Microsoft Word - PNM 93
advertisement
Post. Nauk Med., 1993, t. VI, 37-39 Ewa Zbrojkiewicz, Janusz S. Zbrojkiewicz, Sławomir Graff, Andrzej Głąbiński, Artur Kozłowski Zastosowanie hodowli komórek wyizolowanych z płynu mózgowo-rdzeniowego w cytodiagnostyce neurologicznej II Katedra i Zakład Patofizjologii Śl. AM w Katowicach Kierownik: prof. dr hab. n. med. F. Zych I Katedra i Klinika Neurologii Śl. AM w Katowicach Kierownik: prof. dr hab. n. med. A. Wajgt Oddział Neurologiczny Centralnego Szpitala Górniczego w Katowicach Ordynator: prof. dr hab. n. med. Z. Kazibutowska Zakład Farmakologii Śl. AM w Katowicach Kierownik: prof. dr hab. n. med. H.l. Trzeciak Streszczenie Przedstawiono próby zastosowania hodowli in vitro komórek wyizolowanych z płynu mózgowo-rdzeniowego w cytodiagnostyce neurologicznej. Powyższą metodykę użyto w celu potwierdzenia rozpoznania nowotworów ośrodkowego układu nerwowego lub oceny ich wrażliwości w celowanej chemioterapii. Wiarygodność uzyskiwanych wyników polegała na możliwości namnażania i identyfikacji komórek nowotworowych. W identyfikacji komórek nowotworowych wykorzystano kryteria podane przez Barkera i Stanforda lub zmodyfikowaną skalę Papanicolaou. Nowszą metodą rozpoznawania komórek była ich identyfikacja immunocytochemiczna z zastosowaniem przeciwciał monoklonalnych. Wykazano istotną wyższość opisanych metod z zastosowaniem hodowli komórek nad bezpośrednimi metodami cytologicznymi w cytodiagnostyce neurologicznej. Pleocytoza płynu mózgowo-rdzeniowego (pmr) towarzyszy wielu chorobom ośrodkowego układu nerwowego. Znajdujące się w nim komórki pochodzą nie tylko ze ścian przestrzeni płynowych, lecz także z przestrzeni okołonaczyniowych Virchowa-Robina (4). Pojawienie się dodatkowej liczby komórek często wiąże się z uszkodzeniem bariery krew-mózg. Pierwsze badania dotyczące hodowli komórek wyodrębnionych z pmr pochodziły z lat sześćdziesiątych obecnego stulecia (4, 5, 9, 10, 17). Były to prace Lumsdena (1960) i Sayka (1966), a polegały na próbie hodowania komórek nowotworowych. Muller i wsp. (1967, 1970, 1971) zmodyfikowali dotychczasowe warunki prowadzenia hodowli, wprowadzając sposoby intensywnego namnażania komórek w warunkach in vitro. Powyższe udoskonalenie, jak możliwość zagęszczania pmr, uwiarygodniło ocenę cytologiczną nawet przy nieznacznej pleocytozie. W związku z tym zwiększył się stopień prawdopodobieństwa znalezienia nawet nielicznych komórek nowotworowych (18). Dla potwierdzenia cytochemicznej tożsamości komórek wymagane było wykonanie kilku odczynów barwnych, a następstwie czego wyłoniła się konieczność dysponowania jeszcze większą liczbą komórek. Dlatego w dalszym ciągu udoskonalano metodę ich namnażania i wzrostu w hodowli in vitro (1, 2,4, 5, 7, 9, 11, 14, 17). Istnieją różne możliwości wykorzystania hodowli komórkowej w cytodiagnostyce neurologicznej, a mianowicie: 1. Możliwość uzyskania znacznej liczby komórek do przeprowadzenia wybiórczych odczynów histochemicznych. 2. Możliwość potwierdzenia wzrostu nowotworowego przy jednoczesnym przeciwwskazaniu do wykonania biopsji mózgu. 3. Możliwość określenia wrażliwości lekowej w indywidualnej i celowanej chemioterapii przeciwnowotworowej. 4. Możliwość wewnątrzkomórkowej replikacji antygenów wirusowych w niektórych neuroinfekcjach. Dotychczas opracowano różne sposoby zagęszczania komórek z pmr (1, 2, 4, 5, 7, 9, 11, 14, 17). Najczęściej pmr poddaje się powolnemu odwirowaniu, w celu uzyskania „wzbogaconego koncentratu komórkowego." Następnie przenosi się komórki do płynu odżywczego. Zagęszczanie w metodzie Sayka (4, 18) polega na zastosowaniu komory sedymentacyjnej skonstruowanej przez autora. Namnażanie komórek z pmr nie jest zabiegiem trudnym technicznie, pod warunkiem zachowania jałowości w czasie całego cyklu hodowlanego. Najczęściej używanym podłożem jest pożywka Eagle'a (MEM) z dodatkiem surowicy cielęcej w stężeniach 5-20% (1,2, 5, 7, 11). Jałowo pobrany materiał komórkowy umieszcza się w szklanych lub plastykowych naczyniach hodowlanych, np. w rurkach Leightona (1, 2, 7. 17), butelkach Brockwaya (17) lub na szkiełkach nakrywkowych umieszczonych na szalkach Petriego (1, 6). Całość inkubuje się w temperaturze 37°C, w atmosferze zawierającej 95% powietrza i 5% C02 (1, 4, 6, 14). Poprzez regulowany dopływ powyższej mieszaniny gazów uzyskuje się optymalną wartość pH niezbędną do wzrostu i namnażania się komórek w płynie odżywczym. Często stosuje się prostsze techniki polegające na namnażaniu komórek w zamkniętym naczyniu z pożywką (2, 5, 7, 17). Istnieją takie bardziej złożone metody inkubacji, które niezależnie od dopływu egzogennego C02 wymagają zastosowania roztworów buforowych lub związków chemicznych umożliwiających komórkom zwiększoną syntezę endogennego C02, np. pirogronianu sodu (1). Stosuje się również inne podłoża, np. płyn Eagle'a w modyfikacji Dulbecco (DMEM), podłoże Pucka, a nawet naturalny płyn mózgowo-rdzeniowy (1,17). Czas potrzebny do namnożenia się komórek o optymalnej liczbie przeciętnie wynosi 6-12 dni. Na uwagę zasługuje technika namnażania komórek nowotworowych opisana przez Sano i wsp. (7, 18). Autorzy zastosowali filtry membranowe typu Millipore jako podłoża do wzrostu komórek. Stwierdzili nie tylko znaczny stopień namnażania się komórek, lecz również ich rozprzestrzenianie się na sąsiednie powierzchnie szklanego naczynia. Oczywiście u podstaw tej i innych metod leży wyjątkowa zdolność komórek nowotworowych do proliferacji. Jednak należy zaznaczyć, że wśród komórek występujących w pmr spotyka się wiele komórek atypowych i zidentyfikowanie nowotworu 38 nie jest sprawą łatwą. Dodatkowym utrudnieniem jest zjawisko „maskowania się" komórek nowotworowych w wypadku występowania niewielkiej ich liczby przy równoczesnej znacznej pleocytozie. Barker i Stanford (2) podali kryteria umożliwiające ocenę złośliwości wyhodowanych komórek, a mianowicie: 1. Występowanie więcej niż 5 komórek w polu widzenia, przy powiększeniu immersyjnym (ok. 1000 x). 2. Obecność rozet komórkowych (więcej niż 3 połączone komórki). 3. Występowanie więcej niż jednego jądra w komórce. 4. Występowanie więcej niż trzech jąderek w komórce; 5. Stwierdzenie stosunku powierzchni jądra do cytoplazmy większego niż 0,5 (tj. pole jądra większe niż połowa pola komórki); 6. Występowanie różnorodnych pod względem morfologicznym komórek (wzrost wielopostaciowy); 7. Obecność silnie zasadochłonnej cytoplazmy; Komórki spełniające więcej niż cztery kryteria zaliczane są do złośliwych; spełniające mniej niż cztery kryteria są określane jako wątpliwe. Natomiast komórki nie spełniające żadnego z powyższych kryteriów określa się jako łagodne. Pomijając dwa pierwsze kryteria oparte na liczbie komórek występujących w polu widzenia, pozostałe można określić jako wewnątrzkomórkowe zmiany morfologiczne. Wielu badaczy próbowało klasyfikować komórki wg zmodyfikowanej skali Papanicolaou dla pmr, tj.: 1° brak komórek atypowych; 2° komórki z pojedynczymi cechami atypii; 3° komórki z licznymi cechami atypii; 4° komórki atypowe podejrzane jako nowotworowe; 5C komórki nowotworowe o ustalonym typie histologicznym. Powyższe kryteria oceny złośliwości wyhodowanych komórek nowotworowych straciły na aktualności wobec możliwości użycia specyficznych przeciwciał monoklonalnych w nowoczesnych metodach immunocytochemicznych (20). Metody te umożliwiają przeprowadzenie dokładnej klasyfikacji komórek nowotworowych dzięki posiadanym przez nie antygenom, które niejednokrotnie są markerami danego rodzaju komórek. Najczęściej wykorzystuje się przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko białkom filamentów pośrednich, takich jak: cytokeratyna, desmina, wimentyna, kwaśne białko filamentów glejowych, białka neurofilamentów oraz włókienka neuronalne. Dla różnicowania komórek pmr opracowano zestaw przeciwciał składający się ze znaczników dla tkanki neuroektodermalnej, cytokeratyny nabłonkowej, neoplastycznych neuroblastów i przeciwciała panleukocytarnego. Umożliwia on wstępne różnicowanie między pierwotnymi guzami mózgu, przerzutami nowotworowymi, chłoniakami i białaczkami. Istnieje ponadto możliwość dokładnego rozpoznania różnicowego nowotworu z użyciem innych zestawów przeciwciał monoklonalnych (np. różnicowanie między astrocytoma, oligodendroglioma i ependymoma). Jednak dla uzyskania sukcesu diagnostycznego niezbędna jest wystarczająca ilość materiału komórkowego, stąd konieczność namnażania komórek in vitro. Poszukiwano innych bezpośrednich dowodów potwierdzających tożsamość komórek nowotworowych uzyskiwanych w hodowli in vitro w porównaniu do komórek występujących w guzach mózgu. Rosenblum i wsp. (14) namnażali komórki uzyskiwane z biopsji mózgu. Uzyskany materiał poddawali trypsynizacji lub specyficznemu działaniu enzymatycznemu (pronaza, kolagenaza, DNAza). Następnie komórki namnażali in vitro, uzyskując trójwymiarowe, wielokomórkowe agregaty (sferoidy). Komórki te posiadały wiele cech złośliwości. E. Zbrój kiewicz i wsp. Niektóre z nich o średnicy większej niż 250 mikrometrów zawierały ogniska martwicy łącznie z obszarami bezkomórkowcj macierzy. Ze względu na ich duże wymiary, można było je badać techniką histologiczną, podobnie jak materiał tkankowy. Wykazano również, że komórki uzyskiwane ze złuszczających się powierzchniowych warstw guza były podobne do komórek wyhodowanych z bioptatu guza mózgu. Dlatego w ocenie morfologicznej tychże komórek nowotworowych, uzyskiwanych z hodowli traktowano je podobnie jak komórki badanego guza mózgu. Z kolei Kajikawa i wsp. (7) prowadzili hodowle komórek uzyskiwanych z pmr pacjentów, u których wcześniej rozpoznano glejaki. W 37% hodowli stwierdzono komórki nowotworowe. Podobne badania prowadzono z nowotoworami dającymi przerzuty do O.U.N. i uzyskano zgodność rozpoznania u 40% badanych pacjentów. Macki wsp. (2) prowadzili podobne obserwacje, uzyskując 23% pozytywnych wyników w grupie 35 przypadków pierwotnych i przerzutowych nowotworów wewnątrzczaszkowych. Największy odsetek pozytywnych wyników (46%) uzyskali Sano i wsp. (2) w grupie pacjentów z glejakami. Na uwagę zasługuje fakt, że charakter proliferacji komórek glejaka, złuszczonych do pmr był podobny do proliferacji komórek glejowych w hodowli tkankowej (6,14). Natomiast komórki złuszczone z nowotworów nabłonkowych (przerzutowych) często ulegały degeneracji w hodowli. Dlatego też bezpośrednie badanie cytologiczne nowotworów pochodzenia nabłonkowego jest bardziej miarodajne od hodowli komórkowej np. gruczolakoraka (adenocarcinoma). W innych typach nowotworów, np. w mięsaku, czerniaku lub brodawczaku splotu naczyniówkowego, stwierdzono wzrost komórek w hodowli (2). Odmiennym problemem diagnostycznym jest zróżnicowanie komórek nienowotworowych występujących w pmr, a ulegających wzrostowi w hodowli. Do takich elementów morfotycznych można zaliczyć limfocyty i monocyty (5,10). Proliferujące komórki monocytarno-histiocytarne przyjmują w hodowli kształt wielokątny lub pólksiężycowaty oraz zmieniają swoje położenie na płytkach hodowlanych. Niektóre typy tych hodowli były podobne do fibroblastów, natomiast inne zawierały komórki olbrzymie. Powstawanie tych ostatnich tłumaczy się reakcją na niekorzystne warunki hodowli (np. zmiana pH, wahania temperatury, itp.). Komórki monocytarno-histiocytarne stwierdzono również w pmr w przypadkach przewlekłych procesów zapalnych w OUN. Muller i wsp., stosując metodę hodowli komórek wyizolowanych z pmr oraz technikę immunofluorescencji, stwierdzili wewnątrzkomórkową obecność antygenów wirusa nagminnego zapalenia ślinianek przyusznych, zwłaszcza w przypadkach wtórnego zajęcia układu nerwowego (11). Dlatego hodowle komórek nowotworowych stosunkowo łatwo można było porównać z ich formami wyjściowymi. Z kolei komórki nienowotworowe były trudne w identyfikacji morfologicznej (1, 4, 5, 10, 11). Z drugiej strony za ograniczonym stosowaniem badań cytologicznych pmr w nowotworach OUN przemawia stosunkowo niski odsetek wyników pozytywnych mieszczących się w granicach 1,9-33% (3). Niska wykrywalność komórek nowotworowych zależy od wielu czynników. Podstawowym kryterium jest anatomiczne umiejscowienie nowotworu, gdyż nie zawsze dochodzi do rozsiewu komórek nowotworowych do przestrzeni płynowych. Innym ważnym czynnikiem jest struktura biologiczna nowotworu. Oponiaki mają wysoki stopień spoistości, co powoduje, że tylko niektóre komórki są w stanie oderwać się od głównej masy guza i przeniknąć do pmr. Inne nowotwory, zwłaszcza nisko zróżnicowane i szybko rosnące, wskutek wolniejszej prolife- Zastosowanie hodowli komórek z płynu mózg.-rdz. racji naczyń krwionośnych, w porównaniu ze wzrostem guza, zawierają ogniska rozpadu i martwicy. W tych nowotworach spoistość guza jest o wiele mniejsza i komórki z powierzchni guza łatwiej złuszczają się do pmr (3). Z kolei z przypadkach procesów wieloogniskowych umiejscowionych w oponach miękkich, takich jak np. rakowatość opon, czerniakowatość opon czy też nacieki białaczkowe, wykrywalność sięga 100%. W przypadku uzasadnionego podejrzenia wewnątrzczaszkowego procesu rozrostowego najczęściej rezygnuje się z nakłucia lędźwiowego, często pomimo braku przeciwwskazań. Dlatego też większość pozytywnych wyników stanowią rozpoznania przypadkowe. Szybki rozwój komputerowych technik diagnostycznych (np. tomografia komputerowa - TK) również nie forsuje badań pmr. Także brak zgody pacjenta na nakłucie lędźwiowe uniemożliwia wykonanie badań cytologicznych. Warto jednak wspomnieć, że w monitorowaniu meningioz białaczkowych badanie cytologiczne pmr jest metodą z wyboru. Zdarza się, że nowoczesne metody neuroobrazowania OUN. dają wynik fałszywie dodatni. Wielokrotnie porównywano obrazy TK z wynikami badań autopsyjnych, Nie tak rzadko znajdowano przypadki fałszywie dodatnie, bądź fałszywie ujemne (12, 19). Dlatego wydaje się, że TK częściej należałoby weryfikować innymi badaniami dodatkowymi. Przykładem może być opisany przypadek pierwotnego czerniaka wewnątrzczaszkowego, w którym TK głowy wykazała mnogie ogniska krwotoczne, obustronna angiografia szyjna dała wynik negatywny, a badanie cytologiczne pmr ujawniło liczne komórki czerniaka, co zostało następnie potwierdzone histopatologicznie (19). Reasumując, wprowadzenie oceny morfologicznej komórek wyhodowanych in vitro jest wielce przydatne w diagnostyce neurologicznej, jednak nie decyduje o ostatecznym rozpoznaniu. Przydatność diagnostyczna techniki hodowli 39 komórek wyizolowanych z pmr znajduje coraz szersze zastosowanie praktyczne (2, 7, 14). Dalszym osiągnięciem było wzbogacenie techniki identyfikacyjnej przez użycie przeciwciał monoklonalnych (20). Z innych zastosowań na uwagę zasługują próby wykorzystania hodowli in vitro do oceny wrażliwości komórek na działanie leków przeciwnowotworowych. Dotychczas nie przeprowadzano badań na komórkach pochodzących z pmr, lecz wykorzystano komórki z biopsji cienkoigłowej mózgu (14, 16). Znanym zjawiskiem jest występująca oporność komórek nowotworowych na cytostatyki in vivo, pomimo ich wrażliwości w badaniach in vitro. Wyjaśnienie mechanizmów tego zjawiska utrudnia fakt braku całkowitej znajomości biologii nowotworów układu nerwowego (15). Często wrażliwość komórek nowotworowych jest odmienna w badaniach in vivo i in vitro. Skuteczność terapii przeciwnowotworowej zależy przede wszystkim od stężenia leku cytostatycznego lub jego metabolitów w komórce nowotworowej. Natomiast nieskuteczność in vivo może wynikać z braku dostępności biologicznej leku, ze zbyt niskiego stężenia leku w komórce, czy wreszcie z istnienia enzymatycznych mechanizmów oporności. Przykładem niwelacji oporności enzymatycznej jest stosowanie kwasu etakrynowego, który odwraca oporność wywołaną przez transferazę S-glutationu (13). Hodowla komórek nowotworowych wyizolowanych z pmr stanowi kolejny krok w celu wyjaśnienia biologii nowotworów O.U.N., a jej wykorzystanie w monitorowanej terapii nowotworów mózgu znajduje coraz szersze zastosowanie kliniczne (8). Wzbogacenie cytodiagnostyki neurologicznej przez wprowadzenie hodowli komórek pochodzących z pmr jest korzystne zarówno pod względem diagnostycznym, jak i leczniczym. Wydaje się, że należy oczekiwać dalszych modyfikacji metodycznych poprawiających skuteczność diagnostyki pmr. E. Z b r o j kiewicz, J.S. Zb ro j ki e wi c z , S. G r a f f, A. Gł ą b i ń s ki , A. K o z ł o w s k i The use of culturs of cells isolated from cerebrospinal fluid in neurological diagnosis Summary Trials are reported of using in vitro cultured cells isolated from the cerebrospinal fluid in neurological cytodiagnosis. The method was applied for confirming the diagnosis of central nervous system neoplasms or for the assessment of their sensitivity to targeted chemotherapy. The reliability of the obtained results was owed mainly to the possibility of growing and identification of malignant cells. For the identification of the malignant cells the Barker-Stanford criteria or the modified Papanicolau scalę were used. A newer method for the diagnosis of cells was their immunocytochemical identification using monoclonal antibodies. The presented methods were superior to direct cytological methods in neurological cytodiagnosis. Piśmiennictwo I. Adams R.L.: Celi culture for biochemists. Elsevier (North Holland, Biomedical Press, 1980. - 2. Black PM., Callahan L.V., Kornblitk P.L.: J. Neurosurg. 1978, 49, 697. - 3. Bubik M. i wsp,: Wiad. Lek. 1985,4,295.-4. Dommasch D., Mertenss H.: Cerebrospinalflussigkeit. Georg Thieme Verlag, Stuttgart-New York, 1980. - 5. Dommasch D.: J. Neurol. 1975,209,103. - 6. Gilden D.H. i wsp.: J Neurol. Sci., 1976, 29, 177. - 7. Kajikawa H. i wsp.: Acta Cytol. 1977, 21, 162. - 8. Liikmark J., Peterson C.: Ciin. Pharmacokinet. 1991, 21, 213. - 9. Lumsden CE:. Tissue culture of brain tumors. - W: Handbook of Clinical Neurology (eds), Vinken P.J. i Bruyn G.W., North Holland, Amsterdam-Oxford, 1974,672. -10. Malashkia Y.A., Geladze M.G.: Neurology, 1976, 26, 1081. II. Muller W.K., Yersteeg J., van der Kuip L:. Z. Neurol. 1972, 202, 159.- 12. Musiol A. i wsp.: Some aspectsofCT diagnosis in the cerebrovascular diseases. W: Neuroimaging, Gustav Fischer Yerlag, Stuttgard, New York 1985, 161. - 13. Phillips P.C.: Neurol.-Clin., 1991, 9 (2), 383. - 14. Roscnbhm M.L. i wsp.: J. Neurosurg., 1983, 58, 170. - 15. Schuster J.M., Friedman H.S., Bigner D.D.: Neu-rolClin., 1991, 9(2), 375. - 16. Siherman J.F. i wsp.: Cancer, 1986, 58,1117. - 17. Wilson Ch. B., Barker M.\ Neurology, 1966, 16, 1064. - 18. Zbrojkiewicz J.S., Szeliga-Centarska M:. Pol. Tyg. Lek., 1986, 10,292. - 19. Zbrojkiewicz J.S. i wsp.: Pol. Tyg. Lek., 1987,45,1427. 20. Zbrojkiewicz J.S., Głąbiński A., Graff S:. Pol. Tyg. Lek., 1988, 23, 731. Pracę otrzymano: 1992.03.02, Adres autorów: Ewa Zbrojkiewicz, ul. Radockiego 254 m. 4, 40-645 Katowice. POLSKI TYGODNIK LEKARSKI 1988. T. XLIII. Nr 23 ARTYKUŁ REDAKCYJNY JANUSZ S. ZBROJKIEWICZ, ANDRZEJ GŁĄBIŃSKI, SŁAWOMIR GRAFF Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych w cytodiagnostyce onkologicznej płynu mózgowo-rdzeniowego (Z I Katedry i Kliniki Neurologii SI. AM w Katowicach; kierownik: doc. dr hab. n. med. A. Wajgt i Oddziału Neurologicznego Centralnego Szpitala Górniczego w Katowicach; kierownik: doc. dr hab. n. med. Z. Kazibutowska) SŁOWA KLUCZOWE: przeciwciała monoklonalne; cytodiagnostyka onkologiczna; płyn mózgowo-rdzeniowy Wykrycie przeciwciał monoklonalnych przyśpieszyło rozwój nauk medycznych. Obecnie wykorzystuje się je zarówno w badaniach doświadczalnych (immunologia, genetyka), jak i klinicznych (w tym w diagnostyce onkologicznej, mikrobiologicznej, serologicznej) oraz w seroterapii nowotworów (11). Wielką zaletą przeciwciał monoklonalnych jest ich homogenność. Immunoglobuliny są bardzo różnorodne (klasy, podklasy, allele). Przeciwciała monoklonalne są pod tym względem bardzo swoiste i charakteryzują się: - swoistością izotypową, dotyczącą poszczególnych klas i podklas immunoglobulin w obrębie tego samego gatunku (swoistość gatunkowa); - swoistością idiotypową, związaną z obecnością odpowiednich ugrupowań antygenowych w części wiążącej przeciwciała. Jest ona uwarunkowana sekwencją aminokwasów obszaru zmiennego cząsteczki immunoglobuliny ( 8, 13 ). Stosowane od lat przeciwciała heterogenne nie mają tych zalet, a tym samym ich swoistość jest znacznie mniejsza. Wytwarzanie przeciwciał monoklinalnych przebiega w następujących etapach: a) kilkakrotna immunizacja myszy wybranym antygenem. 732 Przeciwciała monoklonalne b) pozyskanie śledziony uodpornionej myszy i wyodrębnienie z niej limfocytów B, c) fuzja limfocytów z komórkami szpiczaka myszy w celu uzyskania hybryd, d) selekcja hybryd, e) hodowla wybranych klonów in vivo lub in vitro (8). Klon wytawarzający przeciwciała określa się jako hybrydoma. Obecnie przeciwciała monoklonalne są dostępne na rynku w formie preparatów, produkowanych m.in. przez Amersham, Becton-Dickinson, Coulter, Dako, Labsystems, Miles, Sigma. Metody uwidaczniania kompleksów antygen-przeciwcialo w preparatach histologicznych i cytologicznych W celu jak najlepszego uwidocznienia kompleksów antygen-przeciwciało rozwinięto wiele technik immunologicznych. Metody te można ogólnie podzielić, w zależności od sposobu uwidaczniania kompleksów, na histochemiczne, w których substancją wykrywaną jest najczęściej enzym, i fluorescencyjne, w których kompleksy są znakowane fiuoresceiną. Metody histochemiczne mają przewagę nad fluorescencyjnymi, ponieważ przy ich stosowaniu potrzebny jest zwykły mikroskop świetlny. Istnieje jeszcze wiele innych metod identyfikacyjnych z użyciem przeciwciał monoklonalnych opartych na elektroforezie białek, immunofiksacji i technikach immunoblottingu. Zależnie od mechanizmu powstawania połączeń immunologicznych, techniki te można podzielić na: a) bezpośrednie, b) pośrednie, c) z użyciem kompleksów: peroksydaza-antyperoksydaza awidyna-biotyna. Większość z tych technik może być stosowana w modyfikacji histochemicznej lub fluorescencyjnej. Ze względu na wymienione korzyści, częściej używane są metody histochemiczne. Najczęściej stosuje się w nich jako znacznik enzym peroksydazę, która ma wiele zalet: 1) jest bardzo trwała oraz łatwo osiągalna w czystej postaci, a więc jest niewielkie prawdopodobieństwo zanieczyszczeń, 2) niewielkie rozmiary jej cząsteczki nie przeszkadzają w łączeniu się przeciwciał, 3) aktywność peroksydazy endogennej jest niewielka, 4) istnieje wiele związków, które w reakcji z peroksydazą dają barwny produkt końcowy, 5) jest tania. Immunoperoksydazowa metoda bezpośrednia polega na reakcji antygenu ze swoistym przeciwciałem (np. monoklonalnym) sprzężonym z peroksydazą (ryc. 2a). Następnie stosuje się barwnik, który ujawnia obecność peroksydazy, a więc pośrednio i antygenu. Badanie metodą bezpośrednią można wykonać bardzo szybko, z małym prawdopodobieństwem reakcji nieswoistych. Główną wadą tej metody jest to, że do lokalizacji każdego antygenu potrzebne jest inne, sprzężone z peroksydazą, przeciwciało. Metoda ta jest stosowana m.in. do wykrywania immunoglobulin, dopełniacza i kompleksów immunologicznych, uzyskanych z bioptatów nerkowych i skórnych, np. w układowym toczniu rumieniowatym (1). Metoda pośrednia wymaga zastosowania dodatkowego przeciwciała. Swoiste przeciwciało (tzw. pierwotne) wiąże się z antygenem. Do wykrycia tego kompleksu stosuje się drugie przeciwciało, które jest połączone z peroksydazą. Następnie dodaje się barwnik, jak w metodzie bezpośredniej. Zaletą metody pośredniej jest to, że różnorodne przeciwciała pierwotne, pochodzące jednak od danego gatunku, można wykryć za pomocą jednego przeciwciała wtórnego, znakowa- Przeciwciała monoklonalne nego peroksydazą, które jest skierowane przeciwko immunoglobulinom tego gatunku. Wadą natomiast jest większe prawdopodobieństwo wystąpienia reakcji nieswoistych. Głównym zastosowaniem tej metody jest identyfikowanie przeciwciał w surowicach chorych z różnymi schorzeniami autoimmunologicznymi, bakteryjnymi i pasożytniczymi (1, 7). Metoda PAP wymaga zastosowania 3 odczynników: pierwszego przeciwciała skierowanego przeciwko poszukiwanemu antygenowi, wtórnego przeciwciała oraz kompleksu PAP, składającego się z enzymu peroksydazy i przeciwciała przeciwko niemu. Wtórne, tzw. łączące przeciwciało jest zdolne do połączenia pierwotnego przeciwciała z kompleksem PAP, ponieważ oba pochodzą od tego samego gatunku zwierząt (ryc. 2c). Enzym peroksydazą jest dalej wykrywany za pomocą reakcji barwnej. Korzyścią takiego skomplikowania metody jest zwiększenie jej czułości. Jednym z ważniejszych zastosowań tej metody jest określanie pochodzenia komórek i tkanek nowotworowych na podstawie identyfikacji swoistych antygenów komórkowych (1, 7). Metoda awidyna-biotyna wykorzystuje dużą zdolność glikoproteiny awidyny do nieimmunologicznego przyłączania cząsteczek witaminy — biotyny. Tak jak w metodzie PAP, używane są 3 odczynniki. Pierwszym z nich jest przeciwciało skierowane przeciwko poszukiwanemu antygenowi. Drugie przeciwciało, związane z biotyną, jest zdolne do przyłączania pierwszego. Trzecim składnikiem jest kompleks, składający się z peroksydazy połączonej z awidyną-biotyną. Wolne miejsca na cząsteczce awidyny zezwalają na połączenie z biotyną na drugim przeciwciele (ryc. 2d). Również i w tym przypadku peroksydazą, a więc i poszukiwany antygen, są ujawniane za pomocą odpowiedniego barwnika. Silne powinowactwo awidyny do biotyny zwiększa czułość metody w porównaniu z innymi, w których występuje przeciwciało sprzężone z peroksydazą (metoda bezpośrednia i pośrednia). Jest to metoda wprowadzona niedawno i jak dotąd służy do oznaczania białek wirusów i fllamentów pośrednich (1, 7). Ostatnio pojawia się coraz więcej prac, porównujących opisane metody. Sternberg i Sternberg uważają, że metoda PAP jest czulsza od metody awidyna-biotyna w zwykłych rozcieńczeniach przeciwciała. Natomiast w miarę wzrostu stopnia rozcieńczania jej przewaga nad metodą awidynową jest mniej wyraźna. Dodatkową zaletą metody PAP miałoby być umożliwienie zróżnicowania neurofilamentów o dużym i małym stopniu fosforylacji, czego nie można osiągnąć za pomocą metody awidyna-biotyna. Inną wadą tej ostatniej jest jej nieprzydatność do oznaczania stężenia antygenu, czy porównywania miejsc o dużym i małym stężeniu antygenu (12). Ważnym zagadnieniem towarzyszącym wszystkim metodom immunocytochemicznym, jest prawdopodobieństwo wystąpienia nieswoistych połączeń przeciwciała z antygenami tkankowymi. Nawet używając przeciwciał monoklonalnych bardzo wybiórczo działających, udokumentowano przypadki reakcji krzyżowych. Aby temu zapobiec, często przeprowadza się próby monowybiórczości. Wykorzystuje się w tym celu m.in. techniki precypitacji w żelu, unieczynnienia, immunoprecypitacji czy metody z użyciem znaczników radioaktywnych (7). Kolejnym istotnym zagadnieniem jest możliwość wystąpienia zafałszowań pochodzących z samej tkanki czy komórki badanej. Używając znaczników fluorescen- 733 cyjnych należy brać pod uwagę autofluorescencję lipofuscyny, a przy metodach peroksydazowych — aktywność peroksydazową lizosomów. Aby umknąć błędów, należy wiedzieć, które struktury w obrębie badanego materiału mają determinanty te same lub zbliżone do poszukiwanego antygenu (7). Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych w diagnostyce neuroonkologicznej W diagnostyce nowotworów układu nerwowego większość badaczy zwraca uwagę na dużą przydatność oznaczania filamentów pośrednich — układu włókienek o średnicy 10 nm, które stanowią zrąb c y t o s k e 1 e t o n u obok mikrotubul (20-25 nm) i mikrofilamentów (poniżej 10 nm). Wyróżniono 5 grup filamentów pośrednich, a każda z nich doczekała się już swoich przeciwciał monoklonalnych. Są przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko białkom następujących filamentów pośrednich (4 rodzaje białek oraz neurofilamenty): a) cytokeratynie (tonofibryle) występującej w komórkach nabłonkowych i wywodzącej się z nabłonków, np.: carcinoma basocellulare, transitional cell carcinoma, adenocarcinoma, chordoma, synovial sarcoma; b) desminie, występujące głównie w mięśniach szkieletowych, gładkich i mięśniu sercowym oraz guzach i przerzutach pochodzenia miogennego, np, rhabdomyosarcoma, leiomyosarcoma; c) wimetnynie, występujące głównie w komórkach tkanki łącznej, tj. guzach i przerzutach pochodzenia mezenchymalnego, np.: sarcoma, lymphoma, melanoma, schwannoma, endothelioma; d) kwaśnemu białku filamentów glejowych (GFAP), charakterystycznemu dla komórek glejowych, a tym samym guzów i przerzutów pochodzenia glejowego np.: astrocytoma, ependymoma. Oligodendrocyty GFAP nie zawierają. e) neurofilamentom (neurofibryllom) — włóknom neuronów spotykanych także w przypadkach pheochromocytoma i neuroblastoma. Neurofilamenty są głównymi składnikami cystoskeletonu komórek nerwowych. Występują w formie uporządkowanych sieci. System ich połączeń i rozgałęzień wypełnia cytoplazmę perikarionu, aksonów i dendrytów. Białka neurofilamentów ssaków są biochemicznie i immunologicznie różne od białek neurofilamentów ptaków, płazów i ryb. Odznaczają się dużą swoistością polipeptydów. Wyodrębniono kilka frakcji neurofilamentów o masie cząst. 200 000, 160 000, 69 000 i 68 000. Przedostatnia z frakcji jest charakterystyczna dla aksonów. Frakcja 200000 jest typowa dla guzów i przerzutów pochodzących z układu współczulnego, np. ganglioneuroblastoma. Frakcja 160000, podobnie jak 68000, także wykazuje związek z guzami układu współczulnego, przy czym pierwsza z nich daje również reakcje krzyżowe w przypadkach raków i mięsaków. Przeciwciała monoklonalne przeciw poszczególnym frakcjom neurofilamentów nie dają reakcji krzyżowych między sobą, przykładowo — przeciwciała monoklonalne przeciw neurofilamentom frakcji 68 000 nie wykrywa polipeptydów frakcji 200 000. Niektóre z wymienionych już firm produkują zestawy przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko filamentom pośrednim (6, 10). W razie potrzeby zestaw przeciwciał monoklonalnych stosowanych w diagnostyce może zostać zwiększony, Obecnie są juz dostępne na rynku preparaty 734 Przeciwciała monoklonalne przeciwciał monoklonalnych skierowane przeciwko prawie wszystkim rodzajom komórek. Poza strukturami swoistymi cystoskeletonu antygenem dla przeciwciał monoklonalnych mogą być także inne elementy struktury komórkowej oraz produkty syntezy komórki. Dotyczy to zwłaszcza komórek układu limfatycznego, przeciwko którym istnieje najbogatszy zestaw przeciwciał monoklonalnych. Przydatność przeciwciał monoklonalnych w cytodiagnostyce onkologicznej płynu mózgowo-rdzeniowego Badania cytoonkologiczne płynu mózgowo-rdzeniowego należą do najtrudniejszych działów cytodiagnostyki. Trudności powodowane są zarówno niewielką liczbą elementów komórkowych w płynie mózgowo--rdzeniowym, jak i problemami związanymi z ich wychwytem w celu sporządzenia bogatokomórkowego cytogramu oraz trudnościami w samej ocenie uzyskanej populacji komórkowej (2, 15). Część problemów została rozwiązana z chwilą wprowadzenia sączenia przez filtry membranowe, co umożliwia wychwyt prawie 100% komórek z płynu mózgowordzeniowego, tym samym zwiększając możliwość znalezienia w badanej populacji komórkowej gniazd proliferacyjnych, a nawet pojedynczych komórek nowotworowych (9, 14). Nawet jeżeli komórki nowotworowe są obecne, to ich rozpoznanie, a zwłaszcza ustalenie typu nowotworu, od którego pochodzą, jest trudne, nierzadko spotyka się nawet opinie, że jest to niemożliwe. Doświadczony cytolog może czasem zróżnicować niektóre rodzaje nowotworów, jak: adenocarcinoma, melanoma czy medulloblastoma, przeważnie jednak ogranicza się do stwierdzenia obecności komórek „podejrzanych jako nowotworowe". W przypadku mało zróżnicowanych nowotworów, zwłaszcza ze współistniejącym procesem zapalnym i rozpadowym, nierzadkie są rozpoznania fałszywie ujemne. Czasami, ze względu na obecność w płynie mózgowo-rdzeniowym komórek mezenchymy, ependymy i splotu naczyniówkowego lub przypadkowej obecności komórek nabłonkowych czy fragmentów szpiku kostnego, zdarzają się rozpoznania fałszywie dodatnie (2, 15). Próbowano wyeliminować te niedogodności przystosowując do potrzeb analizy cytologicznej techniki fluorescencyjne, autoradiografię czy mikroskopię elektronową. Jednak metody te ze względu na koszty, czasochłonność oraz braki aparaturowe nie poprawiły w sposób istotny sytuacji. Szansą na znaczne zmniejszenie trudności w identyfikacji komórek nowotworowych wydaje się zastosowanie przedstawionych technik immunohistochemicznych czy immunofluorescencyjnych z użyciem przeciwciał monoklonalnych. Do chwili obecnej ukazało się na świecie zaledwie kilka prac, których autorzy próbowali zestawić uniwersalny panel przeciwciał monoklonalnych dla potrzeb cytoonkologii płynu mózgowo-rdzeniowego. Dużą przydatność wykazał zestaw składający się ze znaczników dla tkanki neuroektodermalnej, cytokeratyny nabłonkowej, neoplastycznych neuroblastów i przeciwciała pan-leukocytarnego. Próbki płynu mózgowo-rdzeniowego zagęszczano przez wirowanie i dzielono na kilka porcji, które nakładano na uprzednio przygotowane szkiełka mikroskopowe. Po przepłukaniu buforowanym roztworem 0,9% NaCl na każde szkiełko nakładano jedno z przeciwciał monoklonalnych o odpowiednim stężeniu i inkubowano przez 30 min w komorze wilgotnej w temperaturze pokojowej. Po dalszym płukaniu i inkubowaniu przez 30 min z kozią antymysią immunoglobuliną sprzężoną z fluoresceiną preparat zamykano w 90% glicerolu i oceniano w mikroskopie fluorescencyjnym. Oprócz metod pośredniej immunofluorescencji, w badaniach tych używano również 4stopniowej techniki immunoperoksydazowej. Użycie powyższego zestawu przeciwciał pozwalało na dokładne różnicowanie komórek nowotworowych pochodzenia nabłonkowego, limfoidalnego i neuroektodermalnego. W dalszej kolejności używano dodatkowych przeciwciał monoklonalnych w celu uzyskania bardziej szczegółowych informacji, np. odnośnie do fenotypu chłoniaka albo do wykrycia kwaśnego białka filamentów glejowych (GFAP). Podczas badań okazało się, że przeciwciała monoklonalne przeciw cytokeratynie nie reagują z komórkami pochodzącymi z przerzutu anaplastycznego raka sutka — był to jedyny fałszywie ujemny wynik uzyskany przy tym zestawie przeciwciał. Ostatecznie nowotwór ten zidentyfikowano używając przeciwciał monoklonalnych przeciwko nabłonkowemu antygenowi proliferaeyjnemu. Używając przeciwciał monoklonalnych, Coakham i wsp. uzyskali prawidłowe rozpoznanie w 16 spośród 17 analizowanych przypadków. Spośród 14 przypadków badanych rutynową techniką cytologiczną w 10 znaleziono komórki nowotworowe, a dokładnie sklasyfikowano tylko 3 przypadki. Różnica jest zatem istotna (3, 4). Pozostałe doniesienia miały charakter kazuistyczny (5). Godny podkreślenia jest fakt, że antygeny komórkowe są stosunkowo trwałe, np. w przypadku cytokeratyny struktura antygenowa pozostaje trwała przez co najmniej 3 dni. Właściwość ta umożliwia dłuższe przechowywanie próbek płynu mózgowo-rdzeniowego lub ich transportu do wyspecjalizowanego laboratorium cytologicznego. Opisane przeciwciała monoklonalne umożliwiały wstępne różnicowanie komórek w płynie mózgowo--rdzeniowym na pierwotne guzy mózgu, przerzuty, chłoniaki i białaczki. Istnieje także możliwość dalszego, dokładniejszego rozpoznania różnicowego przy użyciu innych zestawów przeciwciał monoklonalnych, np. różnicowania między astrocytoma, oligodendroglioma i ependymoma. Należy przypuszczać, że techniki immunocytologiczne przyniosą istotny postęp diagnostyczny. Zastosowane w przeciętnie wyposażonym laboratorium diagnostycznym pozwolą na wczesne wykrycie i dokładną charakterystykę komórek nowotworowych w płynie mózgowo-rdzeniowym. PIŚMIENNICTWO 1. Bourne J.A.:Handbook of Immunoperoxidase Staining Methods. DAKO Corp., USA 1983. — 2. Bubik M. i wsp.: Wartość analizy cytologicznej płynu mózgowo-rdzeniowego w diagnostyce nowotworów śródczaszkowych. Wiad. Lek., 1985, 3, 295. — 3. Coakham H.B. i wsp.: Carcinomatous meningitis diagnosed with monoclonal antibo-dies. Brit. Med. J., 1984, 288, 1272. — 4. Coakham H.B. i wsp.: Use of monoclonal antibody panel to identify malignant cells in cerebrospinal fluid. Lancet, 1984,19,1095. — 5. Hancock W.W., Medley G.: Monoclonal antibodies to identify tumor cells in CSF. Lancet, 1983, 24, 739. — 6. Kawiak J. i wsp.: Składniki cytoszkieletu, w: Podstawy cytofizjologii. PWN, Warszawa 1985. — 7. Landis D.M.D.. Promise and pitfalls in immunocytochemistry, TINS, 1985, 7, 312. — 8. Mackiewicz S.: Przeciwciała monoklonalne, w: Immunologia. PZWL, Warszawa 1986. — 9. Musioł A. i wsp.: Zastosowanie mikroskopii elektronowej transmisyjnej i skaningowej w badaniach cytologicznych płynu mózgowo-rdzeniowego. Neur. Neurochir, Pol., 1985, 4, 312. — 10. Ostrowski K., Kawiak J.: Szkielet komórki, w: Cytofizjologia. PZWL, Warszawa 1985.
