BUDOWA, REPLIKACJA, SYSTEMATYKA WIRUSÓW

WIRUSY CHOROBOTWÓRCZE DLA CZŁOWIEKA
TOK BADANIA WIRUSOLOGICZNEGO
METODY STOSOWANE W DIAGNOSTYCE
WIRUSOLOGICZNEJ
Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej
Anna Majewska
Warszawa, 2016
OGÓLNA CHARAKTERYSTYKA WIRUSÓW
•
Małe rozmiary (20 nm-300 średnicy)
•
Brak budowy komórkowej
•
Zależą całkowicie od żywych komórek
•
Nie rosną na podłożach sztucznych
•
Bezwzględne pasożytnictwo wewnątrzkomórkowe
•
Posiadają jeden rodzaj kwasu nukleinowego
• Nie namnażają się przez podziały
•
Są niewrażliwe na antybiotyki
Budowa wirusa
kwas nukleinowy (DNA lub RNA)
DNA jest zwykle dwuniciowy (wyjątek parwowirusy)
RNA jest zwykle jednoniciowy (wyjątek reowirusy)
jednoniciowy RNA - o dodatniej (mRNA) lub ujemnej polarności (transkrypcja
do kopii o dodatniej polarności)
kwas nukleinowy + kapsyd = nukleokopsyd
Funkcje kapsydu:
• ochronna
• udział w adsorpcji i wnikaniu wirusa do komórki przez interakcje
z receptorami błony komórkowej
pojedynczy segment
wielosegmentowy
Nukleokapsyd o symetrii ikosaedralnej
adenowirusy
herpeswirusy
pikornawirusy
liczba kapsomerów
jest cechą taksonomiczną
Nukleokapsyd o symetrii helikalnej (spiralnej)
• kapsomery spiralnie otaczają
kwas nukleinowy
• wydłużony kształt
rabdowirusy
filowirusy
wirus Ebola
Osłonka
nabyta z błony komórkowej podczas późnych faz replikacji
glikoproteiny
przyleganie do receptorów komórkowych
pobudzanie interakcji z białkami nukleokapsydu
(dojrzewanie potomnych cząstek wirusa)
osłonka wirusa
wszystkie wirusy o symetrii helikalnej
wirusy o symetrii ikosaedralnej:
togawirusy
herpeswirusy
retrowirusy
flawiwirusy
wirusy bezosłonkowe
oporne na wysuszenie, detergenty,
ekstremalne pH i temperatury
przenoszone droga oddechową i fekalno-oralną
wirusy osłonkowe
wymagają wilgotnego środowiska,
wrażliwe na kwasy i detergenty
Białka wirusowe
 strukturalne
 enzymatyczne

polimerazy wirusowe (replikacja)

proteazy

modyfikacja dużych protein w procesie translacji,
uwolnienie kwasu nukleinowego z nukleokapsydu

endonukleazy i ligazy (replikacja)
Postaci
pozakomórkowa
spoczynkowa – wirion
wewnątrzkomórkowa
aktywna – pozbawiony
białkowego płaszcza
komórka zarażona wirusem wścieklizny:
liczne wirusy (szare, pałeczkowate struktury)
i większe, ciemniejsze ciałka wtrętowe Negriego
Kryteria uwzględniane w klasyfikacji wirusów
wygląd, kształt i wielkość,
cechy kwasu nukleinowego,
•
typ,
•
liczba nici i ich postać (s, ds, liniowy, kolisty),
•
liczba segmentów,
•
masa cząsteczkowa,
•
polarność genomu wirusowego,
symetria nukleokapsydu,
obecność osłonki lub jej brak,
stopień pokrewieństwa antygenowego,
Replikacja wirusów
• adsorpcja
• wniknięcie
• odpłaszczenie
• synteza białek wczesnych
• powielenie genomu
• synteza białek późnych
• składanie i dojrzewanie wirionów
potomnych
• uwolnienie dojrzałych wirionów
WIRUS
RECEPTOR
RECEPTOR
KOMÓRKOWY
WIRUSOWY
Reowirusy
HIV
cząstka CD4
gp120
sialyloligosacharydy
hemaglutynina
Ortomyksowirus
Wirus grypy
Rabdowirus
Wirus wścieklizny
receptor acetylocholinowy
białko G
receptor hepatocytowy
Pre-S
Hepadnawirusy
HBV
Penetracja
Fuzja wirusowej osłonki z błona komórkową
Białko fuzji, doprowadza do połączenia osłonki wirusowej z błoną
komórkową, do cytoplazmy dostaje się nukleokapsyd, z którego uwalnia się
kwas nukleinowy (odpłaszczanie)
Translokacja – bezpośrednie przejście wirusa przez błonę komórkową, małe
wirusy
penetracja
Endocytoza
Wpuklenie błony komórkowej.
Wirus zamknięty w pęcherzyku pokrytym klarytyną, który
wędruje w głąb cytoplazmy
odpłaszczanie
proteazy wirusowe trawią białka ochronne
uwolnienie kwasów nukleinowych
synteza
 Replikacja kwasu nukleinowego
 Synteza białek wirusowych
DNA przemieszcza się do jądra komórkowego
Dojrzewanie – formowanie wirionów potomnych
wirusy osłonkowe
egzocytoza, odzyskanie osłonki lipoproteinowej
(ortomyksowirusy, paramyksowirusy)
wirusy nagie – liza komórki
Wirusy lityczne
Cykl rozwojowy wirusa doprowadzający do rozpadu (lizy) atakowanej
komórki
Wirus wnika do komórki, „zmusza” ją do powielenia wirusowego kwasu
nukleinowego i do syntezy wirusowych białek.
Powstają potomne cząsteczki wirusa, które opuszczają komórkę, niszcząc ją.
Wirusy lizogenne
Wirus nie powoduje śmierci komórki, ulega włączeniu do komórkowego DNA.
DNA wirusa jest przekazywany komórkom potomnym w procesach podziałów
komórkowych.
Zjawisko to uznaje się za przyczynę niektórych zmian nowotworowych, a wirusy
je wywołujące nazywamy wirusami onkogennymi.
Drogi zakażenia
 powietrzna
 inhalacyjna
 pokarmowa
 fekalno-oralna
 wertykalna
 krwiopochodna
 kontakt płciowy
 wektory
 autoinokulacja
 kontakt bezpośredni (zakażone powierzchnie)
 Zakażenie pierwotne
 Zakażenie wtórne (latencja)

Zakażenie miejscowe

Zakażenie narządowe
Wiremia
zakażenie narządów docelowym (tropizm OUN, wątroba, płuca,
jelita, skóra, wirusy pantropowe)
latencja
zakażenie latentne, utajone
komórki nerwowe – HSV-1, HSV-2, HHV-3
limfocyty B – HHV-4 (EBV)
limfocyty T – HHV-5 (CMV)
reaktywacja ze stanu latencji – czynniki reaktywacji:
bodźce termiczne, psychiczne, fizyczne, hormonalne, zakaźne
OBJAWY ZAKAŻENIA
pierwsze objawy: gorączka, bóle mięśniowe, złe samopoczucie –
aktywacja dopełniacza i uwalnianie cytokin
objawy miejscowe – wysypka, obrzęk ślinianek, nieżyt nosa –
działanie cytopatogenne wirusa
objawy narządowe – ostra faza choroby
procesy nowotworowe
zakażenia przetrwałe – retrowirusy, papillomawirusy
zakażenia wertykalne – zakażenie płodu, noworodka
materiał diagnostyczny
 wczesna postekspozycja
 faza objawów klinicznych (wirusy oddechowe)
 ozdrowieńcy
 kontrola postępów leczenia
 wymaz z błony śluzowej nosa i gardła
 plwocina
 krew/surowica krwi
 moc, kał
 wymazy ze zmian skórnych, zeskrobiny
 aspiraty
 fragmenty tkanek
metody diagnostyczne
 obraz kliniczny
 hodowla komórkowa,
 obserwacja mikroskopowa: CPE, immunofluorescencja, mikroskopia
elektronowa
 wykrywanie „składników” wirusowych
 wykrywanie przeciwciał
Hodowla wirusów
diagnozowanie zakażeń
badania naukowe
produkcja antygenów (szczepionki, testy diagnostyczne)
Metody hodowli
hodowle komórkowe
żywe układy:
zwierzęta laboratoryjne
zarodki ptasie
ZARODKI PTASIE
KURZE - 1931 rok - KACZE, PRZEPIÓRKI JAPOŃSKIE
wirus świnki
wirus grypy
zwierzęta laboratoryjne
(myszy, świnki morskie, króliki, chomiki)
HODOWLE KOMÓRKOWE (1925rok – WIRUS KROWIANKI W
HODOWLI TKANKOWEJ, F. PARKER )
Hodowle komórkowe
PIERWOTNE
Komórki uzyskane ze świeżo izolowanych tkanek lub narządu
WTÓRNE - USTABILIZOWANE
PÓŁCIĄGŁE
CIĄGŁE
diploidalne,
aneuploidalne,
ograniczona liczba pasaży (40-50),
najczęściej wywodzą się
utrzymują swój garnitur chromosomalny,
z tkanki nowotworowej,
ulegają aberracji i degeneracji,
VERO, HeLa,
(MRC-5, WI-38),
Hodowle komórkowe
Hodowla w naczyniach – szkło, nietoksyczny plastik – przyleganie do
powierzchni tworząc jednowarstwową hodowlę – monolayer
Hodowla w zawiesinie – mieszadła magnetyczne
Pożywki do hodowli komórkowych zawierają
- cukry,
- aminokwasy,
- witaminy,
- sole mineralne,
- związek buforujący (do pH 7,2-7,4),
- wskaźnik barwny pH,
- antybiotyki,
- surowicę (najczęściej płodową cielęcą)
w stężeniu 10-20%
pożywka wzrostowa
w stężeniu 2-5%
pożywka utrzymująca
WARUNKI HODOWLI
temperatura 37ºC,
stężenie CO2 5%,
wilgotność
Permisywność
 Wirus zakaża się i replikuje tylko w tych liniach komórkowych, których
komórki zawierają odpowiedni dla gatunku wirusa receptor (komórki
permisywne, zezwalające)
NAZWA
TKANKA
POCHODZENIE
WIRUS
MORFOLOGIA
HeLa
człowiek
rak szyjki macicy
nabłonkowa
Polio 1, adenowirusy, herpeswirusy
Hep-2
człowiek
rak krtani
nabłonkowa
Polio 1, adenowirusy, flawiwirusy
nerka
fibroblasty
adenowirusy, herpeswirusy
BHK-21 chomik
Vero
małpa
nerka
nabłonkowa
SV 40, herpeswirusy
WI-38
człowiek
płuca
fibroblasty
Polio 1, 2, VSV, adenowirusy
PK
świnia
nerka
nabłonkowa
VSV, Coxsackie B2 - B6,
flawiwirusy, herpeswirusy
nie wszystkie wirusy mogą namnażać się we wszystkich liniach komórkowych, wirus
replikuje się tylko w komórce permisywnej tj. zezwalającej, która posiada odpowiedni
dla danego wirusa receptor.
Hodowle komórkowe
stosowane w celach
diagnostycznych, naukowych, produkcyjnych
VERO
Vero
(komórki nabłonkowe z zielonej małpy afrykańskiej)
wielojądrowe komórki olbrzymie
Micrograph showing the viral cytopathic effect of
herpes simplex virus (multi-nucleation, ground glass chromatin).
A – okołojądrowe „halo” , powiększone hyperchromatyczne jądro
B – duże jądro, nieregularne rozmieszczenie chromatyny, nieregularna osłonka
HAdV – ludzkie adenowirusy
Metody wykrywania wirusów
ZMIANY CYTOPATYCZNE (CPE)
WTRĘTY- ciałka wtrętowe, widoczne w barwionych, zakażonych
komórkach za pomocą mikroskopu świetlnego.
Są to skupiska wirusów lub wirusy otoczone komórkowymi elementami
białkowymi i lipidowymi lub składniki komórkowe powstałe pod
wpływem zmienionego metabolizmu zakażonej komórki.
wtręty cytoplazmatyczne
wtręty jądrowe (herpeswirusy)
Wtręty A (HSV, VZV) – ostro
odgraniczone, otoczone jasną przestrzenią
od chromatyny jądrowej
Wtręty B (poliowirus, żółtej febry) –
mniejsze.
Wtręty jądrowe i cytoplazmatyczne
(wirus odry)
CPE - wirus odry w linii komórkowej HeLa, syncytia, wtręty cytoplazmatyczne
(barwienie hematoksyliną)
Hepatocyt – wewnatrzjądrowe wtręty, otoczone strefą „halo”.
barwienie H&E.
Wielojądrzaste komórki olbrzymie
syncytia np. paramyksowirusy, herpeswirusy
Skupiska powiększonych i zaokrąglonych
komórek, utrata mostków cytoplazmatycznych
(grona winogron) - adenowirusy
zaokrąglenie i obkurczenie komórek. liza (zniszczenie warstwy
komórek) np. poliowirus
Efekt cytopatyczny powodowany przez
wirusa HHV-1
hodowla prawidłowa
(linia Vero)
CPE
Efekt cytopatyczny powodowany przez
poliowirusy
hodowla prawidłowa
(linia Vero)
CPE
c
Efekt cytopatyczny powodowany przez
cytomegalowirusa
Efekt cytopatyczny powodowany przez
wirusa Coxsackie A
hodowla prawidłowa
(linia PMK)
CPE
Transformacja nowotworowa komórek
wzrost jednowarstwowy zastąpiony jest chaotycznym i
wielowarstwowym, grudkowate skupiska, aberracje
chromosomów
HHV-8
Mięsak Kaposiego
HPV – typy onkogenne
HHV-4 (EBV) Chłoniak Burkitta
ZMIANY NIECYTOPATYCZNE
1. Hemadsorpcja
ortomyksowirusy,
paramyksowirusy
2. Interferencja
podwójne zakażenie = oporność na
zakażenie komórki innym wirusem
Hemaglutynacja [Hirst 1941]
Stosowania do wykrywania wirusów
posiadających na swej otoczce
hemaglutyniny np. wirusa grypy
Uwolnione wirusy w pożywce hodowlanej
+ krwinki czerwone = aglutynacja erytrocytów
konglomeraty erytrocytarnowirusowe
Dokładna identyfikacja wirusa namnożonego w hodowli
komórkowej wymaga zastosowania
dodatkowych technik diagnostycznych
zdjęcia wykorzystane w prezentacji pochodzą z ogólnie dostępnych stron internetowych