PRACA DOKTORSKA
advertisement
UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCŁAWIU WYDZIAŁ MEDYCYNY WETERYNARYJNEJ KATEDRA IMMUNOLOGII, PATOFIZJOLOGII I PREWENCJI WETERYNARYJNEJ ZAKŁAD PATOFIZJOLOGII Alicja Iwaszko-Simonik „Wskaźniki hemostazy w niedrożności jelit u koni” ROZPRAWA DOKTORSKA Promotor: Prof. dr hab. Stanisław Graczyk Wrocław 2013 SPIS TREŚCI SPIS TREŚCI.................................................................................................................. 2 WYKAZ SKRÓTÓW STOSOWANYCH W PRACY ................................................. 4 1. WSTĘP ........................................................................................................................ 8 1.1. Hemostaza......................................................................................................... 10 1.2. Rola naczyń krwionośnych w procesie hemostazy ..................................... 11 1.3. Hemostaza płytkowa ........................................................................................ 13 1.3.1. Adhezja ......................................................................................................... 18 1.3.2. Aktywacja ..................................................................................................... 20 1.3.3. Agregacja ...................................................................................................... 21 1.4. Hemostaza osoczowa ...................................................................................... 23 1.5. Fibrynoliza ......................................................................................................... 28 1.6. Inhibitory procesu krzepnięcia ........................................................................ 28 1.7. Diagnostyka hemostazy .................................................................................. 30 2. ZAŁOŻENIA I CELE PRACY ................................................................................ 35 3. MATERIAŁ I METODY ........................................................................................... 37 3.1. Zwierzęta ........................................................................................................... 37 3.2. Układ doświadczalny ....................................................................................... 38 3.3. Kryteria kwalifikowania koni do zabiegu laparotomii .................................. 39 3.4. Postępowanie przed-, śród- i pooperacyjne ................................................. 39 3.5. Badania hematologiczne ................................................................................. 41 3.6. Badania koagulologiczne ................................................................................ 42 3.6.1. Ocena hemostazy pierwotnej-płytkowej ....................................................... 42 3.6.2. Ocena hemostazy wtórnej – osoczowej .................................................. 45 3.7. Analiza statystyczna......................................................................................... 46 4. WYNIKI...................................................................................................................... 48 4.1. Wskaźniki hematologiczne .............................................................................. 48 4.2. Wskaźniki hemostazy pierwotnej (płytkowej) ............................................... 51 4.2.1. Płytki krwi ..................................................................................................... 51 4.2.2. Czas okluzji................................................................................................... 53 4.2.3. Ekspresja P-selektyny (CD62P) oraz Integryny IIb3 - GP IIb/IIIa (CD 41/61) na powierzchni płytek krwi ................................................................. 54 2 4.2.4. Pochłanianie czerwieni obojętnej ................................................................. 59 4.3. Wskaźniki hemostazy osoczowej................................................................... 61 4.3.1 Czasy krzepnięcia .......................................................................................... 61 4.3.2. Fibrynogen .................................................................................................... 63 4.3.3. Antytrombina ................................................................................................ 64 4.3.4. Białko C ........................................................................................................ 65 4.3.5. D-dimery ....................................................................................................... 66 5. DYSKUSJA .............................................................................................................. 67 6. WNIOSKI................................................................................................................... 92 7. PIŚMIENNICTWO ................................................................................................... 93 8. STRESZCZENIE .................................................................................................... 111 3 WYKAZ SKRÓTÓW STOSOWANYCH W PRACY 12-HETE - kwas 12-hydroksyeikozatetraenowy 12-HPETE - kwas 12-hydroperoksyeikozatetraenowy AA - kwas arachidonowy ADP - adenozyno-5-difosforan APTT - czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (ang. activated partial thromboplastin time) AT - antytrombina (dawniej antytrombina III – AT III) ATP - adenozyno-5-trifosforan BMBT- czas krwawienia po standardowym nacięciu błony śluzowej przedsionka jamy ustnej (ang. buccal mucosal bleeding time) Ca2+- wapń CD62P - P-selektyna CRT – czas wypełniania naczyń kapilarnych ocenianych poprzez uciśnięcie błony śluzowej w jamie ustnej (ang. capillary refill time) CT - czas okluzji (ang. closure time) D-0 – konie przed zabiegiem chirurgicznym D-1 – grupa koni 24 godziny po zabiegu D-2 – grupa koni 48 godziny po zabiegu D-3 – grupa koni 72 godziny po zabiegu DAG - diacyloglicerol DIC – zespół rozsianego wewnątrznaczyniowego wykrzepiania (ang. disseminated intravascular coagulation) EDTA – wersenian potasowy, kwas edetynowy, kwas wersenowy (ang. ethylene diamine tetraacetic acid) EGF - czynnik wzrostu naskórka (ang. epidermal growth factor) ET-1 - endotelina-1 Fb - fibrynogen FDPs - produkty degradacji fibrynogenu i fibryny (ang. fibrinogen-fibrin degradation products) FITC - fluoresceina (ang. fluorescein isothiocyanate) 4 fl - femtolitr FSC - detector rozproszenia światła zgodny z kierunkiem wiązki laserowej, oceniający wielkość komórki (ang. forward scatter channel) GDP - guanozyno-5-difosforan GP Ib/IX/V - glikoproteina Ib/IX/V GPIa/IIa - integryna 21 GTP - guanozyno-5-trifosforan Ht – hematokryt (ang. hematocrit) Hb – zawartość hemoglobiny (ang. haemoglobin) HMWK - wysokocząsteczkowym kininogen (ang. high molecular weight kininogen) IF – intensywność fluorescencji IL-1 – interleukina 1 IL-6 – interleukina 6 integryna IIb3, inaczej receptor GP IIb/IIIa lub CD41/61 IP3 - trójfosforan inozytolu IXa - aktywny czynnik krzepnięcia IXa K – konie grupy kontrolnej LPS – lipopolisacharyd bakteryjny LT - leukotrieny MGG – barwienie metodą May Grünwalda-Giemzy MPV– średnia objętość płytek (ang. mean platelet volume) n – liczba osobników N/L – stosunek neutrofilów do limfocytów NO - tlenek azotu NR – czerwień obojętna (ang. neutral red) NSAIDs – niesteroidowe leki przeciwzapalne (ang. nonsteroidal inflammatory drugs) OCS - układ otwartych kanalików (ang. open canalicular system) PAF - czynnik aktywujący płytki (ang. platelet-activating factor) PAI - inhibitor aktywacji plazminogenu (ang. plasminogen activator inhibitor) PDGF - płytkowy czynnik wzrostu (ang. platelet-derived growth factor) PE – fikoerytryna (ang. phycoerythrin) PF-4 - czynnik płytkowy 4 (ang. platelet factor 4), 5 PFA-100 – aparat do oceny czasu okluzji (ang. the platelet function analyzer-100) PGE2 - prostaglandyna E2 PGG2 - prostaglandyna G2 PGH2 - prostaglandyna H2 PGI2 - prostacyklina PIP2 - difosforan fosfatydyloinozytolu PLT- płytki krwi (ang. platelets) PMP - mikrocząsteczki (ang. platelet-derived microparticles) PMV – mikropęcherzyki (ang. platelet-derived microvesicles) PRP - osocze bogatopłytkowe (ang. platelet rich plasma) PSGL-1 – ligand dla P-selektyny (ang. P-Selectin Glycoprotein Ligand 1) PT - czas protrombinowy (ang. prothrombin time) RBC – liczba erytrocytów (ang. red blood cells), RPMI 1640 – medium hodowlane (ang. roswell park memorial institute 1640), sCD62P – rozpuszczalna forma P-selektyny (ang. soluble P-selectin) SD – odchylenie standardowe (ang. standard deviation) SSC - detektor, mierzący ilość światła rozproszonego pod kątem 90 stopni od osi optycznej, oceniający ziarnistość komórki (ang. side scatter channel) TF - czynnik tkankowy (ang. tissue factor) TF/VIIa – kompleks czynnika tkankowego i aktywnego czynnika krzepnięcia VIIa TFPI - inhibitor zewnątrzpochodnego toru krzepnięcia (ang. tissue factor pathway inhibitor) TNF-α – czynnik martwicy nowotworów – α (ang. tumor necrosis factor – α) TP – białko całkowite (ang. total protein) t-PA - tkankowy aktywator plazminogenu TT - czas trombinowy (ang. thrombin time) TXA2, tromboksan-A2 TXB2 - tromboksan B2 u-PA - urokinazowy aktywator plazminogenu Va - aktywny czynnik krzepnięcia Va VIIa - aktywny czynnik krzepnięcia VIIa 6 VIIIa - aktywny czynnik krzepnięcia VIIIa vWF - czynnik von Willebranda (ang. von Willebrand Factor) WBC - liczba leukocytów (ang. white blood cells) Xa – aktywny czynnik krzepnięcia Xa XIa - aktywny czynnik krzepnięcia XIa XIIIa - aktywny czynnik krzepnięcia XIIIa 7 1. WSTĘP W praktyce klinicznej u koni istotny problem diagnostyczny i terapeutyczny stanowią choroby morzyskowe będące jedną z najczęstszych przyczyn śmierci tych zwierząt (Abutarbush i wsp. 2005, Dukti i White 2009, Hackett i Hassel 2008, Ihler i wsp. 2004). Charakterystykę oraz leczenie zaburzeń morzyskowych komplikuje zróżnicowana etiopatogeneza. Według Madeja i Riha (2008) pojęcie morzysk obejmuje ponad 400 zespołów chorobowych. Próba systematyzacji sprowadza się do podziału na tzw. morzyska rzekome oraz morzyska prawdziwe. Te ostatnie zwane potocznie „kolkami” obejmują zespół zmian czynnościowych związanych z układem pokarmowym oraz towarzyszących im objawów bólowych, zlokalizowanych w obrębie jamy brzusznej (Alsaad i wsp 2009, Goncalves i wsp. 2002). Szacuje się, iż częstotliwość występowania kolek kształtuje się w granicach 4-10 przypadków na 100 koni rocznie (Dukti i White 2009, Tinker i wsp. 1997, White 2006b). Większość z nich (80-85%) ustępuje samoistnie lub poddaje się leczeniu zachowawczemu (farmakologicznemu). Pozostała część zaburzeń morzyskowych wymaga leczenia operacyjnego (Abutarbush i wsp. 2005, Dukti i White 2009, Dukti i White 2008, Klohnen 2009, White 2006b). Szczególna skłonność koni do występowania morzysk wynika z uwarunkowań anatomicznych i czynnościowych przewodu pokarmowego tych zwierząt (Turek 2004). Koń jest zwierzęciem roślinożernym, jego przewód pokarmowy jest ewolucyjnie przystosowany do ciągłego pobierania małych ilości paszy włóknistej. Ma to odzwierciedlenie w budowie anatomicznej jego przewodu pokarmowego, charakteryzującej się małym w stosunku do masy ciała żołądkiem, długimi jelitami, długą krezką jelitową oraz różną średnicą poszczególnych odcinków jelit. Czynnikami usposabiającymi do rozwoju zaburzeń morzyskowych są m.in. niewłaściwe żywienie, nieprawidłowe użytkowanie i stres, a także procesy zapalne błony śluzowej przewodu pokarmowego, czy też zmiany organiczne w przewodzie pokarmowym (np. blizny w ścianie jelit powstałe po wędrówce pasożytów wewnętrznych, zwężenie światła jelit, zrosty jelit) (Cohen i wsp. 1999, Goncalves i wsp. 2002, Madej i Riha 2008). Najczęstszą przyczyną występowania morzysk u koni jest nagła zmiana diety, zwłaszcza zmiana udziału dodatkowych pasz treściwych (ziarno) w dziennej dawce żywieniowej, co nasila fermentację i wzmożone wytwarzanie kwasów tłuszczowych. 8 Związki te są odpowiedzialne za osłabienie motoryki jelit i w konsekwencji przeładowanie jelita grubego. Do kolejnych ważnych czynników usposabiających do wystąpienia zaburzeń morzyskowych należy duża wrażliwość wegetatywnego układu nerwowego konia na działanie różnych bodźców tj. bezruch lub nadmierny wysiłek, stres, drażniące działanie substancji zawartych w paszy, nagłe oziębienie powłok brzusznych, czy też zmiana ciśnienia atmosferycznego wpływająca na perystaltykę jelit (Cohen i wsp. 1999, Goncalves i wsp. 2002). Czynniki te powodują zmiany napięcia wegetatywnego układu nerwowego, prowadząc do przewagi układu przywspółczulnego (parasympatycznego) nad układem współczulnym (sympatycznym). Pobudzenie układu przywspółczulnego, tzw. wagotonia, może skutkować wzmożoną perystaltyką oraz tzw. skurczem perystaltycznym jelit. Wspomniane zaburzenia w funkcjonowaniu sprzyjają wystąpieniu przemieszczeń jelit i ich całkowitej, częściowej lub przejściowej niedrożności, czyli zaburzeniu przemieszczania się treści pokarmowej od żołądka do końcowego odcinka przewodu pokarmowego (Fryc 1993, Karleskind i Gluntz 1999, Madej i Riha 2008). Mogą one przybierać różną formę, np. zatkania, przemieszczeń, skrętu, wgłobienia lub uwięźnięcia jelit oraz przebiegać z różnym nasileniem. Wymienionym zaburzeniom kolkowym towarzyszy niepokój i objawy bólowe. Zasadniczo nasilenie bólu jest proporcjonalne do zmian w przewodzie pokarmowym (Madej i Riha 2008). Na podstawie stopnia nasilenia objawów wyróżnia się łagodną, umiarkowaną i ciężką postać kolki (Fryc 1999, Sikora 2008). Postępowanie z koniem w przebiegu morzyska uzależnione jest od nasilenia objawów oraz zmian z przewodzie pokarmowym. W przypadku łagodnej i umiarkowanej postaci morzyska wystarczające jest leczenie zachowawcze (podanie leków rozkurczowych i przeciwbólowych, sondowanie żołądka, dożylna podaż płynów w celu unormowania krążenia oraz wyrównania niedoborów elektrolitowych). Jednakże ciężkie postacie kolek związane ze spowolnieniem perystaltyki i nagromadzeniem gazu prowadzące do przemieszczeń i skrętu jelit (ciężki stopień morzyska), wymagają leczenia operacyjnego (Fryc 1999, Sikora 2008). Według danych źródłowych najczęstszymi zaburzeniami wymagającymi interwencji chirurgicznej są przemieszczenia okrężnicy dużej (29%) oraz jej skręt (14%) (Abutarbush i wsp. 2005), a śmiertelność koni operowanych z tych przyczyn wynosi 30-45% (Dallap i wsp. 2003, Tinker i wsp. 1997). Zagrożenie życia zwierzęcia w przebiegu chorób morzyskowych wynika z postępujących zaburzeń w układzie krążenia, których 9 następstwem są zmiany wtórne, typu odwodnienie oraz zmiany zakrzepowo-zatorowe o różnym nasileniu. Zaburzeniom krążenia bardzo często towarzyszą zmiany w hemostazie (Dallap i wsp. 2003, Dallap-Schaer i Epstein 2009). Sprzyja temu zastój krwi spowodowany uciskiem naczyń przez nadmiernie wypełnione lub skręcone jelita. Na skutek ucisku i rozwijających się zaburzeń hemodynamicznych oraz metabolicznych w ścianie jelita dochodzi do rozwoju procesów zapalnych, natomiast w świetle jelit zaczynają się namnażać patogenne bakterie, głównie z rodziny Enterobacteriaceae, których endotoksyny przenikają do krwi. Uważa się, iż uwalniane endotoksyny poprzez aktywację układu krzepnięcia i fibrynolizy przyczyniają się do zaburzeń hemostazy, niedotlenienia i uszkodzenia narządów (Cook i wsp. 2009, Neuder i wsp. 2009). Wykazano, że uwalniane endotoksyny stymulują komórki tj. monocyty, granulocyty do sekrecji mediatorów zapalnych, które dodatkowo uszkadzają śródbłonek naczyń krwionośnych oraz odpowiadają m.in za zapoczątkowanie procesu wykrzepiania (Brooks i wsp. 2007, Dallap-Schaer i Epstein 2009, Hackett i Hassel 2008, Jarvis i Evans 1994, Krumrych i wsp. 1996, 1997, Levi i wsp. 2003, 2012, Levi 2004, Murray 1998, Smith 1993, Weiss i Rashid 1998). Jak wynika z przedstawionych danych, częstym powikłaniem w przebiegu morzysk są zmiany w hemostazie, zwiększające ryzyko komplikacji zakrzepowych, czy też wystąpienie skazy krwotocznej w następstwie wyczerpania czynników krzepnięcia (Alsaad i wsp. 2009, Dallap-Schaer i Epstein 2009, Danese i wsp. 2007, Monreal i wsp. 2000, Yilmaz i wsp. 2002, Yoshida i Granger 2009). Świadczy to o istotnej roli sprawnego funkcjonowania hemostazy jako czynnika predylekcyjnego w przebiegu morzysk. 1.1. Hemostaza Hemostaza obejmuje zespół procesów zapewniających sprawne hamowanie krwawienia po przerwaniu ciągłości ściany naczyń krwionośnych oraz odpowiadających za utrzymanie płynności krążącej krwi (Alsaad i Abid-albar 2009,Yilmaz i wsp. 2002). Układ ten tworzą ściana naczyń krwionośnych oraz płytki krwi (hemostaza pierwotna), białka osocza tj. czynniki krzepnięcia i fibrynolizy oraz ich inhibitory (hemostaza wtórna - osoczowa). Warunkiem optymalnego funkcjonowania hemostazy jest zachowana równowaga pomiędzy krzepnięciem, a fibrynolizą oraz 10 odpowiednia aktywność regulujących je aktywatorów i inhibitorów. Skutkiem zakłócenia tej równowagi jest nadmierne wykrzepianie krwi z powstawaniem licznych zakrzepów lub też osłabienie krzepliwości, przybierającej postać skazy krwotocznej (Monreal i wsp. 2000, Monreal i Cesarini 2009). Istnieje możliwość wystąpienia obu tych procesów równocześnie, przybierając postać rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego (DIC- disseminated intravascular coagulation). Dowiedziono, iż w przebiegu zaburzeń żołądkowo-jelitowych u koni dochodzi do zakłócenia równowagi pomiędzy krzepnięciem i fibrynolizą, skutkując nadmiernym wykrzepianiem krwi z powstawaniem licznych zakrzepów (Brooks 2008, Cesarini i wsp. 2010, Collatos i wsp. 1995b, Cotovio i wsp. 2007, Dallap i wsp. 2003, DallapSchaer i wsp. 2009b, Monreal i wsp. 2000, Monreal i wsp. 2009, Stokol i wsp. 2005, Thomason i wsp. 2006a). Zmiany rozwijające się w opisanych warunkach spełniają wszystkie kryteria, tzw. triady Virchowa, co do okoliczności predysponujących powstawaniu zakrzepów (Byars i wsp. 2003, Kittrell i Berkwitt 2012). Zaleganie zwierzęcia powodowane silnym bólem morzyskowym i towarzyszący ucisk na naczynia skręconych i wzdętych jelit prowadzą do ograniczenia szybkości i ilości przepływającej krwi. Upośledzona wymiana gazowa w obszarze niedokrwionych tkanek i rozwijająca się hipoksja skutkuje uszkodzeniem komórek. Konsekwencją m.in. uszkodzenia śródbłonka jest nie tylko adhezja leukocytów i uwalnianie prozapalnych cytokin. W tych warunkach dochodzi do przenikania do krwi endotoksyn, co stanowi okoliczność wzmagającą powstawanie agregatów leukocytarnopłytkowych. Pojawiające się zaburzenia wodno-elektrolitowe (wzrost lepkości krwi) przy zapoczątkowanej agregacji płytek sprzyjają aktywacji układu krzepnięcia i fibrynolizy. Ostateczny zaś efekt w postaci zakrzepów czy pojawiającej się skazy jest następstwem zaburzonej równowagi dynamicznej uruchomionych procesów. 1.2. Rola naczyń krwionośnych w procesie hemostazy Ściana naczyń krwionośnych tworzy barierę fizyczną i biochemiczną między krwią i tkankami. Zbudowana jest z trzech warstw: warstwy wewnętrznej (intima) tworzonej przez śródbłonek i niewielką ilość tkanki łącznej, warstwy środkowej (media) składającej się głównie z mięśni gładkich oraz z łącznotkankowej warstwy zewnętrznej (przydanka). Wszystkie warstwy ściany uczestniczą w utrzymaniu krążącej krwi 11 w stanie płynnym i w hamowaniu krwawienia po ich uszkodzeniu. Błona wewnętrzna ściany naczyniowej, w skład której wchodzą: pojedyncza warstwa komórek śródbłonka oraz podśródbłonkowa warstwa tkanki łącznej, uczestniczą wspólnie z płytkami krwi w procesach hemostazy pierwotnej. Jednakże najważniejsza rola przypada na śródbłonek, który oprócz funkcji hemostatycznych, jest miejscem wytwarzania szeregu aktywnych biologicznie związków, uczestniczących przede wszystkim w regulacji przepływu krwi, a także w oddziaływaniach między komórkami i ścianą naczyń (Obońska i wsp. 2010, Wnuczko i Szczepański 2007). Hemostatyczna czynność śródbłonka polega na zapewnianiu niekrzepliwości krwi i nietrombogenności ściany naczynia w wyniku przewagi czynników i procesów antykoagulacyjnych nad prokoagulacyjnymi. Ujemnie naładowany glikokaliks pokrywający powierzchnię śródbłonka zapewnia jego „niezwilżalność” w wyniku elektrostatycznego odpychania również ujemnie naładowanych struktur błon komórkowych składników morfotycznych krwi. Działanie antykoagulacyjne zapewniają wytwarzane przez komórki śródbłonka inhibitory krzepnięcia tj. antytrombina, heparyna, trombomodulina, a także związki inaktywujące płytki krwi – tlenek azotu NO, prostacyklina PGI2 (Dallap-Schaer i Epstein 2009, Wnuczko i Szczepański 2007). Komórki śródbłonka uwalniają również dwie grupy substancji o właściwościach zwężających (tromboksan-A2 TXA2, endotelina-1 ET-1, leukotrieny LT, czynnik aktywujący płytki PAF) oraz rozszerzających naczynia (tlenek azotu NO, prostacyklina PGI2, bradykinina, adenozyna). Warstwa podśródbłonkowa, złożona z włókien kolagenu, elastyny, fibronektyny, lamininy i witronektyny, staje się po uszkodzeniu śródbłonka stymulatorem adhezji płytek. W przypadku uszkodzenia naczynia dochodzi do jego skurczu w wyniku uwolnienia z komórek śródbłonka związków naczyniozwężających. Skurcz ten zmniejsza przepływ i utratę krwi. Równocześnie do odsłoniętych włókien kolagenowych zaczynają przylegać płytki krwi, tworząc pierwotny czop płytkowy. Dysfunkcja śródbłonka naczyniowego, niezależnie od przyczyn je wywołujących, może skutkować zwiększonym ryzykiem komplikacji zakrzepowych, jak również występowaniem skaz krwotocznych. Mimo, iż obecnie medycyna ludzka dysponuje biochemicznymi i fizycznymi metodami umożliwiającymi ocenę czynności śródbłonka naczyniowego, to z racji utrudnionego dostępu oraz małej specyficzności testów nadal nie są powszechnie dostępne w codziennej praktyce. 12 1.3. Hemostaza płytkowa Kolejny, obok naczyń krwionośnych, element hemostazy stanowią płytki krwi. Płytki krwi (PLT – ang. platelets), czyli trombocyty, są bezjądrowymi fragmentami cytoplazmy megakariocytów, wytwarzanymi głównie w szpiku oraz w mniejszym stopniu w płucach (Szypuła i wsp. 2009). Po opuszczeniu szpiku około 1/3 puli płytek jest sekwestrowana w śledzionie, podczas gdy pozostałe 2/3 krąży we krwi przez 7 do 10 dni w stanie nieaktywnym (Kaushansky 2009, Saluk-Juszczak i Królewska 2010). Płytka ma kształt dyskoidalny. Otoczona jest błoną komórkową złożoną z 2 warstw lipidowych: zewnętrznej i wewnętrznej, wśród których dominują fosfolipidy. W błonie komórkowej znajdują się liczne białka, które mogą przechodzić przez obie warstwy. Zewnętrzne końce cząstek białkowych wiążąc się z oligosacharydami tworzą glikoproteiny (GP), pełniące funkcje receptorów (Sikora i Kostka 2005, Stachowiak i wsp. 2008). Powierzchnia błony płytkowej wykazuje ujemny ładunek na skutek dużej ilości kwasu sjalowego. Mimo, iż płytka ssaków pozbawiona jest jądra komórkowego, w tym DNA, posiada pozostałe organella występujące w innych komórkach tj.: mitochondria, aparat Golgiego, siateczka śródplazmatyczna, peroksysomy czy lizosomy (Sikora i Kostka 2005, Szypuła i wsp. 2009). Obwodową część cytoplazmy płytki stanowi cytoszkielet zbudowany z białek kurczliwych – aktyny i miozyny. Odpowiada on za zmianę kształtu płytki w trakcie jej aktywacji (Stachowiak i wsp. 2008, Saluk-Juszczak i Królewska 2010, Sikora i Kostka 2005, Szypuła i wsp. 2009, Tablin i Castro 1992). Płytki okazują się być strukturami niezwykle reaktywnymi, a ich zdolność do odpowiedzi na różne bodźce uwarunkowana jest obecnością ogromnej liczby swoistych receptorów powierzchniowych (ponad 40 typów) oraz wielu biologicznie czynnych substancji zawartych w ziarnistościach, które dzieli się na: (McMichael 2005, Saluk-Juszczak i Królewska 2010, Textor 2010, Wrzyszcz 2003) 1. Ziarnistości alfa, zawierające fibrynogen, czynnik von Willebranda, czynnik płytkowy 4 (PF-4), płytkowy czynnik wzrostu (PDGF - platelet-derived growth factor), beta-tromboglobulinę, trombospondynę, czynniki krzepnięcia V, VIII, XI i XIII, kininogen, białko S, czynniki wzrostowe (ułatwiające wzrost fibroblastów, komórek endotelialnych i mięśniowych naczyń), P-selektynę 13 (McMichael 2005, Saluk-Juszczak i Królewska 2010, Śliwińska-Stańczyk 2005). 2. Ziarnistości delta (gęste), które są źródłem ADP, ATP, GDP, GTP, histaminy, epinefryny, serotoniny (nie jest ona produkowana przez płytki, a jedynie inkorporowana z osocza krwi), jony wapnia i magnezu (McMichael 2005, Saluk-Juszczak i Królewska 2010, Śliwińska-Stańczyk 2005). 3. Ziarnistości gamma, wydzielające głównie kwaśne hydrolazy (Szypuła i wsp. 2009). Jakkolwiek przyjmuje się, iż opisana morfologia płytki jest podobna u wszystkich ssaków, to istnieją pewne cechy specyficzne dla konia. Dotyczy to m.in. średniej liczby płytek krwi, która u koni mieści się w dość szerokich granicach od 90 000 do 400 000 w l i stanowi najniższą koncentrację płytek krwi spośród wszystkich ssaków. Mimo, iż objętość większości płytek konia jest mniejsza w porównaniu do człowieka, to w jego krwi obwodowej zaznacza się obecność płytek o zróżnicowanej wielkości (tzw. anizocytoza), tzn.występują płytki o średnicy 2-3 m, jak również 12-20 m (Feldman i wsp. 2000). Kolejną charakterystyczną cechą tego gatunku jest to, że ziarnistości alfa konia są dwukrotnie większe niż u człowieka, jak również ich struktura jest bardziej zorganizowana (uporządkowana) (Brunso i wsp. 2010, Gader i wsp. 2008, Segura i wsp. 2006). Odmienna jest także architektura wewnętrznej błony komórkowej, która u człowieka posiada liczne wgłębienia skierowane ku cytoplazmie, tworząc tzw. układ otwartych kanalików (OCS – open canalicular system). Służą one jako drogi transportu różnych substancji do wnętrza płytek, jak również przez te kanaliki dochodzi do uwolnienia do osocza składników zawartych w ziarnistościach cytoplazmatycznych (Łuksza i Mantur 2009, Feldman i wsp. 2000, White i Escolar 1991). Badania z użyciem kwasu taninowego (ang. tannic acid) przeprowadzone przez Brunso i wsp. 2010, Gader i wsp. 2008, Segura i wsp. 2006 wykazały, iż w płytkach konia brak jest OCS, a mechanizm sekrecji ziarnistości jest całkowicie odmienny w porównaniu do człowieka i innych gatunków zwierząt. Podstawową funkcją płytek jest ich udział w utrzymywaniu hemostazy (Arguelles i wsp. 2006, Fullard 2004, Piccione i wsp. 2010, Dallap-Schaer i Epstein 2009) poprzez: regulowanie przepływu krwi, tworzenie czopa płytkowego, 14 aktywację krzepnięcia i wytwarzanie fibryny stabilizującej czop płytkowy, inicjowanie procesu fibrynolizy Główną rolą trombocytów jest tworzenie płytkowego czopa hemostatycznego, w którym wyróżnia się kilka etapów: a) adhezję płytek do warstwy śródbłonkowej, b) aktywację, zmianę kształtu, sekrecję zmagazynowanych substancji c) agregację (Borowska i wsp. 2006, Dallap-Schaer i Epstein 2009, Stachowiak i wsp. 2008). Procesy te uzależnione są od przekazywania sygnałów z wyspecjalizowanych receptorów błonowych do wnętrza komórki. Możliwe jest to dzięki sprzężeniu receptorów z enzymatycznymi układami przekazywania sygnału (Fullard 2004, Olas 2001). Ze względu na budowę i mechanizm działania receptorów płytkowych wyróżnia się dwie grupy: a) receptory transbłonowe, sprzężone z białkami G, są zbudowane z siedmiu transbłonowych domen tzw. receptorów serpentynowych. Do tej grupy należą receptory dla trombiny, ADP, prostanoidów (TXA2, PGE2, PGI2) oraz fosfolipidów. Za pośrednictwem tych receptorów aktywację płytek mogą również powodować serotonina i adrenalina (epinefryna), które określane są mianem tzw. słabych agonistów (Feldman i wsp. 2000, Olas 2001, Sikora i Kostka 2005). b) receptory dla białek adhezyjnych, których struktura pozwala zaliczyć je do rodzin: integryn, selektyn i immunoglobulin. Receptory integrynowe (np. integryna IIb3 - GP IIb/IIIa) występują w największej ilości na płytkach krwi i stanowią grupę o największym znaczeniu w aktywacji płytek krwi (Sikora i Kostka 2005, Feldman i wsp. 2000, Fullard 2004). Płytki krwi mogą być pobudzone przez szereg agonistów, tj. trombinę, tromboksan A2 (TXA2), ADP, epinefrynę czy też kolagen, co skutkuje zmianą ich kształtu, sekrecją zmagazynowanych substancji oraz agregacją (Olas 2001, Piccione i wsp. 2010, Yeaman 1997). Aktywacja ta może być hamowana poprzez inhibitory cyklooksygenazy (np. niesteroidowe leki przeciwzapalne). Ze względu na to, że pobudzenie płytek pod wpływem trombiny jest niezależne od inhibicji cyklooksygenazy, trombina zaliczana jest do tzw. silnych agonistów płytek. Natomiast ADP i epinefryna (adrenalina) należy do grupy słabych płytkowych aktywatorów 15 (McMichael 2005, Michalak i wsp. 2010, Yeaman 1997). W tym zakresie obserwuje się pewne zróżnicowanie gatunkowe. Badania przeprowadzone przez Segura i wsp. 2005 dowiodły, iż epinefryna jest słabym aktywatorem płytek krwi konia, w związku z czym nie wykazuje efektu agregacyjnego u tego gatunku zwierząt. Przyłączenie agonisty do specyficznego receptora błonowego sprzężonego z białkiem G inicjuje przekazywanie sygnału aktywacyjnego do wnętrza komórki. Zachodząca wówczas hydroliza fosfolipidów błonowych uruchamia dwa podstawowe, powiązane ze sobą szlaki metaboliczne – szlak fosfolipazy C oraz kaskadę kwasu arachidonowego (AA) (Olas i Wachowicz 1995, Feldman i wsp. 2000, Saluk-Juszczak i Królewska 2010, Stachowiak i wsp. 2008). Fosfolipaza C poprzez rozkład PIP 2 (difosforan fosfatydyloinozytolu) prowadzi do powstania „wtórnych przekaźników”: diacyloglicerolu (DAG) oraz trójfosforanu inozytolu (IP3), pośredniczącego w przenoszeniu jonów wapnia Ca2+ do cytoplazmy płytek. IP3 wraz z DAG stymulują fosforylację białek cytoszkieletu, co skutkuje przemieszczeniem i uwalnianiem ziarnistości oraz zmianą kształtu płytek (Feldman i wsp. 2000, Saluk-Juszczak 2007, Stachowiak i wsp. 2008, Szumiło i Rahden-Staroń 2008, Wrzyszcz 2003). Uwolnienie jonów Ca2+ odgrywa kluczową rolę w procesie aktywacji fosfolipazy A2 i uruchomieniu kaskady kwasu arachidonowego (AA) (Feldman i wsp. 2000, Komosa i wsp. 2010, Kuwahara i wsp. 2002). Kwas arachidonowy jest metabolizowany w dwóch odmiennych układach. W układzie zależnym od 12-lipooksygenazy dochodzi do powstania głównie hydroksykwasów (kwas 12-hydroperoksyeikozatetraenowy (12-HPETE) i kwas 12-hydroksyeikozatetraenowy (12-HETE)), a także hepoksylin A3 i B3. Natomiast w układzie zależnym od cyklooksygenazy kwas arachidonowy ulega przemianie w nadtlenki prostaglandyn (PGG2, PGH2), które następnie są przekształcane przy udziale syntazy tromboksanu w tromboksan A2 (TXA2). TXA2 jest metabolitem o dużej aktywności i krótkim, około 30-sekundowym, okresie półtrwania. Szybko ulega rozpadowi do nieaktywnego tromboksan B2 (TXB2) (Feldman i wsp. 2000, McMichael 2005, Stachowiak i wsp. 2008, Szypuła i wsp. 2009). Wspomniany TXA2 jest silnym agonistą płytek, który stymuluje ich agregację i uwalnianie ziarnistości. Powoduje równocześnie silnie zwężenie naczyń krwionośnych (Feldman i wsp. 2000, Murray i Fitzgerald 1989, Olas i Wachowicz 1995, Stachowiak i wsp. 2008, Szypuła i wsp. 2009, Textor 2010). Przeciwstawne do tromboksanu działanie wykazuje inny produkt metabolizmu kwasu arachidonowego komórek śródbłonka, jakim jest prostacyklina (PGI2). Hamuje ona aktywność płytek oraz wywołuje rozszerzenie naczyń 16 krwionośnych (Feldman i wsp. 2000, Komosa w wsp. 2010, Wnuczko i Szczepański 2007, Szypuła i wsp. 2009). Rola płytek krwi nie ogranicza się tylko do układu hemostazy. Wykazano, że płytkopochodne czynniki odgrywają istotną rolę także w wielu innych procesach toczących się w organizmie m.in. w procesach zapalnych, wpływając na wytwarzanie cytokin, chemokin, cząsteczek adhezyjnych, co wpływa na procesy gojenia. Wskazuje się na szczególną ich rolę w procesach odpornościowych poprzez indukcję dojrzewania komórek dendrytycznych, jak również wytwarzania przeciwciał i wzmacnianie odpowiedzi immunologicznej (Arguelles i wsp. 2006, Iwaszko-Simonik i wsp. 2012a, Ważna 2006, Yeaman 1997, 2010). Podkreślany jest także udział płytek w metastazie komórek nowotworowych, a u człowieka również powstawaniu i rozwoju stanów miażdżycowych (Chen i Geng 2006, Kaushansky 2009, Kralisz 2008, Michalak i wsp. 2010, Wrzyszcz 2003). Okazuje się, że płytki krwi, podobnie jak leukocyty, posiadają zdolność pochłaniania różnego rodzaju cząstek nieorganicznych (cząsteczek lateksu, złota), bakterii (np. Staphylococcus aureus), wirusów, czy też grzybów (np. Candida albicans) (Boukour i Cramer 2005, Escolar i wsp. 1989, Kamocki i wsp. 2005, Male i wsp. 1992, Matowicka-Karna i Kemona 2002, Saluk-Juszczak 2007, White 2005, Yeaman 1997, Yeaman 2010, Youssefian i wsp. 2002). Zdolność pochłaniania różnorodnych cząsteczek (np. oranż akrydyny, czerwień obojętna) posiadają komórki żywe, co z powodzeniem wykorzystuje się jako test dla określenia żywotności komórek w testach na cytotoksyczność różnych substancji (Antal i wsp. 1995, Ciapetti i wsp. 1996, Iwaszko-Simonik i wsp. 2010b, Repetto i wsp. 2008, Roland i Birrenkott 1998). Jak dotąd nie wyjaśniono definitywnie, czy jest to proces aktywny, czy tylko bierny efekt sekwestracji obcych cząsteczek (Escolar i wsp. 1989, Male i wsp. 1992, White 1972, White 2005, White 2006a, White i Escolar 1991, Youssefian i wsp. 2002). W badaniach z użyciem trombocytów ptaków Roland i Birrenkott 1998 wykazali, że ilość pochłoniętej czerwieni obojętnej zależy od stanu czynnościowego tych komórek. Znalazło to potwierdzenie w przeprowadzonych badaniach własnych. Zróżnicowaną zdolność pochłaniania czerwieni obojętnej wykazywały płytki szczurów w zależności od pochodzenia podawanych szczurom ekstrahowanych z roślin substancji polifenolowo-polisacharydowych (Iwaszko-Simonik i wsp. 2010b). 17 1.3.1. Adhezja Jak już wspomniano wcześniej, tworzenie pierwotnego czopu hemostatycznego jest procesem wieloetapowym, który rozpoczyna się adhezją płytek do uszkodzonego śródbłonka. Jakiekolwiek naruszenie jego integralności skutkuje odsłonięciem włókien kolagenu oraz uwolnienia z ciałek Weibel-Pallade’go czynnika von Willebranda – vWF (ang. von Willebrand Factor), który ułatwia adhezję płytek do miejsca uszkodzenia (Kobusiak-Prokopowicz i wsp. 2006, Kralisz 2008, Michalak i wsp. 2010). W adhezji płytek do śródbłonka biorą udział receptory rozmieszczone zarówno na powierzchni płytek, a także cząstki adhezyjne na śródbłonku, szereg cytokin uwalnianych z płytek, komórek śródbłonka i leukocytów oraz liczne białka adhezyjne uwalniane z warstwy podśródbłonkowej lub obecne we krwi. Istotną rolę w tym procesie odgrywa P-selektyna, a także integryna 21 oraz kompleks GP Ib/IX/V (Kobusiak-Prokopowicz i wsp. 2006). P-selektyna (CD62P) P-selektyna jest białkiem adhezyjnym umiejscowionym w α-ziarnistościach płytek oraz w ciałkach Weibela-Pallade’a komórek śródbłonka (Gawaz i wsp. 1999, Massaguer i wsp. 2003, Merten i Thiagarajan 2004, Polek i wsp. 2009, Xu i wsp. 2007). Jest glikoproteiną o masie cząsteczkowej 140 kDa, zbudowaną z trzech części: domeny zewnątrzkomórkowej, części międzybłonowej (transbłonowej) oraz domeny wewnątrzkomórkowej (cytoplazmatycznej). Część zewnątrzkomórkowa zbudowana jest z N-końcowej domeny lektynowej wiążącej jony wapnia, leżącej za nią domeny podobnej do czynnika wzrostu naskórka (EGF – epidermal growth factor) oraz serii krótkich, powtarzających się domen przypominających białka regulacyjne układu dopełniacza (Polek i wsp. 2009, Massaguer i wsp. 2003, Ważna 2006, Merten i Thiagarajan 2004, Schmitt-Sody i wsp. 2007). Podczas aktywacji płytek (np. trombiną, ADP, kolagenem czy LPS-em), -ziarnistości ulegają przemieszczeniu i fuzji z błoną komórkową, podczas której dochodzi do uwolnienia do osocza mikropęcherzyków (PMV – platelet-derived microvesicles), zwanych inaczej mikrocząsteczkami (PMP – platelet-derived microparticles) (Merten i Thiagarajan 2004, Polek i wsp. 2009, Smith 2009, Stenberg i wsp. 1985, Ważna 2006). 18 Wykazano, że PMV (PMP) są fragmentami błon komórkowych aktywowanych płytek, które na drodze egzocytozy są uwalniane do osocza (Łuksza i Mantur 2009, Smith 2009, Ważna 2006). Na swojej powierzchni zawierają szereg białek prokoagulacyjnych tj. czynnik von Willebranda, P-selektynę, czy też czynnik tkankowy (TF - tissue tactor). Zjawisko uwalniania PMV z aktywowanych płytek zostało dobrze udokumentowane (Łuksza i Mantur 2009, Smith 2009, Ważna 2006). Towarzyszy temu szybka translokacja P-selektyny na powierzchnię płytek (w ciągu kilkunastu sekund) (Lalko i wsp. 2003, Massaguer i wsp. 2003, Merten i Thiagarajan 2004, Michelson i wsp. 1999, Xu i wsp. 2007). Wykazano, że aktywne płytki człowieka mają na swojej powierzchni około 10 000 cząsteczek P-selektyny (Merten i Thiagarajan 2004, Polek i wsp. 2009, Stenberg i wsp. 1985). Ma ona jednak krótki okres półtrwania i utrzymuje się na powierzchni aktywowanych komórek około jednej godziny od maksymalnej ekspresji. Następnie złuszczana jest do osocza na powierzchni mikropęcherzyków (mikrocząstek) (Merten i Thiagarajan 2004, Polek i wsp. 2009, Stenberg i wsp. 1985, Ważna 2006). Uwolniona do osocza P-selektyna nazywana jest rozpuszczalną formą P-selektyny (sP-selektyna – soluble P-selectin, sCD62P) uznawana jest jako marker aktywacji płytek i śródbłonka. Jednakże ze względu na brak możliwości rozróżnienia źródła pochodzenia rozpuszczalnej P-selektyny (płytki czy śródbłonek), wiarygodniejszą formą oceny aktywności płytek jest cytometryczna analiza ekspresji CD62P na powierzchni wyizolowanych trombocytów (Merten i Thiagarajan 2004). W badaniach klinicznych u człowieka udowodniono, że wzrost ekspresji P-selektyny na powierzchni płytek, a zarazem wzrost jej stężenia w osoczu jest głównym czynnikiem predykcyjnym powikłań zakrzepowo-zatorowych (Polek i wsp. 2009). Można przypuszczać, że podobny mechanizm może mieć miejsce u koni. Powierzchniowa P-selektyna pełni rolę białka receptorowego CD62P, pośrednicząc w adhezji płytek krwi do śródbłonka naczyń krwionośnych oraz do komórek układu białokrwinkowego (Polek i wsp. 2009, Dunkel i wsp. 2009, Śliwińska-Stańczyk 2005). Oddziaływanie P-selektyny z ligandem PSGL-1 (P-Selectin Glycoprotein Ligand 1) obecnym na leukocytach powoduje powstawanie agregatów płytek krwi z leukocytami (Furie 2009, Merten i Thiagarajan 2004, Peters i wsp. 1997, Pawlus i wsp. 2010, Polek i wsp. 2009, Weiss i wsp. 1998a, Xu i wsp. 2007). Wspomniana selektyna uczestniczy również w toczeniu się płytek po powierzchni śródbłonka (Chen i Geng 2006, Furie i Furie 2004, Lalko i wsp. 2003, Merten i Thiagarajan 2004, Pawlus i wsp. 2010, Polek i wsp. 2009, Schmitt-Sody i wsp. 2007, Vandendries i wsp. 2004). W czynności tej 19 udział bierze P-selektyna oraz jej ligand PSGL-1, które odpowiadają za luźny i odwracalny kontakt płytek z komórkami śródbłonka. Ścisła adhezja, a następnie agregacja wymaga zaangażowania integryn płytek krwi i komórek śródbłonka, zwłaszcza integryny IIb3 (inaczej receptor GP IIb/IIIa lub CD41/61) (Borowska i wsp. 2006, Kralisz 2008). Adhezja płytek do składników podśródbłonkowej tkanki łącznej jest również zależna od warunków przepływu krwi oraz od obecności na powierzchni płytek specyficznych receptorów glikoproteinowych (McMichael 2005, Stachowiak i wsp. 2008). Przy przepływie o niskim module ścinania (ang. low shear rate), charakterystycznym dla dużych tętnic i żył, płytki wiążą się bezpośrednio z kolagenem za pośrednictwem receptora GPIa/IIa (integryna 21). Natomiast w warunkach przepływu o wysokim module ścinania (ang. high shear rate), w małych tętnicach lub zwężonych naczyniach krwionośnych, adhezja płytek do kolagenu odbywa się za pośrednictwem vWF. W łączeniu się płytek z vWF uczestniczy kompleks receptorowy GP Ib/IX/V oraz integryna IIb3 (McMichael 2005, Michelson i Barnard 1987, Kralisz 2008, Stachowiak i wsp. 2008, Sikora i Kostka 2005). Adhezja płytek skutkuje ich aktywacją, z następującą zmianą kształtu, sekrecją zmagazynowanych substancji, a w późniejszym okresie agregacją (Borowska i wsp. 2006, Dallap Schaer i Epstein 2009, Stachowiak i wsp. 2008). 1.3.2. Aktywacja Zmiana kształtu płytek krwi W procesie aktywacji dochodzi do zmian metabolizmu płytek, zmiany struktury cytoszkieletu oraz translokacji białek. Reorganizacja cytoszkieletu skutkuje zmianą kształtu płytki z dyskoidalnego na sferyczny, a następnie wytworzeniem licznych wypustek (filopodiów i lamellipodiów) (Kuwahara i wsp. 2002, Saluk-Juszczak i Królewska 2010, Wrzyszcz 2003). Wypustki te wraz ze znajdującymi się na nich receptorami umożliwiają adhezję płytek do ściany naczynia krwionośnego i kontakt z innymi płytkami, a także przemieszczenie ziarnistości i sekrecję zmagazynowanych w nich związków (Olas 2001) 20 Sekrecja Na skutek wspomnianych zmian strukturalnych dochodzi do uwolnienia zawartości ziarnistości płytek do osocza. Uwalnianie ich zawartości następuje na skutek fuzji poszczególnych ziarnistości (Brunso i wsp. 2010, Gader i wsp. 2008, Segura i wsp. 2006). Z ziarnistości gęstych uwalniane są wapń, serotonina i dwufosforan adenozyny (ADP), a z ziarnistości alfa – czynnik von Willebranda, fibronektyna, trombospondyna, płytkowopochodny czynnik wzrostu (PDGF - platelet-derived growth factor) i białko neutralizujące heparynę (PF-4 - płytkowy czynnik 4). Uwolnione substancje aktywne łączą się z odpowiednim receptorami powierzchniowymi, wzmacniając adhezję oraz agregację (McMichael 2005, Olas i Wachowicz 1995). 1.3.3. Agregacja Integryna IIb3 - GP IIb/IIIa (CD 41/61) Końcowa faza powstawania płytkowego czopa hemostatycznego – agregacja polega na łączeniu się płytek ze sobą za pomocą fibrynogenu. Zasadniczą rolę w tym procesie odgrywa integryną IIb3 nazywana inaczej kompleksem glikoproteinowym GP IIb/IIIa, czy też receptorem CD 41/61. Integryna IIb3 jest heterodimerem zbudowanym z dwóch podjednostek: alfa () i beta () połączonych ze sobą niekowalencyjnie. W wiązaniu tych podjednostek biorą udział dwuwartościowe kationy tj. jony wapnia i magnezu, które są niezbędne do utrzymania prawidłowej struktury przestrzennej tego receptora, a tym samym zapewnienia zdolności wiązania ligandów (Borowskaiwsp.2006, Dominguez-Jimenez i wsp. 1999, Ma i wsp. 2007, Fullard 2004, Topol i wsp. 1999). Wspomniany receptor składa się z fragmentu zewnątrzkomórkowego (N-koniec), odcinka przezbłonowego oraz krótkiej sekwencji cytoplazmatycznej (C-koniec). Podjednostka jest odpowiedzialna za swoiste wiązanie z ligandem. Swoistość ligandu jest determinowana sekwencją aminokwasową argininaglicyna-asparagina (tzw. kompleks RGD) fragmentu zewnątrzkomórkowego, rozpoznawanego przez integrynę. Przedstawiona sekwencja aminokwasowa jest składową fibrynogenu i czynnika von Willebranda, dla których integryna IIb3 jest receptorem (Borowska i wsp. 2006, 21 Ma i wsp. 2007, Fullard 2004). Wykazano, iż receptor GP IIb/IIIa charakteryzuje się dwukierunkowym przekazywaniem sygnału do wnętrza komórki i na zewnątrz (ang. outside-in signaling). Aktywacja receptora skutkuje przekazaniem sygnału pobudzającego do wnętrza komórki, a następnie inicjowane jest przekazanie sygnału na zewnątrz, co skutkuje zmianą powinowactwa receptora do ligandu (Ryc. 1) (Cierniewski 2000, Feldman i wsp. 2000, Fullard 2004). Ryc. 1. Aktywacja płytek krwi pod wpływem agonistów, skutkująca ekspresją receptorów powierzchniowych (CD62P - P-selektyna, GPIIb/IIIa – CD41/61) oraz uwolnieniem ziarnistości i mikrocząsteczek (PMP) (wg Gawaz i wsp. 1999, modyfikacja własna). Thr - trombina; Col – kolagen; ADP – adenozynotrójfosforan; Epi – epinefryna (adrenalina); Fg - fibrynogen Kompleks glikoproteiny płytkowej IIb/IIIa jest najliczniejszym receptorem na powierzchni płytek (Olas i Wachowicz 1995, Olas 2001, Wrzyszcz 2003). Szacuje się, iż jeden trombocyt w stanie spoczynku zawiera około 50 000 - 80 000 kopii tej integryny. Dodatkowa ilość tych receptorów jest eksponowana podczas aktywacji, na skutek przesunięcia z puli wewnątrzkomórkowej (Fullard 2004, Topol i wsp. 1999, Varga-Szabo i wsp. 2008). Podczas aktywacji płytek dochodzi do zmiany konformacji glikoproteiny ze zwiniętej formy spoczynkowej, w rozwiniętą formę aktywną (Cierniewski 2000, Feldman i wsp. 2000, Ma i wsp. 2007). W procesie tym uczestniczy kinaza białkowa C, która fosforyluje 22 cytoplazmatyczne domeny receptora. Ta transformacja zwiększa powinowactwo receptora do fibrynogenu i czynnika von Willebrandta (Feldman i wsp. 2000, Ma i wsp. 2007). Związanie się fibrynogenu z receptorami GP IIb/IIIa (CD41/61) znajdującymi się na powierzchni pobudzonych płytek prowadzi do ich połączenia i powstania agregatu płytkowego (Sorensen i wsp. 2012). Płytki te uwalniają substancje biologicznie aktywne, które stymulują inne trombocyty przepływające obok uszkodzonego obszaru. Przyłączają się one do tworzonego agregatu, prowadząc do powstania pierwotnego czopa płytkowego. Jest on jednak nietrwały i utrzymuje się zaledwie kilka godzin, dopóki mechanizmy hemostazy wtórnej (osoczowej) nie doprowadzą do jego wzmocnienia poprzez wytworzenie sieci fibryny (McMichael 2005). W badaniach przeprowadzonych u człowieka za pomocą cytometrii przepływowej dostrzeżono, iż używając przeciwciał łączących się z aktywną formą integryny można określić stopień aktywności płytek (Dunkel i wsp. 2009, Lalko i wsp. 2003, Michelson 2009, Saluk-Juszczak 2007, Wang i wsp. 1999). Ze względu, że receptor ten jest kluczowy dla agregacji trombocytów, stał się on celem efektywnej terapii antypłytkowej u ludzi (Dominguez-Jimenez i wsp. 1999, Komosa i wsp. 2010, Michalak i wsp. 2010). Na skutek zmian strukturalnych podczas aktywacji płytek oprócz ekspresji opisanych receptorów dochodzi również do ekspresji fosfolipidów tj. fosfatydyloseryny i fosfatydyletanoloaminy. Zwiększona ekspresja fosfatydyloseryny w zewnętrznej warstwie błony komórkowej płytek doprowadza do wytworzenia się powierzchni prokoagulacyjnej dostępnej dla czynników krzepnięcia. W ten sposób realizuje się kolejna funkcja płytek, jaką jest aktywacja osoczowej kaskady krzepnięcia, tzw. hemostazy wtórnej (Feldman i wsp. 2000, Łuksza i Mantur 2009, Radziwon i wsp. 2004, Smith 2009). 1.4. Hemostaza osoczowa W hemostazie osoczowej udział biorą białkowe czynniki krzepnięcia, ich kofaktory oraz inhibitory. Najczęściej wyróżnia się 12 osoczowych czynników krzepnięcia, które w większości produkowane są w wątrobie i oznaczane w nomenklaturze międzynarodowej cyframi rzymskimi. Czynniki te krążą w osoczu w postaci nieaktywnych proenzymów, a ich aktywacja zapoczątkowuje szereg 23 uporządkowanych reakcji wtórnej hemostazy, której istotą jest przekształcenie fibrynogenu w fibrynę pod wpływem enzymu trombiny (Dallap-Schaer i Epstein 2009, Levi i wsp. 2003, Raszeja-Specht 2008). Powstawanie fibryny w miejscu uszkodzenia naczynia krwionośnego jest wynikiem cyklu reakcji, definiowanych powszechnie jako kaskada krzepnięcia. W klasycznym modelu kaskady krzepnięcia, odnoszącym się do warunków in vitro, wyróżnia się drogę zewnątrz- i wewnątrzpochodną oraz tor wspólny (Ryc. 2). W rzeczywistości trudno jest wyodrębnić poszczególne drogi aktywacji procesów krzepnięcia, gdyż są one ze sobą ściśle powiązane i zazwyczaj przebiegają równocześnie (Dallap-Schaer i Epstein 2009, Raszeja-Specht 2008, Smith 2009, Wheeler i Rice 2010). Jednakże model ten najprościej obrazuje przemiany zachodzące podczas aktywacji krzepnięcia oraz stanowi proste zaplecze teoretyczne dla laboratoryjnej diagnostyki układu hemostazy (Raszeja-Specht 2008, Smith 2009, Wheeler i Rice 2010). Obecnie klasyczny model kaskady krzepnięcia uległ pewnym modyfikacjom i uwzględnia pojęcia fazy: inicjacji, wzmocnienia oraz fazy efektorowej. Dowiedziono, iż w inicjacji procesów krzepnięcia in vivo odpowiedzialny jest głównie układ zewnątrzpochodny, natomiast układ wewnątrzpochodny, jako modulator układu zewnątrzpochodnego, pełni rolę pomocniczą (Radziwon i wsp. 2004). Głównym aktywatorem zewnątrzpochodnego toru krzepnięcia w ustroju jest czynnik tkankowy (TF – tissue factor) pochodzący z uszkodzonych tkanek. Jakiekolwiek uszkodzenie śródbłonka (uraz, zabieg operacyjny, endotoksyny) powoduje ekspozycję czynnika tkankowego oraz jego bezpośredni kontakt z krwią. Umożliwia to połączenie TF z czynnikiem VII w obecności jonów wapnia, tworząc kompleks TF/VIIa, który aktywuje czynnik X do Xa. Alternatywnie kompleks może pośrednio aktywować czynnik X przez inicjację czynnika IX, który następnie aktywuje czynnik X. Aktywacja czynnika IX może również zachodzić przy pomocy czynnika XI, rozpoczynając fazę wzmocnienia (Dallap-Schaer i Epstein 2009, Levi i wsp. 2003, Radziwon i wsp. 2004). Aktywacja czynników IX i X prowadzi do połączenia pomiędzy wewnątrzi zewnątrzpochodnym torem układu krzepnięcia, nazywanego torem wspólnym. Czynnik X tworzy kompleks ze swoimi kofaktorami – czynnikiem Va i VIIIa, aktywowanymi przez niewielką ilość trombiny, powstającą w pierwszych sekundach krzepnięcia (Dallap-Schaer i Epstein 2009, Levi i wsp. 2003, Raszeja-Specht 2008). Trombina inicjuje uwolnienie czynnika VIII z jego połączenia z czynnikiem von Willebranda. Aktywne czynniki krzepnięcia Xa, Va i VIIIa, są wiązane z ujemnie naładowanymi fosfolipidami powierzchni płytek za pomocą 24 jonów wapnia. Powstały kompleks proteolitycznie przekształca protrombinę do trombiny (Dallap-Schaer i Epstein 2009, Levi i wsp. 2003, Radziwon i wsp. 2004, Raszeja-Specht 2008). Początkowo stężenie trombiny jest zbyt niskie, aby wytworzyć dostateczną ilość fibryny, wystarcza jednak do aktywacji płytek krwi, czynników: V, VIII oraz pośrednio IX, tworząc układ dodatnich sprzężeń zwrotnych zwielokratniających jej generowaną ilość (Dallap-Schaer i Epstein 2009, Michelson i Barnard 1987, Radziwon i wsp. 2004). W fazie efektorowej trombina rozszczepia cząsteczki fibrynogenu na fibrynopeptydy A i B oraz monomery fibryny jak również aktywuje czynnik XIII (czynnik stabilizujący fibrynę). Monomery fibryny ulegają polimeryzacji, tworząc siatkę fibryny, które są wzmacniane i stabilizowane dwusiarczkowymi wiązaniami przy udziale czynnika XIIIa (Radziwon i wsp. 2004, Raszeja-Specht 2008, Sorensen i wsp. 2012). Dowiedziono, iż wewnątrzpochodny szlak krzepnięcia pełni tylko podrzędną rolę w układzie hemostazy w warunkach in vivo. Szlak ten jest aktywowany poprzez kontakt czynnika XII (czynnika Hagemana) z prekalikreiną oraz wysokocząsteczkowym kininogenem (HMWK - high molecular weight kininogen). Białka te nazywane czynnikami kontaktu aktywując się wzajemnie (sprzężenie zwrotne dodatnie), biorą udział przede wszystkim w inicjacji procesu zapalnego (w tym kininogenezy). Z krążącej we krwi prekalikreiny pod wpływem czynnika XII powstaje kalikreina osoczowa, która jest kofaktorem reakcji przejścia wysokocząsteczkowego kininogenu w kininy (bradykinina, kalidyna). Kininy są aktywnymi peptydami regulującymi proces zapalny, które oddziaływują na naczynia prowadzą do ich rozszerzenia oraz zwiększonej przepuszczalności (Levi i wsp. 2003). Czynniki kontaktu stanowią ważne ogniwo łączące proces zapalny z krzepnięciem krwi. Kompleks tych czynników prowadzi do przejścia czynnika XI w jego aktywną formę (XIa), który dalej aktywuje czynnik IX. Czynnik IX może również zostać aktywowany przez czynnik VIIa, co stanowi przykład powiązania szlaku wewnątrz- i zewnątrzpochodnego. Czynniki kontaktu nie są konieczne do aktywacji procesów krzepnięcia, co potwierdza, iż wrodzone niedobory czynnika XII nie prowadzą do skaz krwotocznych. Widoczne jest to u konia, którego cechą gatunkową jest mniejsza aktywność czynnika XII w porównaniu z człowiekiem oraz innymi gatunkami, co nie powoduje występowania krwawień (Byars i wsp. 2003). 25 Czynniki kontaktu uczestniczą również w regulacji procesów fibrynolitycznych, np. czynnik XII aktywuje rozkład plazminogenu do plazminy. Jak już wspomniano, istotą krzepnięcia krwi jest powstanie fibryny w miejscu uszkodzenia. Natomiast procesem, który na skutek rozpuszczenia złogów fibryny przywraca drożność naczyń jest fibrynoliza. 26 UKŁAD KRZEPNIĘCIA XII UKŁAD ANTYKOAGULACYJNY Tor zewnątrzpochodny XIIa XI XIa TF Ca2+ IX IXa Tor Ca2+ wewnątrzpochodny X TF/VIIa VIII VII VIIIa Białko C PL Tor wspólny Xa AT V Ca2+ Protrombina Va PL Trombina AT XIIIa Fibrynogen XIII Fibryna Plazmina UKŁAD t-PA u-PA FIBRYNOLIZY Plazminogen Ryc. 2. Schemat kaskady krzepnięcia (Szułdrzyński 2008, modyfikacja własna) PL – fosfolipidy; TF – czynnik tkankowy; AT – antytrombina; t-PA – tkankowy aktywator plazminogenu; u-PA – urokinazowy aktywator plazminogenu; Ca2+ - wapń. 27 1.5. Fibrynoliza Podobnie jak układ krzepnięcia, układ fibrynolizy stanowi system powiązanych ze sobą enzymów proteazowych, aktywatorów oraz ich inhibitorów (Ryc 2) (RaszejaSpecht 2008). Aktywatory plazminogenu, tj. tkankowy aktywator plazminogenu (t-PA) i urokinazowy aktywator plazminogenu (u-PA) przekształcają plazminogen do aktywnego enzymu plazminy (Dallap-Schaer i Epstein 2009). Plazmina rozkłada fibrynogen i fibrynę, prowadząc do powstania tzw. produktów degradacji – FDPs (ang. fibrinogen-fibrin degradation products) – fragmentów X, Y, D i E. Natomiast w wyniku działania plazminy na ustabilizową przez czynnik XIIIa fibrynę powstają specyficzne produkty degradacji fibryny, zwane D-dimerami (Brooks 2008, DallapSchaer i Epstein 2009, Dąbrowska 2000, Levi i wsp. 1997, 2003, Tapper i Herwald 2000). Obecność tych ostatnich świadczy o wtórnej aktywacji fibrynolizy, poprzedzonej aktywacją krzepnięcia i generacją fibryny, typowej dla przebiegu procesu rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego (DIC - disseminated intravascular coagulation) (Dąbrowska 2000). Hamowanie procesów fibrynolitycznych odbywa się głównie wskutek działania inhibitorów, tj. inhibitorów aktywacji plazminogenu (PAI - plasminogen activator inhibitor) oraz antyplazmin (alfa2 - antyplazmina), unieczynniających plazminę (Brooks 2008, Dallap-Schaer i Epstein 2009, Dąbrowska 2000, Levi i wsp. 1997, 2003, Tapper i Herwald 2000). Zaburzenia procesów fibrynolizy mogą prowadzić zarówno do nadkrzepliwości, jak i krwawień (Brooks 2008, Byars i wsp. 2003, Dolente i Wilkins 2002, Dąbrowska i wsp. 1995, Murray i Fitzgerald 1989, Raszeja-Specht 2008, Sawicka 2000, Wisniewski i wsp. 1991). 1.6. Inhibitory procesu krzepnięcia Przebieg krzepnięcia krwi kontroluje i ogranicza szereg inhibitorów (Ryc. 2). Przy ich pomocy utrzymywana jest płynność krwi. Do najważniejszych inhibitorów należą antytrombina (AT), białko C i S (Couto 1999, Raszeja-Specht 2008). Antytrombina - AT (dawniej antytrombina III – AT III) jest głównym inhibitorem trombiny i czynnika X, a także innych aktywowanych czynników krzepnięcia (Xa, XIIa, XIa, i IXa). 28 Podstawowy mechanizm działania antykoagulacyjnego opiera się na połączeniu AT z heparyną. Interakcja ta prowadzi do zmiany konformacyjnej cząsteczki AT, zwiększając jej powinowactwo do trombiny. Kompleks heparyna - AT inaktywuje wspomniany szereg enzymów krzepnięcia. Aby unieczynnić trombinę, heparyna musi związać się zarówno z enzymem, jak i z AT, natomiast inaktywacja czynnika Xa wymaga jedynie połączenia się heparyny z antytrombiną (Borawski i Myśliwiec 2009, Dąbrowska i Wiśniewski 1996, Hirsh i wsp. 2001, Scott i wsp. 2009). Unieczynnienie trombiny za pomocą AT odbywa się na powierzchni śródbłonka naczyniowego. Szybkość inaktywacji wspomnianych czynników wzrasta pod wpływem heparyny, co stało się podstawą terapii przeciwzakrzepowej (Brooks 2008, Couto 1999, Dallap-Schaer i Epstein 2009, Darien i wsp. 1991, Raszeja-Specht 2008). Obecność AT jest niezbędna do działania heparyny, stąd w stanach jej niedoboru lub zmniejszonej aktywności poniżej 70% może być przyczyną oporności na działanie heparyny i skutkować zwiększonym ryzykiem wystąpienia zakrzepów (Brooks 2008, Dąbrowska 2000). Do drugiego układu inhibitorowego, działającego na zasadzie ujemnego sprzężenia zwrotnego, należy układ białka C z jego kofaktorem – białkiem S. Białko C jest glikoproteiną zależną od witaminy K, która w kompleksie z białkiem S inaktywuje aktywne czynniki Va i VIIIa. Aktywatorem białka C jest trombina wiążąca się z powierzchniowym białkiem nieuszkodzonych komórek śródbłonka – trombomoduliną. Aktywne białko C działa również profibrynolitycznie poprzez inaktywację inhibitorów fibrynolizy. Niedobory białka C, czy też antytrombiny, sprzyjają wystąpieniu powikłań zakrzepowo-zatorowych (Brooks 2008, Dallap-Schaer i Epstein 2009, Dąbrowska 2000, Kittrell i Berkwitt 2012). Jak wcześniej wspomniano, proces zapalny spowodowany np. endotoksemią lub zabiegiem chirurgicznym w przebiegu ostrej postaci morzyska, wpływa na procesy krzepnięcia i fibrynolizy. W celu określenia zaburzeń hemostazy wykonuje się diagnostyczne badania koagulologiczne. 29 1.7. Diagnostyka hemostazy Diagnostyka zaburzeń układu krzepnięcia opiera się w pierwszej kolejności na wynikach badań przesiewowych, stanowiących punkt wyjścia dla dalszej diagnostyki szczegółowej opartej na ukierunkowanym oznaczaniu aktywności czynników osoczowych. (Couto 1999, Dąbrowska 2000, Iwaszko-Simonik i wsp. 2011, 2012b) (Ryc. 3). Wywiad +cechy krwawienia Badania przesiewowe Ocena hemostazy płytkowej Ocena hemostazy osoczowej Liczba płytek Czas okluzji Rozmaz krwi APTT, PT, TT Fibrynogen Badania uzupełniające Ocena hemostazy płytkowej Ocena fibrynolizy Ocena adhezji i agregacji płytek, ocena degranulacji, ocena receptorów powierzchniowych D-dimery Plazminogen Ocena hemostazy osoczowej Czynniki krzepnięcia, Inhibitory Ryc. 3. Schemat badania pacjenta z zaburzeniami hemostazy (wg. Raszeja-Specht 2008, modyfikacja własna). 30 Przesiewowe badania układu hemostazy Dla wstępnego rozpoznania zaburzeń hemostazy stosuje się zakres badań (Brooks 2008, Byars i wsp. 2003, Couto 1999, Dąbrowska 2000, Dallap-Schaer i wsp. 2009a, Dallap-Schaer i Epstein 2009, Iwaszko-Simonik i wsp. 2011, 2012b, Levi i wsp. 2011, Wheeler i Rice 2010, Yilmaz i wsp. 2002), obejmujących określenie: liczby płytek krwi PLT (platelets) wraz z oceną morfologii i funkcji; czasu protrombinowego PT (prothrombin time); czasu trombinowego TT (thrombin time); czasu częściowej tromboplastyny po aktywacji APTT (activated partial thromboplastin time); stężenia fibrynogenu. Ocena morfologii i funkcji płytek krwi W ocenie hemostazy pierwotnej stosuje się szereg badań ilościowych i jakościowych. Niektóre analizatory hematologiczne oprócz określenia liczby płytek pozwalają na wstępną ocenę ich jakości (średnia objętość płytek – MPV (mean platelet volume). Wartość diagnostyczną zwiększa ocena morfologii płytek w rozmazie krwi. Pozwala ona wykluczyć zjawisko małopłytkowości rzekomej wynikającej z formowania się agregatów płytkowych lub opłaszczania przez płytki leukocytów we krwi pobranej na EDTA (Dąbrowska 2000, Dietz i Huskamp 2005, Raszeja-Specht 2008, Szczepiński 2006). Płytki krwi odgrywają kluczową rolę w procesie hemostazy. Zatem niezwykle ważne są badania, za pomocą których można w sposób szybki ocenić czynność płytek. Badania funkcji płytek obejmują najczęściej ocenę ich zdolności do adhezji i agregacji, jako wykładnik formowania pierwotnego czopu płytkowego. Do niedawna w ocenie pierwotnej hemostazy wykorzystywano czas krwawienia po standardowym nacięciu błony śluzowej przedsionka jamy ustnej (BMBT- buccal mucosal bleeding time), tj. czas od rozpoczęcia wypływu krwi po nacięciu błony śluzowej do chwili jego ustania (Dąbrowska 2000, Dietz i Huskamp 2005). Wydłużenie tego czasu wynika z niezdolności płytek do formowania czopu płytkowego, co przy prawidłowej liczbie PLT jest wynikiem zaburzeń funkcji płytek (trombopatii). Pomiar ten jest obarczony dużym błędem wynikającym z różnej głębokość nacięcia, różnic w ukrwieniu tkanek 31 oraz domieszki tromboplastyny tkankowej. Obecnie BMBT zastępowany jest metodami automatycznymi, przesiewowymi badaniami czynności płytek, np. czasem okluzji (CT – ang. closure time) w aparacie PFA-100 (ang. the platelet function analyzer-100), który pozwala na szybką ocenę adhezji i agregacji tych komórek w krwi pełnej cytrynianowej (Michelson 2009, Segura i wsp. 2005). Wiele przeprowadzonych doświadczeń wykazało, iż jest to metoda przydatna w wykrywaniu dysfunkcji płytek nie tylko u ludzi, ale także psów, świń oraz koni (Brooks i wsp. 2009, Callan i Giger 2001, Clancel i wsp. 2009, Wuillemin i wsp. 2002). Czas okluzji jest metodą czułą, ale niespecyficzną, gdyż wpływ na niego ma wiele czynników tj. liczba płytek, hematokryt, leki, zaburzenia funkcjonowania receptorów, czy też reakcji uwalniania (Brooks i wsp. 2009, Harrison 2005a, 2005b). Ocenę aktywności i czynności płytek można również przeprowadzić z wykorzystaniem cytometrii przepływowej. W tej technice stosuje się specyficzne przeciwciała skierowane przeciwko antygenom powierzchniowym (Macey i wsp. 1999, Michelson i wsp. 2000, Ratomski i wsp. 2010). Jak wspomniano wcześniej, w tym celu z powodzeniem wykorzystuje się znakowanie P-selektyny (CD62P) oraz integryny IIb3 - GP IIb/IIIa (CD 41/61). W ocenie żywotności, jak również funkcji płytek wykorzystuje się test pochłaniania czerwieni obojętnej (NR - neutral red). Czerwień obojętna jest kationowym barwnikiem, który łatwo przenika przez błony komórkowe na zasadzie dyfuzji niejonowej i gromadzi się w lizosomach. Na podstawie ilości pochłoniętego barwnika można wnioskować nie tylko o żywotności, ale również o czynności komórek (Antal i wsp. 1995, Ciapetti i wsp. 1996, Iwaszko-Simonik i wsp. 2010b, Repetto i wsp. 2008). Przesiewowe badania hemostazy osoczowej Sprawność układu krzepnięcia może być badana za pomocą czasów krzepnięcia w celu stwierdzenia, która z dróg kaskady krzepnięcia została aktywowana: Czas PT (czas protrombinowy) Pozwala ocenić sprawność zewnątrzpochodnego toru krzepnięcia, uruchamianego przez czynnik tkankowy TF, zwany też tromboplastyną tkankową. Jest szczególnie czuły na niedobory protrombiny, fibrynogenu i czynników V, VII i X 32 a całkowicie niezależny od czynników toru wewnątrzpochodnego. Obecność zwiększonej ilości inhibitorów krzepnięcia (np. heparyny) wpływa na wydłużenie czasu protrombinowego (Brooks 2008, Byars i wsp. 2003, Couto 1999, Dąbrowska 2000, Dallap-Schaer i wsp. 2009a, Dallap-Schaer i Epstein 2009, Levi i wsp. 2011, RaszejaSpecht 2008, Wheeler i Rice 2010, Yilmaz i wsp. 2002). Czas APTT (czas częściowej tromboplastyny po aktywacji) Jest to czas upływający od momentu aktywacji czynników wewnątrzpochodnego układu krzepnięcia do chwili powstania fibryny. Jest szczególnie wrażliwy na niedobory czynników VII, IX, XI, XII, prekalikreiny i wysokocząsteczkowego kininogenu oraz działanie inhibitorów krzepnięcia. Nie zależy od jakościowych i ilościowych zmian płytkowych (Brooks 2008, Byars i wsp. 2003, Couto 1999, Dąbrowska 2000 Dallap-Schaer i wsp. 2009a, Dallap-Schaer i Epstein 2009, Levi i wsp. 2011, Raszeja-Specht 2008, Skotnicki i Sacha 1997, Wheeler i Rice 2010, Yilmaz i wsp. 2002). Czas TT (czas trombinowy) Wskazuje na czas przekształcania fibrynogenu w fibrynę pod wpływem trombiny (tor wspólny). Jest zależny głównie od stężenia i właściwości fibrynogenu, aktywności trombiny, stymulatorów lub inhibitorów procesów polimeryzacji fibryny (Brooks 2008, Byars i wsp. 2003, Couto 1999, Dąbrowska 2000 Dallap-Schaer i wsp. 2009a, Dallap-Schaer i Epstein 2009, Levi i wsp. 2011, Raszeja-Specht 2008, Wheeler i Rice 2010, Winnicka 2003, Yilmaz i wsp. 2002). Fibrynogen (Fb) Rutynowym badaniem ilościowym w kontroli układu krzepnięcia jest oznaczanie stężenia fibrynogenu (czynnika I), który z postaci płynnej pod wpływem enzymu-trombiny, zmienia się w fibrynę stanowiącą konstrukcję skrzepliny. Stężenie fibrynogenu może być oznaczane bezpośrednio metodą chronometryczną Clauss'a lub metodą turbidymetryczną (podczas oznaczania czasu PT) (Brooks 2008, Byars i wsp. 2003, Couto 1999, Dąbrowska 2000, Dallap-Schaer i wsp. 2009a, Dallap-Schaer i Epstein 2009, Levi i wsp. 2011, Raszeja-Specht 2008, Wheeler i Rice 2010, Winnicka 2003, Yilmaz i wsp. 2002). 33 Badania szczegółowe układu hemostazy Ocena aktywności czynników krzepnięcia Obok wymienionych wskaźników hemostazy, odzwierciedlających przebieg poszczególnych etapów krzepnięcia, do dyspozycji lekarza weterynarii są również badania szczegółowe tj. ocena aktywności poszczególnych czynników krzepnięcia, a także aktywatorów i inhibitorów tego procesu (Winnicka 2003). Istotne znaczenie mają oznaczenia aktywności takich inhibitorów krzepnięcia jak antytrombina i białko C, gdyż ich niedobór stanowi zwiększone ryzyko wystąpienia zakrzepicy. Ocena przebiegu fibrynolizy Do oceny aktywności układu fibrynolitycznego służyć może określanie stężenia produktów rozkładu fibrynogenu i fibryny (FDP’s) oraz D-dimerów. U koni największe znaczenie ma oznaczanie stężenia D-dimerów, zwłaszcza w diagnozowaniu zespołu DIC (Cesarini i wsp. 2010, Matyszczak i wsp. 2008, Monreal 2003, Stokol i wsp 2005). 34 2. ZAŁOŻENIA I CELE PRACY Z przedstawionego przeglądu piśmiennictwa wynika, że zmiany ustrojowe w przebiegu ostrych morzysk sprzyjają naruszeniu równowagi pomiędzy procesem krzepnięcia a fibrynolizy. Skutkiem zakłócenia tej równowagi może być nadmierne wykrzepianie krwi z powstawaniem licznych zakrzepów lub też osłabienie krzepliwości, przybierające postać skazy krwotocznej. Zmiany te warunkują nie tylko pogłębienie zaburzeń czynnościowych narządów, ale również mogą stanowić czynnik decydujący o przebiegu i skuteczności leczenia zespołu morzyskowego. Większość badań dotyczących hemostazy u koni wykonywana jest głównie przed zabiegami chirurgicznymi w celu oceny ryzyka krwawień, jak również powikłań zakrzepowo-zatorowych. W okresie pooperacyjnym natomiast kontroluje się skuteczność leczenia, m.in. inhibitorami krzepnięcia (np. heparyną). Opublikowane dotychczas prace dotyczące hemostazy w przebiegu morzysk koncentrowały się głównie na zmianach hemostazy osoczowej oraz towarzyszącemu im zespołowi wewnątrznaczyniowego wykrzepiania - DIC. Nieliczne są badania dotyczące roli i czynności płytek konia w trakcie rozwoju ostrych zaburzeń kolkowych oraz w późniejszym okresie terapii, zwłaszcza po operacyjnym leczeniu niedrożności jelit. Biorąc pod uwagę powyższe, jak również wykorzystując fakt, iż Katedra i Klinika Chirurgii Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu stanowi jeden z kilku ośrodków w kraju, w którym przeprowadza się chirurgiczne leczenie niedrożności jelit u koni, postanowiono prześledzić dynamikę procesów związanych z hemostazą u koni w trakcie rozwoju ostrej postaci morzyska, w zestawieniu ze zmianami zachodzącymi w kolejnych dniach po zabiegu laparotomii. Zaplanowane badania oparto na ocenie wybranych wykładników hemostazy pierwotnej w zestawieniu z wykładnikami hemostazy osoczowej, obejmującej układ krzepnięcia i fibrynolizy. Za wykładniki funkcji płytek przyjęto oprócz parametrów morfologicznych (liczba płytek, średnia objętość płytek) także wskaźniki czynnościowe tj. czas okluzji czy ekspresja wybranych receptorów powierzchniowych. Postanowiono przy tym sprawdzić czy płytki krwi u konia, jako struktury bezpośrednio uczestniczące i kooperujące z komórkami biorącymi udział w odporności nieswoistej, posiadają zdolność pochłaniania (internalizacji) obcych cząsteczek oraz czy zdolność ta zmienia się w przebiegu kolki, co mogłoby posłużyć jako jeden z prostych i tanich testów 35 czynnościowych płytek u konia. W tym celu wykorzystano czerwień obojętną (NR), barwnik od lat stosowany w ocenie żywotności komórek. Ocenę hemostazy osoczowej oparto na testach przesiewowych tj. czasach krzepnięcia PT, APTT i TT, stężeniu fibrynogenu oraz ocenie aktywności wybranych inhibitorów krzepnięcia – antytrombiny i białka C, a także określeniu poziomu produktów fibrynolizy - D-dimerów. Uwzględnienie w badaniach koni leczonych operacyjnie z powodu ostrych niedrożności jelit winno dostarczyć nie tylko informacji dotyczących zmian w hemostazie, ale także ukazać ich dynamikę w trakcie postępującego procesu zdrowienia. Przyjęto bowiem, że tak przeprowadzone doświadczenie posłuży nie tylko lepszemu poznaniu patogenezy zaburzeń morzyskowych u koni, ale może w przyszłości być wykorzystane jako punkt wyjścia dla wypracowania metod diagnostycznych, służących ocenie stanu zdrowia pacjenta przez lekarzy weterynarii, zajmujących się praktyką kliniczną koni. Zaproponowany układ doświadczalny winien przyczynić się do: 1) Wyjaśnienia czy i w jakim stopniu ostre zaburzenia morzyskowe u koni wpływają na funkcje płytek oraz procesy krzepnięcia i fibrynolizy; 2) Przybliżenia dynamiki zaburzeń hemostazy w przebiegu ostrej postaci morzyska oraz w pierwszym okresie po zabiegu laparotomii; 3) Określenia profilu czasowego reaktywności płytek w przebiegu morzyska oraz ich reakcji na uraz operacyjny; 4) Określenia zdolności płytek do internalizacji obcych substancji. 36 3. MATERIAŁ I METODY 3.1. Zwierzęta Badania przeprowadzono w okresie od października 2009 do czerwca 2011 roku. Objęto nimi 50 koni gorącokrwistych podzielonych na dwie grupy: doświadczalną (n = 30) i kontrolną (n = 20). Grupę doświadczalną stanowiły konie hospitalizowane i leczone chirurgicznie z powodu niedrożności jelit w Katedrze i Klinice Chirurgii Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. Konie w okresie hospitalizacji były utrzymywane w boksach Kliniki, karmione mieszanką musli z dodatkiem meszu (siemię lniane) oraz sianem i wyprowadzane na krótkie spacery. Grupa badana obejmowała konie gorącokrwiste w wieku 5-15 lat, różnej płci, rasy polski koń szlachetny półkrwi (n= 23), pełnej krwi angielskiej (n=3), śląskiej (n=2) oraz wielkopolskiej (n=2). Z uwagi na urozmaiconą etiopatogenezę morzysk, a w konsekwencji różny przebieg, w badaniach uwzględniono tylko te konie, które pomyślnie przeszły zabieg chirurgiczny oraz dalszą hospitalizację. W doświadczeniu nie uwzględniono koni poddanych pozorowanej laparotomii. Kierowano się przy tym nie tylko względami technicznymi i finansowymi, ale opinią prezentowaną przez Feige i wsp. (2003a), iż sam zabieg chirurgiczny nie wpływa znacząco na hemostazę. Grupę kontrolną stanowiło 20 koni w wieku 5-15 lat, różnej płci, rasy polski koń szlachetny półkrwi (n=10) oraz śląskiej (n=10), które nie wykazywały żadnych klinicznych objawów chorobowych. Wszystkie konie z tej grupy pochodziły z prywatnej hodowli, gdzie większość czasu przebywały na padokach. Zwierzęta karmiono zgodnie z normami żywienia koni, gdzie podstawę stanowiło siano i owies. Miały one zapewnioną stałą opiekę weterynaryjną, poddawane były regularnej profilaktyce przeciwpasożytniczej (wiosna i lato – Antiverm®, Biowet Drwalew S.A., Polska; jesień i zima – Paramectin®, ScanVet Poland Sp. z o. o., Polska) oraz szczepieniom przeciwko grypie i tężcowi (Equilis Prequenza Te®, Intervet International B.V., Holandia). W przeciągu ostatniego miesiąca przed pobraniem materiału do badań w tej grupie nie przeprowadzano żadnych zabiegów ani też nie stosowano środków terapeutycznych. 37 Badania przeprowadzono po uzyskaniu zgody II Lokalnej Komisji Etycznej do Spraw Doświadczeń na Zwierzętach (Uchwała Nr 72/2009). 3.2. Układ doświadczalny Materiał do badań stanowiła krew pobierana z żyły szyjnej zewnętrznej (vena jugularis externa). Od każdego osobnika jednorazowo pobierano maksymalnie 30 ml krwi. W badaniach pilotowych wykazano, że czterokrotne pobranie 30 ml krwi od konia bez objawów klinicznych w odstępach 24 godzinnych nie wpływa na wartości badanych parametrów. W związku z tym w badaniach własnych postanowiono ograniczyć się do jednokrotnego pobrania krwi od koni z grupy kontrolnej. Od koni z grupy doświadczalnej materiał do badań pobierano w trakcie rutynowych badań przeprowadzanych przez personel medyczny Kliniki, na które właściciel zwierzęcia wyraził pisemną zgodę. Przyjmując, iż pierwsze doby po zabiegu chirurgicznego leczenia niedrożności jelit są decydujące o dalszym postępowaniu terapeutycznym i rokowaniu oraz w celu oceny dynamiki zmian zachodzących w tym okresie, postanowiono od każdego osobnika z grupy doświadczalnej pobrać materiał czterokrotnie. Utworzono w ten sposób następujące grupy doświadczalne: Konie przed zabiegiem operacyjnym – grupa D-0 Konie 24 godziny po zabiegu – grupa D-1 Konie 48 godzon po zabiegu – grupa D-2 Konie 72 godziny po zabiegu – grupa D-3 Zaproponowany układ doświadczalny ilustruje poniższy schemat: 38 W grupie doświadczalnej starano się pobierać krew od każdego osobnika w poszczególnych dniach obserwacji (od D-0 do D-3). Nie zawsze, ze względów technicznych, pobrano krew we wszystkich przedziałach czasowych. Braki w próbobraniu były spowodowane m.in. operacjami w godzinach nocnych lub w dni świąteczne, jak również zbyt małą ilością pobranej krwi, niezbędnej przede wszystkim do rutynowych oznaczeń rekonwalescentów. U wybranej grupy koni wykonano badania cytometryczne. 3.3. Kryteria kwalifikowania koni do zabiegu laparotomii Konie do zabiegu laparotomii kwalifikowano na podstawie wyników badania klinicznego obejmującego badanie układu sercowo-naczyniowego i pokarmowego, w którym uwględniano: - liczbę uderzeń serca oraz jakość tętna, - czas wypełniania naczyń kapilarnych ocenianych poprzez uciśnięcie błony śluzowej w jamie ustnej (CRT – capillary refill time), - ukrwienie błon śluzowych jamy ustnej, - objawy bólowe, nie ustępujące po podaniu niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NSAIDs - nonsteroidal inflammatory drugs), -zaburzenia perystaltyki jelit, jak również przemieszczenie jelit wyczuwalne podczas badania rektalnego, -obecność refluksu żołądkowo-jelitowego po założeniu zgłębnika nosowo- żołądkowego. 3.4. Postępowanie przed-, śród- i pooperacyjne Po przyjęciu do Kliniki u wszystkich koni rutynowo zakładano kateter do żyły szyjnej zewnętrznej, pobierano krew do badań hematologicznych, biochemicznych oraz gazometrycznych. Na podstawie wyników tych badań, jeszcze przed zabiegiem operacyjnym korygowano zaburzenia w gospodarce wodno-elektrolitowej oraz równowadze kwasowo-zasadowej. Po ustabilizowaniu stanu ogólnego, konie poddawano sedacji przy użyciu romifidyny 0,04 - 0,06 mg/kg iv. (Sedivet, Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Ingelheim, Niemcy), butorfanolu 0,03 – 0,05 mg/kg i.v. (Torbugesic Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Ingelheim, Niemcy, ScanVet 39 Poland). Narkozę indukowano podaniem propofolu 0,5mg/kg (Propofol 1% MCT/LCT Fresenius®, Fresenius Kabi Deutschland GmbH, Bad Homburg, Niemcy), ketaminy (1,5 mg/kg i.v.; VetaKetam®, Vet-Agro Sp. z o.o., Lublin, Polska) i diazepamu (0,08 mg/kg i.v; Relanium® Warszawskie Zakłady Farmaceutyczne Polfa S.A., Warszawa, Polska), a następnie podtrzymywano halotanem (Narcotan®, Zentiva N.V.) administrowanym drogą wziewną, a także stałym wlewem propofolu i ketaminy. Optymalne ciśnienie krwi utrzymywano za pomocą ciągłego wlewu dobutaminy (1 – 10 µg/kg, Dobuject®, Bayer Sp. z o. o., Warszawa,Polska), w dawkach zależnych od stopnia hipotensji. Po ustabilizowaniu stanu pacjenta wykonywano zabieg laparotomii, podczas którego przez ranę operacyjną wydobywano poszczególne partie jelit. Podczas eksploracji jamy brzusznej dokonywano odgazowywania jelita ślepego w przypadku jego wzdęcia, przeprowadzano repozycję jelit cienkich i grubych oraz przemasowywania treści jelitowej od początkowego odcinka jelit do jelita ślepego. W przypadku przeładowania okrężnicy masami kałowymi wykonywano enterotomię (przecięcie ściany jelita) w zgięciu miednicznym i usuwano zalegającą treść. W przypadku skrętu jelit cienkich z ich niedokrwieniem i martwicą, przeprowadzano enterektomię (usunięcie części jelita) i zespolenie jelit. W trakcie zabiegu jelita były regularnie płukane 0,9% roztworem soli fizjologicznej, w celu zapobiegnięcia zrostom. W okresie pooperacyjnym prowadzono rutynową terapię, obejmującą podaż niesteroidowych leków przeciwzapalnych - fluniksyny (Finadyne®, Intervet International B.V., Boxmeer, Holandia) w dawce 0,25 mg/kg co 6 godzin przez minimum trzy doby, antybiotyków - penicyliny krystalicznej (22 000 j.m./kg co 6 godz., i.v., Penicillin G Sodium Sandoz, Sandoz GmbH, Kundl, Austria) i gentamycyny (6,6 mg/kg co 24 godz., i.v., Gentamycyna 5% Inj., Biowet Puławy Sp. z o.o., Polska), antykoagulantów – heparyny sodowej w dawce 50 j.m./kg co 8 godz., s.c. (Heparinum WZF, Warszawskie Zakłady Farmaceutyczne Polfa S.A., Warszawa, Polska). U wszystkich koni prowadzono terapię nawadniającą, obejmującą infuzję: roztworu Ringera z mleczanami (10-20 ml/kg/h, i.v., Ringer Lactate®, Baxter Healthcare S.A., Zurich, Szwajcaria), Plasmalyte® (4-8 ml/kg/h, i.v., Baxter Healthcare S.A., Zurich, Szwajcaria), 0,9% roztworu soli fizjologicznej (4-8 ml/kg/h, i.v., Natrium Chloratum 0,9%, Baxter Healthcare S.A., Zurich, Szwajcaria) oraz Duphalyte ® (2 ml/kg/h, i.v., Fort Dodge Animal Health Holland, Weesp, Holland, ScanVet Poland Sp. z o.o.). W razie konieczności (pooperacyjna niedrożność porażenna jelit cienkich, tzw. illeus) 40 podawano lignokainę (Lignocainum Hydrochloricum WZF 2%®, Warszawskie Zakłady Farmaceutyczne Polfa S.A., Warszawa, Polska) we wlewie ciągłym, administrowanym przez 24 h przy pomocy pompy infuzyjnej (bolus 1,3 mg/kg, kontynuacja 0,05 mg/kg/min). Konie były hospitalizowane przez okres 10 - 14 dni po zabiegu, po którym opuszczały klinikę w stanie dobrym (bez nawrotów objawów morzyskowych), co wskazywało na właściwy sposób leczenia i powrót do zdrowia. 3.5. Badania hematologiczne Krew przeznaczoną do badań hematologicznych od zwierząt objętych obserwacjami (n=89) pobierano w ilości 2 ml,do probówek zawierających K3EDTA. Badania wykonywano za pomocą automatycznego analizatora hematologicznego (PE - 6800 vet, Procan Electronics INC, China). W analizie uwzględniono: a) liczbę erytrocytów – RBC, b) hematokryt – Ht, c) zawartość hemoglobiny – Hb, d) liczbę leukocytów – WBC, e) liczbę płytek krwi – PLT, f) średnią objętość płytek – MPV, g) leukogram. W celu wykonania leukogramu sporządzano po dwa rozmazy krwi, które po wybarwieniu według metody May Grünwalda-Giemzy (MGG), analizowano pod mikroskopem (Leitz, Biomed, Niemcy, pow. 1800 x). W rozmazie liczono 200 napotkanych leukocytów, które różnicowano na poszczególne populacje tj. granulocyty obojętnochłonne (neutrofile), limfocyty, monocyty, granulocyty kwasochłonne (eozynofile), granulocyty zasadochłonne (bazofile). Na te tej podstawie ustalano odsetek komórek zaliczanych do: granulocytów: obojętnochłonnych (neutrofile) ze zróżnicowaniem na formy dojrzałe (z jądrem segmentowanym) oraz formy młodociane (mielocyty, metamielocyty i formy pałeczkowate), 41 kwasochłonnych (eozynofile), zasadochłonnych (bazofile), agranulocytów: limfocytów, monocytów. Zestawiając wartości procentowe z ogólną liczbą leukocytów wyliczano bezwględną liczbę poszczególnych komórek. Z wyliczonych wartości bezwzględnych neutrofilów (N) i limfocytów (L) ustalano wskaźnik N/L, czyli stosunek neutrofilów do limfocytów. Dodatkowo w osoczu oznaczano stężenie białka całkowitego TP (total protein) przy użyciu refraktometru (Atago SPR-NE, Atago Co LTD, Japan). 3.6. Badania koagulologiczne Krew do badań koagulologicznych (25 ml) mieszano w stosunku 9:1 z 3,8% roztworem cytrynianu sodu. 3.6.1. Ocena hemostazy pierwotnej-płytkowej Oceny hemostazy pierwotnej – płytkowej wstępnie dokonywano na podstawie: -liczby płytek i ich średniej objętości, -czasu okluzji. Natomiast z uzyskanego osocza bogatopłytkowego (PRP) sporządzano zawiesinę płytek wykorzystywaną dla oceny: - ekspresji P-selektyny (CD62P) - ekspresji integryny IIb3 - GP IIb/IIIa (CD 41/61) - zdolności pochłaniania czerwieni obojętnej. a) Czas okluzji (CT - closure time) Czas okluzji określano za pomocą aparatu PFA-100 (The Platelet Function Analyzer-100, Siemens Healthcare, USA), postępując zgodnie z zaleceniami producenta. Aparat określa czas od rozpoczęcia aspiracji krwi do momentu zatkania kapilary przez tworzący się „czop” płytkowy (tzw. okluzja). Pomiar trwa maksymalnie 42 300 sekund. Badanie było wykonywane w ciągu godziny od pobrania krwi. W tym celu 0,8 ml krwi cytrynianowej umieszczano w przeznaczonej do tego kasetce. Następnie krew jest aspirowana przez kapilarę pokrytą kolagenem oraz odpowiednim agonistą (ADP). Izolacja płytek krwi: W celu uzyskania osocza bogatopłytkowego (PRP), krew pobraną na 3,8% cytrynian sodu odwirowywano przy 150 g przez 10 minut. Tak uzyskane PRP zagęszczano przez wirowanie przy 12 000 g w ciągu 3 minut. Wyizolowane płytki krwi zawieszano w płynie RPMI 1640 (IIiTD PAN we Wrocławiu), a następnie sporządzano zawiesinę o odpowiedniej koncentracji komórek. Wyizolowane płytki sprawdzano pod względem: a) żywotności z użyciem błękitu trypanu, b) obecności innych komórek, ocenianej za pomocą analizatora hematologicznego (PE - 6800 vet, Procan Electronics INC, China) i weryfikacji na sporządzonych rozmazach. b) Fenotypizacja płytek krwi Od każdego badanego osobnika sporządzano po cztery próbki zawiesiny płytek. Każda próbka wynosiła 100 µl i zawierała 1 x 106 komórek. Dwie z tych prób aktywowano dodatkiem trombiny (1U/1ml) (Bio-Ksel System TT®, Bio-Ksel, Grudziądz, Polska). Stężenie trombiny przyjęto za Michelson i wsp. (1999), którzy wykazali, iż przy tej koncentracji następuje maksymalna aktywacja płytek. Po 3 minutowej inkubacji z trombiną w 37 oC, płytki przemywano dwukrotnie medium hodowlanym RPMI 1640 (2ml), a następnie odwirowywano 5 minut przy 1200 g. Po zlaniu nadsączu, odwirowane płytki zawieszano w 100 µl RPMI 1640. Pozostałe próby bez dodatku aktywatora stanowiły kontrolę. Tak przygotowane próbki (jedną stymulowaną i jedną niestymulowaną) poddawano znakowaniu odpowiednimi przeciwciałami. Fenotypizacja płytek krwi została przeprowadzona wg. procedury zalecanej przez producenta (AbD Serotec, Oxford, UK). Zgodnie z informacją podaną przez producenta użyte przeciwciała wykazują reakcję krzyżową z płytkami konia. Poziom ekspresji receptorów powierzchniowych oceniano w ciągu jednej godziny od zakończenia znakowania płytek, dokonując odczytu w cytometrze przepływowym FACS Calibur (Becton Dickinson). Płytki krwi bramkowano w układzie FSC 43 (ang. forward scatter channel), obrazujący ich wielkość oraz SSC (ang. side scatter channel) – granularność. Następnie w obrębie bramki określano intensywność fluorescencji (IF), która była miarą ekspresji antygenów w przeliczeniu na 10 000 płytek. Analizę cytometryczną przeprowadzono przy użyciu programu WinMDI 2.9 (J. Trotter, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA). Badanie ekspresji P-selektyny (CD62P): Próbki zawierające po 100 µl zawiesiny płytek o koncentracji 1 x 106 komórek inkubowano z 10 µl przeciwciała monoklonalnego mysiego przeciw ludzkiemu CD62P skoniugowanym z fikoerytryną (PE) (AbD Serotec, Oxford, UK), przez 30 minut w ciemności w temperaturze 37 oC. Po tym czasie płytki dwukrotnie odpłukiwano płynem RPMI 1640 i zawieszano w objętości 0,5 ml. Kontrolę negatywną stanowiły komórki inkubowane wyłącznie w RPMI 1640 bez dodatku przeciwciał. Badanie ekspresji integryny IIb3 - GP IIb/IIIa (CD 41/61) W celu wykrycia receptora CD 41/61, płytki krwi inkubowano najpierw z 10 µl przeciwciała mysiego przeciw owczemu CD41/61 przez 30 minut. Po tym czasie do próbki dodawano 2ml RPMI 1640 i odwirowywano. Po odpłukaniu, zawiesinę płytek zawieszano w 100 µl RPMI 1640, a następnie znakowano drugim poliklonalnym przeciwciałem kozim przeciw mysiemu IgG1 (10 µl), skoniugowanym z fluoresceiną (FITC) (AbD Serotec, Oxford, UK). Po 30 minutowej inkubacji w 37 oC w ciemności próbki przemywano dwukrotnie płynem RPMI 1640 i zawieszano w objętości 0,5 ml. Kontrolę negatywną (ocena niespecyficznego wiązania przeciwciał z płytkami) stanowiły płytki inkubowane z poliklonalnym przeciwciałem IgG1 – FITC. a) Ocena zdolności pochłaniania czerwieni obojętnej przez płytki krwi Zawiesinę płytek liczącą 4 x 107 komórek zawieszano w 2 ml płynu RPMI 1640, a następnie inkubowano w łaźni wodnej o temperaturze 37 oC z dodatkiem 20 µl roztworu czerwieni obojętnej (1mg/ml PBS bez Ca i Mg) (Neutral Red; Poch S.A., Gliwice, Polska). Postępowano zgodnie z metodą zaproponowaną przez Roland i wsp. (1998), którą zmodyfikowano dla potrzeb własnych. Optymalną gęstość zawiesiny płytek, optymalne stężenie czerwieni obojętnej oraz czas inkubacji ustalono w badaniach pilotowych. 44 Celem określenia dynamiki pochłaniania czerwieni obojętnej przez płytki krwi koni, próbki inkubowano przez okres 15, 30, 45 i 60 minut. Po zakończeniu inkubacji próbki odwirowywano, a nadsącz zlewano. Osad trombocytów poddawano lizie za pomocą roztworu kwaśnego alkoholu (3% HCl w 95% etanolu). Stopień pochłaniania czerwieni obojętnej oznaczano kolorymetrycznie za pomocą spektrofotometru (Epoll-20®, Poll LTD Sp. z o. o., Warszawa, Polska). Ekstynkcję mierzono przy długości fali 533 nm wobec próby ślepej, którą był kwaśny alkohol. Ilość pochłoniętego barwnika w g była wyliczana z krzywej kalibracyjnej (standardowej). 3.6.2. Ocena hemostazy wtórnej – osoczowej Materiał do badań stanowiło osocze pozyskane z krwi cytrynianowej odwirowanej przy 1200 g przez 10 minut w ciągu 30 minut od pobrania. Do czasu wykonywania oznaczeń uzyskane osocze zamrażano i przechowywano w temperaturze –20 oC. Oznaczenia wykonywano za pomocą koagulometru Coag Chrom 3003 firmy BioKsel, przy użyciu reagentów zalecanych przez producenta (Bio-Ksel System). Oceny hemostazy osoczowej dokonywano na podstawie: testów przesiewowych oznaczanych metodą chronometryczną., tj.: czas częściowej tromboplastyny po aktywacji APTT, który jest miarą wewnątrzpochodnego układu krzepnięcia. Dla oznaczenia czasu APTT jako aktywatora używano odczynnika zawierającego koloidalny krzem z syntetycznymi fosfolipidami. czas protrombinowy PT, pozwalający ocenić sprawność zewnątrzpochodnego toru krzepnięcia. Dla oznaczenia czasu PT jako reagent służyła tromboplastyna królicza. czas trombinowy TT, który jest badaniem oceniającym wspólną drogę kaskady krzepnięcia. Dla oznaczenia czasu TT jako reagent stosowano trombinę wołową. stężenie fibrynogenu określano pośrednio na podstawie krzywej PT. Badanie to jest miarą ostatniego etapu wspólnej drogi w kaskadzie krzepnięcia. badań układu antykoagulacyjnego, czyli aktywności inhibitorów krzepnięcia, tj. antytrombiny (AT) i białka C. 45 Aktywność AT w % oznaczano metodą kinetyczną (z krzywej kalibracyjnej) po inkubacji osocza z trombiną w obecności nadmiaru heparyny. Dodanie chromogennego substratu powoduje uwalnianie paranitroaniliny w ilości proporcjonalnej do poziomu antytrombiny. Aktywność białka C w % oznaczano metodą jakościową poprzez dodanie aktywatora – liofilizatu zawierającego jad węża (Agkistrodon c. contortrix). Dodanie syntetycznego substratu chromogennego powoduje uwalnianie paranitroaniliny w ilości proporcjonalnej do poziomu białka C. badań układu fibrynolitycznego - produktów wtórnej fibrynolizy, tj. D-dimerów powstających w wyniku degradacji ustabilizowanej fibryny. Stężenie D-dimerów w g/l oznaczano metoda ilościową, przy użyciu zawiesiny latexu pokrytego przeciwciałami monoklonalnymi. D-dimery zawarte w osoczu łączą się z latexem, powodując zmętnienie próbki proporcjonalne do ich koncentracji. 3.7. Analiza statystyczna Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej za pomocą programu Statistica 9,1 PL (Stat Soft Inc., Tulsa, OK) metodą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) w układzie orto- bądź nieortogonalnym, co wynikało z liczby analizowanych dla każdego parametru prób. W układzie nieortogonalnym istotność różnic oszacowano testem Tukeya dla nierównych liczebności, przy dwóch poziomach istotności: p 0,05 oraz p 0,01. Zdolność pochłaniania czerwieni obojętnej przez płytki krwi oszacowano metodą dwuczynnikowej analizy wariancji uwzględniając podstawowy czynnik doświadczalny (czyli podział koni na grupy doświadczalne) na oraz czas trwania inkubacji. Istotność różnic (przy dwóch poziomach istotności: p 0,05 oraz p 0,01) między grupami doświadczalnymi koni oszacowano testem Tukeya dla nierównych liczebności zaś wpływ czasu inkubacji w obrębie każdej grupy oszacowano testem Duncana. Dla oceny ekspresji receptorów powierzchniowych płytek istotność różnic uzyskanych wyników z jednoczynnikowej analizy wariancji oszacowano testem Tukeya (RIR) przy równych liczebnościach w 46 grupach. Dodatkowo w układzie nieparametrycznym wykorzystując test znaku oszacowano istotność różnic dla wyników otrzymanych w zależności od tego czy płytki były wcześniej pobudzone. Otrzymane wyniki zestawiono w postaci średnich i standardowego odchylenia w tabelach bądź na rycinach (wykresach). Przy średnich dużymi różnymi literami oznaczono różnice wysoko istotne statystycznie przy p 0,01, a małymi różnymi literami przy p 0,05. 47 4. WYNIKI W grupie 30 koni zakwalifikowanych do zabiegu, śródoperacyjnie stwierdzono: skręt okrężnicy dużej u 12 koni, przemieszczenie okrężnicy dużej u 8 koni, zatkanie jelita biodrowego u 3 koni, skręt jelit cienkich u 3 koni, u 2 koni zatkanie jelita ślepego, u jednego konia zatkanie okrężnicy dużej oraz obecność kamieni jelitowych u jednego osobnika. 4.1. Wskaźniki hematologiczne Wyniki badań hematologicznych z przeprowadzonych łącznie 89 oznaczeń, zestawiono w tabeli 1 i 2. Średnia liczba erytrocytów (RBC) odnotowana u koni grupy kontrolnej wynosiła 6,89 T/l. U koni przed zabiegiem (D-0) zanotowano zwiększoną liczbę erytrocytów w porównaniu z końmi pochodzącymi z grupy kontrolnej oraz pozostałymi grupami koni. W okresie pooperacyjnym zaobserwowano nieznaczne obniżenie liczby erytrocytów. Jednakże różnicę statystycznie istotną (p 0,05), w porównaniu do grupy przed zabiegiem (D-0) odnotowano tylko w trzecim dniu po operacji (D-3) (Tab.1). Omawiane zmiany liczby erytrocytów następowały równolegle ze zmianami wartości hematokrytu (Ht). W okresie przed zabiegiem (D-0) zaobserwowano wyraźny wzrost Ht do 0,39 l/l, a następnie stopniowe obniżenie jego wartości w okresie pooperacyjnym. Najniższą wartość Ht odnotowano w drugiej dobie po zabiegu (D-2), a wynik ten różnił się istotnie (p 0,05) z grupą D-0 (Tab.1). U koni grupy doświadczalnej zanotowano sukcesywne obniżenie stężenia hemoglobiny przez cały okres obserwacji. Statystycznie istotną różnicę zaobserwowano między grupą kontrolną, a końmi w drugiej dobie po zabiegu (D-2). Wartości te wynosiły odpowiednio 8,44 mmol/l vs 6,15 mmol/l (Tab.1). Zmianom liczby erytrocytów, wartości hematokrytu oraz hemoglobiny towarzyszyły zmiany stężenia białka całkowitego. Średnia zawartość białka w osoczu koni kontrolnych wynosiła 74,80 g/l. Konie w okresie przed zabiegiem (D-0) wykazywały wyższe stężenie TP (o 5,00 g/l), w porównaniu z grupą kontrolną. 48 W pierwszej dobie po zabiegu (D-1) odnotowano istotne obniżenie się stężenia TP aż o 9,30 g/l względem grupy D-0 (p 0,05). W kolejnych dniach obserwacji poziom białka całkowitego był zbliżony do notowanego w grupie koni kontrolnych (Tab.1). Liczba leukocytów (WBC) u koni grupy kontrolnej wynosiła 8,99 G/l. U koni przed zabiegiem zanotowano nieznacznie zwiększoną liczbę WBC w porównaiu do grupy K. Następnie w okresie pooperacyjnym stwierdzono niewielkie obniżenie ogólnej liczby leukocytów w grupach D-1 i D-2, a w trzeciej dobie powolny wzrost wartości tego parametru do 7,61 G/l. Pomimo zaznaczających się tendencji różnic średnich wartości liczby leukocytów u badanych koni, nie znalazły one potwierdzenia w przeprowadzonej analizie statystycznej (Tab. 2). Wyniki analizy sporządzonych leukogramów wskazują, że w grupie koni kontrolnych dominującą, bo ok. 50 % populację stanowią granulocyty obojętnochłonne (neutrofile) - formy segmentowane. Przy czym nie zaobserwowano obecności we krwi form młodocianych. Drugą równie liczną, bo prawie 45 % populację stanowią limfocyty. U koni doświadczalnych, przy braku różnic w ogólnej liczbie leukocytów w kolejnych dniach obserwacji, odnotowano znaczne przesunięcia we wzajemnych relacjach poszczególnych form leukocytów (Tab. 2). Równocześnie w obrazie krwi obwodowej zauważono obojętnochłonnych pojawienie (neutrofilów) tj. się młodocianych form postaci pałeczkowatych, granulocytów metamielocytów i mielocytów. U koni przed zabiegiem (D-0) nastąpiło wyraźne przesunięcie w proporcji dominujących populacji leukocytów, polegające na zwiększeniu udziału granulocytów obojętnochłonnych (neutrofilów) (83,52%), kosztem prawie trzykrotnego obniżenia odsetka limfocytów (14,77%). Zmianom tym towarzyszyło wyraźne przesunięcie obrazu białokrwinkowego w lewo. Zwiększoną ilość form pałeczkowatych (20,57%) oraz metamielocytów (4,72%) zaobserwowano zwłaszcza w pierwszym dniu po zabiegu (D-1), a wyniki te różniły się istotnie względem grupy kontrolnej (p 0,01). W drugim (D-2) i trzecim dniu (D-3) po operacji nadal utrzymywało się wyraźne zwiększenie odsetka granulocytów obojętnochłonnych (odpowiednio 73,84% i 70,44%) przy równoczesnym spadku odsetka limfocytów (odpowiednio 26,14% i 29,80%). Zaobserwowano przy tym pojawienie się we krwi najmłodszej populacji granulocytów, tj. mielocytów. 49 Parametrem dobrze obrazującym przedstawione zmiany w leukogramie stanowi wyliczony wskaźnik N/L, będący ilorazem liczby granulocytów obojętnochłonnych (neutrofilów) do limfocytów. Wskaźnik ten u koni kontrolnych kształtuje się na poziomie 1,15. Natomiast u koni przed zabiegiem (D-0) wartość tego wskaźnika wzrosła prawie pięciokrotnie. W kolejnych dniach po operacji zanotowano obniżenie wskaźnika N/L, jednakże w porównaniu do koni kontrolnych wartość ta była nadal dwukrotnie wyższa, aż do końca okresu obserwacji (Ryc. 6). 7 6 5 4 N/L 3 2 1 0 D-0 D-1 D-2 grupa doświadczalna D-3 grupa kontrolna Ryc. 6. Wskaźnik N/L u koni leczonych chirurgicznie z powodu niedrożności jelit. Objaśnienia: K – konie kontrolne (n=9); D-0 – konie przed zabiegiem chirurgicznym (n=5); D-1 – konie 24 godziny po zabiegu (n=8); D-2 – konie 48 godzin po zabiegu (n=5); D-3 – konie 72 godziny po zabiegu (n=5); x ± SD. 50 4.2. Wskaźniki hemostazy pierwotnej (płytkowej) 4.2.1. Płytki krwi Przeprowadzona analiza ilościowo-jakościowa podstawowych elementów hemostazy pierwotnej wykazała, że średnia liczba płytek krwi u koni w grupie kontrolnej, przy dużym zróżnicowaniu osobniczym, wynosi 417,36 G/l. U koni z grupy doświadczalnej zaobserwowano sukcesywne obniżanie się liczby płytek krwi przez cały okres obserwacji Istotny statystycznie spadek PLT (p 0,05) w porównaniu z grupą kontrolną odnotowano u koni w 24, 48 oraz 72 godzinie po operacji (Tab. 3, Ryc. 7). 600,00 500,00 400,00 G/l 300,00 200,00 100,00 0,00 D-0 D-1 D-2 grupa doświadczalna D-3 grupa kontrolna Ryc 7. Średnia liczba płytek krwi (PLT) u koni poddanych chirurgicznemu leczeniu niedrożności jelit. Objaśnienia: K – konie kontrolne (n=20); D-0 – konie przed zabiegiem chirurgicznym (n=17); D-1 – konie 24 godziny po zabiegu (n=22); D-2 – konie 48 godzin po zabiegu (n=15); D-3 – konie 72 godziny po zabiegu (n=15); x ± SD. 51 Obniżenie liczby płytek w grupie badanej korelowało ze zmniejszeniem ich objętości (MPV). Średnia objętość płytek u koni grupy kontrolnej wynosiła 9,83 fl, natomiast u koni w grupie doświadczalnej w kolejnych dniach obserwacji uległa znacznemu obniżeniu, a różnice te okazały się wysoko istotne statystycznie (p 0,01) względem grupy kontrolnej (Tab.3, Ryc. 8). 12,00 10,00 8,00 fl 6,00 4,00 2,00 0,00 D-0 D-1 D-2 grupa doświadczalna D-3 grupa kontrolna Ryc. 8. Średnia objętość płytek krwi (MPV) u koni poddanych chirurgicznemu leczeniu niedrożności jelit. Objaśnienia: K – konie kontrolne (n=20); D-0 – konie przed zabiegiem chirurgicznym (n=17); D-1 – konie 24 godziny po zabiegu (n=22); D-2 – konie 48 godzin po zabiegu (n=15); D-3 – konie 72 godziny po zabiegu (n=15); x ± SD. 52 4.2.2. Czas okluzji Czas okluzji, pozwalający ocenić zdolność płytek do adhezji i agregacji, w grupie kontrolnej mieścił się w granicach 81-116 sekund. U koni w okresie przed operacją (D-0) średni CT uległ nieznacznemu skróceniu o 4,93 s, natomiast w okresie pooperacyjnym zaobserwowano wyraźne, ponad dwukrotne jego wydłużenie. Odnotowano wysoko istotne różnice między grupami K i D-0 a D-2 i D-3 (Tab. 3, Ryc. 9). Ponadto zaobserwowano, iż wydłużenie czasu okluzji następowało równocześnie ze zmniejszeniem liczby płytek i ich objętości (MPV) u badanych koni. 400,00 350,00 300,00 250,00 (s) 200,00 150,00 100,00 50,00 0,00 D-0 D-1 D-2 grupa doświadczalna D-3 grupa kontrolna Ryc.9. Średni czas okluzji (CT) u koni poddanych chirurgicznemu leczeniu niedrożności jelit. Objaśnienia: K – konie kontrolne (n=7); D-0 – konie przed zabiegiem chirurgicznym (n=6); D-1 – konie 24 godziny po zabiegu (n=6); D-2 – konie 48 godzin po zabiegu (n=6); D-3 – konie 72 godziny po zabiegu (n=6); x ± SD. 53 4.2.3. Ekspresja P-selektyny (CD62P) oraz Integryny IIb3 – GP IIb/IIIa (CD 41/61) na powierzchni płytek krwi P-selektyna - CD62P Uzyskane wyniki w postaci średniej intensywności fluorescencji (IF) oraz odchylenia standardowego (SD) przedstawiono w tabeli 4a. Zanotowano, że ekspresja P-selektyny na płytkach koni z grupy kontrolnej zarówno aktywowanych, jak i niestymulowanych nie różni się statystycznie między sobą. Natomiast ekspresja tego receptora na aktywowanych płytkach w grupie doświadczalnej była istotnie większa w porównaniu do płytek nieaktywowanych (p 0,01). U koni przed zabiegiem (D-0) oraz w pierwszej dobie po zabiegu (D-1) ekspresja P-selektyny na aktywowanych płytkach była prawie sześciokrotnie wyższa w porównaniu do płytek niestymulowanych, a u koni w drugiej (D-2) i trzeciej dobie (D-3) po zabiegu aż szesnastokrotnie wyższa względem nieaktywowanych (Tab. 4a). Analiza intensywności fluorescencji P-selektyny na aktywowanych płytkach wykazała znaczący wzrost (p 0,01) ekspresji tego receptora u koni w 48 (D-2) i 72 godzinie (D-3) po operacji. Ponadto ekspresja ta była ponad pięciokrotnie większa w porównaniu z wartościami tej molekuły na płytkach pochodzących od koni w okresie przed zabiegiem (D-0) oraz w 24 godziny po zabiegu (D-1) i prawie dziesięciokrotnie większa od ekspresji na płytkach grupy kontrolnej (Ryc. 10). Natomiast ekspresja P-selektyny na płytkach nieaktywowanych u koni w grupie doświadczalnej była wyraźnie zmniejszona (p 0,01) w porównaniu do grupy kontrolnej. Najniższe jej wartości zanotowano w grupie u koni przed zabiegiem (D-0) oraz w pierwszej dobie po operacji (D-1), a wyniki te różniły się istotnie względem grupy kontrolnej oraz D-2 i D-3 (p 0,01). 54 600,00 500,00 400,00 IF 300,00 200,00 100,00 0,00 K D-0 D-1 D-2 D-3 nieaktywowane K D-0 D-1 D-2 D-3 aktywowane Ryc. 10. Ekspresja P-selektyny (CD62P) na powierzchni płytek krwi przed (kolor zielony) i po aktywacji trombiną (kolor pomarańczowy) u koni leczonych chirurgicznie z powodu niedrożności jelit. Objaśnienia: K – konie kontrolne, n=7; D-0 – konie przed zabiegiem chirurgicznym, n=7; D-1 – konie 24 godziny po zabiegu, n=7; D-2 – konie 48 godzin po zabiegu, n=7; D-3 – konie 72 godziny po zabiegu, n=7; IF – intensywność fluorescencji; x ± SD – odchylenie standardowe. 55 Analiza cytometryczna wykazała, iż aktywowane płytki koni, zarówno grupy doświadczalnej, jak i kontrolnej, wykazują zwiększoną wielkość (wskaźnik FSC > 102) i granularność (wskaźnik SSC > 102) w porównaniu do płytek nieaktywowanych. Zmiany tych wskaźników skutkują pojawieniem się charakterystycznego ogona na cytogramie. Natomiast niestymulowana populacja płytek przyjmuje kształt dyskoidalny (sferyczny) na cytogramie (Ryc.11). Ryc.11. Przykładowy obraz analizy cytometrycznej obrazujący zmianę wielkości (FSC forward scatter) oraz granularności (SSC side scatter) wyizolowanych płytek krwi po aktywacji trombiną (0,1 U/106 płytek). Na cytogramie płytki niestymulowane przyjmują kształt dyskoidalny (sferyczny). Aktywacja trombiną skutkuje wzrostem wskaźnika FSC i SSC, co prowadzi do pojawienia się charakterystycznego ogona na cytogramie. Płytki krwi oceniane w przestrzeni dwuwymiarowej przy użyciu cytometru przepływowego, wskaźnik SSC/FSC wyrażony za pomocą skali logarytmicznej. 56 Integryna IIb 3 (GP IIb/IIIa) - CD 41/61 Analogiczna analiza intensywności fluorescencji integryny IIb3 (GP IIb/IIIa), czyli receptora CD 41/61 została przedstawiona w tabeli 4b oraz rycinie 11. Zauważono, że aktywowane płytki krwi, zarówno koni kontrolnych, jak również z grupy badanej, wykazują mniejszą ekspresję receptora CD41/61 w porównaniu z płytkami niestymulowanymi. Intensywność fluorescencji kompleksu CD41/61 na płytkach aktywowanych u koni z grupy kontrolnej oraz koni przed zabiegiem (D-0) była prawie czterdziestokrotnie mniejsza w porównaniu do płytek nieaktywowanych. W 24 godzinie po zabiegu (D-1) zaobserwowano zmniejszoną różnicę w poziomie ekspresji tej integryny pomiędzy płytkami aktywowanymi, a niestymulowanymi (Tab. 4b, Ryc.12). Natomiast w kolejnych dniach obserwacji ponownie zanotowano wysoce istotną różnicę w ekspresji CD41/61 pomiędzy płytkami aktywowanymi, a nieaktywowanymi. W drugiej i trzeciej dobie po zabiegu ekspresja tego kompleksu na płytkach aktywowanych była prawie szesnastokrotnie niższa w porównaniu do niestymulowanych. Analiza ekspresji receptora CD41/61 na płytkach aktywowanych wykazała istotne (p 0,01) zwiększenie intensywności fluorescencji u koni w okresie pooperacyjnym (D-1, D-2, D-3) w porównaniu do koni kontrolnych oraz przed zabiegiem (D-0). Najwyższe wartości zanotowano w pierwszej dobie po operacji (D-1). Porównując intensywność fluorescencji CD41/61 na płytkach nieaktywowanych, stwierdzono, iż tylko w pierwszej dobie po zabiegu (D-1) nastąpiło wysoko istotne zmniejszenie ekspresji tej cząsteczki względem grupy kontrolnej oraz grup D-0, D-2 i D-3. Ponadto istotne zmniejszenie (p 0,05) w intensywności fluorescencji wystąpiło w grupie D-3 w porównaniu do grupy D-0. 57 1800,00 1600,00 1400,00 1200,00 1000,00 IF 800,00 600,00 400,00 200,00 0,00 K D-0 D-1 D-2 D-3 nieaktywowane K D-0 D-1 D-2 D-3 aktywowane Ryc. 12. Ekspresja integryny IIb3 - GP IIb/IIIa (CD 41/61) na powierzchni płytek krwi przed (kolor zielony) i po aktywacji trombiną (kolor pomarańczowy) u koni leczonych chirurgicznie z powodu niedrożności jelit. Objaśnienia: K – konie kontrolne (n=7); D-0 – konie przed zabiegiem chirurgicznym (n=7); D-1 – konie 24 godziny po zabiegu (n=7); D-2 – konie 48 godzin po zabiegu (n=7); D-3 – konie 72 godziny po zabiegu (n=7); IF – intensywność fluorescencji; x ± SD. 58 4.2.4. Pochłanianie czerwieni obojętnej Uzyskane wyniki dotyczące średniej ilości pochłoniętej czerwieni obojętnej (NR) przez płytki krwi zostały zestawione w tabeli 5 i na rycinie 13. Pochłanianie czerwieni obojętnej przez płytki pochodzące od koni z grupy kontrolnej zmieniało się w czasie 60 minutowej inkubacji, a maksimum pochłoniętego barwnika zanotowano w 30 i 45 minucie inkubacji (tab. 5). Po tym czasie zaobserwowano obniżenie ilości pochłaniętej NR. Istotne różnice odnotowano pomiędzy 30 i 45 minutą inkubacji, a 15 i 60 minutą (p 0,05). Podobną jak w grupie kontrolnej tendencję w dynamice pochłaniania czerwieni obojętnej odnotowano u koni przed zabiegiem, a szczyt jej pochłaniania przypadł na 30 minutę inkubacji, po czym nastąpiło stopniowe obniżenie. Różnice te w stosunku do grupy kontrolnej okazały się nieistotne statystycznie. Natomiast w obrębie grupy D-0 potwierdzono istotne zróżnicowanie dla wyników otrzymanych w 15 i 60 minucie w porównaniu do 30 i 45 (p 0,05). Podobnej zależności w pochłanianiu NR nie zaobserwowano w okresie pooperacyjnym, a ilość pochłoniętej czerwieni w ciągu 60 minut utrzymywała się ma podobnym poziomie. W związku z tym, iż wartości pochłoniętej NR nie różniły się statystycznie w poszczególnych przedziałach czasowych, dalszą analizę postanowiono odnieść tylko do 30 i 45 minuty inkubacji, podczas których zanotowano szczyt pochłaniania NR w grupie kontrolnej. Zestawiając ilość pochłoniętej czerwieni obojętnej w szczycie inkubacji, tj. 30 i 45 minucie, odnotowano wyraźne obniżenie pochłaniania NR w całym okresie pooperacyjnym. Najniższe wartości stwierdzono w grupie D-2. W 30 minucie wysoko istotne zróżnicowanie odnotowano między grupą kontrolną a D-2 i D-3 oraz istotne między D-0 a D-2. W 45 minucie wysoko istotne różnice wystąpiły między grupą K a D-2 oraz istotne między K i D-0 a D-1, D-2 i D-3. 59 1,60 1,40 1,20 1,00 NR ug0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 15min 30min 45min 60min czas inkubacji K D-0 D-1 D-2 D-3 Ryc. 13. Średnia ilość (g) pochłoniętej czerwieni obojętnej (NR-neutral red) przez płytki krwi koni poddanych chirurgicznemu leczeniu niedrożności jelit. Objaśnienia: K – konie kontrolne (n=9); D-0 – konie przed zabiegiem chirurgicznym (n=9); D-1 – konie 24 godziny po zabiegu (n=9); D-2 – konie 48 godzin po zabiegu (n=9); D-3 – konie 72 godziny po zabiegu (n=9); x ± SD. 60 4.3. Wskaźniki hemostazy osoczowej 4.3.1 Czasy krzepnięcia Średnie wartości czasów krzepnięcia zostały zamieszczone w tabeli 6. Średni czas protrombinowy (PT) u koni kontrolnych wynosił 12,15 s. Podobne wartości zanotowano u koni przed zabiegiem (D-0). W pierwszej dobie po zabiegu uległ on wydłużeniu o 2,68 s i wynik ten różnił się wysoko istotnie w odniesieniu do kontroli. W kolejnym dniu obserwacji (D-2) mimo nieznacznego skrócenia nadal różnił się istotnie (p 0,05) w stosunku do kontroli. W trzeciej (D-3) dobie po zabiegu odnotowano wartości zbliżone do wyjściowych, występujących w grupach K i D-0 (Ryc. 14). 18,0 17,0 16,0 15,0 (s) 14,0 13,0 12,0 11,0 10,0 D-0 D-1 D-2 grupa doświadczalna D-3 grupa kontrolna Ryc. 14. Średni czas protrombinowy (PT) u koni leczonych chirurgicznie z powodu niedrożności jelit. Objaśnienia: K – konie kontrolne (n=20); D-0 – konie przed zabiegiem chirurgicznym (n=11); D-1 – konie 24 godziny po zabiegu (n=14); D-2 – konie 48 godzin po zabiegu (n=14); D-3 – konie 72 godziny po zabieg (n=12); x ± SD. 61 Średni czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (APTT) u koni kontrolnych wynosił 72,88 s. W grupach koni doświadczalnych odnotowano wyraźne jego wydłużenie (Ryc. 15). Najwyższe wartości czasu APTT zanotowano w 24 (D-1) oraz 48 godzinie po zabiegu (D-2), a różnice w stosunku do grupy kontrolnej zostały potwierdzone statystycznie przy p 0,01, odnotowano również różnice przy p 0,05 między grupą D-0 a D-1 i D-2. W trzeciej dobie po zabiegu odnotowano nieznaczne skrócenie czasu APTT. 200,0 180,0 160,0 140,0 (s) 120,0 100,0 80,0 60,0 40,0 D-0 D-1 grupa doświadczalna D-2 D-3 grupa kontrolna Ryc. 15. Średni czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (APTT) u koni leczonych chirurgicznie z powodu niedrożności jelit. Objaśnienia: K – konie kontrolne (n=20); D-0 – konie przed zabiegiem chirurgicznym (n=11); D-1 – konie 24 godziny po zabiegu (n=14); D-2 – konie 48 godzin po zabiegu (n=14); D-3 – konie 72 godziny po zabiegu (n=12); x ± SD. 62 U wszystkich badanych koni zaobserwowano sukcesywne skracanie się czasu trombinowego (TT) w okresie pooperacyjnym, czyli w grupach D-1, D-2 i D-3, w porównaniu do grupy kontrolnej. Zmiany te jednak okazały się statystycznie nieistotne (Tab. 6). 4.3.2. Fibrynogen Średnie stężenie fibrynogenu w osoczu koni kontrolnych wynosiło 3,61 g/l. U koni grupy doświadczalnej zanotowano stopniowy wzrost stężenia fibrynogenu przez cały okres obserwacji (Tab. 6, Ryc. 16). Najwyższe jego wartości odnotowano w 48 (D-2) i 72 godzinie (D-3) i różniły się one wysoko istotnie (p 0,01) względem grupy kontrolnej. 10 9 8 7 6 g/l 5 4 3 2 1 0 D-0 D-1 D-2 grupa doświadczalna D-3 grupa kontrolna Ryc. 16. Średnie stężenie fibrynogenu (Fb) u koni leczonych chirurgicznie z powodu niedrożności jelit. Objaśnienia: K – konie kontrolne (n=20); D-0 – konie przed zabiegiem chirurgicznym (n=11); D-1 – konie 24 godziny po zabiegu (n=14); D-2 – konie 48 godzin po zabiegu (n=14); D-3 – konie 72 godziny po zabiegu (n=12); x ± SD. 63 4.3.3. Antytrombina Aktywność inhibitora krzepnięcia, jakim jest antytrombina, u koni kontrolnych wynosiła 157,14%. U wszystkich badanych koni zaobserwowano znaczne obniżenie jej aktywności, względem grupy kontrolnej (Tab. 6, Ryc. 17). Najniższą jej wartość odnotowano w 24 godzinie (D-1) po zabiegu i była ona istotnie niższa od aktywności AT w grupie K oraz D-0 (p 0,05), ponadto istotną różnicę stwierdzono pomiędzy grupą K a D-2. W kolejnych dniach po zabiegu aktywność antytrombiny stopniowo wzrastała. 200 180 160 140 % 120 100 80 60 D-0 D-1 D-2 grupa doświadczalna D-3 grupa kontrolna Ryc. 17. Średnia aktywność antytrombiny (AT) u koni leczonych chirurgicznie z powodu niedrożności jelit. Objaśnienia: K – konie kontrolne (n=20); D-0 – konie przed zabiegiem chirurgicznym (n=11); D-1 – konie 24 godziny po zabiegu (n=14); D-2 – konie 48 godzin po zabiegu (n=14); D-3 – konie 72 godziny po zabiegu (n=12); x ± SD. 64 4.3.4. Białko C Podobne jak w przypadku AT zaobserwowano zmiany w aktywności białka C. Średnia aktywność białka C w grupie koni kontrolnych wynosiła 125,29%. W okresie przed zabiegiem (D-0) nastąpiło nieznaczne jej osłabienie, natomiast wyraźny spadek odnotowano w okresie pooperacyjnym. W pierwszej dobie po zabiegu aktywność białka C była niższa o 79,29 %, w drugiej dobie o 57,79 %, a w trzeciej o 61,29 % w odniesieniu do kontroli i różnice te okazały się wysoko istotne statystycznie (Tab. 6, Ryc. 18). 140 120 100 80 % 60 40 20 0 D-0 D-1 D-2 grupa doświadczalna D-3 grupa kontrolna Ryc. 18. Średnia aktywność białka C u koni leczonych chirurgicznie z powodu niedrożności jelit. Objaśnienia: K – konie kontrolne (n=20); D-0 – konie przed zabiegiem chirurgicznym (n=11); D-1 – konie 24 godziny po zabiegu (n=14); D-2 – konie 48 godzin po zabiegu (n=14); D-3 – konie 72 godziny po zabiegu (n=12); x ± SD 65 4.3.5. D-dimery W przeprowadzonym doświadczeniu dla oceny aktywności układu fibrynolitycznego posłużono się określeniem poziomu D-dimerów. Stężenie u koni kontrolnych mieściło się w granicach od 0,00 g/ml do 428,00 g/ml, przyjmując średnią wartość 95,57 g/ml. U wszystkich badanych koni, w porównaniu do grupy kontrolnej, zaobserwowano zwiększone stężenie D-dimerów. Najwyższe wartości ich stężenia odnotowano w okresie przed zabiegiem (D-0) oraz w pierwszej dobie po operacji(D-1). W grupie D-0 średni poziom D-dimerów był ponad 8-krotnie wyższy niż w grupie kontrolnej i różnica ta została potwierdzona statystycznie (p 0,05). Następnie w okresie pooperacyjnym stężenie D-dimerów ulegało sukcesywnemu obniżeniu oraz zmniejszyły się wahania indywidualne, wyrazone odchyleniem standardowym (Tab. 6, Ryc. 19). 1600 1400 1200 1000 ug/ml 800 600 400 200 0 D-0 D-1 grupa doświadczalna D-2 D-3 grupa kontrolna Ryc. 19. Średnie stężenie D-dimerów u koni leczonych chirurgicznie z powodu niedrożności jelit. Objaśnienia: K – konie kontrolne (n=20); D-0 – konie przed zabiegiem chirurgicznym (n=11); D-1 – konie 24 godziny po zabiegu (n=14); D-2 – konie 48 godzin po zabiegu (n=14); D-3 – konie 72 godziny po zabiegu (n=12); x ± SD 66 Tabela 1. Średnie wartości wybranych wskaźników hematologicznych u koni leczonych operacyjnie z powodu niedrożności jelit. Grupa doświadczalna K Parametr (n=20) RBC (T/l) x 6,89 Ht (l/l) SD x ± 1,31 0,36 SD x SD x ± 0,04 8,44 A ± 1,04 74,80 SD ± 2,10 Hb (mmol/l) TP (g/l) D-0 D-1 D-2 D-3 (n=17) (n=22) (n=15) (n=15) 7,85 a ± 1,13 0,39 a ± 0,07 7,92 6,92 5,89 ± 1,32 0,34 ± 2,04 0,29 b ± 0,09 6,15 B ± 1,96 76,0 6,57 b ± 2,46 0,30 ± 1,01 79,80 a ± 6,10 Objaśnienia: K – konie kontrolne; D-0 – konie przed zabiegiem chirurgicznym; D-1 – konie 24 godziny po zabiegu; D-2 – konie 48 godzin po zabiegu; D-3 – konie 72 godziny po zabiegu; n – liczba koni; RBC – liczba erytrocytów; Ht – hematokryt; Hb – hemoglobina; WBC - liczba leukocytów; TP – białko całkowite; x ± SD – odchylenie standardowe; A, B - p 0,01, a,b - p 0,05. 67 ± 0,06 7,02 ± 1,42 70,50 b ± 7,00 ± 8,10 ± 0,12 6,29 ± 2,11 77,4 ± 7,50 Tabela 2. Obraz białokrwinkowy (leukogram) koni poddanych chirurgicznemu leczeniu niedrożności jelit. Wyniki przedstawione w postaci wartości procentowego udziału poszczególnych populacji. Grupa koni WBC (G/L) Granulocyty obojętnochłonne (neutrofile) K D-0 D-1 D-2 D-3 x 8,99 SD 2,28 x 9,48 SD 2,38 x 6,74 SD 3,05 x 6,67 SD 1,88 x 7,61 SD 5,04 Limfocyty % Monocyty % Granulocyty kwasochłonne (eozynofile) % Granulocyty zasadochłonne (bazofile) % 44,55 0,00 4,05 0,94 a Aa Neutrofile razem % Segmentowane % Pałeczkowate % Metamielocyty % Mielocyty % 50,22 50,22 0,00 0,00 0,00 Bb Bc B B 7,27 7,27 0,00 0,00 0,00 7,74 0,00 3,57 0,80 83,52 72,20 7,00 3,12 0,00 14,77 0,70 0,80 0,20 A AC b 4,97 4,08 3,31 1,72 0,00 2,29 0,97 1,78 0,44 72,23 39,62 20,57 4,72 0,00 32,82 0,62 0,25 0,00 A Bb Aa A b B 19,50 13,89 9,66 3,08 0,00 10,34 0,91 0,70 0,00 73,84 63,32 5,52 2,48 2,52 26,14 0,00 0,00 0,00 a C B b b 13,44 8,76 7,06 4,08 4,54 13,48 0,00 0,00 0,00 70,44 58,60 6,60 2,40 1,20 29,80 0,60 0,70 0,30 a b 11,45 7,40 2,30 1,64 3,27 0,89 0,83 0,44 3,98 Aa Ba b b Objaśnienia: K – konie kontrolne; D-0 – konie przed zabiegiem chirurgicznym; D-1 – konie 24 godziny po zabiegu; D-2 – konie 48 godzin po zabiegu; D-3 – konie 72 godziny po zabiegu, x ± SD A, B - p 0,01, a,b - p 0,05. 68 Tabela 3. Wskaźniki hemostazy pierwotnej (płytkowej) u koni leczonych operacyjnie z powodu niedrożności jelit. Grupa doświadczalna K Parametr D-0 D-1 D-2 D-3 (n=20) (n=17) (n=22) (n=15) (n=15) x 417,36 a 341,06 252,91 b 234,67 b 207,44 b SD ± 199,66 ± 184,29 ± 109,28 ± 99,68 (n=20) (n=17) (n=22) (n=15) (n=15) x 9,83 A 7,48 B 7,73 B 7,61 B 7,41 B SD ± 1,57 ± 0,31 ± 0,83 ± 0,42 ± 0,63 (n=7) (n=6) (n=6) (n=6) (n=6) x 96,43 B 91,50 B 215,50 265,67 A 265,67 A SD 12,53 2,74 96,17 84,10 84,10 PLT (G/l) MPV (fl) CT (s) Objaśnienia: K – konie kontrolne; D-0 – konie przed zabiegiem chirurgicznym; D-1 – konie 24 godziny po zabiegu; D-2 – konie 48 godzin po zabiegu; D-3 – konie 72 godziny po zabiegu; n – liczba koni; PLT – liczba płytek krwi; MPV - średnia objętość płytek; CT – czas okluzji; x ± SD – odchylenie standardowe; A, B - p 0,01, a,b - p 0,05. 69 ± 120,52 Tabela 4a. Ekspresja P-selektyny (CD62P) na płytkach przed i po aktywacji trombiną wyrażona w postaci średniej intensywności fluorescencji (IF) u koni leczonych chirurgicznie z powodu niedrożności jelit. Grupa doświadczalna Receptor K CD62P D-0 D-1 D-2 D-3 (n=7) (n=7) (n=7) (n=7) (n=7) 48,27 83,28 97,89 466,00 459,14 B B B A A SD 1,10 13,00 14,59 78,45 66,11 x 37,55 13,50 16,42 28,70 27,92 A B B BC BC 3,54 1,46 3,04 0,77 0,99 x AKT CD62P SD Objaśnienia: K – konie kontrolne; D-0 – konie przed zabiegiem chirurgicznym; D-1 – konie 24 godziny po zabiegu; D-2 – konie 48 godzin po zabiegu; D-3 – konie 72 godziny po zabiegu; AKT – aktywowane trombiną; n – liczba koni; x ± SD – odchylenie standardowe; A, B - p 0,01, a,b - p 0,05. 70 Tabela 4b. Ekspresja integryny GP IIb/IIIa (CD 41/61) na płytkach przed i po aktywacji trombiną wyrażona w postaci średniej intensywności fluorescencji (IF) u koni leczonych chirurgicznie z powodu niedrożności jelit. Grupa doświadczalna Receptor K D-0 D-1 D-2 D-3 (n=7) (n=7) (n=7) (n=7) (n=7) 26,19 27,97 216,41 69,82 65,29 B B A AC AC SD 3,70 2,87 7,67 9,61 7,33 x 1158,02 1289,28 388,83 1188,57 1007,95 A Aa B A Ab 239,31 280,09 12,90 111,67 77,95 x CD41/61 AKT. CD41/61 SD Objaśnienia: K – konie kontrolne; D-0 – konie przed zabiegiem chirurgicznym; D-1 – konie 24 godziny po zabiegu; D-2 – konie 48 godzin po zabiegu; D-3 – konie 72 godziny po zabiegu; AKT – aktywowane trombiną; n – liczba koni; x ± SD – odchylenie standardowe; A, B - p 0,01, a,b - p 0,05. 71 Tabela 5. Średnia ilość czerwieni obojętnej (NR - Neutral Red) w g pochłoniętej przez 4 x 107 płytek krwi u koni leczonych operacyjnie z powodu niedrożności jelit. Czas inkubacji Grupa koni 15 minut 30 minut 45 minut 60 minut x 0,99 1,44 A 1,43 Aa 0,89 SD 0,26 b 0,54 a 0,96 a 0,22 b x 0,99 1,23 a 1,19 a 1,01 SD 0,26 b 0,24 ac 0,13 c 0,12 b x 0,77 0,77 0,84 b 1,01 SD 0,35 0,39 0,55 0,43 x 0,72 0,63 Bb 0,58 Bb 0,70 SD 0,19 0,59 0,32 0,41 x 0,71 0,71 B 0,75 b 0,65 SD 0,21 0,24 0,31 0,24 n=9 K D-0 D-1 D-2 D-3 Objaśnienia: K – konie kontrolne; D-0 – konie przed zabiegiem chirurgicznym; D-1 – konie 24 godziny po zabiegu; D-2 – konie 48 godzin po zabiegu; D-3 – konie 72 godziny po zabiegu; x ± SD – odchylenie standardowe. Istotność różnic zaznaczono dużymi różnymi literami przy p 0,01, a małymi różnymi literami przy p 0,05 oznaczenia przy średniej dla danego parametru odnoszą się do różnic wyliczonych w poszczególnych terminach czasowych, natomiast istotności zaznaczone przy standardowym odchyleniu odnoszą się do wyliczonych wartości w obrębie grupy 72 Tabela 6. Średnie wartości wybranych wskaźników hemostazy osoczowej u koni leczonych operacyjnie z powodu niedrożności jelit. Grupa doświadczalna K Parametr (n=20) PT (s) x D-0 D-1 D-2 D-3 (n=11) (n=14) (n=14) (n=12) 13,00 14,35 a ± 1,83 12,80 12,15 Bb ± 1,43 ± 2,10 14,83 A ± 2,08 72,88 B ± 14,19 26,80 93,00 b ± 16,43 21,44 140,54 Aa ± 49,13 25,62 136,25 Aa ± 38,30 21,49 ± 8,49 3,61 B ± 0,66 157,14 ac ± 13,26 125,29 A ± 12,16 95,57 b ± 171,91 ± 1,94 5,19 ± 6,49 5,21 ± 1,60 153,29 c ± 28,34 95,71 a ± 36,32 789,57 a ± 548,65 ± 1,74 106,20 b ± 26,71 46,00 Bb ± 7,71 742,60 ± 3,14 6,49 A ± 2,10 112,33 bc ± 31,24 67,50 B ± 12,90 432,60 ± 21,58 64,00 B ± 34,82 342,60 ± 488,34 ± 173,79 ± 89,67 ± 0,80 SD APTT (s) x SD x TT (s) SD Fb (g/l) AT (%) Białko C (%) Ddimery (g/ml) x SD x SD x SD x SD 115,56 ± 20,77 20,47 ± 1,61 7,01 A ± 1,08 124,60 Objaśnienia: K – konie kontrolne; PT – czas protrombinowy; D-0 – konie przed zabiegiem chirurgicznym; APTT – czas częściowej tromboplastyny po D-1 – konie 24 godziny po zabiegu; aktywacji; D-2 – konie 48 godzin po zabiegu; TT- czas trombinowy; D-3 – konie 72 godziny po zabiegu; Fb – fibrynogen; n – liczba koni; AT – antytrombina. x ± SD – odchylenie standardowe; A, B - p 0,01, a,b - p 0,05; 73 5. DYSKUSJA Zgodnie z założeniami, celem prezentowanej pracy była próba oceny hemostazy u koni leczonych chirurgicznie z powodu niedrożności jelit. Główną uwagę skupiono więc na analizie stanu i czynności wybranych elementów tego układu. W trakcie prowadzonych badań uwzględniono również fakt, iż w przebiegu ostrych zespołów morzyskowych zmiany hemostazy są zjawiskiem wtórnym w stosunku do rozwijających się zaburzeń hemodynamicznych i czynnościowych przewodu pokarmowego, a także są konsekwencją rozwoju procesu zapalnego (Dallap i wsp. 2003, Dallap-Schaer i Epstein 2009, Levi i wsp. 1997, 2011, Levi i Opal 2006). Rutynowy element diagnostyki weterynaryjnej stanowią podstawowe badania hematologiczne. To na ich podstawie ocenia się ogólny stan organizmu oraz decyduje o dalszym postępowaniu terapeutycznym (Sprayberry 1999). Zgodnie z tym, u koni kontrolnych, jak i doświadczalnych przeprowadzono podstawowe badania hematologiczne. W badaniach własnych u koni doświadczalnych odnotowano jedynie niewielkie wahania liczby krwinek czerwonych, wartości hematokrytu oraz stężenia białka całkowitego. U koni przed zabiegiem zanotowano nieznaczne podwyższenie parametrów hematologicznych tj. RBC, Ht, Hb, co wskazuje na niewielkiego stopnia odwodnienie wynikające z zaburzeń wodno-elektrolitowych. Zmiany te mogą wynikać z przesunięcia wody do przestrzeni pozanaczyniowej, spowodowanego przemieszczeniem jelit uciskających na naczynia krwionośne oraz zaburzoną perfuzją. Natomiast w kolejnych dniach po operacji zaobserwowano powrót do wartości wyjściowych, co można tłumaczyć wpływem prowadzonej w tym okresie intensywnej płynoterapii. Wspomniane zmiany mogą świadczyć o optymalnym i skutecznym postępowaniu terapii pooperacyjnej. Zmiany czynnościowe tj. zaburzenia motoryki przewodu pokarmowego, stwarzają sprzyjające warunki rozwoju ostrego procesu zapalnego (Dallap i wsp. 2003, Dallap-Schaer i Epstein 2009, Levi i wsp. 1997, 2011, Levi i Opal 2006). Jednymi z wielu objawów, jakie towarzyszą procesom zapalnym są zmiany ilości i jakości krążących leukocytów. W klinice człowieka i wielu gatunków zwierząt zmiany obrazu białokrwinkowego stanowią wskaźnik wykorzystywany w diagnostyce procesów zapalnych. W tym kontekście cenne wydaje się być spostrzeżenie poczynione przez Fagliary i wsp. (2008). Autorzy ci analizując m.in. liczbę leukocytów u koni operowanych z powodu morzysk wykazali, że wyraźna leukocytoza występowała jedynie u koni, u których rozwinęła się sepsa, szybko prowadząca do zejścia śmiertelnego. Odnotowane w badaniach własnych tylko niewielkie wahania liczby leukocytów u koni doświadczalnych spostrzeżenia wspomnianych autorów w pełni potwierdzają. Natomiast wyniki badań własnych wykazały, że u koni w przebiegu morzysk ma miejsce wyraźna zmiana udziału poszczególnych form leukocytów. Jeżeli u koni kontrolnych, udział dwóch dominujących populacji tj. granulocytów obojętnochłonnych (neutrofilów) i limfocytów jest zbliżony, to w omawianym doświadczeniu wyraźne zmiany wzajemnych relacji pomiędzy neutrofilami i limfocytami zanotowano u koni w całym okresie obserwacji. Zarówno u koni przed zabiegiem, jak i w całym okresie pooperacyjnym dominującą populację stanowiły neutrofile. Zmianie tej towarzyszyło przesunięcie obrazu białokrwinkowego w lewo, czego wyrazem obojętnochłonnych było pojawienie (neutrofilów) tj. się młodocianych form postaci pałeczkowatych, granulocytów metamielocytów i mielocytów. Można wnosić, iż opisane zmiany w udziale neutrofilów i limfocytów są rezultatem nie tylko rozwijającego się stresu, ale i równocześnie bezpośredniego oddziaływania cytokin, których źródłem jest proces zapalny toczący się w przewodzie pokarmowym (Krumrych i wsp. 1996, Ratomski i wsp. 2009, Seebach i wsp. 1997). Na taką interpretację zmian w leukogramie pozwala również nie tylko wspomniane przesunięcie w obrazie białokrwinkowym w lewo obserwowane u koni przed zabiegiem, ale przede wszystkim utrzymujący się w pierwszych dniach po zabiegu podwyższony odsetek metamielocytów i mielocytów. Skalę omawianych zmian ilustruje wyliczony wskaźnik N/L. Ostra reakcja bólowa towarzysząca kolce oraz nakładający się wpływ procesu zapalnego skutkowały ponad pięciokrotnym wzrostem wartości wskaźnika N/L u koni przed zabiegiem. Postępujący w kolejnych dniach po operacji proces adaptacji wraz z utrzymującym się prawdopodobnie podwyższonym stężeniem cytokin prozapalnych skutkował obniżeniem wskaźnika, który jednak nadal utrzymywał się na wyższym poziomie w porównaniu do grupy kontrolnej. Zachęca to do sprawdzenia w przyszłości, czy opisane zmiany dotyczą tylko zespołów morzyskowych czy są podobnie jak u innych zwierząt wyrazem stresu. W ocenie hemostazy pierwotnej podstawę stanowią badania ilościowe i jakościowe płytek krwi. Badania jakościowe obejmują m.in. ocenę zdolności do adhezji i agregacji płytek oraz ocenę ich aktywności. W tym zakresie, w badaniach 75 własnych wykazano istotne zmiany dotyczące podstawowych elementów hemostazy pierwotnej. Bezwzględna liczba płytek oraz ich objętość u koni w przebiegu niedrożności jelit uległa stopniowemu obniżeniu zarówno w okresie przed- jak i pooperacyjnym. Dane te są zgodne z rezultatami badań innych autorów, w których wykazano, iż trombocytopenia występuje często zarówno u ludzi, jak i koni w przebiegu endotoksemii, podczas której dochodzi do rozwoju zespołu rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego (DIC - disseminated inravascular coagulation) (Akca i wsp. 2002, Dallap i wsp. 2003, Dolente i Wilkins 2002, Levi i Opal 2006, Levi i Schultz 2010, Rice i Wheeler 2009, Yaguchi i wsp. 2004). Okazało się również, że pacjenci po zabiegach chirurgicznych są bardziej predysponowani do wystąpienia trombocytopenii w porównaniu z osobnikami leczonymi zachowawczo (Chang 1996, Dallap i wsp. 2003, Rice i Wheeler 2009, Yaguchi i wsp. 2004). Zdaniem wielu autorów obniżona liczba płytek może wynikać z ich aktywacji (związanej ze wzmożonym procesem generacji trombiny) oraz zużycia w procesie tworzenia zakrzepów, sekwestracji w śledzionie lub wzdłuż powierzchni śródbłonka, niszczeniem, jak również osłabioną produkcją (trombopoezą) w szpiku (Alsaad i wsp. 2009, Kimberley i wsp. 2004, Levi i Opal 2006, Levi i Schultz 2010, Levi i wsp. 2011, Nunez i wsp. 2001, Salat i wsp. 1999). W dostępnym piśmiennictwie poglądy dotyczące wpływu procesu zapalnego na trombopoezę są niekiedy rozbieżne. Zdaniem niektórych autorów cytokiny prozapalne (t.j. czynnik martwicy nowotworów (TNF-α) i interleukiny (IL-1, IL-6) oraz czynniki wzrostu, poprzez stymulację uwalniania trombopoetyny, indukują trombopoezę (Kapsoritakis i wsp. 2001, Pizzulli i wsp. 1998, Śliwińska-Stańczyk 2005). Jednakże badania przeprowadzone przez Francois i wsp. (1997) dowiodły, iż wysoki poziom cytokin prozapalnych uwalnianych w przebiegu ostrego procesu zapalnego wraz ze zwiększonym stężeniem czynnika pobudzającego kolonię makrofagów (M-CSF), aktywują monocyty i makrofagi, inicjując hemofagocytozę. Pobudzone komórki fagocytują nie tylko białe i czerwone komórki krwi, ale także płytki krwi, przyczyniając się do wystąpienia trombocytopenii. Można więc przypuszczać, że obserwowany w badaniach własnych stopniowy spadek liczby płytek u koni doświadczalnych wynika z sukcesywnego zużywania się ich w trakcie tworzenia zakrzepów, bądź też niszczenia przez komórki żerne, jak również upośledzonej odnowy w szpiku. W interpretacji obserwowanej trombocytopenii należy uwzględnić również wpływ heparyny stosowanej u koni leczonych chirurgicznie z powodu ostrych zaburzeń 76 morzyskowych. Obecnie we wszystkich dyscyplinach zabiegowych u ludzi obowiązuje standard profilaktyki przeciwzakrzepowej z zastosowaniem heparyn. Z powodu wysokiego ryzyka wystąpienia aktywacji krzepnięcia u koni poddanych chirurgicznemu leczeniu niedrożności jelit, heparynoterapia jest rekomendowana (Feige i wsp 2003b, Monreal 2008). Stosuje się ją również w profilaktyce ochwatu (laminitis), zrostów w obrębie jamy brzusznej, zakrzepicy żylnej i zapalenia żyły szyjnej zewnętrznej na skutek umieszczonego kateteru (Gerhards i Eberhardt 1988, Monreal i wsp. 1995). Ze względu na wysokie koszty terapii, u koni najczęściej stosuje się heparynę sodową niefrakcjonowaną. Heparyna niefrakcjonowana (unfractionated heparin, UFH) jest glikozaminoglikanem pozyskiwanym z tkanek zwierzęcych (płuca wołu lub błona śluzowa jelit świni). Masa cząsteczkowa preparatów UFH jest niejednorodna i wynosi średnio 15 000 daltonów(Borawski i Myśliwiec 2009, Dąbrowska i Wiśniewski 1996, Hirsh i wsp. 2001). Podstawowy mechanizm działania antykoagulacyjnego opiera się na połączeniu heparyny z antytrombiną (AT). Interakcja ta prowadzi do zmiany konformacyjnej cząsteczki AT, zwiększając jej powinowactwo do trombiny. Kompleks heparyna-AT inaktywuje szereg enzymów krzepnięcia, w tym trombinę oraz czynniki Xa, XIIa, XIa, i IXa. Aby unieczynnić trombinę, heparyna musi związać się zarówno z enzymem, jak i z AT, natomiast inaktywacja czynnika Xa wymaga jedynie połączenia się heparyny z antytrombiną (Borawski i Myśliwiec 2009, Dąbrowska i Wiśniewski 1996, Hirsh i wsp. 2001, Scott i wsp. 2009). Obecność AT jest niezbędna do działania heparyny, stąd w stanach jej niedoboru lub zmniejszonej aktywności poniżej 70% działanie heparyny może być nieskuteczne. Dzieje się tak w przebiegu rozsianego wewnątrznaczyniowego wykrzepiania (Collatos i wsp. 1995b, Dąbrowska i wsp. 1995, Prasse i wsp. 1993). Stosowanie heparyny niefrakcjonowanej (sodowej), wiąże się z ryzykiem wystąpienia różnych powikłań tj. małopłytkowością, obniżeniem stężenia hemoglobiny, spadkiem liczby erytrocytów, ich aglutynacją oraz hemolizą (Feige i wsp. 2003b, Monreal 2008, Monreal i wsp. 1995, Weiss i Rashid 1998). Trombocytopenia indukowana heparyną może być również spowodowana wytwarzanymi przeciwciałami przeciwko kompleksowi czynnika płytkowego 4 (PF-4) oraz heparyny (Hassell 2008, Kowalska i wsp. 2011, Levi i Opal 2006, McGurrin i wsp. 2004, Ortel 2009). Jakkolwiek ten mechanizm brany jest pod uwagę zazwyczaj powyżej 4-7 dnia terapii, można go więc pominąć w tym przypadku. Sugeruje się także, że proces zapalny rozwijający się na skutek niedrożności jelit, wpływając na regulację trombopoezy, przyczynia się nie tylko do osłabionej 77 produkcji płytek, ale również zmniejszenia ich objętości (MPV) (Danese i wsp. 2007, Kapsoritakis i wsp. 2001, Kaushansky 2009, Kralisz 2008). W badaniach własnych wykazano wyraźne obniżenie MPV w całym okresie obserwacji. Wyniki te są zgodne z rezultatami badań przeprowadzonych przez Järemo i Sandberg-Gertzen (1996) oraz Kapsoritakis i wsp. (2001), którzy wykazali zmniejszoną objętość płytek u pacjentów z chorobami zapalnymi jelit. Różni autorzy podkreślają wpływ cytokin prozapalnych na dojrzewanie megakariocytów i trombopoezę, jako że wielkość płytek jest determinowana w momencie ich powstawania (Kapsoritakis i wsp. 2001, Kaushansky 2009, Kralisz i Matowicka-Karna 2008). W badaniach własnych wykazano również, że obniżona liczba płytek u koni doświadczalnych wraz ze zmniejszoną ich średnią objętością (MPV – mean platelet volume) koreluje z wydłużeniem czasu okluzji (CT closure time). Pomiar ten przy użyciu aparatu PFA-100 (the platelet function analyzer-100) pozwala na szybką ocenę adhezji i agregacji płytek w pełnej krwi (Harrison 2005a, 2005b, Michelson 2009, Salat i wsp. 2002, Segura i wsp. 2005). W medycynie ludzkiej analizator PFA-100 umożliwia szybkie, „przyłóżkowe” badanie czynności płytek. Do niedawna w ocenie pierwotnej hemostazy wykorzystywano czas krwawienia po standardowym nacięciu błony śluzowej przedsionka jamy ustnej (BMBT- buccal mucosal bleeding time), tj. czas od rozpoczęcia wypływu krwi po nacięciu błony śluzowej do chwili jego ustania (Dąbrowska 2000, Dietz i Huskamp 2005, Harrison 2005a). Wydłużenie tego czasu wynika z niezdolności płytek do formowania czopu płytkowego, co przy prawidłowej liczbie PLT jest wynikiem zaburzeń funkcji płytek (trombopatii). Pomiar ten jest obarczony dużym błędem wynikającym z różnej głębokości nacięcia, różnic w ukrwieniu tkanek oraz domieszki tromboplastyny tkankowej. Obecnie BMBT zastępowany jest metodami automatycznymi, przesiewowymi badaniami czynności płytek, np. czasem okluzji. Wiele przeprowadzonych doświadczeń wykazało, że czas okluzji jest metodą przydatną w wykrywaniu dysfunkcji płytek nie tylko u ludzi, ale także psów, świń oraz koni (Brooks i wsp. 2009, Callan i Giger 2001, Clancel i wsp. 2009, Iwaszko-Simonik i wsp. 2010a, Iwaszko-Simonik i wsp. 2012c, Wuillemin i wsp. 2002). Badania własne potwierdziły wcześniejsze sugestie innych autorów, iż aparat PFA-100 może być wykorzystywany w praktyce klinicznej koni, jednakże tylko z użyciem ADP jako agonisty. W diagnostyce człowieka użycie dwóch rodzajów agonistów (EPI, spowodowanych ADP) zażyciem służy odróżnieniu kwasu zaburzeń acetylosalicylowego 78 hemostazy od innych pierwotnej zaburzeń funkcjonalnych płytek. W przeciwieństwie do człowieka, epinefryna jest zbyt słabym aktywatorem płytek krwi konia, w związku z czym nie wykazuje efektu agregacyjnego i nie jest przydatna w badaniach u tego gatunku zwierząt (Segura i wsp. 2005). Określenie czasu okluzji jest metodą czułą, ale niespecyficzną, gdyż wpływ na niego ma wiele czynników tj. liczba płytek, hematokryt, leki, zaburzenia funkcjonowania receptorów, czy też sekrecji ziarnistości (Brooks i wsp. 2009, Harrison 2005a, 2005b). W badaniach własnych u koni w okresie pooperacyjnym wykazano wyraźne, ponad dwukrotne wydłużenie czasu okluzji, co wskazuje na upośledzony proces adhezji i agregacji. Jednakże wskazanie dokładnej przyczyny może być trudne. Może to wynikać z obniżonej liczby płytek, a także wpływu leków. Zablokowanie cyklooksygenazy-1 (COX-1) w wyniku stosowanych niesteroidowych leków przeciwzapalnych (fluniksyna, metamizol) skutkuje zmniejszoną syntezą tromboksanu i zahamowaniem degranulacji płytek (De la Cruz i wsp. 2002). Wydłużenie czasu CT w okresie pooperacyjnym może być również spowodowane stosowaną heparyną w tym okresie, zwłaszcza, że w dniu przed zabiegiem czas CT nie uległ zmianie (Hirsh i wsp. 2001). Badania przeprowadzone przez Sobel i wsp. (1991) dowiodły, iż heparyna wiąże się z czynnikiem von Willebranda (vWF) obecnym w osoczu, a nie na ich powierzchni, upośledzając jego wiązanie się z płytkami. Autorzy ci uważają, iż może to pośrednio hamować czynność płytek, jednakże dokładny mechanizm nie jest znany. Natomiast do zupełnie odmiennych wniosków doszli Boldt i wsp. (1997), Zougas i wsp. (1990), którzy wykonywali badania oceniające wpływ heparyny na agregację płytek świń. Wyniki ich badań wskazały, iż inkubacja płytek krwi z heparyną nie wpływa na ich funkcję. Natomiast inkubacja płytek pochodzących od zwierząt przed podaniem heparyny z granulocytami obojętnochłonnymi (nautrofilami) pochodzącymi z krwi zwierząt po podaniu heparyny wpłynęła na osłabienie procesu agregacji. Wspomniani autorzy uważają, iż heparyna nie wpływa bezpośrednio na czynność płytek, ale wpływ ten ma charakter pośredni poprzez czynniki uwalniane z granulocytów. Sugeruje się również, iż stosowane w okresie pooperacyjnym antybiotyki z grupy penicylin mogą osłabiać zdolność płytek do agregacji (Brown i wsp. 1976.) W literaturze można spotkać wiele prób starających się wyjaśnić ten mechanizm. Brown i wsp. (1976) uważają, iż penicyliny wiążą się z powierzchniowymi receptorami płytek dla ADP, co powoduje zaburzenie aktywacji płytek zależnej od wspomnianego agonisty. Badacze ci podają również drugą możliwość upośledzonej agregacji, 79 opierającej się na zredukowanej ilości wewnątrzkomórkowego ADP uwalnianego podczas sekrecji, co jest niewystarczające dla indukcji nieodwracalnej agregacji. Podobnego zdania są Yaguchi i wsp. (2004), z tym, że bardziej prawdopodobną przyczynę upatrują oni w upośledzonym przekazie sygnałów wewnątrzkomórkowych pochodzących z receptorów powierzchniowych. Zgodnie z założeniami w badaniach własnych w celu oceny funkcji płytek oznaczano ekspresję wybranych receptorów powierzchniowych. Dla oceny ich aktywacji oraz zdolności adhezyjnych posłużono się P-selektyną (CD62P), natomiast jako wskaźnik płytkowej agregacji wybrano integrynę IIb3 - GP IIb/IIIa, czyli receptor CD41/61. Ekspresję receptorów oceniano na płytkach nieaktywowanych, jak i aktywowanych trombiną. W badaniach własnych wykazano, iż aktywowane płytki koni kolkowych wykazywały zwiększoną ekspresję receptora GP IIb/IIIa (CD41/61), w porównaniu ze stymulowanymi płytkami koni kontrolnych. Podobne wyniki otrzymano we wcześniej przeprowadzonych badaniach oceniających ekspresję receptorów płytkowych u koni w przebiegu morzysk (Iwaszko-Simonik i wsp. 2010a, 2012c). Wielu autorów sugeruje, że zwiększona ekspresja receptorów GP IIb/IIIa (CD41/61) na płytkach koni sprzyja tworzeniu się agregatów płytkowo-leukocytarnych, które mogą być przyczyną mikrozatorów (Dunkel i wsp. 2009, Jarvis i Evans 1994, Weiss i wsp. 1998a, 1999). Na tej podstawie można przypuszczać, iż płytki pochodzące od koni w przebiegu ostrej niedrożności jelit są pobudzone, mimo wykazanej upośledzonej ich wzajemnej agregacji. Jest to zgodne z wynikami innych badaczy, którzy stwierdzili obniżony proces agregacji u pacjentów w przebiegu endotoksemii i zespołu DIC (Yaguchi i wsp. 2004, Schuerholz i wsp. 2007). Lundahl i wsp. (1996) uważają, iż obniżona zdolność płytek do agregacji, mimo zwiększonej ekspresji receptorów CD41/61, prawdopodobnie wynika ze zmniejszonej zdolności przyłączania fibrinogenu do tego receptora. Interesująca jest również wykazana w badaniach własnych wyraźna różnica w ekspresji receptora CD41/61 między płytkami aktywowanymi, a nie aktywowanymi. Zauważono, iż aktywowane płytki krwi pochodzące zarówno od koni kontrolnych, jak również od koni z grupy doświadczalnej, wykazują mniejszą ekspresję receptora CD41/61 w porównaniu z płytkami niestymulowanymi. Zdaniem Łuksza i Mantur (2009) oraz Schuerholz i wsp. (2007) obniżona ekspresja tego receptora może wynikać z odszczepiania mikrocząsteczek (PMP - platelet-derived microparticles) podczas aktywacji płytek, na których powierzchni znajdują się antygeny CD41/61. 80 Mechanizm generacji mikrocząstek jest złożony i nie do końca poznany. Prawdopodobnie wynika ze zmian zachodzących w komórkach podczas aktywacji, powodujących zaburzenie stabilności błony komórkowej i tworzenie mikrocząsteczek (Mostefal i wsp. 2008, Perez-Pujol i wsp. 2007). Trudny do wyjaśnienia pozostaje odnotowany w pierwszym dniu po zabiegu nagły spadek ekspresji receptora CD41/61 na płytkach nieaktywowanych. Tym bardziej, że w kolejnym dniu obserwacji następuje ponowny jej wzrost. Trudność interpretacyjna jest tym większa, gdyż w dostępnym piśmiennictwie niewiele jest prac dotyczących dynamiki zmian ekspresji receptorów u koni, zwłaszcza w przebiegu zaburzeń morzyskowych. W związku z tym wyniki badań własnych trudno jest skonfrontować z wynikami innych autorów. Z przeprowadzonych badań wynika, że niezależnie od upośledzonej agregacji, zachowana jest ekspresja adhezyjnych molekuł, co oznacza, iż płytki nadal posiadają zdolność do adhezji oraz sekrecji α-ziarnistości (Iwaszko-Simonik i wsp. 2010a, Yaguchi i wsp. 2004, Schuerholz i wsp. 2007). Przykładem molekuły adhezyjnej jest Pselektyna, czyli receptor CD62P, która w płytkach nieaktywnych umiejscowiona jest w α-ziarnistościach, natomiast podczas aktywacji ulega translokacji na ich powierzchnię, a następnie sekrecji do osocza (Kobusiak-Prokopowicz i wsp. 2006, Massaguer i wsp. 2003, Merten i Thiagarajan 2004, Polek i wsp. 2009, Salat i wsp. 1999, Ważna 2006, Xu i wsp. 2007). Wzmożoną ekspresję P-selektyny, a także zwiększone stężenie jej formy rozpuszczalnej w osoczu obserwowano u pacjentów z chorobami układu sercowo-naczyniowego, w zakrzepicach oraz procesach zapalnych (Massaguer i wsp. 2003). Uważa się, iż wzrost ekspresji P-selektyny, jak również jej stężenia w osoczu jest głównym czynnikiem predykcyjnym powikłań zakrzepowo-zatorowych u ludzi (Polek wsp. 2009). Jej udział w procesach zakrzepowych u koni jest słabo poznany (Lalko i wsp. 2003). Z wyników badań własnych wynika, iż ekspresja P-selektyny na powierzchni płytek koni kontrolnych nie różni się pomiędzy płytkami aktywowanymi, a nieaktywowanymi, co wskazuje na konstytutywną (stałą) obecność tej molekuły na powierzchni płytek u tego gatunku. Zupełnie odwrotnie sytuacja przedstawia się u człowieka, którego płytki nieaktywowane nie ekspresjonują P-selektyny (Escolar i White 2000, Salat i wsp. 2002). Zatem stała obecność P-selektyny na niestymulowanych płytkach konia oznacza, iż krążą one w ustroju w stanie pobudzonym, stanowiąc potencjalny czynnik prozakrzepowy. Jest to zgodne ze spostrzeżeniami Jarvis i Evans (1994), Lalko i wsp (2003), Weiss i Evanson (1997), Weiss i wsp. (1998a), którzy podkreślają znaczenie 81 P-selektyny w szczególnej wrażliwości płytek koni na działanie endotoksyn. Dotychczas twierdzono, iż płytki są tylko pośrednio aktywowane przez endotoksyny poprzez działanie mediatorów zapalnych (Brooks i wsp. 2007, Saluk-Juszczak 2007). Obecnie dowiedziono, iż LPS może również bezpośrednio stymulować płytki, łącząc się z obecnym na ich powierzchni receptorem TLR-4 (toll-like receptor) oraz P-selektyną (Bailey i wsp. 2009, Brooks i wsp. 2008, Malhotra i wsp. 1998, Textor 2010). W badaniach własnych wykazano wyraźnie zwiększoną ekspresję P-selektyny na płytkach krwi koni w przebiegu ostrej niedrożności jelit. Znaczący wzrost ekspresji tego receptora zanotowano zwłaszcza w drugiej i trzeciej dobie po operacji. Ekspresja ta była ponad pięciokrotnie większa w porównaniu z wartościami tej molekuły na płytkach pochodzących od koni w okresie przed zabiegiem oraz w pierwszej dobie po zabiegu i prawie dziesięciokrotnie większa w porównaniu do ekspresji P-selektyny na płytkach grupy kontrolnej. Według Brooks i wsp. (2008), Jarvis i Evans (1994) oraz Lalko i wsp. (2003) świadczy to o wzmożonej aktywności płytek, co może stanowić istotny czynnik w patogenezie zmian zakrzepowo-zatorowych. Przedstawione w badaniach własnych zmiany w ekspresji receptorów są zgodne z poglądami innych autorów, którzy uważają, iż stany zapalne jelit przyczyniają się do aktywacji płytek krwi, podczas której dochodzi do translokacji P-selektyny oraz zwiększonej ekspresji integryny IIb3 - GP IIb/IIIa (CD41/61). Może to skutkować zwiększoną skłonnością do formowania agregatów płytkowo- leukocytarnych, które mogą być przyczyną mikrozatorów w naczyniach (Brooks i wsp. 2008, Evans 1992, Jarvis i Evans 1994, Lalko i wsp. 2003, Merten i Thiagarajan 2004, Weiss i Evanson 1997, Weiss i wsp. 1998a, 1998b, 1999). Leukocyty poprzez uwalnianie szeregu aktywnych biologicznie czynników tj. cytokin, enzymów, reaktywnych form tlenu przyczyniają się do uszkodzenia komórek śródbłonka oraz ekspresji powierzchniowego czynnika tkankowego (TF – tissue factor), co indukuje kaskadę krzepnięcia (Merten i Thiagarajan 2004, Polek i wsp. 2009, Salat i wsp. 1999, Sawicka 2000). W badaniach własnych stwierdzono także, iż płytki koni doświadczalnych stymulowane trombiną wykazywały nie tylko zwiększoną ekspresję receptorów powierzchniowych, ale również cechowały się zwiększoną wielkością (wskaźnik FSC > 102) oraz granularnością (wskaźnik SSC > 102). Zmiany te świadczą o pobudzeniu płytek, skutkującym zmianą ich kształtu, translokacją ziarnistości oraz sekrecją, czego markerem jest P-selektyna (Macey i wsp. 1999, Schmitt-Sody i wsp. 82 2007, Segura i wsp. 2006). Wyniki te przeczą sugestiom innych autorów, którzy wskazywali, iż tylko płytki olbrzymie są aktywne (Khandekar i wsp. 2006, Martin i wsp. 1991, Pizzulli i wsp. 1998). Natomiast badania własne dowodzą, iż płytki o mniejszej objętości są równie aktywne, jak płytki o większym MPV. W omawianym doświadczeniu podjęto także próbę oceny zdolności płytek do pochłaniania czy też internalizacji czerwieni obojętnej (NR – neutral red) w warunkach in vitro. Uważa się, iż podstawowa rola płytek u zwierząt wyższych sprowadza się do udziału w hemostazie oraz procesach zapalnych. Mniej uwagi poświęca się na ich udział w procesach odpornościowych, jak ma to miejsce u zwierząt niższych, u których trombocyty, jako komórki fagocytujące spełniają integralną rolę w odporności nieswoistej (Stosik i Deptuła 1998, Stosik 1995, Stosik i wsp. 2002, Roland i Birrenkott 1998). W dostępnym piśmiennictwie można napotkać szereg prac wskazujących, że zdolność pochłaniania różnych cząstek nieorganicznych, bakterii, wirusów lub grzybów posiadają również płytki zwierząt wyższych oraz człowieka (Boukour i Cramer 2005, Escolar i wsp. 1989, Iwaszko-Simonik i wsp. 2010b, Kamocki i wsp. 2005, Male i wsp. 1992, Matowicka-Karna i Kemona 2002, Saluk-Juszczak 2007, White 2005, Yeaman 1997, 2010, Youssefian i wsp. 2002). Z badań przeprowadzonych przez Antal i wsp. (1995), Ciapetti i wsp. (1996), Repetto i wsp. (2008), Roland i Birrenkott (1998) można wnioskować, iż na podstawie ilości pochłoniętej czerwieni obojętnej można ocenić czynność płytek. Proces ten jest często porównywany do fagocytozy przeprowadzanej przez granulocyty obojętnochłonne (neutrofile), monocyty i makrofagi (Antal i wsp. 1995, Boukour i Cramer 2005). W warunkach omawianego doświadczenia okazało się, że odmiennie niż to wykazali Antal i wsp. 1995 w testach aktywności fagocytarnej neutrofilów i monocytów człowieka, ilość pochłanianej NR przez płytki pochodzące od koni kontrolnych oraz przed zabiegiem zmienia się w czasie inkubacji. Natomiast ilość NR pochłoniętej przez płytki koni w okresie pooperacyjnym pozostaje na jednakowym, choć obniżonym poziomie. Wyjaśnienie mechanizmów odpowiedzialnych za wspomniane różnice w dynamice pochłaniania NR przez płytki konia i leukocyty jest trudne, tym bardziej, że trwają dyskusje czy proces internalizacji przez płytki bakterii, wirusów, grzybów czy też cząstek nieorganicznych jest procesem aktywnym, zbliżonym do fagocytozy, czy tylko biernym efektem sekwestracji obcych cząsteczek (Antal i wsp. 1995, Boukour i Cramer 2005, Escolar i wsp. 1989, Male i wsp. 1992, White 1972, 2005, 2006a, White i 83 Escolar 1991, Yeaman 2010, Youssefian i wsp. 2002). Według spostrzeżeń White (2005), pochłanianie cząsteczek przez płytki zachodzi pasywnie poprzez system kanałów otwartych (OCS - open canalicular system), w związku z tym nie są one komórkami fagocytującymi. Odmiennego zdania są Boukour i Cramer (2005), którzy opierając się na wynikach badań własnych, uważają, iż jest to proces czynny. Jakkolwiek w procesie fagocytozy wyróżnia się etapy adherencji, wchłaniania i tworzenia wakuol oraz trawienia i zabijania za pomocą enzymów lizosomalnych, to jak dotąd udowodniono zdolność płytek do tworzenia filopodiów wokół cząsteczek oraz ich pochłanianie. Natomiast zdolność płytek do trawienia i zabijania obcych cząsteczek jest obecnie badana. Według wstępnych doniesień, pochłonięte cząsteczki zamykane są w wakuolach, z którymi następnie łączą się ziarnistości płytek, sekrecjonując swoją zawartość do ich wnętrza (Boukour i Cramer 2005). White (2005) oraz Yeaman (1997) wskazują na zdolność płytek do uwalniania reaktywnych form tlenu oraz enzymów lizosomalnych, co przyczynia się do uszkodzenia i zabicia pochłoniętych patogenów. Wskazuje to na aktywny charakter procesu, zwłaszcza, że płytki konia nie posiadają systemu kanałów otwartych (Brunso i wsp. 2010, Gader i wsp. 2008, Segura i wsp. 2006). Sekrecja ich ziarnistości zachodzi po uprzedniej fuzji błon sąsiadujących granuli, prowadzącej do ich połączenia i powstania charakterystycznych „łańcuszków”. Natomiast sekrecja ziarnistości w płytkach ludzkich zależy w głównej mierze od wewnętrznej reorganizacji cytoszkieletu płytek, skutkującej centralizacją ziarnistości, co nie jest obserwowane w płytkach koni (Brunso i wsp. 2010, Gader i wsp. 2008, Segura i wsp. 2006). Być może te strukturalne i biochemiczne różnice między płytkami ludzkimi i końskimi są odpowiedzialne za zmienne pochłanianie NR, które może opierać się na innych mechanizmach. Sugestie te wymagają sprawdzenia w warunkach doświadczalnych z użyciem aktywatorów oraz inhibitorów płytek. Trudna w interpretacji jest zbliżona ilość pochłoniętej NR przez płytki koni kontrolnych oraz koni przed zabiegiem, jak również obniżona, ale niezmienna przez cały okres 60 minutowej inkubacji ilość pochłoniętej NR przez płytki koni w całym okresie pooperacyjnym. Wskazuje to, iż w przebiegu ostrej niedrożności jelit, przynajmniej w początkowym okresie rozwoju, zdolność pochłaniania nie ulega większym zmianom. Natomiast w kolejnych dniach po zabiegu zdolność pochłaniania wyraźnie słabnie, za czym przemawia odnotowana w tym okresie osłabiona internalizacja NR. Zdaniem Male i wsp. (1992) oraz White (2005), przestrzeń dostępna dla gromadzenia pochłoniętych cząstek jest w płytkach ograniczona. Z racji tego, 84 obniżona ilość pochłoniętej NR w płytkach koni w okresie pooperacyjnym może być spowodowana ich zmniejszoną objętością (MPV). Omawiane zmiany mogą stanowić wypadkową interakcji płytek z innymi nieokreślonymi czynnikami, których źródłem jest proces zapalny lub stosowana terapia. Według danych z piśmiennictwa, pochłanianie cząstek przez płytki uzależnione jest od połączenia się tych substancji z receptorem GP IIb/IIIa, (CD41/61, inaczej integryną IIb3) (White 2005, Yeaman 1997). Biorąc pod uwagę sugestie Brown i wsp. (1976), Lundahl i wsp. (1996) oraz Yaguchi i wsp. (2004) o wpływie leków na upośledzenie przekaźnictwa sygnałów wewnątrzkomórkowych pochodzących z receptorów powierzchniowych płytek, można przypuszczać, że mechanizm ten może również wpływać na inne funkcje płytek, w tym pochłanianie. Yaguchi i wsp. (2004) w swojej pracy wykazali także wzmożoną sekrecję czynników wzrostowych z płytek u pacjentów w przebiegu sepsy. Płytkowopochodne czynniki wzrostu odgrywają istotną rolę w procesie gojenia. Na tej podstawie cytowani autorzy sugerują zmianę funkcji płytek z hemostatycznej na przeważający ich udział w procesie gojenia. Wyniki badań własnych wydają się potwierdzać tę sugestię. W omawianym doświadczeniu wykazano zwiększający się potencjal adherencyjny płytek, wyrażony zwiekszoną ekspresją P-selektyny, w drugim i trzecim dniu po operacji, a więc w okresie, w którym towarzyszyło osłabienie pochłaniania czerwieni obojętnej przez płytki. W praktyce klinicznej diagnostyka hemostazy osoczowej opiera się w pierwszej kolejności na przesiewowych testach koagulologicznych tj. czasy krzepnięcia oraz stężenie fibrynogenu (Byars i wsp. 2003, Iwaszko-Simonik i wsp. 2011). Badanie czasów krzepnięcia pozwala w przybliżeniu określić, który ze szlaków kaskady krzepnięcia został aktywowany (Zbanyszek i wsp. 2004). Wyniki badań własnych dotyczące odnotowanych wartości parametrów hemostazy osoczowej tj. czasów krzepnięcia i stężenia fibrynogenu u koni kontrolnych są zgodne z rezultatami badań innych autorów (Brooks 2008, Dąbrowska i wsp. 1997). Równocześnie w omawianym układzie doświadczalnym, u wszystkich badanych koni w okresie przed i pooperacyjnym stwierdzono wydłużenie czasu protrombinowego (PT – prothrombin time) i czasu częściowej tromboplastyny po aktywacji (APTT - activated partial thromboplastin time). Najwyższe wartości zanotowano głównie w pierwszej dobie po operacji. Zanotowane zmiany w obrębie czasów krzepnięcia PT i APTT są zgodne z moimi wcześniejszymi wynikami badań, jak również obserwacjami innych autorów, którzy przeprowadzili badania układu 85 hemostazy u koni w przebiegu ostrych morzysk (Allen i Kold 1988, Dallap i wsp. 2003, Dolente i wsp. 2002, Feige i wsp. 2003a, 2003b, Iwaszko-Simonik i wsp. 2012b, Johnstone i Crane 1986, Prasse i wsp. 1993, Topper i Prasse 1998, Zbanyszek i wsp. 2004). Zdaniem cytowanych autorów wydłużenie czasów krzepnięcia prawdopodobnie może wynikać ze zużycia czynników krzepnięcia w procesie formowania zakrzepów, upośledzonej ich produkcji w wątrobie lub degradacji przez enzym proteolityczny plazminę. Według opinii Collatos i wsp. (1995b), Wheeler i Rice (2010) wydłużenie czasu PT, będącego wykładnikiem sprawności zewnątrzpochodnego toru krzepnięcia, wskazuje prawdopodobnie na obniżoną aktywność czynnika VII. Czynnik ten w połączeniu z czynnikiem tkankowym – TF (ang. tissue factor) aktywuje czynnik X, będącym połączeniem wewnątrz- i zewnątrzpochodnego toru układu krzepnięcia w tor wspólny (Dallap-Schaer i Epstein 2009, Levi i wsp. 2003, Raszeja-Specht 2008). Natomiast wydłużenie czasu APTT, oceniającego wewnątrzpochodną drogę krzepnięcia może wynikać zarówno ze zużycia czynników XII, XI, IX i VIII, jak i zahamowania ich aktywności przez stosowaną heparynę (Chojnowski i wsp. 2010, Collatos i wsp. 1995b, Wheeler i Rice 2010). Podstawowym warunkiem bezpiecznie przeprowadzonego zabiegu chirurgicznego leczenia kolki oraz okresu hospitalizacji jest uzyskanie optymalnego poziomu heparynizacji krwi operowanego pacjenta. Powszechnie stosowanym wskaźnikiem dla ustalania prawidłowej dawki heparyny jest czas APTT. Zdaniem Gerhards i Eberhardt (1988), Gerhards (1991) oraz Monreal i wsp. (1995), dobrze dobrana dawka wydłuża czas APTT 1,5-2 razy, a nieprawidłowe wartości tych testów pojawiają się dopiero w przypadku istnienia znacznych zaburzeń w hemostazie. W związku z tym, niewielkie dawki heparyny niefrakcjonowanej, stosowanej w ramach profilaktyki powikłań zakrzepowych u badanych koni w okresie okołooperacyjnym, nie spowodowały zmian większych niż przyjęte w wyżej wymienionych testach koagulologicznych. Można więc przypuszczać, iż wspomniana terapia przeciwzakrzepowa nie wpłynęła na zmiany pozostałych wskaźników. W badaniach własnych zanotowano skrócenie czasu trombinowego (TT – thrombin time) u badanych koni, które korelowało ze wzrostem stężenia fibrynogenu. Może to wskazywać na wzmożone tworzenie się fibryny z fibrynogenu pod wpływem trombiny, co sprzyja odkładaniu się złogów fibryny w naczyniach krwionośnych. Fibrynogen jest białkiem syntetyzowanym w wątrobie oraz w mniejszej ilości w megakariocytach. Jego wzmożona synteza odbywa się głównie w czasie trwania 86 reakcji zapalnych. Procesowi zapalnemu towarzyszy odpowiedź ogólnoustrojowa określana mianem odpowiedzi ostrej fazy. W jej przebiegu dochodzi do zmian stężeń szeregu białek osocza, nazywanych białkami ostrej fazy, w tym fibrynogenu (Crisman i wsp. 2008, Kostro i wsp. 1996, Sorensen i wsp. 2012, WłodarczykSzydłowska i wsp. 2000). Wzrost stężenia fibrynogenu był wielokrotnie notowany w przebiegu ostrych zaburzeń morzyskowych u koni, zwłaszcza leczonych operacyjnie z ich powodu (Allen i Kold 1988, Dallap i wsp. 2003, Dolente i wsp. 2002, Feige i wsp. 2003a, Johnstone i Crane 1986, Prasse i wsp. 1993, Topper i Prasse 1998, Zbanyszek i wsp. 2004). Znalazło to potwierdzenie w wynikach badań własnych, które wykazały stopniowe zwiększanie się stężenia fibrynogenu w całym okresie obserwacji. Towarzyszyły temu zmiany w udziale poszczególnych form leukocytów oraz przesuniecie obrazu białokrwinkowego w lewo. W związku z tym wzrost stężenia fibrynogenu u koni leczonych operacyjnie z powodu niedrożności jelit jest prawdopodobnie spowodowany reakcją ostrej fazy, na rozwijający się proces zapalny w przebiegu zaburzeń morzyskowych, jak również w odpowiedzi na zabieg chirurgiczny. Przy rozpatrywaniu wzrostu fibrynogenu u koni, należy uwzględnić ich gatunkową zdolność do syntezy dużej ilości tego białka, przekraczającej jego zużycie (Allen i Kold 1988, Dąbrowska i wsp. 1995, Johnstone i Crane 1986, Prasse i wsp. 1993, Przewoźny 2004, Wiśniewski i wsp. 1991). Zdaniem Wersch i wsp. (1990) oraz Zbanyszek i wsp. (2004) wzrost stężenia tego białka w osoczu powoduje zwiększoną lepkość krwi, utrudniającą jej przepływ w naczyniach krwionośnych, co stanowi podwyższone ryzyko powikłań zakrzepowo-zatorowych. W celu oceny hemostazy, oprócz badań układu krzepnięcia obejmujących czasy krzepnięcia i stężenie fibrynogenu, powinno wykonywać się także oznaczenia aktywności inhibitorów krzepnięcia tj. antytrombiny i białka C oraz produktów fibrynolizy - D-dimerów. W badaniach własnych wykazano wyraźne obniżenie aktywności inhibitorów krzepnięcia, tj. antytrombiny (AT) i białka C, obserwowane zwłaszcza w pierwszej dobie po zabiegu. W zwiazku z tym, iż heparynoterapia nie wpływa na parametry koagulologiczne z wyjątkiem czasu APTT, stopniowe zwiększanie się aktywności inhibitorów krzepnięcia w okresie pooperacyjnym wskazuje na przywrócenie równowagi w układzie hemostazy. Zmiany te są zgodne z doniesieniami innym autorów, którzy wykazali normalizację tych parametrów w ciągu 6 dni po operacji (Feige i wsp. 2003a, 2003b, Prasse i wsp. 1993). Dla wyjaśnienia przyczyn opisanych 87 zmian, Feige i wsp. 2003a przeprowadzili badania porównawcze na koniach operowanych z powodu zaburzeń kolkowych oraz na koniach bez objawów klinicznych morzyska, którym wykonano kontrolną laparotomię. Wyniki tych badań wykazały, iż spadek aktywności AT nastąpił tylko u koni operowanych z powodu morzyska. Oznacza to, iż zaburzenia hemodynamiczne w połączeniu z procesem zapalnym jelit odpowiadają za obniżenie aktywności AT, a nie sam zabieg chirurgiczny. Prawdopodobną przyczynę redukcji aktywności inhibitorów krzepnięcia upatruje się w ich zużyciu w wyniku wzmożonej generacji trombiny, upośledzonej syntezie, a także w wyniku enzymatycznej degradacji przez elastazę uwalnianą z aktywowanych neutrofilów (Dallap Schaer i wsp. 2009a, Levi i wsp.2011). W związku z tym, że antytrombina jest głównym inhibitorem trombiny oraz czynnika X, IX, XI, XII, jej niedobór może prowadzić do wzrostu aktywności trombiny i dalszego formowania się zakrzepów w naczyniach, powodując niedokrwienie otaczających tkanek. Natomiast białko C, oprócz inaktywacji aktywnych czynników Va i VIIIa, działa również profibrynolitycznie poprzez inaktywację inhibitorów fibrynolizy. W związku z tym, zmniejszenie aktywności antytrombiny i białka C może skutkować zwiększonym ryzykiem zakrzepicy, a także opornością na działanie heparyny (Brooks 2008, Dallap-Schaer i Epstein 2009, Dąbrowska 2000, Prasse i wsp. 1993, Yoshida i Granger 2009). Aktywacja procesów fibrynolitycznych przejawia się zwiększonym stężeniem D-dimerów, które są najmniejszymi produktami degradacji ustabilizowanej fibryny przez plazminę (Byars i wsp. 2003, Danese i wsp. 2007, Feige i wsp. 2003a, Matyszczak i wsp. 2008, Stokol i wsp 2005, Wersch i wsp. 1990, Zbanyszek i wsp. 2004). W badaniach własnych zanotowano znaczący wzrost stężenia D-dimerów u koni, zwłaszcza w okresie przed zabiegiem oraz w pierwszej dobie po operacji. W kolejnych dniach zaobserwowano sukcesywny ich spadek oraz zmniejszone wahania indywidualne (mniejsze odchylenie standardowe), co wydaję się wskazywać na stopniowe przywracanie równowagi pomiędzy układem krzepnięcia i fibrynolizy. Wyniki badań własnych są zgodne z rezultatami badań przeprowadzonych przez Dallap i wsp. (2003), Feige i wsp. (2003a) oraz Prase i wsp. (1993). Obniżenie poziomu D-dimerów może wynikać ze zwiększającej się aktywności AT i białka C w tym okresie, które hamują powstawanie fibryny, jak również ze zwiększającej się aktywności inhibitora aktywatora plazminogenu-1 - PAI-1 (ang. plasminogen activator inhibitor-1). Badania przeprowadzone przez Collatos i wsp. (1995a) wykazały 88 stopniowy wzrost aktywności PAI-1 u koni po operacyjnym leczeniu W związku z tym, że obecność D-dimerów świadczy o wtórnej aktywacji fibrynolizy, poprzedzonej aktywacją krzepnięcia i generacją fibryny, uznawane są one za marker powikłań zakrzepowo-zatorowych (Dąbrowska 2000, Sawicka 2000, Yilmaz i wsp. 2002). Wiele badań oceniających przydatność markerów koagulacji i fibrynolizy do diagnozowania zaburzeń zakrzepowych, jak również zespołu wewnątrznaczyniowego wykrzepiania (DIC – disseminated inravascular coagulation), potwierdziło, że oznaczanie koncentracji D-dimeru w surowicy jest bardzo czułym i specyficznym wskaźnikiem tych chorób (Byars i wsp. 2003, Cesarini i wsp. 2010, Matyszczak 2009, Monreal 2003, Stokol i wsp 2005). W 2001 roku opublikowano wytyczne dotyczące klinicznych i laboratoryjnych kryteriów diagnozowania zespołu wewnątrznaczyniowego wykrzepiania u ludzi, opracowane przez International Society on Thrombosis and Haemostasis (ISTH). Uwzględniają one zmiany następujących parametrów: 1) obniżenie liczby płytek, 2) wydłużenie czasu krzepnięcia PT, 3) wydłużenie czasu krzepnięcia APTT, 4) obniżenie aktywności antytrombiny, 5) obniżenie stężenia fibrynogenu, 6) wzrost stężenia D-dimerów. Diagnostyka zespołu DIC u zwierząt, w tym koni, również opiera się na tych samych kryteriach (Brooks 2008, Dolente i wsp. 2002, Monreal i Cesarini 2009, Thomason i wsp. 2006b). Zdaniem Byars i wsp. (2003) oraz Dallap-Schaer i Epstein (2009) zmiany co najmniej 3 z 6 wymienionych parametrów świadczą o występowaniu zespołu DIC. W badaniach przeprowadzonych w tej pracy u koni doświadczalnych odnotowano: a) obniżenie liczby płytek, b) wydłużenie czasu krzepnięcia PT, c) wydłużenie czasu krzepnięcia APTT, d) wyraźne obniżenie aktywności inhibitorów krzepnięcia tj. antytrombiny i białka C, e) wzrost stężenia D-dimerów. W związku z tym można stwierdzić, iż u wszystkich koni doświadczalnych mimo braku wyraźnych objawów klinicznych, w przebiegu ostrej niedrożności jelit wymagającej interwencji chirurgicznej rozwinął się subkliniczny DIC. Według obserwacji Cesarini 89 i wsp. (2010), Dallap i wsp. (2003), Dolente i Wilkins (2002), Monreal i Cesarini (2009), Stokol i wsp. (2005), chorobom układu pokarmowego wymagającym interwencji chirurgicznej często towarzyszy zespół DIC. Szacuje się, że zespół rozsianego krzepnięcia wewnątrznaczyniowego występuje u 40-50% koni w przebiegu ostrych zaburzeń kolkowych, w tym i aż 70% przypadków skrętu okrężnicy. W jego przebiegu dochodzi do odkładania się w naczyniach złogów fibryny, które mogą doprowadzić do niedotlenienia tkanek, uszkodzenia wielonarządowego, a nawet śmierci (Amaral i wsp. 2004, Brainard i wsp. 2011, Cotovio i wsp. 2007, Couto 2000, Levi i wsp. 1997, 2011, Levi i Opal 2006, Morris 1991, Saluk-Juszczak i Królewska 2010, Śliwińska-Stańczyk 2005). W przebiegu subklinicznej postaci DIC objawy są niespecyficzne, co utrudnia postawienie diagnozy oraz opóźnia rozpoczęcie właściwego leczenia. Z tego powodu szanse na przeżycie koni z podostrą formą DIC są 8-krotnie mniejsze w porównaniu do koni, u których DIC się nie rozwinął (Cesarini i wsp. 2010, Dolente i Wilkins 2002, Stokol i wsp. 2005). Szybkie wykrycie i leczenie tej subklinicznej koagulopatii poprawia szanse na przeżycie chorych zwierząt oraz zmniejsza ryzyko śmiertelności (Cesarini i wsp. 2010, Dallap i wsp. 2003). We wcześniejszych doniesieniach zespół DIC był określany koagulopatią ze zużycia. Termin ten nie jest jednak zbyt precyzyjny, gdyż większość składników osocza jest nie tylko zużywana w tworzonych się zakrzepach, lecz również biodegradowana przez plazminę (Sawicka 2000). Możliwa interwencja poprawiająca okres hospitalizacji mogłaby opierać się na administracji produktów osoczowych, zawierających brakujące czynniki krzepnięcia, jak również inhibitory krzepnięcia (AT, białko C,) które przywracałyby równowagę hemostatyczną organizmu, przyczyniając się do skutecznego działania innych środków farmakologicznych. Z badań nie mogliśmy wykluczyć koni poddawanych heparyno- i antybiotykoterapii, jak również koni, u których stosowano niesteroidowe leki przeciwzapalne, gdyż jest to rutynowe postępowanie w okresie pooperacyjnym. Jednakże celem przeprowadzonych badań było monitorowanie rzeczywistego stanu układu hemostazy u koni poddawanych chirurgicznemu leczeniu ostrych stanów kolkowych, na który mają również wpływ wspomniane czynniki. Z tego względu, iż badania były przeprowadzane na przypadkach klinicznych, zaniechanie podawania wspomnianych leków byłoby nieetyczne i wiązałoby się ze zbyt dużym ryzykiem wystąpienia powikłań, grożących śmiercią. 90 W podsumowaniu można stwierdzić, że przeprowadzone badania wskazują na wyraźne zmiany funkcji płytek krwi oraz w układzie krzepnięcia i fibrynolizy u koni w przebiegu ostrej niedrożności jelit. Zdaniem wielu autorów tego typu zmiany mogą przyczyniać się do wzrostu ryzyka komplikacji zakrzepowo-zatorowych, jak również pooperacyjnych powikłań krwotocznych (Brooks 2008, Byars i wsp. 2003, Dolente i Wilkins 2002, Dąbrowska i wsp. 1995, Murray i Fitzgerald 1989, Sawicka 2000, Wiśniewski i wsp. 1991). Pomimo znamiennych różnic w czynności układu hemostazy oraz funkcji płytek krwi u koni w przebiegu ostrej niedrożności jelit, trudno jest jednoznacznie stwierdzić, który z opisanych wskaźników mógłby być prognostycznym. Wydaje się, że w obliczu tak złożonych interakcji w układzie hemostazy, wskaźniki hemostazy powinno się oceniać całościowo, gdyż pojedyncze rozpatrywanie poszczególnych parametrów nie pozwala na określenie złożonych zaburzeń. W związku z tym, oznaczenia podstawowych wskaźników hemostazy powinny zostać włączone do wszystkich rutynowych zestawów testów laboratoryjnych wspomagających diagnozowanie zaburzeń układu hemostazy w przebiegu chorób kolkowych u koni, gdyż każdego pacjenta z ostrą niedrożnością jelit należy traktować z podejrzeniem zespołu DIC. Zdaniem Dallap Schaer i Epstein (2009), Feige i wsp. (2003a) wykonywanie badań koagulologicznych ma znaczenie nie tylko w diagnozowaniu zespołu DIC, ale również w rozpoznawaniu zaburzeń hemostazy wyprzedzających o kilka dni pojawienie się ich klinicznych objawów. Pozwala to na wczesną interwencję farmakologiczną, co zmniejsza ryzyko powikłań i śmiertelności (Cesarini i wsp. 2010, Dallap i wsp. 2003, Dallap Schaer i Epstein 2009). 91 6. WNIOSKI Na podstawie wyników uzyskanych w pracy sformułowano następujące wnioski: 1. U koni z ostrą niedrożnością jelit, przy braku zmian liczby leukocytów, w okresie przed i po laparotomii odnotowuje się zmiany wartości wskaźnika N/L, co może stanowić jedno z pierwszych kryteriów oceny stanu pacjenta. 2. Podobna ekspresja P-selektyny, na niestymulowanych oraz stymulowanych trombiną płytkach u koni kontrolnych, przemawia, że komórki te wykazują stałą aktywność konstytutywną. 3. U koni z niedrożnością jelit, wzmożona, po stymulacji trombiną, ekspresja Pselektyny oraz receptora CD41/61 (GP IIb/IIIa) a także zwiększona wielkość i granularność płytek, świadczą o wysokim stopniu aktywności tych komórek, co może stanowić jeden z czynników zwiększających ryzyko komplikacji zakrzepowo-zatorowych. 4. Płytki u konia wykazują zdolność internalizacji NR a wykazana, zróżnicowana ilość czerwieni pochłoniętej przez płytki koni w okresie przed i pooperacyjnym, stanowi ważny argument zachęcający do wykorzystania tej cechy w ocenie funkcjonalnej tych komórek. 5. Obniżona liczba płytek, wydłużenie czasów PT i APTT, przy osłabieniu aktywności AT oraz wzroście stężenia D-dimerów, wskazują iż u każdego konia z ostrą niedrożnością jelit rozwija się subkliniczna postać DIC. Zróżnicowany charakter tych zmian wskazuje, że wartość diagnostyczną może mieć tylko ocena całościowa. Ograniczenie się do oceny pojedynczych parametrów może prowadzić do niepoprawnych wniosków. 92 7. PIŚMIENNICTWO 1) Abutarbush S.M., Carmalt J.L., Shoemaker R.W.: Causes of gastrointestinal colic in horses in western Canada:604 cases (1992 to 2002). Can. Vet J. 2005, 46, 800-805 2) Akca S., Haji-Michael F., Mendonca A., Suter P., Levi M., Vincent J.L.: Time course of platelet counts in critically ill patients. Crit. Care Med. 2002, 30(4), 753-756 3) Allen B.V., Kold S.E.: Fibrinogen response to surgical tissue trauma in the horse. Equine Vet. J. 1988, 20(6), 441-443 4) Alsaad K. M., Abid-albar A. Nori: Equine colic and coagulation disorders. J. Anim. Vet. Adv. 2009, 8(12), 2675-2679 5) Amaral A., Opal S.M., Vincent J.L.: Coagulation in sepsis. Intensive Care Med. 2004, 30(6), 1032-1040 6) Antal P., Sipka S., Suranyi P., Csipo I., Seres T., Marodi L., Szegedi G.: Flow cytometric assay of phagocytic activity of human neutrophils and monocytes in whole blood by neutral red uptake. Ann. Hematol. 1995, 70, 259-265 7) Arguelles D., Carmona J., Pastor J., Iborra J., Vinals L., Martinez P., Bach E., Prades M.:Evaluation of single and double centrifugation tube methods for concentrating equine platelets. Research in Veterinary Science. 2006, 81, 237-245 8) Bailey S. R., Adair H. S., Reinemeyer C. R., Morgan S. J., Brooks A. C., Longhofer S. L., Elliott J.: Plasma concentrations of endotoxin and platelet activation in the developmental stage of oligofructose-induced laminitis. Vet. Immunol. Immunopathol. 2009, 129, 167-173 9) Boldt J., Muller M., Rothe A., Lenzen P., Hempelmann G.: Does continuous heparinization influence platelet function in the intensive care patient? Intensive Care Med. 1997, 23, 567-573 10) Borawski J., Myśliwiec M.: Nowe właściwości farmakologiczne heparyny i sulodeksydu. Postępy Nauk Medycznych 2009, 10, 764-770 11) Borowska K., Jędrych B., Czerny K., Zabielski S.: Udział integryn w procesach fizjo- i patologicznych. Pol. Merk. Lek. 2006, XXI, 124, 362-366 93 12) Boukour S., Cramer E.: Platelet interaction with bacteria. Platelets 2005, 16, 215-217 13) Brainard B.M., Epstein K.L., LoBato D., Kwon S., Papich M.G., Moore J.N.: Effects of clopidogrel and aspirin on platelet aggregation, thromboxane production and serotonin secretion in horses. J. Vet. Intern. Med. 2011, 25, 116-122 14) Brooks A. C, Menzies-Gow N. J., Wheeler-Jones C., Bailey S.R., Cunningham F.M., Elliot J.: Endotoxin-induced avtivation of aquine platelets: evidence for direct activation of p38 MAPK pathways and vasoactive mediator production. Inflamm. Res. 2007, 56, 154-161 15) Brooks A. C., Menzies-Gow N. J., Wheeler-Jones C. P. D., Bailey S. R., Elliott J., Cunningham F.M.: Regulation of platelet activating factor-induced equine platelet activation by intracellular kinases. J. Vet. Pharmacol. Therap. 2008, 32, 189-196 16) Brooks M.: Equine Coagulopathies. Vet. Clin. Equine 2008, 24, 335-355 17) Brooks M.B., Randolph J., Warner K., Center S.: Evaluation of platelet function screening tests to detect platelet procoagulant deficiency in dogs with Scott syndrome. Vet. Clin. Pathol. 2009, 38(3), 306-315 18) Brown C.H., Bradshaw M.J., Natelson E.A., Alrey C.P., Williams T.W.: Defective platelet function following the administration of penicillin compounds. Blood 1976, 47, 949-956 19) Brunso L., Segura D., Monreal L., Escolar G., White J.G., Diaz-Ricart M.: The secretory mechanisms in equine platelets are independent of cytoskeletal polymerization and occur through membrane fusion. Platelets 2010, 21(8), 658-666 20) Byars T.D., Davis D., Divers T.J.: Coagulation in the equine intensive-care patient. Clinical Techniques in Equine Practice, 2003, 2(2), 178-187 21) Callan M.B., Giger U.: Assessment of point of care instrument for identification of primary hemostatic disorders in dogs. Am. J. Vet. Res. 2001, 62, 652-658 22) Cesarini C., Monreal L., Armengou L., Delgado M. A., Rios J., Jose-Cunilleras E.: Association of admission plasma D-dimer concentration with diagnosis and outcome in horses with colic. J. Vet. Intern. Med. 2010, 24, 1490-1497 23) Chang J.C.: Postoperative thrombocytopenia: with etiologic, diagnostic, and therapeutic consideration. Am. J. Med. Sci. 1996, 311(2 ), 96-105 94 24) Chen M., Geng J.G.: P-selectin meduates adhesion of leukocytes, platelets and cancer cells in inflammation, thrombosis and cancer growth and metastasis. Arch. Immunol. Ther. Exp 2006, 54(2), 75-84 25) Chojnowski K., Podolak-Dawidziak M., Windyga J.: Diagnostyka przedłużonego czasu częściowej tromboplastyny po aktywacji (aPTT). Hematologia 2010, 1(1), 81-86 26) Ciapetti G., Granchi D., Verri E., Savarino L., Cavedagna D., Pizzoferrato A.: Application of combination of neutral red and amido black staining for rapid, reliable cytotoxicity testing of biomaterials. Biomaterials 1996, 17(13), 1259-1264 27) Cierniewski C.S.: Leki przeciwpłytkowe – blokery płytkowego receptora fibrynogenu. Polski Przegląd Kardiologiczny 2000, 2(2), 105-110 28) Clancel N., Burton S., Horney B., MacKenzie A., Nicastro A., Cote E.: Evaluation of platelet function in dogs with cardiac disease using the PFA-100 platelet function analyzer. Vet. Clin. Patholo. 2009, 38(3), 299-305 29) Cohen N. D, Gibbs P. G., Woods A. M.: Dietary and other management factors associated with colic in horses. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1999, 215(1), 53-60. 30) Collatos C., Barton M. H., Moore J. N.: Fibrinolytic activity in plasma from horses with gastrointestinal diseases: changes associated with diagnosis, surgery, and outcome. J. Vet. Intern. Med. 1995a, 9(1), 18-23 31) Collatos C., Barton M., Prasse K., Moore J.:Intravascular and peritoneal coagulation and fibrynolisis in horses with acute gastrointestinal tract diseases. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1995b, 207, 465-470 32) Cook V. L., Meyer C. T., Campbell N. B., Blikslager A. T.: Effect of firocoxib or flunixin meglumine on recovery of ischemic-injured equine jejunum. Am. J. Vet. Res. 2009, 70(8), 992-1000 33) Cotovio M., Monreal L., Navarro M., Segura D., Prada J., Alves A.: Detection of fibrin deposits in tissues from horses with severe gastrointestinal disorders. J. vet. Intern. Med. 2007, 21, 308-313 34) Couto C.: Diagnostyka kliniczna i laboratoryjna krwawień u psów i kotów. Weterynaria po Dyplomie 1999, 1, 39-47 35) Couto C.: Zespół rozsianego krzepnięcia wewnątrznaczyniowego u psów i kotów. Weterynaria po Dyplomie 2000, 1, 41-46 95 36) Crisman M.V., Scarratt W.K., Zimmerman K.L.: Blood proteins and inflammation in the horse. Vet. Clin. Equine 2008, 24, 285-297 37) Dąbrowska J., Wiśniewski E., Krumrych W., Danek J., Janiszewski J.: Wpływ doświadczalnej endotoksemii na niektóre wskaźniki krzepnięcia krwi u koni. Medycyna Wet. 1995, 51, 212-214 38) Dąbrowska J., Wiśniewski E., Krumrych W., Danek J.: Blood coagulation characteristics in horses. The influences of breed. Bull. vet. Inst. Puławy 1997, 41, 121-126 39) Dąbrowska J., Wiśniewski E.: Biologiczne i terapeutyczne właściwości heparyny. Medycyna Wet. 1996, 52(11), 692-696 40) Dąbrowska M. Wartość diagnostyczna badań przesiewowych i wybranych badań specjalistycznych. LabForum 2000, 5, 6-8 41) Dallap B., Dolente B., Boston R.: Coagulation profiles in 27 horses with large colon volvulus. J. Vet. Emerg. Crit. Care 2003, 13, 215-225 42) Dallap-Schaer B.L., Bentz A.I., Boston R.C., Palmer J.E., Wilkins P.A.: Comparison of viscoelastic coagulation analysis and standard coagulation profiles in critically ill neonatal foals to outcome. J. Vet. Emerg. Crit. Care 2009a, 19(1), 88-95 43) Dallap-Schaer B.L., Epstein K.: Coagulopathy of the critically ill equine patient. J. Vet. Emerg. Crit. Care 2009, 19(1), 53-65 44) Dallap-Schaer B.L., Wilkins P.A., Boston R., Palmer J.: Preliminary evaluation of hemostasis in neonatal foals using a viscoelastic coagulation and platelet function analyzer. J. Vet. Emerg. Crit. Care 2009b, 19(1), 81-87 45) Danese S., Papa A., Saibeni S., Repici A., Malesci A., Vecchi M.: Inflammation and coagulation in inflammatory bowel disease: The clot thickens. Am. J. Gastroenterol. 2007, 102, 174-186 46) Darien B. J., Potempa J., Moore J. N., Travis J.: Antithrombin III activity in horses with colic: an analysis of 46 cases. Equine Vet. J. 1991, 23(3), 211-214 47) De La Cruz J.P., Villalobos M.A., Escalante R., Guerrero A., Arrebola M.M., Sanchez de la Cuesta F.: Effects of the selective inhibition of platelet thromboxane synthesis on the platelet-subendotelium Br. J. Pharmacol. 2002, 137, 1082-1088 48) Dietz O, Huskamp B.: Handbuch Pferdepraxis, Enke, Stuttgart 2005 96 interaction. 49) Dolente B., Wilkins P.: Clinicopathologic evidence of disseminated intravascular coagulation in horses with acute colitis. J. Am. Vet. Med. Assoc. 2002, 220, 1034-1038 50) Dominguez-Jimenez C., Diaz-Gonzalez F., Gonzalez-Alvaro I., Cesar J.M., Sanchez-Madrid F.: Prevention of IIb3 activation by non-steroidal antiiinflammatory drugs. FEBS Letters 1999, 446, 318-322 51) Dukti S., White N.: Surgical complications of colic surgery. Vet. Clin. North Am. Equine Pract. 2008, 24(3), 515-534 52) Dukti S., White N.A.: Prognosticating equine colic. Vet. Clin. North Am. Equine Pract. 2009, 25(2), 217-231 53) Dunkel B., Rickards K., Page C., Cunningham F.: Neutrophil and platelet activation in equine recurrent airway obstruction is associated with increased CD13 expression, but not platelet CD 41/61 and CD 62P or neutrophil-platelet aggregate formation. Vet. Immunol. Immunopathol. 2009, 131, 25-32 54) Escolar G., Leistikow E., White J.G.: Tha fate of the open canalicular system in surface and suspension-activated platelets. Blood 1989, 74(6), 1983-1988 55) Escolar G., White J.G.: Changes in glycoprotein expression after platelet activation: differences between in vitro and in vivo studies. Thromb. Haemost. 2000, 83(3), 371-386 56) Evans R. J.: Blood platelets and their role in the genesis and sequelae of intestinal ischaemia. Equine Vet. J. 1992, 24, 31-37 57) Fagliary J.J., Silva S/L., Silva P.C., Pereira G.T.: Leucograma e teores plasmaticos de proteinas de fase aguda de equinos portadores de abdomen agudo e submetidos a laparotomia. Arg. Bras. Med.Vet. Zootec. 2008, 60(2), 322-328 58) Feige K., Kastner S.B.R., Dempfle C.E., Balestra E.: Changes in coagulation and markers of fibrinolysis in horses undergoing colic surgery. J. Vet. Med. Assoc. 2003a, 50, 30-36 59) Feige K., Schwarzwald C. C., Bombeli T. H.: Comparison of unfractioned and low molecular weight heparin for prophylaxis of coagulopathies in 52 horses with colic: a randomized double-blind clinical trial. Equine Vet. J. 2003b, 35(5), 506-513 60) Feldman B.F., Zinkl J.G., Jain N.C.: Schalm’s Veterinary Hematology, Lippincott Williams and Wilkins, USA, 2000. 97 61) Francois B., Trimoreau F., Vignon P., Fixe P., Praloran V., Gastinne H.: Thrombocytopenia in the sepsis syndrome: role of hemophagocytosis and macrophage colony-stimulating factor. Am. J. Med. 1997, 103(2), 114-120 62) Fryc J.: Rozpoznawanie i leczenie schorzeń kolkowych koni. Wydawnictwo SIMA, Warszawa 1999 63) Fryc J.: Ważniejsze zagadnienia z farmakoterapii tzw. schorzeń morzyskowych koni. Magazyn Weterynaryjny, 1993, 6, 32-35 64) Fullard J.F.: The role of the platelet glycoprotein IIb/IIIa in thrombosis and haemostasis. Curr. Pharm. Des. 2004, 10, 1567-1576 65) Furie B., Furie B. C.: Role of P-selectin and microparticle PSGL-1 in thrombus foramation. Trends. Mol. Med. 2004, 10(4), 171-178 66) Furie B.: Pathogenesis of thrombosis. American Society of Hematology 2009, 1, 255-258 67) Gader A.G., Ghumlas A.K., Hussain M.F., Haidari A.A., White J.G.: The ultrastructure of camel blood platelets: A comparative study with human, bovine and equine cells. Platelets 2008, 19(1), 51-58 68) Gawaz M., Neumann F., Schomig A.: Evaluation of platelet membrane glycoproteins in coronary artery disease: consequences for diagnosis and therapy. Circulation 1999, 99, 1-11 69) Gerhards H., Eberhardt C.: Plasma heparin values and hemostasis in equids after subcutaneous administration of low-dose calcium heparin. Am. J. Vet. Res. 1988, 49(1), 13-18 70) Gerhards H.: Low dose calcium heparin i horses: plasma heparin cicentrations, effects on red blood cell mass and coagulation variabes. Equine vet. J. 1991, 23, 37-43 71) Goncalves S., Julliand V., Leblond A.: Risk factors associated with colic in horses. Vet. Res. 2002, 33, 641-652 72) Hackett E. S., Hassel D. M.: Colic: nonsurgical complication. Vet. Clin. North Am. Equine Pract. 2008, 24;3, 535-555 73) Harrison P.: Platelet function analysis. Blood 2005a, 19, 111-123 74) Harrison P.: The role of PFA-100® testing in the investigation and management of haemostatic defects in children and adults. Br. J. Haematol. 2005b, 130, 3-10 75) Hassell K.: Heparin-induced thrombocytopenia: diagnosis and management. Thromb. Res. 2008, 123 Suppl.1., 16-21 98 76) Hirsh J., Warkentin T. E., Shaughnessy S. G., Anand S. S., Halperin J. L., Raschke R., Granger C., Ohman E. M., Dalen J. E.: Profilaktyka przeciwzakrzepowa i leczenie zakrzepicy w różnych stanach klinicznych – VI wytyczne American College of Chest Physicians. Część II:Heparyny.Chest. 2001, 119, 1-7 77) Ihler C., Venger J., Skjerve E.: Evaluation of clinical and laboratory variables as prognostic indicators in hospitalised gastrointestinal colic horses. Acta vet. Scand. 2004, 45, 109-118 78) Iwaszko-Simonik A., Graczyk S., Pliszczak-Król A., Henklewski R., Biazik A.: „Wykorzystanie osocza bogatopłytkowego w leczeniu ścięgien koni”, Magazyn Weterynaryjny, 2012a, 21(176), 67-73 79) Iwaszko-Simonik A., Graczyk S., Pliszczak-Król A.: „Ocena przydatności wybranych wskaźników hemostazy w monitorowaniu pooperacyjnym koni” XIV Kongres PTNW, 2012b, 168 80) Iwaszko-Simonik A., Pliszczak-Król A., Graczyk S., Gancarz R.: Ocena czasu okluzji oraz ekspresji receptorów powierzchniowych płytek krwi (CD41/61, CD62P) w przebiegu zaburzeń żołądkowo-jelitowych u koni. Diagnostyka Laboratoryjna 2(46), 2010a, 226 81) Iwaszko-Simonik A., Pliszczak-Król A., Graczyk S., Pawlaczyk I., Gancarz R.: Wpływ preparatów polifenolowo-polisacharydowych pochodzenia roślinnego na aktywność fagocytarną płytek krwi szczura. Diagnostyka Laboratoryjna 2(46), 2010b, 218-219 82) Iwaszko-Simonik A., Pliszczak-Król A., Graczyk S.: „Analiza funkcji płytek u koni z zaburzeniami żołądkowo-jelitowymi” XIV Kongres PTNW, 2012c, 137 83) Iwaszko-Simonik A., Pliszczak-Król A., Graczyk S.: „Podstawy diagnostyki i terapii zaburzeń krzepnięcia krwi w przebiegu morzysk u koni”, Życie Weterynaryjne, 86(5) 2011, 360-364 84) Järemo P, Sandberg-Gertzen H.: Platelet density and size in inflammatory bowel disease. Thromb. Haemostat. 1996, 75(4), 560-561 85) Jarvis G., Evans R.: Endotoxin-induced platelet aggregation in heparinised equine whole blood in vitro. Res. Vet. Sci. 1994, 57, 317-324 86) Johnstone I.B., Crane S.: Haemostatic abnormalities in horses with colic-their prognostic value. Equine Vet. J. 1986, 18(4), 271-274 99 87) Kamocki Z., Matowicka-Karna J., Piotrowski Z., Kemona H, Bandurski R.: Aktywność fagocytarna i bakteriobójcza płytek krwi we wczesnym żywieniu dojelitowym chorych po całkowitym wycięciu żołądka z powodu raka. Leczenie żywieniowe i metaboliczne 2005;1(2):59-63 88) Kapsoritakis A.N., Koukourakis M.I., Sfiridaki A., Potamianos S.P., Kosmadaki M.G., Koutroubakis I.E., Kouroumalis E.A.: Mean Platelet Volume: A useful maker of inflammatory bowel disease activity. Am. J. Gastroenterol. 2001, 96(3), 776-781 89) Karleskind A., Gluntz X.: Skręt okrężnicy u konia. Magazyn Weterynaryjny 1999, Suppl., 20-24 90) Kaushansky K.: Determinants of platelet number and regulation of thrombopoiesis. Hematology 2009, 1, 147-152 91) Khandekar M.M., Khurana A.S., Deshmukh S.D., Kakrani A.L., Katdare A.D., Inamdar A.K.: Platelet volume indices in patients with coronary artery disease and acute myocardial infarction: an Indian scenario. J. Clin. Pathol. 2006, 59, 146-149 92) Kimberley M., McGurrin J., Arroyo L.G., Bienzle D.: Flow cytometric deection of platelet-bound antibody in three horses with immune-mediated thrombocytopenia. J. Am. Vet. Med. Assoc. 2004, 224(1), 83-87 93) Kittrell D., Berkwitt L.: Hypercoagulability in dogs: pathophysiology. Compendium 2012, 4, 1-5 94) Klohnen A.: New perspectives in postoperative complications after abdominal surgery. Vet. Clin. North Am. Equine Pract. 25(2), 2009, 341-350 95) Kobusiak-Prokopowicz M., Kuliczkowski W., Karolko B., Prajs I., Mazurek W.: Platelet aggregation and P-selectin levels during exercise treadmill test in patients with ischaemic heart disease. Kardiologia Polska 2006, 64, 1094-1099 96) Komosa A., Siniawski A., Lesiak M., Grajek S: Problemy współczesnej terapii przeciwpłytkowej. Post. Kardiol. Interw. 2010, 6, 1(19), 21-29 97) Kostro K., Sobieska M., Wiktorowicz K., Wołoszyn S.: Białka ostrej fazy u zwierząt – występowanie i charakterystyka. Medycyna Wet. 1996, 52(3), 152-155 98) Kowalska M.A, Krishnaswamy S., Rauova L., Zhai L., Hayes V., Amirikian K., Esko J.D., Bougie D.W., Aster R.H., Cines D.B., Poncz M.: Antibodies associated with heparin-induced thrombocytopenia (HIT) inhibit activated 100 protein C generation: new insights into the prothrombotic nature of HIT. Blood 2011, 118(10), 2882-2888 99) Kralisz M., Matowicka-Karna J.: Ocena parametrów morfologicznych płytek krwi w przebiegu gardiazy. Pol. Merk. Lek. 2008, XXV (150), 480-483 100) Kralisz U.: Odziaływana płytek krwi z komórkami śródbłonka w stanach zapalnych – część I. Receptory adhezyjne płytek krwi, komórek śródbłonka i mikropęcherzyków w hemostazie i stanach zapalnych. Post. Biol. Kom. 2008, 35(1), 45-60 101) Krumrych W., Wiśniewski E., Dąbrowska J., Danek J.: Activation of blood neutrophils in horses with the use of different doses of endotoxin. Bull. Vet. Inst. Pulawy 1997, 41, 41-47 102) Krumrych W., Wiśniewski E., Danek J.: Wpływ lipopolisacharydu na aktywność fagocytarną neutrofilów koni. Medycyna Wet. 1996, 52(9), 584-586 103) Kuwahara M., Sugimoto M., Tsuji S., Matsui H., Mizuno T., Miyata S., Yoshioka A.: Platelet shape changes and adhesion under high shear flow. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2002, 22, 329-334 104) Lalko C., Deppe E., Ulatowski D., Lutgen A., Hart A., Patton E., Lunn D., Suresh M., Darien B.: Equine platelet CD62P (P-selectin) expression: a phenotypic and morphologic study. Vet. Immunol. Immunopathol. 2003, 91, 119-134 105) Levi M., Keller T.T., Gorp E., Cate H.: Infection and inflammation and the coagulation system. Cardiovasc. Res. 2003, 60, 26-39 106) Levi M., Opal S.M.: Coagulation abnormalities in critically ill patients. Crit. Care 2006, 10(4), 222-230 107) Levi M., Poll T., Cate H., Deventer J.H.: The cytokine-mediated imbalance between coagulant and anticoagulant mechanisms in sepsis and endotoxaemia. Eur. J. Clin. Invest. 1997, 27, 3-9 108) Levi M., Schultz M., Poll T.: Coagulation biomarkers in critically ill patents. Crit. Care Clin. 2011, 27, 281-297 109) Levi M., Schultz M.: Coagulopathy and platelet disorders in critically ill patients. Minerva Anestesiol. 2010, 76(10), 851-859 110) Levi M., van der Poll T., Schultz M.: Infection anf inflammation as risk factors for thrombosis and atherosclerosis. Semin. Thromb. Hemost. 2012, 38(5), 506-514 101 111) Levi M: Platelet at a crossroad of pathogenic patwhways in sepsis. J. Thromb. Haemost. 2004, 2, 2094-2095 112) Łuksza E., Mantur M.: Nowe spojrzenie na płytki krwi i mikropłytki z uwzględnieniem ich roli w zaburzeniach krzepnięcia i progresji choroby nowotworowej. Pol. Merk. Lek., 2009, XXVII, 162, 491-495 113) Lundahl T.H., Lindahl T.L., Fagerberg I.H., Egberg N., Bunescu A., Larsson A.: Activated plateles and impaired platelet function in intensive care patients analyzed by flow cytometry. Blood Coagul. Fibrinolysis 1996, 7, 218-220 114) Ma Y.-Q., Qin J., Plow E.F.: Platelet integrin IIb3: activation mechanisms. J. Thromb. Haemost. 2007, 5, 1345-1352 115) Macey M.G., Carty E., Webb I., Chapman E.S., Zelmanovic D., Okrongly D., Rampton D.S., Newland A.C.: Use of mean platelet component to measure platelet activation on the ADVIA 120 haematology system. Cytometry 1999, 38, 250-255 116) Madej E, Riha T.: Choroby kolkowe koni. Cz I. Weterynaria w Praktyce 2008, 2, 70-74 117) Male R., Vannier W.E., Baldeschwieler J.D.: Phagocytosis of liposomes by human platelets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States oa America 1992, 89, 9191-9195 118) Malhotra R., Proest R., Foster M. R., Bird M. I.: P-selectin binds to bacterial lipopolisaccharide. Eur. J. Immunol. 1998, 28, 983-988 119) Martin J.F., Bath P.M., Burr M.L.: Influence of platelet size on outcome after myocardial infarction. Lancet 1991, 338, 1409-1411 120) Massaguer A., Engel P., Tovar V., March S., Rigol M., Solanes N., Bosch J., Pizcueta P.: Characterization of platelet and soluble-porcine P-selectin (CD62P). Vet. Immunol. Immunopatgol. 2003, 96, 169-181 121) Matowicka-Karna J., Kemona H.: Aktywność fagocytarna płytek krwi w przebiegu różnych chorób pasożytniczych. Przegl. Lek. 2002, 59(10), 820-822 122) Matyszczak Ł., Niedźwiedź A., Pasławska U., Nicpoń J., Sikorska A.: D-dimer jako wskaźnik wykrzepiania wewnątrznaczyniowego u koni i psów. Medycyna Wet. 2008, 64, 272-275 123) Matyszczak Ł.: Przydatność oznaczania stężenia D-dimeru w surowicy krwi kon w rozpoznawaniu nawracającego zapalenia dróg Praca doktorska 2009, Uniwersytet Przyrodniczy, Wrocław 102 oddechowych. 124) McGurrin M.K., Arroyo L.G., Bienzle D.: Flow cytometric detection of plateletbound antibody in three horses with immune-mediated thrombocytopenia. J. Am. Vet. Med. Assoc. 2004, 224(1), 83-87 125) McMichael M.: Primary hemostasis. J. Vet. Emerg. Crit. Care 2005, 15, 1-8 126) Merten M., Thiagarajan P.: P-selectin in arterial thrombosis. Z. Kardiol. 2004, 93, 855-863 127) Michalak M., Ścibisz A., Filipiak K.J.: Nowa grupa leków przeciwpłytkowychantagoniści receptora aktywowanego proteinaza 1. Choroby Serca i Naczyń 2010, 7(1), 33-39 128) Michelson A.D: Methods for the measurement of platelet function. Am. J. Cardiol. 2009, 103(3A), 20A-26A 129) Michelson A.D., Barnard M.R., Krueger L.A., Frelinger A.L., Furman M.I.: Evaluation of platelet function by flow cytometry. Methods 2000, 21, 259-270 130) Michelson A.D., Barnard M.R.: Thrombin-induced changes in platelet membrane glyccoproteins Ib, IX and IIb-IIIa complex. Blood 1987, 70(5), 16731678 131) Michelson A.D., Ellis P.A., Barnard M.R., Matic G.B., Viles A.F., Kestin A.S.: Downregulation of the platelet surface glycoprotein Ib-IX complex in whole blood stimulated by thrombin, adenosine diphosphate, or an in vivo wound. Blood 1999, 77, 770-779 132) Monreal L., Angles A., Espada Y., Monasterio J., Monreal M: Hypercoagulation and hypofibrinolysis in horses with colic and DIC. Equine Vet. J. Suppl. 2000, 32, 19-25 133) Monreal L., Cesarini C.: Coagulopathies in horses with colic. Vet. Clin. North Am. Equine Pract. 2009, 25, 247-258 134) Monreal L., Villatoro A., Monreal M., Espada Y., Angles A., Ruiz-Gopegui R.: Comparison of the effects of low-molecular-weight and unfractioned heparin in horses. Am. J. Vet. Res. 1995, 56, 1281-1285 135) Monreal L.: D-dimer as a new test for the diagnosis of DIC and thromboembolic disease. J. Ve. Intern. Med. 2003, 17(6), 757-759 136) Monreal L.: Treating Disseminated Intravascular Coagulation. Compendium Equine 2008, 326-330 137) Morris D.D.: Endotoxemia in horses: A review of cellular and humoral mediators involved in its pathogenesis. J. Vet. Intern. Med. 1991, 5(3), 167-181 103 138) Mostefal H.A., Andriantsitohaina R., Martinez M.C: Plasma membrane microparticles in angiogenesis: role in ischemic disease and in cancer. Physiol. Res. 2008, 57, 311-320 139) Murray R., Fitzgerald G.: Regulation of thromboxane receptor activation in human platelets. Proc. Natl. Acad. Sci. 1989, 86, 124-128 140) Murray R.: Endotoxaemia in horses. In Practice 1998, 20, 88-94 141) Neuder L.E., Keener J.M., Eckert R.E., Trujillo J.C., Jones S.L.: Role of p38 MAPK in LPS induced pro-inflammatory cytokine and chemokine gene expression in equine leukocytes. Vet. Immunol. Immunopathol. 2009, 129, 192-199 142) Nunez R., Gomes-Keller M.A., Schwarzwald C., Feige K.: Assessment of Equine Autoimmune Thrombocytopenia (EAT) by flow cytometry. Blood Disorders 2001, 1, 1-13 143) Obońska K., Grąbczewska Z., Fisz J.: Ocena czynności śródbłonka naczyniowego – gdzie jesteśmy, dokąd zmierzamy? Folia Cardiologica Excerpta 2010, 5(5), 292-297 144) Olas B., Wachowicz B.: Aktywacja płytek krwi; mechanizm przekazywania sygnałów. Post. Biol. Kom. 1995, 22(4), 359-378 145) Olas B.: Udział heterotrimerycznych białek G w przekazywaniu sygnałów w płytkach krwi. Acta Haemat. Pol 2001, 32(4), 393-405 146) Ortel T.L.: Heparin-induced thrombocytopenia: when a low platelet count is a mandate for anticoagulation. American Society of Hematology 2009, 225-232 147) Pawlus J., Rusak M., Chociej-Stypułowska J., Dąbrowska M.: Parametry aktywacji płytek krwi i stężenie mieloperoksydazy, jako markery choroby niedokrwiennej serca. Pol. Merk. Lek. 2010, XXIX, 172, 259-262 148) Perez-Pujol S., Marker P.H., Key N.S.: Platelet microparticles are heterogeneus and highly dependent on the activation mechanism: studies using a new digital flow cytometr. Cytometry A., 2007, 71(1), 38-45 149) Peters M. J., Heyderman R. S., Hatch D. J., Klein N. J.: Investigation of plateletneutrophil interaction in whole blood by flow cytometry. J. Immunol. Methods 1997, 209, 125-135 150) Piccione G., Casella S., Gianetto C., Assenza A., Caola G.: Effect of different storage conditions on platelet aggregation in horse. J. Equine Vet. Sci. 2010, 30(7), 371-375 104 151) Pizzulli L., Yang A., Martin J.F.: Changes in platelet size and count in unstable angina compared to stable angina or non-cardiac chest pain. Eur. Heart J. 1998, 19, 80-84 152) Polek A., Sobiczewski W., Matowicka-Karna J.: P-selektyna i jej rola w niektórych chorobach. Post. Hig. Med. Dośw. 2009, 63, 465-470 153) Prasse K., Topper M., Moore J., Welles E.: Analysis of hemostasis in horses with colic. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1993, 203, 685-693 154) Przewoźny M.: Wykorzystanie wybranych białek ostrej fazy w monitorowaniu pooperacyjnym koni. Praca doktorska 2004, Akademia Rolnicza, Wrocław 155) Quellette AL., Evans R.J., Heath M.F.: Platelets enhance endotoxin-induced monocyte tissue factor (TF) activity in the horse. Res. Vet. Sci. 2004, 76, 31-35 156) Radziwon P., Kłoczko J., Kiss B.: Współczesna teoria aktywacji i kontroli krzepnięcia krwi. Przew. Lek. 2004, 11, 50-56 157) Raszeja-Specht A.: Badania układu hemostazy w praktyce laboratoryjnej. Bio-Ksel sp. z o.o., Grudziądz 2008 158) Ratomski K., Żak J., Kasprzycka E., Hryniewicz K., Wysocka J.: Cytometryczna ocena odmłodzenia granulocytów obojętnochłonnych w przebiegu infekcji. Pol. Merk. Lek. 2009, XXVI, 151, 14-18 159) Ratomski K., Żak J., Kasprzycka E., Hryniewicz K., Wysocka J.: Ocena liczby płytek różnymi metodami pomiarowymi. Pol. Merk. Lek. 2010, XXVIII, 167, 379-386 160) Repetto G., del Peso A., Zuritta J.L.: Neutral red uptake assay for the estimation of cell viability/cytotoxicity. Nat. Protoc. 2008, 3(7), 1125-1131 161) Rice T.W., Wheeler A.P.: Coagulopathy in critically ill patients: Platelet disorders. Chest 2009, 136, 1622-1630 162) Roland G. A, Birrenkott G.P.: The effect of in vitro heat stress on the uptake of neutral red by chicken thrombocytes. Poult. Sci. 1998, 77(11), 1661-1664 163) Salat A., Bodingbauer G., Boehm D., Murabito M., Tochkow E., Sautner T., Mueller M.R., Fuegger R.: Changes of platelet surface antigens in patients suffering from abdominal septic shock. Thromb. Res. 1999, 95, 289-294 164) Salat A.: Kroess S., Felfernig-Boehm D., Felfernig M., Fleck T., Schmidt D., Pulaki S., Mueller M.R.: Comparison of in vitro closure time (PFA-100) with whole blood electrical aggregometry and platelet surface antigen expression in healthy volunteers. Thromb. Res. 2002, 105, 205-208 105 165) Saluk-Juszczak J., Królewska K.: Rola szlaku CD40/CD40L w biologicznej aktywności płytek krwi. Część 1. Przegląd Menopauzalny 2010, 5, 305-308 166) Saluk-Juszczak J.: Znaczenie lipopolisacharydu bakteryjnego procesie aktywacji płytek krwi. Post. Biol. Kom. 2007, 31(1), 159-172 167) Sawicka B.: Rozsiane wykrzepianie wewnątrznaczyniowe: aspekty kliniczne, laboratoryjne i terapeutyczne. Postępy Nauk Medycznych 2000, 3, 40-50 168) Schmitt-Sody M., Metz P., Gottschalk O., Birkenmaier C., Zysk S., Veihelmann A., Jansson V.: Platelet P-selectin is significantly involved in leukocyteendothelial cell interaction in murine antigen-induced arthritis. 2007, 18(5), 365372 169) Schuerholz T., Keil O., Wagner T., Klinzing S., Sumpelmann R., Oberle V., Marx G.: Hydrocortisone does not affect major platelet receptors in inflammation in vitro. Steroids 2007, 72, 609-613 170) Scott K. C., Hansen B. D., DeFrancesco T. C.: Coagulation effects of low molecular weight heparin compared with heparin in dogs considered to be at risk for clinically significant venous thrombosis. J. Vet. Emerg. Crit. Care 2009, 19(1), 74-80 171) Seebach J.D., Morant R., Rueqq R., Seifert B., Fehr J.: The diagnostic value of the neutrophil lift shift in predicting inflammatory and infectious disease. Am. J. Clin. Pathol. 1997, 107(5), 582-591 172) Segura D., Monreal L., Espada Y., Pastor J., Mayos I., Homedes J.: Assesment of platelet function analyser in horses. References range and influence of a platelet aggregation inhibitor. Vet. J. 2005, 170, 108-112 173) Segura D., Monreal L., Perez-Pujol S., Pino M., Ordinas A., Brugues R., White J., Escolar G.: Assessment of platelet function in horses: ultrastructure, flow cytometry and perfusion techniques. J. Vet. Intern. Med. 2006, 20, 581-588 174) Sikora J., Kostka B.: Struktura i aktywacja płytek krwi oraz ich zastosowanie jako komórek modelowych. Post. Biol. Kom.2005, 32(3), 561-570 175) Sikora J.: Choroby układu pokarmowego koni. Wydawnictwo SI-MA, Warszawa 2008 176) Skotnicki A., Sacha T.: Zaburzenia krzepnięcia krwi. Diagnostyka i leczenie. Medycyna Praktyczna, Kraków 1997 177) Śliwińska-Stańczyk P.: Rola płytek krwi w procesach zapalnych. Reumatologia 2005, 43(2), 85-88 106 178) Smith N.: A field test for endotoxin in the horse. J. Equine Vet. Sci. 1993, 13(8), 433-440 179) Smith S.: The cell-based model of coagulation. J. Vet. Emerg. Crit. Care 2009, 19(1), 3-10 180) Sobel M, McNeill P.M.,Carison P.L., Kermode J.C., Adelman B., Conroy R., Merques D.: Heparin inhibition of von Willebrand Factor-dependent platelet function in vitro and in vivo. J. Clin. Invest. 1991, 87, 1787-1793 181) Sorensen B., Halfdan O., Rea C.J., Tang M., Foley J.H., Fenger-Eriksen C.: Fibrinogen as a hemostatic agent. Semin. Thromb. Hemost. 2012, 38(3), 268-273 182) Sprayberry K. A.: Why Perform the CBC, and How Can the Information Be Used to Manage Cases? AAEP Proceedings 1999, 45, 285-289 183) Stachowiak G., Zając A., Pertyński T.: Hemostaza płytkowa w okresie menopauzy. Przegląd Menopauzalny 2008, 4, 205-209 184) Stenberg P. E., McEver R. P., Shuman M. A., Jacques YV, Bainton D.F.: A platelet alpha-Granule Membrane Protein (GMP-140) is expressed on the plasma membrane after activation. J. Cell. Biol. 1985, 101, 880-886 185) Stokol T., Erb H. N., Wilde L., Tornquist J., Brooks M.: Evaluation of latex agglutination kits for detection of fibrin(ogen) degradation products and Ddimer in healthy horses and horses with severe colic. Vet. Clin. Pathol. 2005, 34(4), 375-382 186) Stosik M, Deptuła W.: Wybrane funkcje płytek krwi. Medycyna Wet. 1998, 54(7), 452-465 187) Stosik Zdolność M., Deptuła W., granulocytów Tokarz-Deptuła obojętnochłonnych B., karpi Baldy-Chudzik do K.: pochłaniania i wewnątrzkomórkowego zabijania. Medycyna Wet. 2002, 58(1), 61-62 188) Stosik M.: Liczba trombocytów i ich aktywność fagocytarna u karpi (Cyprinus carpio L.) w różnym wieku. Medycyna Wet. 1995, 51(10), 621-623 189) Sykes B., Furr M.: Equine endotoxaemia-A state-of-the-art review of therapy. Aust. Vet. J. 2005, 83, 45-50 190) Szczepiński A.: Małopłytkowość rzekoma EDTA-zależna. Acta Haemat. Pol. 2006, 2, 217-223 191) Szułdrzyński K.: Nowe mechanizmy aktywacji układu krzepnięcia w ostrych zespołach wieńcowych, Praca doktorska, Kraków, 2008 107 192) Szumiło M., Rahden-Staroń I.: Fosfolipaza C zależna od fosfatydyloinozytolu w komórkach ssaków-budowa, właściwości i funkcja. Postępy Hig. Med. Dośw. 2008, 62, 47-54 193) Szypuła J., Iwulski P., Kędziora J.: Płytki krwi nadzieją przyszłości. Pol. Merk. Lek. 2009, XXVI, 156, 587-590 194) Tablin F., Castro M. D.: Equine platelets contain an anisotropic array of microtubules which reorganise upon activation. Comparative Haematology International, 1992, 2, 125-132 195) Tapper H., Herwald H.: Modulation of hemostatic mechanisms in bacterial infectious diseases. Blood 2000, 96(7), 2329-2337 196) Textor J.: Platelets in Laminitis. J. Equine Vet. Sci. 2010, 30(9), 506-509 197) Thomason J., Calvert C., Greene C.: Patofizjologia zespołu rozsianego krzepnięcia wewnątrznaczyniowego-zaburzenia procesu hemostazy. Weterynaria po Dyplomie 2006a, 7, 6-11 198) Thomason J., Calvert C., Greene C.: Zespół rozsianego krzepnięcia wewnątrznaczyniowego-rozpoznawanie i leczenie złożonego zespołu chorobowego. Weterynaria po Dyplomie 2006b, 7, 12-18 199) Tinker M.K., White N.A., Lessard P.: Prospective study of equine colic incidence and mortality. Equine Vet. J. 1997, 29, 448-453 200) Topol E.J., Byzova T., Plow E.F.: Platelet GPIIb-IIIa blockers. Lancet 1999, 353(16), 227-231 201) Topper M.J., Prasse K.W.: Analysis of coagulation proteins as acute phase reactants in horses with colic.Am. J. Vet. Res. 1998, 59(5), 542-545 202) Turek B.: Niedrożności jelita grubego u koni. Część II. Życie Weterynaryjne 2004, 79(6), 311-314 203) Vandendries E. R., Furie B. C., Furie B.: Role of P-selectin and PSGL-1 in coagulation and thrombosis. Thromb. Haemost. 2004, 92(3), 459-466 204) Varga-Szabo D., Pleines I., Nieswandt B.: Cell adhesion mechanisms in platelets. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2008, 28, 403-412 205) Wang Ch., Mody M., Herst R., Sher G., Freedan J.: Flow cytometric analysis of platelet function in stored platelet concentrates. Transfusion Science 1999, 20, 129-139 206) Ważna E.: Płytki krwi jako regulatory Post. Hig. Med. Dośw. 2006, 60, 265-277 108 procesów odpornościowych. 207) Weiss D. J., Evanson O.A., McClenahan D., Fagliari J., Walcheck B.: Shear-induced platelet activation and platelet-neutrophil aggregate formation by equine platelets. Am. J. Vet. Res. 1998a, 59(10), 1243-1246 208) Weiss D. J., Evanson O.A., McClenahan D., Fagliari J.: Haemorrheology of equine platelet-neutrophil aggregates. Comp. Haemoatol. Int. 1999, 9, 55-59 209) Weiss D. J., Evanson O.A., McClenahan D., Fagliari, Dunnwiddie C.T.: Effect of a competitive inhibitor of platelet aggregation on experimentally induced laminitis in ponies. Am. J. Vet. Res. 1998b, 59(7), 814-817 210) Weiss D., Evanson O. A.: Detection of activated platelets and platelet-leukocyte aggregates in horses. Am. J. Vet. Res. 1997, 58 (8), 823-827 211) Weiss D.J., Rashid J.: The sepsis-coagulant axis. A review. J. vet. Intern. Med. 1998, 12, 317-324 212) Wersch J.W.J., Houben P., Rijken J.: Platelet count, platelet function, coagulation activity and fibrinolysis in the acute phase of inflammatory bowel disease. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1990, 28, 513-517 213) Wheeler A.P., Rice T.W.: Coagulopathy in critically ill patients:part 2-Soluble clotting factors and hemostatic testing. Chest, 2010, 137(1), 184-194 214) White J.G., Escolar G.: The blood platelet open canalicular system: a two-way street. Eur. J. Cell Biol. 1991, 56(2), 233-242 215) White J.G.: Platelets are covercytes, not phagocytes: uptake of bacteria involves channels of the open canalicular system. Platelets 2005, 16(2), 121-131 216) White J.G.: Uptake of latex particles by blood platelets: phagocytosis or sequestration? Am. J. Pathol. 1972, 69(3), 439-458 217) White J.G.: Why human platelets fail to kill bacteria. Platelets 2006a, 17(3), 191-200 218) White N.A.: Equine colic. 52 Annual Convention of the American Association of Equine Practitioners - AAEP, 2006b - San Antonio, TX, USA 219) Winnicka A.: Badania laboratoryjne z zakresu hemostazy u psów. Część I.: Magazyn Weterynaryjny 2003, 12(75), 52-53 220) Wiśniewski E., Krumrych W., Danek J.: Wpływ endotoksyny E. coli na czas krzepnięcia krwi, zawartość fibrynogenu i liczbę płytek krwi u koni. Medycyna Wet. 1991, 47, 134-136 109 221) Włodarczyk-Szydłowska A., Chełmońska-Soyta A., Nowacki W.: Białka ostrej fazy u koni. Zeszyty Naukowe Akademii Rolniczej we Wrocławiu, Konferencje XXIX, 2000, 360, 69-74 222) Wnuczko K., Szczepański M.: Śródbłonek – charakterystyka i funkcje. Pol. Merk. Lek. 2007, XXIII, 133, 60-65 223) Wrzyszcz A.: Metaloproteinazy płytek krwi. Adv. Clin. Exp. Med. 2003, 12(6), 833-839 224) Wuillemin W.A., Gasser K.M., Zeerleder S.S., Lammle B.: Evaluation of a platelet function analyser (PFA-100) in patients with a bleeding tendency. Swiss Med.Wkly. 2002, 132, 443-448 225) Xu J., Anderson B., Wagner B., Albrecht R., Peek S.F., Suresh M., Darien B.J.: Cloning and functional characterization of recombinant equine P-selectin. Vet. Immunol. Immunopathol. 2007, 116, 115-130 226) Yaguchi A., Lobo F.L., Pradier O.: Platelet function in sepsis. J.Thromb. Haemost. 2004, 2(12), 2096-2102 227) Yeaman M.R.: Platelets in defense against bacterial pathogens. Cell. Mol. Life Sci. 2010, 67, 525-544 228) Yeaman M.R.: The role of platelets in antimicrobial host defense. Clin. Infect. Dis. 1997, 25, 951-970 229) Yilmaz Z., Senturk S., Ilcol Y.: Analysis of hemostasis in horses with colic. Isr. J. Vet. Med. 2002, 57, 56-59 230) Yoshida H., Granger D. N.: Inflammatory bowel disease: a paradigm for the link between coagulation and inflammation. Inflamm. Bowel Dis. 2009, 15(8), 12451255 231) Youssefian T., Drouin A., Masse J.M., Guichard J., Cramer E.M.: Host defense role of platelets:engulfment of HIV and Staphylococcus aureus occurs in a specific subcellular compartment and is enhanced by platelet activation. Blood 2002, 99(11), 4021-4029 232) Zbanyszek M, Procajło A, Stopyra A., Sobiech P., Rajski K.: The coagulation system in horses with colic. Pol. J. Vet. Sci. 2004, 7, 53-58 233) Zougas E., Thorne J., Faldt R., Ankerst J.: Inhibition of platelet aggregation by granulocytes stimulated during experimental trauma. Crit. Care Med. 1990, 18, 845-847 110 8. STRESZCZENIE W praktyce klinicznej u koni istotny problem diagnostyczny i terapeutyczny stanowią choroby morzyskowe będące jedną z najczęstszych przyczyn śmierci tych zwierząt. Rozwijające się w ich przebiegu zaburzenia krążenia, sprzyjają przechodzeniu do krwi uwalnianych endotoksyn bakteryjnych oraz toksyn pochodzących z rozkładu treści jelitowej. Uważa się, iż uwalniane endotoksyny poprzez aktywację układu krzepnięcia i fibrynolizy przyczyniają się do zaburzeń hemostazy, zwiększających ryzyko komplikacji zakrzepowych, jak również wystąpienia skazy krwotocznej w następstwie wyczerpania czynników krzepnięcia. Zaburzenia te warunkują nie tylko pogłębienie zmian czynnościowych narządów, ale również mogą stanowić czynnik decydujący o przebiegu i skuteczności leczenia zespołu morzyskowego. Większość opublikowanych dotychczas prac dotyczących hemostazy w przebiegu morzysk koncentruje się głównie na zmianach hemostazy osoczowej oraz towarzyszącemu zespołowi wewnątrznaczyniowego wykrzepiania - DIC. Nieliczne są badania dotyczące roli i czynności płytek konia w trakcie rozwoju ostrych zaburzeń kolkowych oraz w późniejszym okresie terapii, zwłaszcza po operacyjnym leczeniu niedrożności jelit. Przesłankami tymi kierowano się planując badania, w których postanowiono prześledzić dynamikę zmian w układzie hemostazy u koni w trakcie rozwoju ostrej postaci morzyska, w zestawieniu ze zmianami zachodzącymi w kolejnych dniach po zabiegu laparotomii. Badaniem objęto 50 koni gorącokrwistych podzielonych na dwie grupy: doświadczalną (n = 30) i kontrolną (n = 20). Grupę doświadczalną stanowiły konie leczone chirurgicznie z powodu niedrożności jelit. Grupę kontrolną stanowiło 20 koni nie wykazujących objawów klinicznych. Materiał do badań stanowiła krew pobierana od badanych koni czterokrotnie: przed przystąpieniem do zabiegu (grupa D-0), a następnie w 24 (grupa D-1), 48 (grupa D-2) oraz 72 (grupa D-3) godzinie po operacji. Materiał do badań od koni z grupy kontrolnej był pobierany jednokrotnie. Wykonywano badania hematologiczne, w których uwzględniono: liczbę erytrocytów – RBC, hematokryt – Ht, zawartość hemoglobiny – Hb, liczbę leukocytów – WBC, liczbę płytek krwi – PLT, średnią objętość płytek – MPV, leukogram. Dla oceny hemostazy pierwotnej wykorzystano oprócz określenia liczby i objętości płytek również oznaczenia czasu okluzji (CT). Natomiast z osocza bogatopłytkowego (PRP) przygotowano zawiesinę wykorzystywaną dla oceny funkcji płytek określanej na 111 podstawie ekspresji P-selektyny (CD62P) oraz integryny αIIbβ3 –GP IIb/IIIa (CD 41/61). Dodatkowo jako test czynnościowy płytek przeprowadzono ocenę zdolności tych komórek do pochłaniania (internalizacji) czerwieni obojętnej (NR). Oceny hemostazy wtórnej dokonywano wykonując podstawowe, przesiewowe testy koagulologiczne a to, zawartość fibrynogenu w osoczu, czas tromboplastyny po aktywacji (APTT), czas protrombinowy (PT), czas trombinowy (TT) a także oznaczenie aktywności inhibitorów krzepnięcia tj. antytrombiny (AT) i białka C. Intensywność fibrynolizy oceniano na podstawie poziomu produktów wtórnej fibrynolizy jakie stanowią D-dimery. Na podstawie wyników przeprowadzonych badan stwierdzono, że u koni w przebiegu kolki, przy braku istotnych zmian ogólnej liczby leukocytów, ma miejsce wyraźna zmiana udziału procentowego głównych populacji leukocytów (granulocytów obojętnochłonnych (neutrofilów) – N i limfocytów - L) z równoczesnym przesunięciem obrazu białokrwinkowego w lewo. Relacje te doskonale ilustruje wartość wyliczonego wskaźnika N/L. Wykazano, że u koni przed zabiegiem, w porównaniu do kontroli, wartość wskaźnika wzrosła prawie pięciokrotnie. W kolejnych dniach po laparotomii odnotowano stopniowe obniżanie się jego wartości, jednak nie osiągające poziomu odnotowanego u koni kontrolnych. Stwierdzono również, że u koni przed zabiegiem średni czas okluzji (CT) uległ nieznacznemu skróceniu, podczas gdy w okresie pooperacyjnym odnotowano wyraźne, ponad dwukrotne jego wydłużenie. Okazało się przy tym, że wydłużenie czasu CT nakładało się ze spadkiem liczby płytek oraz zmniejszeniem ich objętości (MPV). Analiza cytometryczna wykazała, zwiększoną ekspresję P-selektyny (CD62P) oraz integryny αIIbβ3 –GP IIb/IIIa (CD 41/61) obserwowaną na płytkach koni doświadczalnych. Stwierdzono przy tym, iż w porównaniu do płytek nieaktywowanych, aktywowane płytki koni kontrolnych jak i doświadczalnych cechuje zwiększona wielkość (wskaźnik FSC > 102 ) a zarazem granularność (wskaźnik SSC > 102). Przedstawionym, u koni doświadczalnych, zmianom czynnościowym płytek towarzyszyło utrzymujące się przez cały okres obserwacji, osłabienie zdolności pochłaniania czerwieni obojętnej (NR). Stwierdzono również, że u koni w przebiegu ostrej postaci morzyska a także w kolejnych dniach po laparotomii, zmianom ilościowym i jakościowym płytek krwi, towarzyszy wzrost poziomu fibrynogenu i D-dimerów oraz wydłużenie czasu PT i APTT, przy niewielkich wahaniach czasu TT . Równocześnie znacznemu osłabieniu uległa aktywność antytrombiny oraz białka C. 112 Pomimo braku wyraźnych objawów klinicznych, u wszystkich koni doświadczalnych odnotowano zmiany w zakresie co najmniej 3 z 6 parametrów ogólnie przyjętych do oceny występowania zespołu rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego (DIC). Na tej podstawie można wnosić, że w przebiegu, wymagającej interwencji chirurgicznej, niedrożności przewodu pokarmowego u koni, subkliniczny przebieg DIC jest zjawiskiem powszechnym. Przeprowadzone badania wykazały, że w przebiegu ostrej niedrożności jelit u konia, dochodzi do wyraźnych, a zarazem istotnych zmian w morfologii i czynności płytek oraz w osoczowym układzie krzepnięcia i fibrynolizy. Uzyskane wyniki nie pozwalaja jednak na jednoznaczne wskazanie, który z badanych parametrów ma większą wartość prognostyczną. Biorąc pod uwagę złożoność interakcji zachodzących w układzie hemostazy, poczynione obserwacje pozwalają wnosić, iż w przebiegu kolek u konia, podczas oceny i analizy zaburzeń hemostazy, przydatna może być tylko ocena całościowa. Pojedyncza ocena poszczególnych elementów może prowadzić do błędnych wniosków. 113
