nitrotetrazolowym (NBT, ang. nitrotetrazolium blue) lub nadtlenku wodoru diaminobenzydyną (DAB, ang 3,3′-diaminobenzidine). Badania te wykonałam w ramach nawiązanej współpracy z dr Christine Desel podczas pobytu na stażu naukowym w Instytucie Botaniki na Uniwersytecie w Kilonii w Niemczech. Na podstawie tych analiz wykazałam, że różne rodzaje RFT (O2•- i H2O2) są produkowane i akumulowane w różnych częściach eksplantatów w kolejnych fazach tworzenia korzeni. We wczesnych stadiach ryzogenezy, na etapie indukcji aktywności mitotycznej w komórkach walca osiowego oraz formowania centrów merystematycznych, zaobserwowałam wysokie stężenie O2•- w obrębie walca osiowego, natomiast H2O2 w obszarze kory pierwotnej oraz w tkance przewodzącej hypokotyli. Różnice w lokalizacji analizowanych RFT wykazałam również na etapie różnicowania się korzeni. Zaobserwowałam, że akumulacja O2•- związana jest głównie z obszarem formowania merystemu apikalnego nowych organów oraz ze strefą wydłużania się 15 komórek, podczas gdy H2O2 rozmieszczony jest głównie w komórkach tworzących system tkanek przewodzących nowych organów. Uzyskane rezultaty wskazują jednoznacznie, że: wzrost aktywności NOX zbiega się w czasie ze wzrostem stężenia endogennego H2O2 i indukcją aktywności mitotycznej w komórkach walca osiowego hypokotyli. Sugeruje to, że RFT produkowane przez NOX odgrywają istotną rolę w indukcji ryzogenezy w kulturach in vitro hypokotyli M. crystallinum. Wskazują na to również wyniki moich badań przeprowadzonych na hypokotylach rosnących w obecności inhibitora NOX w pożywce. Wykazały one, że inhibicja aktywności NOX powoduje obniżenie stężenia endogennego H2O2 oraz zahamowanie ryzogenezy. Różnice w rozmieszczeniu H2O2 na poziomie ultrastrukturalnym pomiędzy komórkami walca osiowego i kory pierwotnej wynikają z zaangażowania specyficznych elementów systemu antyoksydacyjnego w regulację stężenia RFT w komórkach tych tkanek. W aktywnych mitotycznie komórkach walca osiowego O2•- uczestniczy w rozluźnianiu ściany komórkowej, a jego poziom regulowany jest przez NOX. W komórkach kory pierwotnej H2O2 uczestniczy w procesach prowadzących do usztywniania ścian komórek, a jego stężenie regulują prawdopodobnie POD związane ze ścianą komórkową. Odmienna lokalizacja O2•i H2O2 na poziomie histologicznym wskazuje również na różną funkcję poszczególnych rodzajów RFT. Obecność O2•- w walcu osiowym hypokotyli ryzogenicznych oraz merystemie apikalnym i strefie wydłużania komórek w nowopowstałych korzeniach wskazuje, że miejsce intensywnej produkcji O2•- związane jest z obszarami aktywności podziałowej i procesami wydłużania się komórek, które wymagają obecności tej formy RFT do rozluźniania ścian komórek. Natomiast lokalizacja H2O2 w korze pierwotnej zarówno hypokotyli ryzogenicznych jak i hypokotyli nieryzogenicznych, a także w tkankach przewodzących zregenerowanych korzeni przemawia za udziałem tej formy RFT w mechanizmach usztywniania ścian komórek, które związane są między innymi z procesami różnicowania. 3. Najważniejsze osiągnięcia W publikacjach składających się na osiągnięcie naukowe będące podstawą do ubiegania się o stopień doktora habilitowanego udowodniłam zaangażowanie RFT w indukcję procesów morfogenezy oraz wykazałam regulacyjną rolę elementów systemu antyoksydacyjnego w ustaleniu poziomu stresu oksydacyjnego optymalnego do indukcji potencjału regeneracyjnego w hodowlach in vitro hypokotyli Mesembryanthemum crystallinum L.. Postawiony w przedstawionym cyklu publikacji cel zrealizowałam w oparciu o wielopłaszczyznowe badania na poziomie histologicznym, ultrastrukturalnym jak i biochemicznym w odniesieniu do dwóch systemów eksperymentalnych: organogenezy pośredniej i organogenezy bezpośredniej. Na podstawie uzyskanych rezultatów wykazałam, że: 16 1/ linie kalusów posiadające różny potencjał regeneracyjny oraz wykazujące różny typ morfogenezy charakteryzują się odmienną aktywnością enzymów antyoksydacyjnych regulujących poziom endogennego nadtlenku wodoru. 2/ wysokie stężenie H2O2, niska aktywność KAT, a także indukcja dodatkowej izoformy SOD, określonej jako MnSOD2, towarzyszy indukcji potencjału regeneracyjnego na drodze ryzogenezy w komórkach kalusa. 3/ indukcja danej ścieżki rozwojowej może zależeć od typu metabolizmu, który realizują różnicujące się komórki kalusa: heterotrofizm koreluje z rozwojem korzeni natomiast autotrofizm towarzyszy rozwojowi zarodków somatycznych. 4/ stres solny aplikowany w czasie indukcji regeneracji w hodowlach kalusa wpływa na potencjał regeneracyjny na skutek zaangażowania specyficznych elementów systemu antyoksydacyjnego, takich jak prolina, w regulację poziomu RFT. 5/ stres oksydacyjny wywołany warunkami hodowli na pożywce pozbawionej chlorku sodu powoduje wysoką aktywność SOD i KAT oraz niską aktywność POD i APX, co skutkuje ustaleniem wysokiego poziomu H2O2, na który komórki kalusa reagują brakiem zdolności do regeneracji na korzyść syntezy i akumulacji betacyjanin. 6/ wysoki poziom nadtlenku wodoru oraz obniżenie aktywności enzymatycznych antyoksydantów jest niezbędne do uzyskaniu kompetencji do ryzogenezy przez komórki hodowanych in vitro hypokotyli. W czasie indukcji kompetencji hypokotyle wykazują niskie natężenie procesów fotosyntezy i oddychania komórkowego co wskazuje, że te dwa procesy nie stanowią źródła nadprodukcji RFT na tym etapie regeneracji in vitro. 7/ w czasie indukcji determinacji i różnicowania morfologicznego oraz wzrostu korzeni następuje obniżenie poziomu endogennego nadtlenku wodoru czemu towarzyszy wzrost aktywności enzymów antyoksydacyjnych takich jak KAT i POD oraz indukcja aktywności metabolicznej. 8/ MnSOD2 można uznać za biochemiczny marker ryzogenezy w hodowlach in vitro hypokotyli M. crystallinum ponieważ ekspresja jego aktywności towarzyszy indukcji determinacji do regeneracji oraz różnicowaniu morfologicznemu i wzroście korzeni. 9/ MnSOD2 nie należy do grupy białek z rodziny germin i/lub białek „germinopodobnych”, a jego natura biochemiczna powinna zostać dokładnie sprecyzowana ze względu na specyficzne cechy biochemiczne podające w wątpliwość przynależność tego białka do rodziny dysmutaz ponadtlenkowych. 10/ kompleks enzymatyczny błonowej oksydazy NADPH (NOX), produkującej anionorodnik ponadtlenkowy w przestrzeni apoplastycznej odgrywa znaczącą rolę w produkcji RFT zaangażowanych w indukcję kompetencji do regeneracji na drodze ryzogenezy bezpośredniej z komórek hypokotyli M. crystallinum. 17 11/ różne rozmieszczenie H2O2 na poziomie ultrastrukturalnym pomiędzy komórkami walca osiowego i kory pierwotnej hodowanych hypokotyli w czasie indukcji kompetencji do ryzogenezy wynika z zaangażowania specyficznych elementów systemu antyoksydacyjnego w regulację stężenia RFT w komórkach tych tkanek. W aktywnych mitotycznie komórkach walca osiowego poziom RFT, które uczestniczą w rozluźnianiu ściany komórkowej, regulowany jest przez NOX. W komórkach kory pierwotnej regulacyjną rolę pełnią prawdopodobnie POD związane ze ścianą komórkową. W komórkach kory pierwotnej, H2O2 wykorzystywany jest w procesach prowadzących do usztywniania ścian. 12/ odmienna lokalizacja O2•- i H2O2 na poziomie histologicznym wskazuje na różną funkcję poszczególnych rodzajów RFT w procesie ryzogenezy bezpośredniej. Miejsca intensywnej produkcji O2•związane są z obszarami aktywności podziałowej w walcu osiowym hypokotyli i procesami wydłużania się komórek w nowopowstałych korzeniach. Natomiast lokalizacja H2O2 w korze pierwotnej hypokotyli oraz w tkankach przewodzących nowych korzeni przemawia za udziałem tej formy RFT w mechanizmach usztywniania ścian komórek, które związane są między innymi z procesami różnicowania. Większość badań przedstawionych w opisanym cyklu publikacji została sfinansowana ze środków kierowanego przeze mnie projektu badawczego o numerze N303 356935 przyznanego w roku 2008 przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego (XI 6, wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). 4. Kierunki i perspektywy dalszych badań Kontynuując badania nad rolą RFT i systemu antyoksydacyjnego w morfogenezie in vitro M. crystallinum chciałabym skoncentrować się na identyfikacji specyficznego dla ryzogenezy bialka o aktywności dysmutazy ponadtlenkowej, oznaczonego jako MnSOD2. W celu określenia jego chemicznej natury konieczna jest kompleksowa analiza proteomiczna związana z oczyszczeniem korzeniowo-specyficznego białka wykazującego aktywność dysmutazową, a następnie analiza jego sekwencji z zastosowaniem spektrometrii masowej i dostępnych narzędzi bioinformatycznych. Na podstawie uzyskanych w ten sposób wyników będzie można z dużym prawdopodobieństwem oznaczyć przynależność MnSOD2 do konkretnej grupy białek oraz wnioskować o jego specyficznej funkcji. Realizacja tego celu będzie możliwa dzięki nawiązanej przeze mnie współpracy z prof. S. Lüthje, która kieruje laboratorium Stresu Oksydacyjnego i Proteomiki Roślin na Wydziale Biologii Uniwersytetu w Hamburgu w Niemczech. Obecnie, dzięki nawiązanej współpracy trwają badania nad analizą proteomiczną i identyfikacją białek specyficznie aktywnych w kolejnych etapach ryzogenezy w hypokotylach M. crystallinum L. 18 Kolejnym interesującym mnie zagadnieniem, które wynikło w trakcie prowadzonych doświadczeń jest możliwość indukcji syntezy i akumulacji betacyjanin w komórkach kalusa M. crystallinum w odpowiedzi na warunki stresowe wynikające z czynników kultury. Dotychczas nie przeprowadzono wielu doświadczeń nad indukcją syntezy tych metabolitów wtórnych w odpowiedzi na działanie różnych stresorów. Wyniki doświadczeń nad indukcją syntezy betacyanin w odpowiedzi na stres mogą mieć nie tylko znaczenie dla nauk podstawowych ze względu na określenie roli tych metabolitów wtórnych w fizjologii roślin, ale również mogą mieć znaczenie aplikacyjne. Betacyjaniny są bowiem wykorzystywane w formie dodatków do żywności jako naturalne preparaty koloryzujące. Ponadto, wiele badań wskazuje na ich pozytywne oddziaływanie na organizm człowieka. Ze względu na właściwości przeciwutleniające mogą one odgrywać rolę w prewencji chorób degeneracyjnych i nowotworowych (Klewicka 2012). W Europie najpopularniejszym źródłem betacyjanin jest burak ćwikłowy (Beta vulgaris L. subsp. vulgaris) (Pavoković i KrsnikRasol 2011), jednakże uzyskiwane z tego źródła ekstrakty nie zawierają specyficznych tylko dla M. crystallinum betacyanin (Voght i in. 1999, Ibdah i in. 2002), których rola pod względem prozdrowotnym również nie została poznana. Poważnym utrudnieniem w badaniach nad fizjologią M. crystallinum jest brak systemu regeneracji roślin transgenicznych. Chociaż opisano kilka metod transformacji tej rośliny, dotychczasowe próby uzyskania transformantów zakończyły się niepowodzeniem (Andolfatto i in. 1994; Ishimaru 1999; Konieczny i in. 2011). Przypuszcza się, że jedną z przyczyn niepowodzeń w regeneracji transgenicznego przypołudnika kryształkowego jest zaburzenie homeostazy hormonalnej w transformowanej tkance (Konieczny i in. 2011). W najbliższej przyszłości planuję badania związane z testowaniem różnych metod transformacji oraz różnych konstruktów genetycznych, m.in. pozbawionych genów rol, w celu uzyskania GMO M. crystallinum o podobnym do roślin macierzystych profilu fizjologicznym. Uzyskanie transformantów po wprowadzeniu konstrukcji genowej wywołującej wyciszenie albo nadekspresję genów kodujących enzymatyczne elementy systemu antyoksydacyjnego umożliwiłoby przeprowadzenie interesujących mnie badań nad identyfikacją genów związanych z wysoką odpornością M. crystallinum na czynniki stresowe i ich rolą w procesach morfogenezy. VII. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo – badawczych: Oprócz czterech prac omówionych powyżej, stanowiących treść osiągnięcia naukowego, mój dorobek naukowy obejmuje 19 publikacji, w których w 8 jestem pierwszym autorem, w tym w 5 opublikowanych po uzyskaniu stopnia doktora nauk biologicznych, a w 11 publikacjach jestem współautorem (IIA i B, wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). W moim dorobku naukowym 19 znajduje się również rozdział w książce pt: „The facultative halophyte Mesembryanthemum crystallinum L. as a model plant in oxidative stress studies”, którego jestem współautorem (III 1, wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). Jestem również autorem i współautorem 27 doniesień konferencyjnych prezentowanych w kraju lub na forum międzynarodowym w formie posterów oraz w formie doniesień ustnych (V i VIA, B, C, wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). Mój dorobek naukowy obejmuje także kierownictwo w 2 projektach badawczych oraz wykonawstwo w 8 projektach w tym w 1 projekcie współfinansowanym ze środków Unii Europejskiej (XI, wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). Za działalność naukową uzyskałam 2 nagrody: Dyrektora Instytutu Fizjologii Roślin za pracę doktorską oraz Dyplom uznania V Wydziału Nauk Rolniczych Leśnych i Weterynaryjnych PAN za cykl prac badawczych „Regulacja równowagi redoksowej w tkankach asymilacyjnych liści” (XIII, wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). 1. Osiągnięcia w pracy badawczej przed uzyskaniem stopnia doktora W czasie studiów magisterskich uzyskałam stypendium w ramach programu Tempus, dzięki któremu studiowałam przez okres sześciu miesięcy na Uniwersytecie w Manchester w Wielkiej Brytanii, gdzie ukończyłam kursy z zakresu: fizjologii roślin, genetyki oraz biotechnologii (XVII 1, wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). Pobyt na stypendium w Wielkiej Brytanii umożliwił mi nie tylko zdobycie wiedzy w ramach wymienionych kursów oraz sprecyzowanie swoich zainteresowań biologicznych w zakresie fizjologii i biotechnologii roślin, ale również pozwolił na poszerzenie umiejętności językowych, dzięki którym uzyskałam dyplom First Certificate in English. W okresie studiów magisterskich przebywałam również przez okres trzech miesięcy na stażu naukowym w ramach programu Tempus, na Wydziale Cytologii i Morfologii Roślin Uniwersytetu Rolniczego w Wageningen w Holandii (Department of Plant Cytology and Morphology, Agricultural University of Wageningen) (XVII 2, wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). Podczas tego stażu miałam możliwość uczestniczenia w eksperymentach naukowych dotyczących przebiegu zapłodnienia oraz rozwoju zarodka w wyniku zapylenia międzygatunkowego pszenicy pyłkiem kukurydzy. Badania te były prowadzone pod kierunkiem prof. A. Lammeren’a. oraz prof. dr hab. M. Wędzony. Uzyskane wyniki zostały opublikowane w pracy: Wędzony i Lammeren. (1996), a mój udział w uzyskaniu wyników opisanych w publikacji, został uwzględniony w podziękowaniach. W czasie stażu naukowego na Uniwersytecie Rolniczym w Wageningen miałam także możliwość zapoznania się z metodyką izolowania żywotnych gametofitów oraz protoplastów komórek gametofitu żeńskiego u Petunia hybrida L. w laboratorium prof. J. van Went’a. Zdobyte umiejętności eksperymentalne wykorzystałam do doświadczeń wykonywanych w ramach pracy magisterskiej w Zakładzie Cytologii i Embriologii Roślin UJ pod kierunkiem prof. dr hab. L. 20 Przywary. Opracowałam metodykę izolowania woreczków zalążkowych u kilku gatunków roślin Angiospermae, a wyniki moich eksperymentów opisałam w pracy magisterskiej, którą obroniłam z wyróżnieniem w roku 1994. Wiedzę zdobytą w trakcie przygotowania pracy magisterskiej wykorzystałam również do przygotowania publikacji o charakterze przeglądowym (IIA 1, wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). Opracowana przeze mnie metodyka izolowania gametofitów żeńskich jest dotychczas wykorzystywana w Zakładzie Cytologii i Embriologii Roślin UJ i prezentowana w czasie kursu dla studentów biologii pt. „Kultury in vitro i eksperymentalna embriologia roślin”. Po uzyskaniu dyplomu magistra biologii rozpoczęłam studia III stopnia jako słuchaczka Środowiskowego Studium Doktoranckiego na Wydziale Biologii i Nauk o Ziemi UJ. W trakcie studiów doktoranckich otrzymałam roczne stypendium badawcze, ufundowane przez rząd włoski, na pobyt w Instytucie Biologii Uniwersytetu w Padwie we Włoszech (Department of Biology, University of Padova) (XVIII 1, wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). W czasie stypendium zostałam włączona w cykl badań nad charakterystyką biochemiczną i funkcją białka wiążącego wapń – kalretikuliny w komórkach roślinnych. Badania te były prowadzone w Laboratorium Biologii Komórki Roślinnej kierowanym wówczas przez prof. P. Mariani (obecnie kierownikiem jest prof. B. Baldan). W czasie kiedy rozpoczynałam staż, wiedza na temat występowania i funkcji kalretikuliny w komórkach roślinnych była niewielka, a Laboratorium Biologii Komórki Roślinnej Uniwersytetu w Padwie było jednym z pierwszych, które rozpoczęło badania nad tym białkiem u roślin. Z doświadczeń prowadzonych wcześniej na komórkach zwierzęcych wiadomo było, że kalretikulina jest białkiem wielofunkcyjnym, zlokalizowanym głównie w siateczce śródplazmatycznej, a jej podstawową funkcją jest magazynowanie i uwalnianie jonów wapnia. Ponieważ jony wapnia pełnią w komórce funkcje wtórnego przekaźnika informacji, a ich stężenie jest regulowane przez białka wiążące Ca2+ (Roberts i Harmon 1992) zakładano, że ilość i rozmieszczenie kalretikuliny może mieć kluczowe znaczenie dla przebiegu podstawowych procesów metabolicznych, a także reakcji o charakterze wzrostowym. Celem prowadzonych przeze mnie badań było wyizolowanie, charakterystyka biochemiczna oraz określenie funkcji kalretikuliny z komórek marchwi (Daucus carota L.). Wszystkie wyniki zostały później włączone do mojej rozprawy doktorskiej pt. „Charakterystyka biochemiczna, lokalizacja i funkcje białka wiążącego wapń-kalretikuliny w kulturach in vitro Daucus carota L.” którą obroniłam w roku 1999. W ramach pracy doktorskiej, doświadczenia prowadziłam na kalusie wyprowadzonym z roślin marchwi typu dzikiego oraz na mutancie temperaturowym oznaczonym jako ts11 (ang. temperature sensitive mutant 11). Wcześniej, u tego mutanta opisano zaburzenia procesu somatycznej embriogenezy polegające na zablokowaniu rozwoju zarodków w stadium globularnym (Baldan i in. 1997). W pracy doktorskiej wykazałam obecność kalretikuliny zarówno w komórkach kalusa marchwi pochodzącego z linii typu dzikiego jak również w komórkach linii mutanta ts11. Stwierdziłam 21 również, że zarówno komórki linii typu dzikiego jak i komórki linii mutanta ts11 wydzielają niezmienioną pod względem badanych cech biochemicznych kalretikulinę do pożywki w początkowych etapach różnicowania, tj. w czasie stadium indukcji kompetencji do regeneracji, podczas gdy w późniejszych stadiach rozwojowych zarodków somatycznych sekrecji nie obserwowałam. W pracy doktorskiej wysunęłam hipotezę, że sekrecja kalretikuliny nie jest związana bezpośrednio z procesem regeneracji zarodków somatycznych, ale z działaniem czynników stresowych towarzyszących kulturze in vitro. Opracowałam również po raz pierwszy charakterystykę biochemiczną kalretikuliny pochodzącej z obydwu badanych linii marchwi (formy dzikiej i mutanta ts11) określając jej masę cząsteczkową, zdolność wiązania jonów wapnia, typ glikozylacji oraz obecność sekwencji retencyjnej HDEL/KDEL. Analizując te dane wykazałam, że mutacja w linii komórek ts11 nie powoduje zmian w wyżej wymienionych cechach biochemicznych kalretikuliny. Na podstawie sekwencji aminokwasów i specyficznej sekwencji retencyjnej HDEL (u roślin) w cząsteczce badanego białka wnioskowano, że kalretikulina jest białkiem rezydującym w siateczce śródplazmatycznej (Vitale i in. 1993). W ówczesnej literaturze brakowało jednak danych dotyczących histologicznej lokalizacji kalretikuliny. Nie wiadomo było czy w czasie rozwoju zarodków somatycznych badane białko występuje preferencyjnie w pewnych tkankach czy jego rozkład jest homogenny, oraz czy istnieją różnice w jego rozmieszczeniu pomiędzy komórkami linii dzikiej i mutanta ts11. W badaniach wchodzących w skład rozprawy doktorskiej przeprowadziłam immunodetekcję kalretikuliny. Technik tych nauczyłam się w ramach kursu “Calcium signals in plant cells under cold acclimation” zorganizowanym przez Szkołę Wyższą im. Św. Anny w Pizie (Scuola Superiore di Studi Universitari e di Perfezionamento S. Anna, Pisa, Italy), prowadzonym przez prof. S. Lindberg z Wydziału Biologii Roślin Uniwersytetu w Upsali (Department of Plant Biology and Forest Genetics, Swedish University of Agricultural Sciences in Uppsala), (XVIII 2; wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). W badaniach, które po powrocie z Włoch kontynuowałam w Zakładzie Cytologii i Embriologii Roślin UJ, nie zaobserwowałam różnic w rozmieszczeniu subkomórkowym kalretikuliny między liniami mutanta a formy dzikiej. W obu przypadkach kalretikulina obecna była na terenie cytoplazmy. Jednak zauważyłam, że w trakcie kolejnych etapów rozwoju zarodków somatycznych białko to preferencyjnie gromadzone było w protodermie. Wyniki moich doświadczeń potwierdziły wcześniejsze doniesienia dotyczące rozkładu jonów wapnia w czasie somatycznej embriogenezy w hodowlach zawiesinowych marchwi (Timmers i in. 1996). Dodatkowo, korelując rozmieszczenie kalretikuliny z lokalizacją jonów wapnia wysunęłam hipotezę, że badane przeze mnie białko pośrednio uczestniczy w rozwoju zarodków somatycznych poprzez kontrolowanie poziomu Ca2+ będących wtórnym przekaźnikiem sygnałów warunkujących cyto- i histodyferencjację. W roku 1998 zostałam zatrudniona w Zakładzie Cytologii i Embriologii Roślin UJ na stanowisku asystenta. W tym czasie miałam możliwość prowadzenia zajęć ze studentami I roku 22 biologii w ramach przedmiotu „Biologia ogólna” oraz ze studentami wyższych lat studiów biologicznych w ramach kursu „Kultury in vitro i eksperymentalna embriologia roślin”. Po roku pracy w Zakładzie Cytologii i Embriologii Roślin UJ otrzymałam propozycję pracy w Zakładzie Biologii Stresu w Instytucie Fizjologii Roślin Polskiej Akademii Nauk (IFR PAN) w Krakowie. Ze względu na moje zainteresowania zagadnieniami z zakresu fizjologii roślin, a zwłaszcza oddziaływaniem różnych czynników stresowych na procesy metaboliczne w komórkach roślinnych, podjęłam decyzję o kontynuowaniu pracy naukowej w IFR PAN w Krakowie. Pracę doktorską obroniłam na Wydziale Biologii i Nauk o Ziemi UJ będąc już pracownikiem Zakładu Biologii Stresu IFR PAN. Moja praca doktorska została wyróżniona przez Radę Instytutu Botaniki UJ i nagrodzona przez Dyrekcję Instytutu Fizjologii Roślin PAN (XIII 1, wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). Wyniki uzyskane w czasie wykonywania doświadczeń do pracy doktorskiej prezentowałam w formie posterów na konferencjach międzynarodowych (V 1 i 2, VI C1; wykaz opublikowanych prac, załącznik 5) oraz w formie publikacji (II A2 i 3, II B1; wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). 2. Osiągnięcia w pracy badawczej po uzyskaniu stopnia doktora Obszar moich zainteresowań badawczych obejmuje: A. badania nad udziałem reaktywnych form tlenu (RFT) i systemu antyoksydacyjnego w indukcji metabolizmu typu CAM u M. crystallinum B. zagadnienia związane z regulacyjną rolą stresu oksydacyjnego w procesach organogenezy w warunkach in vitro C. badania nad rolą systemu antyoksydacyjnego w indukcji mechanizmów obronnych przed działaniem czynników stresu środowiskowego u różnych gatunków roślin D. badania nad wpływem stresu oksydacyjnego na syntezę i akumulację metabolitów wtórnych ad. A. W Zakładzie Biologii Stresu IFR PAN uczestniczyłam w badaniach prowadzonych pod kierunkiem prof. dr hab. Zbigniewa Miszalskiego. Badania te dotyczyły charakterystyki systemu antyoksydacyjnego i jego roli w indukcji metabolizmu typu CAM u Mesembryanthemum crystallinum (przypołudnik kryształkowy). Aktywność elementów systemu antyoksydacyjnego pozwala na ustalenie poziomu RFT, który nie zagraża komórce, a wręcz przeciwnie, może wpływać na indukcję genów, które kodują białka odgrywające istotną rolę w odpowiedzi roślin w kierunku przystosowania do działającego czynnika stresowego (Apel i Hirt 2004). Indukcja i funkcjonowanie metabolizmu typu CAM wpływa na ograniczenie strat wody na drodze respiracji na skutek 23 zamykania aparatów szparkowych w dzień i pobierania CO2 nocą. Zabezpiecza także przed nadmierną fotorespiracją zapewniając wysoką sprawność fotosyntetyczną w niekorzystnych warunkach stresu wodnego i solnego. W Zakładzie Biologii Stresu IFR PAN powstało szereg prac naukowych opisujących udział enzymatycznych antyoksydantów w zmianie poziomu endogennych RFT towarzyszącej transformacji metabolicznej C3/CAM (Miszalski i in. 1998, Niewiadomska i in. 1999, Niewiadomska i in. 2002, Ślesak i in. 2002, Ślesak i in. 2003). Zależność między indukcją CAM w warunkach stresu solnego, a stresem oksydacyjnym spowodowanym nadprodukcją RFT potwierdzano korelując dobowe oscylacje w poziomie akumulacji jabłczanu oraz aktywność enzymów antyoksydacyjnych tj. dysmutaza ponadtlenkowa (SOD) i katalaza (KAT), w komórkach liści M. crystallinum. Przystępując do moich doświadczeń założyłam, że sygnał prowadzący do zapoczątkowania fotosyntezy typu CAM indukowany jest w korzeniach, które jako pierwsze reagują na niedobór wody w podłożu spowodowany silnym zasoleniem. Aby to potwierdzić analizowałam zmiany w dobowym stężeniu jabłczanu oraz zmiany w aktywności SOD i KAT w poszczególnych organach roślin poddanych stresowi zasolenia (II B3, II B5; wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). Na podstawie przeprowadzonych doświadczeń wykazałam że: (1) niewielkie dobowe oscylacje w ilości jabłczanu odnotowuje się w korzeniach badanych roślin, co wskazuje, że metabolit ten może być akumulowany również w niefotosyntetyzujących częściach roślin, w których może pełnić rolę osmoprotektanta oraz transportera pobranych z gleby jonów, (2) we wszystkich częściach rośliny odnotowuje się dobowe oscylacje w stężeniu jabłczanu produkowanego w wyniku nocnego wiązania CO2, a najwyższe stężenie tego metabolitu występuje w łodygach i części bazalnej młodych liści roślin poddanych stresowi solnemu, (3) we wszystkich badanych organach rośliny występują oscylacje dobowe w aktywności SOD oraz KAT, przy czym najwyższą aktywność SOD obserwuje się w łodygach roślin poddanych stresowi solnemu, (4) wyniki te wskazują na indukcję stresu oksydacyjnego we wszystkich badanych organach, który towarzyszy indukcji metabolizmu CAM, przebiegającego z największą intensywnością w łodygach M. crystallinum. W badaniach nad rolą stresu oksydacyjnego w indukcji metabolizmu CAM u przypołudnika kryształkowego prowadziłam pomiary stężenia endogennego H2O2 w roślinach poddanych działaniu stresu solnego oraz w roślinach kontrolnych (II B9 wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). Na podstawie wcześniejszych badań na roślinach M. crystallinum, wykazujących metabolizm typu CAM stwierdzono, że na skutek zamknięcia aparatów szparkowych w ciągu dnia, stężenie tlenu w liściach znacznie przewyższa stężenie tego gazu w atmosferze (Miszalski i in. 1998). Wysokie stężenie tlenu doprowadza do powstawania nadmiernej ilości RFT, co z kolei stymuluje aktywność elementów systemu antyoksydacyjnego, które usuwają najbardziej reaktywne formy tlenu, np. anionorodnik ponadtlenkowy (O2•-) czy też rodnik hydroksylowy (•OH) przekształcając je w mniej reaktywny nadtlenek wodoru. Celem naszych doświadczeń było wykazanie czy różnice w 24 endogennym poziomie H2O2 między roślinami M. crystallinum, hodowanymi w warunkach stresu solnego i warunkach bez stresu, są efektem działania stresora zasolenia czy też wynikają z funkcjonowania metabolizmu CAM. Na podstawie otrzymanych wyników stwierdziliśmy, że: (1) wzrost stężenia nadtlenku wodoru znacznie wyprzedza indukcję metabolizmu CAM i jest związany głównie z działaniem stresora zasolenia, (2) po wykształceniu się funkcjonalnego metabolizmu typu CAM zawartość H2O2 obniża się, czyli sam metabolizm typu CAM ma charakter przystosowawczy i nie odpowiada bezpośrednio za zwiększoną produkcję H2O2, (3) poziom nadtlenku wodoru wzrasta początkowo w obrębie głównego nerwu liści, a następnie rozprzestrzenia się na całą blaszkę liściową, co wskazuje na znaczący udział tkanki przewodzącej oraz tkanek otaczających ksylem i floem w produkcji oraz transporcie H2O2. Wyniki te korelują z rezultatami uzyskanymi w doświadczeniach nad aktywnością enzymatycznych antyoksydantów w poszczególnych organach M. crystallinum, na podstawie których stwierdzono wysoką aktywność SOD w komórkach tkanek łodygi (II B5; wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). Wnioski dotyczące pierwszeństwa stresu oksydacyjnego względem indukcji metabolizmu typu CAM znalazły potwierdzenie w doświadczeniach przeprowadzonych na mutancie M. crystallinum, niezdolnym do zmiany metabolizmu C3 na CAM (mutant 351). Wykazały one, że zasolenie powodowało większy wzrost aktywności enzymów antyoksydacyjnych w roślinach mutanta niż w roślinach typu dzikiego, (Borland i in. 2006). Podczas pobytu na stażu naukowym w Laboratorium Ekofizjologii i Biologii Molekularnej na Uniwersytecie w Newcastle w Wielkiej Brytanii (School of Biology, Newcastle University) (XVII 3, wykaz opublikowanych prac, załącznik 5) miałam możliwość uczestniczenia w doświadczeniach przeprowadzanych na mutancie 351 M. crystallinum oraz roślinach typu dzikiego, gdzie pod kierunkiem dr A. Borland nauczyłam się nowych technik, tj. pomiaru aktywności oksydazy cytochromowej (COX, ang. cytochrome c oxidase) oraz pomiaru stężenia zredukowanej i utlenionej formy askorbinianu i glutationu. Metodyka ta została wdrożona do analiz prowadzonych w Zakładzie Biologii Stresu IFR PAN (Niewiadomska i in. 2004). Zagadnienie zaangażowania stresu oksydacyjnego w wywoływaniu transformacji C3-CAM stało się tematem cyklu badań nad indukcją nadmiernej produkcji RFT w roślinach M. crystallinum wywołanej innymi niż zasolenie czynnikami stresowymi. Jednym z takich doświadczeń, w którym brałam czynny udział były eksperymenty dotyczące wpływu stresu oksydacyjnego wywołanego przez fumigację SO2 i oddziaływanie siarczynu na indukcję metabolizmu CAM u M. crystallinum (II B7, wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). Doświadczenia przeprowadzone w tej pracy miały na celu wykazanie czy do indukcji transformacji metabolicznej mogą przyczyniać się RFT, generowane w nadmiarze w konkretnym organellum komórkowym na skutek specyficznego działania czynnika stresowego. W przypadku oddziaływania na rośliny stresem siarkowym, stres oksydacyjny generowany jest głównie w chloroplastach (Miszalski i Ziegler 1989). Na podstawie 25 uzyskanych wyników stwierdziliśmy że: (1) w odpowiedzi na stres siarkowy następuje indukcja stresu oksydacyjnego na terenie chloroplastów i cytozolu, o czym świadczy znaczy wzrost aktywności chloroplastowej izoformy FeSOD, a następnie indukcja Cu/ZnSOD - cytozolowej formy dysmutazy ponadtlenkowej, (2) stres oksydacyjny, generowany w roślinach przez fumigację SO2, nie prowadzi do znacznych oscylacji dobowych w stężeniu jabłczanu, co wskazuje, że nie dochodzi do wykształcenia w pełni funkcjonalnego CAM. Podobne rezultaty uzyskano poddając rośliny M. crystallinum fumigacji ozonem (Niewiadomska i in. 2002) oraz traktując etylenem (Hurst i in. 2004), co udowadnia, że nadprodukcja RFT nie jest czynnikiem wystarczającym do indukcji transformacji metabolicznej. W kolejnej pracy analizowaliśmy wpływ stresu zranienia mechanicznego tkanek liścia na indukcję stresu oksydacyjnego w roślinach M. crystallinum (II B10, wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). Stres zranienia wykazuje wiele cech wspólnych ze stresem zasolenia. Jedną z takich cech są objawy szeroko rozumianego stresu wodnego, przejawiającego się m. in. nadprodukcją RFT i wzrostem zawartości kwasu abscysynowego (ABA, ang. abscisic acid) (de Bruxelles i Roberts 2001; León i in. 2001). W przeprowadzonych badaniach założyliśmy, że ze zranieniem mechanicznym powiązane są pewne symptomy charakterystyczne dla metabolizmu typu CAM. Na podstawie uzyskanych rezultatów stwierdziliśmy, że podobnie jak w przypadku roślin poddanych stresowi solnemu w celu indukcji transformacji metabolicznej (Miszalski i in. 1998, 2001; Niewiadomska i in. 1999; Ślesak i in. 2002, 2003), w odpowiedzi na stres zranienia następuje: (1) wzrost aktywności SOD zwłaszcza izoformy cynkowo-miedziowej i spadek aktywności KAT, któremu towarzyszy znaczny wzrost stężenia H2O2, (2) zmiany w aktywności tych enzymów korelują ze spadkiem przewodności szparkowej, oraz wzrostem aktywności związanego z CAM enzymu jabłczanowego NADP-ME, (3) podobieństwa w funkcjonowaniu badanych elementów systemu antyoksydacyjnego oraz aktywności NADP-ME w odpowiedzi na stres zasolenia i stres zranienia mogą wskazywać na wspólny szlak przekazywania informacji w postaci zmian w stężeniu H2O2 w odpowiedzi na zasolenie i zranienie mechaniczne. W opisywanej pracy wykazaliśmy również, że: (4) w obrębie blaszki liściowej, obszar tkanek budujących wiązki przewodzące (unerwienie liścia) wykazuje wyższą aktywność badanych elementów systemu antyoksydacyjnego oraz zwiększoną akumulację H2O2, a także większą aktywność NADP-ME w porównaniu do mezofilu liścia, (5) na tej podstawie można wnioskować, że enzym jabłczanowy NADP-ME oprócz funkcji związanych z asymilacją CO2 pełni funkcję donora NADPH dla systemu antyoksydacyjnego (np. NADPH oksydazy generującej nadtlenek wodoru w apoplaście i/lub dla aktywności reduktazy glutationowej – ważnego enzymu cyklu askorbinianowo-glutationowego) w komórkach tkanek budujących system wiązek przewodzących, które odgrywają znaczącą rolę w przekazywaniu sygnału w odpowiedzi na działanie czynników stresowych. 26 Opublikowane w kilkunastu pracach rezultaty eksperymentów, powstałe w Zakładzie Biologii Stresu IFR PAN w wyniku prac zespołu badawczego, którego jestem członkiem, spotkały się z uznaniem środowiska naukowego. Za cykl prac badawczych „Regulacja równowagi redoksowej w tkankach asymilacyjnych liści”, przeprowadzonych pod kierunkiem prof. dr hab. Z. Miszalskiego przyznana została nagroda w roku 2010 na wniosek Komisji Nagród Wydziału Nauk Rolniczych, Leśnych i Weterynaryjnych PAN (XIII 2, wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). Mechanizmy wysokiej odporności M. crystallinum na działanie czynników stresu środowiskowego zostały również badane w doświadczeniach nad wpływem stresu biotycznego na zmiany w metabolizmie fotosyntetycznym oraz funkcjonowanie systemu antyoksydacyjnego (II B13; II B15, wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). W przeprowadzonych doświadczeniach, infekowałam rośliny w stadium C3 oraz rośliny w stadium CAM - indukowanym stresem solnym, przy użyciu patogena nekrotroficznego (Botrytis cinerea), a także patogena biotroficznego (Pseudomonas syringae), a następnie badałam aktywność SOD, KAT i peroksydazy gwajakolowej (POD) oraz stężenie endogennego H2O2, a także poziom stężenia jabłczanu oraz aktywność NADPME. Na podstawie uzyskanych wyników wykazałam, że (1) M. crystallinum zarówno w stadium metabolizmu C3 jak i w stadium CAM wykazuje wysoką odporność zarówno na infekcję patogenem nekrotroficznym jak i patogenem biotroficznym, (2) różnice w aktywności badanych elementów systemu antyoksydacyjnego oraz w endogennym stężeniu nadtlenku wodoru w odpowiedzi na infekcję nie zależą od strategii życiowej patogena (biotroficzny vs. nekrotroficzny) lecz związane są ze sposobem asymilacji CO2 przez roślinę, (3) u roślin wykazujących metabolizm C3 stres biotyczny powoduje fluktuacje dobowe w stężeniu jabłczanu, które korelują z uaktywnieniem dodatkowej izoformy NADP-ME również wykazującej fluktuacje dobowe w aktywności, (4) z kolei w komórkach roślin wykazujących metabolizm typu CAM po zainfekowaniu następuje spadek endogennego stężenia jabłczanu i osłabienie oscylacji dobowych w jego poziomie, co z kolei koreluje ze spadkiem aktywności izoform NADP-ME i brakiem dobowych różnic w ich aktywności, (5) różnice w endogennym stężeniu jabłczanu oraz aktywności NADPME u roślin wykazujących odmienny sposób asymilacji CO2 (C3 vs. CAM) wynikają z odmiennie funkcjonującego systemu antyoksydacyjnego, który u roślin typu CAM jest lepiej zaadaptowany do stresu oksydacyjnego na skutek wcześniejszego przystosowania do stresu solnego. Podwyższenie aktywności NADP-ME nie jest konieczne, ze względu na mniejsze zapotrzebowanie na NADPH dla aktywacji niektórych enzymatycznych antyoksydantów. Mój udział w pracach wykonanych w Zakładzie Biologii Stresu IFR PAN polegał również na prowadzeniu doświadczeń z wykorzystaniem metod hodowli in vitro. Celem tych badań było uzyskanie tkanki kalusowej z rożnych organów M. crystallinum, a następnie wykorzystanie uzyskanego materiału do badań nad możliwościami indukcji metabolizmu CAM (II B2; wykaz 27 opublikowanych prac, załącznik 5). W przeprowadzonych doświadczeniach wykazaliśmy że podobnie jak cała roślina również tkanka kalusowa hodowana w obecności NaCl wykazuje dobowe fluktuacje endogennego poziomu jabłczanu i wzrost aktywności enzymu jabłczanowego (NADP-ME), co świadczy o funkcjonowaniu metabolizmu typu CAM. Tkanki kalusowe zostały również wykorzystane do badań nad wpływem NaCl na odpowiedź antyoksydacyjną na stres biotyczny w postaci infekcji hodowanych in vitro, niezróżnicowanych komórek M. crystallinum patogenem grzybowym Botrytis cinerea (II B14; wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). W ten sposób zaplanowane doświadczenie pozwoliło na analizę odpowiedzi na stres na poziomie komórkowym bez wpływu mechanizmów fizjologicznych, które zachodzą na poziomie całej rośliny. W doświadczeniach wykazaliśmy wyraźne różnice w rozwoju infekcji grzybowej pomiędzy komórkami kalusa zaadaptowanymi do stresu solnego i komórkami hodowanych bez działania NaCl. Rozwój strzępek grzyba w kalusie hodowanym na pożywkach z dodatkiem NaCl przebiegał znacznie wolniej, do czego przyczyniają się: (1) znacznie większy potencjał antyoksydacyjny przejawiający się wysokim stężeniem askorbinianu i wysoką aktywnością transferazy glutationowej oraz (2) wysokoaktywne enzymy z grupy peroksydaz, które kontrolują reakcje prowadzące do wzmacniania ścian komórek kalusa hodowanych hodowanego w warunkach stresu solnego, zapobiegając rozprzestrzenianiu się patogena. ad. B. Kontynuując badania nad M. crystallinum w warunkach in vitro podjęłam próby indukcji procesów regeneracyjnych oraz zainicjowałam badania nad regulacyjną rolą stresu oksydacyjnego w przebiegu procesów kallogenezy, ryzogenezy i somatycznej embriogenezy. Na tle ówczesnej literatury, badania które przeprowadziłam były jednymi z pierwszych nad rolą nadtlenku wodoru w procesach różnicowania in vitro. Wyniki tych eksperymentów zostały zebrane w cyklu publikacji, które stanowią przedkładane do oceny moje osiągnięcie naukowe pod tytułem: „Udział nadtlenku wodoru i wybranych elementów systemu antyoksydacyjnego w procesie morfogenezy w kulturach in vitro Mesembryanthemum crystallinum L.” Uczestniczyłam również w badaniach nad rolą stresu oksydacyjnego w somatycznej embriogenezie i kaulogenezie u Helianthus annuus. W tym układzie eksperymentalnym alternatywne ścieżki rozwojowe indukowane są w hodowli zarodków zygotycznych na pożywkach różniących się ciśnieniem osmotycznym: na pożywkach o wysokim ciśnieniu osmotycznym stwierdza się embriogenezę podczas gdy na pożywkach o niższej wartości ciśnienia osmotycznego obserwuje się wyłącznie kaulogenezę. Badania podjęto w celu odpowiedzi na pytanie czy między eksplantatami hodowanymi na rożnych pożywkach i realizującymi odmienne programy rozwojowe istnieją różnice w aktywności enzymów antyoksydacyjnych oraz endogennym poziomie H2O2 (II 28 B8, wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). Pomiary aktywności KAT SOD i POD, a także pomiary endogennego stężenia nadtlenku wodoru w kulturze H. annuus, wykazały istotne różnice w badanych parametrach między eksplantatami realizującymi odmienne ścieżki rozwojowe. W oparciu o uzyskane wyniki, w konkluzji pracy zasugerowaliśmy, że (1) wzrost endogennego poziomu H2O2 na wczesnym etapie kultury na pożywkach o podwyższonym ciśnieniu osmotycznym może być czynnikiem odpowiadającym za indukcję szlaku rozwojowego w kierunku somatycznej embriogenezy, oraz (2) niski poziom endogennego H2O2, który obserwowaliśmy przez cały okres kultury w zarodkach zygotycznych słonecznika ozdobnego, hodowanych na pożywkach o standardowej wartości ciśnienia osmotycznego, sprzyja rozwojowi pędów. Uzyskana wiedza na temat udziału reaktywnych form tlenu jako cząsteczek sygnałowych w indukcji procesów wzrostu i rozwoju roślin została wykorzystana do przygotowania podrozdziału w publikacji przeglądowej dotyczącej regulacyjnej roli nadtlenku wodoru w metabolizmie i rozwoju komórek roślinnych (II B6, wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). ad. C. Brałam również udział w badaniach nad charakterystyką wybranych elementów systemu antyoksydacyjnego komórki roślinnej u innych gatunków roślin, w odpowiedzi na różne czynniki stresu środowiskowego. W doświadczeniach przeprowadzonych na szpilkach sosny górskiej (Pinus mugo Turra) podjęliśmy próbę wyjaśnienia mechanizmów fizjologicznych leżących u podstaw wysokiej odporności P. mugo na działanie czynników stresowych i adaptacji tej rośliny do warunków panujących w strefie górnej granicy lasu (II B4; wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). Na podstawie uzyskanych rezultatów wykazaliśmy, że: (1) znaczny spadek wydajności fotosyntetycznej fotosystemu drugiego (PSII) określony na podstawie niskich wartości parametru Fv/Fm (maksymalna efektywność fotochemiczna PS II), nie wynika ze stresu powodowanego nadmiarem promieniowania lecz powodowany jest stresem niskich temperatur, (2) ważną rolę w ochronie aparatu fotosyntetycznego przed nadmiarem RFT prowadzącym do zmniejszenia aktywności fotosyntetycznej szpilek Pinus mugo, pełni chloroplastowa i cytozolowa forma Cu/ZnSOD. W badaniach przeprowadzonych na roślinach fiołka trójbarwnego Viola tricolor L. pochodzących ze stanowisk poprzemysłowych oraz z populacji rosnącej na terenie nieskażonym wykazaliśmy udział wybranych elementów systemu antyoksydacyjnego w adaptacji do warunków stresowych (II B11; wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). Fiołek trójbarwny jest fakultatywnym metalofitem, rozpowszechnionym na hałdach pokopalnianych. Wysoka odporność na działanie metali ciężkich powoduje, że roślina ta jest dobrym obiektem do badania fizjologicznych reakcji adaptacyjnych do warunków panujących na terenach poprzemysłowych. Dotychczas 29 opisywane wyniki badań prowadzone na roślinach kwiatowych dotyczyły eksperymentów polegających na poddawaniu roślin stresowi metali ciężkich w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Na podstawie takich badań przyjęto, że rośliny traktowane stresem metali ciężkich są bardziej podatne na uszkodzenia na skutek wzrostu stężenia RFT i indukcji stresu oksydacyjnego niż rośliny rosnące w środowisku pozbawionym metali ciężkich (Mithöfer i in. 2004). W badaniach przeprowadzonych na V. tricolor L. po raz pierwszy scharakteryzowaliśmy wybrane elementy systemu antyoksydacyjnego w roślinach rosnących naturalnie w środowisku skażonym, w którym są one narażone nie tylko na toksyczne działanie metali ciężkich, ale również inne czynniki środowiska. W naszych doświadczeniach wykazaliśmy, że: (1) rośliny z terenów silnie skażonych metalami ciężkimi wykazują wyższą aktywność całkowitą SOD w liściach niż w korzeniach, (2) pomimo wzrostu aktywność SOD w liściach stężenie nadtlenku wodoru w tych organach roślin jest najniższe w porównaniu z roślinami z innych stanowisk, (3) w usuwaniu nadmiaru nadtlenku wodoru powstałego w wyniku stresu oksydacyjnego wywołanego toksycznym oddziaływaniem środowiska poprzemysłowego, bierze udział izoforma katalazy oznaczona jako CAT 2, (4) rośliny Viola tricolor z terenów skażonych wyposażone są w sprawnie działający system antyoksydacyjny zarówno w korzeniach jak i w liściach, który zabezpiecza przed nadprodukcją RFT i pozwala na wegetację w trudnych warunkach środowiska. W kolejnej pracy uczestniczyłam w badaniach nad charakterystyką wybranych elementów systemu antyoksydacyjnego w liściach jęczmienia jarego (Hordeum vulgare L. ) oraz kostrzewy łąkowej (Festuca pratensis Huds) w odpowiedzi na stres biotyczny wywołany zakażeniem patogenem grzybowym Bipolaris sorokiniana (II B12; wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). Badane gatunki roślin różnią się odpornością na działanie wyżej wymienionego patogena: kostrzewa łąkowa jest gatunkiem bardziej odpornym. Celem prowadzonych doświadczeń było sprawdzenie czy aktywność systemu antyoksydacyjnego przyczynia się do odmiennej odporności badanych roślin na infekcje B. sorokininana. RFT, oprócz bezpośredniego oddziaływania z patogenem (poprzez zahamowanie kiełkowania zarodników lub wzrostu grzybni), spełniają funkcję wtórnego przekaźnika informacji wewnątrz komórki, który indukuje tzw. reakcję nadwrażliwości (HR, ang. Hypersensitive Response) oraz odporność systemiczną (SAR, ang. Systemic Acquired Resistance) (Low i Merida 1996). HR ma charakter lokalny i wywoływana jest w celu ograniczenia rozprzestrzeniania się patogena w wyniku tworzenia nekroz wokół zakażonego miejsca. SAR jest mechanizmem obronnym obejmującym całą roślinę, charakteryzującym się indukcją ekspresji genów kodujących białka biorące udział w obronie przed patogenem. Do takich białek należą tzw. białka związane z patogenezą (PR, ang. Pathogenesis Related) (Mehdy 1994). W opisywanej pracy wykazaliśmy, że: (1) komórki zakażonych liści kostrzewy w odpowiedzi na infekcję grzybową produkują dużo wyższe stężenie nadtlenku wodoru w porównaniu do jęczmienia jarego, (2) w 30 regulacji poziomu nadtlenku wodoru podczas infekcji grzybowej u obydwu gatunków roślin bierze udział Cu/Zn SOD i peroksydazy: stwierdziliśmy wyższą aktywność CuZnSOD i obniżoną aktywność POD w komórkach kostrzewy w porównaniu do aktywności tych enzymów w komórkach jęczmienia co tłumaczy wyższy poziom H2O2 u zakażonej kostrzewy, (3) komórki kostrzewy wykazują podwyższoną aktywność β-1,3-glukanazy, jednego z białek należących do grupy białek PR. Na podstawie uzyskanych wyników wykazaliśmy, że różnice w odporności badanych gatunków na infekcję B. sorokiniana są związane z funkcjonowaniem systemu antyoksydacyjnego, którego aktywność w przypadku kostrzewy łąkowej sprzyja wzrostowi stężenia H2O2, który indukuję aktywność PR, a to z kolei powoduje podwyższoną odporność na infekcję. Byłam także zaangażowana w badania nad funkcjonowaniem enzymatycznych i nieenzymatycznych elementów sytemu antyoksydacyjnego w liściach pochodzących z różnych warstw głów kapusty pekińskiej (Brassica rapa L. subsp. pekinensis) (II B16, wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). Liście z poszczególnych warstw różnią się nie tylko pod względem morfologicznym i anatomicznym, ale również pod względem zachodzących w nich odmiennych procesów fizjologicznych. Ontogenetycznie najstarsze liście warstw zewnętrznych są w pełni rozwinięte i aktywne fotosyntetycznie, podczas gdy liście warstw głębiej położonych są młodsze i wykazują znacznie mniejszą aktywność fotosyntetyczną. Przeprowadzone badania porównawcze miały na celu wykazanie różnic w aktywności wybranych elementów systemu antyoksydacyjnego w poszczególnych warstwach liści kapusty co jest niewątpliwie istotne nie tylko w aspekcie fizjologiczno-biochemicznym lecz również ma duże znaczenie pod względem praktycznym. Rezultaty te mogą być wykorzystane do oceny kondycji roślin i ich wartości konsumpcyjnej szczególnie istotnej w aspekcie przechowalnictwa. Stwierdziliśmy że: (1) komórki liści warstw zewnętrznych posiadają duże stężenie α-tokoferolu (witamina E) oraz zaopatrzone są w wysokoaktywną: katalazę, manganową formę SOD (MnSOD) oraz peroksydazę askorbinianową (APX), które regulują homeostazę RFT, usuwając ich nadmiar produkowany głównie w procesie fotosyntezy i fotorespiracji, (2) liście z najbardziej wewnętrznych warstw liści kapusty pekińskiej zawierają najwyższe stężenie askorbinianu (witamina C) oraz wykazują największą aktywność żelazowej formy SOD (FeSOD) oraz Cu/Zn SOD. Te elementy systemu antyoksydacyjnego są odpowiedzialne za regulację poziomu RFT i zabezpieczają przed ich nadprodukcją w komórkach młodych liści charakteryzujących się wysoką aktywnością procesów wzrostu i rozwoju, zachodzących bez udziału światła, (3) uzyskane wyniki mogą przyczynić się do opracowania technologii uprawy i przechowalnictwa Brassica rapa L. subsp. pekinensis, które będą w dużym stopniu ograniczały straty wartości odżywczych kapusty pekińskiej. Opracowane przez nas dane doświadczalne zostały wykorzystane do porównania właściwości 31 odżywczych kapusty pekińskiej poddanej działaniu ozonu jako czynnika stymulującego układ antyoksydacyjny (Rozpądek i in. 2014). ad. D. W ostatnich latach, moje zainteresowania poszerzyłam o zagadnienia związane z rolą stresu oksydacyjnego w biosyntezie i akumulacji metabolitów wtórnych w komórkach roślinnych. Badania z tego zakresu prowadzę na roślinie Stevia rebaudiana Bertoni, która charakteryzuje się zdolnością do produkcji i gromadzenia wtórnych produktów metabolizmu w postaci glikozydów stewiolowych. W prowadzonych badaniach założyłam, że glikozydy stewiolowe należące podobnie jak i karotenoidy do grupy diterpenów, mogą pełnić funkcję jednego z elementów systemu antyoksydacyjnego roślin. W dostępnej literaturze brak jest danych dotyczących wpływu stresu oksydacyjnego na biosyntezę i akumulację glikozydów stewiolowych w roślinach S. rebaudiana. Wiadomo natomiast, że w biosyntezę tych związków zaangażowane są enzymy należące do glukozylotransferaz. Wyniki doświadczeń prowadzonych obecnie pozwalają na zbadanie zależności pomiędzy poziomem stresu oksydacyjnego indukowanego działaniem różnych czynników stresu abiotycznego, a ekspresją genów kodujących poszczególne glukozylotransferazy ze szlaku biosyntezy glikozydów stewiolowych. Wyniki eksperymentów mogą mieć duże znaczenie aplikacyjne z uwagi na fakt, iż glikozydy stewiolowe są wykorzystywane jako naturalne substancje słodzące. Wyniki otrzymane w ramach prowadzonych doświadczeń, związanych z wpływem różnych czynników stresu abiotycznego na stężenie glikozydów stewiolowych w rożnych organach rośliny oraz w zależności od fazy rozwojowej roślin, mogą zostać wykorzystane praktycznie w opracowaniu wskazań dla uprawy roślin S. rebaudiana, która będzie warunkować uzyskiwanie optymalnego plonu glikozydów stewiolowych. Do realizacji badań nad zarysowanym problemem uzyskałam fundusze z NCN w ramach projektu badawczego, którego jestem kierownikiem (XI 9; wykaz opublikowanych prac, załącznik 5), a także nawiązałam współpracę z naukowcami z Katedry Roślin Warzywnych i Zielarskich Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie, specjalizującymi się w uprawie roślin zielarskich oraz ze specjalistami z zakresu biotechnologii roślin leczniczych. z Katedry Biologii i Botaniki Farmaceutycznej Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu, Rezultaty moich doświadczeń realizowanych w ramach projektu zostały już zaprezentowane na kilku konferencjach międzynarodowych (VI C 11, 12, 13, 14, 15; wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). Dwie spośród wymienionych prezentacji zostały wyróżnione i nagrodzone. Pani mgr inż. Żaneta Michalec-Warzecha – słuchaczka Międzynarodowego Studium Doktoranckiego Nauk Przyrodniczych Polskiej Akademii Nauk w Krakowie, która pozostaje pod moją opieką naukową, otrzymała drugą nagrodę za prezentację pt: „Is it possible to replace sugar by steviol glycosides?” przyznaną w konkursie na najlepszą prezentację w ramach Sesji Młodych Badaczy podczas 9 Międzynarodowego Kongresu Naukowego Societas 32 Humboldtiana Polonorum w Poznaniu w roku 2013 (VI C 11; wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). W ramach nagrody mgr inż. Ż. Michalec-Warzecha otrzymała miesięczne stypendium ufundowane przez Niemiecką Centralę Wymiany Akademickiej (Deutscher Akademischer Austauschdienst - DAAD) na pobyt w jednym z ośrodków naukowych w Niemczech. Dzięki nawiązaniu przeze mnie kontaktów z prof. S. Lüthje, która kieruje laboratorium Stresu Oksydacyjnego i Proteomiki Roślin na Wydziale Biologii Uniwersytetu w Hamburgu w Niemczech (Oxidative Stress and Plant Proteomics Group, University of Hamburg), Pani Michalec-Warzecha odbyła miesięczny staż (listopad 2014) w laboratorium prof. S. Lüthje w ramach otrzymanego stypendium. Uzyskane umiejętności z zakresu frakcjonowania komórek roślinnych i analizy proteomicznej, mgr Michalec-Warzecha wykorzysta do doświadczeń nad charakterystyką enzymatycznych antyoksydantów w komórkach S. rebaudiana poddanych działaniu czynników stresu abiotycznego. Uzyskane rezultaty będą uzupełnieniem danych otrzymanych w badaniach, które prowadzi mgr Michalec-Warzecha w ramach wykonywanej pod moim kierunkiem pracy doktorskiej (XIV 5; wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). Nawiązana współpraca z prof. S. Lüthje jest dodatkowo istotna dla realizacji moich zainteresowań badawczych z zakresu regulacyjnej roli stresu oksydacyjnego w procesach wzrostu, rozwoju i różnicowania komórek roślinnych. Dzięki współpracy z Uniwersytetem w Hamburgu możliwe będzie rozszerzenie badań opisywanych przeze mnie w cyklu prac wchodzących w skład prezentowanego tutaj osiągnięcia naukowego o analizę proteomiczną i identyfikację białek specyficznie aktywnych w czasie indukcji procesów regeneracji in vitro na przykładzie ryzogenezy z hypokotyli M. crystallinum L. Kolejnym wyróżnionym doniesieniem z zakresu badań prowadzonych w kierowanym przeze mnie projekcie była prezentacja pani mgr inż. Edyty Kąkol - doktorantki z Katedry Roślin Warzywnych i Zielarskich Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie. Pani Kąkol otrzymała pierwszą nagrodę za prezentację pt: „Preliminary studies on Stevia rebaudiana Bertoni plants cultivated in the field conditions of southern Poland” przyznaną przez Dziekana Wydziału Ogrodnictwa Uniwersytetu im. Mendela w Brnie w Czechach (Faculty of Horticulture, Mendel University in Brno) podczas Międzynarodowej Konferencji Doktorantów odbywającej się w Lednicach w Czechach w roku 2013 (3rd International Horticultural Conference for Post-graduate students) (VI C 13; wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). Innym aspektem badań prowadzonych przeze mnie na gatunku Stevia rebaudiana, jest zagadnienie bardzo słabej zdolności kiełkowania nasion tej rośliny, a tym samym dużych ograniczeń w rozmnażaniu generatywnym. Z danych literaturowych wiadomo jest, że w procesie kiełkowania nasion różnych roślin znaczącą rolę pełnią gibereliny (Marciniak i in. 2012). Wczesne etapy szlaku biosyntezy giberelin są wspólne również dla przebiegu szlaku biosyntezy glikozydów stewiolowych. W przypadku roślin S. rebaudiana kontynuacja tego szlaku biosyntezy przebiega głównie w kierunku produkcji glikozydów stewiolowych powodując, że gibereliny są obecne w tkankach liści stewii w stężeniu 10 000 razy mniejszym niż stężenie stewiozydów. Według postawionej przeze 33 mnie hipotezy, może być to przyczyną słabej zdolności kiełkowania nasion S. rebaudiana. W celu zweryfikowania postawionej przeze mnie hipotezy prowadzone są badania w ramach funduszy przyznanych przez NCN w konkursie Preludium. Doktorantka - Żaneta Michalec-Warzecha otrzymała projekt, w którym pełnię rolę opiekuna naukowego (XI 10; wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). Jednym z zadań badawczych w realizowanym projekcie jest transformacja eksplantatów pochodzących z roślin S. rebaudiana przy pomocy Agrobacterium rhizogenes, w celu uzyskania kultury korzeni włośnikowych, a następnie regeneracji roślin transgenicznych, co pozwoli w przyszłości na przeprowadzanie eksperymentów pozwalających na manipulowanie w obrębie genów kodujących enzymy ze szlaku biosyntezy glikozydów stewiolowych, polegające na aktywacji lub wyciszaniu genów. Dopracowanie metody transformacji stewii jest możliwe dzięki nawiązaniu przeze mnie kontaktów z profesor L. Pistelli z Wydziału Rolnictwa, Żywności i Środowiska Uniwersytetu w Pizie we Włoszech (Department of Agriculture, Food and Environment, University in Pisa). Profesor Pistelli jest specjalistką z zakresu fitochemii i posiada duże doświadczenie w eksperymentach nad transformacją różnych gatunków roślin potwierdzone licznymi publikacjami. W lipcu 2014 roku odbyłam krótkoterminowy staż w laboratorium kierowanym przez prof. L. Pistelli, podczas którego rozpoczęłam pierwsze eksperymenty nad transformacją komórek S. rebaudiana (XVIII 5, wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). Obecnie, badania realizowane w ramach projektu NCN Preludium są na etapie opracowania metodyki regeneracji roślin transgenicznych z kultur korzeni włośnikowych, uzyskanych po transformacji komórek liści roślin S. rebaudiana, przy użyciu dwóch szczepów Agrobacterium rhizogenes. Otrzymane dotychczas wyniki zostaną przedstawione na konferencji: „The 6th International Symposium on Production and Establishment of Micropropagated Plants”, która odbędzie się w kwietniu 2015 roku w San Remo we Włoszech. Efektywna transformacja będzie stanowiła narzędzie eksperymentalne, które otworzy nowe perspektywy badań prowadzonych w Zakładzie Biologii Stresu Instytutu Fizjologii Roślin PAN. VIII. Omówienie działalności dydaktycznej, popularyzatorskiej i organizacyjnej: Po zatrudnieniu na stanowisku asystenta w latach 1998 1999, w Zakładzie Cytologii i Embriologii Roślin, Instytutu Botaniki Uniwersytetu Jagiellońskiego prowadziłam ćwiczenia z cytologii i anatomii roślin w ramach organizowanego dla studentów biologii kursu „Botanika ogólna” oraz zajęcia praktyczne w ramach specjalistycznego kursu dotyczącego roślinnych kultur in vitro, zatytułowanego „Kultury in vitro i eksperymentalna embriologia roślin” (XIV 1; wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). W Instytucie Fizjologii Roślin PAN brałam udział w organizacji ćwiczeń oraz prowadzeniu zajęć praktycznych z zakresu metod elektroforezy i techniki Western Blot, a także immunodetekcji 34 białek na błonach nitrocelulozowych w ramach szkolenia „Methods of molecular genetics in plant biology” (XIV 2; wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). W latach 2001-2007, sprawowałam opiekę naukową nad wykonaniem eksperymentów do 15 prac magisterskich studentów Uniwersytetu Pedagogicznego w Krakowie, których oficjalnym opiekunem był prof. dr hab. Z. Miszalski (XIV 3; wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). Od roku 2012 pełnię funkcję opiekuna naukowego pracy doktorskiej mgr inż. Żanety Michalec-Warzechy - słuchaczki IV roku Międzynarodowego Studium Doktoranckiego Nauk Przyrodniczych Polskiej Akademii Nauk w Krakowie (XIV 5; wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). Ponadto, od roku 2001 do 2007 prowadziłam zajęcia w ramach kursów dla kandydatów na studia medyczne z zakresu biologii., na zaproszenie Fundacji dla Uniwersytetu Jagiellońskiego (XIV 4; wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). Zdobywając doświadczenie dydaktyczne w zakresie nauczania biologii współuczestniczyłam w przygotowywaniu podręcznika „ Biologia- Repetytorium” do nauczania w liceum ogólnokształcącym i profilowanym oraz konsultowałam pod względem merytorycznym hasła biologiczne w pozycji „Nowa Encyklopedia Szkolna A-Z”, na zlecenie wydawnictwa Zielona Sowa (XV 1, XVI 1; wykaz opublikowanych prac, załącznik 5) Od początku mojej pracy włączam się w działalność organizacyjną w Instytucie Fizjologii Roślin PAN. Uczestniczyłam w założeniu Pracowni Hodowli In Vitro i nadal koordynuję działalność tej Pracowni, a także jestem odpowiedzialna za funkcjonowanie Laboratorium Analiz Biochemicznych Zakładu Biologii Stresu IFR PAN. Jestem autorką projektu zgłoszonego do Komisji ds. Organizmów Genetycznie Zmodyfikowanych przy Ministerstwie Środowiska, na podstawie którego Instytut Fizjologii Roślin PAN uzyskał zgodę na zamknięte użycie organizmów genetycznie zmodyfikowanych w zakresie wykorzystania genetycznie zmodyfikowanych roślin Stevia rebaudiana Bertoni w badaniach charakterystyki systemu antyoksydacyjnego roślin transformowanych Agrobacterium rhizogenes. Ponadto jestem powoływana na recenzenta prac wydawanych w specjalistycznych i renomowanych czasopismach naukowych krajowych (Acta Biologica Cracoviensia series Botanica, Acta Physiologiae Plantarum) i zagranicznych (Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Scientia Horticulturae) (XXI; wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). Jestem również członkiem w 1 międzynarodowym i w 2 krajowych towarzystwach naukowych (XXII; wykaz opublikowanych prac, załącznik 5). . IX. Literatura 35 Adams P., Nelson DE., Yamada S., Chmara W., Jensen RG., Bohnert HJ., Griffiths H. (1998) Growth and development of Mesembryanthemum crystallinum (Aizoaceae). New Phytologist 138: 171-190. Andolfatto R., Bornhouser A., Bohnert HJ., Thomas JC. (1994) Transformed hairy roots of Mesembryanthemum crystallinum: gene expression patterns upon salt stress. Physiologia Plantarum 90:708–14. Apel K., Hirt H. (2004) Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction. Annual Review of Plant Biology 55: 373-399. Baldan B., Guzzo F., Filippini F., Gasparian M., Lo Schiavo F., Vitale A., de Vries SC., Mariani P., Terzi P. (1997) The secretory nature of the lesion of carrot cell variant ts11, rescuable by endochitinase. Planta 203, 381-9. Bartosz G. (2006) Druga twarz tlenu. Wolne rodniki w przyrodzie. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa. Bohnert HJ., Sheveleva E. (1998) Plant stress adaptations — making metabolism move. Current Opinion in Plant Biology 1: 267–274. Borland A., Elliott S., Patterson S., Taybi T., Cushman J., Pater B., Barnes J. (2006) Are the metabolic components of crassulacean acid metabolism up-regulated in response to an increase in oxidative burden? Journal of Experimental Botany 57: 319–328. Breusegem van F., Bailey-Serres J., Mittler R. (2008) Unraveling the tapestry of networks involving reactive oxygen species in plants. Plant Physiology 147: 978–984. Cai Y., Sun M., Corke H. (2003) Antioxidant activity of betalains from plants of the Amaranthaceae. Journal Agriculture and Food Chemistry 51: 2288–2294. Campanoni P., Nick P. (2005) Auxin-Dependent Cell Division and Cell Elongation. 1-Naphthaleneacetic Acid and 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid Activate Different Pathways. Plant Physiology 137: 939–948. Christianson ML., Warnick DA. (1983) Competence and determination in the process of in vitro shoot organogenesis. Developmental Biology 95: 288–293. 36 Christianson ML., Warnick DA. (1985) Temporal requirement for phytohormone balance in the control of organogenesis in vitro. Developmental Biology 12: 494-497. Cui K., Xing G., Liu X., Xing G., Wang Y. (1999) Effect of hydrogen peroxide on somatic embryogenesis of Lycium barbarum L. Plant Science 149: 9-16. Cushman JC., Wulan T., Kuscuoglu N., Spatz MD. (2000) Efficient plant regeneration of Mesembryanthemum crystallinum via somatic embryogenesis. Plant Cell Reports 19: 459-463. De Bruxelles GL., Roberts MR. (2001) Signals regulating multiple responses to wounding and herbivores. Critical Review in Plant Science 20: 487-521. Gapper C., Dolan L. (2006) Control of plant development by reactive oxygen species. Plant Physiology 141: 341–345. Gaspar T., Frank T., Bisbis B., Kevers C., Jouve L., Hausman JF., Dommes J. (2002) Concepts in plant stress physiology. Application to plant tissue cultures. Plant Growth Regulation 37: 263–285. Gechev TS., van Breusegem F., Stone JM., Denev I., Laloi C. (2006) Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death. BioEssays 28:1091– 1101. Halliwell B. (2006) Reactive species and antioxidants. Redox biology is a fundamental theme of aerobic life. Plant Physiology 141: 312-322. Hare PD., Cress WA. (1997) Metabolic implications of stress-induced proline accumulation in plants. Plant Growth Regulation 21: 79–102. Hare PD., Cress WA., van Staden J. (2001) The effects of exogenous proline and proline analogues on in vitro shoot organogenesis in Arabidopsis. Plant Growth Regulation 34:203–207. Hurst AC., Grams TEE., Ratajczak R. (2004) Effects of salinity, high irradiance, ozone and ethylene on mode of photosynthesis, oxidative stress and oxidative damage in the C3/CAM intermediate plant Mesembryanthemum crystallinum L. Plant Cell and Environment 27: 187–197. 37 Ibdah MA., Krins A., Seidlitz HK., Heller W., Strack D., Vogt T. (2002) Spectral dependence of flavonol and betacyanin accumulation in Mesembryanthemum crystallinum under enhanced ultraviolet radiation. Plant Cell and Environment 25:1145–1154. Ishimaru K. (1999) Transformation of CAM plant, the facultative halophyte Mesembryanthemum crystallinum by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Tissue and Organ Culture 57:61–3. Klewicka E. (2012) Betacyaniny – biodostępność i biologiczna aktywność. ŻYWNOŚĆ. Nauka Technologia Jakość. 81: 5 – 21 Konieczny R., Obert B., Bleho J., Novák O., Heym C., Tuleja M., Müller J., Strnad M., Menzel D., Samaj J. (2011) Stable transformation of Mesembryanthemum crystallinum (L.) with Agrobacterium rhizogenes harboring the green fluorescent protein targeted to the endoplasmic reticulum. Journal of Plant Physiology168 : 722-729. León J., Rojo E., Sánchez-Serrano JJ. (2001) Wound signalling in plants. Journal of Experimental Botany 52: 1-9. Low PS., Merida JR. (1996) The oxidative burst in plant defense – function and signal transduction. against pathogens. Physiologia Plantarum 96: 533-542. Lüttge U. (1993) The role of crassulacean acid metabolism (CAM) in the adaptation of plants to salinity. New Phytologist 125: 59-71. Marciniak K., Kęsy J., Tretyn A., Koncewicz J. (2012) Gibereliny – struktura, biosynteza i dezaktywacja u roślin. Postępy Biochemii 58: 14-24. Mehdy MC. (1994) Active oxygen species in plant defense against pathogens. Plant Physiology 105:467-472. Michalowski CB., Bohnert HJ. (1992) Nucleotide sequence of a root-specific transcript encoding a germin-like protein from the halophyte Mesembryanthemum crystallinum. Plant Physiology 100: 537-538. Meiners MS., Thomas JC., Bohnert HJ., Cushman JC. (1991) Regeneration of multiple shoots and plants from Mesembryanthemum crystallinum. Plant Cell Reports 9: 563–566. 38 Miszalski Z., Ziegler H. (1989) Uptake and efflux of [35S] sulphite by protoplasts and their chloroplasts of oat (Avena sativa L.). Zeitschrift für Naturforschung 44c: 509–513. Miszalski Z., Ślesak I., Niewiadomska E., Bączek-Kwinta R., Lüttge U., Ratajczak R. (1998) Subcellular localization and stress responses of superoxide dismutase isoforms from leaves in the C3-CAM intermediate halophyte Mesembryanthemum crystallinum L. Plant Cell and Environment 21: 169 – 179. Miszalski Z., Niewiadomska E., Ślesak I., Lüttge U., Kluge M., Ratajczak R. (2001) The effect of irradiation on carboxylating/ decarboxylating enzymes and fumarase activities in Mesembryanthemum crystallinum L. exposed to salinity stress. Plant Biology 3: 17–23. Mithöfer A., Schulze B., Boland W. (2004) Biotic and heavy metal stress response in plants: evidence from common signals. FEBS Letters: 566:1–5. Mittler R., Vanderauwera S., Gollery M., van Breusegem F. (2004) Reactive oxygen gene network of plants. Trends in Plant Science 9: 490–498. Molassiotis AN., Dimassi K., Diamantidis G., Therios I. (2004) Changes in peroxidases and catalase activity during in vitro rooting of GF-677 (Prunus amygdalus X Prunus persica). Biologia Plantarum 48: 1–5. Murashige T., Skoog F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15: 473–497. Niewiadomska E., Miszalski Z., Ślesak I., Ratajczak R. (1999) Catalase activity during C3-CAM transition in Mesembryanthemum crystallinum L. leaves. Free Radical Research 31: S251-256. Niewiadomska E., Pater B., Miszalski Z. (2002) Does ozone induce a C3-CAM transition in Mesembryanthemum crystallinum leaves? Phyton (Horn, Austria) 42c: 69- 78. Niewiadomska E., Karpińska B., Romanowska E., Ślesak I., Karpiński S. (2004) A salinity-induced C3-CAM Transition increases energy conservation in the halophyte Mesembryanthemum crystallinum L. Plant Cell Physiology 45: 789–794. 39 Papadakis AI., Roubelakis-Angelakis KA. (2002) Is oxidative stress responsible for plant protoplast recalcitrance? Plant Physiology and Biochemistry 40: 549–559. Parvaiz A., Satyawati S. (2008) Salt stress and phytobiochemical responses of plants-a review. Plant Soil and Environment 54: 89–99. Pavoković D., Krsnik-Rasol M. (2011). Complex biochemistry and biotechnological production of betalains. Food Technology and Biotechnology 49: 145–155. Potters G., Pasternak T., Guisez Y., Palme KJ., Jansen M. (2007) Stress induced morphogenic responses: growing out of trouble? Trends in Plant Science 12: 98–105. Riganti C., Gazzano E., Polimeni M., Costamagna C., Bosia A., Ghigo D. (2004) Diphenyleneiodonium inhibits the cell redox metabolism and induces oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry 279: 47726-47731. Roberts DM., Harmon AC. (1992) Calcium-modulated proteins: targets of intracellular calcium signals in higher plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 43: 375414. Rozpądek P., Nosek M., Ślesak I., Kunicki E., Dziurka M., Miszalski Z. (2014) Ozone fumigation increases the abundance of nutrients in Brassica vegetables: broccoli (Brassica oleracea var. italica) and Chinese cabbage (Brassica pekinensis). European Food Research and Technology, DOI 10.1007/s00217-014-2372-z. Sagi M., Fluhr R. (2006) Production of Reactive Oxygen Species by Plant NADPH Oxidases.Plant Physiology 141: 336–340. Skoog F., Miller CO. (1957) Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symposia of the Society for Experimental Biology 54: 118–130. Ślesak I., Miszalski Z., Karpinska B., Niewiadomska E., Ratajczak R., Karpinski S. (2002) Redox control of oxidative stress responses in the C3–CAM intermediate plant Mesembryanthemum crystallinum. Plant Physiology and Biochemistry 40: 669–77. 40
