Cytofizjologia

Cytofizjologia
PROGRAM
Ćwiczenie 1. Przykłady metod cyto- i histochemicznych.
Prep. nr 209 i nr 209a. Reakcja Feulgena. Preparaty wątroby, nadnercza lub komórek z
hodowli tkanek. DNA wykrywane jest jedynie w jądrach komórkowych. Ilość DNA w
mitochondriach jest zbyt mała, aby można ją było wykryć tą metodą. W niektórych
preparatach cytoplazma jest podbarwiona zielenią metylową.
Prep. nr 222a. Reakcja PAS w komórkach wątroby. W cytoplazmie komórek widoczne są
ziarna glikogenu, barwy karminowo-czerwonej. Ziarna te ulegają przemieszczeniu w czasie
sporządzania preparatu i dlatego często są zlokalizowane w jednym biegunie komórki.
Prep. nr 222b. Reakcja PAS w jelicie. Komórki kubkowe i włókna siateczkowe zabarwione są
na czerwono. Jądra komórek są podbarwione hematoksyliną. Prep. nr 211. Reakcja Bracheta,
RNA w móżdżku. RNA jest szczególnie dobrze widoczne w komórkach Purkinjego.
Prep. nr 212. Kontrola, po trawieniu RNA-zą. Oba preparaty są zabarwione błękitem
toluidyny .Prep. nr 220. Reakcja Gomoriego, aktywność fosfatazy zasadowej w nerce.
Produkt reakcji widać w postaci czarnego strątu. Fosfataza zasadowa występuje w rąbku
szczoteczkowym komórek kanalika bliższego. Obecność produktu reakcji poza rąbkiem
świadczy o niewystarczającej precyzji lokalizacji enzymu. Dzieje się tak dlatego, że fosforan
wapnia, będący pierwszym produktem reakcji, ulega wytrąceniu w pewnej odległości od
centrum aktywności enzymu.
Prep. nr 220a. Reakcja z użyciem fosforanu -naftylu i soli dwuazowej wykrywająca
aktywność fosfatazy zasadowej. Reakcja pozwala na znacznie precyzyjniejszą lokalizację
enzymu niż reakcja Gomoriego.
Prep. nr 213. Rozmaz komórek z węzła chłonnego. Aktywność dehydrogenazy
bursztynianowej. Enzym ten jest charakterystyczny dla mitochondriów. Przenosi elektrony z
kwasu bursztynowego na sole tetrazolowe, wywołując ich redukcję i powodując ich przejście
w barwne, nierozpuszczalne kompleksy.
EM nr 23. Dehydrogenaza bursztynianowa w grzebieniach mitochondrialnych.
Prep. nr 223. Komórki G w części odźwiernikowej żołądka człowieka. Reakcja
immunocytochemiczna z użyciem przeciwciała przeciwko ludzkiej gastrynie związanego z
biotyną. Następnie obecność tego przeciwciała wykazano za pomocą Extravidyny związanej z
peroksydazą i reakcji z dwuaminobenzydyną wykrywającą peroksydazę.
Fot. nr 164. Komórki endokrynowe G wytwarzające gastrynę (z błony śluzowej odźwiemika
żołądka świni). Immunocytochemiczna reakcja pośrednia, zdjęcie z mikroskopu
fluorescencyjnego. Przeciwciała przeciwgastrynowe uzyskano immunizując królika gastryną
świni. Przeciwciała przeciw immunoglobulinom królika pochodzące od kozy zostały
wyznakowane fluoresceiną. Komórki G widać w postaci jasnych plam na czarnym tle. Na
drugim zdjęciu pokazującym sąsiedni skrawek widać komórki G uwidocznione za pomocą
soli srebra.
Fot. nr 163. Seryjne skrawki limfocytów myszy, na których uwidoczniono immunoglobuliny
powierzchniowe za pomocą przeciwciał antyglobulinowych oznakowanych jodem l25
(autoradiografia na poziomie mikroskopu elektronowego ).
Prep. nr 215. Autoradiogram tarczycy znakowanej jodem131.
IMM. Preparaty oznaczone tym symbolem przedstawiają reakcję immunocytochemiczną
wykonaną na leukocytach z krwi człowieka. Rozmazy, wzbogacone w leukocyty, były
inkubowane z monoklonalnymi przeciwciałami znakowanymi fosfatazą zasadową (reakcja
bezpośrednia), skierowanymi przeciwko określonym znacznikom CD (ang. cluster of
differentiation) powierzchni komórki. Po inkubacji z przeciwciałem fosfatazę wykrywano za
pomocą reakcji histochemicznej. Odsetek znakowanych komórek jest różny w
1
poszczególnych preparatach, w zależności od użytego przeciwciała. Zastosowano
przeciwciała identyfikujące:
receptory dla interleukiny 2 (CD 25)
limfocyty B (CD 19)
wszystkie limfocyty T (CD 3)
limfocyty NK (CD 16)
limfocyty cytotoksyczne T (CD 8)
makrofagi (CD 68) :
komórki z receptorem dla składnika C3b dopełniacza
(makrofagi, komórki NK, granulocyty). Znacznikiem dla tych
komórek jest CD 11 b.
Ryc. nr 425. Histogram rozkładu wartości amplitud impulsów światła fluorescencyjnego
emitowanego przez mysie stransformowane fibroblasty L-929 wybarwione bromkiem
etydionu. Wartości amplitud .impulsów światła fluorescencyjnego są wprost proporcjonalne
do ilości DNA w poszczególnych komórkach; histogram przedstawia zatem rozkład
zawartości DNA w populacji fibroblastów L-929. Widoczne są dwa szczyty pierwszy
odpowiada komórkom zawierającym 2c DNA (faza G1) a drugi komórkom zawierającym 4c
DNA (faza G2 oraz część fazy M). Przedział pomiędzy szczytami odpowiada komórkom w
fazie S.
Tekst 367. Proteomika.
Ćwiczenie 2. Przykłady metod stosowanych w hodowli tkanek, preparaty hodowli,
koncepcje dotyczące starzenia się komórek.
Określenie żywotności i cytotoksycznych właściwości komórek.A. Kroplę zawiesiny
komórek należy zmieszać na szkiełku podstawowym z kroplą błękitu trypanu rozpuszczonego
w roztworze fizjologicznym soli w stężeniu 1:1000. Płyn należy nakryć szkiełkiem
przykrywkowym i odczekać 1-2 minuty. Następnie należy policzyć pod obiektywem
powiększającym 40x 100 komórek i określić odsetek komórek żywych. Komórki martwe
poznaje się po niebieskim zabarwieniu jąder.
B. Należy odpowiedzieć na pytanie, czy w danej populacji komórek znajdowały się komórki
cytotoksyczne (komórki NK) w stosunku do komórek znakowanych, którymi były
chondrocyty. Chondrocyty wyizolowano z chrząstki młodych myszy po strawieniu macierzy
kolagenazą. Następnie wyznakowano je radioaktywnym chromianem sodu. Badane komórki
uzyskano ze śledziony, szpiku, grasicy, węzłów chłonnych, kępek Peyera i jamy otrzewnej
myszy syngenicznych w stosunku do dawcy chondrocytów. Różne typy komórek inkubowano
wraz z chondrocytami przez 18 godzin a następnie zbierano pożywkę, w której inkubowano
komórki i oznaczano radioaktywność w liczniku scyntylacyjnym. Uszkodzenie komórek
polegało na ich cytolizie, co w skrócie określa się jako lizę. Ponieważ test dotyczy całej
populacji komórek, dla ustalenia aktywności cytotoksycznej określa się procent lizy ze wzoru:
uwoln. dośw. (imp/min) - uwoln. spont. (imp/min)
% lizy = ----------------------------------------------------------------------- x 100
uwoln. całk. (imp/min) - uwoln. spont. (imp/min)
Spontaniczne uwolnienie oznacza uwolnienie chromianu zachodzące w hodowli
wyznakowanych chondrocytów bez dodatku innych komórek. Jest ono skutkiem wydalania
części chromianu z komórek żywych i rozpadu komórek samoistnie obumierających w
hodowli. Przez uwolnienie całkowite należy rozumieć uwolnienie zachodzące po zniszczeniu
chondrocytów za pomocą detergentu. Każdą z powyższych wartości oblicza się z różnych
hodowli zawierających znakowane chondrocyty z tej samej populacji.
Należy obliczyć % lizy zachodzącej w hodowli chondrocytów z dodatkiem innych komórek
na podstawie wyników doświadczeń (przeprowadzonych przez prof. dr hab. n. med. J.
Malejczyka i współpracowników ) i ocenić, czy w badanej populacji występowały komórki
2
cytotoksyczne. Za wartość krytyczną należy przyjąć 5 %. Wartość ta może być odmienna w
różnych układach doświadczalnych.
Analiza rozmazów Należy obejrzeć rozmazy limfocytów i granulocytów z krwi obwodowej
człowieka sporządzone z krwinek rozdzielonych na poszczególne rodzaje za pomocą
wirowania w gradiencie. W każdym rozmazie należy policzyć 200 komórek i ustalić stopień
czystości populacji (tzn. jaki odsetek komórek stanowią limfocyty lub granulocyty a jaki inne
komórki).
Prep. nr 204. Rozmaz limfocytów.
Prep. nr 205. Rozmaz granulocytów.
Oglądanie hodowli i ilustracji
Prep. nr 310. Komórki nabłonkowe linii WISH wyprowadzonej z owodni człowieka.
Komórki po okresie hodowli uległy samoistnej transformacji. Barwienie H.E.
Prep. nr 97. Hodowla diploidalnych ludzkich fibroblastów. Widać równoległy układ komórek
świadczący o tym, że hodowla osiągnęła stopień zagęszczenia, przy którym komórki nie
mogą się nadal rozmnażać (zahamowanie kontaktowe).
Prep. nr 300. Hodowla heteroploidalnych ludzkich fibroblastów stransformowanych za
pomocą wirusa krowianki. Należy zwrócić uwagę na kształt fibroblastów odmiennych niż na
poprzednim preparacie i na zachodzenie komórek na siebie (brak zahamowania
kontaktowego).
Prep. nr 301. Hodowla melanocytów ze skóry człowieka.
Tekst i foto. nr 362. Zastosowanie hodowanych in vitro keratynocytów w leczeniu trudno
gojących się ran.
Ryc. nr 55. Zachowanie się hodowli komórek diploidalnych w miarę zwiększania się liczby
podwojeń populacji. Na podstawie krzywej obrazującej proliferację komórek można wyróżnić
trzy fazy. Faza I odpowiada hodowli pierwotnej. Po pierwszym pasażu komórki zaczynają się
intensywnie rozmnażać, wchodząc w fazę II. Trwa ona do czasu, gdy komórki przestaną się
dzielić, faza III. W fazie III komórki, w niektórych przypadkach mogą pozostawać nawet
kilka miesięcy, ale w końcu obumierają.
Ryc. nr 54. Zależność pomiędzy maksymalną długością życia przedstawicieli danego gatunku
i liczbą podwojeń populacji, które komórki pobrane z młodych osobników tego gatunku mogą
osiągnąć w hodowli.
Ryc. nr 301. Mechanizm powstawania chromosomów dicentrycznych.
Ryc. nr 1. Telomery w ludzkich chromosomach zlokalizowane za pomocą sondy
fluorescencyjnej rozpoznającej sekwencję TTAGGG.
Ryc. nr 2. Podstawowe elementy struktury chromosomu w ujęciu schematycznym. Duży
walec na końcu jednego z ramion chromosomu odpowiada telomerowi. Telomer łączy
chromosom z macierzą jądra i stanowi jedno z miejsc, w których zaczyna się replikacja.
Ryc. nr 3. Cykle replikacyjne DNA. DNA w kolejnych cyklach replikacyjnych ulega
skróceniu, gdyż nie zachodzi replikacja wszystkich sekwencji TTAGGG. Po rozdzieleniu się
łańcuchów rodzicielskiego DNA przyłączają się do nich cząsteczki RNA służące jako starter,
co umożliwia polimerazom zsyntetyzowanie łańcuchów potomnych. Po usunięciu starterów
polimeraza uzupełnia brakujące fragmenty DNA, ale nie może uzupełnić brakujących
fragmentów na końcach łańcuchów, co prowadzi do ich skracania w każdym cyklu. Skracaniu
się łańcucha DNA może zapobiec telomeraza. Przypuszcza się, że odcinek 3' telomeru
każdego łańcucha macierzystego, który wystaje poza przeciwległy koniec 5' i jest zawinięty,
odgina się w czasie replikacji. Następuje wówczas normalna, zapoczątkowana przez starter,
synteza DNA. Telomeraza połączona z RNA komplementarnym do sekwencji TTAGGG
może zsyntetyzować brakujący odcinek DNA (odpowiadający miejscu przyłączenia startera)
zaczynając od końca 3'. Po zakończeniu replikacji sekwencje telomerów zawijają się, tworząc
rodzaj czapeczki nałożonej na koniec chromosomu.
3
Ryc. nr 307. Rozmieszczenie mortaliny w komórkach stransformowanych (nieśmiertelnych)
(a) i w takich samych komórkach po transfekcji cDNA mortaliny pochodzącej z komórek
prawidłowych
(śmiertelnych)
(b,
c).
Mortalina
jest
wykrywana
metodą
immunofluorescencyjną.
(a) Komórki stransformowane zawierają mortalinę wokół jądra, natomiast w pozostałej
części komórki jej nie ma i dlatego cytoplazma jest niewidoczna.
(b, c ) W komórkach stransfekowanych mortalina jest dosyć równomiernie rozmieszczona w
cytoplaźmie. Komórki utraciły nieograniczoną zdolność do podziałów.
Ćwiczenie 3. Schematy pokazujące strukturę i czynność błon komórkowych i niektórych
receptorów.
Ryc. nr 101. Analiza i dyskusja na temat struktury 2- i 3-wymiarowej błon. Składniki i
dynamika błon.
Ryc. nr 135. Czynny transport i pompy jonowe.
Ryc. nr 136. Schemat uwalniania i recyrkulacji pęcherzyków synaptycznych.
Ryc. nr 137. Diagram ilustrujący różnice w syntezie i transporcie neuroprzekaźników.
Ryc. nr 139. Kanały jonowe synapsy nerwowo-mięśniowej.
Ryc. nr 140. Struktura receptora dla acetylochoIiny.
Ryc. nr 146. Schemat synapsy nerwowo-mięśniowej.
Tekst i foto. nr 364. Mukowiscydoza – choroba uwarunkowana zaburzeniem przezbłonowego
transportu jonów.
Tekst nr 365. Transportery ABC.
Tekst nr 366. Receptory PPAR (peroxisome proliferator activated receptors), ich znaczenie w
fizjologii i patologii
Fot. nr 370. Miejsce przylegania komórki satelitarnej mięśnia szkieletowego do komórki
śródbłonka.
Ćwiczenie 4. Budowa receptorów i szlaki przekazywania sygnałów.
Ryc. nr 340. Schemat mechanizmu przekazywania sygnałów przy udziale białek Gs i Gi.Ryc.
nr 341. Schemat mechanizmu przekazywania sygnałów przy udziale białek Gq.
Ryc. nr 342. Schemat mechanizmu przekazywania sygnałów przy udziale transducyny Gt w
siatkówce oka.
Ryc. nr 343, nr 344, nr 345 i nr 346. Schematy różnych mechanizmów przekazywania
sygnałów przy udziale kinaz tyrozynowych.
Ryc. nr 347. Schemat mechanizmu przekazywania sygnałów przez receptory dla TGF/BMP.
Ryc. nr 348. Schemat mechanizmu przekazywania sygnałów przez receptory jądrowe.
Ryc. nr 315. Schemat powstawania receptorów rozpuszczalnych.
EM nr 244. Endocytoza zależna od receptorów (internalizacja receptorów). Wgłębienie okryte
(A) i receptorosom (B) zawierające kompleksy znakowanej peroksydazą 2-makroglobuliny i
swoistych receptorów.
EM nr 246. Wykazanie pentamerowej budowy nikotynowego receptora dla acetylocholiny za
pomocą mikroskopii elektronowej.
Tekst i foto. nr 368. Zaburzenie przekazywania sygnału przez receptory związane z białkiem
G na przykładzie wola guzowatego nadczynnego.
Tekst nr 369. Kaweole i ich udział w regulacji przekazywania sygnałów.
Ćwiczenie 5. Demonstracja budowy niektórych cząsteczek adhezyjnych.
Schemat. nr 1. Przykłady najlepiej poznanych rodzin cząsteczek adhezyjnych (tabela).
Najlepiej poznane cząsteczki adhezyjne - kadheryny, integryny, selektyny i cząsteczki
immunoglobulinopodobne zostały podzielone na dwie grupy. Cząsteczki biorące udział w
przyleganiu komórek do komórek oraz w przyleganiu komórek do białek macierzy
pozakomórkowej.
4
Schemat nr 2. Przedstawione są najważniejsze rodzaje połączeń komórkowych typu
przylegania (juncturae adherentes). Należy zwrócić uwagę na to jakie cząsteczki adhezyjne
występują w poszczególnych połączeniach oraz z jakimi łączą się elementami cytoszkieletu.
Schemat nr 3. Na schemacie tym przedstawione są: budowa zewnątrzkomórkowej części
klasycznej kadheryny oraz model interakcji kadheryn w obrębie obwódek przylegania.
Zewnątrzkomórkowa część kadheryn zwinięta jest w pięć podobnych do siebie domen.
Pomiędzy tymi domenami znajdują się miejsca wiążące jony wapnia. Jony te stabilizują
budowę przestrzenną kadheryn. Domena najbardziej oddalona od błony komórkowej
prawdopodobnie bierze udział w wiązaniu ligandów. Sekwencja aminokwasowa His-Ala- Val
odgrywa istotną rolę w wiązaniu tych ligandów, gdyż peptydy zawierające tę sekwencję
blokują adhezję zachodzącą za pośrednictwem kadheryn.
Schemat nr 4. Przedstawiony jest sposób w jaki kadheryny łączą się z białkami cytoszkieletu.
Region wewnątrzkomórkowy kadheryn oddziałuje z cytoszkieletem aktynowym poprzez
różne białka pośredniczące (adaptorowe). Do białek tych należą między innymi kateniny.
(Fotografie zostały przygotowane przez Pana doc. Cezarego Kowalewskiego z Kliniki
Dermatologii Akademii Medycznej w Warszawie).Fot. nr 331. Znaczenie N-kadheryny w
rozwoju ośrodkowego układu nerwowego (opis dołączony do fotografii).Fot. nr 324.
Pęcherzyca zwykła - autoimmunizacyjna choroba pęcherzowa skóry i błon śluzowych z
przeciwciałami skierowanymi przeciw kadherynie desmosomalnej - desmogleinie. Na
fotografii pokazana jest chora z pęcherzycą zwykłą - widoczne są liczne, rozległe nadżerki i
spełzanie naskórka.
Fot. nr 325. Bezpośrednie badanie immunofluorescencyjne skóry pobranej od chorego z
pęcherzycą zwykłą przy użyciu koniugatu skierowanego przeciw ludzkim IgG: fluorescencja
w przestrzeniach międzykomórkowych naskórka odpowiada obecności związanych
przeciwciał pęcherzycowych. W centralnej części naskórka widoczna jest separacja komórek,
tak zwana akantoliza - wynik patogennego działania przeciwciał.
Fot. nr 326. Pęcherz śródnaskórkowy z akantolizą. Badanie histologiczne skóry chorego z
pęcherzycą zwykłą: pęcherz tworzy się śródnaskórkowo ponad warstwą podstawną.
Fot. nr 327 i nr 328. Ultrastrukturalna lokalizacja desmogleiny (autoantygenu
rozpoznawanego przez przeciwciała od chorych na pęcherzycę zwykłą) przy użyciu techniki
immunomikroskopowo-elektronowej postembedding immunogold: obecność licznych ziaren
koloidowego złota w desmosomach.
Fot. nr 329 i nr 330. Komórki akantolityczne w mikroskopii elektronowej pobrane z naskórka
od chorego z pęcherzycą zwykłą: keratynocyty utraciły wzajemne połączenia, zmieniły kształt
z wielobocznego na kulisty. Włókna keratyny utraciły łączność z błoną komórkową i są
pozbijane wokół jąder komórkowych. W obrębie błony komórkowej widoczne są wypustki,
tak zwane mikrokosmki.
Schemat nr 5. Budowa podjednostek integryny – komórkowego receptora dla białek macierzy
pozakomórkowej. Na obrazach spod mikroskopu elektronowego można ujrzeć cząsteczki
mające kształt podobny do przedstawionego na schemacie. Mniej więcej 20 nm od
powierzchni błony komórkowej znajduje się globularna struktura, określana niekiedy mianem
główki. Poprzez wiązanie się z białkami macierzy pozakomórkowej z jednej strony
(zewnątrzkomórkowej) oraz z cytoszkieletem aktynowym (poprzez białka pośredniczące,
takie jak talina i -aktynina) z drugiej (wewnątrzkomórkowej) integryny są swego rodzaju
łącznikami „integrującymi” elementy macierzy wewnątrz- i pozakomórkowej. Oba łańcuchy
integryn:  i  są glikozylowane i połączone ze sobą wiązaniami niekowalencyjnymi.
Łańcuch  receptora dla fibrynogenu (przedstawionego na schemacie) powstaje początkowo
jako pojedynczy polipeptyd o masie cząsteczkowej około 140 000 daltonów, który następnie
jest przecięty na dwa fragmenty spięte kowalencyjnie mostkiem dwusiarczkowym.
Schemat nr 6. Schematyczny rysunek przedstawiający cztery izoformy cząsteczki
immunoglobulino-podobnej N-CAM (neural cell adhesion molecule). Cząsteczka ta
5
występuje w czterech izoformach: jako glikoproteina wydzielana poza komórkę, jako
cząsteczka
zakotwiczona
w
błonie
komórkowej
poprzez
łącznik
z
glikozylofosfatydyloinozytolu oraz jako cząsteczki transbłonowe o krótkim i długim odcinku
wewnątrzcytoplazmatycznym. Zewnątrzkomórkowa część łańcucha polipeptydowego składa
się z kilku domen immunoglobulinowych. Domeny takie, po raz pierwszy opisane w
przeciwciałach (immunoglobulinach), składają się kilkudziesięciu aminokwasów spiętych
wewnętrznym mostkiem dwusiarczkowym.
Schemat nr 7. Tabela przedstawiająca kilka, spośród kilkuset poznanych, cząsteczek immunoglobulinopodobnych. W tabeli opisano te glikoproteiny, które odgrywają istotną rolę w
regulacji odpowiedzi odpornościowej. Wszystkie te cząsteczki wiążą się z integrynami
znajdującymi się na powierzchni leukocytów. W niektórych stanach chorobowych dochodzi
do zwiększenia stężenia ich rozpuszczalnych form w surowicy. Oznaczanie stężenia tych
cząsteczek adhezyjnych może być wykorzystane w diagnostyce tych jednostek chorobowych
lub w celu monitorowania ich terapii.
Schemat nr 8. Na schemacie tym przedstawione są selektyny P, które wiążą się ze swoimi
ligandami (glikoproteinami i glikolipidami). Selektyna P zlokalizowana jest na powierzchni
komórek śródbłonka i płytek krwi. Zbudowana jest ona z domeny lektynowej (wiążącej
oligosacharydy swoich ligandów), fragmentu przypominającego swoją budową czynnik
wzrostu naskórka (EGF) oraz z kilku domen o budowie podobnej do pewnych fragmentów
białek regulujących aktywność układu dopełniacza.
Ćwiczenie 6. Przykłady metod stosowanych w badaniu cyklu komórkowego oraz
zaburzeń regulacji cyklu.
Fot. nr 308. Komórki hodowane in vitro wybarwione za pomocą znakowanych fluoresceiną
przeciw-ciał antytubulinowych (rząd drugi i czwarty od góry) oraz za pomocą barwnika DAPI
wiążącego się z DNA (rząd pierwszy i trzeci od góry). Zdjęcia A i D przedstawiają komórkę
we wczesnej profazie; B i E w późnej profazie, przed kongresją chromosomów; C i F w
metafazie; G i J we wczesnej anafazie; H i K w późnej anafazie; I i L w telofazie. Należy
zwrócić uwagę na zmianę struktury cytoszkieletu mikrotubularnego w przebiegu mitozy.
Schemat nr 311. Schemat przedstawia poznane szlaki przemian białek uczestniczących w
cyklu komórkowym. Nazwy białek obrysowane są elipsami. Cykliny są zaznaczone za
pomocą dużych liter, natomiast inne białka za pomocą nazw kodujących je genów (np. cdc2,
wee1, itd.). Reszty fosforanowe pokazane są jako litera P obrysowana okręgiem. Strzałki
ukazują oddziaływanie bądź przemianę danego białka. W środku ilustracji znajduje się
klasyczny schemat cyklu komórkowego.
Fot. nr 334. Zdjęcie przedstawiające pacjentkę z zespołem Beckwitta-Wiedemanna (dzięki
uprzejmości prof. Lecha Korniszewskiego). Po urodzeniu stwierdzono obecność tworów
guzowatych w jamie brzusznej odpowiadających powiększonym nerkom, stany hipoglikemii,
przepuklinę pępkową i powiększony język. Z czasem zaobserwowano przyspieszony rozwój
fizyczny kontrastujący z opóźnionym rozwojem psychicznym. W trzy lata po urodzeniu
usunięta została jedna z nerek z powodu guza Wilmsa. Zaburzenia te wywołane są brakiem
funkcjonalnego inhibitora CDK p57KIP2 w komórkach.
Preparat nr 3l6F. Autoradiogram fibrobIastów, którym na 15 minut przed utrwaleniem dodano
do pożywki znakowaną trytem tymidynę. Nad jądrami komórek, które wbudowały
znakowaną tymidynę wytworzyły się w emulsji ziarna metalicznego srebra widoczne jako
czarne ziarna. Oznacza to, iż komórki te znajdowały się w fazie S. Po obejrzeniu preparatu
pod powiększeniem dużym, należy narysować kilka komórek znakowanych i kilka nie
znakowanych.
Preparat nr 276. Preparat histopatologiczny przedstawiający pobrane w czasie zabiegu
chirurgicznego oko ludzkie z rozwijającym się siatkówczakiem (retinoblastoma). Zwraca
uwagę zaburzenie prawidłowej budowy siatkówki przez tkankę nowotworową. Składa się ona
z licznych okrągłych i zaostrzonych komórek o hiperchromatycznych jądrach i z niewielką
6
ilością cytoplazmy. Niekiedy układają się one w charakterystyczne rozetki. Dla porównania
przedstawiamy także preparat histologiczny prawidłowej siatkówki.
Ćwiczenie 7. Morfologiczne i biochemiczne zmiany towarzyszące apoptozie.
Porównanie cech morfologicznych nekrozy i apoptozy.
Prep. nr 200. Pozawałowa martwica mięśnia sercowego - komórki silnie kwasochłonne, z
obrzmiałą cytoplazmą. Widoczne komórki nacieku zapalnego.
Prep. nr 201. (a - kontrola, b - ekspozycja 400 radów) Apoptoza wywołana naświetlaniem
promieniowaniem jonizującym w jelicie myszy.
Morfologia komórek ulegających apoptozie.
Zdjęcia wykonane techniką elektronowej mikroskopii skaningowej:
EM nr 305a. Powierzchnia komórki nowotworowej raka wątroby. Na powierzchni widoczne
są liczne mikrokosmki.
EM nr 305b. Ta sama komórka po inkubacji z limfocytami cytotoksycznymi (l). Widoczne
tworzenie uwypukleń błony komórkowej we wczesnym stadium formowania ciałek
apoptotycznych.
EM nr 304b. Powierzchnia komórki w późnym stadium apoptozy. Kraterowate zagłębienia
błony komórkowej odpowiadają jej połączeniom z rozszerzonymi cysternami siateczki
śródplazmatycznej.
Zdjęcia wykonane metodą elektronowej mikroskopii transmisyjnej:
EM nr 304a. Rozpad komórki na ciałka apoptotyczne. Widoczne silne pofałdowanie
powierzchni komórki.
EM nr 304c. Kondensacja chromatyny ma charakter obwodowy, skupiając się pod osłonką
jądra. Osmofilne grudki, widoczne w centralnej części karioplazmy są pozostałością jąderka.
EM nr 306. Zaawansowany podział na ciałka apoptotyczne z dobrze widoczną, zagęszczoną
chromatyną (n). Widoczne są również: duże, skondensowane ciałko apoptotyczne (a),
komórka nowotworowa (c) i limfocyt (l).
EM nr 304d. Ciałko apoptotyczne sfagocytowane przez inną komórkę, z widocznym
fragmentem silnie skondensowanej chromatyny.
EM nr 301. Nabłonek krypty jelitowej, po indukcji apoptozy cytostatykiem.
Strzałka wskazuje „obrączkową” kondensację chromatyny. Widoczne na zdjęciu dwie inne
komórki (N) wykazują mocno zaawansowaną degradację struktury wewnętrznej.
Wpływ hormonów troficznych na apoptozę w narządach docelowych:Prep. nr 202.
Obniżenie poziomu ACTH u noworodka szczura powoduje atrofię kory nadnerczy. Proszę
zidentyfikować komórki apoptyczne.Prep. nr 203b. Usunięcie jąder w wyniku kastracji
powoduje nasilenie apoptozy w gruczole krokowym. Dla porównania – preparat kontrolny
(prep. nr 203a).
Fot. nr 335. Wpływ mutacji genu dla CD 95% na morfologię narządów limfatycznych:
węzłów chłonnych i śledziony u myszy lpr. Symbole „+” i „-‘’ oznaczają allele genu,
odpowiednio dominujący i recesywny. Homozygotę dominującą (+/+), jak i heterozygoty
(+/-) cechuje prawidłowa morfologia węzłów i śledziony. Jedynie homozygota recesywna (-/) wykazuje defekt w postaci limfadenopatii i splenomegalii.
Fot. nr 336. Fragmentacja DNA jądrowego – „drabinka” DNA otrzymana w wyniku
indukcji apoptozy w komórce. Fotografia przedstawia wynik elektroforezy DNA izolowanego
z komórek kontrolnych (K) i z komórek hodowanych in vitro w obecności przeciwciała antyCD95 (APO). Dla ułatwienia oceny wielkości produktów degradacji DNA użyto mieszaniny
syntetycznych odcinków DNA (Mx), o długości, odpowiednio: 50, 100, 200, 300, 400, 500,
700, 1000, 1500 i 2000 par zasad. Proszę określić przybliżoną wielkość trzech dowolnie
wybranych prążków z próbki oznaczonej „APO”.
Fot. nr 337. Fotografia preparatu histopatologicznego wątroby mysiej, uszkodzonej przez
podane dożylnie przeciwciało anty-CD95. Podobny obraz obserwuje się w uszkodzeniu
tego narządu, w przebiegu „piorunującego” wirusowego zapalenia wątroby typu B lub C.
7
Ćwiczenie 8. Rola czynników wzrostu w regulacji proliferacji i różnicowania na
przykładzie tkanki kostnej i hemopoetycznej.
Fot. nr 316. Młoda chrząstka szklista powstała po 8 dniach w miejscu kontaktu tkanki łącznej
mięśni szkieletowych biorcy ze wszczepioną matrycą.
Fot. nr 317. Kościotworzenie śródchrzęstne w miejscu implantacji demineralizowanej
matrycy kostnej w 14-16 dni po wszczepieniu. Tkanka kostna powstaje w miejscu uprzednio
zajętym przez wyindukowaną chrząstkę (porównaj z fot. nr 316).
Fot. nr 318. Makroskopowy obraz zmian kości podudzia myszy wywołanych
wirusopochodnym mięsakiem Moloney'a. Po stronie prawej kość izolowana z łapy objętej
zmianą nowotworową (30 dni po miejscowym podaniu onkogennego wirusa Mu-MSV). Po
stronie lewej - izolowana kość podudzia łapy kontralateralnej tego samego zwierzęcia.
Zamiast wirusa podano tu 0.9% NaCl. Przyrost suchej masy kości zmienionej sięga 120%!
Fot. nr 319. Pobudzenie chondrogenezy chrząstki sprężystej ucha myszy po podaniu wirusa
Mu-MSV. W następstwie rozwoju nowotworu błona ochrzęstnowa uległa aktywacji i odkłada
nowe warstwy chrząstki.
Fot. nr 320. Schemat hematopoezy.
Fot. nr 321. Kontrola hematopoezy przez czynniki wzrostu i różnicowania (schemat).
Schem. nr 322. Wpływ granulocytarnego czynnika wzrostu (G-CSF) na produkcję
granulocytów obojętnochłonnych.
Fot. nr 323. Obraz rozmazu krwi obwodowej przed- i po podaniu G-CSF. Po podaniu G-CSF
zwiększa się liczba granulocytów w polu widzenia.
Schem. nr 324. Charakterystyka czynników wzrostu dla komórek hematopoetycznych.
Schem. nr 325. Podsumowanie efektów działania G-CSF.
Schem. nr 326. G-CSF powoduje szybki wzrost liczby neutrofilów we krwi obwodowej.
Schem. nr 327. Wpływ G-CSF na komórki mieloidalne.
Schem. nr 328. Wpływ podania G-CSF na obraz krwi obwodowej.Prep. nr 206. Przekrój
podudzia myszy, której 12 dni wcześniej podano miejscowo wirusa Mu-MSV. Widoczne są
uszkodzone mięśnie, zajmowane przez komórki mięsaka. Na przekrojach kości strzałkowej i
piszczelowej widoczne są od strony zmian nowotworowych pogrubienia błony okostnowej i
w jej obrębie bardzo żywe kościotworzenie. Nowopowstała kość wyraźnie różni się od kości
dojrzałej - osteocyty są duże, jamki kostne słabo zaznaczone, macierz kostna słabiej
wybarwiona.
Prep. nr 207. Przekrój małżowiny usznej myszy w miejscu podania konkanawaliny A aktywatora limfocytów T. Miejscowa nieswoista reakcja zapalna powoduje aktywację błony
ochrzęstnowej chrząstki ucha. Pobudzona do proliferacji ochrzęstna wytwarza młodą
chrząstkę, której komórki nie są jeszcze zwakuolizowane. Proszę też zwrócić uwagę na
pobudzenie naskórka do proliferacji!
Ćwiczenie 9. Różnicowanie komórek na przykładzie przedimplantacyjnego rozwoju
zarodka myszy.
Prep. nr 1. Oocyt niezapłodniony w stadium metafazy II (należy zaznaczyć: wrzeciono II
podziału dojrzewania, I ciałko kierunkowe, osłonkę przejrzystą).
Prep. nr 2. Zapłodniona komórka jajowa (należy zaznaczyć: główkę plemnika, odcinające się
II ciałko kierunkowe, osłonkę przejrzystą, zwrócić uwagę na postać chromatyny jaja i
plemnika).
Prep. nr 3. Zygota w stadium przedjądrzy (należy zaznaczyć. oba przedjądrza i II ciałko
kierunkowe).
Prep. nr 4. Zarodki 4- i 8-blastomerowe (należy zaznaczyć: osłonkę przejrzystą i jądra
blastomerów).
Prep. nr 5. Zarodki 8-blastomerowe przed i po kompakcji (należy opisać w punktach różnice
w morfologii w obu rodzajach zarodków).
8
Prep. nr 6. Blastocysty (należy zaznaczyć: osłonkę przejrzystą, trofektodermę, jamę
blastocysty i węzeł zarodkowy).
Prep. nr 7. Oocyt haploidalny z II ciałkiem kierunkowym (należy zaznaczyć: osłonkę
przejrzystą, przedjądrze żeńskie i II ciałko kierunkowe).
Tekst i ryc.370. Zespół Pradera-Willego.
Fot. nr 89b. Zdjęcie pacjenta z zespołem Pradera-Willego. Występowanie tego schorzenia jest
wynikiem częściowego uszkodzenia (mikrodelecja) 15 chromosomu ojcowskiego.
Fot..nr 89c. Zdjęcie pacjentki z zespołem Angelmana. Schorzenie to jest rezultatem
częściowego ubytku (mikrodelecja)matczynego chromosomu 15. Mikrodelecja chromosomu
ojcowskiego u potomstwa objawia się występowaniem zespołu Pradera-Willego.
Ćwiczenie 10. Schematy pokazujące strukturę i czynność cytoszkieletu.
Schem. nr 1. Występowanie trzech rodzajów filamentów tworzących szkielet komórki.
Schem. nr 2. Budowa filamentów pośrednich Fot. 228. Układ filamentów prekeratynowych w
hodowanej in vitro komórce nabłonkowej nerki ludzkiej. Należy zwrócić uwagę na
zagęszczenie filamentów wokół jądra (barwiono metodą immunofluorescencyjną z użyciem
przeciwciał przeciwko prekeratynie).
Fot. nr 229. Rozmieszczenie desminy, wimentyny, -aktyniny, aktyny i niektórych organeli
we włóknie mięśnia poprzecznie prążkowanego.
Schem. nr 3. Budowa mikrotubul oraz rozmieszczenie mikrotubul w komórkach.
Fot. nr 116. System mikrotubul w komórce nabłonkowej hodowanej in vitro, wyizolowanej z
nabłonka przejściowego ludzkiego pęcherza moczowego. Reakcja peroksydazowa (PAP peroxidase-anti-peroxidase) z użyciem przeciwciał przeciwko tubulinie (AG).
Fot. nr 4A. Dynamika mikrotubul wykazana w hodowli komórek in vitro: tubulinę połączoną
z biotyną wstrzyknięto do komórki hodowanej in vitro, komórkę utrwalono po 1 minucie, a
następnie wykazano obecność tubuliny metodą immunofluorescencyjną stosując przeciwciała
przeciwko biotynie.
Fot. nr 4B. Komórka tego samego typu co na fot. nr 4A, zabarwiona za pomocą sprzężonego
z barwnikiem fluorescencyjnym przeciwciała przeciwko tubulinie (fot. nr 4B). Zdjęcia
wykazują, że mikrotubule są w komórce w stanie równowagi dynamicznej, tzn. tubulina jest
przyłączana do końca plus (+) i odłączana od końca minus (-).
Schem. nr 4. Działanie białek motorycznych odpowiedzialnych za ruch wzdłuż mikrotubul.
EM nr 117. Replikacja par centrioli.
Schem. nr 6. Budowa filamentu aktynowego oraz ułożenie filamentów aktynowych w
różnych obszarach pełzającej komórki.Schem. nr 7. Główne klasy białek towarzyszące
aktynie.Schem. nr 8. Oddziaływanie niektórych białek z filamentami aktynowymi.
Schem. nr 9. Interakcja miozyny I i miozyny II z filamentami aktynowymi.
Schem. nr 10. Budowa i fosforylacja miozyny II.
Schem. nr 11. Przykłady struktur kurczliwych w komórkach niemięśniowych.
Fot. nr 119. Układ filamentów aktynowych tworzących grube, równoległe pęczki w postaci
włókien naprężeniowych (ang. stress fibers) w normalnej komórce nabłonkowej hodowanej in
vitro, wyizolowanej z nabłonka przejściowego ludzkiego pęcherza moczowego (barwiono
metodą immunofluorescencyjną z użyciem przeciwciał przeciwko aktynie) (AG).
Fot. nr 120. Brak pęczków włókien naprężeniowych w stransformowanej komórce
nabłonkowej wyizolowanej z raka pęcherza moczowego człowieka. Na obwodzie w części
korowej komórki widoczna sieć mikrofilamentów aktynowych (barwienie jak fot. nr 119)
(AG).
Schem. nr 13. Połączenia komórkowe typu przylegania.
Schem. nr 14. Budowa szkieletu błony erytrocytu.
Schem. nr 15. Połączenie dystrofiny z filamentami aktynowymi oraz z glikoproteinami
sarkolemmy.
Schem. nr 16. Powstawanie płytki przylegania.
9
Schem nr 17. Fibroblast przemieszczający się na podłożu.
Ćwiczenie 11. Terapia komórkowa.
Ryc. 1. Procesy prowadzące do remodelowania w przypadku uszkodzenia serca.
Ryc. 2. Alternatywne sposoby leczenia uszkodzonego serca.
Ryc. 3. Komórki szpiku kostnego w regeneracji myocardium.
Ryc. 4. Różnicowanie komórek macierzystych pochodzących z mięśnia.
Ryc. 5. Źródła, hodowla in vitro i zastosowanie komórek macierzystych dorosłych w terapii.
Ryc. 6. Lokalizacja komórek macierzystych nerwowych w zonie podependymalnej
okołokomórkowej oraz w hipokampie.
Ryc. 7. Drogi nerwowe podlegające degeneracji w chorobie Parkinsona.
Ryc. 8. Różnicowanie komórek hemocytopoezy i komórek zrębu szpiku.
Ryc. 9. Nisze występowania komórek macierzystych nabłonkowych.
Ryc.10.Wstępne dowody plastyczności komórek macierzystych dorosłych.
Ryc.11. Wytwarzanie komórek wysp trzustki uwalniających insulinę w układzie komórek
macierzystych embrionalnych myszy.
Ryc.12. Źródło, hodowla in vitro i stosowanie w terapii komórkowej komórek macierzystych
embrionalnych.
Ryc.13. Różnicowanie ludzkich komórek macierzystych embrionalnych.
Ryc.14. Techniki wytwarzania komórek macierzystych embrionalnych.
Ryc.15. Rodzaje komórek różnicujących się z komórek macierzystych embrionalnych.
Ryc.16. Klonowanie komórek macierzystych zarodkowych (ES)
Ryc.17. Współczesne sposoby stosowania inżynierii tkankowej.
Ryc.18. Kontrola wzrostu embrionalnych i dorosłych kardiomiocytów.
Ćwiczenie 12. Konserwacja tkanek i narządów dla celów przeszczepiania.
1. Ogólne omówienie problematyki transplantacyjnej (bez materiału, w grupach).
2. Działalność banków tkanek (schemat nr 1 i nr 2).
3. Hodowanie i konserwowanie ludzkich keratynocytów (schemat nr 3)
4. Teoretyczne aspekty stosowania konserwowanych allogenicznych przeszczepów kostnych
(schemat nr 4 i nr 5).
5. Materiał kolagenowy stosowany w chirurgii odtwórczej (schemat nr 6 i nr 7).
6. Konserwowanie zastawek serca (schemat nr 8 i nr 9).
7. Zastępowanie tkanek materiałami sztucznymi - implantologia (schemat nr 10 i nr 11).
Materiały pomocnicze:
1. J. Komender i A. Komender - "Technika przygotowywania przeszczepów biostatycznych"
w "Zarys chirurgii transplantacyjnej" pod red. W. Rowińskiego i J. Wałaszewskiego ,
1993 , str. 214- 218
2. J. Komender (redaktor) - "Przeszczepy biostatyczne", część 2, PZWL 1981
Ćwiczenie 13. Zwiedzanie Centralnego Banku Tkanek.
ZALECANE PODRĘCZNIKI
1. „Fizjologia molekularna komórki” red. S. Moskalewski, W. Sawicki, tom I i II (skrypt),
Warszawska Akademia Medyczna, 1998 (do nabycia w Dziale Wydawnictw Akademii
Medycznej w Warszawie ul. Pawińskiego 3).
2. "Histologia z elementami biologii molekularnej", red. S. Moskalewski i W. Sawicki
(skrypt), Warszawska Akademia Medyczna, 1995 (do nabycia w Dziale Wydawnictw
Akademii Medycznej w Warszawie ul. Pawińskiego 3).
LITERATURA DODATKOWA
1."Molecular Biology of the Cell", Third Edition, Bruce Alberts i współpracownicy,1994
2. "Zarys chirurgii transplantacyjnej", red. W. Rowiński i J. Wałaszewski, 1993
3. "Przeszczepy biostatyczne", część 2, red. J. Komender, wyd. PZWL,1981
10