M_Klaudel-Dreszler-doktorat 9.11. 2010
advertisement
Rozprawa na stopień doktora nauk medycznych Przewlekła neutropenia u dzieci - obraz kliniczny, diagnostyka, czynniki prognostyczne oraz leczenie. Instytut „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka” Warszawa 2010 Maja Klaudel-Dreszler 1 Maja Klaudel-Dreszler Przewlekła neutropenia u dzieci - obraz kliniczny, diagnostyka, czynniki prognostyczne oraz leczenie. Rozprawa na stopień doktora nauk medycznych Promotor: Prof. dr hab.n.med. Ewa Bernatowska Oddział Immunologii Klinika Gastroenterologii, Hepatologii i Immunologii Instytut „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka” Kierownik Oddziału: Prof. dr hab.n.med. Ewa Bernatowska Kierownik Kliniki: Prof. dr hab.n.med. Józef RyŜko Praca została zrealizowana w ramach grantu promotorskiego Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa WyŜszego NN 407 021 535 Warszawa 2010 2 Serdeczne podziękowania kieruję do: • Pani Profesor Ewy Bernatowskiej za inspirację oraz pomoc merytoryczną podczas powstawania niniejszej pracy • Moich pacjentów oraz ich rodziców za okazaną mi Ŝyczliwość, zaufanie oraz współpracę, bez której praca ta nie mogłaby powstać • KoleŜanek i kolegów z Kliniki Gastroenterologii, Hepatologii i Immunologii za podtrzymywanie na duchu w chwilach niemocy twórczej • Doktor Barbary Piątosy za odwieczną Ŝyczliwość oraz wsparcie intelektualne przy opracowywaniu wyników badań cytometrycznych szpiku i krwi obwodowej • Pani Profesor Krystyny Maślanki wraz z zespołem za opracowanie wyników badań przeciwciał przeciwgranulocytarnych oraz cenne sugestie dotyczące piśmiennictwa • InŜynier Urszuli SkarŜyńskiej za ogromny wkład pracy w przygotowanie tabel, rycin oraz diagramów • Doktora Macieja Dądalskiego za pomoc i cierpliwość w statystycznym opracowaniu wyników projektu • Doktora Jakuba Kmiotka za pomysłowość w przygotowaniu diagramów z algorytmami diagnostycznymi • Moim rodzicom za bezcenną pomoc w realizacji Ŝyciowych pasji. Pracę tę dedykuję Gai, mojej córce. I Tobie poznawanie nauk stopniowo wejdzie w krew i w nałóg. „Faust” J. W. Goethe Ancere imparo! (Ciągle jeszcze się uczę!) Michał Anioł Buonarroti 3 WYKAZ UśYTYCH SKRÓTÓW AGAbs – ang. antigranulocyte antibodies – przeciwciała przeciwgranulocytarne AIDS – ang. acquired immunodeficiency syndrome – zespół nabytego niedoboru odporności AIN – ang. autoimmune neutropenia of infancy – autoimmunizacyjna neutropenia niemowląt ANC – ang. absolute neutrophil count – liczba bezwzględna granulocytów obojętnochłonnych AK – ang. Kostmann agranulocytosis – agranulocytoza Kostmanna ALL- ang. acute lymphoblastic leukemia – ostra białaczka limfoblastyczna ALPS – ang. autoimmune lymphoproliferative syndrome – autoimmunizacyjny zespół limfoproliferacyjny AML – ang. acute myeloblastic leukemia – ostra białaczka szpikowa ASDII – and. atrial septal defect type II– otwór w przegrodzie międzyprzedsionkowej typu II ATG – ang. anti-thymocyte-globulin – globulina antylimfocytarna CD- ang. cluster of differentiation – kompleks róŜnicowania, cząsteczka CD CD40Ldef – ang. CD40 ligand deficiency – niedobór ligandu CD40 CFU-GM – ang. Colony Forming Units - Granulocyte Macrophage – jednostka tworząca kolonie granulocytarno-makrofagowe CHS – ang. Chediak-Higashi syndrome - zespół Chediaka – Higashiego CIN – ang. chronic idiopathic neutropenia – przewlekła idiopatyczna neutropenia CML - ang. chronic myeloblastic leukemia – przewlekła białaczka szpikowa CMV – ang. cytomegalovirus – wirus cytomegalii CN – ang. congenital neutropenia – wrodzona neutropenia CsA – cyklosporyna A CyN – ang. cyclical neutropenia – cykliczna neutropenia CVID – ang. common variable immunodeficiency – pospolity zmienny niedobór odporności EBMT – ang. European Bone Marrow Transplantation EBV – ang. Epstein Barr virus - wirus Epsteina-Barr ES – ang. Evans syndrome – zespół Evansa ESID – European Society for Primary Immunodeficiencies - Europejskie Towarzystwo Pierwotnych Niedoborów Odporności FA – ang. Fanconi anemia – niedokrwistość Fanconiego FBN – ang. familial benign neutropenia – rodzinna łagodna neutropenia GAT – ang. Granulocyte Agglutination Test – test aglutynacji granulocytów 4 GIFT– ang. granulocyte immunofluorescence test– granulocytarny test immunofluorescencyjny GC/MS – chromatografia gazowa/spektrofotometria masowa G-CSF – ang. granulocyte colony stymulating factor – czynnik wzrostu kolonii granulocytarnych GM-CSF - ang. granulocyte- macrophage colony-stymulating factor – czynnik wzrostu kolonii granulocytarnych i makrofagowych GSDIb – ang. glycogen storage disease type Ib – glikogenoza typu Ib GS II – ang. Griscelli syndrome type II - zespół Griscellego typu II G-6-P - glukozo-6-fosforan G-6-PT - translokaza glukozo-6-fosforanu HAV – ang. hepatitis A virus – wirus zapalenia wątroby typu A HBV – ang. hepatitis B virus – wirus zapalenia wątroby typu B HCV – ang. hepatitis C virus – wirus zapalenia wątroby typu C HHV6 – ang. human herpes virus 6 – ludzki wirus herpes typu 6 HIGM – ang. hyper IgM syndrome – zespół hiperIgM HIV – ang. human immunodeficiency virus – wirus ludzkiego niedoboru odporności HPV – ang. human papilloma virus – wirus brodawczaka ludzkiego HSV – ang. herpes simplex virus – wirus opryszczki HLA - ang. human leukocyte antigens – antygeny zgodności tkankowej HSCT – ang. haematopoietic stem cell transplantation – przeszczepienie macierzystych komórek krwiotwórczych IBD – ang. inflammatory bowel disease – nieswoiste zapalenie jelit Ig – ang. immunoglobuline - immunoglobulina IFNγ – interferon gamma IP-CZD – Instytut „Pomnik – Centrum Zdrowia Dziecka” ITP - ang. idiopathic thrombocytopenic purpura – samoistna plamica małopłytkowa IVA – ang. isovaleric aciduria – kwasica izowalerinowa IVIG – ang. intravenous immunoglobulin – doŜylny preparat immunoglobulin JCA – ang. juvenile chronic arthritis – młodzieńcze idiopatyczne zapalenie stawów LCH – ang. Langerhan’s histiocytosis – histiocytoza z komórek Langerhansa MAIGA – ang. Monoclonal Antibody specific Immobilization of Granulocyte Antigens MBL – ang. mannose binding protein – białko wiąŜące mannozę 5 MDS – ang. myelodysplastic syndrome – zespół mielodysplastyczny MMA – ang. methylomalonic aciduria – kwasica metylomalonowa MTX - metotreksat MUD-HSCT – ang. matched unrelated donor- haematopoietic stem cell transplantation – przeszczepienie macierzystych komórek krwiotwórczych od dawcy niespokrewnionego NAIN – ang. neonatal autoimmune neutropenia – autoimmunizacyjna neutropenia noworodków OUN – ośrodkowy układ nerwowy PA – ang. propionic aciduria – kwasica propionowa PAMP – ang. pathogen associated molecular patterns - wzorce molekularne związane z patogenami PFO – ang. persistent foramen ovale – przetrwały otwór owalny PN – przewlekła neutropenia PVB-19 – ang. Parvovirus B-19 – parwowirus B-19 RD – ang. reticular dysgenesis – dysgenezja siateczki rHu G-CSF- ang. recombinant human granulocyte colony stimulating factor – rekombinowany ludzki czynnik wzrostu kolonii granulocytarnych SCID – ang. severe combined immunodeficiency – cięŜki złoŜony niedobór odporności SCN – ang. severe congenital neutropenia – cięŜka wrodzona neutropenia SCNIR - ang. Severe Chronic Neutropenia International Registry – Międzynarodowy Rejestr CięŜkiej Przewlekłej Neutropenii SDS – ang. Shwachman-Diamond Syndrome – zespół Shwachmana-Diamonda SLE – ang. systemic lupus erythematosus – układowy toczeń rumieniowaty TLR - ang.Toll-like receptors – receptory Toll-podobne TMP/SMX – trimetoprim/sulfametoksazol TNF α – ang. tumor necrosis factor α – czynnik martwicy nowotworów α TRALI - ang.Transfusion-Related Acute Lung Injury – ostra niewydolność oddechowa związana z przetoczeniem preparatów krwiopochodnych VZV – ang. varicella-zoster virus – wirus ospy wietrznej i półpaśca WHIM – ang. Warts Hypogammaglobulinemia Infections Myelokathexis – zespół: brodawki, hipogammaglobulinemia, zakaŜenia, mielokateksja XHIM – ang. X-linked hyper-IgM syndrome – sprzęŜony z chromosomemX zespół hiperIgM XLA – ang. X- linked agammaglobulinemia – agammaglobulinemia sprzęŜona z płcią ZUM – zakaŜenie układu moczowego 6 SPIS TREŚCI I WSTĘP ......................................................................................................................................................... 9 I.1 I.2 I.3 I.4 ODPORNOŚĆ WRODZONA ......................................................................................................................... 9 ROZWÓJ LINII GRANULOCYTARNEJ W SZPIKU...................................................................................... 11 PRZEWLEKŁA NEUTROPENIA U DZIECI- DEFINICJA, PODZIAŁ, OBJAWY KLINICZNE. .......................... 15 OMÓWIENIE WYBRANYCH CHORÓB NABYTYCH I WRODZONYCH PRZEBIEGAJĄCYCH Z PRZEWLEKŁĄ NEUTROPENIĄ .................................................................................................................................................. 19 I.4.A. Autoimmunizacyjna neutropenia niemowląt (AIN) .................................................................... 19 I.5 I.4.B. Alloimmunizacyjna neutropenia noworodków (NAIN) .............................................................. 20 I.4.C. Wrodzona neutropenia (CN)........................................................................................................ 21 I.4.D. CięŜka wrodzona neutropenia (SCN)........................................................................................... 22 I.4.E. Cykliczna neutropenia (CyN)....................................................................................................... 24 I.4.F. Zespół Shwachmana- Diamonda (SDS) ...................................................................................... 25 I.4.G. Glikogenoza typu Ib (GSD Ib) ..................................................................................................... 27 I.4.H. Łagodna rodzinna neutropenia (FBN)........................................................................................ 30 I.4.I. Niedobór ligandu CD40 (CD40Ldef)........................................................................................... 30 I.4.J. Mielokateksja i zespół WHIM ...................................................................................................... 31 I.4.K. Autoimmunizacyjny zespół limfoproliferacyjny (ALPS) ............................................................. 37 I.4.L. Pospolity zmienny niedobór odporności (CVID) ......................................................................... 38 I.4.M. Zespół Bartha ............................................................................................................................... 39 I.4.N. Przewlekła idiopatyczna neutropenia (CIN)................................................................................ 39 METODY LECZENIA PRZEWLEKŁEJ NEUTROPENII................................................................................ 40 I.5.A. Profilaktyka antybiotykowa.......................................................................................................... 40 I.5.B. Rekombinowany ludzki czynnik wzrostu kolonii granulocytarnych (rHuG-CSF) ................... 41 I.5.C. Glikokortykosteroidoterapia, MMF, Rytuksymab, splenektomia ............................................... 45 I.5.D. Immunoglobuliny ......................................................................................................................... 46 I.5.E. Przeszczepienie macierzystych komórek krwiotwórczych (HSCT) ............................................. 46 I.5.F. Szczepienia profilaktyczne ........................................................................................................... 48 II CELE PRACY ........................................................................................................................................... 49 III MATERIAŁ I METODYKA.................................................................................................................... 50 III.1 CHARAKTERYSTYKA GRUPY BADANEJ ............................................................................................. 50 III.2 PRZYJĘTE KRYTERIA ROZPOZNAWANIA POSZCZEGÓLNYCH JEDNOSTEK CHOROBOWYH ............. 51 III.3 BADANIA MOLEKULARNE.................................................................................................................. 52 III.4 KRYTERIA OCENY KLINICZNEJ CHORYCH ....................................................................................... 54 III.5 METODYKA I INTERPRETACJA BADAŃ DIAGNOSTYCZNYCH ............................................................ 55 III.5.A. Bezwzględna liczba granulocytów obojętnochłonnych ............................................................... 55 III.5.B. Mielogram .................................................................................................................................... 55 III.5.C. Immunofenotyp komórek hematopoezy szpikowej ...................................................................... 55 III.5.D. Badanie cytogenetyczne szpiku .................................................................................................... 57 III.5.E. Przeciwciała przeciwgranulocytarne (AGAbs) ............................................................................ 57 III.5.F. Klasy główne immunoglobulin..................................................................................................... 58 III.5.G. Badania metodą cytometrii przepływowej.................................................................................... 58 7 III.5.H. Inne badania................................................................................................................................. 59 III.5.I. Badania obrazowe ........................................................................................................................ 60 III.6 IV METODY STATYSTYCZNE .................................................................................................................. 60 WYNIKI BADAŃ...................................................................................................................................... 60 IV.1 CHARAKTERYSTYKA OBRAZU KLINICZNEGO DZIECI Z PN W ZALEśNOŚCI OD USTALONEGO ROZPOZNANIA.................................................................................................................................... 61 IV.2 CHARAKTERYSTYKA HEMATOLOGICZNA DZIECI Z PN ................................................................... 72 IV.3 OCENA BADAŃ PRZECIWCIAŁ PRZECIWGRANULOCYTARNYCH ...................................................... 81 IV.4 OCENA BADAŃ IMMUNOLOGICZNYCH .............................................................................................. 82 IV.5 WYNIKI BADAŃ OBRAZOWYCH ......................................................................................................... 84 IV.6 PROPOZYCJA ALGORYTMU DIAGNOSTYCZNEGO DLA DZIECI Z PN................................................. 84 IV.7 ZASTOSOWANE METODY LECZENIA, ICH SKUTECZNOŚĆ ORAZ ODNOTOWANE POWIKŁANIA........ 87 IV.7.A. Profilaktyka przeciwbakteryjna.................................................................................................... 87 IV.7.B. Przewlekłe leczenie czynnikiem wzrostu kolonii granulocytarnych (rHuG-CSF) .................... 88 IV.7.C. Procedura przeszczepienia macierzystych komórek krwiotwórczych (HSCT) .......................... 92 IV.7.D. DoŜylne preparaty immunoglobulin (IVIG) ................................................................................ 93 IV.7.E. Glikokortykosteroidy (GKS) ......................................................................................................... 93 IV.7.F. Dodatkowe szczepienia ochronne ................................................................................................ 93 IV.8 PROPOZYCJA ALGORYTMU TERAPEUTYCZNEGO DLA DZIECI Z PN. ............................................... 94 V DYSKUSJA................................................................................................................................................ 97 VI WNIOSKI................................................................................................................................................. 119 VII STRESZCZENIE .................................................................................................................................... 120 VIII SUMMARY............................................................................................................................................. 125 IX SPIS TABEL, RYCIN ORAZ WYKRESÓW ...................................................................................... 128 X PIŚMIENNICTWO ................................................................................................................................. 129 8 I WSTĘP I.1 Odporność wrodzona W obrębie układu odporności wyróŜnia się mechanizmy nieswoiste, czyli wrodzone (w piśmiennictwie anglojęzycznym określane jako innate immunity) oraz swoiste, znane takŜe jako nabyte (tzw. adaptive immunity)1. RozróŜnienie to stanowi znaczne uproszczenie, gdyŜ obecnie wiemy, Ŝe kaŜdy etap odpowiedzi immunologicznej wiąŜe się ze ścisłą współpracą komórek zaliczanych do obu tych mechanizmów. Odporność wrodzona jest filogenetycznie starsza, mniej precyzyjna, ale jednocześnie szybka, dzięki czemu stanowi pierwszą linię obrony organizmu w walce z patogenami. W jej skład wchodzą fagocyty (monocyty, makrofagi oraz granulocyty), układ dopełniacza, lizozym, interferony, TNF α, komórki zdolne do spontanicznej cytotoksyczności 2,3. Niezwykle istotną cechą odporności nieswoistej jest jej pewna selektywność, która sprawia, Ŝe celem ataku stają się cząsteczki znajdujące się na powierzchni bakterii, pierwotniaków, grzybów oraz wirusów, a jedynie wyjątkowo komórki własne organizmu. Receptory rozpoznające drobnoustroje (tzw. receptory rozpoznające wzorce- PRR = Patern Recognition Receptors) są niezmienne w ciągu całego Ŝycia osobniczego, dziedziczone przez miliony lat ewolucji; mogą znajdować się na powierzchni komórek, w ich wnętrzu lub być przez nie wydzielane. Do tej ostatniej grupy naleŜą przede wszystkim opsoniny, które połączywszy się z drobnoustrojem ułatwiają jego fagocytozę. Do opsonin zaliczamy przeciwciała, składowe dopełniacza, kolektyny (białko wiąŜące mannozę- MBL, białka A i D surfaktantu, składnik C1q dopełniacza), a takŜe pentraksyny (białko C-reaktywne). Do powierzchniowych PRR naleŜą receptory Tollpodobne (TLR = Toll-like receptors), których głównym zadaniem jest aktywacja komórek odporności wrodzonej, co odbywa się za pośrednictwem czynnika transkrypcyjnego NFkappa B, indukującego ekspresję wielu mediatorów prozapalnych1,3. Cząsteczki drobnoustrojów, selektywnie identyfikowane przez komórki odpowiedzi wrodzonej, znane są jako wzorce molekularne związane z patogenami, w skrócie PAMP (Pathogen Associated Molecular Patterns). Przykładem PAMP są lipopolisacharydy znajdujące się w ścianie komórkowej bakterii gramujemnych, kwas tejchojowy wchodzący w skład ściany bakterii gramdodatnich, a takŜe mannan obecny w otoczce droŜdŜaków1,4. Nieswoista reakcja obronna organizmu składa się zwykle z trzech etapów: rozpoznania drobnoustrojów, wzrostu przepuszczalności ściany naczyń, umoŜliwiającego utworzenie wysięku zapalnego oraz chemotaksji komórek do miejsca inwazji drobnoustrojów. Komórki Ŝerne, czyli granulocyty obojętnochłonne i makrofagi, docierają tam jako pierwsze, dzięki czynnikom chemotaktycznym. Poprzez receptory, zlokalizowane w błonie komórkowej, granulocyty i 9 makrofagi reagują na obecność czynników chemotaktycznych, przemieszczając się w kierunku ich rosnącego stęŜenia. Kluczowymi dla odpowiedzi zapalnej czynnikami chemotaktycznymi są fragmenty C5a i C3a dopełniacza, IL-1, IL-8, TNF α, TGF-β, CRP, FMLP (formylowane peptydy, produkowane przez bakterie), a takŜe defensyny (uwalniane przez neutrofile i komórki nabłonków), leukotrien LTB4 i czynnik aktywujący płytki (PAF)wytwarzany między innymi przez neutrofile. Niektóre spośród nich (np. IL-8) działają chemotaktycznie równieŜ na limfocyty T 1, 3. Poza działaniem przyciągającym fagocyty do miejsca inwazji drobnoustrojów, FMLP oraz IL-8 wykazują takŜe właściwości aktywujące fagocytozę i cytotoksyczność. Poza IL-8, głównymi aktywatorami granulocytów obojętnochłonnych jest G-CSF, GM-CSF oraz chemokiny5. Z kolei cytokiną najsilniej pobudzającą monocyty i makrofagi jest IFN-γ1. Czynniki aktywujące granulocyty zwiększają w nich ekspresję enzymów i białek zaangaŜowanych w cytotoksyczność i fagocytozę. Pobudzenie makrofagów skutkuje wzrostem ich właściwości bakteriobójczych, cytotoksycznych (między innymi w stosunku do komórek nowotworowych), fagocytarnych, jak równieŜ aktywną prezentacją antygenów limfocytom T, co stanowi ogniwo łączące odporność nieswoistą ze swoistą1’ 2, 3. Aktywacja odporności swoistej inicjuje z kolei produkcję swoistych przeciwciał przez limfocyty B. Drobnoustroje opłaszczone przeciwciałami i składowymi dopełniacza ulegają immunofagocytozie, która jest procesem znacznie bardziej efektywnym od fagocytozy nieswoistej. Zatem wrodzona odpowiedź immunologiczna ma za zadanie powstrzymać zakaŜenie w jego wstępnej fazie, jednocześnie indukując rozwój doskonalszej i bardziej skutecznej- odpowiedzi swoistej1’2. Zmniejszona rezerwa szpikowa granulocytów obojętnochłonnych, ich niedojrzałość enzymatyczna i fagocytarna, jak równieŜ niska gęstość CD11b i CD62L stanowią główną przyczynę zwiększonej podatności noworodków na zakaŜenia bakteryjne6. Jednocześnie monocyty, pochodzące od noworodka, odznaczają się niŜszą ekspresją CD14 i HLA-DR, co z kolei osłabia pobudzenie odpowiedzi swoistej typu komórkowego. Stwierdzane u noworodków zaburzenia opsonizacji, spowodowane fizjologicznym niedoborem składowej C3 dopełniacza, utrudniają skuteczną immunofagocytozę, co wraz z upośledzeniem chemotaksji i spontanicznej migracji neutrocytów moŜe prowadzić do zakaŜeń uogólnionych6. ZakaŜenia uogólnione mogą rozwinąć się w kaŜdym wieku u chorych z zaburzeniami ilościowymi i/lub czynnościowymi granulocytów obojętnochłonnych. CięŜka neutropenia (ANC < 500/µl), stanowi znany czynnik ryzyka cięŜkich zakaŜeń bakteryjnych oraz grzybiczych7, 8. 10 I.2 Rozwój linii granulocytarnej w szpiku Hematopoeza to wieloetapowy proces, rozpoczynający się w 3 tygodniu Ŝycia płodowego, kiedy to w ścianie pęcherzyka Ŝółtkowego powstają wyspy krwiotwórcze zawierające komórki mezenchymalne, róŜnicujące się w komórki macierzyste krwi oraz w komórki tworzące ścianę naczyń krwionośnych9. W okresie prenatalnym ośrodkami krwiotworzenia są, oprócz pęcherzyka Ŝółtkowego, wątroba i śledziona, a od 3 miesiąca takŜe szpik1’ 10. Wszystkie elementy morfotyczne krwi powstają z pluripotencjalnej komórki macierzystej, dzielącej się przez całe Ŝycie9. Z niej wywodzą się komórki prekursorowe dla linii limfopoetycznej i mielopoetycznej, z której powstają następnie komórki szeregu czerwonokrwinkowego, granulocytarnego, monocytarnego oraz megakariocyty4. Szpik pełni takŜe rolę centralnego narządu, w którym powstają i dojrzewają limfocyty B1’10, 9. Granulocyty obojętnochłonne moŜna znaleźć we krwi płodu od okresu szpikowego hematopoezy, czyli od drugiego trymestru ciąŜy. Płody 22-23-tygodniowe mają około 100200 granulocytów/µl krwi. Cytokiną stymulującą zarówno róŜnicowanie, jak i dojrzewanie granulocytów jest G-CSF, wytwarzany przez komórki podścieliska szpiku, a w ostatnim trymestrze ciąŜy takŜe przez trofoblast, co uwaŜane jest za główną przyczynę fizjologicznej leukocytozy w pierwszych dobach Ŝycia6. Granulocyty obojętnochłonne zostały po raz pierwszy opisane przez Paula Ehrlicha w 1879 roku, dzięki wprowadzonym przez niego metodom barwienia rozmazu krwi, które umoŜliwiły uwidocznienie ziarnistości znajdujących się w cytoplazmie krwinek białych11. Obecnie wiadomo, Ŝe neutrofile powstają w szpiku z komórek progenitorowych CFU-GM (Colony Forming Units - Granulocyte Macrophage)9. Najmłodszym stadium komórkowym linii granulocytarnej, rozpoznawalnym przy uŜyciu mikroskopu świetlnego, jest mieloblast. W miarę kolejnych podziałów i dalszego róŜnicowania powstają promielocyty, mielocyty, metamielocyty, granulocyty obojętnochłonne z jądrem pałeczkowatym (potocznie nazywane pałeczkami lub pałkami) oraz granulocyty obojętnochłonne z jądrem segmentowanym (potocznie- segmenty)9, 12. Promielocyty zawierają ziarnistości pierwotne (azurochłonne, nieswoiste), natomiast ziarnistości wtórne (swoiste) pojawiają się wewnątrz komórek układu granulocytarnego od stadium mielocyta10. Obydwa typy ziarnistości zawierają enzymy proteolityczne oraz substancje bakteriobójcze. Neutrofile wytwarzają takŜe cytokiny prozapalne (IL-1, IL-6, IL-8)1, 3. Czas ich Ŝycia, w porównaniu z innymi krwinkami, jest krótki- wynosi zaledwie 16 dni i moŜe być podzielony na 3 okresy12’6 : • szpikowy (obejmujący proliferację i dojrzewanie, trwające około 7 dni oraz czas pobytu w puli rezerwowej, takŜe 7-dniowy) 11 • naczyniowy (trwający 6-12 godzin) • tkankowy (szacowany na około 36 godzin). Granulocyt opuszczający szpik ma średnicę około 12 µm, jądro w kształcie pałeczki lub składające się z 2- 4 segmentów, a jego cytoplazma zawiera kilkaset ziarnistości10. Rycina 1 Rozwój linii granulocytarnej w szpiku. Dinauer, M. C. et al. Hematology 2000; 2000:303-318 Dinauer, M. C. et al. Hematology 2000;2000:303-318 Mieloblast Promielocyt Mielocyt Ziarnistości pierwotne Metamielocyt Pałeczka Segment Ziarnistości wtórne Ziarnistości wtórne Ziarnistości wtórne Dojrzewaniu granulocytów towarzyszą takŜe zmiany w ekspresji receptorów i antygenów powierzchniowych. MoŜna je badać przy pomocy cytometrii przepływowej, która będąc nowoczesną metodą diagnostyczną, komplementarną w stosunku do tradycyjnego, mikroskopowego badania rozmazu szpiku, umoŜliwia szczegółową analizę przebiegu róŜnicowania i dojrzewania wszystkich linii hematopoetycznych, poprzez ocenę ekspresji antygenów róŜnicowania komórkowego (CD) oraz wielkości (FSC) i ziarnistości komórek (SSC). Od lat osiemdziesiątych minionego wieku trwają prace nad cytometryczną oceną szpiku pochodzącego od osób zdrowych oraz dotkniętych schorzeniami obejmującymi zaburzenia hematopoezy szpikowej13. Dzięki coraz szerszym zestawom barwników fluorescencyjnych oraz bogatym panelom dostępnych przeciwciał monoklonalnych moŜliwa stała się szybka i precyzyjna diagnostyka14. Nieprawidłowości granulopoezy są kluczowym zaburzeniem w etiopatogenezie przewlekłej neutropenii. Obecnie wiemy, Ŝe wadliwa granulopoeza moŜe być następstwem: • wzmoŜonej apoptozy (cięŜka wrodzona neutropenia, cykliczna neutropenia, GSDIb), co daje obraz „bloku dojrzewania” lub tzw. przesunięcia w lewo15’16 • retencji dojrzałych granulocytów w szpiku prowadzącej do tzw. przesunięcia w prawo (mielokateksja w przebiegu WHIM)15’17 12 • zmian dysplastycznych (zespół mielodysplastyczny, do którego predysponują: SCN, niedokrwistość Fanconiego i zespół Shwachmana-Diamonda)15’18 • hipoplazji lub aplazji szpiku (SDS, niedokrwistość Fanconiego, agranulocytoza polekowa i wywołana przez wirusy)12’19 • wzmoŜonego niszczenia dojrzałych neutrocytów po opuszczeniu przez nie szpiku (hipersplenizm, autoprzeciwciała), co prowadzi do pobudzenia granulopoezy i tzw. przesunięcia w lewo12’19 • rozrostu nowotworowego, wypierającego prawidłowe utkanie szpiku10’12’19. Wymienionym powyŜej stanom patologicznym odpowiadają zmiany w proporcjach poszczególnych komórek szeregu granulocytarnego i/lub obecność komórek o nieprawidłowym fenotypie, wielkości, ziarnistości. Do cytometrycznej oceny granulopoezy słuŜyć mogą róŜne zestawy barwień z uŜyciem wielu przeciwciał monoklonalnych, gdyŜ dotychczas poznano zmiany w ekspresji ponad trzydziestu antygenów róŜnicowania komórkowego (CD), znajdujących się na powierzchni poszczególnych stadiów rozwojowych linii granulocytarnej14, co ilustruje tabela 1. Tabela 1 Ekspresja antygenów powierzchniowych CD w czasie granulopoezy11 CFU-GM Mieloblasty Promielocyty Mielocyty Metamielocyty Pałeczki Segmenty genda do tabeli 1: Legenda do tabeli 1: CFU-GM – jednostka tworząca kolonie granulacytarno-monocytarne, +++ wysoka ekspresja , ++ umiarkowana ekspresja , + niska ekspresja , - brak ekspresji. 13 Istotnym elementem oceny granulopoezy jest takŜe parametr SSC (Side Scatter), określający ilość światła rozproszonego na boki. Jest on tym wyŜszy, im więcej ziarnistości zawierają badane komórki, stąd wysokie SSC w komórkach szeregu granulocytarnego, począwszy od stadium promielocyta. Rycina 2 ilustruje zmianę ekspresji róŜnych antygenów CD w przebiegu prawidłowej granulopoezy, w oparciu o dwa zestawy przeciwciał monoklonalnych: CD34/CD117/CD45/CD13.33 oraz CD16/CD13/CD45/CD11b13. Rycina 2 Ekspresja antygenów CD w przebiegu prawidłowej granulopoezy 13 14 Pierwszy zestaw dostarcza głównie informacji dotyczących wczesnych stadiów rozwojowych granulocytów obojętnochłonnych- mieloblastów i promielocytów, natomiast drugi dobrze charakteryzuje kolejne stadia rozwojowe- mielocyty, metamielocyty, pałeczki i segmenty, nie pozwala jednak na rozróŜnienie stadium metamielocyta od granulocyta o jądrze pałeczkowatym13’14. RozróŜnienie to moŜliwe jest dzięki ocenie np. antygenu CD64, którego ekspresję stwierdzić moŜna na metamielocytach, przy jednoczesnym jej braku na pałeczkach14. Patologiczne przesunięcia w dystrybucji poszczególnych subpopulacji komórek układu granulocytarnego zaobserwowano w przebiegu AML, MDS oraz SCN11, 13, 14, 20. We wszystkich wymienionych chorobach wzrasta (w róŜnym stopniu) liczba wczesnych stadiów rozwojowych neutrofili, przy jednoczesnym zmniejszeniu liczby postaci bardziej dojrzałych. Obserwowano takŜe zmiany w zawartości ziarnistości, powodujące spadek lub- rzadziejwzrost SSC. Z kolei nadmierna ekspresja CD13 i CD33, przy jednoczesnej obniŜonej ekspresji CD11b i CD16, pojawienie się antygenów nie występujących na komórkach linii mieloidalnej lub utrata ekspresji CD64 mogą wystąpić w MDS20’21. I.3 Przewlekła neutropenia u dzieci- definicja, podział, objawy kliniczne. Przewlekła neutropenia (PN), będąca ilościowym zaburzeniem układu granulocytarnego, definiowana jest jako obniŜenie bezwzględnej liczby granulocytów obojętnochłonnych (ANC- absolute neutrophil count) poniŜej 1500/µl, trwające przynajmniej 6 miesięcy12’19, 22. Opierając się na ANC wyróŜniono następujące postaci: • neutropenię łagodną • neutropenię umiarkowaną ANC 1000 – 500 /µl • neutropenię cięŜką ANC < 500 /µl • agranulocytozę ANC < 100 /µl ANC 1500 – 1000 /µl Do końca 2 roku Ŝycia, ze względu na fizjologiczną limfocytozę, neutropenia definiowana jest jako stan, w którym ANC nie przekracza 1000 /µl 12 23 ’ . Niektórzy autorzy, jako dolną granicę normy ANC dla dzieci powyŜej 10 roku Ŝycia podają 1800 komórek/µl, podobnie jak u dorosłych24. Z kolei u noworodków, w pierwszych 2 dobach Ŝycia, w związku z fizjologiczną leukocytozą, za wartość graniczną ANC przyjęto 8000/ µl 12’19. PN występuje w przebiegu kilkunastu niezwykle rzadkich schorzeń uwarunkowanych genetycznie, ujawniających się w wieku rozwojowym, częściej jednak stanowi następstwo chorób nabytych, upośledzających granulopoezę lub prowadzących do zwiększonego niszczenia granulocytów obojętnochłonnych przez auto- lub alloprzeciwciała12’23’25. Ze 15 względu na róŜnorodność przyczyn nie sposób jednoznacznie określić częstości występowania PN w wieku rozwojowym. Niewątpliwie występuje ona u dzieci rzadko12’23’26; przykładowo- cięŜka wrodzona neutropenia, cykliczna neutropenia oraz niedobór ligandu CD40 (dawniej-zespół hiperIgM typu I) występują z częstością szacowaną na około 1:1000.000 Ŝywych urodzeń 27 . Większą częstość występowania obserwuje się w przypadku zespołu Shwachmana- Diamonda (1: 200.000)28, autoimmunizacyjnej neutropenii niemowląt (1:100.000)29, alloimmunizacyjnej neutropenii noworodków (1: 6000 ciąŜ)30. Zarówno u dzieci, jak i u dorosłych, dominującą przyczyną przewlekłej neutropenii jest zaburzenie hematopoezy szpikowej przez leki, zakaŜenia wirusowe, związki chemiczne (zawarte w: lakierach, detergentach, pestycydach, rozpuszczalnikach) lub niedobory Ŝywieniowe (główna przyczyna w skali światowej)7’12’19’23. W diagnostyce róŜnicowej najbardziej uŜyteczny wydaje się podział na neutropenie wrodzone (występujące nabyte6’12’19’15’23’27. w przebiegu schorzeń uwarunkowanych genetycznie) i Jednostki chorobowe zaliczające się do obu tych grup ujęto w tabeli 2. Tabela 2 Przyczyny przewlekłej neutropenii u dzieci Neutropenie wrodzone Neutropenie nabyte • CięŜka wrodzona neutropenia (SCN) Neutropenie polekowe • Agranulocytoza Kostmanna (AK) Neutropenie poinfekcyjne • Cykliczna neutropenia (CyN) Uszkodzenie szpiku przez: • Zespół Bartha • związki chemiczne • Glikogenoza typu I b (GSD Ib) • promieniowanie jonizujące Zespół Shwachmana- Diamonda (SDS) Immunoneutropenie : Łagodna rodzinna neutropenia (FBN) Kwasice organiczne: • metylomalonowa (MMA) • izowalerianowa (IVA) • propionowa (PA) • alloimmunizacyjna – NAIN • autoimmunizacyjne : pierwotna – AIN wtórne – w przebiegu SLE, JCA, ES, ALPS, CVID 16 Niedokrwistość Fanconiego (FA) Zespół hiperIgM typ I i III Mielokateksja i zespół WHIM Agammaglobulinemia Brutona (XLA) Zespół Chediaka – Higashiego (CHS) Zespół Griscellego typu II (GS II) Dysgenezja siateczki (RD) Hipoplazja chrząstkowo – włosowa Zespół Cohena Zmniejszenie czynnej masy szpiku : • białaczki, MDS, LCH • przerzuty nowotworów, chłoniaki • cystynoza, osteomieloskleroza Idiopatyczna neutropenia (CIN) NiedoŜywienie Niedobór wit. B12 lub kwasu foliowego Niedobór miedzi Hipersplenizm Przewlekła neutropenia moŜe stanowić jeden z wielu elementów zespołu (np. zespołu Shwachmana- Diamonda, niedoboru ligandu CD40), jak równieŜ być wiodącym objawem choroby (cięŜka wrodzona neutropenia, cykliczna neutropenia, łagodna rodzinna neutropenia). Jest takŜe charakterystycznym zaburzeniem hematologicznym kilku wrodzonych błędów metabolizmu takich, jak: glikogenoza typu I b (GSD Ib)31, kwasica metylomalonowa, izowalerianowa, propionowa6’7’23’32 oraz zespołu Bartha32’33. Towarzyszyć moŜe pierwotnym niedoborom odporności: zespołowi hiperIgM typu I i III6’7’34’35, agammaglobulinemii Brutona (XLA)35’36’37’38, zespołowi Chediaka-Higashiego (CHS)15’32’39, zespołowi Griscellego typu II (GS II)15’32’40’41, pospolitemu zmiennemu niedoborowi odporności (CVID)6’7’15’25’35’42’43, autoimmunizacyjnemu zespołowi limfoproliferacyjnemu (ALPS)6’7’15’27’35’43’44’45, zespołowi Wiskotta-Aldricha (WAS)15’35’46 oraz cięŜkiemu złoŜonemu niedoborowi odporności (SCID)15’27’47. PN moŜe być równieŜ skutkiem autoimmunizacji, co ma miejsce w przebiegu autoimmunizacyjnej neutropenii niemowląt (AIN)6’12’23’29’48, rzadziej w układowym toczniu rumieniowatym (SLE)7’12’19’23’32’49, przewlekłym idiopatycznym zapaleniu stawów (JCA)7,23,32,49 i w zespole Evansa 7’35’43’45’50. Nabyta PN występuje częściej niŜ postaci wrodzone, a jej główną przyczynę stanowią leki7,12,51, związki chemiczne, wirusy (EBV, CMV, HAV, HBV, HCV, HIV, Parwowirus B19, HHV6, VZV)6’12’19’23’24’32, bakterie (Mycobacteruim tuberculosis, Brucella sp, Helicobacter pylori)24, niedobory Ŝywieniowe, jak równieŜ choroby prowadzące do zmniejszenia czynnej masy szpiku (tabela 2)12’19. 17 PN moŜe być takŜe skutkiem hipersplenizmu, obserwowanego w przebiegu CVID i ALPS, zespołu Felty’ego, chorób wątroby z nadciśnieniem wrotnym, sferocytozy wrodzonej oraz choroby Gauchera22. Coraz częściej rozpoznawaną obecnie jednostką chorobową jest autoimmunizacyjna neutropenia niemowląt- AIN, określana dawniej jako przewlekła łagodna neutropenia. Występuje z częstością szacowaną w USA na około 1:100000 23, 29, 52. Podstawą rozpoznania AIN jest wykrycie obecności przeciwciał przeciwgranulocytarnych w surowicy chorego dziecka. Przeciwciała przeciwko antygenom powierzchniowym granulocytów mogą powstać takŜe wskutek alloimmunizacji, jak ma to miejsce w NAIN (noworodkowa alloimmunizacyjna neutropenia)29, 30, 53. Zmniejszona liczba krąŜących we krwi neutrocytów zwiększa podatność chorych na zakaŜenia szczególnie, gdy ANC spada poniŜej 500/µl, dlatego teŜ na obraz kliniczny przewlekłej neutropenii składają się przede wszystkim nawracające zakaŜenia bakteryjne: skóry, tkanki podskórnej, śluzówek, węzłów chłonnych, dróg oddechowych i moczowych6, 12, 15,19,22,54 . Charakterystycznymi objawami klinicznymi PN są równieŜ nawracające bolesne owrzodzenia w jamie ustnej, przewlekłe zapalenie przyzębia, przedwczesna utrata zębów mlecznych i stałych, przedłuŜone gojenie ran, a u noworodków- późne oddzielenie kikuta pępowiny i stan zapalny pępka (omphalitis)6,7,12,22,23,54. CięŜkość oraz częstość zakaŜeń występujących u chorych z przewlekłą neutropenią zaleŜy od rozpoznanej jednostki chorobowej, wieku dziecka, towarzyszących zaburzeń odporności swoistej (hipogammaglobulinemia w SDS, WHIM i CVID, zaburzenia odporności komórkowej i humoralnej w niedoborze ligandu CD40 i RD, nieprawidłowa chemotaksja w SDS, zespole Chediaka- Higashiego i glikogenozie typu I b, zaburzenia aktywności cytotoksycznej komórek NK i limfocytów T cytotoksycznych w zespole Griscellego typu II i ChediakaHigashiego)15,23,25,26,54. Wśród mikroorganizmów wywołujących zakaŜenia u chorych z PN dominują bakterie G(+): gronkowce (Staphylococcus aureus, epidermidis), paciorkowce (Streptococcus pneumoniae, pyogenes, viridans), enterokoki (Enterococcus faecalis, faecium); istotnym czynnikiem etiologicznym są takŜe pałeczki G(-): Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa i Klebsiella sp oraz beztlenowce stanowiące florę jamy ustnej: Peptococci, Peptostreptococci, Bacteroides fragilis, Fusobacterium sp12,15,23,24,48. Natomiast grzyby oportunistyczne, powodujące cięŜkie zakaŜenia u chorych z neutropenią wtórną do chemioterapii, rzadko stanowią czynnik etiologiczny w przebiegu przewlekłej neutropenii7,8,19,55. Wyjątek stanowią 18 chorzy z cięŜką wrodzoną neutropenią (SCN) i pierwotnymi niedoborami odporności, którym towarzyszą zaburzenia odporności komórkowej. Dlatego teŜ u chorych z niedoborem ligandu CD40 i RD wystąpić moŜe nawracająca pleśniawica, inwazyjna kandydoza i aspergilloza, pneumocystozowe zapalenie płuc 6,7,15,23,56, a nawet mukormykoza56,57. I.4 Omówienie wybranych chorób nabytych i wrodzonych przebiegających z przewlekłą neutropenią I.4.A. Autoimmunizacyjna neutropenia niemowląt (AIN) AIN (AutoImmune Neutropenia of infancy), określana dawniej jako przewlekła łagodna neutropenia (chronic benign neutropenia), jest jednostką chorobową rozpoznawaną od kilkunastu lat z rosnąca częstością23,24,29,54. Przyczyna choroby pozostaje nieznana, choć podejrzewa się, Ŝe powstawanie autoprzeciwciał w mechanizmie mimikry antygenowej mogą stymulować czynniki zakaźne, a zwłaszcza wirusy7,23,48. AIN występuje z częstością szacowaną w USA na około 1:100000 co sprawia, Ŝe jest uwaŜana za główną przyczynę przewlekłej neutropenii u dzieci poniŜej 4 roku Ŝycia52. Rozpoznawana jest zwykle między 5 miesiącem a 5 rokiem Ŝycia; przebiega łagodnie, z niewielkim ryzykiem cięŜkich zakaŜeń bakteryjnych, mimo obniŜenia ANC nawet poniŜej 100/µl7,29,48,54. W związku z fizjologiczną limfocytozą, występującą u dzieci poniŜej 4 roku Ŝycia, leukopenia w przebiegu AIN obserwowana jest rzadko29,52. Część chorych prezentuje monocytozę, rzadziej eozynofilię; natomiast wystepująca u nich niedokrwistość jest następstwem niedoboru Ŝelaza i zakaŜeń 29,52,48,54 . Choroba ma przebieg samoograniczający się- ustępuje po 6-60 miesiącach (średnio po 17 miesiącach), choć około 5% dzieci nie uzyskuje prawidłowej liczby neutrocytów przed ukończeniem 4 roku Ŝycia23,29,48. Podstawą rozpoznania AIN jest wykrycie obecności przeciwciał przeciwgranulocytarnych w surowicy chorego dziecka, co wykazał w 1975 roku – Lalezari, będący autorem pierwszego opisu grupy 121 chorych z tą postacią przewlekłej neutropenii29. Większość dzieci choruje na nawracające zapalenia ucha środkowego, zakaŜenia górnych dróg oddechowych, bakteryjne zapalenia węzłów chłonnych, ropnie podskórne, zakaŜenia dróg moczowych i przewodu pokarmowego. Zapalenie dziąseł z reguły nie występuje u niemowląt. CięŜkie zakaŜenia takie, jak: posocznica, bakteryjne zapalenie płuc, czy ropnie okołoodbytnicze lub wargi sromowej, naleŜą do rzadkości w przebiegu AIN i jak dotąd nie opisano Ŝadnego chorego, który zmarłby wskutek powikłań infekcyjnych23,48,52,54,58. Ten łagodny obraz kliniczny jest najpewniej konsekwencją prawidłowej czynności szpiku. 19 Mielogramy dzieci z AIN wyglądają podobnie- szpik jest bogatokomórkowy, z tzw. przesunięciem w lewo do granulocyta obojętnochłonnego pałeczkowatego, a nawet metamielocyta27,29,48,. Dzięki temu, pod wpływem zakaŜenia, dochodzi do uwolnienia ze szpiku większej liczby granulocytów, która jest zwykle wystarczająca, aby opanować rozwijającą się infekcję 27,52. Przeciwciała przeciwgranulocytarne, identyfikowane u chorych z AIN, naleŜą głównie do klasy IgG, czasem towarzyszą im przeciwciała klasy IgM, a skierowane są przeciw antygenowi granulocytów HNA1 lub HNA2 7,23,24,59. Niestety, mimo powszechnie stosowanych nowoczesnych metod diagnostycznych, wykrycie AGABs w surowicy chorych nie jest łatwe. Dzieje się tak między innymi dlatego, Ŝe kompleksy jakie tworzą one z antygenami błony komórkowej neutrocytów, szybko ulegają internalizacji do wnętrza komórki i cytoplazmy 7. I.4.B. Alloimmunizacyjna neutropenia noworodków (NAIN) NAIN (Neonatal AlloImune Neutropenia) występuje u noworodków i młodszych niemowląt urodzonych przez matki, w których surowicy znajdują się alloprzeciwciała skierowane przeciwko antygenom granulocytów dziecka, które odziedziczyło ono po ojcu, a których nie posiada matka23,30. Chorobę tę po raz pierwszy opisał w 1960 roku Lalezari 53, a późniejsze badania wykazały, Ŝe odpowiadają za nią przeciwciała skierowane przeciw antygenom HNA-1a (NA1), HNA-1b (NA2), HNA-1c (SH), HNA-2a (NB1), HNA-3a (5b), HNA-4a (MART) oraz FcγRIIIb24,30,60,61,62. W Polsce ekspertami z zakresu NAIN są panie profesor Barbara śupańska i Krystyna Maślanka, które w 2001 roku opublikowały wyniki swych badań dowodząc, Ŝe częstość występowania tej jednostki chorobowej wynosi około 1: 6000 noworodków30. NAIN moŜe pojawić się u noworodka z pierwszej ciąŜy, ale ryzyko jej wystąpienia jest niskie, gdyŜ zaledwie 3% matek z niezgodnością antygenów granulocytarnych w stosunku do dziecka, wytwarza alloprzeciwciała przeciwgranulocytarne 30 . Obecność alloprzeciwciał wywołujących NAIN moŜna wykazać zarówno we krwi matki, jak i dziecka, przy czym matka nigdy nie ma z tego powodu neutropenii. Większość niemowląt uzyskuje prawidłowe ANC przed ukończeniem 3 miesiąca Ŝycia (normalizację ANC obserwowano u dzieci w wieku od 3 do 28 tygodni) i rzadko ma z tego powodu cięŜkie powikłania infekcyjne23,30, choć opisano przypadki gwałtownie przebiegających, 53 zakończonych zgonem, zakaŜeń uogólnionych . Mielogramy dzieci z NAIN są prawidłowebogatokomórkowe, z pobudzonym układem granulocytarnym, natomiast we krwi obwodowej chorych często stwierdza się monocytozę53. CięŜszy i dłuŜszy przebieg zaobserwowano w 20 NAIN wywołanej przez alloprzeciwciała skierowane przeciw antygenom HNA-2a, co związane jest z obecnością tych antygenów takŜe na niedojrzałych komórkach granulopoezy i powodować moŜe obraz wysokiego bloku dojrzewania szeregu granulocytarnego60. Kobieta, u której dziecka stwierdzono NAIN, wywołaną swoistymi alloprzeciwcialami przeciwgranulocytarnymi, nie moŜe zostać krwiodawcą z uwagi na wysokie ryzyko wystąpienia u biorcy cięŜkiego powikłania po przetoczeniu preparatów jej krwi, typu TRALI (Transfusion-Related Acute Lung Injury)63. W okresie noworodkowym, u dzieci matek z neutropenią autoimmunizacyjną np. w przebiegu tocznia rumieniowatego układowego, wystąpić moŜe tzw. przejściowa neutropenia noworodków (Transitory Neonatal Neutropenia)24,52. Neutropenię i przeciwciała przeciwgranulocytarne mają wówczas oboje- matka i jej dziecko. Powrót ANC do normy obserwowano u tych niemowląt po około 8 tygodniach52. I.4.C. Wrodzona neutropenia (CN) Wrodzona neutropenia (Congenital Neutropenia- CN) obejmuje heterogenną grupę niezwykle rzadkich chorób, uwarunkowanych genetycznie, do których zaliczono: cięŜką wrodzoną neutropenię (SCN), cykliczną neutropenię, glikogenozę typu Ib, zespół Shwachmana-Diamonda, zespół Chediaka-Higashiego, zespół Griscellego typu II, zespół Bartha, zespół WHIM, dysgenezję siateczki, zespół Cohena, hipoplazję chrząstkowo-włosową i zespół Pearsona6,7,15,23,24,64. Choroby te róŜnią się symptomatologią, rokowaniem, a takŜe ryzykiem transformacji nowotworowej. Odkrycia ostatnich lat pozwoliły zidentyfikować geny, których mutacje odpowiadają za większość przypadków CN15,65, co ilustruje tabela 3. Tabela 3 Defekty genetyczne we wrodzonej neutropenii (CN)65 Jednostka chorobowa Zmutowany gen Konsekwencje CięŜka wrodzona neutropenia: AD-SCN i CyN - ELA2/ELANE AR-SCN / AK - HAX-1 Niedobór GFI 1 - GFI 1 XL-SCN - WAS Niedobór G6PC3 - G6PC3 Nadmierna apoptoza komórek linii granulocytarnej w szpiku 21 - SLC37A4 Glikogenoza typu Ib CN związana z albinizmem: Z. Chediaka-Higashiego - LYST/CHS1 Z. Griscellego typu II - RAB27A Z. Hermansky’ego-Pudlaka - AP3B1 Zaburzenia aktywności limfocytów T CD8+ i komórek NK, często zespół hemofagocytarny Inne zespoły związane z CN: Dysgenezja siateczki - AK2 Z. Shwachmana-Diamonda - SBDS WHIM - CXCR4 - CN + brodawki skórne - RMRP - CN + dysplazja kostna Z. Bartha - G 4.5/TAZ - CN + kardiomiopatia Z. Cohena - COH/VPS13B - CN + dysmorfia + upośledzenie Hipoplazja chrząstkowowłosowa - SCID z agranulocytozą - CN + zaburzenia zewnątrzwydzielnicze trzustki umysłowe Z. Pearsona - pancytopenia + zaburzenia (-) Delecja mitochondrialna Niedobór CD40L I.4.D. zewnątrzwydzielnicze trzustki - TNFSF5 - CN + hipogammaglobulinemia + zaburzenia odporności komórkowej CięŜka wrodzona neutropenia (SCN) CięŜka wrodzona neutropenia (SCN - Severe Congenital Neutropenia)- do niedawna utoŜsamiana z agranulocytozą Kostmanna (AK)66,67, dziedziczona jest w sposób bardzo róŜnorodny- autosomalnie recesywny, dominujący lub sprzęŜony z płcią; wiele przypadków określono, jako sporadyczne15,26. Odkrycie mutacji w genach ELA-2/ELANE, HAX-1, GFI1, G6PC3 oraz mutacji aktywujących białko WAS wyjaśniły tę heterogenność68,69,70,71,72. Obecnie wiadomo, Ŝe opisana w 1956 roku przez szwedzkiego pediatrę Rolfa Kostmanna grupa chorych z cięŜką przewlekłą neutropenią, dziedziczoną w sposób autosomalnie 22 recesywny, miała homozygotyczne mutacje w genie HAX-1, zlokalizowanym na dłuŜszym ramieniu chromosomu 1 (1q22)71. Pozostali chorzy, u których udało się zidentyfikować mutacje HAX-1 pochodzili w większości z rodzin tureckich i kurdyjskich67, a ich rodzice byli spokrewnieni – podobnie, jak w grupie opisanej przez Kostmanna. Z kolei mutacje w genie ELA-2 (ostatnio określanym jako ELANE), kodującym elastazę neutrofili, zidentyfikowane u około 60- 80% chorych z SCN, dziedziczone są w sposób autosomalnie dominujący lub występują sporadycznie65. Do tej pory zidentyfikowano około 50 róŜnych mutacji genu ELANE, w większości zlokalizowanych w obrębie egzonów 4 i 573. Natomiast za przypadki SCN sprzęŜone z chromosomem X odpowiadają mutacje aktywujące białko WAS (WiskottAldrich syndrome)70. Opublikowane niedawno dane SCNIR (Severe Chronic Neutropenia International Registry) wykazały, Ŝe około 56% chorych z SCN, znajdujących się w rejestrze, ma heterozygotyczną mutację w genie ELA2/ELANE74; u 18% wykryto mutacje genu HAX1 (w obu allelach), a u około 4% pacjentów - w genie G6PC3 68. Częstość występowania SCN szacowana jest na 1- 2 : 1000.000 Ŝywych urodzeń6,15,26. Pierwsze objawy choroby występują u większości dzieci juŜ w okresie noworodkowym i obejmują: opóźnione oddzielenie kikuta pępowiny, zapalenie pępka (omphalitis), cięŜkie zakaŜenia bakteryjne (posocznice, zapalenia płuc, ropnie okołoodbytnicze); u nielicznych chorych zakaŜenia pojawiają się dopiero w okresie niemowlęcym7,15,22,23,56,66,67. Klasycznym objawem SCN jest cięŜkie zapalenie dziąseł, prowadzące do destrukcji kości szczęki i Ŝuchwy, a następnie do rozchwiania i utraty zębów75,76. Mimo cięŜkiej neutropenii, zapalenie przyzębia obserwowane jest dopiero u 2-3-letnich dzieci z SCN 67,77. We krwi obwodowej chorych z SCN stwierdza się cięŜką neutropenię; ANC rzadko przekracza 200/µl, a maksymalne wartości, odnotowane u pacjentów z chorobą potwierdzoną genetycznie, nie przekraczały 600 neutrocytów/µl. Zahamowanie dojrzewania szeregu granulocytarnego na etapie promielocyta lub mielocyta, określane jako tzw. wysoki blok dojrzewania oraz zwiększona ilość granulocytów kwasochłonnych w szpiku stanowią obraz charakterystyczny, lecz nie patognomoniczny dla SCN6,15,22,26,56,66. Podobne nieprawidłowości w mielogramie opisano u części chorych z niedoborem CD40L i zespołem Bartha15,33. Monocytoza, eozynofilia, niedokrwistość (z niedoboru Ŝelaza i śródinfekcyjna), poliklonalna hipergammaglobulinemia, czasem nadpłytkowość, to kolejne zaburzenia obserwowane w tej grupie chorych7,19,22,23,51,54,78. Najnowsze doniesienia mówią o nieprawidłowościach neurologicznych (zmiany degeneracyjne w OUN, padaczka, obniŜony iloraz inteligencji) obserwowanych u chorych z mutacjami w genie HAX-179,80. 23 Do czasu wprowadzenia do leczenia, w latach osiemdziesiątych ubiegłego wieku, rekombinowanego ludzkiego czynnika wzrostu kolonii granulocytarnych (rHuG-CSF), większość chorych z SCN umierała we wczesnym dzieciństwie, w przebiegu cięŜkich zakaŜeń; pozostali ginęli z powodu MDS lub AML 15,67,23,56 . Okazało się bowiem, Ŝe SCN podobnie jak inne wrodzone zaburzenia hematopoezy (niedokrwistość Fanconiego, dyskeratoza wrodzona, SDS) predysponuje do transformacji w zespół mielodysplastyczny i ostrą białaczkę szpikową81. Dane z Międzynarodowego Rejestru SCNIR (Severe Chronic Neutropenia International Registry) wskazują na 12-15 % ryzyko wystąpienia AML u chorych z SCN. Ryzyko to znamiennie wzrasta u dzieci z monosomią chromosomu 7 (wystąpiła u 14% chorych z SCNIR), trisomią chromosomu 21 (wystąpiła u 16% chorych w rejestrze), a takŜe nabytą somatyczną mutacją punktową genu receptora dla G-CSF (80% dzieci z MDS/AML w przebiegu SCN miała tę mutację)15,77,82. Mimo róŜnorodnego tła genetycznego, przyczyną cięŜkiej przewlekłej neutropenii u chorych z SCN jest wzmoŜona apoptoza komórek progenitorowych linii granulocytarnej. Nadmierne niszczenie prekursorów szeregu granulocytarnego pozwala wyjaśnić takŜe zjawisko pozornego „bloku dojrzewania granulocytów”, którym tłumaczono brak metamielocytów, pałeczek i dojrzałych granulocytów obojętnochłonnych w szpiku osób z SCN15,26. Nieliczne granulocyty, które nie uległy przedwczesnej apoptozie, dojrzewają i przenikają do krwi obwodowej, lecz jest ich zbyt mało, aby zapewnić sprawne funkcjonowanie odporności wrodzonej. I.4.E. Cykliczna neutropenia (CyN) Cykliczna neutropenia (Cyclical Neutropenia- CyN) jest, podobnie jak SCN, spowodowana mutacjami w genie ELA2/ELANE, lecz dziedziczonymi w sposób autosomalnie dominujący lub występującymi sporadycznie15,68. Mutacje te zidentyfikowano dotąd u 80-90% chorych z klinicznym podejrzeniem CyN. Gen ELANE, znajdujący się na chromosomie 19p13.3, koduje glikoproteinowy enzym- elastazę neutrocytów, której obecność udowodniono w promielocytach. Przypuszcza się, Ŝe wskutek mutacji dochodzi do gromadzenia nieprawidłowej elastazy poza ziarnistościami azurochłonnymi, wskutek czego wydostaje się ona z retikulum endoplazmatycznego do cytoplazmy promielocytów, co z kolei przyspiesza ich apoptozę15,26,65,83. Choroba charakteryzuje się spadkami liczby granulocytów obojętnochłonnych poniŜej 200/µl, trwającymi od 3 do 6 dni, pojawiającymi się regularnie co około 21 dni (opisano 24 chorych z cyklami co 15, a nawet 31 dni). Okresom neutropenii obwodowej towarzyszą zmiany w obrazie szpiku. Podczas najgłębszego spadku ANC zaobserwowano brak metamielocytów, pałeczek i dojrzałych neutrocytów w mielogramach chorych z CyN15, 22,26. Natomiast w okresach wolnych od neutropenii, obraz szpiku jest prawidłowy. Wraz z obniŜaniem się ANC wzrasta liczba monocytów w szpiku i we krwi obwodowej. Cykliczną neutropenię po raz pierwszy opisał Leale w 1910, u 19-miesięcznego chłopca z nawrotami gorączek i owrzodzeń w jamie ustnej z jednoczesną agranulocytozą, u którego w okresach bez dolegliwości ANC sięgało 2000/ µl 68 . Większość chorych rozwija objawy CyN we wczesnym dzieciństwie, a okresom cięŜkiej neutropenii towarzyszy zwykle gorączka, osłabienie, bolesne owrzodzenia w jamie ustnej, zapalenie gardła i/lub migdałków, powiększenie węzłów chłonnych szyjnych, czasemzapalenie ucha środkowego lub ropnie podskórne, rzadziej- cięŜkie zakaŜenia, choć opisano chorych z posocznicą o etiologii gronkowcowej lub Clostridium septicum, zapaleniem otrzewnej i ropniami okołoodbytniczymi6,15,26,22,54. Typowym dla CyN objawem jest takŜe przewlekłe zapalenie dziąseł, rozpoczynające się zwykle w 2-3 roku Ŝycia. Potwierdzenie występowania regularnych oscylacji ANC wymaga wykonywania morfologii krwi obwodowej wraz z rozmazem manualnym 3 razy w tygodniu przez 5-6 tygodni 22,23,27. I.4.F. Zespół Shwachmana- Diamonda (SDS) SDS jest chorobą wieloukładową, w przebiegu której obserwuje się zaburzenia hematopoezy, zewnątrzwydzielniczą niedoczynność trzustki, nieprawidłowości układu kostnego oraz zaburzenia ilościowe i czynnościowe granulocytów obojętnochłonnych15. Zespół występuje 1:100.000-200.000 urodzeń, bez predylekcji dla płci lub z niewielką przewagą chłopców (1,7:1) i jest uwaŜany za drugą, pod względem częstości, po mukowiscydozie, przyczynę niewydolności zewnątrzwydzielniczej trzustki 15,26,84. Przyczyną, dziedziczonego w sposób autosomalnie recesywny, zespołu są mutacje genu Shwachmana-Bodiana-Diamonda (SBDS), zlokalizowanego na chromosomie 7q1185. Diagnozę ustala się w oparciu o obraz kliniczny, przy pomocy kryteriów zaproponowanych przez Drora i Freedmana86. Dzieci z SDS cierpią z powodu zakaŜeń układu oddechowego oraz nawracającej lub przewlekłej biegunki tłuszczowej, w związku z czym słabo przybierają na wadze. W badaniu Ginzberga, opublikowanym w 1999 roku, stolce tłuszczowe oddawało 86% chorych, a u 91% 25 stwierdzono niskie stęŜenie trypsynogenu w osoczu 87. Czułym testem diagnostycznym u dzieci z podejrzeniem stolców tłuszczowych jest oznaczanie stęŜenia tłuszczu w trzydobowej zbiórce kału 86,88. Chorym powyŜej trzeciego roku Ŝycia, bez biegunki i z prawidłowym stęŜeniem trypsyno genu w surowicy, poszukując dowodów na zaburzenia czynności zewnątrzwydzielniczej trzustki, naleŜy zbadać stęŜenie izomaltazy w surowicy 88. Hepatomegalię i/lub podwyŜszoną aktywność enzymów wątrobowych opisano u około 75% chorych z SDS poniŜej 5 roku Ŝycia; zaburzenia te zwykle ulegają normalizacji z wiekiem, choć opisano chorych z SDS i przewlekłą chorobą wątroby, prowadząca do marskości89. Przewlekła neutropenia, stała lub okresowa, wystąpiła u około 95-98% opisanych dotąd chorych z SDS. Niedokrwistość (słabo odpowiadająca na leczenie preparatami Ŝelaza, witaminą B12 i kwasem foliowym) dotyczyła około 42% dzieci, natomiast małopłytkowość stwierdzono u około 35% badanych, a pancytopenię u 10-25% 87. Neutropenia nie jest jedyną przyczyną zwiększonej zapadalności na zakaŜenia, jaką stwierdzono u chorych z SDS. Dror i wsp. u 11 chorych wykazali zaburzenia chemotaksji granulocytów i monocytów, a takŜe opisali zaburzenia związane z limfocytami B w postaci hipogammaglobuliemii (obniŜenie stęŜenia IgG, podklas IgG lub zaburzenia produkcji swoistych przeciwciał) i/lub zmniejszonej liczby krąŜących limfocytów B90. Kornfeld i wsp. opisali chorą z hipogammaglobulinemią w zakresie wszystkich klas głównych, z towarzyszącym brakiem izohemaglutynin grupowych oraz swoistych przeciwciał poszczepiennych, a takŜe obniŜoną liczbą limfocytów B91. Jako pierwszy nieprawidłową chemotaksję neutrocytów zauwaŜył i scharakteryzował Thong 92. Obraz szpiku wykazywać moŜe zmieniającą się wraz z wiekiem chorego cytozę, od prawidłowej po skąpokomórkową, natomiast w układzie granulocytarnym stwierdza się róŜnego stopnia „przesunięcie w lewo” lub hipoplazję; z czasem moŜe rozwinąć się jedno- lub wieloukładowa aplazja szpiku 93. ZakaŜenia bakteryjne ucha środkowego, zatok, płuc, skóry, węzłów chłonnych, kości i układu moczowego stanowią główny problem kliniczny dzieci z SDS i mogą być przyczyną śmierci we wczesnym dzieciństwie 86,87,89. Do zaburzeń układu kostnego, opisanych u chorych z SDS, naleŜą: dysplazja przynasadowa kości długich (wystąpiła u 40- 80% chorych, najczęściej dotyczyła kości piszczelowych), wąska klatka piersiowa (wskutek skrócenia Ŝeber), poszerzone zakończenia 26 chrzęstno- kostne Ŝeber (ang. dish-shaped ribs), koślawość kolan i łokci, syndaktylia i klinodaktylia oraz osteopenia94, 95. Problemy stomatologiczne chorych z SDS obejmują: zapalenie dziąseł, nawracające wrzodziejące zapalenia jamy ustnej oraz dysplazję szkliwa, prowadzącą do rozległej próchnicy u około 1/3 dzieci96. Przy pomocy USG lub TK jamy brzusznej moŜna wykazać zmieniony obraz trzustki, która ulega stłuszczeniu, w związku z czym staje się mała, hiperechogenna i hipodensyjna97. Niskorosłość ma w SDS patogenezę wieloczynnikową- jest następstwem częstych chorób zakaźnych, zaburzeń wchłaniania, nieprawidłowości chrzęstno- kostnych, a takŜe obniŜonego stęŜenia hormonu wzrostu (co udowodniono jedynie u części pacjentów), w związku z czym chorzy z SDS są niscy, mimo leczenia preparatami enzymów trzustki 91. Opisano juŜ kilkanaście mutacji genu SBDS 98, ale dotąd nie udało się ustalić korelacji między genotypem, a fenotypem chorych99. Część zaburzeń (funkcji wątroby i trzustki) ulega złagodzeniu z wiekiem100, inne (hematologiczne) pogłębiają się, prowadząc do hipoplazji układu granulocytarnego, a nawet aplazji szpiku 86,101, gdyŜ SDS, obok niedokrwistości Fanconiego i Dysceratosis congenita, zaliczany jest do wrodzonych zespołów prowadzących do niewydolności szpiku (ang. congenital bone marrow failure syndromes)22,26,93. Z wiekiem rośnie takŜe ryzyko transformacji w zespół mielodysplastyczny i/lub ostrą białaczkę szpikową, które opisano u 15- 24 % chorych z SDS 26,82,102. Częstość występowania AML u dzieci wynosi około 5%, ale u dorosłych sięga 25% 82. Ryzyko AML rośnie do 70% w grupie chorych z SDS, którzy rozwinęli pancytopenię i/lub zaburzenia cytogenetyczne, a zwłaszcza monosomię chromosomu 7 15, 22,26,82,103. Wg Altera i wsp. średni przewidywany wiek, którego doŜyje chory z SDS wynosi około 35 lat; pacjenci z niedokrwistością aplastyczną osiągają średnio 24 lata, natomiast chorzy z SDS i białaczką (najczęściej AML-M6), która wystąpiła w pierwszej dekadzie, rzadko przekraczają 10 rok Ŝycia104. Patogenezę neutropenii w SDS opisał Dror i wsp. wykazując, Ŝe szpik chorych zawiera zmniejszoną liczbę komórek progenitorowych CD34+; komórki te mają obniŜoną zdolność tworzenia kolonii in vitro oraz zwiększoną skłonność do ulegania apoptozie, co z kolei wiąŜe się z nadmierną ekspresją antygenu Fas na komórkach podścieliska szpiku 93. I.4.G. Glikogenoza typu Ib (GSD Ib) GSDIb (Glycogen Storage Disease type Ib) jest wrodzoną wadą metabolizmu, dziedziczoną w sposób autosomalnie recesywny, spowodowaną mutacjami w obu allelach 27 genu SLC37A4, zlokalizowanego na chromosomie 11q23 105,106.Częstość występowania wszystkich glikogenoz wątrobowych szacowana jest na 1: 25000- 30000, z czego GSDIb stanowi około 31% 105. Objawy choroby są następstwem zaburzonej degradacji glikogenu w wątrobie, wskutek niedoboru translokazy glukozo-6-fosforanu (G-6-PT). Enzym ten przemieszcza glukozo-6-fosforan (G-6-P) do światła retikulum endoplazmatycznego, gdzie następnie ulega on hydrolizie do glukozy i fosforanu nieorganicznego107. Dlatego teŜ konsekwencją niedoboru G-6-PT jest brak moŜliwości uwalniania glukozy z G-6-P, co prowadzi do hipoglikemii i hipermleczanemii. W świetle najnowszych badań, wysoka ekspresja genu kodującego translokazę G-6-P, stwierdzana w wątrobie, nerkach, komórkach progenitorowych hematopoezy, neutrofilach i monocytach, tłumaczy lokalizację narządową objawów choroby 108, prowadząc do powiększenia wątroby, nerek, a takŜe przewlekłej neutropenii. Przewlekła neutropenia oraz towarzyszące jej zaburzenia funkcji granulocytów obojętnochłonnych po raz pierwszy opisane zostały u chorych z GSDIb przez Beaudet i wsp.109. Prace kolejnych badaczy przyniosły obserwacje dotyczące zaburzeń ruchliwości, migracji oraz funkcji fagocytarnych- wtórnych do obniŜonej aktywności oksydazy NADPH neutrocytów110, stąd nieprawidłowe wyniki tzw. „wybuchu tlenowego”, jakie obserwuje się badając granulocyty obojętnochłonne, pochodzące od chorych z tą glikogenozą. Przyczyny neutropenii w GSDIb upatruje się obecnie we wzmoŜonej apoptozie granulocytów, obserwowanej zarówno w szpiku, jak i we krwi obwodowej111. Według Leuzzi i wsp. G-6-PT pełni istotną rolę w ochronie antyoksydacyjnej granulocytów, stąd jego niedobór prowadzi do wzmoŜonej apoptozy oraz zaburzeń czynności neutrofili112. Objawy kliniczne nie leczonej GSDIb to: niedobór wzrostu, twarz lalki, otyłość tułowia, opóźnione pokwitanie i przede wszystkim nawracające bakteryjne zakaŜenia skóry i tkanek miękkich (zwłaszcza okolicy urogenitalnej), zapalenia ucha środkowego, zatok, gardła, migdałków, oskrzeli, przewlekłe zapalenie dziąseł oraz nieswoiste zapalenie jelita grubego (IBD)15,26,82,106,113. CięŜkie zakaŜenia takie, jak: posocznica, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych i bakteryjne zapalenia płuc nie naleŜą do rzadkości 15. Patogenami najczęściej izolowanymi od chorych z GSDIb są bakterie G(+): Staphylococcus asureus, Streptococci grupy A, Streptococcus pneumoniae, a takŜe bakterie G(-): Escherichia coli, Pseudomonas sp.110,114. Poza neutropenią- od cięŜkiej po umiarkowaną, obserwowaną zwykle od okresu niemowlęcego, pacjenci z GSDIb prezentują takŜe niedokrwistość o wieloczynnikowej 28 etiologii (nawracające i przewlekłe zakaŜenia, niedobór Ŝelaza, witaminy B12 i kwasu foliowego, IBD) oraz upośledzoną agregację i adhezję płytek krwi, powodującą krwawienia z nosa i łatwe siniaczenie 15,105,114. Obraz szpiku pacjentów z GSDIb nie jest charakterystyczny; opisywano mielogramy zarówno prawidłowe, jak i patologiczne - z przesunięciem w lewo do metamielocyta lub hipoplazją linii granulocytarnej110,113. Ta róŜnorodność obrazu moŜe być równieŜ następstwem mielotoksycznego wpływu nawracających zakaŜeń, stosowanych leków przeciwbakteryjnych i przeciwgorączkowych, a takŜe hipersplenizmu. Powikłaniem GSDIb, mającym związek zarówno z neutropenią, jak i z defektem czynnościowym granulocytów oraz monocytów, jest wspomniane juŜ nieswoiste zapalenie jelit, które jako pierwsi opisali Roe i wsp. w 1986 roku u 2 chorych z tą glikogenozą113. Visser i wsp. poddali retrospektywnej analizie 56 pacjentów z GSDIb, stwierdzając u około 77% badanych objawy ze strony przewodu pokarmowego typowe dla IBD takie, jak: przewlekła biegunka, tworzenie przetok okołoodbytniczych i szczelin odbytu, zwęŜenie przełyku, owrzodzenia śluzówek jamy ustnej. Wymienionym symptomom towarzyszyły charakterystyczne dla IBD zmiany w badaniach- endoskopowym oraz histopatologicznym 110. Na związek przyczynowo-skutkowy neutropenii i czynnościowego defektu fagocytów z IBD wydają się takŜe wskazywać coraz liczniejsze doniesienia mówiące o występowaniu przewlekłych stanów zapalnych śluzówek przewodu pokarmowego w przebiegu: neutropenii cyklicznej, SCN oraz przewlekłej choroby ziarniniakowej115,116,117. Z drugiej strony, udowodniono występowanie zaburzeń funkcji neutrocytów u pacjentów z chorobą Crohna, a czynnik wzrostu kolonii granulocytarnych zastosowany w ich leczeniu, przynosił poprawę zarówno liczby, jak i funkcji granulocytów obojętnochłonnych118. Charakterystyczne nieprawidłowości w badaniach laboratoryjnych obejmują takŜe: hipermleczanemię, hiperlipidemię (znaczną hipertriglicerydemię z umiarkowaną hipercholesterolemią) i hiperurikemię105,106. Mimo hepatomegalii, funkcja wątroby jest zwykle prawidłowa, a aktywność aminotransferaz bywa nieznacznie podwyŜszona. Groźnym, lecz rzadkim, powikłaniem w przebiegu GSDIb są jedno- lub wieloogniskowe gruczolaki wątroby, które niosą ryzyko transformacji w hepatocarcinoma119. Z wiekiem wystąpić mogą kolejne powikłania w postaci dny moczanowej, kamicy nerkowej, nefropatii prowadzącej do nadciśnienia tętniczego i osteopenii, a nawet niewydolności nerek w 3-5 dekadzie Ŝycia106. 29 I.4.H. Łagodna rodzinna neutropenia (FBN) FBN (Familial Benign Neutropenia) dziedziczona jest autosomalnie dominująco, a locus defektu zlokalizowano na chromosomie 14 6,7,22,120. Chorzy prezentują przewlekłą leukopenię z neutropenią łagodną lub umiarkowaną, której moŜe towarzyszyć monocytoza22. Choroba przebiega zwykle bez cięŜkich zakaŜeń co sprawia, Ŝe o jej istnieniu chorzy często dowiadują się przypadkowo, w związku z badaniami wykonywanymi z innego powodu12,121. Szpik osób z FBN jest bogatokomórkowy; u niektórych chorych odnotowano zmniejszoną liczbę granulocytów dojrzałych, stąd obraz „przesunięcia w lewo” do granulocyta pałeczkowatego, a nawet metamielocyta12,122. Podejrzewa się, Ŝe przyczyną leuko- i neutropenii w tej jednostce chorobowej jest zmniejszona rezerwa szpikowa granulocytów, co wydaje się potwierdzać obserwacja poczyniona u tych chorych podczas zakaŜeń bakteryjnych, wskazująca na mierny - w porównaniu z osobami zdrowymi - wzrost liczby krwinek białych, w tym neutrocytów, we krwi obwodowej12,122. Rodzinne występowanie FBN udaje się czasem potwierdzić wykonując morfologię z rozmazem manualnym członkom najbliŜszej rodziny chorego (rodzice, rodzeństwo). I.4.I. Niedobór ligandu CD40 (CD40Ldef) Niedobór ligandu CD40, dawniej zespół hiper IgM typu I (XHIGM) jest złoŜonym pierwotnym niedoborem odporności, dziedziczonym w sposób sprzęŜony z chromosomem X, występującym z częstością szacowaną na 1:100.000 Ŝywych urodzeń, tj. znacznie częściej niŜ pozostałe pięć postaci HIGM123. Ligand CD40, obecny na aktywowanych limfocytach T pomocniczych, jest niezbędny do interakcji z cząstką CD40 zlokalizowaną na powierzchni limfocytów B, inicjującą ciąg reakcji prowadzących do tzw. przełączenia klas i wytwarzania przez limfocyty B oprócz IgM, takŜe IgG, IgA i IgE 123. Mutacja genu dla CD40L powoduje więc hipogammaglobulinemię z charakterystycznym prawidłowym lub podwyŜszonym (rzadko obniŜonym) stęŜeniem IgM i jednoczesnym głębokim niedoborem pozostałych klas głównych immunoglobulin124. W węzłach chłonnych, pobranych od chorych, brak jest ośrodków rozmnaŜania7,15. Obraz subpopulacji limfocytów krwi obwodowej mieści się w granicach normy, choć u niektórych chorych opisano podwyŜszoną liczbę limfocytów B124. Przewlekła neutropenia, od umiarkowanej po cięŜką, obserwowana jest stale lub okresowo u 50-60% chorych, powodując owrzodzenia w jamie ustnej, zapalenie dziąseł, bakteryjne zakaŜenia ucha środkowego i skóry6,7,15. Wg danych ESID (European Society for Primary Immunodeficiencies), 30 opublikowanych w 1997 roku, spośród 56 pacjentów z rozpoznanym niedoborem CD40L, aŜ 38 (68%) prezentowało neutropenię, która okazała się być przewlekła u 25 (45%), natomiast cykliczna u 7124. Obraz szpiku chorych z niedoborem ligandu CD40 przypomina mielogramy osób z SCN- wysoki blok dojrzewania linii granulocytarnej oraz wakuolizacja cytoplazmy promielocytów występuje bowiem w obu wymienionych jednostkach chorobowych26. Chłopcy z CD40Ldef od okresu niemowlęcego chorują takŜe na nawracające zakaŜenia górnych i dolnych dróg oddechowych, wywołane nie tylko przez bakterie i enterowirusy (czyli patogeny typowe dla niedoborów odporności humoralnej), ale równieŜ przez oportunistyczne grzyby takie, jak Pneumocystis jirovecii 6,55. Pneumocystozowe zapalenie płuc u niemowlęcia płci męskiej, moŜe być pierwszym objawem tego pierwotnego niedoboru odporności i stanowi pilne wskazanie do oceny rozkładu subpopulacji limfocytów krwi obwodowej oraz ekspresji CD40L na aktywowanych limfocytach CD4+, przy pomocy cytometrii przepływowej. ZakaŜenie PVB19 u chorych tych, częściej niŜ u innych dzieci, prowadzi do niedokrwistości aplastycznej125. Kolejną szczególną cechą osób z XHIGM jest podatność na zakaŜenie pierwotniakiem Cryptosporidium, który oprócz przewlekłej biegunki powodować moŜe takŜe stwardniające zapalenie dróg Ŝółciowych, wraz z jego powaŜnymi powikłaniami - marskością wątroby, nadciśnieniem wrotnym oraz nowotworami wątroby i dróg Ŝółciowych126. Opisano takŜe zwiększoną częstość chorób autoimmunizacyjnych, czym próbowano wyjaśnić obecność neutropenii u ponad połowy pacjentów, nigdy jednak nie znaleziono u nich przeciwciał przeciwgranulocytarnych34,35,43. Najbardziej prawdopodobną przyczyną występowania przewlekłej neutropenii w CD40Ldef wydaje się być zaburzona interakcja pomiędzy CD40L, znajdującym się na powierzchni komórek podścieliska szpiku, a cząstką CD40 na limfocytach pomocniczych T, która to interakcja jest niezbędna do prawidłowej syntezy G-CSF 127. I.4.J. Mielokateksja i zespół WHIM Terminu „mielokateksja”, czyli nagromadzenie, po raz pierwszy uŜył Zelzer128 opisując w 1964 roku nową postać przewlekłej neutropenii z niezwykłym obrazem szpiku. Szpik chorych okazał się być wybitnie bogatokomórkowy, z tzw. przesunięciem w prawo i nagromadzeniem dojrzałych form granulocytów obojętnochłonnych o nadmiernie 31 segmentowanym jądrze, z wydłuŜonymi filamentami łączącymi poszczególne segmenty jądra, pyknotycznej i zwakuolizowanej cytoplazmie (obraz typowy dla granulocytów mających wkrótce ulec apoptozie)15,17. Akronim WHIM powstał z pierwszych liter kardynalnych objawów zespołu, w skład którego wchodzą: Warts (brodawki), Hypogammaglobulinemia, Infections, Myelokathexis129. W 2003 roku, u chorych z objawami WHIM, zidentyfikowano heterozygotyczne mutacje w genie kodującym receptor dla chemokin- CXCR4130. Jest to pierwsza jednostka chorobowa u ludzi spowodowana mutacją, prowadzącą do zaburzeń funkcjonowania receptora dla chemokin. Zespół dziedziczony jest w sposób autosomalnie dominujący; przypadki sporadyczne opisano głównie u kobiet131. Chorzy z WHIM demonstrują róŜnorodne objawy kliniczne, którym towarzyszą liczne zaburzenia immunologiczne. Częste lub przewlekłe bakteryjne zakaŜenia dróg oddechowych, ucha środkowego, skóry, zapalenie przyzębia oraz nawracające zakaŜenia wirusem brodawczaka ludzkiego, pod postacią brodawek pospolitych zlokalizowanych na kończynach i/lub tułowiu, kłykcin kończystych, a u dorosłych pacjentek- zmian dysplastycznych na wargach sromowych i w pochwie, tworzą obraz kliniczny zespołu15,26,132. Nawracające lub przewlekłe zakaŜenia HPV obserwuje się zwykle od drugiej dekady Ŝycia, ale u niektórych chorych wystąpiły juŜ między 5 a 8 rokiem Ŝycia133,134. Częste i/lub przewlekające się zakaŜenia dolnych dróg oddechowych mogą prowadzić do powstania rozstrzeni oskrzeli 133. U trzech chorych opisano chłoniaki wywodzące się z limfocytów B, po przebytym zakaŜeniu wirusem Epsteina-Barr135,136. Ten unikatowy obraz kliniczny jest konsekwencją złoŜonych nieprawidłowości immunologicznych, na które składa się przewlekła neutropenia- od łagodnej po cięŜką, obserwowana często juŜ u niemowląt, limfopenia ze znacznie obniŜoną liczbą limfocytów B, czasem takŜe obniŜoną liczbą limfocytów dziewiczych T oraz rozwijająca się z czasem - róŜnego stopnia hipogammaglobulinemia (dotycząca głównie IgG, rzadziej IgM)137,138 . Mimo zaburzeń odporności humoralnej, wielu chorych wytwarza przeciwciała w odpowiedzi na szczepienia ochronne139,140. Zjawiskiem wyróŜniającym tę grupę chorych jest równieŜ szybki, bo występujący juŜ po kilku godzinach, wzrost ANC w odpowiedzi na podanie G-CSF, adrenaliny, glikokortykosteroidów oraz podczas zakaŜeń bakteryjnych139,140. Ta obserwacja, w połączeniu z charakterystycznym obrazem szpiku sugerowała, Ŝe przyczyna przewlekłej neutropenii w tej jednostce chorobowej leŜy w zaburzonym uwalnianiu dojrzałych neutrocytów do krwi obwodowej. Hipotezę tę potwierdzają najnowsze badania, dzięki którym wykazano, Ŝe interakcje pomiędzy CXCR4 a 32 jego ligandem- CXCL12 stanowią kluczowy element hematopoezy płodowej oraz przemieszczania się komórek hematopoetycznych132. Mutacja genu dla CXCR4 prowadzi do zaburzeń w funkcjonowaniu tego receptora dla chemokin, a jego nieprawidłowa, nadmierna aktywność, opóźnia wyrzut granulocytów obojętnochłonnych do krwi, przyczyniając się do ich apoptozy w obrębie szpiku141. Spontaniczna apoptoza progenitorowych komórek mielopoezy jest w zespole WHIM takŜe wzmoŜona141. Rokowanie u chorych właściwie leczonych jest dobre; przypadki zgonów w przebiegu zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i posocznicy dotyczyły osób nie otrzymujących preparatów immunoglobulin, ani G-CSF139. Zwiększona podatność na zakaŜenie HPV moŜe prowadzić do powstania zmian dysplastycznych skóry i śluzówek, a w konsekwencji do rozwoju raka płaskonabłonkowego u dorosłych pacjentów133,138. Rycina 3 Fot. aut. E. Kalinowskiej, Laboratorium Analiz Lekarskich „ALAB” przy IP-CZD, zjawisko pseudopelgeryzacji jądra granulocyta, stwierdzone u ojca pacjentki z WHIM. 33 Rycina 4 Fot. aut. E. Kalinowskiej, Laboratorium Analiz Lekarskich „ALAB” przy IP-CZD, przedstawia typową dla WHIM dwujądrzastą pałeczkę. Niektórych niezmiernie rzadkich chorób takich jak zespół Cohena, czy Pearsona oraz nie będących przedmiotem pracy- kwasic organicznych, nie opisano szczegółowo. W omówieniu pominięto takŜe agammaglobulinemię Brutona, która moŜe przebiegać z neutropenią, a nawet z agranulocytozą, lecz niezmiernie rzadko obniŜenie ANC ma w tej jednostce chorobowej przewlekły charakter. W związku z tym w tabeli 4, zawierającej najistotniejsze informacje na temat uwarunkowanych genetycznie chorób przebiegających z PN, umieszczono owe pominięte, lecz waŜne z punktu widzenia diagnostyki róŜnicowej, jednostki chorobowe. 34 Tabela 4 Choroby uwarunkowane genetycznie przebiegające z neutropenią (wg częstości występowania) Jednostka chorobowa Początek objawów Rodzaj neutropenii Objawy kliniczne Mielogram Odchylenia w badaniach dodatkowych Zespół ShwachmanaDiamonda (SDS) okres niemowlęcy cięŜka do umiarkowanej przewlekła biegunka tłuszczowa, niedobór masy ciała, niskorosłość, zakaŜenia bakteryjne dróg oddechowych, przewlekle zapalenie przyzębia, zapalenia jamy ustnej norma lub hipoplazja układu granulocytarnego, MDS/AML u 15-25% chorych Hiperaminotransferazemia, ↑ HbF, niedokrwistość i małoptytkowość, hipogammaglobulinemia, USG - hiperechogenna trzustka, Rtg –wąska klatka piersiowa, chondrodysplazja przynasadowa kości długich Niedobór ligandu CD40 dawniej zespół hiperlgM typu I (XHIGM) okres niemowlęcy stała lub cykliczna u 5060% chorych nawracające zakaŜenia dróg oddechowych, wrzodziejące zapalenia jamy ustnej, zakaŜenia oportunistyczne (CMV, Pneumocystis jiroveci, Cryptosporidium sp.), limfadenopatia, hepatosplenomegalia, niedobór masy ciała prawidłowy lub aplastyczny po zakaŜeniu PVB-19, czasem wysoki blok dojrzewania, jak w SCN dysgammaglobulinemia - niskie IgG, Ig A, i sIg E wysokie lub w normie IgM, niska ekspresja ligandu CD40 na limfocytach CD4 Glikogenoza typu I b (GSD Ib) okres niemowlęcy cięŜka do umiarkowanej zakaŜenia bakteryjne skóry i tkanek miękkich, nawracające zakaŜenia dróg oddechowych, zapalenia ucha środkowego, przewlekle zapalenie przyzębia, twarz lalki, hepatomegalia zwykle prawidłowy Rodzinna łagodna neutropenia (FBN) dzieci młodsze lub nastolatki łagodna lub umiarkowana bezobjawowa lub nawracające zakaŜenia dróg oddechowych i zapalenie przyzębia prawidłowy lub zmniejszona liczba prekursorów linii granulocytarnej leukopenia, czasem monocytoza Agammaglobulinemia Brutona (XLA) od 6 miesiąca do 4 roku Ŝycia umiarkowana do agranulocytozy nawracające bakteryjne zakaŜenia dróg oddechowych, przewlekła biegunka, powikłania po Ŝywej szczepionce p/polio, atroficzne migdałki podniebienne przesunięcie w lewo w obrębie linii granulocytarnej wysoki blok dojrzewania limfocytów B w cytometrycznym badaniu szpiku cięŜka hipogammaglobulinemia IgG, IgA, IgM odsetek limfocytów CD19 we krwi obwodowej < 2 CięŜka wrodzona neutropenia (SCN) okres noworodkowy lub niemowlęcy cięŜka ANC 0-600 posocznica, zapalenia płuc, pępka, j. ustnej, ucha środkowego, zatok, przyzębia, ropnie skórne, okołoodbytnicze, narządowe wysoki „blok dojrzewania” na etapie promielocyta lub mielocyta, MDS/AML u ok. 15% chorych monocytoza i eozynofilia, niedokrwistość, czasem hipergammaglobulinernia lub nadptytkowość Neutropenia cykliczna (CyN) okres niemowlęcy CięŜka ANC<200 przez 3-6 dni co 21 dni w okresie neutropenii: gorączka, wrzodziejące zapalenie jamy ustnej, zapalenie gardła, angina, ropnie podskórne w okresie neutropenii - wysoki blok dojrzewania linii granulocytarnej, między okresami neutropenii – pobudzenie szeregu granulocytamego wysoka monocytoza podczas ↓ ANC Niedokrwistość Fanconiego (FA) 4-14 r Ŝ łagodna do cięŜkiej wady wrodzone: serca, uszu, nerek, kciuka, kości nadgarstka i przedramienia, małogłowie, niskorosłość, plamy „cafe au lait", czasem upośledzenie umysłowe hipoplazja szpiku róŜnego stopnia, 20- 30% ryzyko MDS/AML oporna na leczenie niedokrwistość, małopłytkowość, niskie retikulocyty, podwyŜszona HbF, nieprawidłowy test z DEB i MMC Mielokateksja i zespół WHIM Okres niemowlęcy od łagodnej po cięŜką zakaŜenia bakteryjne, nawracające brodawki skórne od 5-10 roku Ŝycia hiperplastyczny szereg granulocytarny, przesunięcie w prawo, dwujądrzaste pałeczki; blok dojrzewania linii B w cytometrii szpiku leukopenia, wzrost ANC podczas zakaŜeń, limfopenia <1500/µl, z limfopenią CD19, hipogammaglobulinemia od 2- 4 roku Ŝycia leukopenia; hipoglikemia 2- 4 godzin po posiłku, hipertriglicerydemia, hiperurykemia, kwasica mleczanowa 35 Jednostka chorobowa Początek objawów Rodzaj neutropenii Objawy kliniczne Mielogram Odchylenia w badaniach dodatkowych Zespół Bartha okres noworodkowy lub niemowlęcy cięŜka stała lub cykle co 3-5 tygodni cięŜkie zakaŜenia bakteryjne, przewlekła biegunka, niedobór masy ciała, hipotonia, kardiomiopatia rozstrzeniowa, zez bogatokomórkowy z zahamowaniem dojrzewania na etapie mielocyty, jak w SCN monocytoza, wzrost ANC podczas zakaŜeń, hipocholesterolemia, kwasica 3-melyloglutakonowa w GC/MS Kwasice organiczne: MMA, IVA, PA okres noworodkowy lub niemowlęcy od łagodnej po cięŜką noworodki - zespół intoksykacji, niemowlęta dekompensacja metaboliczna w czasie zakaŜeń hipoplastyczny ze zmniejszoną liczbą prekursorów szeregu granulocytamego niedokrwistość, małopłytkowość, hiperamonemia, kwasica mleczanowa, czasem hipogammaglobulinemia, hipoglikemia, nieprawidłowy wynik badania GC/MS i/lub MS/MS Zespół Pearsona okres niemowlęcy od łagodnej po cięŜką wymioty, przewlekła biegunka tłuszczowa, niedobór masy, postępująca hepatomegalia, ostra niewydolność wątroby, skaza krwotoczna, zakaŜenia bakteryjne, posocznica bogatokomórkowy, hipoplazja linii granulocytarnej, wakuolizacja erytro- i mieloblastów, syderoblasty niedokrwistość syderoblastyczna, megaloblastyczna, małopłytkowość, kwasica mleczanowa, zewnątrzwydzielnicza niedoczynność trzustki, tubulopatia (hiperkalciuria, glikozuria, fosfaturia), kwasica 3-metyloglutakonowa w GC/MS, ↑HbF i AT Zespół ChediakaHigashiego (CHS) okres niemowlęcy umiarkowana do cięŜkiej ziarnistości olbrzymie we wszystkich komórkach linii granulocytarnej i monocytach, w fazie akceleracji – wzmoŜona erytrofagocytoza ziarnistości olbrzymie w leukocytach, zaburzenia chemotaksji i degranulacji neutrofili, zaburzenia agregacji płytek, w fazie akceleracji - pancytopenia i zespól hemofagocytamy Zespól Griscellego typu II (GS II) okres niemowlęcy umiarkowana do cięŜkiej srebrzysty blond włosów, jasna karnacja nawracające zakaŜenia bakteryjne, limfadenopatia, hepatosplenomegalia prawidłowy, w fazie akceleracji – wzmoŜona erytrofagocytoza patognomoniczny rozkład barwnika w mikroskopowym badaniu włosa Hipoplazja chrząstkowowłosowa (CHH) okres niemowlęcy umiarkowana do cięŜkiej Karłowatość krótkokończynowa, rzadkie, jasne włosy, dyzmorficzna twarz, hipotonia, wada serca, skolioza, dysplazja stawów biodrowych niecharakterystyczny limfopenia, chondrodysplazja przynasadowa kości, hipokalcemia, nieprawidłowy zapis EEG Zespół Cohena okres niemowlęcy łagodna do umiarkowanej małogłowie, zez, nos dziobokształtny, wydatne siekacze, antymongoloidalne ustawienie szpar powiekowych, gęste włosy, brwi i rzęsy, opóźnienie psychomotoryczne, obniŜone napięcie mięśniowe, otyłość tułowia prawidłowy lub przesunięcie w lewo retinopatia barwnikowa, powiększone ciało modzelowate częściowy albinizm oczno-skórny, jasne włosy, brwi i rzęsy, nawracające zakaŜenia bakteryjne, zapalenia jamy ustnej, przyzębia, uszu, posocznice, ropnie, limfadenopatia, hepatosplenomegalia, skaza krwotoczna 36 I.4.K. Autoimmunizacyjny zespół limfoproliferacyjny (ALPS) ALPS (Autoimmune Lymphoproliferative Syndrome), dawniej zespół Canale-Smith, stanowi niejednorodną, pod względem genetycznym, grupę schorzeń manifestujących się nawracającą lub przewlekłą limfadenopatią, cytopeniami oraz zwiększoną częstością splenomegalią, występowania autoimmunizacyjnymi chłoniaków ziarniczych i nieziarniczych7,142. Przyczyną zespołu są mutacje genów odpowiedzialnych za apoptozę limfocytów; najczęściej genu TNFRSF6, kodującego Fas/CD95 (ALPS typu Ia), rzadziej genu dla ligandu Fas (ALPS typu Ib), kaspazy 8 i 10 (ALPS typu II) oraz innych, jeszcze nie zidentyfikowanych (ALPS typu III)143,144,145,146. Defekty te dziedziczone są w sposób autosomalnie dominujący lub recesywny. Zaburzenia apoptozy prowadzą do akumulacji limfocytów, w tym populacji tzw. limfocytów T podwójnie negatywnych (DNTC) - wykazujących ekspresję receptora TCRαβ, ale pozbawionych ekspresji zarówno CD4, jak i CD8. Odsetek DNTC wyŜszy niŜ 5 oraz podwyŜszone stęŜenie IL-10 i FasL stanowią, obok hipergammaglobulinemii (zwykle podwyŜszone stęŜenie IgG, rzadziej IgA), uŜyteczne markery biologiczne ALPS 147,148. Pierwsze objawy zespołu obserwowane są zwykle u dzieci przed ukończeniem 5 roku Ŝycia, choć część chorych prezentowała je juŜ w okresie noworodkowym. Przewlekła limfadenopatia, zwykle szyjna i pachowa, czasem uogólniona, wystąpiła u 97-100% dzieci. Splenomegalię odnotowano u 95-100%, hepatosplenomegalię u około 70%, wysypki plamisto-grudkowe lub guzki podskórne u 10% chorych44,149. Obecność autoprzeciwciał wykazano w surowicy ponad 80% chorych z ALPS; najczęściej były to przeciwciała antykardiolipinowe (rzadko wywołujące objawy zespołu antyfosfolipidowego), a takŜe skierowane przeciwko erytrocytom, wykrywane w bezpośrednim teście antyglobulinowym (BTA), rzadziej przeciwpłytkowe, przeciwgranulocytarne oraz przeciwjądrowe44,150,151. Chorobami autoimmunizacyjnymi najczęściej obserwowanymi u tych chorych są autoimmunizacyjna niedokrwistość małopłytkowość (ITP), (AIHA) i idiopatyczna autoimmunizacyjna występujące z częstością 23-51%44,149. Autoimmunizacyjną neutropenię odnotowano u 19-27% chorych44,150. Neutropenia w ALPS ma mechanizm złoŜony; jest następstwem hipersplenizmu oraz produkcji przeciwciał przeciwgranulocytarnych przez autoreaktywne klony limfocytów B. Cytopenie mogą być pierwszą manifestacją kliniczną ALPS i wyprzedzać, czasem o kilka lat, powiększenie węzłów chłonnych i/lub śledziony. Część chorych moŜe mieć 37 pierwotnie rozpoznany zespół Evansa152,153, od którego ALPS róŜni się, między innymi, występowaniem hipergammaglobulinemii. Rzadziej opisywane, autoimmunizacyjne manifestacje zespołu obejmowały glomerulopatie, zespół Guillain-Barre, zapalenie tęczówki lub nerwu wzrokowego, pierwotną marskość Ŝółciową7,44,149. Chłoniaki wywodzące się z limfocytów B odnotowano u limfoproliferację jest często EBV około 44,49,154 10% pacjentów149. Czynnikiem inicjującym . Szpik chorych jest bogatokomórkowy, z pobudzeniem w obrębie linii, której odpowiada cytopenia występująca we krwi obwodowej. Histopatologiczne badania węzłów chłonnych oraz śledzion, pochodzących od pacjentów z ALPS, wykazały obecność przerostu grudek chłonnych oraz gromadzenia DNTC 7,44. I.4.L. Pospolity zmienny niedobór odporności (CVID) CVID (Common Variable ImmunoDeficiency) jest pierwotnym niedoborem odporności przebiegającym z hipogammaglobulinemią, rozpoznawanym często dopiero w drugiej, a nawet trzeciej dekadzie Ŝycia 6,7,42. Poznane dotąd defekty genetyczne takie, jak mutacje genu TACI, ICOS, BAFF-R, CD19 wykazano u zaledwie 15-20% chorych155. Częstość CVID szacowana jest na 1:10.000- 50.000 urodzeń 6,42. Zwiększona podatność na zakaŜenia bakteryjne dróg oddechowych, zakaŜenia bakteryjne, wirusowe i pasoŜytnicze przewodu pokarmowego oraz hiperplazja układu chłonnego, prowadząca do limfadenopatii i splenomegalii u około 30% chorych, to typowe objawy kliniczne CVID 6,7,42,49 . Manifestację autoimmunizacyjną odnotowano u 22- 48% chorych156,157,158, ale wśród pacjentów, którzy rozwinęli ziarniniaki płuc lub przewodu pokarmowego, częstość ta wynosiła aŜ 50% 159. Najczęściej obserwowano ITP, która wystąpiła u 11- 20% chorych, AIHA- odnotowano u około 4%, natomiast neutropenię u 2% badanych157,160. Poszukując przyczyny autoimmunizacyjnych cytopenii w przebiegu CVID stwierdzono, Ŝe chorzy z tą szczególną manifestacją choroby mają zmniejszoną liczbę limfocytów CD8+, limfocytów regulatorowych CD4+CD25+FoxP3+ 161,162, a takŜe obniŜoną liczbę jednej z podgrup limfocytów B pamięci - tzw. class- switched memory, zdolnych do produkcji immunoglobulin innych niŜ IgM163. Mutacje w genie TACI wydają się predysponować do rozwoju powikłań autoimmunizacyjnych w przebiegu CVID164. Badania duŜych grup pacjentów wskazują na występowanie chorób autoimmunizacyjnych u osób z CVID od 100 do 1000 razy częściej, niŜ jest to obserwowane w całej populacji156. 38 Choroba wiąŜe się równieŜ ze zwiększonym ryzykiem wystąpienia chłoniaków przewodu pokarmowego7,42,156. I.4.M. Zespół Bartha Zespół Bartha (ang. X-linked cardioskeletal myopathy with neutropenia)165, występujący z częstością 1: 400.000 urodzeń, spowodowany jest mutacją genu G4.5/TAZ, który zlokalizowany jest na ramieniu długim chromosomu X (Xq28)165,166. Koduje on białka nazywane tafazynami, które są niezbędne podczas biosyntezy fosfolipidów, stąd mutacja wywołująca zespół Bartha powoduje głęboki niedobór kardiolipiny15. Na klasyczne objawy zespołu, naleŜącego do grupy cytopatii mitochondrialnych, składają się: obserwowana juŜ u niemowląt - kardiomiopatia rozstrzeniowa, niski wzrost w dzieciństwie (ale ostateczny- prawidłowy), obniŜone napięcie mięśniowe, zez, a takŜe nawracające zakaŜenia bakteryjne, którym sprzyja cięŜka neutropenia167. Wartości ANC często nie przekraczają 500/µl, nierzadko są bliskie 0, mimo dobrego stanu klinicznego dziecka33. Neutropenia moŜe mieć charakter cykliczny; opisano chorych z cyklami 3-5 tygodniowymi, podczas których wartości ANC były bliskie normy 33,165. ObniŜonej liczbie neutrocytów we krwi obwodowej towarzyszy często monocytoza. Typowy jest takŜe wzrost ANC w odpowiedzi na zakaŜenie bakteryjne. Diagnozę pomaga ustalić badanie profilu kwasów organicznych w moczu metodą GC/MS, które u chorych z zespołem Bartha pozwala stwierdzić obecność kwasu 3-metyloglutakonowego15,33,165. Obraz szpiku jest bogatokomórkowy, z tzw. blokiem dojrzewania linii granulocytarnej na poziomie mielocyta, przypominającym cięŜką wrodzoną neutropenię33. U najmłodszych dzieci choroba moŜe takŜe przebiegać skąpoobjawowo, bez klasycznej kardiomiopatii, a jej jedyną manifestacją są wówczas zakaŜenia, spowodowane cięŜką neutropenią 33. I.4.N. Przewlekła idiopatyczna neutropenia (CIN) CIN (Chronic Idiopathic Neutropenia) pozostaje rozpoznaniem, do którego dochodzi się poprzez wykluczenie wielu innych przyczyn przewlekłej neutropenii; występuje zarówno u dzieci, jak i dorosłych, z przewagą płci Ŝeńskiej 7,23,24,168. Jej częstość szacowana jest na 2-4 przypadków na 1000.000 populacji 23,169. Choroba ma zwykle łagodny przebieg kliniczny, nawet u chorych z cięŜką neutropenią i nie wiąŜe się z ryzykiem transformacji nowotworowej82. Większość chorych cierpi z powodu nawracających owrzodzeń w jamie ustnej, infekcji dróg oddechowych, bakteryjnych zakaŜeń skóry i tkanki podskórnej oraz przewlekłego zapalenia przyzębia170. 39 Szpik osób z CIN jest często w róŜnym stopniu hipoplastyczny, czemu towarzyszy tzw. przesunięcie w lewo do granulocyta pałeczkowatego lub metamielocyta171. Chorzy mogą mieć takŜe niedokrwistość lub małopłytkowość, co wymaga róŜnicowania z MDS172. Przypuszcza się, Ŝe przyczyną przewlekłej neutropenii w CIN są zaburzenia lokalnej regulacji immunologicznej w szpiku, związane z nadmierną produkcją cytokin prozapalnych takich, jak TNFα i IFNγ – znanych ze swego działania mielosupresyjnego oraz ligandu Fas, którego zwiększone stęŜenie moŜe tłumaczyć zjawisko wzmoŜonej apoptozy prekursorów linii granulocytarnej, prowadzące do obrazu bloku dojrzewania173. U chorych z CIN zaobserwowano takŜe- zarówno we krwi obwodowej, jak i w szpiku- zwiększony odsetek aktywowanych limfocytów T, które wytwarzały cytokiny prozapalne o właściwościach mielosupresyjnych174. Wg rejestru SCNIR, dotychczasowe obserwacje nie wykazały predyspozycji chorych z CIN do rozwoju MDS/AML, nawet mimo przewlekłego leczenia Neupogenem 82. I.5 Metody leczenia przewlekłej neutropenii. Wybór metody leczenia przewlekłej neutropenii zaleŜy od: rozpoznanej jednostki chorobowej, wieku chorego oraz cięŜkości dotychczasowego przebiegu klinicznego22,23,25,27. Stosuje się: profilaktykę antybiotykową, rekombinowany ludzki czynnik wzrostu kolonii granulocytarnych (rHuG-CSF), przeszczepienie macierzystych komórek krwiotwórczych, doŜylne preparaty immunoglobulin, glikokortykosteroidy oraz poszerzenie kalendarza szczepień o szczepionki przeciwko tzw. bakteriom otoczkowym 24,27. I.5.A. Profilaktyka antybiotykowa Wprowadzenie profilaktyki antybiotykowej naleŜy rozwaŜyć indywidualnie u kaŜdego chorego z przewlekłą neutropenią szczególnie, gdy ANC nie przekracza 500 komórek w µl, co znacząco zwiększa ryzyko wystąpienia cięŜkich zakaŜeń bakteryjnych 54. Jest ona zalecana w pierwszym roku Ŝycia, zwłaszcza u niemowląt chorujących na nawracające zakaŜenia bakteryjne23,54. U dzieci powyŜej 12 miesiąca stosujemy ją jedynie u chorych z cięŜkimi i/lub częstymi zakaŜeniami, a zwłaszcza z nawracającymi zapaleniami ucha środkowego. Niewątpliwym wskazaniem do jej wprowadzenia jest rozpoznanie SCN, CyN, WHIM i GSDIb do czasu włączenia leczenia rHuG-CSF lub u chorych nie odpowiadających na tę metodę leczenia78,54. Dzieci z AIN, ze względu na zazwyczaj łagodny przebieg kliniczny choroby, wymagają zastosowania przewlekłej antybiotykoterapii wyłącznie w przypadku nawracających zapaleń ucha środkowego23,29,52. Antybiotykiem najczęściej zalecanym, z uwagi na szerokie spektrum przeciwbakteryjne 40 oraz brak przeciwwskazań do przewlekłego stosowania u dzieci, jest Amoxicillina. Stosuje się ją w dawce 20mg/kg/dobę, podawanej raz na dobę54. Rzadziej podawanym lekiem przeciwbakteryjnym, między innymi z powodu opisanych przypadków neutropenii polekowej, którą spowodował19,27, jest Trimetoprim/ Sulfametoksazol. Zalecany jest przede wszystkim u chorych z niedoborem ligandu CD40, z uwagi na wysokie ryzyko zakaŜenia grzybem Pneumocystis jiroveci, charakterystyczne dla tego pierwotnego niedoboru odporności. Innym wskazaniem do profilaktycznego podawania tego właśnie leku jest WHIM, który łącząc przewlekłą neutropenię z deficytem odporności humoralnej w szczególny sposób zwiększa podatność chorych na zakaŜenia bakteriami otoczkowymi138. Zalecaną dawkę stanowi 20mg/kg/dobę25,27. Zastosowanie przewlekłej profilaktyki przeciwbakteryjnej wymaga systematycznego podawania probiotyków. I.5.B. Rekombinowany ludzki czynnik wzrostu kolonii granulocytarnych (rHuG-CSF) Wprowadzenie w latach osiemdziesiątych leczenia z zastosowaniem cytokin, okazało się wydarzeniem przełomowym w terapii przewlekłej cięŜkiej neutropenii175. Wcześniej, chorzy z agranulocytozą Kostmanna i innymi postaciami SCN, ginęli we wczesnym dzieciństwie wskutek cięŜkich zakaŜeń bakteryjnych takich, jak posocznica i zapalenie płuc, mimo antybiotykoterapii, przetoczeń masy granulocytarnej, czy prób leczenia litem176,177. Czynnik wzrostu kolonii granulocytarnych (G-CSF) jest kluczową cytokiną regulującą granulopoezę, wpływającą na proliferację, dojrzewanie oraz czas przeŜycia mieloidalnych komórek progenitorowych178, która swoje efekty wywiera poprzez receptor G-CSFR, znajdujący się na powierzchni komórek linii granulocytarnej179. U człowieka cytokinę tę wydzielają komórki podścieliska szpiku, śródbłonka naczyń oraz fibroblasty 5. Dzięki metodom inŜynierii genetycznej moŜliwa stała się produkcja rekombinowanych cytokin na skalę przemysłową. Rekombinowany ludzki czynnik wzrostu kolonii granulocytarnych (rHuG-CSF) wytwarzany jest przez bakterie Escherichia coli, do których przy pomocy wektora wprowadzono gen dla G-CSF180. Wyprodukowane przez bakterie białko róŜni się od ludzkiego G-CSF jedynie dodatkową metioniną na N- końcu oraz brakiem glikozylacji. UwaŜa się, Ŝe im mniejszy stopień glikozylacji cytokiny, tym lepsza jest jej penetracja do tkanek i większa efektywność kliniczna180,181. Wprowadzenie w 1987 roku rHuG-CSF do leczenia neutropenii dramatycznie zmieniło rokowanie w SCN182, jak równieŜ zaowocowało pracami mówiącymi o korzyściach płynących z terapii cytokinowej u chorych z wrodzonymi postaciami neutropenii183, 41 184,185,186,187 . W 1994 powstał Międzynarodowy Rejestr Przewlekłej Wrodzonej Neutropenii (SCNIR), któego celem stało się monitorowanie przebiegu klinicznego przewlekłych neutropenii uwarunkowanych genetycznie oraz efektów leczenia Neupogenem 82. Według danych SCNIR, dotyczących grupy około 600 chorych z SCN, ponad 90% leczonych - po zastosowaniu podskórnych preparatów rHuG-CSF - uzyskała wzrost liczby neutrocytów powyŜej 1000/µl 82,176,188. W związku z czym pacjenci rzadziej wymagali antybiotykoterapii oraz pobytu w szpitalu 185,189, 190. Co więcej, Neupogen nie tylko zwiększa liczbę granulocytów obojętnochłonnych we krwi obwodowej poprzez skrócenie ich okresu dojrzewania w szpiku z 6 dni do 1 dnia, lecz takŜe korzystnie wpływa na ich aktywność fagocytarną 5,191,192 oraz poprawia aktywność oksydazy NADPH 193. Zaleca się, aby rozpoczynać leczenie Neupogenem od dawki 5-10 µg/kg/dobę, a w razie braku efektu podwajać ją co około 2 tygodnie82,188. Wg danych SCNIR większość dzieci uzyskuje poprawę hematologiczną po dawce Neupogenu mieszczącej sie w przedziale 3- 10 µg/kg/dobę. Chorzy nie odpowiadający na tę terapię (tzw. non-responders), nie uzyskują oczekiwanego wzrostu ANC nawet po wysokich dawkach leku, sięgających 120 µg/kg/dobę 82,188 195 . Korzyści z takiego leczenia udowodniono równieŜ u chorych z cykliczną neutropenią194, , GSDIb 191,196,197 , WHIM198,199, ALPS 44, CD40Ldef 200oraz w zespole Bartha 15,201, przy czym wymagali oni znacznie mniejszych dawek niŜ pacjenci z SCN. Wg danych SCNIR chorzy z CyN, GSDIb i zespołem Bartha uzyskują normalizację ANC po dawce Neupogenu mieszczącej się w przedziale 1-5 µg/kg/dobę, chorym z CIN wystarcza dawka 0,5-10 µg/kg/dobę, pacjentom z WHIM zaledwie 1 µg/kg/dobę 82, natomiast dzieciom z ALPS 1-2 µg/kg/dobę podawane co drugi dzień 44. Podczas przewlekłego leczenia rHuG-CSF pamiętać naleŜy o ryzyku transformacji nowotworowej 18. Transformacja w zespół mielodysplastyczny i/lub ostrą białaczkę szpikową wpisana jest bowiem w historię naturalną cięŜkiej wrodzonej neutropenii spowodowanej mutacjami w genie ELA2/ELANE oraz HAX-1 (AML wystąpiła u 12% chorych zarejestrowanych w SCNIR)77,82. Wysokie ryzyko transformacji nowotworowej cechuje takŜe zespół Shwachmana – Diamonda (dane z piśmiennictwa mówią o 25-30% ryzyku MDS/AML 15,18,26,101,202 ) oraz niedokrwistość Fanconiego 104,203. Podejrzewa się, Ŝe terapia cytokinowa, zmniejszająca częstość i cięŜkość zakaŜeń, poprawiająca jakość oraz długość Ŝycia chorych, moŜe tę transformację przyspieszać. Wprawdzie przed rutynowym stosowaniem terapii cytokinowej wiedziano o predyspozycji chorych z SCN do transformacji białaczkowej204,205, lecz ponad 40% dzieci ginęło wówczas z powodu cięŜkich zakaŜeń nie ukończywszy 2 roku 42 Ŝycia, stąd rzeczywiste ryzyko zachorowania na MDS lub AML było trudne do oszacowania. Dzieci leczone Neupogenem Ŝyją obecnie na tyle długo, by mogło dojść do ujawnienia owej uwarunkowanej genetycznie - predyspozycji. Analiza długości Ŝycia oraz częstości występowania transformacji w MDS/AML w grupie chorych leczonych rHuG-CSF, objętych przez SCNIR wykazała, Ŝe po 8 latach terapii skumulowane ryzyko transformacji nowotworowej wynosi 16,5 %, co daje około 2% ryzyka przypadającego na kaŜdy kolejny rok leczenia 82,190. Wykazano takŜe, iŜ w przypadku dzieci odpowiadających dopiero na dawkę rHuG-CSF większą niŜ 8 µg/kg/dobę, ryzyko transformacji w MDS/AML jest znacznie wyŜsze- po 10 latach leczenia sięga 40% 206. Natomiast chorzy uzyskujący dobrą odpowiedź hematologiczną po dawkach nie przekraczających 8 µg/kg/dobę, mają niŜsze ryzyko rozwoju białaczki- oszacowano je na 11 %, po 10 latach systematycznego podawania Neupogenu. Ryzyko przejścia cięŜkiej wrodzonej neutropenii w MDS/AML, według danych SCNIR, znamiennie wzrasta u dzieci z monosomią chromosomu 7 (wystąpiła u 14% chorych w SCNIR), trisomią chromosomu 21 (stwierdzona u 16% chorych w rejestrze)77. Większe ryzyko transformacji nowotworowej wydają się mieć takŜe chorzy, u których stwierdzono nabytą somatyczną mutację genu receptora dla G-CSF, poniewaŜ aŜ 80% osób z koincydencją SCN i MDS/AML miała tę mutację77,82,. Jednocześnie mutacje genu G-CSFR potwierdzono u około 30% chorych, którzy nie rozwinęli MDS/AML207. Obecność mutacji G-CSFR nigdy nie została stwierdzona u noworodka, ani w dwu allelach genu G-CSFR; odstawienie Neupogenu prowadziło do jej ustąpienia, a ponowne zastosowanie przywracało jej obecność, stąd przekonanie o nabytym charakterze mutacji genu G-CSFR oraz braku związku przyczynowoskutkowego z występowaniem neutropenii 64,208. Dlatego teŜ wykrycie mutacji G-CSFR nie przesądza o rozpoznaniu SCN, natomiast moŜe być przydatnym wykładnikiem ryzyka transformacji w MDS/AML209. Zaobserwowano takŜe, Ŝe nieprawidłowości cytogenetyczne rozwijają się u chorych, którzy przed wdroŜeniem leczenia rHuG-CSF mieli prawidłowe badanie cytogenetyczne szpiku 64. Dotąd nie udało się jednak wyjaśnić, czy jest to skutkiem terapii cytokiną, czy teŜ następstwem wrodzonej predyspozycji; być moŜe - obu tych czynników jednocześnie. Udowodniono, Ŝe obecność mutacji w genie dla G-CSFR wyprzedza o kilka lat transformację w MDS/AML, choć wśród chorych z tą mutacją opisano takŜe ALL i CML210,211. W warunkach polskich badanie mutacji G-CSFR stanowi powaŜny problem, gdyŜ jest to badanie drogie, wymagające powtarzania, a samo stwierdzenie obecności mutacji nie stanowi wskazania do HSCT 212. Co więcej, eksperci skupieni przy SCNIR nie rekomendują obecnie regularnego badania powyŜszych mutacji, jako metody monitorowania ryzyka transformacji nowotworowej u pacjentów z SCN185. 43 Pojedyncze doniesienia mówią takŜe o chorych z glikogenozą typu 1b, leczonych rHuG-CSF, u których rozpoznano AML82. Jak wiadomo GSDIb nie predysponuje do rozwoju białaczek, lecz nowotworów wątroby 213. PowyŜsze obserwacje nakładają na prowadzących leczenie Neupogenem obowiązek corocznego powtarzania biopsji aspiracyjnej oraz badania cytogenetycznego szpiku u wszystkich chorych, otrzymujących przewlekle czynnik wzrostu kolonii granulocytarnych, w celu monitorowania obecności zmian zwiastujących transformację nowotworową (jest to rekomendacja SCNIR) 82. Na podstawie wieloletnich obserwacji uwaŜa się z kolei, Ŝe CyN i CIN nie niosą ryzyka transformacji nowotworowej, choć w rejestrze SCNIR znalazło się 3 pacjentów z tymi rozpoznaniami, którzy rozwinęli MDS lub AML82,214. Kolejnym, istotnym klinicznie, powikłaniem leczenia przy pomocy Neupogenu jest osteopenia. Yakisan i wsp. jako pierwsi opisali jej obecność u dzieci z SCN 215. W grupie badanych przez nich 30 chorych, aŜ 15 (50%) prezentowało objawy osteopenii w postaci bólu pleców lub złamań patologicznych. Według danych SCNIR, wśród 121 chorych poddanych badaniom oceniającym gęstość kośćca, aŜ 66 (54%) miało róŜnego stopnia osteopenię lub osteoporozę, ale aŜ 70% chorych nie prezentowała w związku z tym Ŝadnych objawów 82. Przyczyna tego zjawiska nie jest do końca wyjaśniona zwłaszcza, Ŝe chorzy ci nie naleŜeli do grupy otrzymującej duŜe dawki Neupogenu. Najbardziej prawdopodobnym patomechanizmem wydaje się być aktywacja dojrzałych osteoklastów pod wpływem większych niŜ fizjologiczne dawek czynnika wzrostu kolonii granulocytarnych, a takŜe ich osłabiona apoptoza, co łącznie prowadzi do wzmoŜonej resorpcji kości216. W związku z powyŜszym, chorzy przewlekle otrzymujący Neupogen wymagają kontrolnych badań densytometrycznych kośćca (przynajmniej raz w roku), diety z odpowiednią dla wieku podaŜą wapnia oraz suplementacji witaminą D3. U chorych z osteoporozą w przebiegu SCN leczonej rHuG-CSF, podejmowano takŜe udane próby terapii dwufosfonianami217. Innymi objawami niepoŜądanymi leczenia tą cytokiną są 5,82: • bóle kostne – obserwowane u około 25% chorych • bóle mięśniowe • powiększenie śledziony i/lub wątroby • rumień w miejscu podania podskórnego • krwawienia z nosa – odnotowano u 10% leczonych • ból głowy, uczucie zmęczenia, nudności, wymioty 44 • zapalenie kłębuszków nerkowych • martwicze zapalenie naczyń Odchylenia w badaniach laboratoryjnych podczas leczenia Neupogenem 5,82: • małopłytkowość (od łagodnej po cięŜką) – 97% chorych • łagodna lub umiarkowana niedokrwistość – 65% leczonych • odwracalny wzrost aktywności dehydrogenazy mleczanowej, fosfatazy alkalicznej, aminotransferaz w osoczu • wzrost stęŜenia kwasu moczowego w osoczu (proporcjonalny do wzrostu liczby krwinek białych) Mimo skutecznego leczenia neutropenii przy pomocy rHuG-CSF, dzieci z SCN nadal cierpią z powodu przewlekłego zapalenia przyzębia, co związane jest z występującym u nich niedoborem przeciwbakteryjnego peptydu, obecnego w ślinie i neutrofilach, znanego jako katelina LL-37218. Poza terapią przewlekłą, zarezerwowaną dla chorych z uwarunkowanymi genetycznie postaciami przewlekłej neutropenii, Neupogen moŜe być takŜe podawany doraźnie wszystkim dzieciom z przewlekłą neutropenią w przypadkach, gdy rozwiną one cięŜkie zakaŜenia bakteryjne lub przed zabiegami operacyjnymi- w celu przyspieszenia gojenia ran oraz zapobiegania powikłaniom bakteryjnym 23,54. I.5.C. Glikokortykosteroidoterapia, MMF, Rytuxymab, splenektomia Po glikokortykosteroidy (GKS) sięgamy lecząc immunoneutropenie wtórne - w przebiegu CVID, ALPS, zespołu Evansa, tocznia rumieniowatego układowego, młodzieńczego idiopatycznego zapalenia stawów23,24,43,44. Leki te mogą takŜe przynieść przejściową poprawę hematologiczną u chorych z CIN i AIN, lecz z powodu licznych działań niepoŜądanych, wobec stosunkowo łagodnego przebiegu klinicznego tych jednostek chorobowych, wydają się być nieprzydatne w leczeniu przewlekłym23,29,52. Cytopenie w przebiegu ALPS są często oporne na leczenie. W przeszłości wykonywano z ich powodu splenektomię, lecz znając wysokie ryzyko inwazyjnych zakaŜeń bakteriami otoczkowymi, jakie stwierdzono u osób po usunięciu śledziony, wykonuje się ją wyjątkowo. Zalecanym obecnie postępowaniem u chorych z ALPS jest doustna podaŜ prednizonu, w dawce 1-2 mg/kg, a w razie braku poprawy hematologicznej stosuje się doŜylny metylprednizolon43,44. Pojedyncze doniesienia mówią o dobrej odpowiedzi na mykofenolan mofetilu (MMF) i sirolimus219. UŜycie Rytuxymabu, w celu zniszczenia autoreaktywnych klonów limfocytów B, moŜe wiązać się z wtórną, ale przejściową 45 hipogammaglobulinemią, dlatego teŜ zalecany jest chorym, którzy nie uzyskali poprawy po glikokortykosteroidach lub MMF. Z kolei autoimmunizacyjne cytopenie, w tym neutropenia, w przebiegu CVID są nadal leczone głównie glikokortykosteroidami220. Doniesienia na temat efektywności Rytuxymabu są wciąŜ nieliczne158. Podobnie jak w ALPS, splenektomia powinna być zarezerwowana jedynie dla chorych z cięŜką, autoimmunizacyjną cytopenią oporną na leczenie43. W AIN glikokortykosteroidy powodowały wzrost ANC ponad 1000/µl u około 70% leczonych w ten sposób dzieci, jednakŜe wraz z ich odstawieniem dochodziło do ponownego obniŜenia liczby granulocytów obojętnochłonnych we krwi obwodowej23,48. Leczenie glikokortykosteroidami okazało się być nieskuteczne w przewlekłych neutropeniach polekowych, będących skutkiem idiosynkrazji19. U nielicznych chorych z SCN próbowano podawać GKS jednocześnie z Neupogenem, co miało zwiększać wraŜliwość receptorów dla G-CSF na rHuG-CSF, lecz mimo obiecujących wstępnych doniesień jest to wciąŜ metoda eksperymentalna221. I.5.D. Immunoglobuliny Preparaty doŜylnych lub podskórnych immunoglobulin stosowane są w leczeniu neutropenii towarzyszącej niektórym pierwotnym niedoborom odporności. Jest to terapia substytucyjna w przypadku chorych z agammaglobulinemią Brutona, pospolitym zmiennym niedoborem odporności oraz deficytem ligandu CD40. U dzieci z XLA i części chorych z CD40Ldef, po włączeniu lecznia immunoglobulinami, obserwowano ustąpienie neutropenii 34,35 . Niektórzy chorzy z WHIM wymagają leczenia preparatami immunoglobulin, ale w ich przypadku leczenie to pozostaje bez wpływu na neutropenię 17,129,133,139. Zastosowanie immunoglobulin w innych jednostkach chorobowych, przebiegających z neutropenią, ma wciąŜ charakter eksperymentalny 25. Największą wadą leczenia preparatami immunoglobulin jest ich wysoki koszt, a takŜe często przemijający i krótkotrwały efekt terapeutyczny – przykładowo w AIN podanie immunoglobulin w dawce immunosupresyjnej powodowało wzrost ANC zaledwie u 50% dzieci, trwający około 7 dni 23,222. I.5.E. Przeszczepienie macierzystych komórek krwiotwórczych (HSCT) Dla chorych z SCN, nie odpowiadających wzrostem ANC powyŜej 1000 komórek/µl na leczenie podskórnymi preparatami rHuG-CSF, jedyną opcją terapeutyczną jest obecnie przeszczepienie macierzystych komórek krwiotwórczych 56,64,188,223 . Uzyskanie pełnej rekonstytucji hematologicznej pozwala wówczas wyleczyć nie tylko przewlekłą, cięŜką 46 neutropenię oraz przewlekłe, cięŜkie zapalenie dziąseł, lecz przede wszystkim znosi ryzyko transformacji w MDS/AML223. Rokowanie w przypadku HSCT przeprowadzanego u dzieci, które rozwinęły zespół mielodysplastyczny lub ostrą białaczkę mieloblastyczną w przebiegu SCN jest złe- wg danych SCNIR śmiertelność wynosiła około 70% (na 18 chorych, leczonych w ten sposób, Ŝyje zaledwie 3) 82,224. Poza brakiem odpowiedzi na rHuG-CSF, wskazaniem do HSCT u chorych z SCN są takŜe nieprawidłowości cytogenetyczne takie, jak monosomia chromosomu 7 i trisomia chromosomu 2182,223. Choć u około 80% chorych objętych rejestrem SCNIR stwierdzenie nabytej mutacji w genie dla receptora G-CSF wyprzedzało transformację w MDS/AML, jednakŜe nie uwaŜa się tej nieprawidłowości za wystarczającą, by zalecać HSCT. HSCT jest leczeniem z wyboru u chorych z niektórymi pierwotnymi niedoborami odporności, którym towarzyszy przewlekła neutropenia. NaleŜą do nich dysgenezja siateczki, zespół Chediaka-Higashiego i zespół Griscellego typu II 7,15,26,225. Wskazania do HSCT u chorych z niedoborem CD40L są wciąŜ kontrowersyjne, gdyŜ część z nich moŜe osiągnąć trzecią dekadę Ŝycia dzięki profilaktyce pneumocystozowego zapalenia płuc i regularnej substytucji immunoglobulin. JednakŜe większe szanse na powodzenie procedury przeszczepowej mają dzieci poddane HSCT przed wystąpieniem cięŜkich zakaŜeń (PVB19, Pneumocystis jiroveci, Cryptosporidium sp) i uszkodzeń narządowych, zwłaszcza wątroby. Zgodnie z zaleceniami EBMT i ESID z 2004 roku, wskazania do HSCT zaleŜą w tej grupie chorych przede wszystkim od rodzaju dostępnego dawcy macierzystych komórek krwiotwórczych225. Chłopcy posiadający HLA- zgodne rodzeństwo powinni być poddawani HSCT jak najszybciej po ustaleniu rozpoznania, zanim rozwiną powikłania choroby. Jeśli dostępny jest jedynie dawca niespokrewniony, to wobec około 30% śmiertelności po MUDHSCT , jaką odnotowano u chorych z CD40L-def, leczenie to jest rekomendowane mniej jednoznacznie, lecz nadal wyraźnie zalecane dzieciom, u których wystąpiły cięŜkie powikłania zakaźne i narządowe226. Wskazania do transplantacji macierzystych komórek krwiotwórczych mają takŜe chorzy z zespołem Shwachmana-Diamonda, którzy rozwinęli zaburzenia cytogenetyczne, aplazję szpiku, MDS lub AML. Wg danych Francuskiego Rejestru Przewlekłej Neutropenii 5letnie przeŜycie po HSCT uzyskało około 60% chorych z SDS 227. Podjęto takŜe udane próby leczenia chorych z SDS, powikłanym niedokrwistością aplastyczną, z wykorzystaniem krwi pępowinowej, jako źródła komórek macierzystych228. 47 I.5.F. Szczepienia profilaktyczne Jak juŜ wcześniej wspomniano przewlekła neutropenia usposabia chorych do zakaŜeń bakteryjnych, szczególnie tzw. bakteriami otoczkowymi. W związku z tym chorym z PN, bez towarzyszących zaburzeń odporności humoralnej i/lub komórkowej, zaleca się wykonanie dodatkowych szczepień ochronnych przeciwko pneumokokom, meningokokom oraz Haemophilusowi influenzae typu B 23,25,54. NaleŜy podkreślić, Ŝe chorzy z PN nie mają przeciwwskazań do szczepień ochronnych. Szczepionki zawierające „zabite” bakterie lub wirusy mogą być podawane bez kontrolowania morfologii krwi obwodowej. Wyjątek stanowią jedynie szczepienia przeciwko odrze, śwince, róŜyczce i ospie wietrznej, zawierające Ŝywe wirusy. Przed ich podaniem wymagana jest kontrola morfologii krwi gdyŜ uwaŜa się, Ŝe aby mogły być podane w sposób bezpieczny dla chorego, ANC powinno wynosić przynajmniej 1000/µl 229. Chorym z WHIM, w związku z występowaniem u nich zmian dysplastycznych na wargach sromowych oraz w pochwie, po przebyciu zakaŜenia wirusem brodawczaka ludzkiego, zaleca się podanie rekombinowanej szczepionki przeciwko HPV, choć w związku z zaburzeniami liczebności oraz funkcji limfocytów B, mogą one wymagać regularnego podawania dawek przypominających 138. 48 II CELE PRACY 1. Charakterystyka obrazu klinicznego przewlekłej neutropenii u dzieci, ze szczególnym uwzględnieniem autoimmunizacyjnej neutropenii niemowląt. 2. Podsumowanie wyników badań immunologicznych i hematologicznych oraz ocena ich przydatności, jako czynników prognostycznych przewlekłej neutropenii u dzieci. 3. Ocena przydatności cytometrii przepływowej w diagnostyce i monitorowaniu chorych z przewlekłą neutropenią. 4. Ocena skuteczności oraz działań niepoŜądanych zastosowanych metod leczenia. 5. Propozycja algorytmu diagnostycznego i terapeutycznego dla dzieci z przewlekłą neutropenią. 49 III MATERIAŁ I METODYKA Badaniem objęto 88 dzieci, u których ustalono rozpoznanie PN w latach 1985- 2009 w Oddziale Immunologii IP-CZD oraz 9 chorych z glikogenozą typu Ib, leczonych w Klinice Chorób Metabolicznych IP-CZD, konsultowanych immunologicznie podczas wizyt kontrolnych. Retrospektywną analizą objęto 52 chorych z przewlekłą neutropenią rozpoznaną w IPCZD do roku 2006. Prospektywna część badania dotyczyła okresu od 1.01.2007 do 31.12.2009 i objęła kolejnych 45 dzieci oraz 30 chorych, pozostających pod opieką IP-CZD, którzy uzyskali rozpoznanie PN przed 2007 rokiem. Opiekę specjalistyczną nad chorymi sprawowano poprzez systematyczne (przynajmniej 2 razy w roku) wizyty w Poradni Immunologicznej i/lub w Oddziale Immunologii IP-CZD. Warunkiem włączenia dziecka do grupy badanej było udokumentowane obniŜenie liczby bezwzględnej granulocytów obojętnochłonnych poniŜej przyjętej normy dla wieku (przynajmniej 3 nieprawidłowe wyniki ANC wyliczone z rozmazu manualnego krwi obwodowej), w ciągu poprzedzających 6 miesięcy lub 2 miesięcy- w przypadku niemowląt. Z badania wykluczono dzieci z PN wtórną do aktywnych zakaŜeń wirusowych, hipersplenizmu, chorób zapalnych tkanki łącznej oraz kwasic organicznych. III.1 Charakterystyka grupy badanej W skład grupy badanej weszło 97 dzieci , w tym 59 dziewczynek i 38 chłopców, w wieku od 2 miesięcy do 17,5 lat; średni wiek chorych wyniósł 15 miesięcy, a mediana- 13 miesięcy. Na podstawie wykonanych badań ustalono następujące rozpoznania: 1. Autoimmunizacyjna neutropenia niemowląt (AIN) wystąpiła u 21 dzieci (12 dziewczynek i 9 chłopców) 2. Prawdopodobna autoimmunizacyjna neutropenia niemowląt (AINsusp) u 34 chorych (20 dziewczynek i 14 chłopców) 3. Glikogenoza typu Ib (GSDIb) wystąpiła u 9 chorych (8 chłopców i 1 dziewczynki) 4. CięŜka wrodzona neutropenia (SCN) rozpoznana została u 7 dzieci (4 chłopców i 3 dziewcząt) 5. Cykliczna neutropenia (CyN) wystąpiła u 5 dzieci (4 dziewczynek i 1 chłopca) 6. Zespół Shwachmana-Diamonda (SDS) rozpoznano u 3 dzieci (2 chłopców i 1 dziewczynki, dwoje dzieci było rodzeństwem) 7. Przewlekłą idiopatyczną neutropenię (CIN) zdiagnozowano u 6 chorych (4 dziewcząt i 2 chłopców) 50 8. Rodzinną łagodną neutropenię (FBN) rozpoznano u 5 pacjentów (4 dziewcząt i 1 chłopca) 9. Zespół WHIM podejrzewamy u 4 chorych (3 dziewczynek i 1 chłopca) 10. Niedobór ligandu CD40 (CD40Ldef) wystąpił u 1 chorego z PN 11. Autoimmunizacyjny zespół limfoproliferacyjny (ALPS) rozpoznano u 1 chłopca 12. Pospolity zmienny niedobór odporności (CVID) zdiagnozowano u 1 nastolatka z PN Badanie przeprowadzono po uzyskaniu pozytywnej opinii Komisji Bioetycznej IP-CZD. Od rodziców dzieci objętych badaniem, a takŜe od chorych, którzy ukończyli 16 rok Ŝycia, uzyskano pisemną zgodę na udział w projekcie. III.2 Przyjęte kryteria rozpoznawania poszczególnych jednostek chorobowych Kryterium rozpoznania AIN stanowiło stwierdzenie AGAbs w jednym z 3 wykonywanych testów diagnostycznych, u dziecka w wieku poniŜej 72 miesięcy w chwili wystąpienia zakaŜeń, sugerujących obecność neutropenii 23,29,48. Kryteria rozpoznania prawdopodobnej AIN: - wiek poniŜej 72 miesięcy w chwili wystąpienia zakaŜeń, sugerujących obecność neutropenii23,29,48 - cięŜka neutropenia w chwili rozpoznania - komórkowość szpiku prawidłowa, obecne „przesunięcie w lewo” do granulocyta pałeczkowatego lub metamielocyta 29,48 - brak innych, istotnych zaburzeń hematologicznych - udokumentowane prawidłowe wartości ANC w okresie poprzedzającym wystąpienie objawów neutropenii i/lub normalizacja ANC z wiekiem - negatywny wynik badania obecności przeciwciał przeciwgranulocytarnych w 3 testach: MAIGA, GIFT i GAT Diagnozę GSDIb, u wszystkich 9 chorych włączonych do badania, ustalono w Klinice Chorób Metabolicznych IP-CZD. Rozpoznanie SDS oparto na kryteriach klinicznych zaproponowanych przez Drora i Freedmana w 2001 roku, które obejmują 86: 1. obecność zewnątrzwydzielniczej dysfunkcji trzustki (potwierdzoną obniŜonym stęŜeniem trypsynogenu w osoczu lub zwiększoną zawartością tłuszczu w trzydobowej zbiórce kału) 2. przewlekłą cytopenię dotyczącą 1 lub więcej linii hematopoetycznych: 51 • ANC < 1500/µl, Hb < 2 SD dla wieku, płytki <150.000/µl lub 3. mielodysplazję Diagnoza SCN ustalona została na podstawie 56: - obrazu klinicznego (występowania nawracających, cięŜkich zakaŜeń bakteryjnych od wczesnego niemowlęctwa) - obecności cięŜkiej neutropenii (potwierdzonej przynajmniej trzema nieprawidłowymi badaniami krwi obwodowej w ciągu poprzedzających 6 miesięcy) - badania szpiku, które wykazało tzw. wysoki blok dojrzewania układu granulocytarnego, na etapie promielocyta lub mielocyta U 4 chorych rozpoznanie SCN potwierdzono badaniami molekularnymi. Rozpoznanie CyN ustalono w oparciu o badanie genetyczne i/lub analizę morfologii krwi obwodowej z rozmazem manualnym, wykonywanym 3 razy w tygodniu przez 5- 6 tygodni. Diagnoza pierwotnych niedoborów odporności sformułowana została w oparciu o kryteria zaproponowane przez Europejskie Towarzystwo Niedoborów Odporności (ESID)230. Rozpoznania WHIM, niedoboru ligandu CD40 oraz CVID dokonano w kategoriach prawdopodobnych, natomiast ALPS jest diagnozą potwierdzoną genetycznie. Przewlekła idiopatyczna neutropenia (CIN) zdiagnozowana została po wykluczeniu innych przyczyn prowadzących do neutropenii przewlekłej, na podstawie badań szpiku (mielogram i/lub badanie cytometryczne szpiku, prawidłowe badanie cytogenetyczne) oraz stosunkowo łagodnego przebiegu klinicznego, mimo ANC często poniŜej 500/µl 26,170. Rozpoznanie rodzinnej łagodnej neutropenii (FBN) oparto na stwierdzeniu u chorych przewlekłej leukopenii z łagodną lub umiarkowaną neutropenią, wykluczeniu etiologii autoimmunizacyjnej i infekcyjnej PN oraz wystąpieniu leukopenii z neutropenią u przynajmniej jednego członka najbliŜszej rodziny- rodzica lub rodzeństwa. III.3 Badania molekularne Diagnostykę genetyczną przeprowadzono u 16 chorych z klinicznym podejrzeniem wrodzonej neutropenii - SCN lub CyN w Instytucie Karola w Sztokholmie. Genetyczne tło przewlekłej neutropenii zdołano potwierdzić u 7 poddanych badaniom dzieci, przy czym wykonano wyłącznie badania genu ELANE i HAX-1. W oparciu o badania molekularne rozpoznano cykliczną neutropenię (CyN) u 3 dziewczynek i cięŜką wrodzoną neutropenię (SCN) u 4 chorych. We wszystkich przypadkach stwierdzono mutację genu ELA2/ELANE; Ŝaden chory nie miał mutacji genu HAX-1. Diagnostyka molekularna przyczyniła się takŜe do wyboru metody terapeutycznej u chłopca z SCN, który nie uzyskał poprawy hematologicznej 52 po zastosowaniu Neupogenu. Podjęto decyzję o przeszczepieniu macierzystych komórek krwiotwórczych. Wyniki przeprowadzonej diagnostyki molekularnej zawarto w tabeli 5. Tabela 5 Wyniki badań molekularnych u chorych z PN Badane geny Inicjały Rok DGN Płeć chorego urodzenia kliniczna ELA2/ELANE HAX1 Mutacja J.C. 1996 ♀ SCN nie znaleziono nie znaleziono (-) M.D. 1980 ♀ SCN (+) nie badano c.308 G>C Arg104Pro nie opisana wcześniej M.Ko. 1995 ♂ SCN nie znaleziono nie znaleziono (-) M.Kr. 1998 ♂ SCN (+) nie badano c.200 C>A / Ser 67Trp nie opisana wcześniej M.B. 1990 ♂ SCN Znany polimorfizm c.390 C>T nie badano (-) E.N. 2001 ♀ CyN (+) nie badano c.416 C>T / Pro139Leu opisana K.Ł. 1999 ♀ CyN (+) nie badano c.597+ 5G>A / Intron4, ‘splicing’ defect Z.B. 2004 ♀ CyN (+) nie badano IVS4+ 5G>A splicing defekt opisana S.P. 1992 ♀ SCN (-) (-) (-) R.Z. 1989 ♂ SCN (-) (-) (-) D.W. 1992 ♀ SCN (+) nie badano c.170C>A /p.Ala57Asp nie opisana wcześniej P.W. 1994 ♂ SCN (-) (-) (-) W.T. 2001 ♀ SCN (-) (-) (-) R.K. 2003 ♂ SCN (-) (-) (-) Ł.A. 2008 ♂ SCN (+) nie badano c.640 G>A / p.Gly214Arg opisana Kr.M. 2005 ♂ CyN (-) (-) (-) M.C. 2005 ♂ ALPS gen FAS c.817 C>A p.Glu273Lys w egzonie 9 W.B. 2009 ♀ leaky SCID RAG1, RAG2, ARTEMIS (-) Badania molekularne u 2 chorych z podejrzeniem pierwotnego niedoboru odporności (ALPS i „leaky” SCID) wykonano na Uniwersytecie Erazma w Rotterdamie. Dzięki nim potwierdzono diagnozę ALPS typu I u 3-letniego chłopca, natomiast wykluczono SCID, 53 wywołany przez mutację genu RAG1, RAG2 oraz ARTEMIS, u 10- miesięcznej dziewczynki, u której ostatecznie rozpoznano WHIM. Siedmioro dzieci z GSDIb uzyskało potwierdzenie genetyczne choroby dzięki współpracy naukowo-badawczej Kliniki Chorób Metabolicznych IP-CZD z ośrodkiem w Sheffield w Wielkiej Brytanii. U wszystkich badanych zidentyfikowano, w obu allelach genu SLC37A4, tę samą mutację pod postacią dwunukleotydowej delecji zmieniającej ramkę odczytu, c.1042_1043delCT, p.L348VfsX53. III.4 Kryteria oceny klinicznej chorych Przebieg kliniczny przewlekłej neutropenii oceniono w oparciu o dokumentację medyczną chorych, badanie podmiotowe i przedmiotowe, przeprowadzane podczas wizyt kontrolnych. ZakaŜenia Określono rodzaje zakaŜeń, które przebyli chorzy oraz podzielono je według stopnia cięŜkości. Do zakaŜeń cięŜkich zaliczono: posocznicę, inwazyjną aspergillozę, zapalenie płuc, ropnie narządowe i okołoodbytnicze, rozległe bakteryjne zakaŜenie tkanki podskórnej (ropowica ramienia, uda), ospę wietrzną oraz odrę o cięŜkim przebiegu (z wysoką gorączką i powikłaniami bakteryjnymi, wymagającymi leczenia w szpitalu). Inne zakaŜenia, jakie wystąpiły u chorych, objęły: zapalenie węzłów chłonnych, ropnie podskórne, zanokcicę, bakteryjne zapalenie pępka, nawracające zapalenie dróg łzowych, zapalenie ucha środkowego, nawracające anginy, zapalenie gardła, zapalenie zatok obocznych nosa, zapalenie oskrzeli, zakaŜenie układu moczowego, biegunkę ostrą lub przewlekłą. W przypadku niektórych zakaŜeń- posocznica, ropnie, bakteryjne zapalenie węzłów chłonnych, udało się określić ich czynnik etiologiczny. Zmiany w jamie ustnej Oceniano takŜe zmiany w obrębie jamy ustnej, dzieląc je na: • wrzodziejące zapalenie jamy ustnej • zapalenie dziąsła brzeŜnego • rozległe zapalenie dziąseł • cięŜkie zapalenie przyzębia z destrukcją kości szczęki i Ŝuchwy, prowadzące do rozchwiania i przedwczesnej utraty zębów mlecznych i stałych. Rozwój fizyczny 54 Ocena rozwoju fizycznego obejmowała pomiary masy oraz długości/wysokości ciała, a następnie określenie ich pozycji na dostępnych siatkach centylowych, z uwzględnieniem wieku i płci dziecka. III.5 Metodyka i interpretacja badań diagnostycznych W ramach pracy poddano ocenie następujące badania diagnostyczne: III.5.A. Bezwzględna liczba granulocytów obojętnochłonnych (ANC) ANC (Absolute Neutrophil Count) wyliczono w oparciu o rozmaz manualny krwi obwodowej, barwiony metodą Wrighta. Aby potwierdzić rozpoznanie przewlekłej neutropenii niezbędne były przynajmniej 3 nieprawidłowe wyniki, uzyskane przez chorego w ciągu 6 miesięcy lub 2 miesięcy – w przypadku niemowląt w wieku poniŜej pół roku. Dzieciom, u których zaobserwowano znaczne wahania wartości ANC i/lub cykliczność zakaŜeń, zalecono wykonywanie morfologii krwi z rozmazem manualnym 3 razy w tygodniu przez 6 tygodni, w celu uchwycenia ewentualnej cykliczności spadków ANC, występującej przede wszystkim w cyklicznej neutropenii, ale takŜe u chłopców z zespołem Bartha lub niedoborem ligandu CD40. Wartości odsetkowe i liczba bezwzględna monocytów, granulocytów kwasochłonnych, leukocytów oraz płytek krwi były interpretowane w zaleŜności od wieku pacjenta, zgodnie z obowiązującymi normami12,19 . III.5.B. Mielogram Szpik pobierany był metodą biopsji aspiracyjnej z kości piszczelowej lub kolca biodrowego przedniego górnego. Z pobranego materiału wykonywano rozmaz, który następnie barwiono metodą Wrighta. W większości przypadków badanie wykonano w Pracowni Hematologicznej IP-CZD, kilka pochodziło z akademii medycznych (Lublin, Bydgoszcz, Gdańsk, Szczecin, Białystok). Normy odsetkowe poszczególnych linii hematopoezy szpikowej, które posłuŜyły do oceny wykonanych badań, opracowane zostały przez Opitza i Bakera w 1954 oraz opisane przez Matysiaka12. III.5.C. Immunofenotyp komórek hematopoezy szpikowej Oceny immunofenotypu komórek hematopoezy szpikowej dokonano przy pomocy cytometrii przepływowej w Pracowni Zgodności Tkankowej IP-CZD. Badanie przeprowadzono w płukanej czterokrotnie zawiesinie komórek szpiku, z lizą dojrzałych erytrocytów z wykorzystaniem roztworu chlorku amonu (BD FACS Lysing solution, BectonDickinson), przy pomocy czterokolorowego cytometru FACS Calibur firmy BectonDickinson, wykorzystując licencjonowane oprogramowanie Cellquest. 55 Do cytometrycznej oceny granulopoezy posłuŜyły 3 rodzaje barwień z uŜyciem przeciwciał monoklonalnych: CD34/CD117/CD45/CD13.33, CD16/CD13/CD45/CD11b oraz CD64/CD16/CD45/CD11b - dla rozróŜnienia mielocyta od pałeczki; do oceny rozwoju monocytów – CD14/CD36/CD45/CD33, erytrocytów – CD34/CD117/CD45/CD13, limfocytów B – 5 róŜnych barwień opisanych w tabeli 6. Obecne w szpiku limfocyty T i NK wykrywano stosując kolejne zestawy przeciwciał monoklonalnych: CD4/CD8/CD3/HLA-DR i CD16 /CD13/CD45/CD11b. Tabela 6. Koktajle przeciwciał uŜyte w badaniach cytometrycznych. CD40L Podst. subpopulacje CD95 DNTC krwi obwodowej Badanie Probówka FITC Swoistość/ Klon PE Swoistość/ Klon PerCP Swoistość/ Klon CD45/ 2D1(HLe-1) APC Swoistość/ Klon 1 CD3/ SK7 CD8/ SK1 2 CD3/ SK7 CD16/ B73.1 CD56/ NCAM 16.2 CD45/ 2D1(HLe-1) CD19/ SJ25C1 1 CD8/ SK1 TCRαβ/ 11F2 CD4/ SK3 CD3/SK7 1 CD45RO/ UCHL1 CD3/ SK7 CD45/ 2D1(HLe-1) CD95/ DX2 1 CD8/ SK1 IgG1/X40 CD3/ SK7 - 2 CD8/ SK1 CD154/89-756 CD3/ SK7 - 3 CD8/ SK1 CD45/ 2D1 (HLe-1) CD69/ L78 CD16/ B73.1 CD56/ MY31 CD3/ SK7 CD71/L01.1 CD13/ CD33 CD45/ 2D1(HLe-1) CD22/ S-HCL-1 CD22/ S-HCL-1 CD22/ S-HCL-1 CD19/ SJ25C1 CD34/ 8G12 HLADR/L43 CD13/WM 15 CD33/ P67.6 CD33/P67. 6 CD11b/ D12 CD11b/ D12 1 2 cyt TdT/HTd T-6 IgM/ G20127 CD34/ 8G12 CD19/4G7 cytIgM/ G20127 CD20/ L27 5 CD20/ L27 CD10/ HI10a CD19/4G7 6 CD4/ SK3 CD8/ SK1 CD3/ SK7 7 CD34/8G12 CD117/ 104D2 CD45/ 2D1(HLe-1) 3 4 Szpik CD3/ SK7 CD45/ 2D1(HLe-1) CD16/ CD45/ 9 CD13/ L138 NKP15 2D1(HLe-1) CD45/ 10 CD64/ 10.1 CD16/ B73.1 2D1(HLe-1) Uwagi: cytTdT oraz cytIgM – oznacza barwienia wewnątrzkomórkowe 8 CD14/ MφP9 CD36/ CB38 CD4/ SK3 56 III.5.D. Badanie cytogenetyczne szpiku Badania te wykonane zostały w Zakładzie Patologii Wieku Rozwojowego Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego z zastosowaniem barwienia techniką prąŜkową GTG i CBG. Analizowano mitozy z hodowli 24-godzinnej niestymulowanej. Pięcioro dzieci miało badanie cytogenetyczne przeprowadzone w Akademii Medycznej w Lublinie. III.5.E. Przeciwciała przeciwgranulocytarne (AGAbs) Badania wykrywające AGAbs wykonywano u dzieci z podejrzeniem neutropenii autolub alloimmunizacyjnej. Przeciwciała przeciwgranulocytarne oceniano w 3 testach: • MAIGA (Monoclonal Antibody specific Immobilization of Granulocyte Antigens)231 • GIFT (Granulocyte Immunofluorescence Test)232 • GAT (Granulocyte Agglutination Test)233. Testy wykonane zostały w Instytucie Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie, w Pracowni Immunologii Leukocytów i Krwinek Płytkowych. W testach GAT i GIFT do wykrywania AGAbs stosowano całe komórki granulocytów; w GAT wykrywano przeciwciała klasy IgG/IgM o charakterze aglutynin, a w GIFT- przeciwciała nie wiąŜące dopełniacza, klasy IgG. W teście enzymatycznym MAIGA, przy uŜyciu przeciwciał monoklonalnych, które ujawniały glikoproteiny błon komórkowych granulocytów, będące nośnikami swoistych antygenów granulocytarnych (HNA-1, HNA-2, HNA-4, HNA-5), wykrywano AGAbs klasy IgG. W teście mikroaglutynacji GAT, najczęściej wykrywane są przeciwciała skierowane do antygenu HNA-3 (dawniej 5b), natomiast w testach GIFT i MAIGA przeciwciała skierowane do pozostalych wymienionych antygenów granulocytów. Ponadto, przy uŜyciu testu ELISA, w surowicach poszukiwano takŜe AGAbs skierowanych do antygenów HLA klasy I i II. U części dzieci, objętych badaniem retrospektywnym, a takŜe ich rodziców, metodą reakcji łańcuchowej polimerazy z alleloswoistymi starterami (PCR SSP) wykonano badanie antygenów granulocytarnych układu HNA-1 na poziomie DNA234. Badanie to było pomocne w róŜnicowaniu AIN z NAIN, a takŜe w ustalaniu swoistości przeciwciał przeciwgranulocytarnych. 57 III.5.F. Klasy główne immunoglobulin Oceny stęŜeń klas głównych immunoglobulin IgG, IgA, IgM, a u wybranych dzieci takŜe podklas IgG, dokonano w Pracowni Diagnostyki Immunologicznej, Zakładu Mikrobiologii i Immunologii IP-CZD techniką nefelometryczną, aparatem BN Prosper firmy Dade Behring. Uzyskane wyniki porównano z normami dla poszczególnych grup wiekowych, opracowanymi w 1994 roku przez H. Gregorek i wsp.235. III.5.G. Badania metodą cytometrii przepływowej Przy pomocy cytometrii przepływowej oceniono takŜe: 1. rozkład subpopulacji limfocytów we krwi obwodowej 2. aktywność oksydazy NADPH w granulocytach obojętnochłonnych; badanie potocznie określane mianem „wybuchu tlenowego”; wykonywano je wyłącznie u chorych z GSD1b, w celu oceny wskazań i skuteczności leczenia rHuG-CSF 3. ekspresję ligandu CD40 (CD154) na aktywowanych limfocytach CD4+ oznaczano u chłopców z hipogammaglobulinemią. Badania powyŜsze wykonano w Pracowni Zgodności Tkankowej IP-CZD, z uŜyciem opisanego powyŜej cytometru i oprogramowania. Oceny subpopulacji limfocytów krwi obwodowej dokonano korzystając z firmowych kombinacji przeciwciał monoklonalnych firmy Becton-Dickinson (tabela 6), co pozwoliło na zidentyfikowanie limfocytów T (CD3+, CD4+, CD8+), limfocytów B (CD19+), komórek NK (CD3-CD16+CD56+), komórek T podwójnie negatywnych (CD3+CD4-CD8-). Oceniono zarówno odsetek, jak i liczbę bezwzględną badanych komórek, a uzyskane wyniki porównano z normami opracowanymi dla poszczególnych grup wiekowych przez Comans-Bitter236. Celem badania „wybuchu tlenowego” jest wykrycie aktywności oksydazy NADPH w granulocytach obojętnochłonnych. W czasie trwania testu, DHR123 jest utleniana do rodaminy 123 przez H2O2 i O²-, emitując jednocześnie jasne światło fluorescencyjne pod wpływem stymulacji światłem niebieskim. Barwnik przechodzi swobodnie do komórek i moŜe być stosowany we krwi pełnej, w celu sprawdzenia zdolności granulocytów obojętnochłonnych do wytwarzania reaktywnych form tlenu pod wpływem myrystynianu forbolu (PMA), silnie stymulującego oksydazę NADPH. Za wynik prawidłowy przyjęto aktywność oksydazy NADPH stanowiącą nie mniej niŜ 80% komórek lub nasilenia 58 fluorescencji, w porównaniu do aktywności NADPH oznaczonej w porównywalnych warunkach w komórkach kontrolnych. Z kolei cytometryczna ocena obecności ligandu CD40 na aktywowanych, 4-godzinną stymulacją myrystynianem forbolu z jonomycyną, limfocytach CD4+ przeprowadzana była u chłopców z hipogammaglobulinemią i ich matek, a takŜe u ojców lub osób niespokrewnionych w charakterze tzw. zdrowej kontroli. Krew w ilości 2 ml pobierana była do probówek zawierających heparynę sodową, gdyŜ uŜycie heparyny litowej zmniejsza skuteczność stymulacji o około 50%. Analizowano limfocyty CD3+CD8-, gdyŜ w stosowanych warunkach stymulacji dochodzi do złuszczenia markera CD4, przejawianego na powierzchni limfocytów pomocniczych. Przyjęto następujące kryteria interpretacji uzyskanych wyników: - u osób zdrowych > 90% limfocytów CD3+CD8- po stymulacji wykazuje obecność markera CD154 - stymulacja uwaŜana jest za prawidłową, jeśli > 90% limfocytów CD3+CD8- po stymulacji wykazuje obecność markera CD69 - wynik < 10% obecności CD154 na aktywowanych limfocytach T u chłopca, przy prawidłowej stymulacji (> 90% CD69+) oznacza moŜliwy defekt genetyczny, którego konsekwencją jest niedobór CD40L - wynik około 50% obecności CD154 u matki, przy prawidłowej stymulacji, sugeruje nosicielstwo defektu - wynik jest niemiarodajny, jeśli stymulacja nie była skuteczna, a ekspresję CD69 wykazało mniej niŜ 80% komórek o fenotypie CD3+CD8- wynik moŜe być fałszywie ujemny u noworodków, dzieci z niedoborem limfocytów T CD4+, niedoborem cząsteczek MHC II oraz z zaburzeniami mechanizmów stymulacji limfocytów T. III.5.H. Inne badania Wiele badań dobierano indywidualnie, kierując się wynikami badania podmiotowego, przedmiotowego oraz diagnostyką przeprowadzoną wcześniej, w innych ośrodkach. Chorym z podejrzeniem choroby zapalnej tkanki łącznej wykonywano badania diagnostyczne poszukując przeciwciał przeciwjądrowych (ANA), przeciwciał przeciw natywnemu DNA (dsDNA), a takŜe oceniono stęŜenie klas głównych immunoglobulin oraz 59 składowych C3 i C4 dopełniacza. U 80 dzieci, w celu wykluczenia aktywnych zakaŜeń będących potencjalną przyczyną neutropenii (CMV, EBV, PVB19, HIV, HAV, HBV, HCV, Toxoplasma gondii), przeprowadzono badania serologiczne i/lub badania metodą PCR. W celu wyklucznia metabolicznych przyczyn przewlekłej neutropenii, u niektórych chorych oznaczono stęŜenie w osoczu: kwasu moczowego i mlekowego, glukozy, cholesterolu i triglicerydów, jak równieŜ aktywność w osoczu: aminotransferaz, amylazy trzustkowej, gammaglutamylotranspeptydazy; u 38 dzieci wykonano takŜe profil kwasów organicznych w moczu - metodą GC/MS (diagnostyka kwasic organicznych i zespołu Bartha), natomiast pacjentom z przewlekłą biegunką i/lub niedoborem masy ciała wykonano bilans tłuszczu w 3-dobowej zbiórce kału (w kierunku SDS). We wszystkich przypadkach zebrano wywiad dotyczący przyjmowanych przez chorego leków, przebytych zakaŜeń, chorób towarzyszących oraz wywiad rodzinny, ze szczególnym uwzględnieniem występowania nowotworów, zgonów dzieci, chorób zapalnych tkanki łącznej oraz innych chorób autoimmunizacyjnych. III.5.I. Badania obrazowe Ze względu na szeroką diagnostykę róŜnicową, badania obrazowe dobierano indywidualnie: • USG jamy brzusznej – oceniano wielkość narządów miąŜszowych, obecność limfadenopatii • RTG klatki piersiowej i nadgarstka – oceniano wiek kostny, poszukiwano cech SDS • ECHO - w poszukiwaniu wady serca lub cech wskazujących na kardiomiopatię • densytometrię kośćca – wykonywano dzieciom leczonym przewlekle Neupogenem III.6 Metody statystyczne Statystykę opisową przeprowadzono przy uŜyciu pakietu Statistica for Windows. Porównanie liczebności grup wykonano testami z grupy chi² , w modyfikacji Fischera, dobierając rodzaj testu do liczebności oczekiwanych. Za istotne statystycznie uznano p<0,05. IV WYNIKI BADAŃ Czas obserwacji 97 chorych mieścił się w przedziale od 3 miesięcy do 20,4 lat; średnia wynosiła 44 miesiące, natomiast mediana - 34 miesiące. Dwóch chorych zmarło (obaj z SCN), a 55 jest nadal leczonych w IP-CZD. Zmarli – pierwszy chłopiec z powodu ostrej 60 choroby przeszczep przeciw gospodarzowi, drugi – wskutek posocznicy o etiologii Clostridium perfringens. Nabytą przewlekłą neutropenię zdiagnozowano u 61 (63%) pacjentów (34 z prawdopodobną AIN, 21 z AIN, 6 z CIN), odnotowując przewagę dziewcząt – było ich 36, podczas gdy chłopców - 25. Przewlekła neutropenia uwarunkowana genetycznie wystąpiła u 36 (37%) pacjentów (9 z GSDIb, 7 z SCN, 5 z CyN, 5 z FBN, 4 z WHIM, 3 z SDS, po 1 z CD40Ldef, CVID i ALPS), w tym u 23 dziewczynek i u 13 chłopców. IV.1 Charakterystyka obrazu klinicznego dzieci z PN w zaleŜności od ustalonego rozpoznania. Grupę badaną podzielono w oparciu o wyniki badań hematologicznych, immunologicznych oraz molekularnych na następujące podgrupy (wykres 1): • 21 chorych z pewnym rozpoznaniem AIN (uzyskali pozytywny wynik testów stwierdzających obecność przeciwciał przeciwgranulocytarnych) • 34 chorych z prawdopodobnym rozpoznaniem AIN - AINsusp (uzyskali negatywny wynik testów na obecność przeciwciał przeciwgranulocytarnych) • 15 chorych z przewlekłą wrodzoną neutropenią – CN (7 z SCN, 5 z CyN, 3 z SDS) z wyłączeniem GSDIb • 9 chorych z GSDIb • 7 chorych z pierwotnym niedoborem odporności – PIDs (4 z podejrzeniem WHIM, po 1 z CD40Ldef, CVID i ALPS) • 11 chorych z przewlekłą idiopatyczną neutropenią oraz z rodzinną łagodną neutropenią – 6 z CIN i 5 z FBN 61 Grupy pacjentów z przewlekłą neutropenią. 15 9 SCN + CyN + SDS GSDIb PIDs FBN + CIN 55 7 AIN + AIN susp 11 Wykres 1 Grupy chorych z przewlekłą neutropenią W grupie 21 chorych z pewnym rozpoznaniem AIN zakaŜenia, sugerujące istnienie neutropenii, zaobserwowano w wieku od pierwszego do 22 miesiąca Ŝycia (średnia 7 miesięcy, mediana 6 miesięcy). Rozpoznanie ustalane było często z kilkumiesięcznym opóźnieniem, stąd wiek w chwili sformułowania właściwej diagnozy, dzięki wykryciu obecności przeciwciał przeciwgranulocytarnych w surowicy chorych, wahał się między 2 a 29 miesiącem (średnia 12,6 miesięcy, mediana 12 miesięcy). Analizie poddano takŜe wartość ANC w chwili oznaczania przeciwciał przeciwgranulocytarnych. Mieściła się ona w przedziale od 0 do 450 neutrocytów /µl (średnia - 101, mediana - 65). Normalizację liczby granulocytów osiągnęło dotąd 12 spośród 21 dzieci z AIN, najwcześniej w 11 miesiącu Ŝycia, a najpóźniej w 102 miesiącu, średnia wynosiła 63, a mediana 62 miesiące. Ustąpienie neutropenii zaobserwowano u 6 (28%) chorych przed ukończeniem 2 roku Ŝycia, u 3 (14%) w 3 roku Ŝycia, u kolejnych 2 (9%) do czasu 5 urodzin; wiek normalizacji ANC u 1 chłopca nie jest znany, gdyŜ jego rodzice nie zgłosili się z nim na badania kontrolne. W grupie chorych z AIN zaburzenia rozwoju somatycznego, pod postacią niskorosłości i niedoboru masy ciała, zaobserwowano u 1 chorej z hipotrofią wewnątrzmaciczną (tabela 10). 62 ZakaŜenia cięŜkie odnotowano u 5 (23%) dzieci; spośród nich 4 przebyło zapalenie płuc, a u 1 wystąpiła posocznica, podczas której po raz pierwszy stwierdzono neutropenię (tabela 8). Wrzodziejące zapalenie jamy ustnej zaobserwowano u 5 (23%) chorych, a przewlekłe zapalenie dziąseł u 9 (43%), przy czym występowało ono u dzieci powyŜej 12 miesiąca Ŝycia, ograniczało się zwykle do zapalenia dziąsła brzeŜnego, nigdy nie spowodowało destrukcji brodawek międzyzębowych, ani kości wyrostka zębodołowego szczęki lub Ŝuchwy. Bakteryjne zapalenie węzłów chłonnych lub ropnie podskórne stanowiły pierwszą kliniczną manifestację neutropenii u odpowiednio 5 (23%) i 11 (52%) chorych. Ropień pośladka wystąpił u 2 dzieci, krocza u 1 dziewczynki, a zanokcica u 1 chłopca. Zaledwie u 2 dzieci zidentyfikowano bakterię wywołującą zakaŜenie; w obu przypadkach z pobranej do badań treści ropnej wyhodowano Staphylococcus aureus (tabela 9). Większość dzieci chorowała na zakaŜenia górnych dróg oddechowych; zapalenie gardła miało 15 (71%) z nich, anginę 4 (21%). Zapalenie ucha środkowego odnotowano u 8 (38%). Ostra biegunka o etiologii Salmonella enteritidis wystąpiła u 1 chorej. ZakaŜenie układu moczowego zaobserwowano u 4 dziewczynek i 1 chłopca (łącznie u 23%), a epizody kilkudniowych gorączek o nieustalonej przyczynie u 4 (21%) dzieci (tabela 9). W grupie 34 chorych z rozpoznaniem prawdopodobnej AIN zakaŜenia, podczas których po raz pierwszy zaobserwowano neutropenię, wystąpiły w wieku od drugiego do 72 miesiąca Ŝycia (średnia 10,8 miesiąca, mediana 9 miesięcy). Podobnie jak w grupie dzieci z AIN rozpoznanie ustalano z opóźnieniem. Wiek w chwili sformułowania ostatecznej diagnozy, mimo uzyskania negatywnego wyniku wszystkich trzech testów wykrywających przeciwciała przeciwgranulocytarne, wahał się między 6 a 97 miesiącem (średnia 16,7 miesięcy, mediana 12,5 miesięcy). Analizie poddano takŜe wartość ANC w chwili oznaczania AGAbs. Mieściła się ona w przedziale od 0 do 500 neutrocytów /µl (średnia 134, mediana 120). Normalizację liczby granulocytów obojętnochłonnych uzyskało 23 spośród 34 dzieci z prawdopodobną AIN, najwcześniej w 14 miesiącu, a najpóźniej w 154 miesiącu Ŝycia (średnia wynosiła 67, a mediana 101 miesięcy). Ustąpienie neutropenii zaobserwowano u 8 (24%) chorych w 2 roku Ŝycia, u 6 (18%) w 3 roku Ŝycia, u kolejnych 4 (11%) do czasu 5 urodzin, u 5 (15%) do ukończenia 7 lat. Jedenaścioro dzieci, w wieku od 20 miesięcy do 7 lat, nie uzyskało jeszcze normalizacji liczby neutrocytów we krwi obwodowej. W grupie chorych z prawdopodobną AIN zaburzenia rozwoju somatycznego wystąpiły u 2 dzieci; jedno miało niedobór masy ciała, drugie- nadwagę. 63 ZakaŜenia cięŜkie odnotowano u 20 (59%) dzieci; spośród nich 18 wymagało pobytu w szpitalu z powodu zapalenie płuc, a 2 rozwinęło posocznicę. CięŜki przebieg ospy wietrznej (z wysoką gorączką, bakteryjnym zakaŜeniem skóry lub zapaleniem płuc) wystąpił u dwojga chorych (tabela 8). Wrzodziejące zapalenie jamy ustnej zaobserwowano u 9 (26%) chorych, a przewlekłe zapalenie dziąseł u 16 (47%), przy czym występowało ono u dzieci powyŜej 12 miesiąca Ŝycia; u 10 dzieci ograniczyło się do zapalenia dziąsła brzeŜnego, nigdy nie powodując destrukcji brodawek międzyzębowych, ani kości wyrostka zębodołowego szczęki lub Ŝuchwy. Bakteryjne zapalenie węzłów chłonnych stwierdzono u 8 (23 %), ropnie podskórne u 9 (26%), a zanokcicę u 1 chorego. Patogen wywołujący zakaŜenie zidentyfikowano u 4 dzieci; w 3 przypadkach wyhodowano Staphylococcus aureus, a w jednym Pseudomonas aeruginosa (tabela 9). Podobnie jak w grupie z AIN, większość dzieci chorowała na zakaŜenia górnych dróg oddechowych: zapalenie gardła przebyło 30 (88 %) z nich, anginę - 5 (15%). Zapalenie ucha środkowego odnotowano u 16 (47%), przy czym jedno dziecko przebyło 10 zapaleń uszu, zanim wykonano mu morfologię krwi obwodowej z rozmazem. Zapalenie oskrzeli wystąpiło u 10 (29%) pacjentów, natomiast zatok obocznych nosa u dwojga (tabela 9). Ostrą biegunkę o etiologii Klebsiella sp. stwierdzono u 1 chłopca. ZakaŜenie układu moczowego zaobserwowano u 9 dziewczynek i 1 chłopca (łącznie 29%), a epizody kilkudniowej gorączki o nieustalonej przyczynie u 7 (20%) dzieci (tabela 9). Jeden chłopiec oprócz przewlekłej neutropenii rozwinął takŜe autoimmunizacyjne zapalenie wątroby, które wymagało leczenia glikokortykosteroidami, ale normalizację ANC osiągnął przed włączeniem terapii prednisonem. Poszukując przyczyny trudności w wykrywaniu AGAbs u chorych z klinicznym podejrzeniem neutropenii autoimmunizacyjnej, dokonano porównania obu grup chorych AIN i prawdopodobnej AIN- oceniając wiek wystąpienia pierwszych objawów PN (zakaŜeń, zapalenia dziąseł i/lub wrzodziejącego zapalenia jamy ustnej), wiek w chwili ustalenia rozpoznania, wartość ANC w chwili oznaczania przeciwciał przeciwgranulocytarnych, a takŜe występowanie róŜnych rodzajów zakaŜeń. Parametry te porównano statystycznie, stwierdzając znamienną statystycznie róŜnicę w zakresie zaledwie jednego z nich- grupy róŜniły się częstością występowania cięŜkich zakaŜeń, na które złoŜyły się głównie zakaŜenia dolnych dróg oddechowych (tabela 7). Była ona wyŜsza u chorych z prawdopodobną AIN. 64 Jednocześnie stwierdzono, Ŝe 19 z 20 dzieci z klinicznym podejrzeniem AIN, u których wystąpiły cięŜkie zakaŜenia (posocznica lub zapalenie płuc) uzyskało juŜ prawidłowe wartości ANC. Tabela 7 Analiza porównawcza 2 grup chorych z AIN i prawdopodobną AIN AIN Oceniany parametr Prawdopodobna AIN min max Średnia mediana 1 22 7 6 2 2 29 12,6 12 ANC w chwili rozpoznania [komórki/µl] 0 450 101 Wiek oznaczenia AGAbs [miesiące] 2 29 12,6 Wiek wystąpienia pierwszych objawów [miesiące] Wiek w chwili rozpoznania [miesiące] RóŜnica znamienia statystycznie średnia Mediana 72 10,8 9 NIE 6 97 16,7 12,5 NIE 65 0 500 134 120 NIE 12 6 97 16,7 12,5 NIE min max CięŜkie zakaŜenia 5/21 (23%) 20/35 (59%) TAK Wrzodziejące zapal. jamy ustnej 5/21 (23%) 9/34 (26%) NIE Zapalenie dziąseł 9/21 (42%) 16/34 (47%) NIE Zapalenie węzłów chłonnych 5/21 (23%) 8/34 (23%) NIE Ropnie 11/21 (52%) 9/34 (26%) NIE Zapalenie ucha środkowego 8/21 (38%) 16/34 (47%) NIE Zapalenie gardła 15/21 (71%) 30/34 (88%) NIE Nie chorują po zastosowaniu profilaktyki antybiotyk+szczepienia 18/21 (85%) 28/34 (82%) NIE W grupie 15 chorych z rozpoznaniem wrodzonej neutropenii pierwsze zakaŜenia, sugerujące istnienie neutropenii, zaobserwowano w wieku od pierwszego do 36 miesiąca 65 Ŝycia (średnia 7 miesięcy, mediana 4 miesiące). TakŜe w tej grupie, mimo wystąpienia cięŜkich zakaŜeń i nieprawidłowego rozmazu krwi obwodowej, rozpoznanie ustalane było u około połowy dzieci z wielomiesięcznym opóźnieniem, stąd wiek w chwili sformułowania właściwej diagnozy wahał się między 2 a 96 miesiącem Ŝycia (średnia 28, a mediana 13 miesięcy). Zaburzenia rozwoju somatycznego wystąpiły u 6 (40%) dzieci. Niedobór masy ciała poniŜej 3 centyla oraz wzrost poniŜej 10 centyla zaobserwowano u wszystkich trzech chorych z SDS oraz u trojga dzieci z SCN (tabela 10 i wykres 2). ZakaŜenia cięŜkie odnotowano u 13(87%) dzieci; zapalenie płuc (często więcej niŜ jedno) wystąpiło u wszystkich 7 chorych z SCN, 3 z SDS oraz 3 z CyN. Posocznicę o etiologii Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa lub Clostridium perfringens rozwinęło 4 dzieci z SCN. Ostatnie z wymienionych zakaŜeń było przyczyną śmierci chłopca z SCN. Inwazyjną aspergillozę rozpoznano u dziecka z SCN, nie odpowiadającego na leczenie rHuG-CSF, który zmarł z powodu ostrej choroby przeszczep przeciw gospodarzowi IV stopnia w 4 tygodniu po MUD-HSCT. Ropnie wątroby wystąpiły u dwojga chorych z potwierdzonym genetycznie SCN (tabela 8). Wrzodziejące zapalenie jamy ustnej zaobserwowano u 11 (73%) chorych, w tym u wszystkich z CyN. Przewlekłe zapalenie przyzębia wystąpiło u 12 (80%) dzieci z CN, przy czym u wszystkich pacjentów z SCN miało ono cięŜki przebieg, z obserwowanym stopniowym zanikiem brodawek międzyzębowych i destrukcją wyrostka zębodołowego kości. Zapalenie dziąseł oraz zmiany na śluzówkach jamy ustnej nie występowały u Ŝadnego z niemowląt, nawet w przebiegu SCN. Bakteryjne zapalenie węzłów chłonnych stwierdzono u 4 (27%) dzieci, ropnie podskórne- w tym wargi sromowej- u 9 (60%), martwicze zapalenie tkanek miękkich pachwiny i moszny o etiologii Pseudomonas aeruginosa wystąpiło u niemowlęcia z SCN, a ropowica ramienia w miejscu szczepienia przeciw wirusowemu zapaleniu wątroby typu B, wywołana przez Staphylococcus aureus, u kolejnego chłopca z tym samym rozpoznaniem. Dziewczynka z CyN przebyła 5 gronkowcowych zapaleń dróg łzowych, zanim wykonano jej morfologię krwi obwodowej z rozmazem manualnym, w którym dostrzeŜono cięŜką neutropenię. Poza dominującymi w obrazie klinicznym cięŜkimi zakaŜeniami, wszystkie dzieci z wrodzoną neutropenią chorowały na nawracające zakaŜenia górnych dróg oddechowych; zapalenie gardła przebyły wszystkie z nich, a zapalenia migdałków podniebiennych obserwowano wielokrotnie u 5 (33%). Zapalenie ucha środkowego odnotowano u 9 (60%) 66 dzieci. Chora z SCN wymagała operacji laryngologicznej z powodu przewlekłego zapalenia ucha środkowego z perlakiem. Zapalenie oskrzeli wystąpiło u 5 (33%) pacjentów, a przewlekłe zapalenie zatok obocznych nosa u 1 chorej (tabela 9). Przewlekłą biegunkę miały wszystkie dzieci z SDS, a takŜe chłopiec z SCN potwierdzoną genetycznie. ZakaŜenia układu moczowego wystąpiły u 2 dziewczynek i 1 chłopca, łącznie u 20% pacjentów z wrodzoną neutropenią. Tabela 8 Występowanie zakaŜeń cięŜkich w grupie 97 dzieci z PN * oznaczono zakaŜenia, które wystąpiły u 100% dzieci w danej grupie Rodzaj zakaŜenia Łącznie SCN CyN SDS GSDIb AIN +AIN susp PID FBN +CIN Liczebność grupy 97 7 5 3 9 55 7 11 Zapalenie płuc 54 7* 3 3* 8 22 6 5 Posocznica 10 4 0 0 1 3 1 1 CięŜki przebieg ospy wietrznej 3 0 0 0 1 2 0 0 CięŜki przebieg odry 1 0 0 0 0 1 0 0 Ropień wątroby 2 2 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 6 1 1 0 2 0 0 2 Inwazyjna aspergilloza płuc Ropień okołoodbytniczy lub wargi sromowej W grupie 9 chorych z GSDIb pierwsze objawy choroby ujawniły się w przebiegu zakaŜeń, między pierwszym a 6 miesiącem Ŝycia (mediana 2 miesiące); u jednego chłopca podejrzewano nowotwór wątroby w związku ze znaczną hepatomegalią. Zaburzenia rozwoju somatycznego wystąpiły u 3 (33%) dzieci (tabela 10 i wykres 2). Niedobór masy ciała (poniŜej 3 centyla) zaobserwowano u 2 chorych i niskorosłość takŜe u 2, przy czym jeden z nich leczony był przewlekle glikokortykosteroidami. Odchyleniem w badaniu przedmiotowym, obecnym u wszystkich pacjentów z GSDIb od wczesnego dzieciństwa, było znacznego stopnia powiększenie wątroby. CięŜkie zakaŜenia odnotowano u większości, bo aŜ u 8 (89%) dzieci (tabela 8); ośmioro z nich wymagało pobytu w szpitalu z powodu zapalenia płuc, a jedyna dziewczynka 67 w grupie rozwinęła takŜe posocznicę gronkowcową. JednakŜe głównym problemem, dotyczącym wszystkich chorych z GSDIb, okazały się bakteryjne zakaŜenia skóry i tkanki podskórnej (tabela 9). Zapalenie pępka, ropowica uda, ropnie okołoodbytnicze lub krocza, czyraczność pośladków, czyrak i owrzodzenie grzbietu nosa wystąpiły u 4 (45%) dzieci, natomiast nawracające ropnie w miejscach skaleczeń, otarć, ukąszeń owadów dotyczyły wszystkich chorych z GSDIb. Czynnikiem etiologicznym tych zakaŜeń był w przypadku 7 chorych, wielokrotnie - Staphylococcus aureus, a u jednego dziecka - Escherichia coli. Tabela 9 Występowanie zakaŜeń innych niŜ cięŜkie w grupie 97 dzieci z PN * oznaczono zakaŜenia, które wystąpiły u 100% dzieci w danej grupie Rodzaj zakaŜenia Łącznie SCN CyN SDS GSDIb AIN +AIN susp PID FBN +CIN Liczebność grupy 97 7 5 3 9 55 7 11 Zapalenie dziąseł 56 6 4 2 9* 25 2 8 Wrzodziejące zapalenie jamy ustnej 40 5 4 1 7 14 3 6 Zapalenie węzłów chłonnych 20 3 1 0 0 13 2 1 Zapalenie ucha środkowego 53 5 3 1 9* 24 6 5 Ropnie podskórne 45 7* 3 0 9* 20 3 3 Zapalenie pępka 3 2 0 0 1 0 0 0 Wrzodziejące zapalenie jamy ustnej zaobserwowano u 7 (78%) chorych, a przewlekłe zapalenie dziąseł u wszystkich dzieci powyŜej 12 miesiąca Ŝycia. Zapalenie ucha środkowego i gardła występowały u wszystkich dzieci z GSDIb, częste anginy u dwojga. Nawracająca biegunka, ostra lub przewlekająca się, stanowiła problem 6 (66%) chorych, a zakaŜenie układu moczowego 3 (33%) z nich. Jeden chory rozwinął IBD, potwierdzone badaniem kolonoskopowym, a dwaj bracia – zwęŜenie przełyku, uwaŜane takŜe za manifestację IBD w GSDIb. W grupie 7 chorych z rozpoznanym pierwotnym niedoborem odporności (PID) pierwsze zakaŜenia, sugerujące istnienie deficytu odporności, zaobserwowano w wieku od 2 do 123 miesiąca Ŝycia (średnia - 39 miesięcy, mediana -12 miesięcy). Najpóźniej, bo w 10 roku Ŝycia, objawy kliniczne wystąpiły u chłopca z CVID. Chorzy ci wymagali szerokiej 68 diagnostyki róŜnicowej, takŜe genetycznej, zanim postawiono właściwe rozpoznanie, stąd wiek w chwili ustalenia ostatecznej diagnozy wahał się między 12 a 172 miesiącem Ŝycia (średnia 70, a mediana 60 miesięcy). Tabela 10 Nieprawidłowości stwierdzone w badaniu przedmiotowym u 97 dzieci z PN * oznaczono odchylenia w badaniu, które wystąpiły u 100% dzieci w danej grupie Objaw AIN AIN susp SCN CyN SDS GSDIb PID FBN +CIN Łącznie Liczebność grupy 21 34 7 5 3 9 7 11 97 Niedobór masy ciała 1 1 3 - 3* 2 2 3 15 Niskorosłość 1 - 3 - 3* 2 - - 9 Nadwaga - 1 1 - - 3 2 4 11 Zapalenie dziąseł 9 16 6 5* 2 9* 3 8 58 Hepatomegalia - 1 1 - 2 9* 2 - 15 Splenomegalia - 2 2 - - 3 2 - 9 Blizny po ropniach 6 5 7* 2 - 9* 1 2 32 Limfadenopatia 2 6 4 1 - 5 3 2 23 Dyzmorfia - - 1 - - - - - 1 Małogłowie - - 1 - - - - - 1 Twarz „lalki” - - - - 2 4 - - 6 AZS 3 6 - 3 2 - - - 14 - - - - - - 2 WHIM - 2 2 4 5 5* 1 6 2 3 28 Brodawki skórne Przerośnięte migdałki Zaburzenia rozwoju somatycznego, pod postacią niedoboru masy ciała, odnotowano u 2 (28%) pacjentów (tabela 10 i wykres 2). U dziewczynki z WHIM rozpoznano równieŜ wrodzoną wadę serca (ASDII) oraz refluks Ŝołądkowo- przełykowy; jeden chory miał nawracające biegunki w przebiegu niedoboru ligandu CD40, między innymi o etiologii Cryptosporidium sp.. 69 Większość, bo aŜ 6 (86%), dzieci z PID przebyła cięŜkie zakaŜenia (tabela 8). Zapalenia płuc odnotowano u wszystkich chorych z wyjątkiem chłopca z CVID, natomiast posocznica o etiologii gronkowcowej, jako powikłanie ospy wietrznej, wystąpiła u dziewczynki z rodzinnym zespołem WHIM (u ojca dziewczynki diagnozę ustalono pośmiertnie, na podstawie dostarczonych preparatów szpiku i dokumentacji medycznej). Inna chora z tym samym rozpoznaniem, wskutek nawracających zakaŜeń dolnych dróg oddechowych, rozwinęła rozstrzenia oskrzeli przed rozpoczęciem substytucyjnego leczenia doŜylnymi preparatami immunoglobulin. Manifestację kliniczną cięŜkiej neutropenii w obrębie jamy ustnej zaobserwowano u 5 (71%) chorych. Troje dzieci - dwoje z WHIM i chłopiec z CD40Ldef- prezentowało nawracające, wrzodziejące zapalenia jamy ustnej. TakŜe troje miało przewlekłe zapalenie dziąseł- dwaj chłopcy z ALPS i niedoborem ligandu CD40 oraz dziewczynka z cięŜką neutropenią w przebiegu WHIM. Wykres 2 Odchylenia stwierdzone w badaniu przedmiotowym 97 chorych z PN Nieprawidłowości w badaniu przedmiotowym u 97 dzieci z PN Liczebność grupy 70 60 50 40 30 20 10 Tw ar za z „la pa lk le i” ni e B s kó ro da ry w ki sk ór ne A to po w e H ep at om eg S al pl ia en B o m liz eg ny al po ia ro pn Li ia m ch fa de no pa tia D ys m or fia N ad w ag a 0 Zapalenie węzłów chłonnych, odnotowane u obu chłopców z ALPS i niedoborem ligandu CD40 (tabela 9). ZakaŜenie wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV) w postaci licznych, nawracających brodawek pospolitych, zlokalizowanych na skórze kończyn lub głowy, wystąpiło u 2 chorych z WHIM juŜ w 6 i 7 roku Ŝycia (tabela 10). Nawracające zakaŜenia HSV, manifestujące się jako długo gojąca się opryszczka warg i śluzówek nosa, odnotowano u 3 z 4 chorych z 70 WHIM.Ropnie podskórne wystąpiły u 3 (43%) dzieci, a zapalenie ucha środkowego u 6 (86%). ZakaŜenia górnych dróg oddechowych odnotowano u wszystkich pacjentów z PID, najczęściej było to zapalenie gardła (100%), rzadziej angina (28%) lub pansinusitis – u chorej z WHIM (tabela 9). Chłopiec z CVID przebył takŜe zapalenie najądrza i zespół nerczycowy. Ostatnią grupę utworzyło 6 chorych z przewlekłą idiopatyczną neutropenią oraz 5 z rodzinną łagodną neutropenią . Większość dzieci naleŜących do tej grupy zaczęła chorować z chwilą pójścia do przedszkola lub szkoły, zaledwie dwoje w niemowlęctwie i kolejna dwójka w drugim roku Ŝycia. ZakaŜenia miały zwykle lekki przebieg (tabela 8 i 9), więc dzieciom nie wykonywano badań laboratoryjnych. TakŜe w tej grupie wiek w chwili ustalenia rozpoznania znacząco odbiegał od momentu wystąpienia zakaŜeń i zapalenia dziąseł, sugerujących istnienie neutropenii. Przewlekłą neutropenię u tych chorych stwierdzano pomiędzy 10 a 192 miesiącem Ŝycia, średnia wynosiła - 111 miesięcy, a mediana- 116. śaden z omawianych pacjentów, w okresie obserwacji w IP-CZD, nie uzyskał normalizacji liczby granulocytów obojętnochłonnych. TakŜe w tej grupie, jedynie u nielicznych chorych, występowały zaburzenia rozwoju somatycznego. Masę ciała poniŜej 10 percentyla odnotowano u 3 dziewczynek, a powyŜej 90 percentyla u 3 nastolatków (tabela 10). CięŜkie zakaŜenia, wymagające leczenia w warunkach szpitalnych, wystąpiły u 5 (30%) chorych; w pięciu przypadkach były to zapalenia płuc, a w jednym- posocznica gronkowcowa wikłająca ospę wietrzną u chorej z CIN (tabela 8). Nawracające wrzodziejące zapalenie jamy ustnej odnotowano u 5 z 6 chorych z CIN i zaledwie jednej dziewczynki z FBN. Przewlekłe zapalenie dziąseł obserwowano u wszystkich pacjentów z CIN oraz 2 z FBN, przy czym miało ono cięŜszy przebieg - z postępującym uszkodzeniem brodawek międzyzębowych - u chorych z CIN. Ropnie podskórne o etiologii Staphylococcus aureus (MSSA) stanowiły problem wyłącznie 3 pacjentów z CIN. Jedna chora z tej grupy miała nawracające ropnie pach, pośladków i warg sromowych, a u chłopca wystąpił ropień okołoodbytniczy i czyraczność pośladków. Wszystkie dzieci chorowały na zakaŜenia górnych dróg oddechowych, przynajmniej jedno zapalenie gardła przebył kaŜdy chory z tej grupy, nawracające anginy obserwowano u 5 chorych, w tym u 4 z FBN; zapalenie ucha środkowego przebyło 4 dzieci z CIN i jedno z FBN, natomiast zapalenie oskrzeli odnotowano u 2 chorych. ZakaŜenie układu moczowego wystąpiło u 2 dziewcząt z CIN (tabela 9). 71 Występowanie zakaŜeń cięŜkich i innych niŜ cięŜkie oraz odchyleń w badaniu przedmiotowym, jakie stwierdzono w omówionej powyŜej grupie 97 chorych, podsumowano w tabelach 8, 9 i 10, a takŜe na wykresie 2. IV.2 • Charakterystyka hematologiczna dzieci z PN Obraz krwi obwodowej W obrazie krwi obwodowej chorych z przewlekłą neutropenią obserwowano róŜne odchylenia od stanu prawidłowego. NaleŜą do nich monocytoza, eozynofilia, leukopenia, niedokrwistość, małopłytkowość lub nadpłytkowość (tabela 11). Tabela 11 Zaburzenia hematologiczne w grupie 97 chorych z PN * oznaczono odchylenia, które wystąpiły u 100% dzieci w danej grupie Rodzaj zaburzenia AIN AIN susp SCN CyN SDS GSDIb PID FBN +CIN Łącznie % Monocytoza 20 27 7* 5* 1 8 5 6 78 80 Eozynofilia 6 5 5 2 0 0 1 2 21 22 Leukopenia 5 6 2 0 0 9* 5 10 25 26 Małopłytkowość przewlekła - - 1 - 1 - 1 - 3 3 Nadpłytkowość 3 3 - 1 - 3 - - 10 10 W badanej grupie monocytoza wystąpiła u (wykres 3 i 6, tabela 11): - 20 z 21 (95%) chorych z AIN - 27 spośród 34 (79%) dzieci z prawdopodobną AIN - 13 z 15 (87%) pacjentów z wrodzoną neutropenią (CN) - 8 z 9 (89%) chorych z GSDIb - 5 z 6 (83%) dzieci z CIN oraz 1 z FBN - 5 spośród 7 (71%) pacjentów z rozpoznaniem PID Łącznie odnotowano ją u 78 (80%) spośród 97 badanych . Wszyscy chorzy mieli odsetek monocytów większy od 10. Porównując minimalne oraz maksymalne wartości odsetka monocytów, a takŜe średnią arytmetyczną monocytozy obliczoną dla poszczególnych pacjentów na podstawie dostępnych, przynajmniej 3, wyników badań stwierdzono, Ŝe najwyŜsze wartości występowały u dzieci z SCN (15-56%, średnia 39%), nieco niŜsze odsetki 72 monocytów osiągały w okresie spadku ANC dzieci z CyN (12-45%, średnia 32%). Monocytozę zaobserwowano równieŜ u 8 z 9 pacjentów z GSDIb (13-37%, średnia 19%), 5 chorych z CIN (16-61%, średnia 21%), 95% dzieci z AIN (12-33%, średnia 15%) oraz 27 chorych z prawdopodobną AIN (10-37%, średnia 17%). Monocytoza 100 90 80 70 60 50 Monocytoza 40 30 20 10 0 AIN AIN susp SCN CyN SDS GSDIb PID FBN +CIN Wykres 3 Występowanie monocytozy we krwi obwodowej 97 dzieci z PN Eozynofilię stwierdzano rzadziej niŜ monocytozę, bo zaledwie u 21 (22%) badanych dzieci: - u 6 (28%) chorych z AIN, przy czym 2 z nich miało takŜe atopowe zapalenie skóry - u 5 (15%) dzieci z prawdopodobną AIN, wśród nich 2 prezentowało objawy atopowego zapalenia skóry - 7 z 15 dzieci z SCN, w tym u 2 dziewczynek z CyN i atopowym zapaleniem skóry - u 1 dziecka z PID, 1 z CIN i 1 z FBN, chorującego na astmę atopową - u Ŝadnego chorego z GSDIb Częstość występowania eozynofilii we krwi obwodowej dzieci z PN podsumowano na wykresie 4 i 6 oraz w tabeli 11. 73 Wykres 4 Częstość występowania eozynofilii we krwi obwodowej 97 dzieci z PN Leukopenia wystąpiła u 25 (26%) dzieci w grupie badanej. Stwierdzono ją u następujących chorych (wykres 5 i 6, tabela 11): - 5 z 21 (23%) z AIN - 6 spośród 34 (17%) z podejrzeniem AIN - 10 z 11 (90%) z grupy CIN + FBN - wszystkich z GSDIb - 2 z SCN - 5 spośród 7 (71%) z PID 74 Wykres 5 Częstość występowania leukopenii w grupie dzieci z PN Przewlekłą małopłytkowość odnotowano u 3 dzieci: po jednym z rozpoznaniem SDS, CVID i SCN. Z kolei przejściowa nadpłytkowość wystąpiła podczas zakaŜeń u 3 chorych z AIN, 3 z podejrzeniem AIN, 3 z GSDIb oraz u 1 dziewczynki z cykliczną neutropenią. Najczęstsze zaburzenia hematologiczne, jakie zaobserwowano w badanej grupie podsumowano na wykresie 6. 75 Wykres 6 Zaburzenia hematologiczne u 97 dzieci z PN Zmiana obrazu krwi obwodowej w odpowiedzi na zakaŜenie W grupie 75 chorych objętych badaniem prospektywnym od większości uzyskano wyniki badania morfologii krwi obwodowej wraz z rozmazem, pobranej zarówno w okresie wolnym od objawów zakaŜenia, jak i w trakcie infekcji z towarzyszącą gorączką i podwyŜszonym CRP. Chorzy z SCN nawet podczas zakaŜeń nie osiągali wartości ANC przekraczających 600/µl. Z kolei pacjenci z CyN uwalniali ze szpiku odpowiednie ilości granulocytów obojętnochłonnych, niezbędne do zwalczenia infekcji, dopiero po upływie, trwającego 3 do 6 dni, okresu agranulocytozy- typowego dla tej jednostki chorobowej. Natomiast chorzy z AIN, prawdopodobną AIN, WHIM oraz CIN w odpowiedzi na zakaŜenie prezentowali wzrost ANC od 500 do1000/µl, co zapewne wpłynęło na bardziej łagodny obraz zakaŜeń, jaki zaobserwowano w tej grupie. W przypadku chorych z GSDIb, SDS, CD40Ldef oraz FBN wzrost ANC podczas zakaŜeń był mierny – mieścił się w przedziale od 200 do 600/µl. 76 • Mielogram Pobrania szpiku i oceny jego rozmazu dokonano u 89 chorych. Oceniano cytozę, czyli komórkowość szpiku, która przedstawiała się następująco (tabela 12): - szpik wybitnie bogatokomórkowy stwierdzono u 5 dzieci (2 z AIN,1 z prawdopodobną AIN i 2 z WHIM) - szpik bogatokomórkowy odnotowano u 74 chorych - szpik średniobogatokomórkowy opisano u 7 pacjentów (3 z AIN, 1 z prawdopodobną AIN i 3 z SCN) - szpik średnioubogokomórkowy stwierdzono u 2 chorych z CIN, a ubogokomórkowy u 1 dziecka z podejrzeniem SDS Tabela 12 Komórkowość szpiku w grupie 89 chorych z PN. Cytoza AIN AIN susp SCN CyN SDS GSDIb Wybitnie bogatokomórkowy 2 1 0 0 0 0 Bogatokomórkowy 14 30 4 5 2 7 5 7 3 1 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 2 Średnio bogatokomórkowy Średnio ubogokomórkowy lub ubogokomórkowy PID FBN CIN 2 0 (WHIM) Ocena układu granulocytarnego w mielogramie wykazała (tabela 13): - prawidłowy odsetek wszystkich postaci naleŜących do linii granulocytarnej u 16 dzieci - przesunięcie w lewo do granulocyta pałeczkowatego u 54 chorych - przesunięcie w lewo do metamielocyta u 8 badanych (7 z SCN i 1 dziewczynki z CyN) - wysoki „blok dojrzewania”- na etapie mielocyta u 7 pacjentów (6 z SCN i 1 z CD40Ldef) - hipoplazję linii granulocytarnej u 4 dzieci (po 1 z CIN, SDS, SCN i prawdopodoną AIN) - przesunięcie w prawo odnotowano u 2 chorych z WHIM 77 Tabela 13 Szereg granulocytarny w mielogramie w grupie 89 chorych z PN. Szereg granulocytarny AIN AIN susp SCN CyN SDS GSDIb PID FBN +CIN Prawidłowy 5 2 - 1 - 1 2 5 13 27 - 4 1 5 2 2 1 2 - 1 1 - - 1 Wysoki blok dojrzewania - na mielocycie - - 7 - - - CD40L def - Hipoplastyczny - 1 1 - 1 - - 1 Przesunięcie w prawo - - - - - - 2 - Przesunięcie w lewo do pałeczki Przesunięcie w lewo do metamielocyta 1 WHIM Eozynofilię (rzędu 6,2 - 22,5%) stwierdzono u 6 spośród 7 chorych z SCN oraz u 4 z 5 dzieci z CyN, przy czym opis 1 mielogramu, spoza IP-CZD, nie zawierał informacji dotyczących granulocytów kwasochłonnych. Monocytoza (6,4 - 14,8%) wystąpiła w mielogramie 5 dzieci z SCN, a takŜe 3 z CyN. Biopsji szpiku nie wykonano u 8 dzieci, z wymienionych poniŜej powodów: - 2 z AIN (bez cięŜkich zakaŜeń w wywiadzie, po uzyskaniu pozytywnego wyniku badania przeciwciał przeciwgranulocytarnych) - 2 z prawdopodbną AIN (bez cięŜkich zakaŜeń w wywiadzie, brak zgody rodziców na BMA) - 2 chorych z GSDIb (brak zgody rodziców na biopsję szpiku) - 2 dziewcząt z FBN (bez cięŜkich zakaŜeń w wywiadzie, bez innych zaburzeń hematologicznych, brak zgody pacjentek na wykonanie BMA). • Cytometryczne badanie szpiku Cytometrycznej oceny szpiku dokonano u 17 dzieci. W grupie tej znalazło się 6 chorych z AIN, 3 z GSDIb, 2 z WHIM, 2 z SDS, 2 CyN, nastolatka z SCN oraz chłopiec z SCN, którego szpik zbadano dwukrotnie - przed włączeniem i w trakcie leczenia Neupogenem. Dane chorych, których szpik poddano w IP-CZD ocenie przy pomocy cytometrii przepływowej znajdują się w tabeli 14. Z uwagi na ograniczoną ilość miejsca pominięto w niej szczegółowe dane dotyczące układu erytrocytarnego, a takŜe obecnych w szpiku, lecz nie dojrzewających w jego obrębie, limfocytów T i komórek NK. W 2 próbkach odnotowano wyraźnie podwyŜszony odsetek limfocytów CD19 o fenotypie komórek dojrzałych, natomiast 78 w jednej wysoki odsetek dojrzałych erytrocytów, co moŜe świadczyć o domieszce krwi obwodowej. Przeprowadzone badania cytometryczne szpiku wykazały: - prawidłową komórkowość u 11 chorych - szpik średnioubogokomórkowy u chłopca z SDS - obniŜony odsetek komórek szeregu granulocytarnego u dwojga chorych z SCN oraz u chorej z CyN, której biopsję szpiku wykonano podczas agranulocytozy we krwi obwodowej - tzw. wysoki blok dojrzewania, na etapie mielocyta, u obojga chorych z SCN - obniŜony odsetek granulocytów o jądrze segmentowanym u 9 dzieci (5 z AIN, 2 z SCN, po jednym z SDS i CyN- w okresie agranulocytozy) - podwyŜszony odsetek dojrzałych granulocytów u 2 chorych z podejrzeniem WHIM oraz u jednego z prawdopodobną AIN - podwyŜszony odsetek metamielocytów i granulocytów o jądrze pałeczkowatym, czyli tzw. przesuniecie w lewo do metamielocyta, u 5 dzieci z AIN, 3 z GSDIb, 1 z CyN oraz u 1 chorej z WHIM - podwyŜszony (w stosunku do normy dla wieku) odsetek mielocytów u 1 dziewczynki z WHIM - zwiększony odsetek linii monocytarnej u 12 z 17 zbadanych dzieci: 4 z AIN oraz po 2 z SCN, CyN, GSDIb i SDS; przy czym u chłopca z SCN i dziewczynki z CyN, formy rozwojowe układu monocytarnego stanowiły około 32% komórek szpiku, z czego od 17,5 do blisko 21% miało postać dojrzałych monocytów Rozład komórek prekursorowych limfocytów B był prawidłowy w przypadku 14 badanych, u pozostałych 3 chorych stwierdzono: - zahamowanie dojrzewania na etapie limfocyta pro-B (u niemowlęcia z WHIM) - znacznie obniŜony odsetek limfocytów B z zahamowaniem dojrzewania na etapie pre-B-II zaobserwowano u pacjentki z WHIM (jednocześnie wysoki odsetek limfocytów T i dojrzałych limfocytów B sugerował obecność domieszki krwi obwodowej) - znacznie podwyŜszone odsetki limfocytów pro-B i pre-B-I, z jednoczesnym obniŜeniem liczby pozostałych stadiów rozwojowych limfocytów B (u niemowlęcia z prawdopodobną AIN) - podwyŜszony stosunek limfocytów T CD4:CD8 u 4 chorych z AIN i chorej z WHIM 79 0,5 1,2 0,6 0,8 0,3 1,1 1,0 1,2 0,8 0,4 0,8 0,6 1,5 0,3 1,0 0,6 1,2 1,3 0,8 2,5 1,5 1,8 3,7 3,4 1,5 2,1 0,7 1,6 1,4 1,1 1,4 0,3 1,5 0,5 3,2 2,9 7,7 39,2 18,7 16,9 6,4 54,7 10,1 37,8 18,0 27,5 20,9 31,5 15,3 22,2 9,0 3,0 3,1 1,3 0,3 13,5 43,9 4,9 23,3 5,4 19,3 19,5 2,9 6,3 27,1 14,9 7,0 1,5 48,8 4,3 0,5 0,1 10,3 18,2 7,9 25,4 1,5 22,8 7,8 4,5 11,8 10,2 2,6 1,8 2,1 9,3 5,7 1,5 1,1 0,3 13,5 1,5 1,1 6,9 slgM+slgD+/CD19+ CD117+CD34- 8,6 35,0 10,1 12,9 10,8 11,4 26,4 7,0 77,4 10,5 6,9 15,5 45,2 5,9 10,1 15,3 11,0 14,4 slgM+slgD-/CD19+ CD34+CD117+ 30,2 2,0 11,5 26,1 25,4 13,1 23,2 43,8 9,2 9,9 25,2 29,1 28,8 12,6 6,0 46,4 40,9 31,0 clgM+slgM-/CD19+ CD71+CD45- 11,5 0,8 7,3 6,1 2,5 8,4 7,8 32,0 5,0 10,9 31,8 8,1 12,7 38,6 10,6 30,8 14,2 10,2 CD19-CD22+ TdT+CD34+CD10/CD19+ CD45++SSC low 49,7 62,1 71,1 55,0 61,3 67,1 42,7 17,1 8,3 68,7 36,1 47,3 13,3 42,9 73,2 7,5 34,0 44,3 CD36+CD14+ CD45+intCD13.33+ 53,0 dr.sk. 184,0 dr.sk. dr.sk. 35,8 43,4 dr.sk. dr.sk. 70,0 43,0 21,8 21,8 dr.sk. dr.sk. 5,5 16,0 33,0 CD36+CD14- CD45+highCD13.33+ + + + + - CD117+34+13.33+ Cytoza x 1000/mm O. B. W. B. E. G. E. H. W. K. S. K. Ł. K. R. K. R. K. P. L. K. Ł. A. M. E. N. K. S. T. S. D. W. H. W. L. W. Rozpoznanie Inicjały CD16-CD11b+ CD16+CD11b+CD64 + CD16+CD11b+CD64 CD16++CD13++CD1 1b+ Neupogen AIN 1,64 WHIM 0,44 AIN 1,54 AIN 1,12 WHIM 14,96 GSDIb 1,80 AIN 1,75 SCN 4,82 SCN 6,04 GSDIb 4,42 CyN 9,39 AIN 0,34 CyN 7,91 GSDIb 3,73 AIN 0,22 SCN 17,28 SDS 3,52 SDS 0,42 3 Wiek w chwili badania Tabela 14 Badanie szpiku przy pomocy cytometrii przepływowej u 17 chorych z przewlekłą neutropenią. 0,4 1,1 10,0 9,4 6,1 35,1 20,4 29,1 0,3 0,0 0,5 94,4 2,2 1,6 0,9 0,9 0,2 2,7 4,4 21,7 9,2 37,1 18,2 13,7 1,4 3,3 1,3 19,3 9,2 36,3 25,0 10,1 0,3 0,5 1,8 18,8 12,6 21,1 4,3 43,1 2,0 4,0 2,4 15,1 8,6 34,1 15,9 26,2 1,0 8,0 7,0 17,9 10,4 30,7 20,7 20,3 5,7 8,7 17,5 8,6 4,6 24,6 1,9 60,3 0,0 1,5 3,5 5,7 9,6 45,2 13,4 17,1 0,1 10,2 0,5 24,7 15,4 0,0 30,7 29,2 0,2 10,8 20,7 22,1 6,3 26,0 12,5 33,2 0,0 5,7 2,4 8,6 10,0 39,3 19,7 22,4 0,3 8,0 4,4 13,6 10,0 29,3 19,9 27,2 0,2 28,7 9,8 10,7 7,4 38,0 12,3 31,1 0,1 6,6 3,8 43,0 24,8 20,0 4,1 8,2 0,1 7,0 23,6 19,5 3,4 29,0 6,1 42,0 0,7 5,8 7,7 15,3 8,6 27,7 13,7 34,8 0,1 8,2 2,0 12,9 12,3 40,1 20,9 13,8 CD45+SSChigh - linia granulocytarna,błękitna;CD45++SSCint - linia monocytarna, pomarańczowa; CD45++SSClow - linia limfoidalna, Ŝółta; CD71+CD45linia erytroidalna,niebieska;CD34+CD117+ mieloblast,CD117+CD34- promielocyt,CD16-CD11b+ mielocyt,CD16+CD11b+CD64+ metamielocyt, CD16+CD11b+CD64-pałka,CD16++CD13++CD11b+ segment,CD117+34+13.33+monoblast,CD36+CD14-promonocyt,CD36+CD14+monocyt, Przedział komórek prekursorowych limfocytów B(Ŝółte): CD19-CD22+ Pro-B,TdT+CD34+CD10-/CD19+ Pre-B-I,clgM+slgM-/CD19+ Pre-B-II, slgM+slgD-/CD19+ niedojrzałe B, slgM+slgD+/CD19+ dojrzałe limfocyty B; dr.sk. – drobne skrzepy w próbce szpiku 80 • Cytogenetyczne badanie szpiku Cytogenetyczną ocenę szpiku przeprowadzono u 25 chorych. We wszystkich przypadkach uzyskano prawidłowy kariogram. Badanie wykonane zostało u 3 chorych z SCN, 3 z CyN, 3 z GSDIb, 1 z WHIM w ramach postępowania diagnostycznego, przygotowania do włączenia leczenia przy pomocy rHuG-CSF oraz w trakcie leczenia tą cytokiną. Zbadano takŜe 2 dzieci z CIN, 3 z SDS, 5 z AIN, 1 z podejrzeniem AIN i 1 z CVID. Sześciu chorych miało badanie powtarzane z uwagi na leczenie Neupogenem. IV.3 Ocena badań przeciwciał przeciwgranulocytarnych Testy oceniające obecność w surowicy przeciwciał przeciwgranulocytarnych (AGAbs) wykonano u 65 chorych. Badania przeprowadzano u dzieci z podejrzeniem AIN, ALPS, CVID. Przeciwciała te wykryto u 21 dzieci z klinicznym podejrzeniem AIN, a takŜe u chłopca z CVID w 13 roku Ŝycia. Pozostałym chorym, u których wykonano badania nie wykrywając AGAb, ustalono następujące rozpoznania: 34- prawdopodobna AIN, 5 - SCN, 4 – CIN, 1 – FBN. W poszukiwaniu AGAbs u większości chorych wykonywano 3 testy diagnostyczne: MAIGA, GIFT, GAT. Do 1998 roku w Instytucie Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie wykonywano jedynie test immunofluorescencyjny. Pozytywny wynik GIFT pozwolił ustalić rozpoznanie neutropenii autoimmunizacyjnej u 15 dzieci. Test aglutynacji – GAT wykazał obecność AGAbs u 9 dzieci, przy czym u 3 z nich był jedynym testem diagnostycznym, który wypadł pozytywnie. Natomiast MAIGA, przyniósł pozytywny rezultat u 6 chorych, w tym u 2 jako jedyny wykazał obecność AGAb.Czworo dzieci uzyskało potwierdzenie obecności AGAbs we wszystkich 3 testach diagnostycznych. U jednej chorej, w teście ELISA, wykryto przeciwciała anty-HLA nie wiąŜące dopełniacza, które stały się przyczyną trwającej około 10 miesięcy neutropenii. We krwi chłopca z CVID znajdowały się przeciwciała anty-HNA-1, co wykazano w teście GIFT. Precyzyjne dane dotyczące testów diagnostycznych wykonanych u chorych z podejrzeniem autoimmunizacyjnej neutropenii zawarto w tabeli 15 . 81 Tabela 15 Przeciwciała przeciwgranulocytarne u dzieci z AIN Inicjały ANC WB 150 OD 100 EG 150 MH 500 WJ 300 AK 100 KKol 100 KKon 300 MM 400 AM 300 SN 40 DP 300 OP 500 PP 300 PS 550 HS 300 MS 600 WT Nb MK 400 TP-B 0 FM 200 swoistość AGAb Nb anty-HNA1a antyHNA1 anty-HNA1 anty-HNA1 anty-HNA1a/1b anty-HNA1a Nb antyHLA Nb anty-HNA1a anty-HNA1b Nb Nb Nb Nb Nb Nb anty-HNA1a Nb anty-HNA1 MAIGA GIFT + + + + + + + + + + + + GAT + + + + + + + + + + + + + + + + + + wiek oznaczenia [m-ce] 13 9 14 20 28 9 10 14 ELISA 14 4 13 14 7 19 50 29 2 12 24 6 10 Inne testy wiek [m-ce] normalizacji ANC nadal nieznany nadal 62 nadal 30 20 27 20 nadal 22 nadal 11 nadal 56 nadal 19 8 rŜ nadal 18 36 Legenda: Nb – nie badano IV.4 • Ocena badań immunologicznych StęŜenie klas głównych immunoglobulin StęŜenie klas głównych immunoglobulin IgG, IgA oraz IgM w surowicy zbadano u 93 dzieci, uzyskując następujące wyniki (tabela 16): - stęŜenie 3 klas głównych immunoglobulin w normie dla wieku miało 50 chorych - obniŜone stęŜenie 1, 2 lub 3 klas głównych immunoglobulin odnotowano u 8 pacjentów, przy czym u chłopca z niedoborem CD40L wystąpiła typowa hipogammaglobulinemia IgG i IgA, z jednoczesnym podwyŜszonym stęŜeniem IgM - hipergammaglobulinemię w zakresie 1, 2 lub 3 klas głównych immunoglobulin stwierdzono u 26 pacjentów (stęŜenie immunoglobulin nieznacznie powyŜej 2 SD dla wieku) - znacznego stopnia hipergammaglobulinemię dotyczącą klas IgG, IgA oraz IgM (stęŜenia wyraźnie powyŜej 2 SD w stosunku do normy dla wieku) zaobserwowano u 4 dzieci z SCN oraz 3 z GSDIb. 82 Tabela 16 StęŜenie klas głównych immunoglobulin w surowicy 93 chorych z PN StęŜenie Ig AIN AIN susp SCN CyN SDS GSDIb PID W normie dla wieku 12 23 0 2 1 2 2 8 50 ↑ IgG 2 3 1 niemowlę 0 0 0 0 0 6 ↑ IgA 2 1 0 1 0 0 0 0 4 ↑ IgG i IgA/IgM 3 3 2 2 0 3 1 ALPS 1 15 ↑ IgG,A,M 1 1 0 0 0 0 0 1 3 ↑↑ IgG,A.M 0 0 4 0 0 3 0 0 7 ↓ IgG i IgA 0 0 0 0 0 0 2 CVID i WHIM 0 2 ↓ IgM i/lub IgA 1 0 0 0 2 0 0 1 4 ↓ IgG,A,M 0 0 0 0 0 0 1 WHIM 0 1 ↑ IgM oraz ↓↓ IgG i IgA 0 0 0 0 0 0 1 CD40L def 0 0 • FBN Łącznie +CIN Rozkład subpopulacji limfocytów krwi obwodowej Rozkład subpopulacji limfocytów krwi obwodowej oceniono u 58 dzieci.Badanie to zostało wykonane u 10 pacjentów z AIN oraz 24 z prawdopodobną AIN, a jedyną stwierdzoną nieprawidłowością był podwyŜszony stosunek limfocytów CD4/CD8, co zaobserwowano u 90% dzieci z AIN oraz 32% z prawdopodobną AIN. Cytometryczna ocena subpopulacji limfocytów we krwi obwodowej miała szczególne znaczenie w postępowaniu diagnostycznym u dzieci z grupy PID, gdyŜ w większości przypadków przyczyniła się do ustalenia właściwego rozpoznania. Limfopenię CD19 stwierdzono u 4 dzieci - 3 z podejrzeniem WHIM oraz u 1 chłopca z CVID. Wysoki, bo wynoszący aŜ 16,6%, odsetek tzw. podwójnie negatywnych limfocytów T (CD3+CD4-CD8TCRαβ) odnotowano u chłopca z ALPS typu I. Chory z niedoborem ligandu CD40 uzyskał prawidłowy wynik badania subpopulacji limfocytów i dopiero ocena ekspresji CD154 na aktywowanych limfocytach CD4+ pozwoliła ustalić właściwą diagnozę. Zbadano takŜe chorych z wrodzonymi postaciami PN- 5 (100%) dzieci z CyN, 3 (100%) z SDS oraz 4 spośród 7 z SCN miało prawidłowy rozkład subpopulacji limfocytów krwi obwodowej. Jeden z chłopców z SCN, poddany badaniu wielokrotnie podczas kilkuletniej 83 obserwacji, niezmiennie prezentował podwyŜszony odsetek limfocytów CD8+ z jednoczesnym obniŜeniem odsetka i wartości bezwzględnej limfocytów CD4+ i komórek NK. W grupie dzieci z GSDIb badanie to wykonano u 3 chorych, uzyskując wynik prawidłowy. Wśród pacjentów z CIN i FBN odnotowano 7 prawidłowych rezultatów, jeden chory z CIN miał podwyŜszony odsetek i liczbę bezwzględną limfocytów CD8+, natomiast drugi prezentował obniŜony odsetek limfocytów CD4+. • Aktywność oksydazy NADPH w granulocytach, czyli tzw. „wybuch tlenowy” Aktywność oksydazy NADPH w granulocytach, czyli tzw. „wybuch tlenowy”, badano wyłącznie u dzieci z GSDIb. Badanie wykonano u wszystkich 9 chorych z tym rozpoznaniem, stwierdzając wyraźnie (14- 86%) obniŜoną ekspresję oksydazy NADPH u 8 dzieci, a nieznacznie obniŜoną (91,5%) u 1 nastolatka. NiŜsze wartości dotyczyły dzieci poniŜej 7 roku Ŝycia. Po włączeniu leczenia Neupogenem badanie powtórzono u 4 pacjentów. Trzech chorych uzyskało normalizację „wybuchu tlenowego”, który podczas terapii G-CSF wynosił od 90 do 92%. Jedno dziecko, u którego zwiększaniu dawki Neupogenu towarzyszyła postępująca splenomegalia i małopłytkowość, uzyskało nieznaczny wzrost aktywności oksydazy NADPH - z 45% na 51%. IV.5 Wyniki badań obrazowych Ultrasonograficznej oceny narządów jamy brzusznej dokonano (w IP-CZD lub poza nim) u 90 chorych, często kilka razy, stwierdzając: - powiększenie wątroby u wszystkich 9 chorych z GSDIb (znacznego stopnia, stwierdzone takŜe badaniem fizykalnym), 2 z SDS, 3 z podejrzeniem AIN oraz u chłopca z ALPS - powiększenie śledziony u 3 dzieci z SCN, 4 z GSDIb, 2 z prawdopodobną AIN, a takŜe u chłopca z ALPS i nastolatka z CVID. Zdjęcie RTG klatki piersiowej wykazało nieprawidłowo poszerzone zakończenia Ŝeber u 1 chorego z SDS oraz wąską klatkę piersiową u drugiego z nich. Opóźnienie wieku kostnego odnotowano u wszystkich 3 pacjentów z SDS, a takŜe u 1 dziecka z SCN. Badanie echokardiograficzne wykonano u 14 chorych, stwierdzając wrodzoną wadę serca pod postacią ASDII u dziewczynki z WHIM oraz PFO u chłopca z GDSIb. IV.6 Propozycja algorytmu diagnostycznego dla dzieci z PN. Na podstawie uzyskanych wyników, a takŜe w oparciu o zalecenia SCNIR237 opracowano poniŜsze algorytmy diagnostycznych dla dzieci z przewlekłą neutropeni (rycina 3 i 4). 84 Rycina 5 Propozycja algorytmu diagnostycznego dla dzieci z przewlekłą neutropenią w oparciu o obecność/brak przeciwciał przeciwgranulocytarnych oraz mielogram. Rycina 6 Propozycja algorytmu diagnostycznego dla dzieci z neutropenią przewlekłą neutropenią w oparciu o obecność/brak zaburzeń rozwoju somatycznego. Znajdująca się na kolejnej stronie. 85 przewlekła neutropenia W pierwszej kolejności moŜemy wówczas wykonać testy wykrywające obecność AGAb w surowicy chorych, a dopiero nie znajdując ich, przeprowadzić biopsję aspiracyjną szpiku oraz inne badania, w celu wykluczenia/potwierdzenia chorób uwarunkowanych genetycznie, pierwotnych niedoborów odporności, zakaŜeń i chorób metabolicznych. Jeśli jednak dziecko przebyło cięŜkie zakaŜenia, słabo przybiera na niskorosłość prawidłowy wzrost i/lub i masa ciała albinizm, szmer nad sercem) wówczas naleŜymasy niezwłocznie niedobór ciała wykonać biopsję aspiracyjną szpiku. Brak wysokiego bloku dojrzewania szeregu wadze lub prezentuje istotne odchylenia w badaniu przedmiotowym (hepatomegalia, limfadenopatia, nieprawidłowości kostne, małogłowie, granulocytarnego, typowego dla SCN, ale widywanego takŜe w mielogramach pochodzących od chorych z niedoborem ligandu CD40 i zespołem Bartha, wiąŜe się z koniecznością poszerzenia diagnostyki róŜnicowej w kierunku SDS, GSDIb, SCID, ALPS. Jedynym schorzeniem chłopiec biegunka zakaŜenia występującym u dzieci, które oportunistyczne przebiega z patognomonicznym obrazem szpiku jest zespół WHIM. W mielogramach bez tychodchyleń chorych stwierdzić tłuszczowa kardiomiopatia hepatomegalia niezwykły w badaniach nawracające przewlekła rozstrzeniowa hipoglikemia zapach moczu moŜna retencję dojrzałych granulocytów, pałeczek oraz zmian degeneracyjnych w dojrzałych małopłytkowość biegunka jak równieŜ obecność dwujądrzastych zakaŜenia hipotonia twarz „lalki” zez nieprawidłowości granulocytach obojętnochłonnych, pod postacią hipersegmentacji jąder i obecności wodniczek. Wystąpienie u chorego z PN zakaŜeń kostne oportunistycznych sugeruje istnienie pierwotnego (SCID, CD40Ldef) lub wtórnego niedoboru odporności (AIDS). Dlatego niezwykle waŜne u chlorki wdzieci pocie- młodszych wydaje się wykonanie podstawowych badań immunologicznych. Nawet samo badanie stęŜenia klas głównych immunoglobulin norma badania 3-metylo nieprawidłowe ↑ triglicerydy nierzadko wnosi cenne informacje, ukierunkowujące dalsze postępowanie↑ diagnostyczne. Hipogammaglobulinemia sugerować moŜe immunologiczne glutakonik badanie ↑ tłuszczew w surowicy kale kwas mlekowy FBN lub CIN GC/MS moczu acyduria ↓ elastaza w ↑ kwas moczowy Z kolei hipergammaglobulinemia występuje u dzieci z ALPS, SCN, ↓ cholesterol kalerozpoznanie SCID, XLA, CD40Ldef, WHIM, SDS lub zespół Evansa. ↑ AT GSDIb, AIDS, chorobami zapalnymi tkanki łącznej. Zespół ShwachmanaDiamonda ↓↓ IgG,IgA,IgM nieprawidłowe subpopulacje limfocytów we krwi obwodowej chłopiec ↓↓ IgG i IgA ↑ lub prawidłowe IgM ↓ekspresja CD40L na limfocytach CD4+ (+) p/ciała antyHIV (+) HIV-PCR Zespół Bartha GSD I b AIN lub NAIN MMA IVA PA NEUTROPENIA SCID CD40Ldef AIDS • POLEKOWA • INFEKCYJNA 86 IV.7 Zastosowane metody leczenia, ich skuteczność oraz odnotowane powikłania. Metody leczenia chorych z PN dobierane były indywidualnie- zaleŜały od rozpoznanej jednostki chorobowej, cięŜkości przebiegu klinicznego, wieku dziecka. Stosowano profilaktykę przeciwbakteryjną, podawany podskórnie rekombinowany ludzki czynnik wzrostu kolonii granulocytarnych, przeszczepienie macierzystych komórek krwiotwórczych, doŜylne preparaty immunoglobulin oraz dodatkowe szczepienia ochronne. IV.7.A. Profilaktyka przeciwbakteryjna Profilaktykę przeciwbakteryjną zastosowano łącznie u 52 (54%) chorych, w tym u wszystkich niemowląt. Otrzymali ją następujący pacjenci: - 7 (100%) z SCN, 3 (60%) z CyN, 1 (33%) z SDS (w pierwszym roku Ŝycia) - 7 (78%) z GSDIb - 7 (100%) z PID - 8 (38%) z AIN, w tym u 5 w pierwszym roku Ŝycia - 15 (44%) z prawdopodobną AIN, w tym u 5 poniŜej 12 miesiąca Ŝycia. Najczęściej podawanym lekiem była amoxicillina; otrzymywało ją przewlekle 40 dzieci w dawce 20mg/kg/dobę. Rzadziej zalecanym profilaktycznie chemioterapeutykiem był trimetoprim/sulfametoksazol. Podawano go 16 pacjentom. Poza wymienionymi lekami, w charakterze profilaktyki przeciwbakteryjnej u pojedynczych chorych zastosowano: - amoxycylinę z kwasem klawulanowym - u niemowlęcia z SCN, nie odpowiadającego na terapię Neupogenem, po przebyciu posocznicy o etiologii Pseudomonas aeruginosa - ciprofloksacynę otrzymywał chory z CIN i nawracającymi ropniami okołoodbytniczymi o etiologii gronkowcowej. Zastosowanie profilaktyki przeciwbakteryjnej spowodowało zmniejszenie częstości (przynajmniej o 50%) i cięŜkości zakaŜeń u 40 dzieci, co stanowi 76% leczonych w ten sposób chorych. U pozostałych 12 dzieci, mimo przewlekłego podawania amoxicilliny lub TMP/SMX, obserwowano nawracające zapalenia płuc i/lub zapalenia ucha środkowego, zapalenie wyrostków sutkowatych oraz rozległe ropne zakaŜenia tkanki podskórnej. Profilaktyka przeciwbakteryjna okazała się niewystarczająco efektywna u wszystkich 7 dzieci z SCN, 2 z GSDIb, 2 z WHIM oraz 1 z CIN. Część tych chorych uzyskała zmniejszenie liczby zakaŜeń dopiero po włączeniu leczenia Neupogenem. Dwóch chłopców z SCN, po nieudanej próbie leczenia Neupogenem, rozwinęło cięŜkie powikłania bakteryjne, mimo przewlekłej podaŜy antybiotyku (w obu przypadkach – amoxicilliny). U pierwszego z 87 nich doszło do powstania ropni wątroby, natomiast drugi chłopiec zmarł wskutek uogólnionego zakaŜenia wywołanego przez Clostridium perfringens. Podsumowując, naleŜy stwierdzić, Ŝe profilaktyka przeciwbakteryjna spowodowała zmniejszenie częstości oraz cięŜkości zakaŜeń bakteryjnych u wszystkich dzieci z AIN i prawdopodobną AIN, 5 chorych z GSDIb, 5 z PID, 3 z CyN i 1 z SDS. Profilaktyka przeciwbakteryjna nie zmniejszyła częstości wrzodziejących zapaleń jamy ustnej; pozostała takŜe bez wpływu na przewlekły stan zapalny dziąseł. Profilaktykę przeciwgrzybiczną otrzymywało 6 dzieci z SCN. We wszystkich przypadkach stosowano ketokonazol. Leczenie to okazało się nieskuteczne u 5-latka z SCN, który nie uzyskał poprawy hematologicznej po próbie terapii Neupogenem. Chłopiec rozwinął inwazyjną aspergillozę, leczoną następnie z dobrym efektem itrakonazolem. Chory z niedoborem ligandu CD40, jako profilaktykę zakaŜenia grzybem Pneumocystis jiroveci, będącą jednocześnie postępowaniem zmniejszającym ryzyko zakaŜeń bakteryjnych, otrzymywał TMP/SMX, co uchroniło go przed pneumocystozą i zmniejszyło częstość oraz cięŜkość innych infekcji. IV.7.B. Przewlekłe leczenie czynnikiem wzrostu kolonii granulocytarnych (rHuG-CSF) Przewlekłe leczenie czynnikiem wzrostu kolonii granulocytarnych zastosowano u 17 (18%) dzieci. Ponadto 8 chorych, w tym 2 z AIN, otrzymywało lek wyłącznie doraźniepodczas cięŜkich zakaŜeń i przedłuŜonego gojenia głębokich owrzodzeń w jamie ustnej. Kolejnych 6 pacjentów leczono Neupogenem w innych ośrodkach, przez kilka miesięcy lub lat, zanim zostali objęci opieką immunologiczną w IP-CZD. Przewlekłą terapię Neupogenem wprowadzono u następujących chorych: - 9 z wrodzoną neutropenią (CN): 6 z SCN i 3 z CyN - 5 z GSDIb (w tym u chłopca z IBD) - 1 z podejrzeniem WHIM - 2 ze wstępnym rozpoznaniem neutropenii wrodzonej, zweryfikowanym później na prawdopodobną AIN, w związku z normalizacją ANC, łagodnym obrazem klinicznym oraz mielogramem typowym dla AIN Zadowalającą odpowiedź hematologiczną, w postaci wzrostu ANC powyŜej 1000/ul, uzyskało 15 chorych (tabela 17). Jedynie 2 chłopców z potwierdzoną genetycznie SCN, 88 poddanych następnie przeszczepieniu macierzystych komórek krwiotwórczych od dawcy niespokrewnionego, nie odpowiedziało na leczenie podskórnym rHuG-CSF. Skuteczna dawka rHuG-CSF mieściła się w zakresie od 1– 46 µg/kg (tabela 17). Większość dzieci początkowo otrzymywała lek codziennie, następnie u 10 z nich udało się podawać go co drugi dzień; jednemu chłopcu z CyN wystarczała podaŜ leku raz na 3 dni. Wielkość dawki, skutecznie podnoszącej liczbę granulocytów we krwi obwodowej, zaleŜała od przyczyny PN. NajwyŜsze dawki odnotowano wśród chorych z SCN (46 i 20 µg/kg), choć 2 chore z tym rozpoznaniem uzyskały poŜądany wzrost ANC po zastosowaniu dawki wynoszącej zaledwie 2 µg/kg. W terapii przewlekłej zdołano je obniŜyć do, odpowiednio: 42, 10 i 1 µg/kg. Chorym z CyN wystarczały dawki od 5 do 11,5 µg/kg (średnio 8,8 µg/kg), natomiast w terapii podtrzymującej od 4 do 6,5 µg/kg (średnio 5,2 µg/kg). Pacjenci z rozpoznaniem GSDIb wymagali zastosowania dawki Neupogenu od 3,4 do 10 µg/kg (średnio 7,4 µg/kg), a podczas leczenia przewlekłego od 3,2 do 11 µg/kg (średnio 6,1 µg/kg). Niemowlęciu z podejrzeniem WHIM włączono początkowo dawkę 10 µg/kg, lecz w związku z małopłytkowością zredukowano ją do 11,5 µg/kg co drugi dzień. Dwie chore, podejrzewane początkowo o SCN, uzyskały szybką normalizację ANC juŜ po dawce Neupogenu 1 i 2 µg/kg, podawaną następnie co drugi dzień. Po kilku miesiącach terapii cytokinowej chore te uzyskały trwałą poprawę hematologiczną, która pozwala podejrzewać inną etiologię PN, a mianowicie AIN. W grupie 15 chorych leczonych Neupogenem, którzy uzyskali poprawę hematologiczną, oceniono takŜe efekt kliniczny terapii, stwierdzając zmniejszenie przynajmniej o 50% częstości zakaŜeń bakteryjnych u 6 dzieci lub całkowite ich ustąpienie u pozostałych 9. NaleŜy podkreślić, Ŝe podczas leczenia rHuG-CSF, Ŝaden chory nie rozwinął cięŜkich zakaŜeń bakteryjnych lub grzybiczych. Częstość zakaŜeń miała związek z wartościami ANC, jakie osiągali chorzy podczas leczenia- nieliczni chorujący mieli ANC oscylujące między 800 a 1300/µl oraz leukopenię. Wśród nich znalazł się równieŜ chłopiec z GSDIb, który wskutek leczenia Neupogenem osiągnął jedynie niewielką poprawę w zakresie „wybuchu tlenowego” i miał przewlekłą leukopenię, mimo ANC około1000/ µl. 89 Tabela 17 Leczenie Neupogenem 17 dzieci z PN Legenda: ♀ płeć Ŝeńska, ♂ płeć męska , ~ około Inicjały Diagnoza Płeć chorego kliniczna Dawka, która skutecznie ↑ ANC ≥ 1000 Dawka podtrzymująca Działania niepoŜądane M. Ko. ♂ SCN 20 µg/kg 10 µg/kg co drugi dzień splenomegalia(+3cm) i małopłytkowość R. K. ♂ SCN 46 µg/kg 42 µg/kg J. C. ♀ SCN ~ 2 µg/kg 1 µg/kg (-) M. D. ♀ SCN ~ 2 µg/kg 1 µg/kg co drugi dzień (-) Ł. A. ♂ SCN brak odpowiedzi (-) splenomegalia(+2cm) M. Kr. ♂ SCN brak odpowiedzi (-) K. Ł. ♀ CyN 5 µg/kg (-) ~ 4 µg/kg co drugi dzień K. M. ♂ CyN 10 µg/kg ~ 6,5 µg/kg co trzeci dzień bóle kostne E. N. ♀ CyN 11,5 µg/kg ~ 5 µg/kg co drugi dzień (-) P. L. ♂ GSD Ib 3,75 µg/kg 5 µg/kg co drugi dzień splenomegalia(+4cm) i małopłytkowość K. S. ♂ GSD Ib ~10 µg/kg ~11 µg/kg splenomegalia (+2cm) bóle kostne S. K. ♂ GSD Ib 10 µg/kg ~ 6,6 µg/kg co drugi dzień (-) Ł. D. ♂ GSD Ib ~ 3,4 µg/kg ~ 3,2 µg/kg (-) M. D. ♂ GSD Ib 10 µg/kg ~ 5 µg/kg (-) W. B. ♀ WHIM 10 µg/kg małopłytkowość (ustąpiła po ↓ dawki) K. J. ♀ AIN susp 1 µg/kg M. S. ♀ AIN susp 2 µg/kg 11,5 µg/kg co drugi dzień 2 µg/kg co drugi dzień 1 µg/kg co drugi dzień początkowo bóle kostne bóle kostne (-) splenomegalia (+1cm) Terapia cytokinowa korzystnie wpłynęła równieŜ na stan przyzębia i śluzówek jamy ustnej u wszystkich leczonych. Wyraźną poprawę (brak zapalenia przyzębia lub zapalenie dziąsła brzeŜnego) uzyskało 10 chorych, a pozostałych 5 osiągnęło ją w stopniu zadowalającym (brak bólu i krwawienia z dziąseł podczas mycia zębów, zahamowanie dalszej destrukcji kości). U chorych z CyN ustąpiły, pojawiające się wcześniej regularnie co 3 90 tygodnie, wrzodziejące zapalenia jamy ustnej, zapalenia gardła, anginy i limfadenopatia szyjna, choć u całej trójki utrzymywał się stan zapalny dziąseł. • Działania niepoŜądane Neupogenu Większość dzieci poddanych leczeniu Neupogenem dobrze tolerowała zastosowaną terapię. Jedynym, zaobserwowanym przez nas, istotnym klinicznie- działaniem ubocznym leku, które spowodowało przerwanie leczenia, była cięŜka małopłytkowość, ze spadkiem liczby płytek do 10.000/mm3, jaką zaobserwowano u dwóch chłopców - z SCN i GSDIb. W przypadku pierwszego dziecka, spadek liczby płytek do 10.000/µl z objawową skazą krwotoczną (wzmoŜone siniaczenie, nawracające krwawienia z nosa i dziąseł) był przyczyną odstawienia Neupogenu, natomiast drugi chłopiec, chorujący na GSDIb powikłaną nieswoistym zapaleniem jelit, wymagał 2 miesięcznej przerwy w leczeniu, podczas której uzyskał znaczne zmniejszenie wielkości śledziony i normalizację liczby trombocytów, co umoŜliwiło powrót do terapii Neupogenem. Pozostałe objawy uboczne, jakie zaobserwowano u leczonych Neupogenem, a które mogły mieć związek z jego stosowaniem, były następujące: - bóle kostne odnotowano u 5 dzieci - powiększenie śledziony wystąpiło u 5 pacjentów, w tym u 2 (z GSDIb) znacznego stopnia - krwawienia z nosa zaobserwowano u 4 chłopców (2 z GSDIb i 2 z SCN) - łatwe siniaczenie zauwaŜono u 2 dzieci (z GSDIb) Wśród chorych z PN objętych badaniem znalazł się chłopiec z GSDIb, który przez 5 lat leczony był Neupogenem poza IP-CZD, lecz podjęto decyzję o odstawieniu leku w związku z nefropatią IgA, która wystąpiła u niego podczas terapii cytokinowej. U Ŝadnego z poddanych leczeniu Neupogenem pacjentów nie doszło do transformacji nowotworowej. W celu monitorowania leczenia, corocznie oceniano mielogram, badanie cytogenetyczne, a jeśli udało się pobrać wystarczająco duŜo materiału, wykonywano takŜe cytometryczne badanie szpiku, nie stwierdzając u Ŝadnego dziecka cech MDS, ani AML. Większość dzieci leczonych Neupogenem, objętych badaniem prospektywnym, miała wykonaną densytometrię kośćca. Densytometria wykazała obniŜenie gęstości kości u 6 pacjentów (4 z GSDIb, po 1 z SCN i WHIM). Wynik prawidłowy uzyskało 4 dzieci (3 z CyN, 1 z GSDIb). 91 W grupie dzieci poddanych przewlekłej terapii Neupogenem oceniono takŜe odchylenia w badaniach laboratoryjnych, stwierdzając poza omówioną powyŜej małopłytkowością: - niedokrwistość, która wystąpiła u 5 pacjentów z GSDIb, 1 z SCN i 1 z WHIM - przejściowy wzrost stęŜenia kwasu moczowego w surowicy, po pierwszych dawkach leku, zaobserwowano u 4 chorych, w tym u Ŝadnego z GSDIb - przejściowy wzrost aktywności dehydrogenazy mleczanowej w osoczu odnotowano u 3 chorych. Wszystkie dzieci, z wyjątkiem jednego chłopca z GSDIb, dobrze znosiły podskórną podaŜ leku; nie zaobserwowano niepoŜądanych odczynów w miejscu podania rHuG-CSF. IV.7.C. Procedura przeszczepienia macierzystych komórek krwiotwórczych (HSCT) Leczenie przy pomocy przeszczepienia macierzystych komórek krwiotwórczych zastosowano u dwóch chłopców z cięŜką wrodzoną neutropenią, u których nie uzyskano poprawy hematologicznej po próbie terapii Neupogenem, mimo zastosowania duzych dawek leku– sięgających 100 µg/kg. W obu przypadkach źródłem komórek macierzystych, wobec braku zgodnego- w zakresie antygenów zgodności tkankowej- dawcy rodzinnego, był dawca niespokrewniony. Pierwszy z chorych poddany został procedurze przeszczepowej w 5 roku Ŝycia, lecz zmarł 4 tygodnie później wskutek cięŜkiej (IV stopnia), ostrej choroby przeszczep przeciw gospodarzowi. Dzięki zachowanej próbce DNA chłopca, pośmiertnie przeprowadzono badania molekularne, które wykazały obecność mutacji w genie ELA2/ELANE. Badania genetyczne, przeprowadzone u niemowlęcia z klinicznym podejrzeniem SCN, wykazały istnienie mutacji tego samego genu. Dzieci zostały poddane MUD-HSCT w dwóch ośrodkach wrocławskich: Dolnośląskim Centrum Transplantacji Komórkowych oraz Klinice Transplantacji Szpiku, Onkologii i Hematologii Dziecięcej Akademii Medycznej. Zastosowano następujące schematy kondycjonowania: - Busulfan, Cyclofosfamid, ATG u starszego chłopca - Treosulfan, Fludarabina, Cyclofosfamid, ATG u niemowlęcia. Profilaktyka GvHD składała się z następujących leków immunosupresyjnych : 92 - ATG, CsA u 5-latka - ATG, CsA, MTX u chłopca 10-miesięcznego Pierwszy chłopiec zmarł, drugi (obecnie 10 miesięcy po MUD-HSCT) uzyskał pełną rekonstytucję układu odporności, mimo mieszanego chimeryzmu. Chory z niedoborem ligandu CD40 uzyskał właściwe rozpoznanie dopiero po 30 roku Ŝycia i w związku ze stosunkowo łagodnym przebiegiem klinicznym choroby, nie wyraził zgody na HSCT. IV.7.D. DoŜylne preparaty immunoglobulin (IVIG) IVIG zastosowano u dwojga pacjentów z powodu hipogammaglobulinemii, w ramach terapii substytucyjnej. Leczono tak chorego z niedoborem ligandu CD40 oraz u 6-miesięczną dziewczynkę z podejrzeniem zespołu WHIM. U obojga chorych leczenie to nie spowodowało ustąpienia neutropenii, w związku z czym dziewczynka leczona była takŜe Neupogenem, natomiast chłopiec otrzymywał profilaktykę w postaci TMP/SMX. IV.7.E. Glikokortykosteroidy (GKS) śaden pacjent włączony do grupy badanej, nie otrzymywał z powodu przewlekłej neutropenii preparatów GKS. IV.7.F. Dodatkowe szczepienia ochronne Poszerzenie kalendarza szczepień o szczepionki przeciwko tzw. bakteriom otoczkowym (Haemophilus influenzae typu B, pneumokokom, meningokokom typu C) zalecono 95 chorym z PN, niezaleŜnie od wieku. Wyjątek stanowiło 2 dzieci z hipogammaglobulinemią, otrzymujących doŜylne preparaty immunoglobulin. Zalecenie to zrealizowane zostało przez rodziców następujących pacjentów: 20 z AIN, 30 z prawdopodobną AIN, 8 z GSDIb, 11 z grupy CN, 8 z grupy FBN + CIN, 3 chorych z rozpoznaniem pierwotnego niedoboru odporności. Wybranym chorym z GSDIb, AIN, SDS, SCN i CIN, zalecano takŜe szczepienie przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu A. Szczepienie to otrzymało 6 dzieci z GSDIb, 10 z AIN i prawdopodobną AIN, 2 z SDS, 1 chory z SCN, 2 dziewczynki z CIN oraz po 1 z FBN i CyN. 93 Wykonane szczepienia nie były przyczyną niepoŜądanych odczynów poszczepiennych; zaledwie u 3 chorych wystąpił niewielki obrzęk w miejscu podania skoniugowanej szczepionki przeciw pneumokokom (Prevenar). IV.8 Propozycja algorytmu terapeutycznego dla dzieci z PN. Na rycinach 7, 8 i 9 przedstawiono, oparte na doświadczeniach Oddziału Immunologii IP-CZD oraz zaleceniach SCNIR, propozycje algorytmów terapeutycznych dla dzieci z wrodzonymi postaciami przewlekłej neutropenii, a mianowicie: SCN, GSDIb, CyN, WHIM, SDS, zespołem Bartha i niedoborem ligandu CD40. Sposób leczenia chorych z autoimmunizacyjną neutropenią podyktowany jest cięŜkością przebiegu klinicznego oraz wiekiem pacjenta. Dzieciom z AIN zalecano profilaktykę antybiotykową, jeśli nie ukończyły 12 miesiąca Ŝycia; powyŜej tego wieku znajdowała ona zastosowanie wyłącznie u pacjentów chorujących na nawracające zapalenia ucha środkowego lub zakaŜenia dolnych dróg oddechowych. CD40L def IVIG + TMP/SMX Bez cięŜkich zakaŜeń ZakaŜenia oportunistyczne Kontynuacja leczenia CięŜkie zakaŜenia bakteryjne RozwaŜyć HSCT Rycina 7 Propozycja algorytmu lecznicznego dla chorych z niedoborem ligandu CD40 94 SCN s.c. Neupogen 5-10 µg/kg/dobę przez 7-14 dni ANC ≥ 1000/µl Kontynuacja leczenia • BMA co 12 miesięcy Profilaktyka przeciwbakteryjna + do czasu ↑ ANC ≥ 1000/ µl ANC <1000/µl ↑ dawkę Neupogenu o 50% przez 7 dni - mielogram - cytometria szpiku - cytogenetyka szpiku • Densytometria co 12 m-cy • ustalenie minimalnej skutecznej dawki Neupogenu ACN ≥ 1000/µl • Zmiany klonalne w badaniu cytogenetycznym szpiku (monosomia chr. 7) • Objawy niepoŜądane Neupogenemu: cięŜka małopłytkowość, zapal.naczyń glomerulopatia • wtórnie słaba odpowiedź na Neupogen ACN < 1000/µl stopniowe ↑ dawki Neupogenu o 50% co 7 dni brak poprawy po dawce Neupogenu ~ 100-120 µg/kg/dobę HSCT • optymalny dawca- HLA-zgodne rodzeństwo • dawca niespokrewniony Rycina 8 Propozycja algorytmu terapeutycznego dla chorych z SCN 95 WHIM, GSDIb, CyN, SDS, zespół Bartha BEZ CIĘśKICH ZAKAśEŃ W WYWIADZIE Profilaktyka przeciwbakteryjna s.c. Neupogen 1-10 µg/kg/dobę CIĘśKIE ZAKAśENIA W WYWIADZIE Ustalenie minimalnej skutecznej dawki ↓ częstości zakaŜeń Kontynuacja leczenia Amoxycylina lub TMP/SMX 20mg/kg/dobę Wystąpienie cięŜkich zakaŜeń lub częste zakaŜenia wymagające leczenia w szpitalu LECZENIE PRZEWLEKŁE • BMA co12 m-cy (mielogram, cytometria, cytogenetyka) • Densytometria co 12 m-cy Rycina 9 Propozycja algorytmu terapeutycznego dla chorych z wrodzoną neutropenią inną niŜ SCN 96 V DYSKUSJA Przewlekła neutropenia, będąca ilościowym zaburzeniem odporności nieswoistej, występuje w wieku rozwojowym rzadko6,23,24. Jak pokazuje ponad 25-letnie doświadczenie Oddziału Immunologii IP-CZD, z powodu przewlekłej neutropenii diagnozowano i leczono 107 dzieci, u 36 z nich rozpoznano chorobę uwarunkowaną genetycznie, co stanowi niespełna 3 % wśród około 1450 chorych z róŜnymi PID rozpoznanymi w IP-CZD. Z terenu całego kraju kierowano dzieci z neutropenią o nieustalonej etiologii, podejrzeniem pierwotnego niedoboru odporności lub wrodzonego błędu metabolizmu. Kryteria pozwalające na włączenie do projektu badawczego spełniło 97 chorych. W toku przeprowadzonego postępowania diagnostycznego u 61 (63%) z nich ustalono rozpoznanie wtórnej neutropenii; w grupie tej znalazło się 55 dzieci z rozpoznaniem pewnym lub prawdopodobnym AIN. Biorąc pod uwagę średnią (15 miesięcy) i medianę (13 miesięcy) wieku pacjentów, w chwili rozpoczęcia postępowania diagnostycznego, a takŜe wiek normalizacji ANC (średnia 63 miesiące- u dzieci z AIN vs 67 miesięcy- w grupie prawdopodobnej AIN), badanie wykazało wiodącą rolę autoimmunizacyjnej neutropenii niemowląt wśród przyczyn przewlekłej neutropenii u dzieci poniŜej 5 roku Ŝycia. Podobne wyniki uzyskali inni badacze zajmujący się problemem PN u dzieci29,48,52,238,239. Z kolei przewlekła neutropenia uwarunkowana genetycznie wystąpiła u 36 (37%) chorych włączonych do badania. Grupy badane przez Lalezariego29, Buxa48, Lyalla52 oraz Jonssona239 wykazywały niŜszy - w porównaniu z omawianą grupą 97 dzieci - odsetek chorych z neutropenią uwarunkowaną genetycznie, lecz wynikało to z odmiennych kryteriów włączania do badań, przyjętych przez poszczególnych badaczy. IP-CZD gromadzi wielu chorych z rzadkimi, uwarunkowanymi genetycznie jednostkami chorobowymi, co tłumaczy stosunkowo duŜą liczbę pacjentów z GSDIb, SCN, CyN, WHIM, SDS oraz PID w omawianej grupie. Poczynione obserwacje wskazują na zdecydowaną przewagę płci Ŝeńskiej zarówno w grupie pacjentów z nabytą, jak i z wrodzoną neutropenią przewlekłą. Odmienne spostrzeŜenia zawiera raport SCNIR, wg którego odnotowano nieznaczną przewagę płci męskiej w grupie chorych z wrodzoną neutropenią oraz niewielką przewagę płci Ŝeńskiej w grupie pacjentów z AIN i CIN 82. Z kolei wspomniane juŜ prace Lalezariego, Lyalla oraz Jonssona, podobnie jak wykazało badanie opisywanej grupy, pokazały przewagę płci Ŝeńskiej w grupie dzieci z AIN, prawdopodobną AIN oraz PN o nieustalonej etiologii. 97 Trudności diagnostyczne u dzieci z przewlekłą neutopenią U około 60% chorych objętych badaniem diagnoza przewlekłej neutropenii ustalona została z wielomiesięcznym, a nawet kilkuletnim opóźnieniem w stosunku do pierwszych objawów choroby w postaci nawracających wrzodziejących zapaleń jamy ustnej, bakteryjnych zapaleń płuc, ropnych zmian skórnych, gronkowcowych zapaleń węzłów chłonnych, czy przewlekłego zapalenia przyzębia. W grupie 55 chorych z ostatecznym rozpoznaniem AIN i prawdopodobnej AIN rozpoznanie ustalane było zwykle z kilkumiesięcznym opóźnieniem, wynikającym z ograniczonej dostępności do badań wykrywających obecność AGAbs, niedostatecznej znajomości tej jednostki chorobowej, a takŜe z błędnej interpretacji limfocytozy, obserwowanej u tych chorych w obrazie odsetkowym krwinek białych. Traktowano ją bowiem jako fizjologiczną u dzieci poniŜej 4 roku Ŝycia i nie zalecano wykonania kontrolnej morfologii krwi po 7- 10 dniach od uzyskania pierwszego nieprawidłowego wyniku. Diagnozę AIN ustalano dzięki jednoczesnemu zastosowaniu 3 testów diagnostycznych. Najbardziej czułym okazał się test immunofluorescencyjny - GIFT, którego pozytywny wynik pozwolił ustalić rozpoznanie neutropenii autoimmunizacyjnej u 15 dzieci. Test aglutynacji – GAT jako jedyny wykazał obecność AGAbs u 3 badanych, natomiast uchodzący za najbardziej swoisty spośród 3 wymienionych testów – MAIGA, przyniósł pozytywny rezultat u kolejnych 2 chorych. Uzyskane wyniki potwierdzają celowość wykonywania kompletu wymienionych powyŜej testów diagnostycznych. Podobne obserwacje, dotyczące czułości testu GIFT, zawierają prace Buxa48, Lyalla52 i Jonssona239. Ocena swoistości wykrytych przeciwciał, jako czynnika determinującego czas trwania AIN nie była moŜliwa z powodu braku danych na ten temat u blisko 50% dzieci. Bux wskazuje na dłuŜsze utrzymywanie się neutropenii u chorych z AGAbs skierowanymi przeciwko HNA-2 60 . Autoprzeciwciał o tej swoistości poszukiwano w surowicy 9 dzieci z AIN, nie uzyskując wyniku pozytywnego u Ŝadnego z nich. W poszukiwaniu czynników mogących mieć wpływ na wykrycie lub nie - AGAbs, dokonano porównania obu grup- AIN z prawdopodobną AIN. Podobnie jak wykazali Lalezari29, Lyall52 i Jonsson239, grupy te nie róŜniły się istotnie pod względem wyników badań hematologicznych i immunologicznych. TakŜe porównanie wieku wystąpienia pierwszych zakaŜeń, sugerujących neutropenię, wieku oznaczania AGAbs, ANC w chwili 98 oznaczania AGAbs oraz rodzaju przebytych zakaŜeń nie wykazało istotnej statystycznie róŜnicy między grupami. Jedynym, co róŜniło obie grupy, była częstość występowania cięŜkich infekcji, w tym głównie- zakaŜeń dolnych dróg oddechowych, która okazała się być wyŜsza w grupie prawdopodobnej AIN. Wydaje się, Ŝe uzyskane wyniki upowaŜniają do ustalenia diagnozy prawdopodobnej AIN w oparciu o typowy przebieg kliniczny oraz charakterystyczny, choć nie patognomoniczny obraz szpiku, mimo niepowodzenia w detekcji przeciwciał przeciwgranulocytarnych. Podobne problemy diagnostyczne opisywane są w piśmiennictwie dotyczącym AIN23,29,48,52,238,239. Lalezari zaleca, aby chorym z utrzymującą się cięŜką neutropenią wykonać testy, wykrywające AGAbs, po 6-8 tygodniach od pierwszego badania 29. Ze względu na wysoki koszt badań, w IP-CZD powtarzano je wyłącznie u dzieci z ANC < 500/µl, u nielicznych chorych dwukrotnie, co zwiększyło liczbę potwierdzonych AIN zaledwie o 1. U pacjentów zaliczonych do grupy z prawdopodobną AIN, uzyskano jedynie pośrednie dowody na wzmoŜone niszczenie dojrzałych granulocytów obojętnochłonnych, w postaci mielogramów ukazujących szpik bogatokomórkowy, z prawidłową lub pobudzoną linią granulocytarną. Jednocześnie obraz ten przeczył wtórnym przyczynom neutropenii przewlekłej takim, jak reakcje polekowe, czy zakaŜenia wirusowe, które prowadzić mogą do hipoplazji/aplazji szpiku lub wybiórczego upośledzenia mielopoezy12,19,22,23. Za diagnozą AIN wydaje się równieŜ przemawiać przemijający charakter neutropenii, jaki odnotowano u 23 spośród 34 obserwowanych w IP-CZD dzieci z prawdopodbną AIN. Według Lalezary’ego i Lyalla, spontaniczna normalizacja ANC w przebiegu AIN występuje u 95% dzieci przed ukończeniem 4 roku Ŝycia, trwając od 6 do 60 miesięcy, z medianą rzędu 30 miesięcy 29,52. Z kolei Jonsson i wsp. wykazali dłuŜsze utrzymywanie się neutropenii - do 114 i 86 miesiąca Ŝycia, z medianą wynoszącą 19 i 27 miesięcy, odpowiednio w grupach z AIN i prawdopodobną AIN. W grupie badanej w IP-CZD, powrót ANC do normy zaobserwowano najwcześniej w 11 miesiącu Ŝycia (AIN) i 14 miesiącu (prawdopodobna AIN), najpóźniej zaś w 9 (AIN) i 12 roku Ŝycia (prawdopodobna AIN); mediana w obu grupach wynosiła odpowiednio - 62 i 101 miesięcy, a zatem do normalizacji ANC w grupie badanej dochodziło znacznie później, niŜ wskazywały dotychczasowe opisy tej jednostki chorobowej. Na podstawie obserwacji Buxa60, moŜna sądzić, Ŝe przyczyną dłuŜszego trwania AIN mogły być przeciwciała o swoistości anty-HNA-2, lecz nie ma na to dowodów w uzyskanych wynikach. Celem wykluczenia FBN, kontrolowano obraz krwi rodziców i rodzeństwa pacjentów z prawdopodobną AIN, nie znajdując leukopenii, ani neutropenii u nikogo z badanych. W opisywanej grupie, dwoje dzieci z AIN oraz jedno z prawdopodobną AIN, po ustaleniu rozpoznania, przebyło zakaŜenia EBV lub CMV, co mogło przyczynić się do pogłębienia 99 zaburzeń hematologicznych oraz przedłuŜyć czas trwania neutropenii. Zgodnie z panującym poglądem, produkcję autoprzeciwciał przeciwgranulocytarnych w AIN, podobnie jak przeciwciał przeciwpłytkowych w ITP, inicjują czynniki zakaźne52, stąd moŜna przypuszczać, Ŝe chorzy z dłuŜej utrzymujacą się neutropenią mogli mieć ponowny kontakt z patogenem, który zapoczątkował u nich powstanie AGAb. Hipotezę tę czyni prawdopodobną obserwacja trzech naszych chorych, którzy około 4 roku Ŝycia osiągnęli ANC bliskie normy i nie mieli problemów infekcyjnych, po czym zaczęli uczęszczać do przedszkola, co z kolei było przyczyną nawracających zakaŜeń dróg oddechowych i ponownego obniŜenia liczby granulocytów obojętnochłonnych we krwi obwodowej. Mimo doniesień śupańskiej i wsp. o stosunkowo wysokiej, bo szacowanej na 1: 6000, częstości występowania NAIN30, w grupie badanej nie znalazł się Ŝaden chory z tym rozpoznaniem. MoŜe to świadczyć o łagodnym przebiegu klinicznym choroby co sprawia, Ŝe niemowlęta z NAIN nie rozwijają objawów zakaŜenia i w związku z tym nie mają wykonywanej morfologii krwi obwodowej z rozmazem, która pozwoliłaby zidentyfikować obniŜenie liczby granulocytów obojętnochłonnych. W grupie chorych z przewlekłą neutropenią w przebiegu chorób uwarunkowanych genetycznie najwięcej trudności diagnostycznych sprawili pacjenci z cykliczną neutropenią, zespołem WHIM oraz chłopiec z ALPS. Trudności z ustaleniem rozpoznania u dzieci z CyN wynikały z niskiej świadomości istnienia tej jednostki chorobowej wśród pediatrów, jak równieŜ z niechęci rodziców do wykonywania dzieciom badania morfologii krwi 3 razy w tygodniu przez 5 do 6 tygodni, co jest niezbędne do uzyskania dowodów na oscylujące, między agranulocytozą a normą, wartości ANC. Diagnoza WHIM okazała się być trudną przede wszystkim z powodu stopniowego pojawiania się poszczególnych objawów zespołu (np. brodawek pogłębiających się w czasie trwania obserwacji nieprawidłowości skórnych) oraz w badaniach immunologicznych. Postępująca hipogammaglobulienamia, a takŜe limfopenia w zakresie limfocytów CD19+ wystąpiły u wszystkich chorych z podejrzeniem WHIM, lecz początkowo były interpretowane jako objawy pospolitego zmiennego niedoboru odporności (CVID). Podobnie obecność neutropenii, mimo braku dowodów na jej autoimmunizacyjny charakter, była kojarzona takŜe z CVID. U jednej chorej, jeszcze przed stwierdzeniem hipogammaglobulinemii, doszło do rozwoju rozstrzeni oskrzeli- powikłania typowego dla niedoborów odporności humoralnej, opisanego takŜe u pacjentów z WHIM. Kolejna chora z 100 ostatecznym rozpoznaniem WHIM, która prezentowała niedobór masy ciała, cięŜką neutropenię, hipogammaglobulinemię, leukopenię oraz limfopenię w zakresie komórek CD19+ od wczesnego niemowlęctwa, była początkowo diagnozowana w kierunku cięŜkiego złoŜonego niedoboru odporności- T(+)B(-)SCID. JednakŜe obecność wrodzonej wady serca133, a takŜe brak zakaŜeń oportunistycznych w wywiadzie przemawiały za diagnozą WHIM. Ze względu na brak mutacji w genach RAG1 i 2 oraz ARTEMIS, nie potwierdzono u tej chorej zespołu Omenna. Chory z ALPS, z powodu powiększenia wątroby i śledziony, uogólnionej limfadenopatii, małopłytkowości oraz wysypki sugerującej histiocytozę z komórek Langerhansa, zanim skierowany został do Oddziału Immunologii, poddany był diagnostyce w celu wykluczenia choroby nowotworowej. Obraz kliniczny typowy dla ALPS oraz wysoki odsetek tzw. komórek T podwójnie negatywnych (DNTC) we krwi obwodowej pozwolił wysunąć podejrzenie tego pierwotnego niedoboru odporności, lecz ostateczne rozpoznanie moŜliwe było dopiero po uzyskaniu wyników badań molekularnych, potwierdzających istnienie mutacji w egzonie 9 genu Fas. Najsprawniej przebiegała diagnostyka u dzieci, które rozwinęły najcięŜsze powikłania infekcyjne- chorych z SCN, GSDIb, SDS, a takŜe u młodszego rodzeństwa pacjentów dotkniętych chorobą uwarunkowaną genetycznie. Niemowlętom z agranulocytozą, po przebyciu posocznicy lub cięŜkiego bakteryjnego zapalenia płuc, w związku z podejrzeniem SCN, bez wahania wykonywano biopsję aspiracyjną szpiku, która pomagała potwierdzić wstępną diagnozę. Natomiast dzieci z GSDIb, z uwagi na znacznego stopnia powiększenie wątroby oraz zaburzenia gospodarki węglowodanowej i lipidowej, z podejrzeniem wrodzonego błędu metabolizmu kierowane były do Kliniki Chorób Metabolicznych IP-CZD. Zaledwie jedno dziecko z GSDIb, z powodu agranulocytozy i cięŜkich zakaŜeń w wywiadzie, skierowano do Oddziału Immunologii. Propozycja algorytmu diagnostycznego dla dzieci z PN Diagnostyka przewlekłej neutropenii, ze względu na mnogość i róŜnorodność schorzeń, które do niej prowadzą, jest często procesem Ŝmudnym, czasochłonnym i kosztownym. W oparciu o charakterystykę obrazu klinicznego chorych włączonych do badania oraz ocenę zastosowanego u nich postępowania diagnostycznego, jak równieŜ na podstawie przeglądu aktualnego piśmiennictwa, w tym zaleceń ekspertów z Międzynarodowego Rejestru CięŜkiej Wrodzonej Neutropenii- SCNIR237, podjęto próbę 101 stworzenia, moŜliwego do realizacji w warunkach polskich, algorytmu diagnostycznego dla dzieci z przewlekłą neutropenią. NaleŜy podkreślić, iŜ badaniami odgrywającymi kluczową rolę w diagnostyce PN u dzieci, są od wielu lat mielogram oraz panel testów oceniających obecność przeciwciał przeciwgranulocytarnych w surowicy chorych. Przeprowadzone badanie wykazało takŜe korzyści płynące z jednoczesnego wykonania cytometrii przepływowej szpiku. Dzięki niej, u chorych z WHIM i SDS, zidentyfikowano zaburzenia w zakresie dojrzewania limfocytów B, jak równieŜ monitorowano lecznie czynnikiem wzrostu kolonii granulocytarnych, nie znajdując cech MDS ani AML, u Ŝadnego z leczonych w ten sposób chorych. Rycina 3 ilustruje przebieg postępowania diagnostycznego w oparciu o ocenę tych właśnie badań; podkreśla takŜe wagę badania cytogenetycznego, zwłaszcza w przypadku podejrzenia SCN, SDS, FA i MDS. Poszukiwanie AGAbs wskazane jest u wszystkich dzieci z cięŜką neutropenią (ANC<500/µl) i powinno składać się z 3 testów: MAIGA, GIFT oraz GAT. Mimo zastosowania trzech odmiennych metod diagnostycznych, wykrycie AGAbs jest trudne, co tłumaczone jest szybką internalizacją HNA, po związaniu z przeciwciałem7. Niektórzy autorzy zalecają powtórne oznaczenia u chorych z prawidłowym obrazem szpiku i utrzymującymi się niskimi wartościami ANC 29. W polskich warunkach zalecenie to jest trudne do zrealizowania z uwagi na wysoki koszt wymienionych powyŜej testów (obecnie około 660 PLN), co więcej - jak wskazują przeprowadzone badania - powtarzanie ich rzadko, bo zaledwie u 5% chorych, przynosi pozytywny rezultat. W przypadku dzieci, u których nie wykryto AGAbs, a tradycyjny mielogram nie pozwolił ustalić rozpoznania, wobec faktu występowania PN w przebiegu kilku pierwotnych niedoborów odporności, wydaje się uzasadnione przeprowadzenie diagnostyki immunologicznej15,23,24,27,35,155. Badaniami zalecanymi u tych chorych są: stęŜenie klas głównych immunoglobulin oraz składowych C3 i C4 dopełniacza, stęŜenia podklas IgG oraz swoistych przeciwciał poszczepiennych (istotne przy podejrzeniu CVID, WHIM, SDS, XLA), cytometryczna ocena subpopulacji limfocytów krwi obwodowej (wiele wnosząca w diagnostyce XLA, CVID, WHIM, ALPS) oraz ekspresji ligandu CD40 na aktywowanych limfocytach CD4+ u chłopców z hipogammaglobulinemią. Badaniem wciąŜ zbyt rzadko wykonywanym u dzieci z PN jest cytometryczna ocena szpiku. Powinno ono wejść w skład standardowego postępowania przy kaŜdorazowym pobieraniu próbek szpiku, gdyŜ stanowi badanie komplementarne w stosunku do tradycyjnej mikroskopowej oceny mielogramu, dostarczając cennych informacji na temat rozwoju linii 102 limfocytów B, monocytów oraz nieprawidłowości, występujących w przebiegu MDS i AML, które wpisane sa w historię naturalną SCN, SDS i FA. Zaburzenia w zakresie róŜnicowania komórek limfoidalnych w szpiku opisano równieŜ u pacjentów z agammaglobulinemią Brutona, CVID, CIN, WHIM i SDS 240. Istotnym elementem diagnostyki PN jest takŜe badanie podmiotowe i przedmiotowe. Przewlekła biegunka (SDS, CD40Ldef, SCID, zespół Bartha i Pearsona), niedobór masy ciała i/lub wzrostu (zespoły wymienione poprzednio oraz SCN i GSDIb), małogłowie (niedokrwistość Fanconiego, agranulocytoza Kostmanna), nieprawidłowości układu kostnego (FA, SDS), częściowy albinizm skórno-oczny (CHS, GS II), brodawki skórne (WHIM), plamy ‘cafe au lait’(FA), twarz „lalki”(GSDIb), cięŜkie zapalenie przyzębia (SCN, GSDIb), wrodzona wada serca (WHIM, FA), kardiomiopatia rozstrzeniowa (zespół Bartha), powiększenie wątroby (GSDIb, ALPS) i/lub śledziony (CVID, ALPS, MDS), niezwykły zapach moczu (MMA, IVA, PA), zaburzenia neurologiczne (GSII, CHS, agranulocytoza Kostmanna, zespół Pearsona)- to waŜne objawy obserwowane u dzieci z PN o róŜnej etiologii. Wiele do diagnostyki PN wnieść mogą takŜe podstawowe badania laboratoryjne takie, jak ocena aktywności aminotransferaz (często podwyŜszona u dzieci z SDS, zespołem Pearsona i w zakaŜeniach wirusowych), enzymów trzustkowych (obniŜona u niemowląt i dzieci młodszych z SDS i zespołem Pearsona), stęŜenia triglicerydów i cholesterolu w osoczu (podwyŜszone u pacjentów z GSDIb i zespołem Pearsona, obniŜone w zespole Bartha), kwasu mlekowego i moczowego w osoczu (podwyŜszone w GSDIb). W przypadku dzieci z przewlekłą lub nawracającą biegunką oraz słabo przybierających na wadze, warto uzupełnić diagnostykę o ocenę zawartości tłuszczu w trzydobowej zbiórce kału (pomocne w identyfikacji chorych z SDS). Objawy takie prezentować mogą takŜe chorzy z niedoborem ligandu CD40 w związku z zakaŜeniem Cryptosporidium sp., chorzy na AIDS oraz dzieci ze SCID (często z przewlekłym zakaŜeniem rotawirusowym), stąd niezbędna wydaje się takŜe analiza mikrobiologiczna próbek stolca. W związku z występowaniem PN w przebiegu kwasic organicznych i zespołu Bartha (kwasica 3-metyloglutakonowa), wskazane jest badanie profilu kwasów organicznych w moczu metodą GC/MS. Opierając się na obecności wybranych odchyleń w badaniu podmiotowym, przedmiotowym oraz testach laboratoryjnych, stworzono propozycję algorytmu diagnostycznego, ułatwiającego wybór badań pierwszego i drugiego rzutu (rycina 4). 103 Postępowanie diagnostyczne w PN u dzieci zaleŜy takŜe od wieku chorego, w którym wystąpiły u niego pierwsze objawy sugerujące zaburzenia liczby granulocytów obojętnochłonnych. Zapalenie pępka i cięŜkie zakaŜenia zaobserwowane u noworodka lub niemowlęcia sugerować mogą zarówno chorobę uwarunkowaną genetycznie (SCN, GSDIb, SDS, CD40Ldef, kwasice organiczne), jak i wtórną do obecności przeciwciał przeciwgranulocytarnych (NAIN, AIN) lub będącą następstwem zakaŜenia (CMV, HIV, PVB19, HHV6, Toxoplasma gondii). W przypadku niemowląt w wieku powyŜej 6 miesiąca, bez cięŜkich zakaŜeń w wywiadzie i nieprawidłowości w badaniu przedmiotowym, prawidłowo przybierających na wadze, najbardziej prawdopodobne jest rozpoznanie autoimmunizacyjnej neutropenii niemowląt- choroby, która w świetle przeprowadzonego badania oraz przeglądu piśmiennictwa, jest najczęstszą przyczyną PN u dzieci poniŜej 5 roku Ŝycia. Wywiad rodzinny obciąŜony śmiercią małego dziecka, wymaga wnikliwej diagnostyki zarówno immunologicznej (w kierunku SCID, XLA, CD40Ldef, ALPS), jak i metabolicznej (w kierunku 3 kwasic organicznych, GSDIb i zespołu Bartha). U dzieci powyŜej szóstego roku Ŝycia, podobnie jak u dorosłych, wśród czynników prowadzących do PN dominują zakaŜenia, leki oraz związki chemiczne, zawarte w farbach, lakierach, środkach ochrony roślin. ZakaŜeniami, których przebycie wywołać moŜe agranulocytozę są przede wszystkim infekcje wirusowe (EBV, CMV, HHV6, HAV, HBV, HCV, HIV, PVB19, VZV, wirus odry), rzadziej bakteryjne (Mycobacterium tuberculosis, Brucella sp.) lub pierwotniakowe (Toxoplasma gondii, Plasmodium vivax). Dlatego teŜ niezwykle istotne jest przeprowadzenie diagnostyki serologicznej i - jeśli to moŜliwerównieŜ molekularnej, w poszukiwaniu dowodów na przebyte lub aktywne zakaŜenie jednym z wymienionych powyŜej patogenów. W tej grupie wiekowej neutropenia moŜe być takŜe pierwszym objawem hematologicznym niedokrwistości Fanconiego, dlatego teŜ stwierdzenie u dziecka z PNmałogłowia, upośledzenia umysłowego, niskorosłości, wad kostnych w obrębie kończyn górnych (a zwłaszcza kciuka), plam ‘cafe au lait’, wady serca i/lub nerek, niedosłuchu, bądź opornej na leczenie niedokrwistości powinno skłonić lekarza do pilnej diagnostyki potwierdzającej, bądź wykluczającej tę jednostkę chorobową. Obecnie zaleca się wykonanie testu z mitogenami -mitomycyną C (MMC) lub diepoksybutanem (DEB), pod wpływem których dochodzi u chorych z FA do wzmoŜonej łamliwości chromosomów 241. Ustalenie diagnozy FA jest szczególnie istotne wobec wysokiego ryzyka transformacji nowotworowej, jakie zaobserwowano u tych chorych; AML wystąpiła u 10-33% chorych, guzy lite głowy, 104 szyi, przełyku, wątroby i okolicy urogenitalnej opisano u około 29% chorych z FA do piątej dekady Ŝycia. W związku z tym uwaŜa się, Ŝe pacjenci z FA mają pilne wskazania do HSCT, choć niestety procedura ta nie znosi ryzyka wystąpienia u nich guzów litych241. Przeprowadzając badanie podmiotowe naleŜy szczególny nacisk połoŜyć na przyjmowane przez chorego w ciągu minionych 3 miesięcy leki, a takŜe zmiany dokonane w jego przewlekłym leczeniu np. przeciwdrgawkowym. Leki powodować mogą neutropenię w róŜnych mechanizmach19,23,27. Niektóre z nich wywierają bezpośredni efekt mielosupresyjny (karbamazepina, kwas walproinowy, antybiotyki betalaktamowe), inne (chloramfenikol, sulfonamidy, pyralgina) prowadzą do reakcji idiosynkratycznych, wywołując agranulocytozę jedynie u osób z tego rodzaju nadwraŜliwością. Istnieje grupa leków wywołujących aplazję szpiku u wszystkich osób, które otrzymały ich mielotoksyczną dawkę (fenytoina, fenobarbital). Niektóre z kolei leki stają się haptenami, indukując powstawanie przeciwciał przeciwgranulocytarnych (penicyliny, leki przeciwtarczycowe, sole złota, aminopiryna). Z punktu widzenia diagnostyki róŜnicowej istotny wydaje się nie tylko rodzaj przebytych przez dziecko zakaŜeń, ale równieŜ ich częstotliwość, gdyŜ istnieje kilka schorzeń, w przebiegu których zaobserwowano cykliczne spadki wartości ANC. Klasycznym przykładem jest cykliczna neutropenia, charakteryzująca się regularnym, co około 21 dni obniŜeniem liczby neutrocytów we krwi obwodowej, z towarzyszącym zahamowaniem dojrzewania linii granulocytarnej w szpiku. Cykliczne, ale mniej regularne, spadki ANC obserwowano takŜe w zespole Bartha (od 3-5 tygodni), niedoborze ligandu CD40 oraz w SDS. Chorym z regularnie nawracającymi wrzodziejącymi zapaleniami jamy ustnej, zapaleniami migdałków podniebiennych lub gardła z wysoką gorączką i limfadenopatią szyjną naleŜy zalecić wykonywanie morfologii krwi obwodowej z rozmazem manualnym 3 razy w tygodniu, przez 5- 6 tygodni. Wykazanie regularnych spadków ANC z towarzyszącą im monocytozą „wyrównawczą” jest wskazaniem do przeprowadzenia diagnostyki genetycznej, w poszukiwaniu mutacji genu ELA2/ELANE, odpowiedzialnych za około 90% przypadków CyN. Wystąpienie bólu i/lub obrzęku stawów, wysypek o nieustalonej etiologii, powiększenia wątroby i śledziony oraz węzłów chłonnych, z towarzyszącą hipergammaglobulinemią nakazuje wszczęcie diagnostyki w kierunku chorób zapalnych tkanki łącznej (układowy toczeń rumieniowaty, młodzieńcze idiopatyczne zapalenie stawów), ale wymaga takŜe wykluczenia autoimmunizacyjnego zespołu limfoproliferacyjnego, zespołu mielodysplastycznego, histiocytozy z komórek Langerhansa oraz ostrej białaczki limfoblastycznej. Stąd poza diagnostyką reumatologiczną (obejmującą oznaczenie: 105 przeciwciał przeciwjądrowych, składowych C3 i C4 dopełniacza, aktywności hemolitycznej dopełniacza, przeciwciał przeciw natywnemu DNA, czynnika reumatoloidalnego) konieczne jest badanie szpiku, z uwzględnieniem cytometrii przepływowej i cytogenetyki, badanie całego węzła chłonnego, wykonanie badań obrazowych kośćca (RTG, scyntygrafia) oraz oznaczenie odsetka tzw. komórek T podwójnie negatywnych we krwi obwodowej (większy od 5 moŜe wskazywać na ALPS). U nastolatków, poza przyczynami zakaźnymi (zwłaszcza wirusy hepatotropowe i HIV), lekami i narkotykami, pamiętać naleŜy o takich przyczynach PN, jak rodzinna łagodna neutropenia (FBN), za którą przemawiać moŜe obecność leukopenii we krwi obwodowej, bez towarzyszących zaburzeń hematologicznych i immunologicznych, brak cięŜkich zakaŜeń w wywiadzie, zwykle łagodny stan zapalny przyzębia oraz stwierdzenie leukopenii z neutropenią łagodną do umiarkowanej u jednego z rodziców lub rodzeństwa. W tej grupie wiekowej mogą wystąpić takŜe pierwsze objawy kliniczne pospolitego zmiennego niedoboru odporności, stąd konieczność zbadania stęŜeń klas głównych immunoglobulin, podklas IgG, izohemaglutynin grupowych oraz rozkładu subpopulacji limfocytów krwi obwodowej. Przyczyną PN u nastolatków moŜe być równieŜ przewlekła idiopatyczna neutropenia (CIN), której rozpoznanie pozostaje diagnozą opartą na wykluczeniu wymienionych powyŜej przyczyn15,168. Obraz kliniczny neutropenii przewlekłej Na obraz kliniczny przewlekłej neutropenii, u dzieci w grupie badanej, złoŜyły się nawracające zakaŜenia bakteryjne: skóry, śluzówek, dróg oddechowych, węzłów chłonnych, dróg moczowych, wyjątkowo grzybicze (aspergilloza u chorego z SCN), jak równieŜ przewlekłe zapalenie przyzębia. W opisanej grupie wszyscy chorzy mieli wykonaną morfologię krwi obwodowej z powodu cięŜkiego lub kolejnego zakaŜenia. CięŜkość oraz częstość zakaŜeń w przebiegu PN zaleŜała od rozpoznanej jednostki chorobowej oraz mechanizmu prowadzącego do neutropenii. Przeprowadzone badanie oraz przegląd piśmiennictwa wskazują, Ŝe najcięŜszy przebieg kliniczny mają jednostki i zespoły chorobowe przebiegające z zaburzeniami wytwarzania oraz dojrzewania granulocytów obojętnochłonnych w szpiku (SCN, GSDIb, CyN), hipoplazją lub aplazją szpiku (SDS, SCN, CIN, FA), a takŜe z towarzyszącymi zaburzeniami odporności komórkowej i/lub humoralnej (CD40Ldef, RD, ALPS), nieprawidłową chemotaksją (GSDIb, SDS, CHS) lub zaburzeniami aktywności cytotoksycznej komórek NK i limfocytów cytotoksycznych (GS II i CHS) 7,15,23,26,35,64,90,110,239 . W przebiegu wymienionych chorób opisywano śmiertelny przebieg 106 zakaŜeń bakteryjnych, rzadziej grzybiczych, podczas gdy u Ŝadnego z opisanych dotąd chorych z AIN nie doszło do zgonu wskutek zakaŜenia29,48,52,238,239. W grupie 97 obserwowanych przez nas dzieci cięŜkie zakaŜenia takie, jak zapalenia płuc, posocznice, ropnie wątroby lub okołoodbytnicze, dotyczyły 72% chorych, jednakŜe u dzieci z AIN lub prawdopodobną AIN zapalenie płuc lub posocznica stanowiły w większości pojedyncze epizody, natomiast pacjenci z PN w przebiegu chorób wrodzonych chorowali na zakaŜenia dolnych dróg oddechowych i inne zakaŜenia cięŜkie - wielokrotnie. Podobne spostrzeŜenia zawierają prace opisujące spektrum zakaŜeń u dzieci z AIN i SCN15,26,29,48,54,58,64,170,239. W grupie badanej cięŜkie zakaŜenia wystąpiły u wszystkich pacjentów z SCN, GSDIb, SDS, PID oraz u większości z CyN i CIN. Najczęściej izolowanym patogenem był Staphylococcus aureus. Nastolatek z SCN zmarł w przebiegu uogólnionego zakaŜenia wywołanego przez Clostridium perfringens, a niemowlę z tym samym rozpoznaniem, wymagało leczenia w komorze hiperbarycznej w związku ze zgorzelinowym zapaleniem skóry krocza i moszny, stanowiącym powikłanie posocznicy o etiologii Pseudomonas aeruginosa. Kolejnych dwoje chorych z SCN rozwinęło ropnie wątroby oraz przewlekłe zapalenie ucha środkowego, prowadzące do upośledzenia słuchu i wymagające leczenia operacyjnego. Podobne opisy powikłań infekcyjnych znajdują się w pracach omawiających chorych z SCN 71,77,82,239,242. Głównym problemem 9 pacjentów z rozpoznaniem GSDIb były bakteryjne zakaŜenia skóry i tkanki podskórnej- ropnie, czyraki, ropowice, najczęściej o etiologii Staphylococcus aureus, w jednym przypadku wyhodowano E. coli. Uzyskane wyniki pozostają w zgodzie z doniesieniami na temat zakaŜeń występujących u chorych z GSDIb26,105,106,114. U 3 chłopców wystąpiły takŜe objawy nieswoistego zapalenia jelit (IBD), będącego powikłaniem typowym dla tej postaci glikogenozy 113,115. W pracy Vissera, dotyczącej 55-osobowej grupy chorych z GSDIb, aŜ 77% pacjentów rozwinęło objawy IBD110. W grupie badanej w IP-CZD, odsetek ten wynosił tylko 33%, co najpewniej było konsekwencją niŜszej średniej wieku w porównaniu z wiekiem chorych opisanych przez Vissera. U chorej z WHIM, przed stwierdzeniem hipogammaglobulinemii, doszło do rozwoju rozstrzeni oskrzeli, które to powikłanie opisano u kilku osób z WHIM133. Kolejna chora z tym samym rozpoznaniem, prezentowała cięŜką neutropenię, hipogammaglobulinemię oraz limfopenię w zakresie limfocytów CD19+ od wczesnego niemowlęctwa, rozwinęła teŜ posocznicę w przebiegu zakaŜenia układu moczowego w 2 miesiącu Ŝycia, lecz od czasu włączenia Neupogenu i IVIG, nie doszło u niej do Ŝadnych cięŜkich zakaŜeń. 107 Z kolei dzieci, u których rozpoznano cięŜką neutropenię wtórną do obecności przeciwciał przeciwgranulocytarnych lub hipersplenizmu, których szpik był bogatokomórkowy z pobudzoną linią granulocytarną i przesunięciem w lewo do pałeczki lub metamielocyta, rozwijały cięŜkie zakaŜenia zdecydowanie rzadziej. W liczącej 55 chorych grupie AIN i prawdopodobnej AIN posocznica wystąpiła u 3 niemowląt, natomiast jedno zapalenie płuc przebyło 40% dzieci - nie były to jednak cięŜkie zakaŜenia bakteryjne, gdyŜ większość dzieci leczona była ambulatoryjnie i u Ŝadnego z nich nie wystąpiły powaŜne powikłania np. niewydolność oddechowa, czy ropień płuca. Zgodnie z doniesieniami z piśmiennictwa, chorzy z AIN, CIN oraz WHIM, w odpowiedzi na zakaŜenie i towarzyszący mu wzrost stęŜenia cytokin prozapalnych, szybko mobilizują granulocyty obojętnochłonne ze szpiku do krwi obwodowej co sprawia, Ŝe rzadko dochodzi u nich do uogólnienia procesu zapalnego52,130,139,168,170. U chorych z WHIM nieliczne zgony obserwowano jedynie u pacjentów nie otrzymujących IVIG i/lub preparatów G-CSF139. W grupie 75 chorych objętych badaniem prospektywnym od większości pacjentów uzyskano wyniki badania morfologii krwi obwodowej wraz z rozmazem, pobranej zarówno w okresie wolnym od objawów zakaŜenia, jak i w trakcie infekcji z towarzyszącą gorączką i podwyŜszonym CRP. Chorzy z SCN nawet podczas zakaŜeń bakteryjnych nie osiągali wartości ANC przekraczających 600/µl. Z kolei pacjenci z CyN uwalniali ze szpiku odpowiednie ilości granulocytów obojętnochłonnych, niezbędne do zwalczenia infekcji, dopiero po upływie, trwającego od 3 do 6 dni, okresu agranulocytozy - typowego dla tej jednostki chorobowej. Natomiast dzieci z AIN, prawdopodobną AIN, WHIM oraz CIN w odpowiedzi na zakaŜenie prezentowały wzrost ANC rzędu 1000/µl, co zapewne wpłynęło na bardziej łagodny obraz zakaŜeń, jaki zaobserwowano w tej grupie, stanowiąc niewątpliwy dowód istniejącej u nich bogatej rezerwy szpikowej granulocytów obojętnochłonnych. W przypadku chorych z GSDIb, SDS, CD40Ldef oraz FBN wzrost ANC podczas zakaŜeń mieścił się w przedziale od 200 do 600/µl, co jedynie chorym z FBN pozwalało osiągnąć ANC powyŜej 1500/µl. W przypadku pacjentów z GSDIb oraz SDS zjawisko to moŜna tłumaczyć nieprawidłową chemotaksją granulocytów15,26,90,110, natomiast chorzy z FBN i CD40L mają zmniejszoną rezerwę szpikową neutrocytów12,34,243. PowyŜsze obserwacje upowaŜniają do sformułowania wniosku, iŜ wzrost ANC powyŜej 1500/µl, w odpowiedzi na zakaŜenie bakteryjne, jest w przebiegu przewlekłej neutropenii czynnikiem korzystnie rokującym, podczas gdy brak lub niewielki wzrost liczby neutrocytów we krwi obwodowej stanowi o złej prognozie, gdyŜ predysponuje chorych do rozwoju cięŜkich infekcji bakteryjnych. 108 Jak juŜ wspomniano, obraz szpiku determinuje przebieg kliniczny przewlekłej neutropenii u dzieci. Hipoplazja i/lub tzw. wysoki blok dojrzewania układu granulocytarnego, prowadząc do cięŜkiej neutropenii we krwi obwodowej, naraŜa chorych na wystąpienie powaŜnych, a nawet letalnych zakaŜeń bakteryjnych, podczas których wbrew mechanizmom odporności wrodzonej, mimo zwiększonego stęŜenia cytokin prozapalnych, nie dochodzi do zwiększonego uwalniania neutrocytów ze szpiku. W badanej grupie najcięŜsze zakaŜenia – posocznice wywołane przez bakterie G(+), G(-) oraz beztlenowce, zapalenia płuc prowadzące do niewydolności oddechowej, a takŜe zakaŜenie uogólnione zakończone zgonem, wystąpiły u dzieci z SCN. Inwazyjną aspergillozę i ropień wątroby zaobserwowaliśmy takŜe u chłopca z SCN, który nie uzyskał poprawy hematologicznej, mimo zastosowania terapii Neupogenem w dawce sięgającej 100 µg/kg. Przeprowadzone badania wskazują, iŜ opisany powyŜej obraz szpiku jest czynnikiem niepomyślnej prognozy. Z kolei prawidłowa komórkowość szpiku oraz mieszcząca się w normie liczba wszystkich form cyklu rozwojowego neutrofila, przynajmniej do etapu metamielocyta/pałeczki, wydają się być czynnikami dobrego rokowania. Potwierdzeniem tej tezy jest brak doniesień o śmiertelnym przebiegu zakaŜeń u dzieci z rozpoznaniem AIN oraz stosunkowo łagodny przebieg kliniczny zakaŜeń, jaki obserwowano w badanej grupie 55 dzieci z AIN i prawdopodobnej AIN, mimo agranulocytozy we krwi obwodowej. Opisywane u chorych z przewlekłą neutropenią, zapalenie przyzębia i wrzodziejące zapalenie jamy ustnej 19,75,82 ,wystąpiły odpowiednio u 58% i 41% naszych pacjentów, w tym u wszystkich z GSDIb, SDS, cykliczną neutropenią i CIN oraz u prawie wszystkich z cięŜką wrodzoną neutropenią; wyjątek stanowiło niemowlę z potwierdzonym genetycznie SCN. Zapalenie przyzębia pojawiało się takŜe u pojedynczych dzieci z AIN- w okresie obniŜenia ANC znacznie poniŜej 500/µl. Stan zapalny dziąseł, zgodnie z doniesieniami zawartymi w piśmiennictwie23,71,75,76, nie wystepuje u dzieci w wieku poniŜej 12 miesiąca Ŝycia, nawet w przebiegu SCN, co potwierdziły nasze obserwacje. Nieprawidłowści w obrębie kośćca, w postaci wąskiej klatki piersiowej lub poszerzonych zakończeń Ŝeber na granicy chrzęstno-kostnej oraz opóźnionego wieku kostnego, u dzieci z przewlekłą biegunką i hiperaminotransferazemią nasunęły podejrzenie SDS. Zgodnie z doniesienami zawartymi w piśmiennictwie86,94,100, u 2 chorych doszło do normalizacji aktywności enzymów wątrobowych w 3 roku Ŝycia, a u całej trójki takŜe do ustąpienia biegunki tłuszczowej, po włączeniu leczenia enzymami trzustkowymi. Podsumowanie badań hematologicznych i immunologicznych oraz ich rola prognostyczna 109 Nieprawidłowy wynik komputerowy obrazu odsetkowego leukocytów krwi obwodowej powinien zawsze skłonić lekarza do wykonania tzw. rozmazu manualnego19. Dopiero pełen wzór Schillinga, poza neutropenią, ujawnić moŜe takŜe inne nieprawidłowości np. monocytozę i eozynofilię, stosunkowo często obserwowane u chorych z SCN i CyN12,19,22,23,54. Z kolei odsetek limfocytów atypowych wyŜszy od 10 wskazywać moŜe na zakaŜenie EBV, CMV, HIV lub Toxoplasma gondii, jako przyczynę neutropenii12,23,52. Natomiast obecność ziarnistości olbrzymich w leukocytach jest unikatową cechą zespołu Chediaka- Higashiego10,22,39. W grupie badanej monocytoza wystąpiła u 80% chorych, w tym u wszystkich z SCN i CyN oraz u większości dzieci z AIN, GSDIb, CIN i podejrzeniem AIN. Zjawisko to bywa określane mianem monocytozy wyrównawczej, jako Ŝe monocyty, podobnie jak neutrofile, wywodzą się z linii mieloidalnej i wspólnie z nimi tworzą układ fagocytów, odpowiedzialnych za tzw. odporność wrodzoną. Stąd pogląd, Ŝe obecność monocytozy jest zjawiskiem pozytywnym rokowniczo19,51. Analiza grupy badanej wskazuje, Ŝe cięŜkie zakaŜenia wystąpiły u wszystkich chorych z SCN, SDS i PID, 89% chorych z GSDIb, 80% dzieci z CyN oraz 40% pacjentów z pewną lub prawdopodobną diagnozą AIN. Blisko 95% z nich miała takŜe monocytozę we krwi obwodowej. Trudno rozstrzygnąć, czy właśnie dzięki zwiększonej mobilizacji monocytów ze szpiku układ odporności zdołał opanować zakaŜenie, czy teŜ doszło do rozwoju zakaŜenia mimo monocytozy, jak ma to miejsce u chorych z CyN w okresie spadku ANC, a zatem nie byłby to skuteczny mechanizm kompensacyjny. Z powyŜszych przyczyn monocytoza nie moŜe być uznana za miarodajny czynnik prognostyczny, wbrew wcześniejszym poglądom19,51. Eozynofilia, opisywana przez niektórych autorów u chorych z cięŜką wrodzoną neutropenią19,22,23, występowała u 22 % badanych dzieci, lecz w niektórych przypadkach mogła być następstwem towarzyszących chorób alergicznych takich, jak atopowe zapalenie skóry, czy astma oskrzelowa atopowa12,19,22,54. Kolejnym zaburzeniem hematologicznym uchwytnym w badaniu morfologii krwi obwodowej, obserwowanym u części dzieci z przewlekłą neutropenią, jest leukopenia. Jej obecność stwierdzono u 26% chorych, w tym u wszystkich pacjentów z GSDIb i FBN, większości z CIN i PID oraz u 23% dzieci z pewną i prawdopodobną AIN. Liczba chorych prezentujących jednocześnie przewlekłą neutropenię i leukopenię rosła wraz z wiekiem badanych. Występowanie leukopenii dopiero u dzieci trzy- lub czteroletnich, moŜna wytłumaczyć fizjologicznymi zmianami, jakie zachodzą w obrazie krwi obwodowej w 110 pierwszych latach Ŝycia. Do 4 roku Ŝycia limfocyty stanowią 55-60% leukocytów w rozmazie10,12; powyŜej tej granicy wiekowej proporcje ulegają zmianie na korzyść granulocytów obojętnochłonnych, stąd ich cięŜki niedobór powodował leukopenię dopiero u trzy- lub czterolatków, które nie miały wysokiej monocytozy- dzieci z GSDIb, PID, FBN i CIN. Ciekawych obserwacji, mogących mieć związek z patogenezą autoimmunizacyjnej neutropenii, dostarczyły badania immunologiczne, jakie przeprowadzono u dzieci z AIN i podejrzeniem AIN. Cytometrycznej oceny rozkładu subpopulacji limfocytów krwi obwodowej dokonano u 10 pacjentów z AIN oraz 24 z prawdopodobną AIN, a jedyną stwierdzoną nieprawidłowością był podwyŜszony stosunek limfocytów CD4/CD8 u 90% dzieci z AIN oraz 32% z podejrzeniem AIN. Podobne spostrzeŜenia zawiera praca Lyalla i wsp., którzy ponadto zaobserwowali normalizację stosunku limfocytów CD4/CD8 po kilku lub kilkunastu miesiącach trwania AIN52. Kluczem do wyjaśnienia tych zjawisk moŜe być niedojrzałość mechanizmów regulatorowych, a zwłaszcza zaburzenia funkcji limfocytów T cytotoksycznych, jakie występować mogą u dzieci poniŜej 3 roku Ŝycia244. Być moŜe z powodu opóźnionej- w stosunku do wystąpienia pierwszych objawów neutropeniidiagnostyki, dzieci z grupy prawdopodobnej AIN nie miały juŜ odpowiednio wysokiego i umoŜliwiającego wykrycie- miana AGAb, ale jednocześnie prezentowały niŜsze wartości CD4/CD8. Z kolei ocena stęŜenia klas głównych immunoglobulin w osoczu chorych z pewną i prawdopodobną AIN wykazała, iŜ było ono w normie u 64% pacjentów, a podwyŜszone w zakresie 1,2 lub 3 klas głównych u 29% badanych. WyŜsze stęŜenia odnotowano u dzieci powyŜej pierwszego roku Ŝycia oraz u chorujących na nawracające zakaŜenia dróg oddechowych. MoŜna sądzić, Ŝe wobec ilościowych zaburzeń odporności wrodzonej, u chorych tych uruchomione zostały mechanizmy odporności swoistej, dzięki czemu nie rozwinęli oni cięŜkich powikłań infekcyjnych. W tej grupie cięŜkie zakaŜenia wystąpiły bowiem wyłącznie u dzieci poniŜej 12 miesiąca Ŝycia. Przeprowadzona analiza badań immunologicznych pozwoliła nie tylko zidentyfikować chorych z PID, dostarczyła takŜe informacji przemawiajacych za rozpoznaniem SCN u kilku pacjentów, zanim uzyskaliśmy moŜliwość wykonania im badań molekularnych. Zgodnie z opisami zawartymi w piśmiennictwie, chorzy z SCN, CyN oraz GSDIb często prezentują poliklonalną hipergammaglobulinemię78, natomiast pacjenci z SDS i WHIM hipogammaglobulinemię lub zaburzenia produkcji przeciwciał swoistych25,90,129. W grupie badanej odnotowaliśmy podwyŜszone stęŜenie 2 lub 3 klas głównych immunoglobulin u 111 wszystkich dzieci z SCN- z wyjątkiem niemowlęcia, które miało wysokie jedynie stęŜenie IgG, poza tym u 3 dzieci z CyN i 6 chorych z GSDIb (niemowlęta z tym rozpoznaniem miały stęŜenie immunoglobulin w górnej granicy normy dla wieku). WyŜsze stęŜenia immunoglobulin obserwowano u pacjentów z cięŜką neutropenią, chorujących na zakaŜenia dróg oddechowych lub skóry i tkanki podskórnej, a takŜe prezentujących przewlekłe zapalenie dziąseł. Wraz z normalizacją ANC, uzyskaną dzięki leczeniu Neupogenem, dochodziło nie tylko do zmniejszenia liczby zakaŜeń, ale takŜe do obniŜenia- podwyŜszonego wcześniej- stęŜenia immunoglobulin. Obserwacje te wydają się przemawiać za kompensacyjnym zwiększeniem aktywności mechanizmów odporności swoistej u chorych z upośledzoną odpornością wrodzoną. ObniŜone stęŜenie IgM odnotowaliśmy u rodzeństwa z SDS, a 2 lub 3 klas głównych immunoglobulin u chorych z WHIM. Podobne obserwacje zawarte są w cytowanym powyŜej piśmiennictwie dotyczącym WHIM. Obraz subpopulacji limfocytów krwi obwodowej wraz z oceną odsetka DNTC i ekspresji ligandu CD40 na aktywowanych limfocytach CD4+, pozwolił ukierunkować diagnostykę w stronę pierwotnego deficytu odporności u dwóch pacjentów - z ALPS i CD40Ldef, a u kolejnego chorego wykazał – opisane w CIN – podwyŜszenie liczby limfocytów CD8+. Jeden z chłopców z SCN, poddany badaniu wielokrotnie podczas kilkuletniej obserwacji, niezmiennie prezentował podwyŜszony odsetek limfocytów CD8+ i poliklonalną hipergammaglobulinemię; jednocześnie w jego mielogramach obserwowano postępującą hipoplazję szeregu granulocytarnego. Taka konstelacja odchyleń w badaniach immunologicznych moŜe być następstwem rozwijającego się u chorego hipoplastycznego zespołu mielodysplastycznego83, co wpisane jest w historię naturalną SCN15,26,56,64. Aktywność oksydazy NADPH w granulocytach, czyli tzw. „wybuch tlenowy”, badano wyłącznie u dzieci z GSDIb. Badanie wykonano u wszystkich 9 chorych z tym rozpoznaniem, stwierdzając wyraźnie obniŜoną ekspresję oksydazy NADPH u 8 dzieci, a nieznacznie obniŜoną - u 1 nastolatka. Jednocześnie stwierdzono, Ŝe dwaj chorzy z mniejszym stopniem obniŜenia aktywności oksydazy NADPH, mierzonej „wybuchem tlenowym”, mimo cięŜkiej neutropenii oraz leukopenii, chorowali mniej od pozostałych dzieci z GSDIb. Badanie powtórzono u 4 dzieci po włączeniu leczenia Neupogenem. Trzech chorych uzyskało poprawę – aktywność oksydazy NADPH mieściła się w granicach normy. Jedno dziecko, osiągnęło jedynie nieznaczny wzrost aktywności oksydazy NADPH z 45% na 51%, ale zwiększenie dawki Neupogenu spowodowało u niego powiększenie śledziony (+4cm poniŜej lewego łuku Ŝebrowego) z objawami hipersplenizmu pod postacią cięŜkiej 112 małopłytkowości. Chorzy, których „wybuch tlenowy”- dzięki leczeniu Neupogenem- wzrósł powyŜej 90%, mimo ANC nie przekraczającego 2000/µl, uzyskali zmniejszenie liczby zakaŜeń powyŜej 50%, poprawę stanu dziąseł, nie rozwinęli Ŝadnych cięŜkich infekcji ani IBD. PowyŜsze obserwacje pozwalają sformułować wniosek, iŜ u chorych z GSDIb obniŜenie aktywności oksydazy NADPH, w większym stopniu niŜ głębokość neutropenii, warunkuje zapadalność na zakaŜenia bakteryjne, być moŜe takŜe na IBD, lecz wymaga to dalszych badań. Analiza wieku poszczególnych chorych z GSDIb pokazała, Ŝe wartości „wybuchu tlenowego” były niŜsze u najmłodszych pacjentów, a wyraźnie wyŜsze, u chorujących rzadziej - nastolatków. Tradycyjny mielogram, wykonany u 89 chorych włączonych do badania, umoŜliwił zidentyfikowanie wszystkich dzieci z SCN (wysoki blok dojrzewania + eozynofilia), wykazał typowy obraz przesunięcia w lewo do pałeczki/metamielocyta u 78% dzieci z AIN oraz postępującej hipoplazji szeregu granulocytarnego u 2 chłopców z SDS. Dzięki mikroskopowej ocenie rozmazu szpiku wykazano takŜe charakterystyczne cechy morfologiczne granulocytów obojętnochłonnych (dwujądrzaste pałeczki, wakuolizacja cytoplazmy) u 2 chorych z podejrzeniem WHIM, a takŜe u ojca pacjentki początkowo podejrzewanej o CVID, z powodu obserwowanej u niej limfopenii CD19. Poza patognomonicznym dla WHIM mielogramem zarówno dziewczynka, jak i jej ojciec, prezentowali nawracające, oporne na leczenie brodawki pospolite (zakaŜenie HPV) w obrębie skóry kończyn- objaw typowy dla tego zespołu. Ojciec dziecka zmarł z rozpoznaniem uogólnionego zakaŜenia, ale z dostarczonej dokumentacji wynika, Ŝe splenomegalię i uogólnioną limfadenopatię oraz neutropenię i hipogammaglobulinemię prezentował kilka tygodni przed śmiercią, której przyczyną mógł być chłoniak nieziarniczy- opisany u kilku chorych z WHIM136,138. W związku z doniesieniami mówiącymi o eozynofilii i/lub monocytozie obserwowanej w rozmazach szpiku chorych z SCN i CyN15,76,77, oceniono mielogramy pochodzące od pacjentów z grupy badanej takŜe pod kątem występowania tych nieprawidłowości. Uzyskane wyniki potwierdziły występowanie zarówno monocytozy, jak i eozynofilii u chorych z SCN oraz wysokiej monocytozy w mielogramach pochodzących od dzieci z CyN, zwłaszcza gdy pobierano szpik w okresie agranulocytozy we krwi obwodowej. Cytometryczne badanie szpiku, poza potwierdzeniem większości obserwacji zawartych w tradycyjnym mielogramie, przyniosło szczegółowe informacje na temat dojrzewania w szpiku granulocytów, monocytów i limfocytów B. Spośród 17 chorych, u których dokonano oceny rozładu komórek prekursorowych limfocytów B, u 2 pacjentek z 113 podejrzeniem WHIM wykazano zahamowanie dojrzewania na etapie limfocyta pro-B lub preB-II, czemu odpowiadała obniŜona, w porównaniu do normy dla wieku, liczba limfocytów CD19 we krwi obwodowej. W związku ze zwiększonym ryzykiem transformacji w MDS/AML, cechującym SCN i SDS, moŜliwość oceny fenotypu zarówno granulocytów, jak i monocytów jest niezwykle przydatna w identyfikowaniu chorych z zaburzeniami, mogącymi wskazywać na powyŜsze powikłania. Jak bowiem wykazały prace Lokena, Kussica20 oraz Stetler-Stevenson21 – około 10% chorych z MDS miała prawidłowe badanie cytogenetyczne, podczas gdy cytometryczna ocena szpiku wykazała u nich nieprawidłowści pozwalające ustalić właściwe rozpoznanie. Opublikowana ostatnio praca Arnoulet i wsp., zawierająca szczegółową charakterystykę szpiku osób zdrowych, uzyskaną dzięki 4- i 5- kolorowej analizie cytometrycznej fenotypu poszczególnych linii hematopoezy, stanowi doskonały materiał porównawczy do prowadzenia badań szpiku chorych z PN245. Podobnie, opublikowana w 2010, praca Matarraz i wsp., omawiająca nieprawidłowości fenotypu dojrzewających oraz dojrzałych komórek hematopoezy szpikowej, jakie stwierdzono u 56 chorych z MDS, stanowi źródło wielu cennych informacji, niezbędnych do profesjonalnego monitorowania pacjentów z SCN i SDS, a takŜe wszystkich chorych leczonych czynnikiem wzrostu kolonii granulocytarnych246. Opisywanych przez Matarraza i wsp. cech MDS nie mieli chorzy z grupy badanej. Niewątpliwą zaletą cytometrii przepływowej jest takŜe krótki czas oczekiwania na wynik badania oraz jego niŜszy koszt, w porównaniu z czasochłonnym (bo wymagającym hodowli leukocytów) i drogim badaniem cytogenetycznym20. Wobec konieczności powtarzania badań szpiku u chorych z SCN, SDS, FA, a takŜe u wszystkich przewlekle leczonych Neupogenem, zalety te wydają się być szczególnie istotne. W opisywanej grupie u Ŝadnego z chorych nie wystąpiły nieprawidłowości sugerujące zmiany klonalne, zarówno w cytometrycznym, jak i cytogenetycznym badaniu szpiku. Badanie nabytych mutacji punktowych genu dla G-CSFR było szczególnie waŜne dla pacjentki, której starsza siostra zmarła wskutek AML, tuŜ po rozpoczęciu leczenia Neupogenem, w ośrodku innym niŜ IP-CZD. Planujemy wykonać je takŜe u chłopca z SCN, u którego nie wyktyto mutacji w genie ELA2/ELANE i HAX-1, ale od początku leczenia wymaga on stosunkowo duŜej dawki Neupogenu, co uwaŜane jest za zwiastun większego ryzyka transformacji w MDS/AML64,82. Podsumowanie zastosowanych metod lecznia PN W leczeniu przewlekłej neutropenii stosuje się profilaktykę antybiotykową, rekombinowany ludzki czynnik wzrostu kolonii granulocytarnych, preparaty 114 immunoglobulin, HLA- identyczne przeszczepienie macierzystych komórek krwiotwórczych - optymalnie od dawcy spokrewnionego, profilaktykę zakaŜeń bakteriami otoczkowymi w postaci szczepień ochronnych. W grupie 97 włączonych do badania dzieci zastosowano wszystkie z wymienionych metod. Próbę przewlekłego leczenia czynnikiem wzrostu kolonii granulocytarnych podjęto, zgodnie z zaleceniami SCNIR82, u dzieci z podejrzeniem neutropenii wrodzonej, łącznie u 23% badanych; kolejnych ośmioro otrzymywało lek wyłącznie doraźnie - podczas cięŜkich zakaŜeń oraz w celu przyspieszenia gojenia rozległych, bolesnych owrzodzeń w jamie ustnej. Podobnie postępowali takŜe autorzy publikacji dotyczących leczenia chorych z AIN29,48,238,239, CIN170 oraz FBN. Jedynym zaobserwowanym przez nas, istotnym klinicznie, działaniem ubocznym leku, które spowodowało przerwanie terapii u dwójki dzieci, była cięŜka małopłytkowość- powikłanie opisywane u chorych leczonych preparatami G-CSF 5,82,178,180. U części chorych, doniesieniami w 185,186,187 początkowym okresie leczenia, zgodnie z wcześniejszymi , wystąpiły bóle kostne, powiększenie śledziony, przejściowy wzrost aktywności dehydrogenazy mleczanowej lub stęŜenia kwasu moczowego. Zadowalającą odpowiedź hematologiczną uzyskano u 88%, leczonych w ten sposób, chorych. Dane SCNIR mówią o około 95% chorych uzyskujących poŜądany (>1500/µl) wzrost liczby neutrocytów podczas leczenia preparatami rHuG-CSF. NiŜszy wynik, uzyskany w grupie badanej, moŜe być następstwem jej mniejszej liczebności. W opisywanej grupie, wielkość dawki rHuG-CSF, skutecznie podnoszącej liczbę granulocytów we krwi obwodowej, zaleŜała od przyczyny PN. NajwyŜszych dawek, podobnie jak wykazał to raport SCNIR82, wymagały dzieci z SCN, choć dwie chore z tym rozpoznaniem uzyskały poŜądany wzrost ANC po zastosowaniu zaledwie 2 µg/kg/dobę247. W grupie dzieci leczonych Neupogenem, które uzyskały poprawę hematologiczną, stwierdzono zmniejszenie częstości lub całkowite ustąpienie zakaŜeń bakteryjnych. śaden, leczony w ten sposób, chory nie rozwinął cięŜkich zakaŜeń, choć istnieją prace, z których wynika, Ŝe terapia cytokinowa nie znosi całkowicie ryzyka cięŜkich powikłań infekcyjnych248. Podobnie, mimo doniesień o złamaniach patologicznych u chorych leczonych preparatami rHuG-CSF82,185,216,217, w grupie badanej, mimo dowodów na obniŜenie gęstości kośćca u 6 spośród 10 zbadanych dzieci, nie odnotowano powikłań osteopenii. Warto dodać, Ŝe w czterech przypadkach nieprawidłowy wynik densytometrii kośćca uzyskali chorzy z GSDIb, która predysponuje do rozwoju osteopenii (między innymi wskutek stosowania diety 115 niskolaktozowej i skłonności do rozwoju IBD)106, w tym jeden chory otrzymywał takŜe glikokortykosteroidy, z powodu młodzieńczego idiopatycznego zapalenia stawów. Natomiast chora z WHIM, poza terapią cytokinową, miała dodatkowe czynniki sprzyjające osteopenii w postaci zaburzeń karmienia, refluksu Ŝołądkowo-przełykowego, alergii na białko mleka krowiego oraz niedoboru masy ciała. Profilaktykę przeciwbakteryjną zalecano: wszystkim dzieciom z przewlekłą neutropenią w wieku poniŜej 12 miesiąca Ŝycia, wszystkim z PID oraz z SCN, GSDIb i CyN do czasu włączenia Neupogenu, jak równieŜ wybranym chorym z AIN/AINsusp, jeŜeli występowały u nich cięŜkie zakaŜenia (np. zapalenia płuc, posocznica, ropnie) lub nawracające zapalenia ucha środkowego. Podczas leczenia, mimo obaw zgłaszanych przez rodziców po otrzymaniu zalecenia przewlekłego podawania dziecku antybiotyku, nie zaobserwowano niepoŜądanych działań antybiotykoterapii w postaci biegunki, czy zakaŜeń grzybami z rodzaju Candida. Zastosowanie profilaktyki przeciwbakteryjnej spowodowało zmniejszenie częstości i cięŜkości zakaŜeń u 76% leczonych w ten sposób chorych. U pozostałych 24% dzieci, mimo przewlekłego podawania amoxycylliny lub TMP/SMX, obserwowano nawracające zakaŜenia, w tym takŜe cięŜkie. W grupie tej znaleźli się wszyscy chorzy z SCN, 2 z GSDIb, 2 z WHIM oraz 1 z CIN. Doniesienia zawarte w piśmiennictwie potwierdzają niewystarczającą ochronę antybiotykoterapii w przypadku pacjentów z cięŜką neutropenią uwarunkowaną genetycznie82. Nieudana próba leczenia Neupogenem pokazała takŜe cięŜkość przebiegu naturalnego SCN- 3 chorzy rozwinęli cięŜkie powikłania infekcyjne, mimo przewlekłej podaŜy antybiotyku (we wszystkich przypadkach– amoxycylliny). U pierwszego z nich doszło do powstania ropni wątroby oraz inwazyjnej aspergillozy płuc, drugi chłopiec zmarł wskutek uogólnionego zakaŜenia wywołanego przez Clostridium perfringens, trzeci rozwinął posocznicę o etiologii Pseudomonas aeruginosa. Podsumowując, naleŜy stwierdzić, Ŝe profilaktyka przeciwbakteryjna spowodowała zmniejszenie częstości oraz cięŜkości zakaŜeń bakteryjnych u wszystkich dzieci z neutropenią nabytą, natomiast jej skuteczność okazała się ograniczona w przypadku połowy chorych z cięŜką neutropenią uwarunkowaną genetycznie. Uzyskane wyniki znajdują potwierdzenie w obserwacjach innych autorów29,48,82,239. Skuteczność tego rodzaju profilaktyki wydaje się potwierdzać takŜe nawrót zapaleń ucha środkowego, który zaobserwowano u 2 dzieci z podejrzeniem AIN, po próbie odstawienia amoxycilliny w 3 roku Ŝycia, jak równieŜ kolejne gronkowcowe zakaŜenie dróg 116 łzowych z zapaleniem tkanki łącznej oczodołu u chorej z CyN, której rodzice postanowili odstawić lek w związku z poprawą kliniczną, jaką uzyskała podczas stosowania antybiotykoterapii. Chorzy z pierwotnymi niedoborami odporności, powikłanymi autoimmunizacyjną neutropenią wymagają podejścia bardziej zindywidualizowanego. W IP-CZD amoxycyllinę lub TMP/SMX zalecamy pacjentom z ALPS, jeśli prezentują cięŜką neutropenię i/lub częste (powyŜej 4 w ciągu 6 miesięcy) lub cięŜkie zakaŜenia. W przypadkach agranulocytozy rozwaŜyć naleŜy leczenie Neupogenem, pulsami z metylprednisolonu lub Rytuxymabem44. Chorzy z przewlekłą autoimmunizacyjną neutropenią w przebiegu CVID, leczeni IVIG, wymagają profilaktyki przeciwbakteryjnej jedynie w przypadku występowania cięŜkich zakaŜeń. Godną rozpatrzenia alternatywę stanowić moŜe Rytuxymab, jeŜeli kandydat do takiego leczenia nie ma cięŜkiej limfopenii CD19 43. Zgodnie z zaleceniami dla chorych z zaburzeniemi odporności nieswoistej229, szczepienia przeciwko Haemophilusowi influenzae typu B, pneumokokom oraz Neisserii meningitidis typu A i C powinny być wykonane u chorych z neutropenią przewlekłą, która usposabia do cięŜkiego, a takŜe uogólnionego przebiegu zakaŜeń bakteriami otoczkowymi. W grupie badanej zalecono je większości dzieci, a przeprowadzono u 80, nie odnotowując powaŜnych odczynów niepoŜądanych. Niektórych szczepień nie wykonano z powodu protestu lekarzy rejonowych przed szczepieniem dziecka z niedoborem odporności. Nieliczni rodzice, z powodu trudności finansowych, kupowali tylko wybrane szczepionki (głównie przeciwko pneumokokom), co miało związek z kampanią trwającą w mediach. Głosy ruchów antyszczepionkowych spowodowały odmowę dalszego szczepienia w przypadku jednego dziecka. śadne dziecko z grupy badanej, szczepione lub nie, nie rozwinęło inwazyjnego zakaŜenia wywołanego przez bakterie otoczkowe. Chorzy z AIN i prawdopodobną AIN, zaszczepieni przeciwko pneumokokom, przestawali chorować na zapalenia ucha środkowego, do czego mogło przyczynić się podanie szczepionki. U Ŝadnego chorego, nawet z cięŜką neutropenią, nie odnotowano ogólnych, ani miejscowych objawów niepoŜądanych po podaniu zaleconych szczepień, co świadczy o ich bezpieczeństwie w tej grupie chorych. Rokowanie Rokowanie u dzieci z przewlekłą neutropenią zaleŜy przede wszystkim od jednostki chorobowej, która spowodowała obniŜenie liczby granulocytów obojętnochłonnych. Jest ono powaŜne w przypadku większości wrodzonych postaci neutropenii przewlekłej (SCN, SDS, GSDIb, CyN, zespołu Bartha, PID), poniewaŜ wiąŜe się z wysokim ryzykiem cięŜkich 117 zakaŜeń bakteryjnych, a w mniejszym stopniu takŜe grzybiczych. Wg danych SCNIR zakaŜenia są wciąŜ najczęstszą przyczyną śmierci chorych z wrodzoną neutropenią82, nawet w przypadku osób leczonych preparatami G-CSF248.W grupie badanej jedno dziecko z SCN zmarło wskutek posocznicy, a pięcioro wymagało leczenia w oddziale intensywnej opieki medycznej z powodu posocznicy ze wstrząsem septycznym lub niewydolnością oddechową, przed zastosowaniem terapii G-CSF. Chłopiec z SCN, w oczekiwaniu na MUD-HSCT, rozwinął inwazyjną aspergillozę płuc i ropnie wątroby, mimo profilaktyki antybiotykowej. TakŜe transformacja nowotworowa w MDS, AML, ALL lub CML, mogą przyczynić się do śmierci chorych z SCN, SDS, FA. Z kolei chłoniaki opisano u chorych z ALPS, CVID i WHIM, natomiast gruczolakoraki wątroby występują u pacjentów z GSDIb. Wg informacji opublikowanych przez ekspertów SCNIR, nowotwory stanowią drugą pod względem częstości przyczynę zgonów pacjentów z wrodzonymi postaciami przewlekłej neutropenii82; skumulowane ryzyko wystąpienia MDS lub białaczki, po 20 latach obserwacji wynosi około 25%, natomiast po 10 latach leczenia preparatami G-CSF - około 21 % 248. Pomimo tego, trudno rekomendować leczenie przy pomocy HSCT chorym uzyskującym poprawę po rHuGCSF, skoro ryzyko transformacji nowotworowej w SCN wciąŜ nie przewyŜsza ryzyka niepowodzenia procedury przeszczepowej, nawet w przypadku uzyskania komórek macierzystych od HLA- zgodnego rodzeństwa. Wyjątek wśród neutropenii wrodzonych stanowi FBN, nie predysponująca ani do cięŜkich zakaŜeń, ani do transformacji w MDS/AML12,19. W grupie badanej nie odnotowano wystąpienia chorób nowotworowych, ale starsza siostra chorej z SCN zmarła z powodu ostrej białaczki, po rozpoczęciu leczenia Neupogenem. Rokowanie u chorych z wtórnymi postaciami PN, takimi jak AIN oraz CIN, jest zdecydowanie lepsze niŜ w postaciach wrodzonych jako, Ŝe wyjątkowo rzadko prowadzą one do zagraŜających Ŝyciu zakaŜeń bakteryjnych, a przede wszystkim nie wiąŜą się z ryzykiem transformacji nowotworowej82. Ponadto AIN jest chorobą samoogranoczająca się, po kilku lub kilkudziesięciu miesiącach dochodzi u większości dzieci do samoistnego ustąpienia neutropenii, co potwierdziło przeprowadzone badanie. NaleŜy podkreślić, Ŝe AIN jest najczęstszą postacią przewlekłej neutropenii u niemowląt i dzieci młodszych, co udowodniły poczynione przez nas obserwacje. Częstość występowania AIN w Polsce nie jest znana; chcąc w przybliŜeniu określić ją w oparciu o grupę badaną, porównano liczbę chorych z rozpoznaniem SCN (7) i CyN (5) oraz częstość występowania obu tych jednostek chorobowych, szacowaną na około 1:1000.000 Ŝywych urodzeń, z liczącą 55 dzieci grupą 118 AIN (pewną i prawdopodobną). PowyŜsze porównanie pozwala stwierdzić, Ŝe AIN występuje około 10-krotnie częściej od wymienionych postaci wrodzonej neutropenii, co pozwala przypuszczać, Ŝe prawdopodobna jest częstość występowania rzędu 1:100.000. Podobne wyniki uzyskali badacze zajmujący się AIN29,48. Przeprowadzone badania doprowadziły do sformułowania następujących wniosków: VI WNIOSKI 1. Autoimmunizacyjna neutropenia niemowląt jest najczęstszą przyczyną przewlekłej neutropenii u dzieci poniŜej piątego roku Ŝycia. Jej łagodny przebieg kliniczny jest następstwem prawidłowej produkcji dojrzałych form granulocytów obojętnochłonnych w szpiku oraz szybkiego ich uwalniania do krwi obwodowej podczas zakaŜeń. 2. Wystąpienie cięŜkich zakaŜeń u dzieci z przewlekłą neutropenią, związane jest z zahamowaniem dojrzewania granulocytów obojętnochłonnyh w szpiku na poziomie mielocyta lub cięŜką hipoplazją szeregu granulocytarnego. 3. Postępowanie diagnostyczne w przewlekłej neutropenii wymaga wykonania biopsji aspiracyjnej szpiku. Wyjątkiem od tej reguły mogą być jedynie chorzy bez cięŜkich zakaŜeń w wywiadzie, z podejrzeniem AIN lub NAIN, u których moŜna rozpocząć diagnostykę od poszukiwania w surowicy przeciwciał przeciwgranulocytarnych. 4. Badanie szpiku przy pomocy cytometrii przepływowej jest metodą diagnostyczną, komplementarną w stosunku do mielogramu oraz badań cytogenetycznych i jak wykazanoniezbędną w diagnostyce PN oraz MDS i AML, do których prowadzi. 5. U chorych z GSDIb zapadalność na zakaŜenia bakteryjne zaleŜy w większym stopniu od aktywności oksydazy NADPH, niŜ od stopnia cięŜkości neutropenii. 6. Przewlekłego leczenia rHuG-CSF wymagają dzieci z SCN, a takŜe innymi chorobami zaliczanymi do wrodzonych neutropenii, jeŜeli towarzyszą im cięŜkie zakaŜenia bakteryjne. Wobec braku odpowiedzi na leczenie rHuG-CSF, chorzy z SCN wymagają pilnego przeprowadzenia HSCT, poniewaŜ profilaktyka antybiotykowa nie zapewnia im ochrony przed rozwojem cięŜkich zakaŜeń bakteryjnych i grzybiczych. 7. Czynnikami dobrego rokowania w przebiegu przewlekłej neutropenii są: prawidłowy obraz morfologiczny szpiku, wzrost ANC w odpowiedzi na zakaŜenie, a w przypadku niemowląt i dzieci młodszych- obecność przeciwciał przeciwgranulocytarnych w surowicy. 8. Czynnikami niekorzystnej prognozy w przewlekłej neutropenii u dzieci są: zahamowanie dojrzewania układu granulocytarnego na wczesnym etapie rozwoju- promielocyta/mielocyta lub cięŜka hipoplazja linii granulocytarnej, brak wzrostu ANC powyŜej 1500/µl podczas 119 zakaŜeń bakteryjnych oraz towarzyszące zaburzenia immunologiczne (upośledzenie chemotaksji granulocytów, zaburzenia odporności komórkowej i/lub humoralnej), a takŜe brak odpowiedzi na leczenie rHuG-CSF. VII STRESZCZENIE Przewlekła neutropenia (PN) jest rzadkim, nabytym lub wrodzonym, ilościowym zaburzeniem odporności nieswoistej. Definiowana jest jako obniŜenie bezwzględnej liczby granulocytów obojętnochłonnych (ANC) poniŜej 1500 w µl, trwające przynajmniej 6 miesięcy. Najczętszą przyczyną PN nabytej jest- w skali światowej- niedoŜywienie, natomiast w krajach europejskich dominującymi czynnikami sprawczymi są leki, wirusy, związki chemiczne, promieniowanie jonizujące. PN jest takŜe głównym objawem kilku niezwykle rzadkich, uwarunkowanych genetycznie jednostek chorobowych takich, jak cięŜka wrodzona neutropenia (dawniej- agranulocytoza Kostmanna), cykliczna neutropenia (CyN), zespół Shwachmana-Diamonda (SDS), glikogenoza typu Ib (GSDIb); moŜe towarzyszyć pierwotnym niedoborom odporności (WHIM, CD40Ldef, XLA, CVID, WAS, CHS, GSII, RD), chorobom autoimmunizacyjnym (SLE, JCA) oraz wrodzonym błędom metabolizmu (MMA, IVA, PA). Postępowanie diagnostyczne wymaga badania podmiotowego ze szczególnym uwzględnieniem ekspozycji na leki i związki chemiczne, wykonania kilku morfologii krwi obwodowej z rozmazem manualnym, biopsji aspiracyjnej szpiku, a w przypadku cięŜkiej neutropenii- takŜe oznaczenia przeciwciał przeciwgranulocytarnych. U części chorych konieczne jest przeprowadzenie diagnostyki immunologicznej, reumatologicznej lub metabolicznej. Metody lecznia PN zaleŜą od ustalonego rozpoznania, cięŜkości przebiegu klinicznego oraz wieku chorego. Stosuje się profilaktykę antybiotykową, rekombinowany ludzki czynnik wzrostu kolonii granulocytarnych, przeszczepienie macierzystych komórek krwiotwórczychoptymalnie od HLA-zgodnego dawcy rodzinnego oraz szczepienia ochronne przeciwko tzw. bakteriom otoczkowym. CięŜka wrodzona neutropenia (SCN), SDS oraz niedokrwistość Fanconiego wiąŜą się ze zwiększonym ryzykiem transformacji w MDS/AML. Oddział Immunologii Instytutu-Pomnik Centrum Zdrowia Dziecka w Warszawie zajmuje się diagnozowaniem oraz leczeniem dzieci z przewlekłą neutropenią od ponad 25 lat, obejmując opieką ponad 100 pacjentów, wśród nich chorych z uwarunkowanymi genetycznie pierwotnymi niedoborami odporności i GSDIb. 120 Diagnostyka przewlekłej neutropenii, ze względu na mnogość i róŜnorodność schorzeń, które do niej prowadzą, jest często procesem Ŝmudnym, czasochłonnym i kosztownym. W oparciu o charakterystykę obrazu klinicznego chorych włączonych do badania, ocenę zastosowanego u nich postępowania diagnostycznego oraz skuteczności wdroŜonych metod leczenia, jak równieŜ na podstawie przeglądu aktualnego piśmiennictwa, w tym zaleceń ekspertów z Międzynarodowego Rejestru CięŜkiej Wrodzonej Neutropenii - SCNIR, podjęto próbę stworzenia, moŜliwych do realizacji w warunkach polskich, algorytmów diagnostycznych i terapeutycznych dla dzieci z przewlekłą neutropenią. Cele pracy: 1. Charakterystyka obrazu klinicznego przewlekłej neutropenii u dzieci, ze szczególnym uwzględnieniem autoimmunizacyjnej neutropenii niemowląt. 2. Podsumowanie wyników badań immunologicznych i hematologicznych oraz ocena ich przydatności, jako czynników prognostycznych PN u dzieci. 3. Ocena przydatności cytometrii przepływowej w diagnostyce i monitorowaniu chorych z przewlekłą neutropenią. 4. Ocena skuteczności oraz działań niepoŜądanych zastosowanych metod leczenia. 5. Propozycja algorytmu diagnostycznego i terapeutycznego dla dzieci z PN. Pacjenci i metodyka Badaniem objęto 88 dzieci, u których ustalono rozpoznanie PN w latach 1985- 2009 w Oddziale Immunologii IP-CZD oraz 9 chorych z glikogenozą typu Ib, leczonych w Klinice Chorób Metabolicznych IP-CZD. Warunkiem włączenia dziecka do grupy badanej było udokumentowane obniŜenie ANC poniŜej normy dla wieku, stwierdzone w okresie poprzedzających 6 miesięcy oraz wykluczenie wtórnej PN, z wyjątkiem AIN i CIN. Diagnostykę oparto na: ocenie liczby i stopnia dojrzałości komórek układu granulocytarnego przy pomocy mielogramu, analizie cytometrycznej fenotypu komórek hematopoezy szpikowej, badaniu przeciwgranulocytarnych, badaniach cytogenetycznym szpiku, immunologicznych i oznaczeniu innych - przeciwciał dobieranych indywidualnie. Ponadto u chorych z GSDIb, przy pomocy cytometrii przepływowej, oznaczano aktywność oksydazy NADPH w fagocytach, przed i w trakcie leczenia Neupogenem. Wyniki 121 W grupie 97 chorych, nabytą przewlekłą neutropenię zdiagnozowano u 61 (63%) pacjentów, w tym u 36 dziewczynek i 25 chłopców. Ustalono rozpoznanie AIN u 21, prawdopodobnej AIN u 34 oraz przewlekłej idiopatycznej neutropenii (CIN) u 6 dzieci. Przewlekła neutropenia, uwarunkowana genetycznie, wystąpiła u 36 (37%) pacjentów, w tym u 23 dziewczynek i 13 chłopców. W toku przeprowadzonej diagnostyki ustalono następujące rozpoznania: GSDIb wystąpiła u 9 chorych, SCN u 7, CyN u 5, SDS u 3, FBN u 5 pacjentów. U kolejnych 7 dzieci PN związana była z pierwotnym niedoborem odporności: u 4 rozpoznano WHIM, a u pozostałych 3 chłopców CD40Ldef, CVID i ALPS. Dzięki diagnostyce molekularnej, której poddano 18 dzieci, zdołano potwierdzić obecność mutacji odpowiedzialnej za wystąpienie choroby u 8 chorych. W oparciu o badania molekularne rozpoznano CyN u 3 dziewczynek i SCN u 4 chorych. We wszystkich przypadkach stwierdzono mutację w genie ELA2/ELANE; Ŝaden chory nie miał mutacji w genie HAX-1. Przy pomocy badań genetycznych potwierdzono takŜe rozpoznanie ALPS u 1 chorego oraz GSDIb u 7. W badanej grupie oceniono występowanie zakaŜeń cięŜkich i innych niŜ cięŜkie oraz wywołujące je patogeny, obecność zmian na śluzówkach jamy ustnej, a takŜe odchyleń w badaniu przedmiotowym. CięŜkie zakaŜenia (zapalenia płuc, posocznice, ropnie wątroby lub okołoodbytnicze) dotyczyły 70 (72%) chorych, a najczęstszym izolowanym patogenem był Staphylococcuc aureus. ZakaŜenia te wystąpiły u wszystkich pacjentów z SCN, GSDIb, SDS, PID oraz u większości z CyN i CIN. Nastolatek z SCN zmarł w przebiegu uogólnionego zakaŜenia wywołanego przez Clostridium perfringens. Wszystkie dzieci chorowały na zakaŜenia górnych dróg oddechowych, a 58 (59%) miało przewlekłe zapalenie dziąseł. Zapalenie przyzębia i/lub wrzodziejące zapalenie jamy ustnej wystapiły u wszystkich chorych z GSDIb, SDS, CyN i CIN oraz u prawie wszystkich z cięŜką wrodzoną neutropenią wyjątek stanowiło niemowlę z potwierdzonym genetycznie SCN. Zapalenie przyzębia pojawiało się takŜe u pojedynczych dzieci z AIN- w okresie obniŜenia ANC znacznie poniŜej 500/µl. Najczęstszym odchyleniem w badaniu przedmiotowym, jakie odnotowano w badanej grupie, było właśnie zapalenie przyzębia; często obserwowano takŜe blizny po przebytych ropniach podskórnych – odnotowano je u 32 (34%) dzieci, a takŜe przerośnięte migdałki podniebienne; wszyscy chorzy z GSDIb mieli znacznie powiększoną wątrobę. Ocenie poddano takŜe efekty i działania uboczne leczenia przy pomocy antybiotykoterapii profilaktycznej, Neupogenu, MUD-HSCT, dodatkowych szczepień ochronnych. Zastosowanie profilaktyki przeciwbakteryjnej u 52 (54%) chorych, 122 spowodowało zmniejszenie częstości (przynajmniej o 50%) i cięŜkości zakaŜeń u 40 z nich; stanowili oni 76% leczonych w ten sposób chorych. Próbę przewlekłego leczenia czynnikiem wzrostu kolonii granulocytarnych podjęto u 17 (18%) dzieci; kolejnych ośmioro otrzymywało lek wyłącznie doraźnie - podczas cięŜkich zakaŜeń oraz w celu przyspieszenia gojenia rozległych lub bolesnych owrzodzeń w jamie ustnej. Zadowalającą odpowiedź hematologiczną, w postaci wzrostu ANC powyŜej 1000/µl, uzyskało 15 chorych, co stanowiło 88% leczonych przewlekle Neupogenem. Jedynym zaobserwowanym przez nas, istotnym klinicznie, działaniem ubocznym leku, które spowodowało przerwanie terapii u 2 dzieci, była cięŜka małopłytkowość. śaden z leczonych nie rozwinął MDS ani AML. MUD-HSCT, zgodnie z zalecniami SCNIR, wykonano u chorych z SCN, którzy nie odpowiedzieli na lecznie Neupogenem. Starszy chłopiec zmarł z powodu ostrej GvHD, natomiast młodszy- obecnie 10 miesięcy po przeszczepieniu- osiągnął pełną rekonstytucję układu odporności, mimo tzw. mieszanego chimeryzmu. Przeprowadzone badania pozwoliły na sformułowanie poniŜszych wniosków: 1. Autoimmunizacyjna neutropenia niemowląt jest najczęstszą przyczyną PN u dzieci poniŜej piątego roku Ŝycia. Jej łagodny przebieg kliniczny jest następstwem prawidłowej produkcji dojrzałych form granulocytów obojętnochłonnych w szpiku oraz szybkiego ich uwalniania do krwi obwodowej podczas zakaŜeń. 2. Wystąpienie cięŜkich zakaŜeń u dzieci z PN, związane jest z zahamowaniem dojrzewania granulocytów obojętnochłonnyh w szpiku na poziomie mielocyta lub cięŜką hipoplazją szeregu granulocytarnego. 3. Postępowanie diagnostyczne w przewlekłej neutropenii wymaga wykonania biopsji aspiracyjnej szpiku. Wyjątkiem od tej reguły mogą być jedynie chorzy bez cięŜkich zakaŜeń w wywiadzie, z podejrzeniem AIN lub NAIN, u których moŜna rozpocząć diagnostykę od poszukiwania w surowicy przeciwciał przeciwgranulocytarnych. 4. Badanie szpiku przy pomocy cytometrii przepływowej jest metodą diagnostyczną, komplementarną w stosunku do mielogramu oraz badań cytogenetycznych i jak wykazano- niezbędną w diagnostyce PN oraz MDS i AML. 5. U chorych z GSDIb zapadalność na zakaŜenia bakteryjne zaleŜy w większym stopniu od aktywności oksydazy NADPH, niŜ od stopnia cięŜkości neutropenii. 6. Przewlekłego leczenia rHuG-CSF wymagają dzieci z SCN, a takŜe innymi chorobami zaliczanymi do wrodzonych neutropenii, jeŜeli towarzyszą im cięŜkie zakaŜenia 123 bakteryjne. Wobec braku odpowiedzi na leczenie rHuG-CSF, chorzy z SCN wymagają pilnego przeprowadzenia HSCT, poniewaŜ profilaktyka antybiotykowa nie zapewnia im ochrony przed rozwojem cięŜkich zakaŜeń bakteryjnych i grzybiczych. 7. Czynnikami dobrego rokowania w przebiegu PN są: prawidłowy obraz morfologiczny szpiku, wzrost ANC w odpowiedzi na zakaŜenie, a w przypadku niemowląt i dzieci młodszych- obecność przeciwciał przeciwgranulocytarnych w surowicy. 8. Czynnikami niekorzystnej prognozy w PN u dzieci są: zahamowanie dojrzewania układu granulocytarnego na wczesnym etapie rozwoju- promielocyta/mielocyta lub cięŜka hipoplazja linii granulocytarnej, brak wzrostu ANC powyŜej 1500/µl podczas zakaŜeń bakteryjnych oraz towarzyszące zaburzenia immunologiczne (upośledzenie chemotaksji granulocytów, zaburzenia odporności komórkowej i/lub humoralnej), a takŜe brak odpowiedzi na leczenie rHuG-CSF. 124 VIII SUMMARY Chronic neutropenia (CN) is a rare, acquired or congenital, disorder of innate immunity. It is defined by an absolute neutrophil count (ANC) below 1500/µl, lasting at least 6 months. Acquired CN seems to be more common and it is caused by starvation, viruses, drugs, chemical compounds, radiation and autoimmune diseases (AIN, NAIN, SLE, JCA). CN makes also a cardinal symptom of a few, extremely rare, congenital diseases such as SCN, CyN, SDS, GSDIb. It may complicate some primary immunodeficiencies and organic acidemias. SCN, SDS and FA belong to bone marrow failure syndromes and are connected with an increased risk of MDS/AML. The aims of the study were as follows: 1. Detailed characteristics of clinical course in chidren afflicted with chronic neutropenia caused by different entities, with a special interest in AIN, has been analyzed. 2. Immunologic and hematologic aberrations and their value as prognostic factors in the course of chronic neutropenia have been evaluated. 3. Introducing flow cytometry as reliable, contemporary method of evaluating bone marrow series in children with chronic neutropenia. 4. Efficacy and adverse events of introduced treatment have been analysed. 5. The proposal of diagnostic and therapeutic algorithm for children affected with chronic neutropenia has been created. Patients and methods: Since 1985, 88 children affected with CN (58 girls and 30 boys) have been diagnosed and treated in Department of Immunology and 9 patients (8 boys and a girl) with GSD1b have been cured in Department of Metabolic Disorders, Children’s Memorial Health Institute in Warsaw. The diagnostics was based on abnormal ANC noted within 6 months, peripheral blood smears, flow cytometric and cytogenetic analysis of bone marrow, antigranulocytic antibodies, assays towards viral and rheumatologic diseases. Activity of NADPH-oxidase was evaluated in patients with GSDIb, prior to implementation and in the course of treatment with rHuG-CSF. Results: We established the diagnosis of: SCN, CyN, SDS, FBN and WHIM in: 7, 5, 3, 5 and 4 children respectively. We also diagnosed 3 boys afflicted with CD40L deficiency, ALPS and CVID. Due to positive results of MAIGA, GIFT or GAT, the diagnosis of AIN was 125 confirmed in 21 children and suspected in 34 other patients with typical of AIN clinical picture and hematologic aberrations, despite negative results of above mentioned assays. After broad differential diagnostics, 6 patients were finally given the diagnosis of CIN. The diagnosis of GSDIb was established in 9 children, cured in the Department of Metabolic Disorders, and confirmed by genetic evaluation in 7. Due to molecular diagnostics, performed in 18 patients, the underlying genetic defect has been identified in 8 of them; 7 children have been found to carry the mutation of ELA2/ELANE gene and one boy presents with a mutation of FAS gene, causing ALPS type I. During observation period all children suffered from upper respiratory tract infections, 70 (72%) of them (all with SCN, GSDIb, SDS, PID, most of CyN and CIN) developed severe infections such as sepsis, pneumonia, liver or perianal abscess, pulmonary aspergillosis. A teenager, afflicted with SCN, died due to fulminant Clostridium perfingens sepsis, despite antibiotic prophylaxis. The most common aberration, found in physical examination of tested children, was chronic gingivitis (observed in 58 pts). It was seen in all children affected with GSDIb, SDS, CyN, CIN and SCN besides an infant. Patients with AIN have developed gingivitis only while having agranulocytosis. Scares located in places of abscesses have been seen in 32 children, enlargement of tonsills in 28 and hepatomegaly in 15, among them in all patients with GSDIb. Efficacy and adverse events of introduced treatment have been also evaluated. Antibiotic prophylaxis, implemented in 52 (54%) patients, decreased frequency and severity of bacterial infections in 40 (76%) of them. RHuG-CSF was ordered in 17 children and found to be effective in 15. The other 8 patients were given the drug only in case of serious infectious complications (eg. severe varicella, pneumonia) or deep and treatment- resistant ulceration of mouth. Severe thrombocytopenia has been the only clinically significant, adverse event of such a treatment, but it has forced us to ceasation of the drug. MUD-HSCT was performed in 2 boys afflicted with SCN, who had not responded to cytokine therapy. Unfortunately, the older boy died due to acute GvHD 4 weeks after the procedure. The younger one is currently 10 months after HSCT, with complete immunologic reconstitution, despite mixed donor chmerism. I have come to listed below conclusions: 1. AIN is the most frequent cause of chronic neutropenia under the age of 5 years. It proved to be a relatively mild condition, what seems to be connected with normal production, maturation and release of granulocytes from bone marrow, especially in the face of bacterial infection. 126 2. Serious infectious complications have been observed in children presenting with so-called ‘high maturration arrest’ – at the stage of promyelocyte/myelocyte, or with severe hypoplasia of granulocytic series. 3. Diagnostic management of chronic neutropenia requires bone marrow aspiration. Only children without history of severe bacterial or opportunistic infections, suspected of AIN or NAIN, may undergo assays detecting AGAbs first. 4. Flow cytometry analysis of bone marrow proved to be a very useful and objective, diagnostic method; providing complementary pieces of information to conventional bone marrow smears and cytogenetics in patients affected with chronic neutropenia. 5. In patients with GSDIb the activity of NADPH- oxidase, rather than the severity of neutropenia, seems to influence the risk of bacterial infections. 6. The chronic treatment with rHuG-CSF proved to be essential for patients with SCN and other types of congenital neutropenia, if accompanied by severe infections. Non-responders to such a treatment, if afflicted with SCN, need an urgent evaluation towards HSCT as antibiotic prophylaxis proved to be uneffective in them. 7. Good prognostic factors in chronic neutropenia are as follows: normal bone marrow smears, ANC increasing during bacterial infections and detection of AGAbs. 8. Bad prognosis in chronic neutropenia in children is connected with maturration arrest at promyelocyte/myelocyte stage or severe hypoplasia of granulocytic series, poor output of neutrophils in response to bacterial infections, accompanying immunologic defects and no response to rHuG-CSF treatment. 127 IX SPIS TABEL, RYCIN ORAZ WYKRESÓW Tabela 1 Tabela 2 Tabela 3 Tabela 4 Tabela 5 Tabela 6 Tabela 7 Tabela 8 Tabela 9 Tabela 10 Tabela 11 Tabela 12 Tabela 13 Tabela 14 Tabela 15 Tabela 16 Tabela 17 Ekspresja antygenów powierzchniowych CD w czasie granulopoezy.................................................. 13 Przyczyny przewlekłej neutropenii u dzieci ......................................................................................... 16 Defekty genetyczne we wrodzonej neutropenii (CN). .......................................................................... 21 Choroby uwarunkowane genetycznie przebiegające z neutropenią……………………………… 35 i 36 Wyniki badań molekularnych u chorych z PN...................................................................................... 53 Koktajle przeciwciał uŜyte w badaniach cytometrycznych................................................................... 56 Analiza porównawcza 2 grup chorych z AIN i prawdopodobną AIN................................................... 65 Występowanie zakaŜeń cięŜkich w grupie 97 dzieci z PN................................................................... 67 Występowanie zakaŜeń innych niŜ cięŜkie w grupie 97 dzieci z PN ................................................... 68 Nieprawidłowości stwierdzone w badaniu przedmiotowym u 97 dzieci z PN...................................... 69 Zaburzenia hematologiczne w grupie 97 chorych z PN ........................................................................ 72 Komórkowość szpiku w grupie 89 chorych z PN. ................................................................................ 77 Szereg granulocytarny w mielogramie w grupie 89 chorych z PN. ...................................................... 78 Badanie szpiku przy pomocy cytometrii przepływowej u 17 chorych z przewlekłą neutropenią. ........ 80 Przeciwciała przeciwgranulocytarne u dzieci z PN .............................................................................. 82 StęŜenie klas głównych immunoglobulin w surowicy 93 chorych z PN............................................... 83 Leczenie Neupogenem 17 dzieci z PN ................................................................................................. 90 Rycina 1 Rozwój linii granulocytarnej w szpiku. ................................................................................................... 12 Rycina 2 Ekspresja antygenów CD w przebiegu prawidłowej granulopoezy ........................................................ 14 Rycina 3 Pseudopelgeryzacja jądra neutrocyta u pacjenta z mielokateksją i WHIM.............................................. 34 Rycina 4 Dwujądrzasta pałeczka u chorej z WHIM ............................................................................................... 85 Rycina 5 Propozycja algorytmu diagnostycznego dla dzieci z PN w oparciu o AGABs i mielogram.................... 85 Rycina 6 Propozycja algorytmu diagnostycznego dla dzieci z PNw oparciu o obecność/brak zab.somatycznych...86 Rycina 7 Propozycja algorytmu lecznicznego dla chorych z niedoborem ligandu CD40 ........................................ 94 Rycina 8 Propozycja algorytmu terapeutycznego dla chorych z SCN .................................................................... 95 Rycina 9 Propozycja algorytmu terapeutycznego dla chorych z wrodzoną neutropenią inną niŜ SCN .................. 96 Wykres 1 Wykres 2 Wykres 3 Wykres 4 Wykres 5 Wykres 6 Grupy chorych z przewlekłą neutropenią ............................................................................................... 62 Odchylenia stwierdzone w badaniu przedmiotowym 97 chorych z PN.................................................. 70 Występowanie monocytozy we krwi obwodowej 97 dzieci z PN .......................................................... 73 Częstość występowania eozynofilii we krwi obwodowej 97 dzieci z PN............................................... 74 Częstość występowania leukopenii w grupie dzieci z PN ...................................................................... 75 Zaburzenia hematologiczne u dzieci z PN.............................................................................................. 76 128 X PIŚMIENNICTWO 1 Gołąb J, Jakóbisiak M, Lasek W, Stokłosa T. Główne komponenty i zasadnicze elementy odpowiedzi immunologicznej. Odporność nieswoista. w: Immunologia PWN, Warszawa 2007 2 Roitt I, Brostoff J, Male D, red. śeromski J. Immunologia PZWL, Warszawa 2008 3 Nathan Carl Neutrophils and immunity:challenges and opportunities. Nat Rev Immunology 2006; 6:173-182 4 Stachurska A. Rozwój komórek linii mieloidalnej. CMKP, Zakład Biofizyki, Warszawa 2005 5 Zsebo KM, Cohen AM, Murdock DC et al. Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor: Molecular and biological characterization. Immunobiology 1986; 172; 175-184 6 Zeman K (red) Zaburzenia odporności u dzieci. PZWL, Warszawa 2002 7 Chapel H, Haencey M, Misbak S, Snowdon N: Essentials of Clinical Immunology. Blackwell Publishing Ltd, 2006 8 Rosenzweig SD, Holland SM. Phagocyte immunodeficiencies and their infections. J Allergy Clin Immunol 2004; 113,4: 620-626 9 Jędrzejczak WW. Zagadka tworzenia krwi. Wyd. Wiedza Powszechna, Warszawa 1987 10 Hoffbrand AV, Pettit JE. Atlas hematologii Klinicznej. Wyd.Czelej, Lublin 2003 11 Rich RR, Fleisher TA, Shearer WT. w : Clinical Immunology- principles and practice. Mosby, London 2001 12 Matysiak M. Zaburzenia dotyczące układu granulocytarnego. w: Matysiak M.(red). Hematologia w praktyce pediatrycznej. Wyd. Lekarskie PZWL, Warszawa 2002, 56-59 13 Van Lochem E G, van der Velden VHJ, Wind HK et al. Immunophenotypic differentiation patterns of normal hematopoiesis in human bone marrow: reference patterns for age-related changes and disease-induced shifts. Clinical Cytometry 2004; 60B: 1-13 14 Elghetany MT. Surface antigen changes during normal neutrophilic development: a critical reviev. Blood cells, Molecules, and Diseases 2002; 28(2): 206-274 15 Dror Y, Sung L. Update on childhood neutropenia: molecular and clinical advances. Hematol Oncol Clin N Am 2004; 18:1439-1458 16 Leuzzi R, Bahegyi G, Kardon T et al. Inhibition of microsomal glucose-6-phosphate in human neutrophils results in apoptosis: a potential explanation for neutrophil dysfunction in glycogen storage disease type 1b. Blood 2003; 101(6): 2381-2387 17 Aprikyan AA, Liles WC, Park JR. Myelokathexis, a congenital disorder of severe neutropenia characterized by accelerated apoptosis and defective expression of bcl-x in neutrophil precursors. Blood 2000; 95(1): 320-327 18 Freedman MN, Alter BP Risk of myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia in congenital neutropenias. Semin Hematol 2002; 39(2): 128-133 19 Janicki K. Choroby układu białokrwinkowego. w: Hematologia, W-wa, Wyd. lekarskie PZWL, 2001 20 Kussick SJ, Wood BL. Using 4-colour flow cytometry to identify abnormal myeloid populations. Arch Pathol Lab Med 2003; 127:1140-1147 21 Stetler-Stevenson M, Arthur DC, Jabbour N et al. Diagnostic utility of flow cytometric immunophenotyping in myelodysplastic syndrome. Blood 2001; 98: 979-987 22 Lanzkovsky P. Zaburzenia w układzie białokrwinkowym.w: Hematologia i onkologia dziecięca. Wyd. Lekarskie PZWL, Warszawa 1994 23 Boxer L A. Zaburzenia układu granulocytarnego. Ped po Dypl 2003; 7(5): 52-60 24 Segel GB, Halterman JS. Neutropenia w praktyce pediatrycznej. Ped po Dypl 2009; 13(5): 47-60 25 Klaudel-Dreszler M, Irga N, Bernatowska E. Przewlekła neutropenia u dzieci- diagnostyka róŜnicowa oraz leczenie. Stand Med 2004; 12: 1300- 1306 26 Ancliff P J. Congenital neutropenia. Blood Rev 2003; 7(4): 209-216 27 Klaudel-Dreszler M, Bernatowska E. Chronic neutropenia in children-diagnostics, therapeutic management and prophylaxis. Centr Eur J Immunol 2007; 32(4): 226-233 28 Smith OP, Hann IM, Chessells JM et al. Haematological abnormalities in Shwachman-Diamond syndrome. Br J Haematol 1996; 94(2): 279-284 29 Lalezari P, Khorshidi M, Petrosowa M. Autoimmune neutropenia of infancy. J Pediatr 1986; 109: 764 –769 30 śupańska B, Uhrynowska M, Guz G, Maślanka K i wsp. The risk of antibody formation against HNA1a and HNA1b granulocyte antigens during pregnancy and its relation to neonatal neutropenia. Transf Med. 2001; 11: 377-382 31 Beaudet AL, Anderson DC, Michaels VV et al. Neutropenia and impaired neutrophil migration in type Ib glycogen storage disease. J Inherit Metab Dis 1991; 14: 305-307 32 Behrman RE, Kliegman RM, Jenson HB. Metabolic diseases. w: Nelson Textbook of Pediatrics 17th edition, Saunders 2004 33 Kelley RI, Cheatham JP, Clark BJ et al. X- linked dilated cardiomyopathy with neutropenia, growth retardation and 3- methyloglutaconicaciduria. J Pediatr 1991; 119: 738-747 129 34 Levy J, Espanol-Boren T, Thomas C et al. Clinical spectrum of X-linked hyper-IgM syndrome J Pediatr 1997; 131: 47- 54 35 Cham B, Bonilla MA, Winkelstein J. Neutropenia associated with primary immunodeficiency syndromes. Semin Hematol 2002; 39: 107- 112 36 Kozlowski C, Evans DI. Neutropenia associated with X-linked agammaglobulinemia. J Clin Pathol 1991; 44: 388- 390 37 Plo Rodriguez F, Garcia-Rodrigez MC, Ferreira-Cerdan A et al. Neutropenia as early manifestation of Xlinked agammaglobulinemia. Report of 4 pts. An Esp Pediatr 1999; 51: 235- 240 38 Irga N, Wierzba J, BroŜek J i wsp. Agammaglobulinemia sprzęŜona z chromosomem X z towarzyszącą agranulocytozą – opis przypadku. Wiad. Lek 2003, LVI, 7-8 39 Mc Vey-Ward D, Shiflet SL, Kaplan J. Chediak-Higashi syndrome: a clinical and molecular view of a rare lysosomal storage disorder. Curr Mol Med 2002; 2:469-477 40 Sanal O, Ersoy F, Tezcan I et al. Griscelli disease: genotype-phenotype correlation in an array of clinical heterogeneity. J Clin Immunol 2002; 22: 237-243 41 Klein C, Le Deist K, Griscelli C et al. Partial albinism and immunodeficiency- Griscelli syndrome. J Pediatr 1994; 125: 886-895 42 Cunningham-Rundles C, Bodian C. Common variable immunodeficiency: clinical and immunological features of 248 pts. Clin Immunol 1999; 92: 34-48 43 Notarangelo LD. Primary immunodeficiencies presenting with cytopenias. Hematology 2009:139-143 44 Sneller MC, Dale JK, Straus SE. Autoimmune lymphoproliferative syndrome. Curr Opin Rheumatol. 2003; 15: 417-421 45 Teachey DT, Manno CS, Axsom KM et al. Unmasking Evans syndrome: T-cell phenotype and apoptotic response reveal autoimmune lymphoproliferative syndrome (ALPS). Blood 2005; 105: 2443-2448 46 Schurman SH, Candotti F. Autoimmunity in Wiskott-Aldrich syndrome. Curr Opin Rheumatol. 2003; 15: 446-453 47 Milner JD, Fasth A, Etzioni A. Autoimmunity in severe combined immunodeficiency (SCID): lessons from patients and experimental models. J Clin Immunol 2008; 28: S29-S33 48 Bux J, Behrens G, Welte K. Diagnosis and clinical course of autoimmune neutropenia in infancy: analysis of 240 cases. Blood 1998; 91(1): 181-186 49 Socha J. (red) Choroby autoimmunologiczne u dzieci. seria Biblioteka pediatry. PZWL , Warszawa 2005 50 Mathew P, Chen G, Wang W. Evans syndrome: results of a national survey. J Pediatr Hematol Oncol 1997; 19(5): 433-137 51 Begemann H Hematologia praktyczna. Rozpoznanie róŜnicowe.Leczenie.Metodyka. PZWL Warszawa 1985 52 Lyall EGH, Lucas GF, Eden OB. Autoimmune neutropenia of infancy. J Clin Pathol 1992; 45:431-434 53 Lalezari P, Nussbaum M, Gelman S et al. Neonatal Neutropenia due to Maternal Isoimmunisation. Blood 1960; 15: 236-243 54 Klaudel-Dreszler M, Pietrucha B, Skopczyńska H i wsp. Przewlekła neutropenia- doświadczenia własne Oddziału Immunologii Instytutu”Pomnik-Centrum Zdrowia Dziecka” w Warszawie z lat 1985-2006. Med. Wieku Rozw 2007; XI, 2(I): 145-152 55 Klaudel-Dreszler M, Heropolitańska-Pliszka E, Pietrucha B i wsp. ZakaŜenie grzybicze chorobą sugerującą pierwotny niedobór odporności. Mikologia Lekarska 2009; 16(2): 85-89 56 Welte K, Zeidler C, Dale DC. Severe congenital neutropenia. Semin Hematol 2006;189-195 57 Fahmizad A, Chavochzadeh Z, Abdollahpour H et al. necrosis of nasal cartilage due to mucormycosis in a patient with severe congenital neutropenia due to HAX-1 deficiency. J Invest Allegol Clin Immunol 2008; 18(6): 469-472 58 Conway LT, Clay ME, Kline WE et al. Natural History of Primary Autoimmune Neutropenia of Infancy. Pediatrics 1987; 79: 728-733 59 Bruin MCA, Kr von dem Borne AEG, Tamminga RYJ. Neutrophil Antibody Specifity in Different Types of Childhood Autoimmune Neutropenia. Blood 1999; 94 (5): 1797-1802 60 Bux J. Human neutrophil alloantigens. Vox Sang 2008; 94: 277-285 61 Maślanka K, Gronkowska A, śupańska B i wsp. Alloimmunologiczna granulocytopenia noworodków wywolana przeciwciałami anty-NA1. Pol Tyg Lek 1990; 65: 38-40 62 Maślanka K, Guz K, Uhrynowska M i wsp. Isoimmune neonatal neutropenia due to anti –Fc gamma RIIIb antibody in a mother with an Fc gamma RIIIb deficiency. Transf Med 2001; 11: 111-113 63 Sulliwan CC, Fung YL, Ball JB et al. Transfusion- related acute lung injury (TRALI): Current concepts and misconceptions. Blood reviews 2009; 23: 245-255 64 Skokova J, Germeshausen M, Zeidler C et al. Severe congenital neutropenia: inheritance and pathophysiology. Curr Opin Hematol 2007; 14:22-28 130 65 Boztug K, Klein C. Novel genetic etiologies of severe congenital neutropenia. Curr Opin Immunol 2009; 21: 472-480 66 Kostmann R. Infantile genetic agrannulocytosis. A review with presentation of ten new cases. Acta Paediatr Scan 1975; 64(2): 362-368 67 Zetterstrom R. Kostmann disease- infantile genetic agranulocytosis: historical views and new aspects. Acta Ped 2002; 91(12):1279-81 & 1397-1399 68 Dale DC, Person DE, Bolyard AA et al. Mutations in the gene encoding neutrophil elastase in congenital and cyclic neutropenia. Blood 2000; 96, 2317- 2322 69 Boxer LA, Stein S, Buckley D et al. Strong evidence for autosomal dominant inheritance of severe congenital neutropenia associated with ELA2 mutations. J Pediatr 2006; 148: 633- 636 70 Devriend K, Kim AS, Mathijs et al. Constutively activating mutations in WASP causes X-linked severe congenital neutropenia. Nat Genet 2001; 27: 313- 317 71 Soylu H, Unuvar A, Ustun N et al. Congenital agranulocytosis (Kostmann’s syndrome) G-CSF therapy. Turkish J Hemat 1999; 16(4): 22- 25 72 Klein C, Grudzień M, Welte K et al. HAX1 deficiency causes autosomal recessive congenital neutropenia (Kostamann syndrome). Nat Gen 2007; 39(1): 86- 92 73 Thomas M, Jayandharan G, Chandy M. Molecular Screening of the Neutrophil Elastase Gene inCongenital Neutropenia. Indian Pediatr 2006; 43: 1081- 1084 74 Boxer L, Stein S, Buckley D et al. Strong evidence for autosomal dominant inheritance of severe congenital neutropenia associated with ELA2 mutations. J Pediatr 2006; 633- 636 75 Defraia E, Marinelli A. Oral manifestations of congenital neutropenia or Kostmann syndrome. J Clin Pediatr Dent 2001; 26: 99–102 76 Carlsson G, Fasth A. Infantile genetic agranulocytosis, morbus Kostmann: presentation of six cases from the original “Kostmann family” and a review. Acta Paediatr 2001; 90: 757- 764 77 Dale DC, Cottle TE, Fier CJ et al. Severe chronic neutropenia: treatment and follow-up of patients in Severe chronic Neutropenia International Registry. Am J Hemat 2003; 72: 82-93 78 Welte K, Boxer LA. Severe chronic neutropenia: pathophysiology and therapy. Semin Hematol 1997; 34: 267278 79 Matsubara K, Imai K, Okada S et al. Severe developmental delay and epilepsy in a Japanese patient with severe congenital neutropenia. Hematologica 2007; 92: 123- 125 80 Carlsson G, van’t Hooft I, Melin M et al. Central nervous system involvement in severe congental neutropenia: neurological and neurophysiological abnormalities associated with specific HAX1 mutations. J Int Med 2008; 264: 388- 400 81 Rivers A, Slayton WB. Congenital Cytopenias and Bone Marrow Failure Syndromes. Semin Perinat 2009; 33: 20- 28 82 Dale D, Bolyard AA, Schwinzer BG et al. Chronic Neutropenia International Registry: 10-year follow-up report. Supportive Cancer Therapy 2006; 3(4): 223- 234 83 Aprikyan AA, Liles WC, Rodger E et al. Impaired survival of bone marrow hematopietic progenitor cells in cyclic neutropenia. Blood 2001; 97(1): 147-153 84 Rothbaum R, Perrault J, Vlachos A et al. Shwachman-Diamond syndrome: Report from an international conference. J Pediatr 2002; 141: 266- 270 85 Boocock GRB, Morrison JA, Popovic M et al. Mutations in SBDS gene are associated with ShwachmanDiamond syndrome. Nat Genet 2003; 33: 97-101 86 Dror Y, Freedman NH. Shwachman-Diamond syndrome. A review. Br J Hematol 2002; 118: 701-713 87 Ginzberg H, Shin J, Ellis L et al. Shwachman syndrome: phenotypic manifestations of sibling sets and isolated cases in a large patient cohort are similar. J Pediatr 1999; 135: 81- 88 88 Mack DR Shwachman-Diamond syndrome. J Pediatr 2002; 141: 164- 165 89 Cipolli M, D’Orazio C, Delmarco A et al. Shwachman’s syndrome: pathomorphosis and long-term outcome. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1999; 29(3): 265- 272 90 Dror Y, Ginzberg H, Dalal I et al. Immune function in patients with Shwachman –Diamond syndrome. Br J Haematol 2001; 114: 712- 717 91 Kornfeld S, Kratz J, Diamond F et al. Shwachman-Diamond syndrome associated with hypogammaglobulinemia and growth hormone deficiency. J Allergy Clin Immunol 1995; 96: 247- 250 92 Thong YH. Impaired neutrophil kinesis in a patient with Shwachman-Diamond syndrome. Aust Paediatr J 1978; 14: 34-37 93 Dror Y, Freedman MH. Shwachman-Diamond syndrome: an inherited preleukemic bone marrow failure disorder with aberrant hematopoietic progenitors and faulty marrow microenvironment. Blood 1999; 94: 30483054 131 94 McLennan TW, Steinbach HL. Shwachman’s syndrome: the broad spectrum of bony abnormalities. Radiology 1974; 112: 167- 173 95 Smerling DH,Prader A, Hitzig et al. The syndrome of exocrine pancreatic insufficiency, neutropenia, metaphyseal dysostosis and dwarfism. Helv.Paediat Acta 1969; 24: 547- 575 96 Hall GW, Dale P, Dodge JA. Shwachman –Diamond syndrome: UK perspective. Arch Dis Child 2006; 91: 521-524 97 Townhend J, Clark J, Cant A et al. Congenital neutropenia. Arch Dis Child Educ Pract Ed 2008; 93:14-18 98 Woloszynek JR, Rothbaum RJ, Rawis AS et al. Mutations of the SBDS gene are present in most patients with Shwachman-Diamond syndrome. Blood 2004; 104 (12): 3588- 3591 99 Kuijpers TW, Alders M, Tool ATJ et al. Hematologic abnormalities in Shwachman-Diamond syndrome: lack of genotype-phenotype relationship. Blood 2005; 106: 356- 361 100 Mack DR, Forstner GG, Wilschanski M et al. Shwachman syndrome: exocrine pancreatic dysfunctionand variable phenotypic expression. Gastroenterology 1996; 111: 1593- 1602 101 Smith OP, Hann IM, Chessells JM. Haematological abnormalities in Shwachman-Diamond syndrome Br J Haemat 1996; 94: 279- 284 102 Woods WG, Roloff JS, Lukens JN et al. The occurrence of leukemia in patients with Shwachman syndrome. J Pediat 1981; 99: 425- 428 103 Dror Y, Freedman HM. Malignant myeloid transformation with isochromosome 7q in Shwachman-Diamond syndrome. Leukemia 1998; 12: 1591- 1595 104 Alter BP, Young NS. The bone marrow failure syndromes. In: Nathan DG, Orkin SH eds. Philadelphia, WB Saunders 1998: 276- 278 105 Chen Y-T. Glycogen storage disease. In : Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS. The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease. 8th edition; McGraw-Hill, New York 2001: 1521-1551 106 Moses SW. Historical highlights and unsolved problems in glycogen storage disease type I. Eur J Ped 2002; 161: S2-S9 107 Mayes PA. Metabolizm glikogenu. w: Murray RK, Granner DK, Mayes PA Biochemia Harpera. Wydanie IV, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 1998; 233- 242 108 Ihara K, Nomura A, Hikino S i wsp. Quantative analysis of glucose-6-phosphate translocase gene expression In various human tissues and haematopoietic cells. J Inherit Metab Dis 2000; 23: 583- 592 109 Beaudet AL., Anderson DC, Michels VVet al. Neutropenia and impaired neutrophil migration in type b glycogen storage disease. J Pediatr 1980; 97: 906- 910 110 Visser G, Rake JP, Fernandes J et al. Neutropenia, neutrophil dysfunction and inflammatory bowel disease in glycogen storage disease type Ib: results of the European Study on GSD type Ib. J Pediatr 2000; 137:187- 191 111 Kuijpers TW, Maianski NA, Tool ATJ et al. Apoptotic neutrophils in the circulation of patients with glycogen storage disease type Ib. Blood 2003; 101 (12): 5021- 5024 112 Leuzzi R, Banhegyi G, Kardon T et al. Inhibition of microsomal glucose-6-phosphate transport in human neutrophils results in apoptosis: a potential explanation for neutrophil dysfunction in glycogen storage disease type Ib. Blood 2003; 101(6): 2381- 2387 113 Roe TF, Thomas DW, Gilsanz V et al. Inflammatory bowel disease in glycogen storage disease type Ib. J Pediatr 1986; 109(1): 55- 59 114 Kannourakis G. Glycogen storage disease. Semin Hematol 2002; 39: 103- 106 115 Ament ME, Ochs MD Gastrointestinal manifestations of chronic granulomatous disease. N Engl J Med 1973; 288: 382- 387 116 Fata F, Myers P, Addeo J et al. Cyclic neutropenia in Crohn’s ileocolitis: efficacy of granulocyte colonystimulating factor. J Clin Gastroenterol 1997; 24: 253- 256 117 Shanahan F, Bernstein CN. Odd forms of inflammatory bowel disease: what can they tell us? Gastroenterology 1993; 104: 327- 329 118 Roe TF, Coates TD, Thomas DW et al. Brief report: treatment of chronic inflammatory bowel disease in glycogen storage disease type 1b with colony stimulating factors. N Engl Med 1992; 326: 1666- 1669 119 Franco LM, Krishnamurthy V, Bali D et al. Hepatocellular carcinoma in glycogen storage disease type I. J Inherit Metab Dis 2005; 28: 153- 162 120 Porter SR, Luker J, Scully et al. Oral features of a family with benign neutropenia. J Am Academ Deramatol 1994; 30: 877- 880 121 Deasey MJ, Vogel RI, Macedo-Sobrinho B et al. Familial benign chronic neutropenia with periodontal disease. J Periodontol 1980; 51: 206- 210 122 Shoenfeld Y, Modan M, Berliner S et al. The mechanism of benign hereditary neutropenia. Arch Intern Med 1982; 142: 797- 799 132 123 Notarangelo L.D, Hayward AR. X-linked immunodeficiency with hyper-IgM (XHIM). Clin Exp Immunol 2000; 120: 399- 405 124 Levy J, Espanol-Boren T, Notarangelo LD et al. Clinical spectrum of X-linked hyper-IgM syndrome. J Pediatr 1997; 131: 47-54 125 Kryteria diagnostyczne CD40Ldeficiency dostępne na stronie ESID: www.esid.com 126 Harward AR, Levy J, Facchetti et al. Cholangiography and tumors of the pancreas, liver and biliary tree in boys with X-linked immunodeficiency with Hyper-IgM. J Immunol 1997; 158: 977- 983 127 Mori M, Nonoyama S, Neubauer M et al. Mutation analysis and therapeutic response to granulocyte colonystimualting factor in a case of hypergammaglobulin M syndrome with chronic neutropenia. J Pediatr Oncol 2000; 22: 288- 289 128 Zueler WW. Myelokathexis – a new form of chronic granulocytopenia. Case report. N Engl J Med 1964; 270: 699- 704 129 Wetzler M, Talpaz M, Kleinerman ES et al. A new familial immunodeficiency disorder characterized by severe neutropenia a defective marrow release mechanism and hypogammaglobulinemia. Am J Med 1990; 89: 663- 672 130 Kawai T, Choi U, Whiting-Theobald NL et al. Enhaced function with decreased internalization of carboxyterminus truncated CXCR4 responsible for WHIM syndrome. Exp Hematol 2005; 33(4): 460- 468 131 Tarzi MD, Jenner M, Hattotuwa K et al. Sporadic case of warts, hypogammaglobulinemia, immunodeficiency and myelokathexis syndrome. J. Allergy Clin. Immunol 2005; 116: 1101- 1105 132 Gulino AV, Moratto D, Sozzani S et al. Altered leukocyte response to CXCL12 in patients with warts hypogammaglobulinemia, infections, myelokathexis (WHIM) syndrome. Blood 2004; 104: 444- 452 133 Gulino AV. WHIM syndrome: a genetic disorder of leukocyte trafficking. Curr Opin Allerrgy Clin Immunol 2003; 3: 443- 450 134 Diaz GA. CXCR4 mutations in WHIM syndrome: a misguided immune system. Immunol Rev 2005; 203: 325- 243 135 Chae K M, Ertle J O, Tharp M D. B-cell lymphoma in patient with WHIM syndrome. J Am. Acad Dermatol 2005; 44: 124- 128 136 Imashuku S, Miyagawa A, Chiyonobu T et al. Epstein-Barr virus associated T- lymphoproliferative disease with hemophagocytic syndrome followed by fatal intestinal B lymphoma in young adult female with WHIM syndrome. Ann Hematol 2002; 81: 470- 473 137 Hernandez P A, Gorlin R J, Lukens J N et al. Mutations in the chemokine receptor gene CXCR4 are associated with WHIM syndrome a combined immunodeficiency disease. Nat Genet 2003; 34: 70- 74 138 Siedlar M, Rudzki Z, Strach M et al. Familial occurrence of wharts, hypogammaglobulinemia, infections, and myelokathexia (WHIM) syndrome. Arch Immunol Ther Exp 2008; 56: 419- 425 139 Kawai T, Malech HL. WHIM syndrome: congenital immune deficiency disease. Curr Opin Hematol 2009; 16: 20- 26 140 Cernelc P, Andoljsek D, Mlakar U et al. Effects of molgramostim, filgrastim and lenograstim in the treatment of myelokathexis. Pflugers Arch 2000; 440:R81– R82 141 Aprikyan AAG, Liles WC,Park JR et al. Myelokathexia, a congenital disorder of severe neutropenia characterized by accelerated apoptosis and defective expression of bcl-x in neutrophil precursors. Blood 2000; 95(1): 320- 327 142 Rieux-Laucat F, Le Deist F, Hivroz C et al. Mutations in Fas associated with human lymphoproliferative syndrome and autoimmunity. Science 1995; 268: 1347- 1349 143 Dianzani U, Bragardo M, DiFranco D et al. Deficiency of the Fas apoptosis pathway without Fas gene mutations in pediatric patients with autoimmunity/lymphoproliferation. Blood 1997; 89: 2871- 2879 144 Wang J, Zheng L, Lobito A et al. Inherited human caspase 10 mutations underlie defective lymphocyte and dendritic cell apoptosis in autoimmune lymphoproliferative syndrome type II. Cell 1999; 98: 47- 58 145 Chun HJ, Zheng L, Ahmad M et al. Pleiotropic defects in lymphocyte activation caused by caspase-8 mutations lead to human immunodeficiency. Nature 2002; 419: 395- 399 146 Su HC, Lenardo MJ. Genetic defects of apoptosis and primary immunodeficiency. Immunol Allergy Clin North Am 2008; 28: 329- 351 147 Magerus-Chatinet A, Stolzenberg MC, Loffredo MS et al. FAS-L, IL-10, and double-negative CD4- CD8TCR alpha/beta+ T cells are reliable markers of autoimmune lymphoproliferative syndrome (ALPS) associated with FAS loss of function. Blood 2009; 113: 3027- 3030 148 Bristeau-Leprince A, Mateo V, Lim A et al. Human TCR alpha/beta+ CD4-CD8- double-negative T cells in patients with autoimmune lymphoproliferative syndrome express restricted Vbeta TCR diversity and are clonally related to CD8+ T cells. J Immunol 2008; 181: 440- 448 149 Bleesing J, Strauss S, Fleisher T. Autoimmune lymphoproliferative syndrome. Ped Clin North Amer 2000; 47(6): 1- 18 133 150 Kwon SW, Procter J, Dale JK et al. Neutrophil and platelet antibodies in autoimmune lymphoproliferative syndrome. Vox Sang 2003; 85: 307- 312 151 Fleisher TA. The autoimmune lymphoproliferative syndrome: an experiment of nature involving lymphocyte apoptosis. Immunol Rev 2008; 40: 87- 92 152 Rieux-Laucat F, Le Deist F, Fischer A. Autoimmune lymphoproliferative syndromes: genetic defects of apoptosis pathways. Cell Death Differ 2003; 10: 124- 133 153 Teachey DT, Manno CS, Axsom KM et al. Unmasking Evans syndrome: T-cell phenotype and apoptotic response reveal autoimmune lymphoproliferative syndrome (ALPS). Blood 2005; 105: 2443- 2448 154 Pac M, Bernatowska E, Piotrowska-Jastrzębska J. Autoimmunizacyjny zespół limfoproliferacyjny u chłopca z mutacją genu Fas/CD95. Nowa Ped 2003; Vol 1, No 32: 20- 23 155 Notarangelo LD Primary immunodeficiencies (PIDs) presenting with cytopenias. Hematology 2009: 139- 143 156 Chapel H, Lucas M, Lee M et al. Common variable immunodeficiency disorders: division into distinct clinical phenotypes. Blood 2008; 112: 277- 286 157 Brandt D, Gershwin ME. Common variable immune deficiency and autoimmunity. Autoimmun Rev 2006; 5: 465- 470 158 Cunningham-Rundles C. Autoimmune manifestations in common variable immunodeficiency. J Clin Immunol 2008; 28: S42- S45 159 Knight AK, Cunningham-Rundles C. Inflammatory and autoimmune complications of common variable immune deficiency. Autoimmun Rev 2006; 5: 156- 169 160 Lopes-da-Silva S, Rizzol V. Autoimmunity in common variable immunodeficiency. J Clin Immunol 2008; 28: S46- S55 161 Genre J, Errante PR, Kokron CM. Reduced frequency of CD4(+)CD25(HIGH)FOXP3(+) cells and diminished FOXP3 expression in patients with common variable immunodeficiency: a link to autoimmunity? J Clin Immunol 2009; 132: 215- 221 162 Fevang B, Yndestad A, Sandberg WJ et al. Low numbers of regulatory T cells in common variable immunodeficiency: association with chronic inflammation in vivo. Clin Exp Immunol 2007;147: 521- 525 163 Warnatz K, Wehr C, Drager R et al. Expansion of CD19(hi)CD21(lo/neg) B cells in common variable immunodeficiency (CVID) patients with autoimmune cytopenia. Immunobiology 2002; 206: 502- 513 164 Zhang L, Radigan L, Salzer U et al. Transmembrane activator and calcium-modulating cyclophilin ligand interactor mutations in common variable immunodeficiency: clinical and immunologic outcomes in heterozygotes. J Allergy Clin Immunol 2007; 120: 1178- 1185 165 Barth PG, Wanders RJ, Vreken P. X-linked cardioskeletal myopathy and neutropenia (Barth syndrome). J Pediatr 1999; 135: 273- 6 166 Bione S, D’Adamo P, Maestrini E et al. A novel X-linked gene, G4.5 is responsible for Barth syndrome. Nat Genet 1996; 12: 385- 389 167 Barth PG, Scholte HR, Berden JA et al. An X-linked mitochondrial disease affecting cardiac muscle, skeletal muscle and neutrophil leucocytes. J Neurol Sci 1983: 62: 327- 355 168 Kyle RA. Natural history of chronic idiopathic neutropenia. N Engl J Med 1980; 302: 908-909 169 Papadaki HA, Xylouri I, Coulocheri S et al. Prevalence of chronic idiopathic neutropenia of adults among an apparently healthy population living on the island of Crete. Ann Hematol 1999; 78: 293- 297 170 Dale DC. Immune and idiopathic neutropenia. Curr Opin Hematol 1998; 5: 33- 36 171 Papadaki HA, Chatzivassili A, Stefanaki K et al. Morphologically defined myeloid cell compartments, lymphocyte subpopulations, and histological findings of bone marrow inpatients with nonimmune chronic idiopathic neutropenia of adults. Annals of Hematology 2000; 79: 563- 570 172 Papadaki HA, Eliopoulos DG, Valatas V et al. Anemia of chronic disease is the most frequent type of anemia seen in patients with chronic idiopathic neutropenia of adults. Annals of Hematology 2001; 80: 195- 200 173 Papadaki HA, Eliopoulos AG, Kosteas T et al. Impaired granulopoiesis in patients with chronic idiopathic neutropenia is associated with increased apoptosis of bone marrow myeloid progenitor cells. Blood 2003; 101: 2591- 2600 174 Papadaki HA, Stamatopoulos K, Damianaki A et al. Activated T-lymphocytes with myelosuppresive properties in patients with chronic idiopathic neutropenia. Br J Haematol 2005; 128: 863- 876 175 Welte K, Zeidler C, Reiter A. Differential effects of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and granulocyte colony-stimulating factor in children with severe congenital neutropenia. Blood 1990; 75, 10561063 176 Zeidler C, Boxer L, Dale DC. Management of Kostmann syndrome in the G-CSF era. Br J Haematol 2000; 109: 490- 495 177 Barrett AJ, Griscelli C, Buriot D et al. Lithium therapy in congenital neutropenia. Lancet 1977; 2: 1357- 1358 178 Welte K, Bonilla MA, Gillio AP et al. Recombinant human G-CSF: Effects on hematopoiesis in normal and cyclophosphamide treated primates. J Exp Med 1987; 165: 941- 948 134 179 Morstyn G, Souza L, Keech J et al. Effect of granulocyte colony-stimulating factor on neutropenia induced by cytotoxic chemotherapy. Lancet 1988; 1: 667- 672 180 Jędrzejczak WW, Podolak-Dawidczak M (red) Cytokiny-zastosowanie kliniczne. Volumed, Wrocław 1997 181 Chybicka A, Sawicz-Birkowska K (red) Onkologia i hematologia dziecięca. PZWL, Warszawa 2009 182 Duhrsen U, Villeval JL, Boyd J et al. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on hematopoietic progenitor cells in cancer patients. Blood 1988; 72: 2074- 2081 183 Bonilla MA, Gillo AP, Ruggeiro M et al. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on neutropenia in patients with congenital agranulocytosis. N Eng J Med 1989; 320: 1574- 1589 184 Boxer LA,Hutchinson R, Emerson E. Recombinant human granulocyte colony- stimulating factor in the treatment of patients with neutropenia. Clin Immunol Immunopathol 1992; 62: S39- S46 (supl) 185 Dale DC, Bonilla MA, Davis R et al. A randomized controlled phase III trial of recombinant human G-CSF for treatment of severe chronic neutropenia. Blood 1993; 81: 2496- 2502 186 Donadieu J, Boutard P, Bernatowska E et al. A European phase II study of recombinat human granulocyte colony-stimulating factor (rHuG-CSF; Lenograstim) in the treatment of severe chronic neutropenia in children. Eur J Pediatr 1997; 156: 693- 700 187 Imashuku S, Tsuchida M, Sasaki M et al. Recominant human granulocyte-colony-stimulating factor in the treatment of patients with chronic benign granulocytopenia and agranulocytosis (Kostmann’s syndrome). Acta Paediatr 1992; 81(2): 133-136 188 Zeidler C, Schwinzer B, Welte K. Severe congenital neutropenia: trends in diagnosis and therapy. Klin Padiatr 2000; 212(4): 145- 152 189 Bonilla M, Gillio A, Ruggeiro M et al. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on neutropenia in patients with congenital agranulocytosis. N Eng J Med 1989; 320: 1574- 1580 190 Freedman MH. Safety of long-term administration of granulocyte colony-stimulating factor for severe chronic neutropenia. Curr Opin Hematol 1997; 4: 217- 224 191 Schroten H, Roesler J, Breidenbach T et al. G-CSF and GM-CSF for treatment of neutropenia in glycogen storage disease type 1b. J Pediatr 1991; 119: 748- 754 192 Souza L, Boone T, Gabrilove J et al. Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor: effects on normal and leukemic myeloid cells. Science 1986; 232: 61- 65 193 McCawley LJ, Korchak HM, Douglas SD et al. In vitro and in vivo effects of granulocyte-stimulating factor on neutrophils in glycogen storage disease type 1b: granulocyte colony-stimulating factor therapy corrects the neutropenia and the defects in respiratory burst activity and Ca2+ mobilization. Ped Research 1994; 35: 84- 90 194 Jayabose S, Tugal O, Sandoval C et al. Recombinant human granulocyte colony stimulating factor in cyclic neutropenia: use of a new 3-day-a-week regimen. Am J Pediatr Hemat Oncol 1994; 16: 338- 340 195 Hammond WP, Price TH, Souza LM et al Treatment of cyclic neutropenia with granulocyte colony stimulating factor. N Engl J Med 1992; 320: 1306- 1311 196 Ishiguro A , Nakahata T, ShimboT et al. Improvement of neutropenia and neutrophil dysfunction by granulocyte colony-stimulating factor in a patient with glycogen storage disease type Ib. Eur J Pediatr 1993; 152: 18- 20 197 Calderwood S, Kilpatrick L, Douglas S D et al. Recombinant human granulocyte colony- stimulating factor therapy for patients with neutropenia and/or neutrophil dysfunction secondary to glycogen storage disease type 1b. Blood 2001; 97(2): 376- 382 198 Weston B, Axtell RA, Todd RF 3rd et al. Clinical and biologic effects of granulocyte colony stimulating factor in the treatment of myelokathexis. J Pediatr 1991; 118: 229- 234 199 Cernelc P, Andoljsek D, Mlakar U et al. Effects of molgramostim, filgrastim and lenograstim in the treatment of myelokathexis. Pflugers Arch 2000; 440: R81- R82 200 Wang WC, Cordoba J, Infante AJ et al. Successful treatment of neutropenia in the hyperimmunoglobulin M syndrome with granulocyte colony-stimulating factor. Am J Pediatr Hematol Oncol 1994; 16: 160- 163 201 Zeidler C, Barth PG, Bonilla MA et al. Neutropenia in Barth syndrome: clinical course and treatment of neutropenia. Blood 2001; 98: 300 (abstract) 202 Dror Y, Durie P, Ginzberg H et al. Clonal evolution in marrows of patients with Shwachman-Diamond syndrome: a prospective 5-year follow-up study. Exp Hematol 2002; 30(7): 659- 669 203 Alter BP, Greene MH, Velzquez I et al. Cancer in Fanconi anaemia. Blood 2003; 101(5): 2072- 2082 204 Gilman P, Jackson D, Guild H Congenital agranulocytosis: prolonged survival and terminal acute leukemia. Blood 1970; 36: 576- 585 205 Rosen R, Kang S. Congenital agranulocytosis terminating in acute myelomonocytic leukemia. J Pediatr 1979; 94: 406- 408 206 Rosenberg PS, Alter BP, Bolyard AA et al. Severe Chronic Neutropenia International Registry. The incidence of leukemia and mortality from sepsis in patients with severe congenital neutropenia receiving long-term G-CSF therapy. Blood 2006; 107: 4628- 4635 135 207 Bernard T, Gale R, Evans J et al. Mutations of the granulocyte colony-stimulating factor receptor in patients with severe congenital neutropenia are not required for transformation to acute myeloid leukaemia and may be a bystander phenomenon. Br J Haematol 1998; 101: 141- 149 208 Dong F, Russel KB, Tidow N et al. Mutations in the gene for the granulocytecolony stimulating factor receptor in patients with acute myeloid leukemia preceded by severe congenital neutropenia. N Engl J Med 1995; 333: 487- 493 209 Cassinat B, Bellanne -Chantelot C, Notz-Carrere A et al. Screening for G-CSF receptor mutations in patients with secondary myeloid or lymphoid transformation of severe congenital neutropenia. A report from the French neutropenia register. Leukemia 2004; 18: 1553- 1555 210 Germeshausen M, Schulze H, Kratz C et al. An acquired G-CSF receptor mutation results in increased proliferation of CMML cells from a patient with severe congenital neutropenia. Leukemia 2005; 19: 611- 617 211 Germeshausen M, Ballmaier M, Schulze H et al. Granulocyte colony stimulating factor receptor mutations in a patient with acute lymphoblastic leukemia secondary to severe congenital neutropenia. Blood 2001;97:829-830 212 Dale DC, Cottle TE, Fier CJ et al. Severe chronic neutropenia: treatment and follow-up of patients in Severe Chronic Neutropenia International Registry. Am J Hemat 2003; 72: 82- 93 213 Limmer J, Fleig WE, Leupold D et al. Hepatocellular carcinoma in type I glycogen storage disease. Hepatology 1988; 8: 531- 537 214 Auner HW, Klintschar M, Crevenna R et al. Two case studies of chronic idiopathic neutropenia preceding acute myeloid leukemia. Br J Haematol 1999; 105: 431- 433 215 Yakisan E, Schirg E, Zeidler, C et al. High incidence of significant bone loss in patients with severe congenital neutropenia (Kostmann's syndrome). J Pediatr 1997; 131: 592- 597 216 Simon M, Lengfelder E, Reiter S et al. Osteoporosis in severe congenital neutropenia: inherent to the disease or a sequela of G-CSF treatment ? Am J Hematol 1996; 52: 127 217 Bishop NJ, Williams DM, Compston JC et al. Osteoporosis in severe congenital neutropenia treated with granulocyte colony-stimulating factor. Br J Haematol 1995; 89: 927- 928 218 Putsep K, Carlsson G, Boman HG et al. Deficiency of antibacterial peptides in patients with morbus Kostmann: an observation study. Lancet 2002; 360(12): 1144- 1149 219 Teachey DT, Greiner R, Seif A et al. Treatment with sirolimus results in complete responses in patients with autoimmune lymphoproliferative syndrome. Br J Haematol 2009;145: 101- 106 220 Chapel H, Cunningham-Rundles C. Update in understanding common variable immunodeficiency disorders (CVIDs) and the management of patients with these conditions. Br J Haematol 2009; 145: 709- 727 221 Dror Y, Ward AC, Touw IP et al. combined corticosteroid /granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) therapy in the treatment of severe congenital neutropenia unresponsive to G-CSF. Activated glucocorticoid receptors synergize with G-CSF signals. Exp Hematol 2000; 28: 1381- 1389 222 Bussel J, Lalezari P, Fikrig S. Inravenous treatment with gamma globulin of autoimmune neutropenia of infancy. J Pediatr 1988; 112: 298- 301 223 Zeidler C, Welte K, Barak Y et al. Stem cell transplantation in patients with severe congenital neutropenia without evidence of leukemic transformation. Blood 2000; 95: 1195- 1198 224 Choi SW, Boxer LA, Pulsipher MA et al. Stem cell transplantation in patients with severe congenital neutropenia with evidence of leukemic transformation. Bone Marrow Transplant 2005; 35: 473- 477 225 EBMT guidelines for haematopietic stem cell transplantation for primary immunodeficiencies. Paris 2004. www.ebmt.org 226 Wolska-Kuśnierz B. praca doktorska pt: Ocena wyników leczenia i rekonstytucji układu immunologicznego u pacjentów z pierwotnymi niedoborami odporności po przeszczepieniu macierzystych komórek krwiotwórczych. Warszawa 2008 227 Donadieu J, Michel G, Merlin E et al. Hematopoietic stem cell transplantation for Shwachman-Diamond syndrome: experience of the French neutropenia registry. Bone Marrow Transplant 2005; 36: 787- 792 228 Vibhakar R, Radhi M, Ruelhart S et al. Successful unrelated umbilical cord blood transplantation in children with Shwachman-Diamond syndrome. Bone Marrow Transplant 2005; 36: 855- 861 229 Bernatowska E.(red) Profilaktyka chorób zakaźnych w stanach zaburzonej odporności. Stand Med. 2008; suplement; 34, 10 230 Kryteria rozpoznania pierwotnych niedoborów odporności. Strona ESID: www.esid.com 231 Bux J, Kober V, Kiefel V, Mueller-Eckhardt C. Analysis of granulocyte- reactive antibodies using an immunoassay based upon monoclonal-antibody-specific immobilization of granulocyte antigens. Transf Med. 1993; 3: 157- 162 232 Vergheugt FWA, von dem Borne AEG, Decary F et al. The detection of granulocyte alloantibodies with an indirect immunofluorescence test. Br J Haematol 1997; 36, 533- 544 136 233 Lalezari P, Jang A, Lee S. A microagglutination technique for the detection of leukocyte agglutinins. In: Manual of Tissue Typing Techniques, NIH Publication, 1979; 80-545 (Ray J.G.ed.) National Institute of Health, Rockville 234 Brojer E, Uhrynowska M, Drzewek K i wsp. Serological and genetic analysis of the frequency of NA antigen on human granulocytes. Acta Haematol Pol 1997; 28, 155- 162 235 Gregorek H, Imielska D, Gornicki J et al. Development of IgG subclasses in healthy Polish children. Arch Immunol Ther Exp 1994; 42: 377- 382 236 Commans-Bitter W, de Grott R, van der Beemd R et al. Immunophenotyping of blood lymphocytes in childhood. Reference values for lymphocyte subpopulations. J Pediatr 1997; 138: 388- 393 237 Strona internetowa SCNIR: www.scnir.com 238 Pincus SH, Boxer LA, Stossel TP. Chronic neutropenia in childhood: Analysis of 16 cases and review of the literature. Am J Med 1976; 61: 849- 861 239 Jonsson OG, Buchanan GR. Chronic Neutropenia During Childhood. A 13-year Experience in a Single Institution. AJDC 1991; 145: 232- 235 240 Noordzij JG. Genotypic and Phenotypic Aspects of Primary Immunodeficiency Diseases of the Lymphoid System. Rotterdam 2002 241 Muller LUW, Williams DA. Finding the needle in the hay stock: hematopoietic stem cells in Fanconi anemia. Mutation Research 2009; 668: 141- 146 242 Matsubara K, Omori K, Baba K. Acute coalescent mastoiditis and acustic sequele in an infant with severe congenital neutropenia. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 2002; 62: 63- 67 243 Shoenfeld Y, Modan M, Berliner S et al. The mechanism of benign hereditary neutropenia. Arch Intern Med 1982; 142: 797- 799 244 Saabe LJM, Class FHJ, Langerak J et al. Group-specific autoimmune antibodies directed to granulocytes as a cause of chronic benign neutropenia in infants. Acta Haematol 1982; 68: 20- 27 245 Arnoulet C, Bene MC, Durrieu F et al. Four- and Five- Colour Flow Cytometry Analysis of Leukocyte Differentiation Pathways in Normal Bone Marrow: A reference Document Based on a Systemic Approach by the GTLLF and GEIL. Clin Cytometry 2010; 78B: 3- 10 246 Matarraz S, Lopez A, Barrena S et al. Bone Marrow cells from Myelodysplastic Syndromes Show Altered Immunophenotypic Profiles That May Contribute to the Diagnosis and Prognostic Stratification of the Disease: a Pilot Study on A Series of 56 Patients. Clin Cytometry 2010; 78B: 154- 168 247 Skopczyńska H, Litwin J, Rump Z i wsp. Wpływ leczenia rekombinowanym czynnikiem wzrostu kolonii granulocytarnych na przebieg zakaŜeń u dzieci z cięŜką przewlekłą wrodzoną neutropenią. Klinika 1995;8:65-67 248 Rosenberg PS, Alter BP, Bolyard AA et al. The incidence of leukemia and mortality from sepsis in patients with severe congenital neutropenia receiving long-term G-CSF therapy. Blood 2006; 107(12):4628- 4635 137
