Polimorfizm epsilon genu apolipoproteiny E i polimorfizm insercyjno

CHILD NEUROLOGY
NEUROLOGIA
DZIECIĘCA
PRACA ORYGINALNA/ORIGINAL ARTICLE
Vol. 14/2005 Nr 28
Polimorfizm epsilon genu apolipoproteiny E
i polimorfizm insercyjno-delecyjny genu ACE
a udar niedokrwienny mózgu u dzieci:
pilotowe badanie związków
Epsilon polymorphism of apolipoprotein E gene
and insertion-deletion polymorphism of ACE gene
and brain ischemic stroke in children: association
pilot-study
Iwona Żak, 1Anna Balcerzyk, 1Beata Sarecka, 1Paweł Niemiec, 2Ilona
Kopyta, 2Ewa Emich-Widera, 2Elżbieta Marszał
1
Katedra i Zakład Biochemii i Genetyki Medycznej Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach
Kierownik: dr hab. n. med. I. Żak
2
Katedra i Klinika Pediatrii i Neurologii Wieku Rozwojowego Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach
Kierownik: prof. dr hab. n. med. E. Marszał
1
Streszczenie
Słowa kluczowe: udar
niedokrwienny mózgu,
apolipoproteina E, konwertaza angiotensynowa, polimorfizm
Cel pracy: Analiza związku polimorfizmów epsilon genu APOE i I/D genu ACE z dokonanym udarem niedokrwiennym mózgu u dzieci z uwzględnieniem ciężkości stanu pacjenta. Materiał i metody: Badaniami objęto 218 osób rasy kaukaskiej, w tym: dzieci po udarze niedokrwiennym mózgu
(n = 17), ich rodziców (n = 33) oraz grupę kontrolną (n = 168). Grupa dzieci po udarze mózgu
została podzielona na 2 podgrupy w zależności od ciężkości stanu klinicznego pacjenta w okresie
ostrym oraz dalszego przebiegu choroby i odległych następstw oraz pod względem płci. Grupę
kontrolną również podzielono na 2 podgrupy: dzieci zdrowe (n = 53) oraz dobrowolnych dawców
krwi (n = 115). Polimorfizm epsilon genu APOE analizowano techniką RFLP-PCR, polimorfizm
insercyjno/delecyjny genu ACE metodą PCR. Wyniki: Wykazano, że w grupie dzieci po udarze
niedokrwiennym mózgu częstość allelu ε4 genu apolipoproteiny E jest znamiennie wyższa w porównaniu zarówno z całą grupą kontrolną (0,23 vs 0,08, p = 0,01, OR = 3,36), jak i podgrupą osób
zdrowych do 20 roku życia (0,05, p = 0,01, OR = 6,26). Szczególnie duże różnice w częstościach
allelu ε4 oraz nosicieli tego allelu stwierdzono między podgrupami płci męskiej (p = 0,003 dla allelu
i p = 0,02 dla nosicielstwa). Różnice wykazano także pomiędzy podgrupami chorych wyodrębnionymi na podstawie ciężkości stanu pacjenta. Stwierdzono znacznie niższą częstość allelu ε4 w
grupie w stanie klinicznym ciężkim niż w grupie w stanie dość dobrym (p = 0,03). Wykazano, że
częstość allelu I polimorfizmu ACE jest wyższa w podgrupie pacjentów w stanie klinicznym ciężkim (0,78) w porównaniu do pacjentów w stanie klinicznym dość dobrym (0,42). Po zróżnicowaniu
badanych grup ze względu na płeć stwierdzono, że częstość allelu I jest znamiennie wyższa w
podgrupie dziewcząt po udarze (0,72) w porównaniu do podgrupy dziewcząt zdrowych (0,39) (p =
0,01, OR = 4,00). Wyniki te wymagają potwierdzenia na liczniejszej grupie pacjentów.
Abstract
Key words: brain ischemic stroke, APOE,
ACE, polymorphism
Aim: Analysis of association between epsilon polymorphism of APOE gene and I/D polymorphism of ACE gene and brain ischemic stroke in children with considering of state after stroke
and gender. Material and methods: The study included 218 Caucasian subjects: children with
brain ischemic stroke (n = 17), their parents (n = 33) and control group (n = 168). Study group of
children after brain stroke was divided into two subgroups dependently on the state of patients in
acute phase and in further development of the disease and noticeable distant consequences and
considering gender. Control group were also divided into two subgroups: healthy subjects aged <
20 years (n = 53) and aged 21–40 years (n = 115). The epsilon polymorphism of APOE gene was
analyzed using PCR-RFLP method and insertion/deletion polymorphism in ACE gene was analyzed using PCR. Results: There was shown significantly higher frequency of ε4 allele of APOE
Vol. 14/2005, Nr 28
15
Iwona Żak, Anna Balcerzyk, Beata Sarecka et al.
gene in group of children after brain ischemic stroke in comparison to entire control group (0.23 vs
0.08, p = 0.01, OR = 3.36), as well as to healthy subjects up to 20 years old (0.05, p = 0.01, OR
= 6.26). Especially significant differences in the frequency of ε4 allele and ε4 allele carriers were
observed between male subgroups (p = 0.003 for allele and p = 0.02 for carriers). The differences
were also obtained between subgroups of patients divided dependently on the state of patients.
There was signifficantly lower frequency of ε4 allele in the subgroup of patients in serious state
comparing to patients in good state (p = 0.03). We also demonstrate that frequency of I allele of
ACE I/D polymorphism is significantly higher in subgroup of patients in serious state (0.78) compared to patients in good state (0.42). After considering the gender we found that frequency of I
allele is significantly higher in subgroup of girls after stroke (0.72) compared to subgroup of healthy
girls (0.39) (p = 0.01, OR = 4.00).These results need confirmation on larger group of patients.
Wstęp
Udar niedokrwienny mózgu jest trzecią co do częstości przyczyną zgonów osób dorosłych. Chociaż choroba ta u dzieci występuje znacznie rzadziej (z częstością
około 1/100 000/rok) pozostaje ważnym problemem
społecznym ze względu na deficyty neurologiczne, które pozostają u ok. połowy pacjentów. Etiologia udarów
u dzieci jest słabo poznana i składają się na nią prawdopodobnie liczne czynniki środowiskowe i genetyczne.
Za udziałem tych ostatnich przemawia fakt, że udary
niedokrwienne mózgu pięciokrotnie częściej występują u par bliźniąt jednojajowych w porównaniu z dwujajowymi [1]. Czynnik genetyczny może być szczególnie
istotny u osób młodych, u których udział czynników
środowiskowych nie jest jeszcze tak znaczący. W nielicznych przypadkach do powstania udarów u dzieci
mogą prowadzić rzadkie choroby uwarunkowane jednogenowo, np. rodzinna hipercholesterolemia [2] czy
anemia sierpowata [3]. Wśród zaburzeń genetycznych
mogących odgrywać rolę w etiopatogenezie udaru
niedokrwiennego mózgu u dzieci szczególna rola jest
przypisywana polimorfizmom w genach fibrynogenu
[4], reduktazy metylenetetrahydrofolianowej, czynników krzepnięcia V i VII [5] oraz konwertazy angiotensynowej [6]. Jednak najczęściej genetyczne podłoże
udarów niedokrwiennych mózgu jest uwarunkowane
wielogenowo. W światowej literaturze niewiele jest
doniesień na ten temat.
Podłoże genetyczne chorób naczyń mózgowych
mogą stanowić geny polimorficzne, których produkty
białkowe uczestniczą w patogenezie choroby [7, 8].
Genów kandydatów chorób naczyń mózgowych poszukuje się między innymi wśród genów kodujących
białka biorące udział w zaburzeniach gospodarki lipidowej oraz wśród genów kodujących składniki układu
renina-angiotensyna (RAS).
Poza rzadko występującym schorzeniem monogenowym – hipercholesterolemią rodzinną, uwarunkowaną mutacjami w genie receptora LDL, stężenie
cholesterolu i innych lipidów w osoczu może być wynikiem funkcjonalnego współdziałania ze sobą wielu
genów. Do ważniejszych czynników genetycznych,
wpływających na poziom cholesterolu w osoczu, na16
leży polimorfizm genu apolipoproteiny E (apo E). Apo
E jest syntetyzowana głównie w wątrobie, występuje w
remnantach chylomikronów i VLDL, umożliwiając ich
usuwanie z krążenia, dzięki pełnionej funkcji liganda
dla dwóch ważnych receptorów dla lipoprotein, mianowicie receptora LDL i receptora LRP. Polimorfizm
genu APOE odpowiedzialny jest za istnienie trzech
izoform tej apolipoproteiny: E2, E3, E4, które kodowane są przez trzy allele ε2, ε3, ε4. Ze względu na różne
powinowactwo poszczególnych izoform do receptora
lipoprotein, polimorfizm ten wpływa na profil lipidowy osocza. W mózgu i płynie mózgowo-rdzeniowym,
gdzie brakuje głównych osoczowych transporterów
lipidów endogennych, lipoprotein o niskiej gęstości
(LDL), apoE, która jest podstawową apoproteiną płynu mózgowo-rdzeniowego, pełni funkcję białkowego
transportera lipidów. Funkcje apo E wykraczają jednak
znacznie poza jej udział w regulacji metabolizmu lipidów. Liczne prace dowodzą, że apo E jest zaangażowana w modulowanie odpowiedzi zapalnej, regulację
funkcji płytek krwi, zjawiska apoptozy i stresu oksydacjnego [9].
Konwertaza angiotensynowa (ACE) bierze udział
w proteolitycznym przekształceniu angiotensyny I w
aktywną angiotensynę II, jak również w inaktywacji
bradykininy [10]. Angiotensyna II pobudza wzrost i
proliferację miocytów naczyniowych, a także skurcz
mięśni gładkich ściany tętnic. Posiada również właściwości aktywowania śródbłonka naczyniowego, manifestowane syntezą i ekspresją na powierzchni błony receptorów adhezyjnych (VCAM, ICAM, CD-62E) oraz
sekrecją chemokin (MCP-1). Zjawiska stymulowane
przez angiotensynę II należą do kluczowych w patogenezie miażdżycy.
Wykazano, że polimorfizm insercyjno-delecyjny
(I/D) w genie ACE ma związek ze stężeniem ACE w
osoczu [11]. Homozygoty DD charakteryzują się aktywnością ACE większą co najmniej dwukrotnie, w
porównaniu do homozygot II. Heterozygoty ID charakteryzują się aktywnością pośrednią. Bazując na powyższych informacjach wykazano, że genotyp DD może
być czynnikiem ryzyka choroby niedokrwiennej serca
i zawału mięśnia sercowego w niektórych populacjach
[12, 13]. Związek ten został potwierdzony i udokumenNeurologia Dziecięca
Polimorfizm epsilon genu apolipoproteiny E i polimorfizm insercyjno-delecyjny genu ACE...
towany badaniami własnymi w populacji pacjentów
kardiologicznych z Górnego Śląska [14]. Wpływ polimorfizmu genu ACE na ryzyko wystąpienia choroby
niedokrwiennej serca może sugerować jego udział w
tworzeniu genetycznego podłoża udarów niedokrwiennych mózgu, zarówno u dorosłych, jak i u dzieci.
Autorzy prowadzą badania nad genetycznym podłożem chorób naczyń mózgowych, w tym udaru niedokrwiennego mózgu u dzieci. Celem niniejszej pracy
jest analiza związku polimorfizmów epsilon genu apolipoproteiny E oraz insercyjno/delecyjnego genu konwertazy angiotensynowej (ACE) z dokonanym udarem
niedokrwiennym mózgu u dzieci z uwzględnieniem
ciężkości stanu pacjenta i następstw.
Materiał i metody
Badaniami objęto 218 białych osób rasy kaukaskiej,
w tym dzieci po dokonanym udarze niedokrwiennym
mózgu, ich rodziców, osoby zdrowe do 20 roku życia
bez klinicznych objawów neurologicznych i bez obciążeń rodzinnych chorobami sercowo-naczyniowymi w
wywiadzie oraz dobrowolnych dawców krwi w wieku
21–40 lat bez obciążeń rodzinnymi chorobami sercowo-naczyniowymi w ankiecie.
Grupę pacjentów stanowiło siedemnaścioro dzieci
i młodych dorosłych w wieku od 2 do 27 lat (9 dziewcząt, 8 chłopców), którzy byli hospitalizowani w ostrej
fazie niedokrwienia mózgu w Klinice Neurologii Wieku Rozwojowego ŚAM w Katowicach i nadal są objęci
opieką ambulatoryjną. Dokonany udar niedokrwienny
mózgu rozpoznano zgodnie z obowiązującymi kryteriami klinicznymi i potwierdzono badaniami neuroobrazującymi (TK i MR). Ocenę neurologiczną stanu
pacjentów (grupa 1) przeprowadzano w skali Orgogozo, nazywanej przez autora „skalą tętnicy środkowej
mózgu”. Skala ta pozwala na dokonanie obiektywnej
oceny stanu świadomości, kontaktu słownego, ruchów
oraz napięcia mięśniowego w obrębie kończyny górnej
i dolnej, a także ruchów głowy i gałek ocznych. Uzyskanie 100 punktów oznacza, iż pacjent jest w pełnym,
logicznym kontakcie słownym, nie stwierdza się także deficytów neurologicznych (porażenia/niedowłady
kończyn oraz mięśni twarzy), a ruchy głowy i gałek
ocznych są prawidłowe. Mniejsza od 100 liczba punktów oznacza z kolei obecność deficytów ruchowych,
zaburzeń świadomości i/lub zaburzeń mowy. Grupę
pacjentów podzielono na dwie podgrupy w zależności
od ciężkości stanu pacjenta w okresie ostrym, od początku wystąpienia objawów klinicznych oraz dalszego
przebiegu choroby i widocznych odległych następstw:
pacjentów w stanie ciężkim (śpiączka, porażenie lub
niedowład znacznego stopnia, poniżej 55 punktów w
skali Orgogozo; n = 9; wiek w czasie ostatnich badań
kontrolnych od 8 do 27 lat) – podgrupa 1a; pacjentów w
Vol. 14/2005, Nr 28
stanie dość dobrym (niedowład średnio lub słabo wyrażony, bez zaburzeń świadomości, powyżej 55 punktów
w skali Orgogozo; n = 6; wiek w czasie ostatnich badań
kontrolnych od 2 do 17 lat) – podgrupa 1b.
Dwie pacjentki spośród całej grupy chorych nie
mogą być zakwalifikowane do żadnej z podgrup ze
względu na brak widocznych następstw poudarowych.
Grupę rodziców pacjentów stanowiło trzydziestu
trzech zdrowych rodziców w wieku od 28 do 53 lat.
Matka jednego pacjenta zmarła z powodu tętniaków
tętnic nerkowych (grupa 2).
Grupę kontrolną stanowiło sto sześćdziesiąt osiem
osób bez klinicznych objawów neurologicznych i bez
obciążeń rodzinnymi chorobami sercowo-naczyniowymi w wywiadzie w wieku od 7 do 40 lat (♀ n = 59, ♂ n
= 109). Osoby te były rekrutowane spośród pacjentów
Kliniki Neurologii Wieku Rozwojowego ŚAM w Katowicach oraz dobrowolnych dawców krwi (grupa 3).
Grupę tę podzielono na dwie podgrupy w zależności od
wieku: osoby do 20 roku życia, n = 53, ♀ n = 33,♂ n =
20 (grupa 3a), osoby między 21 a 40 rokiem życia, n =
115, ♀ n = 26, ♂ n = 89 (grupa 3b).
Wszystkie osoby włączone do badań wyraziły chęć
uczestniczenia w nich zgodnie z zasadami etycznymi i
organizacją badań naukowych, na które uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej przy Śląskiej Akademii Medycznej.
Analizy biochemiczne
Krew do badań pobierano z żyły odłokciowej po 12–
–24-godzinnej przerwie w przyjmowaniu pokarmów.
Stężenia wskaźników gospodarki lipidowej: cholesterolu całkowitego, cholesterolu HDL i trójglicerydów
oznaczano w świeżej surowicy za pomocą gotowych
zestawów firmy Analco i spektrofotometru UV-VIS
MINI 1240 firmy Schimadzu. Stężenie cholesterolu
LDL obliczono wg wzoru Friedewalda [15].
Analizy genetyczne
Izolację DNA z limfocytów krwi obwodowej wykonywano z użyciem gotowego zestawu MasterPureTM
Genomic DNA Purification Kit (Epicentre Technologies). Stężenie i czystość izolatów DNA mierzono
spektrofotometrycznie przy λ = 260/280 nm.
Polimorfizm epsilon genu APOE genotypowano techniką PCR-RLFP (Polymerase Chain Reaction
– Restriction Fragments Lenght Polymorphism), która
obejmuje następujące etapy:
Reakcję łańcuchową polimerazy (PCR), która umożliwia namnożenie badanego fragmentu genu APOE.
Wykorzystano następującą parę oligonukleotydowych
starterów [16]:
5’-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3,
17
Iwona Żak, Anna Balcerzyk, Beata Sarecka et al.
5’-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3’
Reakcję prowadzono w termocyklerze gradientowym Tgradient 96 firmy Biometra w następujących
warunkach: 1) wstępna denaturacja DNA: 950C – 5
min, 2) denaturacja: 950C – 1 min, 3) przyłączanie starterów: 640C – 1 min, 4) wydłużanie nici DNA: 720C – 1
min, etapy 2, 3, 4 powtarzano dwukrotnie, obniżając
temp. przyłączania starterów o 1 stopień co 2 cykle aż
do temp. 610C, 5) denaturacja: 950C – 1 min, 6) przyłączanie starterów: 600C – 1 min, 7) wydłużanie nici
DNA: 720C – 2 min, etapy 5, 6, 7 powtarzano cyklicznie 20 razy, 8) końcowe wydłużanie 720C – 30 min.
Trawienie enzymem restrykcyjnym HhaI produktu reakcji PCR. Restrykcję przeprowadzano w temp. 370C,
przez 16 godzin, używając 2,5 U enzymu na 8,65 μl
amplifikatu. Na skutek trawienia uzyskiwano następujące fragmenty: dla allelu ε2 – 38, 83, 91 par zasad (pz),
dla ε3 – 35, 38, 48, 91 pz, dla ε4 – 35, 38, 48, 72 pz.
Elektroforezę i wizualizację DNA, umożliwiające
detekcję określonej formy polimorficznej.
Produkty trawienia rozdzielano elektroforetycznie
na 8% żelu poliakrylamidowym z 5% glicerolem w buforze 1xTBE o pH 8,3. DNA po elektroforezie barwiono azotanem srebra zgodnie ze standardową procedurą
dla DNA. Następnie żele suszono i dokumentowano za
pomocą systemu UV i VIS Docprint firmy Vilber Lourmat.
Polimorfizm insercyjno/delecyjny genu ACE genotypowano techniką PCR (ang. polymerase chain reaction), obejmującą następujące etapy:
1. Reakcję PCR, która umożliwia namnożenie badanego fragmentu genu konwertazy angiotensyny I z
parą oligonukleotydowych starterów opisanych wcześniej [12]. Reakcję przeprowadzano w termocyklerze
gradientowym Tgradient 96 firmy Biometra w warunkach wg własnego opracowania: wstępna denaturacja
w 94oC przez 5 min; 30 cykli obejmujących: denaturację w 92oC przez 1 min, przyłączanie starterów w
52oC przez 1 min, wydłużanie w 72oC przez 2 min. 30
s; końcowe wydłużanie w 72oC przez 6 min; schłodzenie w 4oC. Wielkość produktu allelu I wynosi 490 par
zasad (pz), natomiast allelu D wynosi 190 pz.
2. Elektroforezę i wizualizację DNA. Produkty reakcji PCR rozdzielano elektroforetycznie na 2% żelu
agarozowym w roztworze buforowym TBE 1x o pH
8,3. Rozdzielone fragmenty DNA uwidaczniano na
elektroforogramach bromkiem etydyny. Żele suszono
i dokumentowano przy użyciu systemu dokumentacji
żeli Docprint core UV-Vis firmy Vilber Lourmat.
Analiza statystyczna
Uzyskane wyniki analizowano za pomocą programu
EpiInfo-6 (WHO). Częstości alleli ustalono na podstawie częstości genotypów. Zgodność rozkładu z równo18
wagą Hardy-Weinberga określono za pomocą testu χ2.
Porównanie częstości genotypów i alleli między grupami badanymi wykonano testem χ2. W przypadku gdy
liczba danych była mniejsza niż 5, stosowano dodatkowo test dokładny Fishera. Za istotne statystycznie różnice przyjmowano te wartości, dla których p < 0,05.
Siłę asocjacji poszczególnych alleli i genotypów z
dokonanym udarem niedokrwiennym mózgu określono na podstawie wartości współczynnika ilorazu szans
(ang. odds ratio – OR) z przedziałem ufności 95% CI.
Wyniki i dyskusja
Wiek poszczególnych pacjentów w chwili wystąpienia ostrego niedokrwienia mózgu wahał się w granicach od 14 miesiąca życia do 15 roku życia. Badania
kontrolne przeprowadzano w warunkach ambulatoryjnych, ostatnie po upływie 10 miesięcy do 12 lat od wystąpienia udaru, odpowiednio w wieku pacjentów 2 do
27 lat. Udar mózgu u wszystkich pacjentów dotyczył
przedniego krągu unaczynienia mózgu PACI (ang. Partial Anterior Circulation Infarct). Pełną charakterystykę pacjentów pod względem klinicznym i biochemicznym przedstawiono we wcześniejszej publikacji, gdzie
szczegółowo opisano objawy udaru w fazie ostrej i
najczęstsze odległe następstwa udaru oraz szczegóły
klinicznych badań kontrolnych [17].
We wcześniejszym doniesieniu wykazano [18], że
u badanych dzieci z dokonanym udarem niedokrwiennym mózgu współwystępowało wiele różnych czynników ryzyka chorób naczyniowych mózgu, najczęściej
dyslipidemie, w tym hipercholesterolemia u 6 pacjentów, hipertrójglicerydemia u 2, hiperlipoproteinemia u
4, dyslipidemia mieszana u jednego pacjenta, dodatkowo zespół antyfosfolipidowy u 2 pacjentów, deficyt
białka S u 4 pacjentów, oporność na aktywną postać
białka C APCR (ang. Activated Protein C Resistance) u
dwóch pacjentów i deficyt białka C u jednego pacjenta.
Stwierdzono współwystępowanie przynajmniej dwóch
czynników ryzyka u 9 dzieci.
Wyniki wskaźników gospodarki lipidowej surowicy przedstawiono w tabeli I.
Stwierdzono istotną statystycznie różnicę pomiędzy
grupą chorych (gr. 1) a zdrowymi dziećmi (gr. 3a) w
stężeniu cholesterolu całkowitego oraz cholesterolu
LDL (p = 0,014 i p = 0,004).
Zdrowi rodzice dzieci po udarze niedokrwiennym
mózgu nie odbiegają znacząco od normy pod względem parametrów gospodarki lipidowej surowicy, nie
wykazano znamiennych statystycznie różnic w porównaniu z krwiodawcami (tab. I).
Polimorfizm APOE. Rozkłady częstości genotypów
i alleli genu apolipoproteiny E w badanych grupach
oraz rozkłady w podgrupach z uwzględnieniem płci
przedstawiono w tabeli II. Rozkłady we wszystkich
Neurologia Dziecięca
Polimorfizm epsilon genu apolipoproteiny E i polimorfizm insercyjno-delecyjny genu ACE...
Tab. I. Wskaźniki gospodarki lipidowej w surowicy wśród badanych grup. Parameters of serum lipids levels among
study groups
mediana
lub
średnia
Cholesterol
całkowity
(mmol/l)
Cholesterol HDL
(mmol/l)
Cholesterol LDL
(mmol/l)
Trójglicerydy
(mmol/l)
3,13 (1,71–4,32)*
1,10 (0,54–2,54)
pacjenci (grupa 1)
Mediana
(min.-max.)
4,53 (3,81–5,96)*
1,11 (0,67–2,05)
pacjenci w stanie ciężkim (podgrupa 1a)
Mediana
(min.-max.)
4,53 (3,91–5,96)
1,11 (0,67–2,05)
3,00 (1,71–4,32)
1,01 (0,54–2,54)
pacjenci w stanie dość dobrym (podgrupa 1b)
Mediana
(min.-max.)
4,87 (4,14–5,83)
1,37 (0,85–1,55)
3,26 (2,28–4,12)
1,14 (0,62–2,06)
2,84 ± 1,12
1,24 ± 0,68
2,56 (1,29–4,35)
0,90 (0,36–3,48)
rodzice pacjentów (grupa 2)
Średnia ± SD
4,49 ± 1,04
1,07 ± 0,42
dzieci zdrowe (podgrupa 3a)
Mediana
(min.-max.)
4,09 (2,61–6,73)
1,07 (0,47–2,59)
dobrowolni dawcy krwi (podgrupa 3b)
Średnia ± SD
4,98 ± 1,31
1,04 ± 0,39
3,28 ± 1,15
1,36 ± 0,62
* Dane są znamienne statystycznie. * Statistically significant data
Tab. II. Dystrybucja częstości genotypów i alleli polimorfizmu epsilon genu APOE wśród badanych grup. Distribution of genotypes and alleles frequencies of epsilon polymorphism in APOE gene among study groups
GENOTYPY*
GRUPA
n
ALLELE
ε3ε3
ε3ε4
ε3ε2
ε4ε4
ε4ε2
ε3
ε4
ε2
17
n
częst
10
0,59
2
0,12
2
0,12
3
0,17
0
0
24
0,71
8
0,23
2
0,06
♀
9
n
częst
6
0,67
0
0
2
0,22
1
0,11
0
0
14
0,78
2
0,11
2
0,11
♂
8
n
częst
4
0,50
2
0,25
0
0
2
0,25
0
0
10
0,63
6
0,37
0
0
(1a) w stanie
ciężkim1
9
n
częst
8
0,89
0
0
0
0
1
0,11
0
0
16
0,90
2
0,10
0
0
(1b) w stanie
dość dobrym2
6
n
częst
2
0,33
2
0,33
0
0
2
0,33
0
0
6
0,50
6
0,50
0
0
Pacjenci (1)
Vol. 14/2005, Nr 28
19
Iwona Żak, Anna Balcerzyk, Beata Sarecka et al.
27
n
częst
17
0,63
7
0,26
3
0,11
0
0
0
0
44
0,82
7
0,13
3
0,05
137
n
częst
101
0,74
22
0,16
13
0,09
0
0
1
0,01
237
0,87
23
0,08
14
0,05
♀
45
n
częst
33
0,73
7
0,16
5
0,11
0
0
0
0
78
0,87
7
0,08
5
0,05
♂
92
n
częst
68
0,74
15
0,16
8
0,09
0
0
1
0,01
159
0,86
16
0,09
9
0,05
32
n
częst
23
0,72
3
0,09
6
0,19
0
0
0
0
55
0,86
3
0,05
6
0,09
♀
21
n
częst
14
0,67
3
0,14
4
0,19
0
0
0
0
35
0,83
3
0,07
4
0,01
♂
11
n
częst
9
0,82
0
0
2
0,18
0
0
0
0
20
0,91
0
0
2
0,09
105
n
częst
78
0,74
19
0,18
7
0,07
0
0
1
0,01
182
0,87
20
0,09
8
0,04
♀
24
n
częst
19
0,79
4
0,17
1
0,04
0
0
0
0
43
0,90
4
0,08
1
0,02
♂
81
n
częst
59
0,73
15
0,19
6
0,07
0
0
1
0,01
139
0,86
16
0,10
7
0,04
Rodzice pacjentów (2)
Gr. kontrolna (3)
(3a) do 20 lat
(3b) 21-40 lat
Porażenie lub niedowład znacznego stopnia, śpiączka, poniżej 55 punktów75 w skali Orgogozo.
Niedowład średnio lub słabo wyrażony, bez zaburzeń świadomości, powyżej 55 punktów w skali Orgogozo.
* Nie uwzględniono genotypu ε2ε2 ponieważ nie obserwowano takiego genotypu w żadnej grupie.
1
2
Tab. III. Dystrybucja częstości genotypów i alleli polimorfizmu insercyjno/delecyjnego genu ACE wśród badanych
grup. Distribution of genotypes and alleles frequencies of insertion/deletion polymorphism in ACE gene among
study groups
GENOTYPY
GRUPA
n
II
ID
DD
I
D
17
n
częstość
8
0,47
7
0,41
2
0,12
23
0,68
11
0,32
♀
9
n
częstość
5
0,56
3
0,33
1
0,11
13
0,72
5
0,28
♂
8
n
częstość
3
0,38
4
0,50
1
0,12
10
0,63
6
0,37
(1a) w stanie
ciężkim1
9
n
częstość
5
0,56
4
0,44
0
0
14
0,78
4
0,22
(1b) w stanie
dość dobrym2
6
n
częstość
1
0,17
3
0,50
2
0,33
5
0,42
7
0,58
Pacjenci (1)
20
ALLELE
Neurologia Dziecięca
Polimorfizm epsilon genu apolipoproteiny E i polimorfizm insercyjno-delecyjny genu ACE...
33
n
częstość
14
0,42
15
0,46
4
0,12
43
0,65
23
0,35
168
n
częstość
44
0,26
88
0,52
36
0,22
176
0,52
160
0,48
♀
59
n
częstość
11
0,19
32
0,54
16
0,27
54
0,46
64
0,54
♂
109
n
częstość
33
0,30
56
0,52
20
0,18
122
0,56
96
0,44
53
n
częstość
12
0,23
29
0,54
12
0,23
53
0,50
53
0,50
♀
33
n
częstość
4
0,12
18
0,55
11
0,33
26
0,39
40
0,61
♂
20
n
częstość
8
0,40
11
0,55
1
0,05
27
0,68
13
0,32
115
n
częstość
32
0,28
59
0,51
24
0,21
123
0,54
107
0,46
♀
26
n
częstość
7
0,27
14
0,54
5
0,19
28
0,54
24
0,46
♂
89
n
częstość
25
0,28
45
0,51
19
0,21
95
0,53
83
0,47
Rodzice pacjentów (2)
Gr. kontrolna (3)
(3a) do 20 lat
(3b) 21-40 lat
1
2
Porażenie lub niedowład znacznego stopnia, śpiączka, poniżej 55 punktów w skali Orgogozo.
Niedowład średnio lub słabo wyrażony, bez zaburzeń świadomości, powyżej 55 punktów w skali Orgogozo.
Tab. IV. Porównanie częstości allelu ε4 i nosicieli allelu ε4 genu APOE oraz częstości allelu I genu ACE między
pacjentami a grupą kontrolną z uwzględnieniem płci oraz między pacjentami w stanie ciężkim a pacjentami w
stanie dość dobrym za pomocą testu χ2 i testu dokładnego Fishera. Comparison of ε4 allele and ε4 allele carriers of APOE gene and allele I of ACE gene between patients and control group considering gender and between
patients in serious state and patients in rather good state using χ2 test and Fisher’s exact test
POLIMORFIZM EPSILON GENU APOE
test
ALLEL ε4
nosiciele allelu ε4 (ε3ε4 + ε4ε4)
Pacjenci po udarze (1) n = 17 / zdrowe dzieci (3a) n = 32
χ2 (p)
Fisher jednostronny
Fisher dwustronny
OR (95% CI)
7,91 (p = 0,005)*
p = 0,01*
p = 0,01*
6,26 (1,35–32,71)
3,26 (p = 0,07)
p = 0,08
p = 0,11
Pacjenci po udarze (1) n = 17 / cała grupa kontrolna (3) n = 137
χ2 (p)
Fisher jednostronny
Fisher dwustronny
OR (95% CI)
7,65 (p = 0,01)*
p = 0,01*
p = 0,01*
3,36 (1,24–8,92)
1,82 (p = 0,18)
p = 0,15
p = 0,18
♂ po udarze (1) n = 8 / ♂ zdrowe dzieci (3a) n = 11
χ2 (p)
Fisher jednostronny
Fisher dwustronny
Vol. 14/2005, Nr 28
9,80 (p = 0,002)*
p = 0,003*
p = 0,003*
6,97 (p = 0,01)*
p = 0,02*
p = 0,02*
21
Iwona Żak, Anna Balcerzyk, Beata Sarecka et al.
Pacjenci w stanie ciężkim (1a) n = 9 / Pacjenci w stanie dość dobrym (1b) n = 6
χ2 (p)
Fisher jednostronny
Fisher dwustronny
OR (95% CI)
5,57 (p = 0,02)*
p = 0,03*
p = 0,03*
0,13 (0,01–1,02)
5,0 (p = 0,03)*
p = 0,05
p = 0,09
0,06 (0,0–1,34)
POLIMORFIZM INSERCYJNO/DELECYJNY GENU ACE
ALLEL I
test
♂ po udarze (1) n = 9 / ♂ zdrowe (3a) n = 33
χ2 (p)
OR (95% CI)
6,13 (p = 0,01)*
4,00 (1,14–14,77)
Pacjenci w stanie ciężkim (1a) n = 9 / Pacjenci w stanie dość dobrym (1b) n = 6
χ (p)
Fisher jednostronny
Fisher dwustronny
OR (95% CI)
2
4,04 (p = 0,04)*
p = 0,05
p = 0,06
4,90 (0,78–34,28)
* Różnice są znamienne statystycznie. * Statistically significant data.
badanych grupach, z wyjątkiem chorych, były zgodne
z równowagą Hardy-Weinberga. Istotne statystycznie
różnice w częstościach alleli i genotypów między badanymi grupami przedstawiono w tabeli IV.
Porównanie grupy chorych dzieci (1) z grupą zdrowych osób do 20 roku życia (3a) wykazało istotne statystycznie różnice w częstościach allelu ε4 (0,23 vs 0,05,
p = 0,01). Nieco mniejsze różnice, ale również istotne,
stwierdzono porównując chorych z całą grupą kontrolną
(0,23 vs 0,08, p = 0,01). Częstość nosicieli allelu ε4 (genotypy ε3ε4, ε4ε4) była również wyższa wśród chorych
(0,29) zarówno w porównaniu z młodymi, zdrowymi
osobami (0,09), jak i z całą grupą kontrolną (0,16), różnice te jednak nie były istotne statystycznie.
Szczególnie duże różnice w częstościach allelu ε4
oraz nosicieli tego allelu stwierdzono między podgrupami płci męskiej. Częstość allelu ε4 u chorych
chłopców wynosiła 0,37, a częstość nosicieli tego allelu – 0,50, podczas gdy wśród zdrowych chłopców
nie stwierdzono nosicieli allelu ε4 (p = 0,003 oraz p
= 0,02 odpowiednio). Różnice w rozkładzie częstości
genotypów i alleli pomiędzy grupą rodziców a grupą
kontrolną nie były istotne statystycznie.
Znaczące różnice stwierdzono natomiast pomiędzy
podgrupami chorych wyodrębnionymi na podstawie
ciężkości stanu pacjenta w okresie ostrym, od początku
wystąpienia objawów klinicznych oraz dalszego przebiegu choroby i widocznych następstw odległych. W
podgrupie w stanie dość dobrym częstość allelu ε4 była
znacznie wyższa w porównaniu z podgrupą w stanie
ciężkim (0,50 vs 0,10, p = 0,03). Podobne różnice dotyczyły częstości nosicieli allelu ε4 (0,66 vs 0,11).
Polimorfizm ACE. Dystrybucję wariantów polimorfizmu insercyjno/delecyjnego genu ACE w badanych
22
grupach przedstawia tabela III. Istotne statystycznie
różnice w częstościach alleli i genotypów między badanymi grupami przedstawiono w tabeli IV.
W grupie pacjentów stwierdzono wyższą częstość
allelu insercyjnego oraz nosicieli tego allelu niż w grupie kontrolnej. Analiza podgrup pacjentów w zależności od stanu wykazała, że homozygotyczny genotyp II
występuje znacznie częściej u pacjentów w stanie ciężkim (0,56) w porównaniu do grupy pacjentów w stanie
dość dobrym (0,17). W podgrupie pacjentów w stanie
ciężkim nie stwierdzono występowania genotypu DD.
W podgrupach kontrolnych (3a i 3b) częstość genotypu II jest na porównywalnym poziomie (odpowiednio
0,23 i 0,28) i w porównaniu do grupy rodziców jest
prawie 2-krotnie niższa (0,42). Wykazane różnice nie
są znamienne statystycznie.
Podobne tendencje zaobserwowano w dystrybucji
alleli analizowanego polimorfizmu genu ACE. Częstość allelu I jest wyższa w grupie pacjentów (0,68) niż
w grupie kontrolnej (0,52). Częstość allelu I w podgrupie pacjentów w stanie ciężkim jest prawie dwukrotnie wyższa w porównaniu do pacjentów w stanie dość
dobrym (0,78 vs 0,42). Nie stwierdzono znamiennych
różnic w częstościach allelu I między rodzicami chorych dzieci (0,65) a podgrupą dobrowolnych dawców
krwi (0,54).
Cała grupa pacjentów (n = 17) charakteryzuje się
najniższą częstością występowania heterozygot ID.
Częstości heterozygot ID w podgrupie pacjentów w
stanie dość dobrym (0,50) są nieznacznie wyższe w
porównaniu z podgrupą pacjentów w stanie ciężkim
(0,44). U rodziców pacjentów i w grupie kontrolnej
wartości te są na porównywalnym poziomie (0,46 vs
0,52).
Neurologia Dziecięca
Polimorfizm epsilon genu apolipoproteiny E i polimorfizm insercyjno-delecyjny genu ACE...
Liczba nosicieli allelu I (osoby z genotypami II +
ID) w grupie pacjentów jest taka sama jak w grupie
rodziców (0,88 vs 0,88). Najwyższą częstość występowania nosicieli allelu I zaobserwowano w podgrupie
pacjentów w stanie ciężkim (1,00), najniższą charakteryzuje się podgrupa pacjentów w stanie dość dobrym
(0,67). Różnica ta nie jest istotna statystycznie. Pomiędzy pozostałymi badanymi grupami nie stwierdzono
znamiennych różnic w występowaniu nosicieli polimorficznego wariantu I polimorfizmu insercyjno/delecyjnego genu ACE.
Po zróżnicowaniu badanych grup pod względem
płci wykazano, że najwyższą częstością występowania
allelu I charakteryzuje się podgrupa dziewcząt po udarze i jest to wartość prawie dwukrotnie wyższa w porównaniu do częstości allelu I w grupie dziewcząt zdrowych (0,72 vs 0,39, p = 0,01). Liczba nosicieli allelu I
jest nieznacznie wyższa u pacjentek po udarze (0.89) w
porównaniu do dziewcząt zdrowych (0,77). Nie stwierdzono istotnych różnic w częstości występowania allelu I i nosicieli allelu I między chorymi dziewczętami a
dobrowolnymi dawcami krwi płci żeńskiej, jak również
pomiędzy chłopcami po udarze a chłopcami zdrowymi.
W podgrupach płci męskiej częstości występowania allelu I i nosicieli allelu I są na podobnym poziomie.
Otrzymane wyniki sugerują związek pomiędzy nosicielstwem allelu ε4 a udarem niedokrwiennym mózgu, szczególnie u dzieci płci męskiej. Związek taki
stwierdzono w niektórych pracach u ludzi dorosłych
[19]. W populacjach chorych dzieci nie badano do tej
pory wpływu polimorfizmu genu APOE na ryzyko
wystąpienia udaru. Nasze wstępne badania wykazują,
że genotyp APOE ma także wpływ na ciężkość stanu
pacjenta. Nieco zaskakujący może być fakt, że osoby
w stanie dobrym charakteryzują się znacznie wyższą
częstością nosicieli allelu ε4 niż pacjenci w stanie ciężkim. Być może wskazówką do wyjaśnienia tego faktu
są wyniki badań osób dorosłych po przebytym udarze
niedokrwiennym mózgu, które dowodzą, że z allelem
ε4 związane jest zwiększone przeżycie [20]. Jeśli podobny związek istniałby wśród chorych dzieci, możliwe byłoby, że wśród badanych przez nas osób zwiększona częstość allelu ε4 jest wynikiem zwiększonego
przeżycia pacjentów będących nosicielami ε4. Mogłoby to również wyjaśniać niską częstość tego allelu w
podgrupie w stanie ciężkim. Dodatkowo niezgodność
rozkładu genotypów i alleli z równowagą Hardy-Weinberga może wskazywać, że pewne genotypy mogą być
eliminowane z populacji chorych dzieci w związku ze
śmiertelnością.
Obiecujące wyniki badań pilotowych, przedstawione w niniejszej pracy, wymagają potwierdzenia
na znacznie liczniejszej populacji pacjentów. Analiza
większej liczby chorych dzieci wraz z rodzicami pozwoliłaby dodatkowo na potwierdzenie ewentualnego
związku danego polimorfizmu z chorobą przy użyciu wewnątrzrodzinnego testu powiązań – TDT (ang.
transmission/disequilibrium test). Ponieważ w populacji wieku rozwojowego schorzenia naczyniowe mózgu
występują rzadziej niż u ludzi dorosłych, zamierzamy
objąć badaniami genetycznymi przypadki udaru niedokrwiennego mózgu u dzieci z innych regionów Polski.
Piśmiennictwo
[1] Brass L.M., Isaacsohn J.L., Merikangas K.R. et al.: A study of twins and stroke. Stroke, 1992:23, 221.
[2] Kaste M., Koivisto P.: Risk of brain infarction in familial hypercholesterolemia. Stroke, 1988:19, 1097.
[3] Hoppe C., Klitz W., Cheng S. et al.: Gene interactions and stroke risk in children with sickle cell anemia. Blood,
2004:103, 2391.
[4] Liu Y., Pan J., Wang S. et al.: Beta-fibrinogen gene -455A/G polymorphism and plasma fibrinogen level in Chinese
stroke patients. Chin. Med. J. (Engl.), 2002:115, 214.
[5] Nowak-Gottl U., Strater R., Heinecke A. et al.: Lipoprotein (a) and genetic polymorphisms of clotting factor V, prothrombin, and methylenetetrahydrofolate reductase are risk factors of spontaneous ischemic stroke in childhood. Blood,
1999:94, 3678.
[6] Sharma P.: Meta-analysis of the ACE gene in ischaemic stroke. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry., 1998:64, 227.
[7] Bednarska-Makaruk M., Wehr H.: Genetyka udarów. Czyn. Ryzyka., 2002:35, 29.
[8] Członkowska A., Sarzyńska-Długosz I.: Genetyczne podłoże udaru mózgu. [w:] Genetyka chorób układu krążenia. Red.
Ciechanowicz A., Medycyna Praktyczna, Kraków 2002, 95.
[9] Balcerzyk A., Żak I.: Apolipoproteina E – rola polimorfizmu w patogenezie licznych chorób. Postępy Biochemii, 2004:4,
344.
[10] Ruiz-Ortega M., Lorenzo O., Ruperez M. et al.: Role of renin-angiotensin system in vascular diseases. Hypertension,
2001:38, 1382.
[11] Rigat B., Hubert C., Alhenc-Gelas F. et al.: An insertion/deletion polymorphism in the angiotensin I-converting enzyme
gene accounting for half the variance of serum enzyme levels. J. Clin. Invest., 1990:86, 1343.
[12] Cambien F., Poirier O., Lecerf L. et al.: Deletion polymorphism in the gene for angiotensin-converting enzyme is a
potent risk factor for myocardial infarction. Nature, 1992:359, 641.
Vol. 14/2005, Nr 28
23
Iwona Żak, Anna Balcerzyk, Beata Sarecka et al.
[13] Arbustini E., Grasso M., Fasani R. et al.: Angiotensin converting enzyme gene deletion allele is independently and
strongly associated with coronary atherosclerosis and myocardial infarction. Br. Heart J., 1995:74, 584.
[14] Żak I., Niemiec P., Sarecka B. et al.: Carrier-state of D allele in ACE gene insertion/deletion polymorphism is associated with coronary artery disease, in contrast to the C677→T transition in the MTHFR gene. Acta Biochimica Polonica,
2003:50, 527.
[15] Friedewald W.T., Levy R.I., Fredrickson D.S.: Estimation of the concentration of low-density lipoprotein cholesterol in
plasma without the use of preparative centrifuge. Clin. Chem., 1972:18, 499.
[16] Hixson J.E., Vernier D.T.: Restriction isotyping of human apolipoprotein E by gene amplification and cleavage with
HhaI. J. Lipid. Res., 1990:31, 545.
[17] Żak I., Sarecka B., Balcerzyk A. et al.: Polimorfizm PstI 561A→C genu selektyny-E i udar niedokrwienny mózgu u
dzieci: pilotowe badania związków, część I. Neurol. Dziec., 2004:26, 23.
[18] Kopyta I., Emich-Widera E., Marszał E.: Udar niedokrwienny mózgu u dzieci – analiza przypadków ze szczególnym
uwzględnieniem czynników ryzyka. Neurol. Dziec., 2002:11, 21.
[19] McCarron M.O., Delong D., Alberts M.J.: APOE genotype as a risk factor for ischemic cerebrovascular disease: a metaanalysis. Neurology, 1999:53, 1308.
[20] McCarron M.O., Muir K.W., Weir C.J. et al.: The apolipoprotein E epsilon4 allele and outcome in cerebrovascular disease. Stroke, 1998:29, 1882.
Adres autora:
Katedra i Zakład Biochemii i Genetyki Medycznej
40-752 Katowice, ul. Medyków 18
e‘mail: [email protected]
24
Neurologia Dziecięca