Szablon dla tlumaczy

ROZDZIAŁ 10
Witaminy
Agnieszka Kłych
Agnieszka Kosowska
Teresa Jurczak
Witaminy to drobnocząsteczkowe egzogenne związki organiczne, które pełnią funkcje
regulatorowe i są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania organizmu. W odróżnieniu od
większości składników pokarmowych, witaminy nie są substratami energetycznymi, ale
uczestniczą w reakcjach katalitycznych pełniąc rolę koenzymów. Witaminy pełnią także
funkcje parahormonalne. Witaminy muszą być dostarczane do organizmu z pożywieniem w
postaci
prowitamin
lub
witamin
preformowanych,
bądź
są
produkowane
przez
mikroorganizmy zasiedlające przewód pokarmowy. Podział witamin opiera się na ich
rozpuszczalności.
Witaminy rozpuszczalne w tłuszczach
Wchłanianie tych witamin uzależnione jest od prawidłowego trawienia i wchłaniania
tłuszczów pokarmowych. Nieprawidłowe wchłanianie tłuszczów skutkuje niedoborem
witamin rozpuszczalnych w tłuszczach. Transport witamin rozpuszczalnych w tłuszczach w
organizmie odbywa się dzięki udziałowi swoistych białek transportujących lub lipoprotein
osocza. Ponieważ witaminy te są nierozpuszczalne w wodzie, ich wydalanie przez nerki jest
uniemożliwione. Dlatego w przypadku ich nadmiernej podaży mogą gromadzić się w
tkankach bogatych w tłuszcz, osiągając stężenia toksyczne. W praktyce objawy toksyczne są
efektem farmakologicznego przedawkowania tych witamin.
285
Witamina A
Rysunek 10.1. Retinol
Wszystkie pochodne witaminy A są związkami 20-węglowymi, zawierającymi pierścień
β-jononu oraz dwie jednostki izoprenowe. Ponadto w strukturze występują cztery sprzężone
wiązania podwójne. Aktywność witaminy A wykazują retinoidy, czyli retinol, retinal i kwas
retinowy. Przy czym pełną aktywność biologiczną ma jedynie retinol. W formie
preformowanej witamina A występuje jedynie w pokarmach zwierzęcych w postaci estrów
kwasu retinowego. Natomiast karotenoidy i ich pochodne występujące w pokarmach
roślinnych są prowitaminami dla człowieka. Do karotenoidów będących prekursorami
witaminy A zaliczane są głównie: karoteny α, β, γ oraz kryptoksantyna.
Karotenoidy w jelicie ulegają rozszczepieniu przez dioksygenazę karotenową tworząc retinal.
Retinal ulega redukcji do retinolu, a następnie estryfikacji. W takiej formie wydzielany jest do
chylomikronów. Chylomikrony są transportowane z limfą i trafiają do krążenia wrotnego
wątroby. Uwolniony z wątroby retinol transportowany jest z krwią w połączeniu z białkami
RBP. Na powierzchni komórki występują specyficzne receptory wiążące kompleks witamina
A - RBP. Po związaniu, retinol uwalniany jest do wnętrza komórki, gdzie przekształcany jest
do retinalu lub kwasu retinowego.
W komórce retinol i kwas retinowy łączą się odpowiednio z białkami CRBP i CRABP.
Kompleksy takie łączą się z receptorami jądrowymi: RAR (dla kwasu retinowego) i RXR (dla
retinoidów). Wnikając do jądra, regulują ekspresję genów.
Źródła aktywnej witaminy A: tran, mleko, wątroba, żółtka jaj, ser.
Źródła prowitaminy A: warzywa i owoce zawierające karoteny.
Funkcje:
 retinal jest składnikiem rodopsyny,
 retinol jest niezbędny do prawidłowego wzrostu i różnicowania komórek,
 retinol jest niezbędny do prawidłowego działania hormonów steroidowych,
 kwas retinowy jest niezbędny do syntezy glikoprotein i mukopolisacharydów,
 kwas retinowy działa jak hormon steroidowy,
286
 kwas retinowy wykazuje działanie przeciwnowotworowe,
 witamina A bierze udział w regulacji ekspresji genów,
 witamina A warunkuje integralność błon komórkowych,
 witamina A odpowiada za funkcje nabłonka.
Dobowe zapotrzebowanie: 1-2 mg.
Przyczyny niedoboru witaminy A: zespół złego wchłaniania i trawienia, choroby miąższu
wątroby, niedobór w diecie.
Skutki niedoboru witaminy A: zmiany w obrębie oczu (suchość spojówek, zmiany chorobowe
w rogówce, kurza ślepota), hiperkeratoza, zahamowanie wzrostu u dzieci, niedokrwistość
hemolityczna.
Witamina D
Rysunek 10.2. 1,25-dihydroksycholekalcyferol
Witamina D to grupa kalcyferoli, będących pochodnymi cholesterolu, wykazujących działanie
biologiczne właściwe dla witaminy D. Prekursorami witaminy D są: ergokalcyferol
(pochodzenia roślinnego) i cholekalcyferol (pochodzenia zwierzęcego). Jej aktywne formy to:
25-hydroksycholekalcyferol,
25-hydroksyergokalcyferol
oraz
1,25-
dihydroksycholekalcyferol. Aktywne formy witaminy D powstają w wyniku przemian
zachodzących w skórze, nerkach i wątrobie.
287
Rysunek 10.3. Schemat biosyntezy witaminy D.
Przemiany witaminy D są bezpośrednio związane z gospodarką wapniowo-fosforanową.
Witamina D odpowiada za utrzymanie prawidłowego stężenia wapnia we krwi, poprzez:
zwiększenie wchłaniania wapnia w jelitach, retencję wapnia w kościach, zmniejszenie
wydalania wapnia z moczem. Dodatkowo, kalcytriol bierze udział w sekrecji insuliny,
hormonów przytarczyc oraz tarczycy.
Źródła witaminy D: pokarmy zwierzęce, olej z wątroby ryb morskich.
Funkcje:
 stymulacja ekspresji genu dla białka wiążącego wapń CaBP w jelicie,
 hamowanie wydalania wapnia i fosforanów w nerkach,
 nasilenie osteolizy,
 wzrost syntezy tkanki kostnej,
 wzrost syntezy osteokalcyny,
 regulacja uwalniania prolaktyny,
 hamowanie syntezy parathormonu,
 udział w wewnątrzkomórkowej homeostazie komórek ściany naczyniowej.
Dobowe zapotrzebowanie: 0,01-0,02 mg.
288
Przyczyny niedoboru: zespoły złego wchłaniania, uszkodzenie czynności miąższu wątroby i
nerek, długoletnie leczenie lekami przeciwpadaczkowymi.
Skutki
niedoboru:
hipokalcemia,
wtórna
nadczynność
przytarczyc,
hipofosfatemia,
demineralizacja kości.
Witamina E
Rysunek 10.4. α-tokoferol
Grupa związków wykazujących aktywność witaminy E zbudowana jest z pierścienia
aromatycznego i 6-członowego pierścienia heterocyklicznego z atomem tlenu, do którego
przyłączony jest 16-węglowy łańcuch boczny. Terminem witamina E określa się związki, do
których zaliczamy: α, β, γ, δ tokoferole oraz α, β, γ, δ tokotrienole. Przy czym największą
aktywność biologiczną wykazuje α-tokoferol.
Tokoferole dostarczane z pożywieniem wchłaniane są w jelicie cienkim. Wchłonięte
tokoferole są wbudowywane do chylomikronów i wraz z limfą transportowane są krążeniem
wrotnym do wątroby. Połowa z dostarczonych z pokarmem tokoferoli magazynowanych jest
w tym narządzie, a reszta trafia do krążenia. Ponadto tokoferole magazynowane są również
przez tkankę mięśniową i tłuszczową. We krwi α-tokoferol transportowany jest przez
lipoproteiny LDL, a tokotrienole przez VLDL.
Źródła witaminy: pokarmy pochodzenia zwierzęcego (mięso, jaja, wątroba, ryby, drób) i
roślinnego (kiełkujące ziarna zbóż, oleje roślinne).
Funkcje:
 antyoksydacyjna,
 stabilizacja błon komórkowych i lizosomalnych,
 nasilanie odpowiedzi immunologicznej.
Dobowe zapotrzebowanie: 10-20 mg.
Przyczyny niedoboru: zespoły złego wchłaniania, niedobór w diecie.
Skutki niedoboru: u wcześniaków – niedokrwistość hemolityczna, zwyrodnienie rdzeniowomózgowe; u dorosłych – obwodowa neuropatia, ataksja, oczopląs, osłabienie mięśni.
289
Witamina K
Rysunek 10.5. Filochinon
Naturalna witamina K jest związkiem dwupierścieniowym, z których jeden jest pierścieniem
aromatycznym, a drugi chinonowym z kilkoma podstawnikami. Główny z podstawników jest
łańcuchem poliizoprenoidowym.
Naturalne witaminy K to: filochinon (K1) oraz menachinon (K2). Filochinon jest pochodzenia
roślinnego, natomiast menachinon wytwarzany jest przez florę bakteryjną jelita cienkiego.
Ponadto występują także formy syntetyczne witaminy K: menadiol oraz dioctan menadiolu,
które mogą ulec przemianie do filochinonu.
Źródła witaminy: pokarmy pochodzenia roślinnego (rośliny zielonolistne) i zwierzęcego
(wątroba, jaja); flora bakteryjna przewodu pokarmowego.
Funkcje:
 uczestniczy w γ-karboksylacji reszt glutaminanu w trakcie potranslacyjnej modyfikacji
protrombiny oraz innych osoczowych czynników krzepnięcia: VII, IX, X,
 uczestniczy w γ-karboksylacji reszt glutaminanu w osteokalcynie, osteopontynie i
osteonektynie,
 uczestniczy w procesach glikozylacji.
Dobowe zapotrzebowanie: 0,05-1 mg.
Przyczyny niedoboru: u noworodków – słabe przechodzenie witaminy K przez łożysko, brak
flory bakteryjnej jelita; u dorosłych – zespoły złego wchłaniania, leki hamujące wchłanianie
witaminy K (np. związki kumarolowe, salicylany, sulfonamidy), u chorych po długotrwałej
antybiotykoterapii, cholestaza.
Skutki niedoboru: skaza krwotoczna.
Witamina F (wielonienasycone kwasy tłuszczowe)
Kwas linolowy, kwas linolenowy oraz kwas arachidonowy zaliczane są do tzw. niezbędnych
kwasów tłuszczowych. Szczególnie ważne jest, aby w diecie dostarczane były
wielonienasycone kwasy omega-3.
290
Funkcje:
 wchodzą w skład struktur komórkowych,
 wywierają hamujący wpływ na syntezę cholesterolu i VLDL,
 kwasy ω-3 wykazują działanie przeciwmiażdżycowe.
Przyczyny niedoboru: stosowanie diety beztłuszczowej.
Skutki niedoboru: zahamowanie wzrostu u dzieci, suchość i szorstkość skóry, zaburzenia
neurologiczne.
Witaminy rozpuszczalne w wodzie
Jest to największa grupa witamin. Jako substancje rozpuszczalne w wodzie, są one łatwo
wchłaniane w jelicie i wydalane przez nerki. Powoduje to, że witaminy rozpuszczalne w
wodzie nie kumulują się w organizmie i najczęściej nie powodują skutków toksycznych.
Witamina B1 (tiamina)
Rysunek 10.6.Tiamina
Tiamina zbudowana jest z pierścieni pirymidynowego i tiazolowego, połączonych mostkiem
metylenowym. Tiamina ulegając fosforylacji tworzy pirofosforan tiaminy (kokarboksylaza,
TPP), który jest aktywną formą witaminy B1.
Źródła witaminy: pokarmy pochodzenia roślinnego (głównie niełuszczone ziarna zbóż) i
zwierzęcego (wątroba, wieprzowina, nerki); flora bakteryjna przewodu pokarmowego.
Funkcje:
 jest koenzymem enzymów: dehydrogenazy pirogronianowej, dehydrogenazy
α-ketoglutarowej, dehydrogenazy ketokwasów o rozgałęzionym łańcuchu,
transketolazy,
 udział w przewodnictwie impulsów nerwowych.
Dobowe zapotrzebowanie: 1,5-2 mg.
Przyczyny niedoboru: alkoholizm, zespoły złego wchłaniania, obecność tiaminazy w diecie.
Skutki niedoboru: choroba beri-beri, psychoza Korsakowa, kwasica mleczanowa.
291
Witamina B2 (ryboflawina)
Rysunek 10.7. Ryboflawina
Ryboflawina jest zbudowana z pierścienia dimetyloizoalloksazyny połączonego z rybitolem.
Jest źródłem koenzymów: FMN, FAD. FMN powstaje w wyniku reakcji fosforylacji
ryboflawiny z udziałem ATP, natomiast dalsza fosforylacja prowadzi do uzyskania FAD.
FMN i FAD są grupami prostetycznymi flawoprotein, pełniących funkcję enzymów oksydoredukcyjnych. Witamina B2 jest odporna na działanie wysokiej temperatury oraz utlenianie,
natomiast jest inaktywowana pod wpływem światła widzialnego.
Źródła witaminy: pokarmy pochodzenia roślinnego (świeże jarzyny, kiełkujące ziarna zbóż) i
zwierzęcego (mleko, wątroba, nerki), drożdże.
Funkcje: jest koenzymem enzymów oksydo-redukcyjnych w łańcuchu oddechowym,
utlenianiu kwasów tłuszczowych i aminokwasów, cyklu Krebsa.
Dobowe zapotrzebowanie: 1,7-3 mg.
Przyczyny niedoboru: braki w diecie, fototerapia noworodków.
Skutki niedoboru: triada objawów ze strony jamy ustnej, oczu i narządów płciowych;
łojotokowe zmiany skóry, niedokrwistość normocytowa.
Witamina B6 (pirydoksyna)
Rysunek 10.8. Pirydoksal
292
Pochodna pirydyny z jednym atomem azotu w pierścieniu. Aktywność witaminy B6 wykazują
pirydoksyna, pirydoksal, pirydoksamina oraz ich 5’-fosforany. Fosforan pirydoksalu
zgromadzony w mięśniach stanowi 80% witaminy B6 w ustroju. W stanach wygłodzenia,
fosforan pirydoksalu jest uwalniany z mięśni. Uwolniona witamina jest zużywana w
procesach glukoneogenezy.
Źródła witaminy: pokarm pochodzenia roślinnego (ziarna zbóż, zielone warzywa) i
zwierzęcego (mleko, wątroba, jaja); drożdże.
Funkcje:
 jest grupą prostetyczną enzymów: dekarboksylaz, deaminaz, aminotransferaz,
desulfhydraz, enzymów transsulfuracji i transmetylacji oraz kinureninazy,
 uczestniczy w przemianach aminokwasowych,
 uczestniczy w biosyntezie: sfingozyny, porfiryn, neuroprzekaźników, DNA.
Dobowe zapotrzebowanie: 2-3 mg.
Przyczyny niedoboru: niedostateczna podaż w diecie, zespoły złego wchłaniania, wiązanie
lub inaktywacja witaminy przez leki (np. penicylamina).
Skutki niedoboru: Łojotokowe zapalenie skóry, zapalenie jamy ustnej, niedokrwistość
mikrocytarna lub megaloblastyczna, zaburzenia OUN.
Skutki nadmiaru: długotrwałe przyjmowanie wysokich dawek prowadzi do neuropatii
obwodowej.
Witamina B12 (kobalamina)
Rysunek 10.9. Kobalamina
293
Jest zaliczana do porfiryn. Zbudowana jest z pierścienia tetrapirolowego (korynowego) z
centralnie usytuowanym atomem kobaltu, który może tworzyć sześć wiązań koordynacyjnych
z ligandami. Szósta pozycja atomu kobaltu może łączyć się z jedną z następujących grup
funkcyjnych:
 CN- tworząc cyjanokobalaminę,
 OH- tworząc hydroksykobalaminę,
 CH3 tworząc metylokobalaminę,
 5-deoksyadenozyną tworząc adenozylokobalaminę,
 H2O tworząc akwakobalaminę.
Witamina B12 jest wchłaniana z przewodu pokarmowego w połączeniu z czynnikiem
wewnętrznym Castle’a (wytwarzanym przez komórki okładzinowe błony śluzowej żołądka).
Czynnik Castle’a wiąże jedynie aktywne formy kobalaminy.
Źródła witaminy: pokarm pochodzenia zwierzęcego (wątroba, nerki, mięso, mleko, jaja), flora
bakteryjna przewodu pokarmowego.
Funkcje:
jest
koenzymem
enzymów:
mutazy
metylomalonylo-CoA,
aminomutazy
leucynowej, syntazy metioninowej.
Dobowe zapotrzebowanie: 0,003-5 mg.
Przyczyny niedoboru: niedostateczna podaż, niedobór lub upośledzenie wydzielania czynnika
wewnętrznego Castle’a, resekcja żołądka.
Skutki niedoboru: zmiany w układzie nerwowym (zaburzenia psychiczne, zaburzenia czucia),
niedokrwistość
megalocytarna,
hipersegmentacja
granulocytów,
hiperbilirubinemia,
niedokrwistość złośliwa, zanik nabłonka wydzielniczego żołądka i jelit, zapalenie języka.
Kwas foliowy
Rysunek 10.10. Kwas foliowy
Zbudowany jest z pterydyny i kwasu p-aminobenzoesowego oraz od 1 do 7 reszt
glutaminianu. Aktywną formą kwasu foliowego jest tetrahydrofolian (THF). W pożywieniu
294
występuje forma kwasu foliowego bogata w reszty glutaminowe, które hydrolizowane są w
przewodzie pokarmowym. W wyniku hydrolizy powstaje produkt, który jest przekształcany
do THF przy udziale reduktazy folianowej.
Źródła witaminy: pokarm pochodzenia roślinnego (jarzyny zielonolistne) i zwierzęcego
(wątroba, nerki), drożdże, grzyby, flora bakteryjna przewodu pokarmowego.
Funkcje:
 przenoszenie rodników jednowęglowych,
 synteza puryn i pirymidyn,
 przemiany aminokwasów i fosfolipidów,
 synteza formylometionylo-tRNA.
Dobowe zapotrzebowanie: 0,3-0,4 mg.
Przyczyny niedoboru: niedostateczna podaż, zespoły złego wchłaniania, zwiększone
zapotrzebowanie (np. w ciąży), podawanie antagonistów kwasu foliowego (np. metotreksat),
zwiększony metabolizm kwasu foliowego.
Skutki niedoboru: niedokrwistość makrocytarna, nadbarwliwa; nadmierna segmentacja
granulocytów, megaloblastoza w szpiku; wady cewy nerwowej u płodu.
Witamina C (kwas askorbinowy)
Rysunek 10.11. Kwas askorbinowy
Witamina C jest γ-laktonem kwasu 2,3-okso-L-gulonowego. Jest związkiem nietrwałym,
wrażliwym na działanie wysokiej temperatury i zasad.
Źródła witaminy: pokarmy pochodzenia roślinnego (świeże owoce, jarzyny) i zwierzęcego
(wątroba, nerki, mleko).
Funkcje:
 jest niezbędnym składnikiem w biosyntezie kości, chrząstek i substancji
międzykomórkowej tkanki łącznej. Uczestniczy w biosyntezie kolagenu
(hydroksylacji proliny i lizyny),
295
 uczestniczy w procesach hydroksylacji steroidów nadnerczowych,
 udział w przemianach tyrozyny (niezbędna do prawidłowego funkcjonowania
β-hydroksylazy dopaminowej),
 niezbędna do prawidłowego funkcjonowania hydroksylazy peptydyloglicynowej,
 udział w procesach hydroksylacji związków aromatycznych w mikrosomach,
 zachowanie prawidłowego potencjału oksydacyjno-redukcyjnego w komórce,
 ułatwienie wchłaniania wapnia,
 działanie antyoksydacyjne.
Dobowe zapotrzebowanie: 60-100 mg.
Przyczyny niedoboru: niedobór w diecie, alkoholizm.
Skutki niedoboru: szkorbut, upośledzenie gojenia się ran, kruchość naczyń włosowatych; u
dzieci choroba Moellera-Barlowa; u dorosłych ogólne osłabienie, senność, brak łaknienia,
bóle typu gośćcowego.
Niacyna (witamina PP)
Rysunek 10.12. Kwas nikotynowy i amid kwasu nikotynowego.
Niacyna jest kwasem nikotynowym, bądź jego amidem. Nie jest ona typową witaminą,
ponieważ może być wytwarzana w organizmie człowieka w reakcjach przemian tryptofanu.
Jednak endogenna niacyna nie zaspokaja dobowego zapotrzebowania, dlatego niezbędna jest
jej suplementacja.
Pokarm dostarczany z dietą zawiera niacynę w formie NAD+ i NADP+. W przewodzie
pokarmowym NAD+ i NADP+ są hydrolizowane do wolnej niacyny lub niacynamidu. W tej
postaci są wychwytywane w jelicie cienkim i dostarczane do tkanek. W tkankach wolne
formy witaminy są ponownie wbudowywane do NAD+ i NADP+.
Źródła witaminy: pokarm pochodzenia roślinnego i zwierzęcego, drożdże, synteza z
tryptofanu.
Funkcje:
296
 jest składnikiem koenzymów NAD+ i NADP+, uczestniczących w reakcjach utleniania i
redukcji,
 NAD+ i NADP+ biorą udział w przemianach: białek, węglowodanów, lipidów, zasad
azotowych, porfiryn. Ponadto uczestniczą w tworzeniu wiązań
wysokoenergetycznych.
Dobowe zapotrzebowanie: 20-25 mg.
Przyczyny niedoboru: niedobór w diecie, marskość wątroby, zespoły złego wchłaniania,
cukrzyca, zwiększone zapotrzebowanie na witaminę PP (przewlekłe choroby zakaźne,
stosowanie antymetabolitów witaminy PP np. hydrazyd kwasu izonikotynowego), choroba
Hartnupów, rakowiak.
Skutki niedoboru: pelagra (brak łaknienia, osłabienie, zmiany skórne, zaburzenia ze strony
układu pokarmowego i ośrodkowego układu nerwowego).
Biotyna (witamina H)
Rysunek 10.13. Biotyna
Biotyna zbudowana jest z pierścieni imidazolowego i tiofenowego połączonego z
pięciowęglowym łańcuchem bocznym zakończonym grupą karboksylową.
Źródła witaminy: pokarmy pochodzenia roślinnego (pomidory) i zwierzęcego (wątroba, nerki,
żółtka jaj), drożdże, flora bakteryjna przewodu pokarmowego.
Funkcje:
 uczestniczy w przenoszeniu grup COO- w reakcjach karboksylacji, stanowiąc grupę
prostetyczną enzymów: karboksylazy acetylo-CoA, karboksylazy pirogronianowej,
karboksylazy propionylo-CoA,
 uczestniczy w regulacji cyklu komórkowego, poprzez stymulację białek
w jądrze komórkowym.
Dobowe zapotrzebowanie: 0,015-0,3 mg.
Przyczyny niedoboru: długotrwała antybiotykoterapia powodująca wyjałowienie przewodu
pokarmowego, spożywanie dużej ilości surowego białka jaj.
297
Skutki niedoboru: zmiany skórne, bóle mięśniowe, ogólne wyczerpanie organizmu, stany
depresyjne, senność.
Kwas pantotenowy
Rysunek 10.14. Kwas pantotenowy
Kwas pantotenowy zbudowany jest z β-alaniny i reszty kwasu pantoinowego.
Źródła witaminy: pokarmy pochodzenia zwierzęcego (wątroba, nerki, żółtka jaj), drożdże.
Funkcje: jest substratem do biosyntezy acetylo-CoA oraz białka przenoszącego reszty
acylowe – ACP. Koenzym A i ACP uczestniczą w reakcjach biosyntezy kwasów
tłuszczowych. Nie obserwuje się niedoboru kwasu pantotenowego.
Kwas liponowy
Funkcje:
bierze
udział
w
procesie
dekarboksylacji
kwasu
pirogronowego
i
α-ketoglutarowego. Nie obserwuje się niedoboru kwasu liponowego.
Diagnostyka laboratoryjna gospodarki witaminowej
Diagnostyka gospodarki witaminowej jest trudna i kosztowna. Witaminy w organizmie
występują w stężeniach mili- lub mikrogramowych, dlatego też metody stosowane do ich
badania muszą charakteryzować się wysoką czułością i dużą precyzją.
Najczęściej stosowane do oznaczania stężenia witamin i ich metabolitów są metody:
 radioimmunologiczne,
 chemiluminescencyjne,
 fluorymetryczne,
 chromatograficzne, głównie wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC),
 spektrofotometryczne.
Diagnostyka gospodarki witaminowej obejmuje:
 oznaczanie stężenia witamin we krwi,
 oznaczanie stężenia witamin w moczu,
 oznaczanie stężenia metabolitów powstających w procesach, w których biorą udział
witaminy,
298
 testy dynamiczne – po obciążeniu określoną witaminą bądź jej prekursorem,
 testy obciążeniowe – po obciążeniu związkiem, który metabolizuje się przy udziale
witaminy.
Największe znaczenie diagnostyczne ma oznaczanie stężenia witaminy B12, kwasu foliowego
oraz metabolitów witaminy D. Oznaczenia poziomu witaminy B12 i kwasu foliowego
wykonuje się głównie ze względu na częsty niedobór tych witamin prowadzący m.in. do
niedokrwistości, a przy dłużej trwającym niedoborze także do zmian neurologicznych.
Szczególnie często niedobór B12 występuje u osób starszych, u których jest najczęstszą
przyczyną niedokrwistości.
Natomiast poziom metabolitów witaminy D oznacza się głównie w ramach diagnostyki
osteoporozy i zaburzeń kostnych.
WITAMINA B6
Diagnoza niedoboru witaminy B6 zwykle opiera się na badaniu poziomu fosforanu
pirydoksalu w osoczu krwi. Prawidłowe stężenie fosforanu pirydoksalu wynosi 20-140
nmol/l.
Test ksanturenowy
Fosforan pirydoksalu jest koenzymem kinureninazy, enzymu biorącego udział w katabolizmie
tryptofanu.
Kinureninaza
katalizuje
przemianę
3-L-hydroksykinureniny
do
hydroksyantranilanu. W stanach niedoboru witaminy B6 dochodzi do zaburzenia tej
przemiany, w wyniku czego gromadząca się 3-L-hydroksykinurenina przekształcana jest do
kwasu ksanturenowego wydalanego z moczem.
Wykonanie testu
Pacjentowi podaje się 10 g tryptofanu rozpuszczonego w 250 ml wody lub soku. Następnie
przeprowadza się dobową zbiórkę moczu. W dobowej zbiórce oznacza się stężenie kwasu
ksanturenowego metodą spektrofotometryczną z wykorzystaniem siarczanu żelazowoamonowego. Kwas ksanturenowy z żelazem tworzy zielony kompleks.
Interpretacja wyniku
W warunkach prawidłowych kwas ksanturenowy nie powstaje lub powstaje w bardzo
niewielkich ilościach. Po obciążeniu tryptofanem dobowe wydalanie kwasu ksanturenowego
u osób zdrowych może wynosić około 20 mg/dobę. Stężenie kwasu powyżej 50 mg/dobę
świadczy o niedoborze fosforanu pirydoksalu. Należy jednak zwrócić uwagę, że test jest mało
swoisty, dlatego też prawidłowe ilości kwasu ksanturenowego w moczu nie świadczą o
prawidłowej zawartości witaminy B6 w organizmie.
299
WITAMINA B12
Standardowym badaniem, mającym na celu potwierdzenie podejrzenia niedoboru witaminy
B12 jest oznaczenie stężenia B12 w surowicy krwi. Oznaczenie przeprowadza się najczęściej
metodami
chemiluminescencyjnymi
lub
radioimmunologicznymi.
Zakres
wartości
referencyjnych:
 niedobór witaminy B12
<150 pmol/l
 stężenie graniczne
150-300 pmol/l
 prawidłowe stężenie
>300 pmol/l
Kwas metylomalonowy (MMA)
Stężenie kwasu metylomalonowego (MMA) jest czułym i wczesnym wskaźnikiem niedoboru
witaminy B12. Metylomalonylo-CoA jest wytwarzany w niewielkich ilościach w trakcie
metabolizmu aminokwasów oraz nieparzystowęglowych kwasów tłuszczowych. Witamina
B12
jest
koenzymem
mutazy
metylomalonylowej
katalizującej
konwersję
metylomalonylo-CoA w bursztynylo-CoA. W przypadku niedoboru kobalaminy stężenie
metylomalonylo-CoA zaczyna wzrastać, a organizm zaczyna przekształcać go w MMA.
Powoduje to wzrost stężenia MMA we krwi i moczu.
Rysunek 10.15. Powstawanie kwasu metylomalonowego w niedoborze witaminy B12.
300
Wykonanie testu
Podczas testu pacjentowi podaje się prekursor kwasu metylomalonowego, najczęściej walinę
lub metioninę. Następnie oznacza się stężenie MMA w dobowej zbiórce moczu metodą
kolorymetryczną lub chromatograficzną.
Interpretacja wyniku
Prawidłowe wydalanie MMA wynosi 0-11 mg/dobę i nie ulega zmianie po obciążeniu
prekursorem. U osób z niedoborem witaminy B12 dobowe wydalanie MMA wzrasta do
37-75 mg/dobę natomiast po obciążeniu prekursorem osiąga wartość powyżej 1000 mg/dobę.
Zastosowanie testu ma pewne ograniczenia. U części pacjentów z niewyrównaną chorobą
Addisona-Biermera obserwuje się wzrost wydalania MMA dopiero po obciążeniu pacjenta
prekursorem. Natomiast u chorych po całkowitej remisji choroby Addisona-Biermera, z
marskością wątroby oraz osób z obniżoną ilością czynnika Castle’a nie następuje wzrost
wydalania MMA nawet po obciążeniu. Test jest jednak istotny w diagnostyce niedokrwistości
megaloblastycznych.
Test Schillinga
Test Schillinga jest pośrednią metodą oceny wchłaniania witaminy B12 na podstawie pomiaru
jej wydalania z moczem. Wykonuje się go w celu określenia przyczyny niedoboru
witaminy B12.
Wykonanie testu
Badanie przeprowadza się na czczo. Po opróżnieniu pęcherza moczowego pacjentowi podaje
się doustnie 1 µg znakowanej promieniotwórczym izotopem kobaltu witaminy B12. Następnie
po 2 godzinach wstrzykuje się domięśniowo preparat zawierający 1000 µg tej witaminy, ale
zawierającej kobalt niepromieniotwórczy. Następnie przeprowadza się dobową zbiórkę
moczu i dokonuje się pomiaru radioaktywności moczu będącej miarą wydalania znakowanej
witaminy B12.
Drugą fazę testu wykonuje się tylko u pacjentów, u których w pierwszej części wykryto
zaburzone wchłanianie witaminy. U pacjentów z prawidłowym wchłanianiem odstępuje się
od wykonania drugiej części testu. W drugiej fazie testu, po upływie około 5 dni, znakowaną
witaminę B12 podaje się łącznie z 60 mg świńskiego czynnika wewnętrznego (IF).
Interpretacja wyniku
W warunkach prawidłowych wydalone z moczem zostaje więcej niż 10% podanej dawki
znakowanej witaminy B12. Zmniejszone wydalanie znakowanej witaminy B12, poniżej 5%,
301
wskazuje na jej upośledzone wchłanianie w przewodzie pokarmowym. Jeżeli wynik ulega
normalizacji po podaniu znakowanej witaminy B12 związanej z czynnikiem wewnętrznym,
wskazuje to na utratę aktywności czynnika wewnętrznego. Brak wchłaniania znakowanej
witaminy B12 związanej z czynnikiem wewnętrznym może być wynikiem:
 polekowego złego wchłaniania witaminy B12,
 niewydolności trzustki,
 zespołu Zollingera-Ellisona,
 nieprawidłowej jelitowej flory bakteryjnej.
Oznaczanie przeciwciał przeciwko IF w surowicy krwi
Niedokrwistość Addisona-Biermera (niedokrwistość złośliwa) jest chorobą u podstaw której
leży zanikowe zapalenie błony śluzowej żołądka o charakterze autoimmunologicznym.
Prowadzi ono do upośledzenia wydzielania czynnika wewnętrznego a w konsekwencji
niedoboru witaminy B12 i związanych z tym objawów klinicznych. U około 60% chorych
stwierdza się obecność przeciwciał przeciwko czynnikowi wewnętrznemu Castle’a.
Metody oznaczania przeciwciał:
 immunoenzymatyczne
 radioimmunologiczne
Oznaczenie holotranskobalaminy
Nową metodą stosowaną w diagnostyce gospodarki witaminowej jest oznaczanie stężenia
holotranskobalaminy (holoTC). Witamina B12 w surowicy związana jest z dwoma białkami:
transkobalaminą (TC) oraz haptokoryną (HC). Kompleks transkobalamina-kobalamina zwany
holotranskobalaminą rozpoznawany jest przez receptory tkankowe i jest jedynym
rezerwuarem zawierającym witaminę B12 w formie dostępnej biologicznie.
Oznaczenie stężenia holoTC przeprowadza się głównie w przypadkach stężenia witaminy B12
na poziomie 150 - 300 pmol/l. Prawidłowe stężenie holoTC w surowicy wynosi >35 pmol/l,
wartości niższe świadczą o niedoborze witaminy B12.
KWAS FOLIOWY
Podstawowym badaniem diagnostycznym jest oznaczenie stężenia kwasu foliowego w
surowicy krwi metodami immunologicznymi. Prawidłowe stężenie tej witaminy wynosi
5,7-38 nmol/l.
302
Test FIGLU
Kwas formiminoglutaminowy (FIGLU) jest produktem pośrednim w procesie przemiany
histydyny do kwasu glutaminowego. Przeniesienie grupy formiminowej z FIGLU na
tetrahydrofolian przy udziale enzymu formiminotransferazy prowadzi do utworzenia
glutaminianu. W stanach niedoboru kwasu foliowego reakcja ta jest zahamowana a FIGLU
wydalany jest z moczem.
Test FIGLU wykorzystywany jest w diagnostyce niedoboru kwasu foliowego, witaminy B12
oraz chorób miąższu wątroby.
Wykonanie testu
Badanie przeprowadza się na czczo. Pacjentowi podaje się 15 g chlorowodorku L-histydyny
rozpuszczonej w wodzie a następnie przeprowadza się 5 godzinną zbiórkę moczu pomiędzy 3
a 8 godziną od podania roztworu. W zebranym moczu oznacza się stężenie FIGLU metodami
spektrofotometrycznymi, chromatograficznymi lub elektroforetycznymi.
Interpretacja wyniku
Zdrowi pacjenci wydalają z moczem niewielkie ilości FIGLU – do 2 mg/h. U osób z
niedoborem kwasu foliowego lub witaminy B12 stężenie FIGLU w moczu może wzrosnąć
nawet do 80 mg/h.
WITAMINA D
Diagnostyka niedoborów witaminy D opiera się na oznaczeniu stężenia jej metabolitów:
25-hydroksycholekalcyferolu (25-OH-D3) oraz 1,25-dihydroksycholekalcyferolu (1,25(OH)2-D3). Nigdy nie oznacza się tylko 1,25-(OH)2-D3 ponieważ jej niedobór może być
kompensowany przez zachodzącą w nerkach 1α-hydroksylację. Stężenie metabolitu 1,25(OH)2-D3 odzwierciedla więc aktywność 1α-hydroksylazy, a obniża się w ciężkich
niedoborach substratu (witaminy) lub uszkodzeniu nerek.
Stężenie 25-OH-D3 i 1,25-(OH)2-D3 oznacza się w surowicy krwi pobranej od pacjenta
będącego na czczo. Oznaczenie wykonuje się metodami radioimmunologicznymi.
Prawidłowe stężenie 25-OH-D3 mieści się w zakresie 20-60 ng/ml, natomiast 1,25-(OH)2-D3
18-67 pg/ml. Wartości referencyjne zależą od zastosowanej metody, dlatego należy
uwzględnić te ustalone przez laboratorium.
Obniżone stężenie witaminy 25-OH-D3 obserwuje się u osób starszych, nie wychodzących z
domu na skutek ograniczonej ekspozycji na światło słoneczne oraz u osób niedożywionych
lub z upośledzonym wchłanianiem. Ponadto zwiększone zapotrzebowanie na witaminę 25OH-D3 występuje u dzieci oraz kobiet w ciąży, a także w stanach wyniszczenia organizmu.
303
Zwiększony metabolizm witaminy 25-OH-D3 obserwuje się także w trakcie zażywania leków
przeciwpadaczkowych oraz w pierwotnej nadczynności przytarczyc. Podwyższone stężenie
25-OH-D3 występuje po przedawkowaniu witaminy, a także po intensywnej ekspozycji na
światło UV oraz u chorych leczonych dużymi dawkami heparyny.
304
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA
ĆWICZENIE 1
WYKRYWANIE WITAMINY A METODĄ CARRA-PRICE’A
ZASADA METODY
Witamina A i karotenoidy dają niebieskie zabarwienie z nasyconym roztworem trójchlorku
antymonu. Witaminę A z materiału biologicznego ekstrahujemy za pomocą chloroformu.
Ekstrakt chloroformowy służyć może nie tylko do wykrywania, ale również do ilościowego
oznaczania witaminy A, poprzez pomiar absorbancji produktu reakcji z SbCl3
ODCZYNNIKI
 Nasycony roztwór trichlorku antymonu w chloroformie (odczynnik Carra-Price`a)
WYKONANIE
Do suchej probówki wlać około 2 ml odczynnika Carra-Price`a i dodać 1 kroplę witaminy A.
Do odczynnika Carra-Price`a używać wyłącznie suchej pipety lub wlać odczynnik
bezpośrednio z butelki (woda powoduje hydrolizę soli antymonu i wytrącanie się białego
osadu tlenosoli SbO2Cl).
ĆWICZENIE 2
WYKRYWANIE WITAMINY B1
ZASADA METODY
Witamina B1 jest wrażliwa na działanie czynników utleniających, np. żelazicyjanku potasu
czy nadtlenku wodoru. Przekształca się ona wówczas w tiochrom, charakteryzujący się
niebieską fluorescencją.
ODCZYNNIKI
 1% wodny roztwór K3[Fe(CN)6]
 20% wodny roztwór NaOH
 Rozpuszczalnik organiczny: butanol lub alkohol amylowy
WYKONANIE
Pół tabletki witaminy B1 rozpuścić w około 10 ml wody destylowanej, dodać po 1 ml
roztworu K3[Fe(CN)6] i NaOH. Po wymieszaniu odczekać kilka minut i dodać około 5 ml
285
rozpuszczalnika organicznego. Wstrząsnąć i obejrzeć niebieską fluorescencję w warstwie
rozpuszczalnika organicznego w świetle lampy kwarcowej.
ĆWICZENIE 3
WYKRYWANIE WITAMINY B2
ZASADA METODY
Pod wpływem światła i tlenu ryboflawina odszczepia łańcuch cukrowy i przekształca się
w środowisku zasadowym w lumiflawinę (7,8,10-trimetyloizoalloksazyna), natomiast w
środowisku obojętnym i kwaśnym w luminochrom (7,8-dimetyloalloksazyna).
WYKONANIE
Pół tabletki witaminy B2 rozpuścić w 10 ml wody destylowanej. Obejrzeć żółtozieloną
fluorescencję w świetle lampy kwarcowej.
ĆWICZENIE 4
ILOŚCIOWE
OZNACZENIE
WITAMINY
C
W
DOWOLNIE
WYBRANYCH
PRODUKTACH SPOŻYWCZYCH
ZASADA METODY
Barwnik 2,6-dichlorofenoloindofenol utlenia kwas askorbinowy, a sam redukuje się do
związku bezbarwnego. Barwnik ten jest jednocześnie indykatorem, który w środowisku
kwaśnym przybiera barwę różową a w zasadowym niebieską. Ilość kwasu askorbinowego
oznacza się przez miareczkowanie w środowisku kwaśnym mianowanym roztworem
barwnika, do momentu uzyskania różowego zabarwienia utrzymującego się przez okres około
1 minuty. Miareczkowanie przeprowadza się w środowisku kwaśnym, gdyż w tych
warunkach samoutlenianie się kwasu askorbinowego tlenem z powietrza jest bardzo powolne.
MATERIAŁ BADANY
 Produkty spożywcze: ziemniaki, kapusta, cebula, jabłka itp.
ODCZYNNIKI
 2,6-dichlorofenoloindofenol – w 1 ml znajduje się 0,08 mg barwnika
 Wzorzec kwasu askorbinowego - 1 ml zawiera 0,012 mg kwasu askorbinowego
 3% roztwór kwasu metafosforowego w 8% kwasie octowym
286
WYKONANIE
A. Wyznaczanie miana 2,6-dichlorofenoloindofenolu
1 ml świeżo sporządzonego roztworu kwasu askorbinowego o stężeniu 0,012 mg w 1 ml
miareczkować z mikrobiurety roztworem barwnika do momentu uzyskania trwałego, przez
czas co najmniej 30 sekund, różowego zabarwienia. Obliczyć jaka ilość kwasu
askorbinowego odbarwia 1 ml barwnika.
Przykład: do miareczkowania próbki kwasu askorbinowego zużyto 0,8 ml barwnika, a zatem
1 ml barwnika utlenił 0,015 mg kwasu askorbinowego.
Miano: to ilość substancji oznaczanej, która reaguje z jednostką miary (w ml)
danego odczynnika w pewnych ściśle zachowanych warunkach.
B. Próba ślepa
Wykonać miareczkowanie 1 ml kwasu metafosforowego roztworem barwnika.
C. Oznaczanie witaminy C w produktach spożywczych
Odważyć 1 g materiału przeznaczonego do oznaczania (ziemniaki, kapusta, cebula, jabłka
itp.). Każda sekcja przynosi na ćwiczenia 5 różnych produktów spożywczych (wskazana
pomysłowość studentów). Odważony materiał rozetrzeć w moździerzu z 5 ml 3% roztworu
kwasu metafosforowego w 8% roztworze kwasu octowego. Roztartą miazgę przenieść
ilościowo do cylindra (przepłukując moździerz kilkakrotnie małymi porcjami kwasu
metafosforowego użytego do rozcierania badanego materiału) i całość uzupełnić do objętości
10 ml tym samym kwasem. Przesączyć. Z przesączu odmierzyć 1 ml i miareczkować
mianowanym roztworem barwnika, aż do uzyskania utrzymującej się przez 30 sekund
różowej barwy. Ilość zużytego barwnika w próbie ślepej odjąć od ilości barwnika zużytego w
miareczkowaniu poszczególnych prób badanych (produktach spożywczych). Z wyznaczonego
miana, obliczyć zawartość witaminy C w 0,1 g badanego materiału. Obliczyć zawartość
kwasu askorbinowego w 100 g badanego materiału i porównać z wartościami stężeń
witaminy C w poszczególnych produktach spożywczych podanych poniżej.
Uwaga!
Z materiałów bogatych w witaminę C należy sporządzić bardziej rozcieńczone
wyciągi, uwzględniając rozcieńczenie przy obliczaniu wyników. Orientacyjna
zawartość witaminy C w różnych produktach spożywczych w mg/100g wynosi:
brukselka - 94, kalafior - 69, truskawka - 60, kapusta - 52, cytryna i pomarańcze 45-50, pomidory - 23, ziemniaki - 17, jabłka i śliwki - 5.
287
ĆWICZENIE 5
OZNACZANIE STĘŻENIA KWASU ASKORBINOWEGO W MOCZU
ZASADA METODY
Jak w ćwiczeniu nr 4
MATERIAŁ BADANY
 Mocz
ODCZYNNIKI
 2,6-dichlorofenoloindofenol – w 1 ml znajduje się 0,08 mg barwnika
 Wzorzec kwasu askorbinowego – 1 ml zawiera 0,012 mg kwasu askorbinowego
WYKONANIE
A. Wyznaczanie miana 2,6-dichlorofenoloindofenolu
Jak w ćwiczeniu nr 4
B. Oznaczanie witaminy C w moczu
Świeżo oddany mocz zakwasić kilkoma kroplami kwasu octowego lodowatego. Pobrać 1 ml
moczu
i
miareczkować
mianowanym
roztworem
dichlorofenoloindofenolu
(barwę
obserwować na białym tle) do uzyskania różowego zabarwienia utrzymującego się przez 30
sekund.
Przykład obliczania zawartości witaminy C w moczu
Korzystamy z tego samego roztworu 2,6-dichlorofenoloindofenolu o ustalonym wcześniej
mianie (patrz ćwiczenie nr 4). Przypuśćmy, że do miareczkowania 1 ml moczu zużyto 2 ml
roztworu barwnika. Z poprzedniego ćwiczenia wiadomo, że 1 ml użytego barwnika utlenia
0,015 mg kwasu askorbinowego (jest to wartość przykładowa), czyli w badanej próbce moczu
znajduje się 0,03 mg kwasu askorbinowego w 1 ml, tj. 3 mg na 100 ml (ponieważ użyto 2 ml
roztworu barwnika).
INTERPRETACJA
Dobowe wydalanie kwasu askorbinowego z moczem wynosi 5 - 55 mg. Ilość witaminy C
wydalana z moczem w ciągu doby wskazuje na nasycenie organizmu tym związkiem.
Podejrzewając niedobór witaminy C w organizmie, należy podać dużą jej dawkę (15 mg/kg
masy ciała), a następnie oznaczyć jej zawartość w dobowej zbiórce moczu. Jeżeli w ciągu 24
godzin zostanie wydalone około 60% podanej jednorazowo dawki witaminy to oznacza, że
288
nie ma jej deficytu w organizmie. Wydalanie witaminy C poniżej 60% podanej dawki
świadczy
o
jej
niedoborze
w
organizmie
(zmniejszona
podaż
lub
zwiększone
zapotrzebowanie np. w stanach zapalnych, zakażeniach itp.).
ĆWICZENIE 6
ILOŚCIOWE
OZNACZANIE
WITAMINY
C
W
OSOCZU
METODĄ
KOLORYMETRYCZNĄ
ZASADA METODY
Kwas L-askorbinowy redukuje kwas fosforowolframowy do błękitu wolframowego.
Natężenie powstałego zabarwienia jest proporcjonalne do stężenia kwasu askorbinowego.
Kwas fosforowolframowy służy jednocześnie do odbiałczania osocza oraz do ekstrakcji
witaminy C.
MATERIAŁ BADANY
 Osocze (krew pobrana na szczawian potasu). Badanie należy wykonać w czasie nie
dłuższym niż 30 minut od pobrania krwi.
ODCZYNNIKI
 Odczynnik redukujący o pH 1,0 (fosforowolframowy)
 0,46 mol/l wolframian disodowy (wolny od molibdenu)
 0,42 mol/l bezwodny wodorofosforan disodowy
 Wzorzec kwasu L-askorbinowego o stężeniu 56,8 mol/l (1 mg/dl)
WYKONANIE
W probówkach wirowniczych sporządzić próby o składzie podanym w tabeli.
Próba
Próba
Próba
badana
wzorcowa
odczynnikowa
[ml]
[ml]
[ml]
1,5
-
-
wzorzec kw. askorbinowego
-
1,5
-
H2O dest.
-
-
1,5
1,5
1,5
1,5
Składnik próby
Osocze
odczynnik redukujący
289
Wymieszać i pozostawić na 30 minut w temperaturze pokojowej, po czym mieszaniny
wirować przez 10 minut przy 2500 obr./min. Zlać supernatant do czystych probówek.
Zmierzyć absorbancję próby badanej i wzorcowej względem próby odczynnikowej przy
długości fali 700 nm.
Obliczenie wyników
AB
 56,8  st. wit . C (mol/l)
AW
AB
- absorbancja próby badanej
AW
- absorbancja próby wzorcowej
56,8 - stężenie wzorca kw. L-askorbinowego
Stężenie prawidłowe witaminy C w osoczu (oznaczone powyższą metodą) – 52,51,6(mol/l)
ĆWICZENIE 7
PRZEGLĄD PREPARATÓW HEMATOLOGICZNYCH
A. Krew obwodowa – normocytoza
B. Krew obwodowa – niedobór witaminy B12 – megalocytoza
C. Szpik kostny – niedobór witaminy B12 – odnowa megaloblastyczna
290