Badanie aktywności fotouczulaczy stosowanych w PDT

Marta Kempa
Badanie aktywności fotouczulaczy stosowanych w terapii PDT metodami fizykochemicznymi
1. Prowadzone badania oraz uzyskane wyniki:
Terapia fotodynamiczna (PDT) jest metodą leczenia nowotworów polegającą na
selektywnym niszczeniu tkanek nowotworowych w wyniku reakcji fotodynamicznej.
Leczenie tą techniką wymaga podania specjalnego leku, zwanego fotuczulaczem, który
gromadzi się w chorych tkankach. Jest to związek, który aktywowany jest pod wpływem
światła o określonej długości fali dobranej do jego ostatniego pasma absorpcji. Następnie w
wyniku reakcji fotodynamicznej, zachodzącej w obecności tlenu, wytwarzane są
cytotoksyczne produkty. Uszkadzają one ważne dla życia makromolekuły oraz liczne
struktury wewnątrzkomórkowe prowadząc do zniszczenia tkanki zmienionej chorobowo.
Istnieją dwa mechanizmy: typu I i typu II powodujące destrukcję komórek nowotworowych w
procesie utlenienia biomolekuł i prowadzą do powstania wysokoreaktywnych związków
tlenowych (ang. reactive oxygen species – ROS) odpowiednio wolnych rodników oraz tlenu
singletowego. Oba mechanizmy indukowane są jednocześnie, a który z nich jest dominujący
zależy od wielu czynników (rodzaju stosowanego fotouczulacza, stężenia substratu, stężenia
tlenu w środowisku reakcji).
Fotouczulacz musi posiadać szereg specyficznych właściwości fizycznych, chemicznych
oraz biologicznych, aby wykazywał pożądany efekt terapeutyczny. Wymagania te z punktu
widzenia PDT są wysokie i trudno znaleźć związki, które spełniałyby je wszystkie
jednocześnie. Dodatkowo ze względu na różnorodną strukturę morfometryczną tkanek
zmienionych chorobowo dany barwnik jest w różnym stopniu skuteczny w odmiennych
typach zmian chorobowych. Obecnie zatwierdzonych do użytku jest pięć związków.
Wykazują one jednak pewne niedoskonałości, które obniżają efektywność terapii. Dlatego
jednym z aktualnych kierunków badań jest poszukiwanie nowych, lepszych fotouczulaczy.
Celem projektu było wyznaczenie charakterystyki fizykochemicznej oraz mechanizmów
działania nowych syntetycznych fotouczulaczy o potencjalnym wykorzystaniu w PDT
pochodzących z grupy porfiryn i chloryn. Badania te przeprowadzane były przy
wykorzystaniu różnych technik spektroskopowych.
Na wstępie przeprowadzono pomiary widm absorpcyjnych, które posłużyły do
wyznaczenia położenia ostatniego pasma absorpcyjnego oraz do oceny stopnia agregacji
badanych związków. Kolejnym etapem badań były pomiary konsumpcji tlenu, jakie zachodzą
w roztworze z badanym związkiem pod wpływem naświetlania. Wyniki tych pomiarów mogą
wskazywać o tworzeniu potencjalnych reaktywnych form tlenu. Następnie przeprowadzono
pomiary mające na celu ustalenie mechanizmu działania fotouczulaczy związanego z
generowaniem ROS przy wykorzystaniu m. in. spektroskopii laserowej fotolizy błyskowej
oraz spektroskopii EPR. W celu identyfikacji
i porównania kinetyki fotogenerowanych
rodników tlenowych posłużono się metodą pułapkowania spinowego. Związki te zostały
przebadane w różnych układach modelowych: w środowisku wodnym i micelarnym.
Przeprowadzone eksperymenty potwierdziły, że
testowane fotouczulacze pod wpływem
naświetlania generują tlen singletowy oraz wolne rodniki: rodnik hydroksylowy oraz
anionorodnik ponadtlenkowy. Kolejnym etapem badań było określenie mechanizmu
tworzenia wolnych rodników przy wykorzystaniu różnych wygaszaczy np. SOD, NaN 3,
DABCO. Efektywność związana z generowaniem ROS uwarunkowana jest środowiskiem w
jakim znajduje się związek.
A
B
chl 2 PBS + 0.2% Triton X100 (1270nm)
chl 2 PBS + 0.2% Triton X100 (1195nm)
chl 2 PBS + 0.2% Triton X100 (1355nm)
chl 2 PBS + 0.2% Triton X100 + 5mM NaN3(1270nm)
0,9
chl 2 PBS
chl 2 PBS + 0.2% Triton X100
chl 2 DMSO
0,6
Abs (a.u.)
0,3
0,0
300
400
500
600
wavelength (nm)
700
Signal intensity (a.u.)
5µM Chl 2
600
400
200
0
20000
40000
Time (ns)
Rys. 1. A -Widmo absorpcyjne chloryny. B - Pomiar emisji luminescencji tlenu przy różnych
długościach fali w środowisku hydrofobowym (Triton X 100).
1.50E+06
*
Signal intensity [a.u.]
1.00E+06
5.00E+05
*
*
+
+
+
+ +
*+
0.00E+00
-5.00E+05
-1.00E+06
-1.50E+06
3350
3360
3370
3380
3390
3400
3410
3420
Magnetic Field [G]
Rys. 2. Spektrum EPR adduktu DMPO-OH (*) oraz DMPO-CH(CH3)OH (+) powstałego
podczas naświetlania roztworu chloryny 2 w PBS + 0.5% Triton X100.
+
Stopień monomeryzacji fotouczulaczy determinuje ich skuteczność, a także typy reakcji
jakie zachodzą. Z badań absorpcyjnych wynika, że testowane fotouczulacze wykazują
tendencję do agregowania w środowisku wodnym. W środowisku micelarnym (z dodatkiem
detergentu – Tritonu X100) występują w formie zmonomeryzowanej. W środowisku wodnym
przeważa mechanizm typu I fotosensybilizowanego utleniania, w którym kluczowa rolę
odgrywają wolne rodniki. W środowisku micelarnym natomiast dużą rolę będzie odgrywał
mechanizm typu II – tworzenie tlenu singletowego, przy czym mechanizm typu I także
będzie miał duże znaczenie.
2. Upowszechnienie wyników
Publikacja: Marcin Rojkiewicza, Piotr Kuś, Patrycja Kozub, Marta Kempa; The synthesis of
new potential photosensitizers [1]. Part 2. Tetrakis-(hydroxyphenyl)porphyrins with long
alkyl chain in the molekule; Dyes and Pigments; 2013, Vol 99, 627–635.