odpowiedź antyoksydacyjna roślin pomidora na infekcję botrytis

S ł u p s k i e P r a c e B i o l o g i c z n e 5 • 2008
ODPOWIEDŹ ANTYOKSYDACYJNA ROŚLIN POMIDORA
NA INFEKCJĘ BOTRYTIS CINEREA
THE ANTIOXIDANT REACTION OF TOMATO PLANTS
TO BOTRYTIS CINEREA INFECTION
Tomasz Furmanek
Akademia Pomorska
Zakład Biologii Eksperymentalnej i Ochrony Środowiska
Instytut Biologii i Ochrony Środowiska
ul. Arciszewskiego 22b, 76-200 Słupsk
e-mail: [email protected]
ABSTRACT
Tomato plants are easily infected by a broad spectrum of fungus. Among them Botrytis
cinerea is particularly dangerous. The goal of this study was to investigate tomato plants’
responses to infection with this fungus in in vitro settings. The stabilized tissue cultures derived from three wild forms and three cultivated forms of tomato were used in the study. The
plants were infected through mechanical inoculation with “suspension of spores” of the Botrytis cinerea. Then, after 24, 48, 72 and 96 hours from fungus infection, the activity of catalase and peroxidase in the leaves was measured. The degree of plants’ infection was evaluated
according to standard criterion. The obtained results demonstrated clearly that wild species
were more resistant to fungus infection than cultivable plants. In spite of this, the cultivated
ones contained a higher level of the antioxidative enzymes’ activity, compared to wild species. The activity of these enzymes was increasing with the duration of fungus infection.
Słowa kluczowe: pomidor, stres, Botrytis, katalaza, peroksydaza
Key words: tomato, stress, Botrytis, catalase, peroxydase
WPROWADZENIE
Pomidor jest rośliną o duŜym znaczeniu gospodarczym. Stosunkowo wysoka wilgotność powietrza i spadki temperatur w przypadku upraw w gruncie sprzyjają rozwojowi
chorób, zwłaszcza szarej pleśni powodowanej przez Botrytis cinerea. W warunkach stresowych wywołanych infekcją grzyba uruchamiane są mechanizmy ochronne, w których
kluczową rolę odgrywają enzymy antyoksydacyjne (Małolepsza i RóŜalska 2005). Ograniczają one penetrację tkanek poraŜonej rośliny przez mykotoksyny (Lurie i in. 1997)
i uczestniczą w unieszkodliwianiu reaktywnych form tlenu (Gay i Tuzin 2000). Zmiany
w aktywności enzymów – katalazy i peroksydazy – (Kuźniak i Skłodowska 1999, 2001) są
odpowiedzią roślin na poraŜenie grzybem.
37
Celem przeprowadzonych badań było określenie zmian aktywności enzymów antyoksydacyjnych w roślinach pomidora infekowanych grzybem Botrytis cinerea w kulturach in
vitro.
MATERIAŁ I METODY BADAŃ
Materiałem badawczym były rośliny dzikich form pomidora: Lycopersicon peruvianum
(L) Mill LA1278 i LA2744, L. hirsutum Humb. et Bonp. f. glabratum 99L1303 oraz odmian uprawnych: Wysoki Krakus, Beta i Oskar F1. Nasiona otrzymano z: PHN L. Legutko,
POLAN Kraków, PHRO Krzeszowice oraz z Tomato Genetics Resource Center Department of Vegetable Crops Uniwersytetu Kalifornijskiego w USA.
Sterylne kultury załoŜono według metody Fari i in. (1991) w modyfikacji własnej
(Furmanek i Andrzejewska-Ponomarev 2006). Nasiona (sterylizacja 70% etanol + 0,1%
NaOCl i płukanie w sterylnej H2O destylowanej) wykładano na poŜywkę MS bez witamin
i hormonów. Po 10 dniach wzrostu siewkom dekapitowano wierzchołki i wykładano je na
poŜywkę elongacyjną MS + 0,3 mg·dm-3IAA. Łodygi 4-tygodniowych roślin cięto na fragmenty z pączkiem bocznym. Tak przygotowane eksplantaty wykładano na poŜywkę
namnaŜającą MS + 3,0 mg·dm-3BAP. Z wieloroślinek odcinano pędy i ukorzeniano na poŜywce MS. Otrzymane rośliny infekowano przez wstrzykiwanie 1µl zawiesiny zawierającej 1 x 10-6 ml zarodników grzyba. KaŜdorazowo infekowano po 60 roślin z badanej formy
pomidora. W 24, 48, 72 i 96 godzinie od ich infekcji przeprowadzano obserwacje ich wyglądu oraz wykonywano pomiary aktywności enzymów katalazy i peroksydazy (Nakano
i Asada 1981). Aktywność enzymów oznaczono na podstawie spektrofotometrycznego
pomiaru absorbancji światła ekstraktów roślinnych. Doświadczenie załoŜono w 3 replikacjach.
Obliczono wartości średnie badanych cech oraz odchylenie standardowe.
WYNIKI I DYSKUSJA
Grzyb Botrytis cinerea jest pospolitym grzybem pasoŜytniczym (Commenil i in. 1998,
Espino i in. 2005), który u pomidora powoduje groźną chorobę nazywaną szarą pleśnią.
Reakcje roślin na poraŜenie grzybami są przedmiotem wielu badań. W zainfekowanych
roślinach dochodzi do zmian w strukturze i funkcji komórek, tkanek i poszczególnych
organów. Postępująca zgorzel naczyniowa prowadzi do więdnięcia i zamierania roślin
(Kochman 1980, Quidde i in. 1998).
Spośród sześciu testowanych form pomidora pierwsze objawy poraŜenia zaobserwowano po 24 godzinach od infekcji na roślinach L. hirsutum oraz odmianie Oskar F1. Występujące przebarwienia były podstawą zaklasyfikowania roślin do 7-8 stopnia poraŜenia (tab. 1).
W drugiej dobie od infekcji u wszystkich testowanych roślin stwierdzono objawy poraŜenia. Największe zaobserwowano u roślin odmiany Wysoki Krakus (5 stopień poraŜenia),
najmniejsze – u formy L. peruvianum LA1278 (8 stopień poraŜenia). Po 96 godzinach od
infekcji wykazano, Ŝe rośliny form dzikich, zwłaszcza L. peruvianum LA1278 i L. hirsutum (5-6 stopień poraŜenia) były w mniejszym stopniu poraŜone niŜ rośliny odmian
uprawnych Wysoki Krakus i Beta (3-4 stopień poraŜenia).
Podczas infekcji Botrytis cinerea syntetyzuje enzymy degradujące ściany komórkowe
roślin. Odpowiedzią roślin jest blokowanie lub opóźnienie rozwoju infekcji. Mellersh i in.
38
Tabela 1
Analiza stanu roślin pomidora w kolejnych 4 dobach od ich infekcji Botrytis cinerea
(w skali bonitacyjnej wg Góreckiego i Grzesiuka 2002)
Table 1
The analysis of the tomato plants on the 4 successive days after infection with Botrytis cinerea
(index by Górecki and Grzesiuk 2002)
Forma pomidora
Tomato form
L. peruvianum LA1278
L. peruvianum LA2744
L. hirsutum f. glabratum
Wysoki Krakus
Beta
Oskar F1
Wariant
Inf.*
Kont.*
Inf.
Kont.
Inf.
Kont.
Inf.
Kont.
Inf.
Kont.
Inf.
Kont.
0
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
Czas pomiaru (h)
Time analysis (hours)
24
48
72
9
8
7
9
9
9
9
6-7
5-6
9
9
9
7-8
6
6
9
9
9
9
5
4
9
9
9
9
7
6
9
9
9
7-8
7
6
9
9
9
96
5-6
9
4
9
5
9
3
9
4
9
5
9
Inf. – rośliny infekowane (infected plants)
Kont. – rośliny kontrolne (control plants)
(2002) oraz Baker i in. (2005) wykazali, Ŝe w początkowych stadiach infekcji zasadniczą
formą RFT wytwarzaną przez rośliny jest nadtlenek wodoru, którego zwiększona produkcja
prowadzi do reakcji nadwraŜliwości. Odpowiedzią rośliny na czynnik stresowy jest zachowanie równowagi pomiędzy wytwarzaniem reaktywnych form tlenu, a ich usuwaniem przez
wyspecjalizowane systemy (Bartosz 1995). Reaktywne formy tlenu wywołują liczne reakcje
w komórce, co doprowadziło do wykształcenia u roślin róŜnych mechanizmów obronnych,
do których zaliczane są enzymy katalaza i peroksydaza (Tiedemann 1997).
Na podstawie wykonanych pomiarów aktywności enzymów antyoksydacyjnych moŜna
zauwaŜyć, Ŝe po infekcji zarówno rosła, jak i malała aktywność katalazy (tab. 2), natomiast
aktywność peroksydazy była wyŜsza (tab. 3).
U roślin infekowanych z linii LA1278 i LA2744 formy Lycopersicon peruvianum
w pierwszej i drugiej dobie od zabiegu aktywność katalazy była niŜsza niŜ ta obserwowana
u roślin kontrolnych. W pierwszej dobie od infekcji aktywność katalazy w infekowanych
roślinach L. hirsutum była wyraźnie wyŜsza od tej w grupie kontrolnej, podczas gdy
w drugiej i trzeciej dobie było odwrotnie. Aktywność katalazy w roślinach odmian uprawnych w warunkach stresowych była zawsze wyŜsza niŜ ta u roślin kontrolnych. Na podstawie wyliczonego odchylenia standardowego moŜna stwierdzić, Ŝe spośród badanych form
zwłaszcza infekowane rośliny Lycopersicon hirsutum były zróŜnicowanie pod względem
aktywności katalazy.
39
40
41
Otrzymane wyniki są zgodne z doniesieniem Mlíčkovej i in. (2004) o reakcji roślin pomidora na infekcję Odium neolycopersici. W pierwszych dobach od infekcji wzrost aktywności enzymów: katalazy i peroksydazy u odmian uprawnych był wyraźny. Zdaniem Mlíčkovej i in. (2004), aktywność enzymów antyoksydacyjnych jest skorelowana z produkcją
reaktywnych form tlenu.
Reakcja form naturalnych (dzikich) na infekcję grzybem była inna niŜ reakcja odmian
uprawnych. Ze względu na swoją odrębność genetyczną i duŜą ekspresję cech dziedzicznych, formy naturalne powinny być wykorzystywane w hodowli pomidora (Hassan i in.
1989, Asins i in. 1993). Zgodnie z sugestiami tych autorów, spośród gatunków uŜytych
w doświadczeniu, na uwagę zasługują L. hirsutum i L. peruvianum.
Tego typu badania wymagają kontynuacji. Do oceny odporności roślin na stres naleŜy
wykorzystać więcej form pomidora oraz zbadać inne parametry fizjologiczne.
WNIOSKI
1. Formy pomidora charakteryzowały się zróŜnicowaną reakcją na infekcję Botrytis cinerea.
2. Zainfekowane rośliny linii LA1278 i LA2744 formy Lycopersicon peruvianum charakteryzowały się niŜszą aktywnością katalazy w porównaniu z roślinami przed infekcją.
3. U roślin infekowanych wszystkich badanych form pomidora stwierdzono większą aktywność peroksydazy w porównaniu z roślinami kontrolnymi.
4. Pomiar aktywności enzymów antyoksydacyjnych wydaje się dobrym kryterium oceny
wraŜliwości roślin na poraŜenie patogenami.
LITERATURA
Asins M.J., Breto M.P., Carbonell E.A. 1993. Salt tolerance in Lycopersicon species. II: Genetic
effects and a search for associated traits. Theor. Appl. Genet., 86: 769-774.
Baker C.J., Mock N.M., Whitaker B.D., Roberts D.P., Rice C.P., Deahl K.L., Aver’yanov A.A. 2005.
Involvement of acetosyringone in plant-pathogen recognition. Biochem. Biophys. Res. Commun., 328: 130-136.
Bartosz G. 1995. Druga twarz tlenu. PWN, Warszawa.
Commenil P., Belinghari L., Dehorter A. 1998. Antilipase antibodies prevent infection of tomato
leaves by Botrytis cinerea. Physiol. Mol. Plant Pathol., 52: 1-14.
Espino J.J., Brito N., Noda J., González C. 2005. Botrytis cinerea endo-β-1.4-glucanase Cel5A is
expressed during infection but is not required for pathogenesis. Physiol. Mol. Plant Pathol., 66:
213-221.
Fari M., Szasz A., Mitykö J., Nagy I., Csanyi M., Andrasfalvy A. 1992. Induced organogenesis via
the Seedling Decapitation Method (SDM) in three Solanaceous vegetable species. Capsicum
Newsletter 7th Meeting “Genetic and Breeding on Capsicum and Eggplant”. Rome, Italy, 7-10
September 1992: 243-248.
Fizjologia plonowania roślin. Górecki R.J., Grzesiuk S. 2002 (red.). UWM, Olsztyn.
Furmanek T., Andrzejewska-Ponomarev M. 2006. Wpływ ołowiu na rozwój roślin pomidora Lycopersicon sp. określony w warunkach in vitro. Słupskie Pr. Biol., 3: 5-12.
Gay P.A., Tuzin S. 2000. Temporal and spatial assessment of defense response in resistant and susceptible cabage varieties during infection with Xantomonas campestris pv. Campestris. Physiol.
Mol. Plant Pathol., 57: 201-210.
Hassan A.A., Al-Afifi M.A., Matsuda K., Koto A., Itani S. 1989. Sources of salinity tolerance in
Lycopersicon species. Bull. Fac. Agric. Univ. Cairo., 40: 605-621.
42
Kochman J. 1980. ZakaŜenie roślin przez grzyby. PAN, Warszawa.
Kuźniak E., Skłodowska M. 1999. The effect of Botrytis cinerea infection on ascorbate-glutathione
cycle in tomato leaves. Plant Sci., 148: 69-76.
Kuźniak E., Skłodowska M. 2001. Ascorbate, glutathione and related enzymes in chloroplasts of
tomato leaves infected by Botrytis cinerea. Plant Sci., 160: 723-731.
Lurie S., Fallik E., Handros A., Shapira R. 1997. The possible involvement of peroxidase in resistance to Botrytis cinerea in heat treated tomato fruit. Physiol. Mol. Plant Pathol., 50: 141-149.
Małolepsza U., RóŜalska S. 2005. Nitric oxide and hydrogen peroxide in tomato resistance. Nitric
oxide modulates hydrogen peroxide level in α-hydroxyethylorutin-induced resistance to Botrytis
cinerea in tomato. Plant Physiol. Biochem., 43: 623-635.
Mellersh D.G., Foulds I.V., Higgins V.J., Heath M.C. 2002. H2O2 plays different roles in determining
penetration failure in three diverse plant-fungal interactions. Plant Journal., 29: 257-268.
Mlíčkova K., Luhová L., Lebeda A., Mieslerová A., Peč P. 2004. Reactive oxygen species generation
and peroxidase activity during Oidium neolycopersici infection on Lycopersicon species. Plant
Physiol. Biochem., 4: 753-761.
Nakano Y., Asada K. 1981. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in
spinach chloroplasts. Plant Cell Physiol., 22: 867-880.
Quidde T., Osborn A.E., Tudzyński P. 1998. Detoxification of α-tomatine by Botrytis cinerea.
Physiol. Mol. Plant Pathol., 52: 151-165.
Tiedemann A.V. 1997. Evidence for primary role of active oxygen species in induction of host cell
death during infection bean leaves with Botrytis cinerea. Physiol. Mol. Plant Pathol., 50: 151-166.
43