Obrazowanie i analiza blastocyst bydlęcych

Obrazowanie i analiza
blastocyst bydlęcych
- zastosowanie spektroskopii
wibracyjnej (FTIR)
Anna Wiecheć
Zakład Spektroskopii Stosowanej
Seminarium IFJ
15.03.2012
PLAN SEMINARIUM:
• Spektroskopia FTIR
• Co to są blastocysty
• Materiał badawczy – utrwalone blastocysty bydlęce
• Metoda badawcza – spektroskopia w podczerwieni z zastosowaniem
źródła laboratoryjnego i detektora FPA
• Rezultaty –
• Podsumowanie
mapy 2D, analiza statystyczna (hierarchiczna
analiza klastrowa z zastosowaniem metody Warda,
analiza głównych składowych PCA, analiza
wybranych pików)
Spektroskopia wibracyjna w podczerwieni z zastosowaniem
transformaty Fouriera (spektroskopia FTIR)
Metoda polega na analizie pochłoniętego promieniowania
elektromagnetycznego przez badaną substancję (drgające
cząsteczki).
I=I0
log
I0
I
10-cαd
Prawo Lamberta-Beera:
Natężenie światła padającego na
próbkę maleje wykładniczo, ze
wzrostem długości drogi tego
promieniowania w próbce
= cαd = A
I – natężenie promieniowania po przejściu przez próbkę
I0 - natężenie promieniowania padającego na próbkę
d – długość drogi promieniowania w próbce
c - stężenie molowe substancji absorbującej
d
http://pl.wikipedia.org/wiki/Prawo_Lamberta-Beera
α - molowy współczynnik absorpcji
Absorbancja A zależy od rodzaju promieniowania, stężenia
substancji w próbce i długości drogi promieniowania w
próbce.
Spektroskopia wibracyjna w podczerwieni z zastosowaniem
transformaty Fouriera (spektroskopia FTIR)
Idea pomiaru:
Próbka
badana
Detektor,
Źródło
Obróbka sygnału,
promieniowania
Transformację
Fouriera widma
interferencyjnego
IR
(polichromatyczne)
Wzorzec
Interferencyjne
widmo IR
Spektroskopia wibracyjna w podczerwieni z zastosowaniem
transformaty Fouriera (spektroskopia FTIR)
0,01nm
1nm
100nm
400nm
800nm
1mm
1m
http://www.darewit.pl/dane-techniczne---wykresy---jak-grzeja-zarowki-.html
Bliska
podczerwień
(NIR – near
InfraRed)
Średnia
podczerwień (MIR
– mid InfraRed)
Daleka
podczerwień (FIR –
far InfraRed)
Długość fali λ
[μm]
0,8-2,5
2,5-25
25- 1000
Liczba falowa ν
[1/cm]*
12500-4000
4000-400
400-20
* ν [1/cm]*= 1000/ λ [μm]
- (1500- 3700 [cm-1]) analiza grup funkcyjnych biocząsteczek,
-(700 – 1500[cm-1]) obszar daktyloskopowy – analiza biocząsteczek,
w których
podczas
wibracji zmienia
się moment
dipolowy
- analiza drgań wiązań między atomami w cząsteczce (analiza widm oscylacyjnych)
Rodzaje drgań cząsteczkowych
Drgania rozciągające
Symetryczne
Asymetryczne
Drgania deformacyjne
W płaszczyźnie
Poza płaszczyzną
Kołyszące Nożycowe
Wachlarzowe Skręcające
http://teaching.shu.ac.uk/hwb/chemistry/tutorials/molspec/irspec1.htm
Widmo charakterystyczne dla komórki:
Białka:
Białka:
cm-1)
Amid IIIrz (1299
30% C–N rozciaganie;
30% N–H zginanie;
10% C=O rozciąganie;
10% O=C–N zginanie;
20% inne
Amid IIrz (1567cm-1)
60% N–H rozciąganie;
40% C–N rozciąganie
Białka:
Amid Irz (1654 cm-1)
80% C=O rozciąganie,
10% C- N rozciąganie,
10% N-H rozciąganie
Lipidy (2850cm-1 – 3010cm-1)
Symetryczne i asymetryczne
rozciągania grup CH3, CH2,=C-H
Kwasy nukleinowe (950cm-1-1250cm-1)
1244 cm-1 – asymetryczne rozciąganie PO2 w RNA
1230 cm-1 – asymetryczne rozciąganie PO2 w DNA
1089 cm-1 – symetryczne rozciąganie PO2 w DNA
1084 cm-1 – symetryczne rozciąganie PO2 w RNA
Cukry:
1155 cm-1, 1032 cm-1 – rozciąganie –C-O
Literatura:
Stuard,2004;
Socrates Group, 2004
Blastocysta
gr. blastós – kiełek, zarodek, kýstis – pęcherz
to stadium rozwojowe zarodka ssaków łożyskowych
gotowe do zagnieżdżenia w macicy.
http://www.ramsem.com/embryolocal.html
http://www.youtube.com/watch?v=nkAIfrTQELA
-
Blastocysta - pierwsze stadium rozwojowe z wyróżnionymi
częściami zarodka
(węzeł zarodkowy,
embrioblast)
http://elinowbioreview2.wikispaces.c
om/Stages+of+Embryo
Komórki macierzyste dla
zarodka właściwego
Komórki macierzyste
dla łożyska
(pierwotna jama ciała)
http://www.independent.com/news/2009/nov/21/showtime-stem-cells/
W warunkach in vitro na tym etapie bardzo często występuje
zahamowanie rozwoju zarodka.
Dojrzałość oocytu (komórki jajowej) jest podstawowym
warunkiem jego zdolności do zapłodnienia i prawidłowego
rozwoju zarodkowego, a następnie płodowego.
• Podczas dojrzewania in vitro ponad 80%
oocytów osiąga stadium metafazy II (MII)
(osiąga dojrzałość mejotyczną).
• Z kolei, 70−80% w pełni dojrzałych oocytów
Oocyt I rzędu (stadium MI)
jest zdolnych do zapłodnienia.
• Z nich tylko 50% rozwija się do stadium
blastocysty podczas hodowli in vitro [Mermillod i
in., 1999; Kątska-Książkiewicz i in., 2007].
Jednym z czynników ograniczających zdolności
rozwojowe oocytów in vitro może być ich
nieprawidłowe dojrzewanie, spowodowane
suboptymalnymi warunkami hodowli
1998].
[Moor i in.,
Oocyt II rzędu (stadium MII)
http://panorama.varsovia.pl/varsovia/war
stwy/dna/ha/oocyt-GV.html
Instytut Zootechniki w Balicach – prowadzi badania wpływu
hialuronianu na kompetencje rozwojowe oocytów.
Hialuronian jest produkowany w warunkach in vivo w komórkach
sąsiadujących (komórki wzgórza jajonośnego) z oocytem.
Hialuronian (HA) – glikozoaminoglikan (polisacharyd):
• Nie tworzy kowalencyjnego wiązania z białkami, nie
może więc wchodzić w skład typowego proteoglikanu.
• Może natomiast stanowić oś, na której wiążą się inne
proteoglikany tworząc wraz z nimi "agregat
proteoglikanu".
[ Laurent T.C., J. R.E. Fraser (1992) The
FASEB Journal vol. 6 no. 7 2397-2404 ]
• Wchodzi w skład macierzy zewnątrzkomórkowej.
Na podstawie wstępnych badań [E.Latasiewicz, J.Opiela, Wiadomości Zootechniczne R. XLIX
(2011) 4:3-7]:
• zaobserwowano wzrost liczby dojrzałych oocytów dla stężenie 0,07%
HA
• nie zaobserwowano wpływu na wzrost fragmentacji DNA (HA nie
przyspiesza apoptozy)
Materiał badawczy
Materiał badawczy dostarczony z Instytutu Zootechniki, Balice
– dr inż. Jolanta Opiela
Blastocysty bydlęce
(utrwalone)
Blastocysta uzyskana z
zapłodnienia oocytu
hodowanego bez HA;
blastocysta hodowana w
pożywce SOF2
Blastocysta uzyskana z
zapłodnienia oocytu
hodowanego bez HA;
blastocysta hodowana we
współhodowli
z komórkami Vero
w pożywce B2
Kontrola doświadczenia
Blastocysta, uzyskana z
zapłodnienia oocytu
hodowanego z dodatkiem
hialuronianu HA (12,5 μl
1% HA / ml pożywki IVM)
(Vk= 0,007%)
Materiał - cel badania
Cel badań

Określenie wpływu dodatku hialuronianu
(HA) do pożywki do dojrzewania oocytów
bydlęcych na ich kompetencje rozwojowe.

Odpowiedź na pytania:
 Czy zastosowanie laboratoryjnego źródła
promieniowania IR i detektora FPA
pozwoli na zobrazowanie i analizę
komórek zarodkowych w stadium
blastocysty?
 Czy metody spektroskopowe mogą
stanowić uzupełnienie testów
biochemicznych w badaniach zarodków?
Metoda i urządzenia pomiarowe
SPEKTROSKOPIA W ZAKRESIE PODCZERWIENI Z ZASTOSOWANIEM
TRANSFORMATY FOURIERA
Miejsce: laboratorium SISSI (Source for Imaging and Spectroscopic
Studies in the Infrared) synchrotron ELETTRA, Triest, Włochy
Data pomiaru: 08-14. 07.2011
Źródło IR: Laboratoryjne Globar
Interferometr - Bruker VERTEX70
Mikroskop Vis/IR- Hyperion 3000
Detektor: Focal Plane Array (FPA, 64 x 64 piksele)
15xobjektyw: 1 pixel= 2,65 μm
Rozmiar obrazowanego obszaru próbki: 170 μm x 170 μm
Zakres spektralny: 900 cm-1 – 4000 cm-1
Rozdzielczość spektralna: 4 cm-1
Liczba skanów: 64
Dwuwymiarowe mapy rozkładu intensywności wybranych pasm
absorpcji:
Blastocysta
kontrolna (K)
DNA
(1250cm-1- 950cm-1)
Amidy I i II rz
(1715cm-1-1400cm-1)
Blastocysta ze
współhodowli
kontrolna (KV)
Blastocysta (H)
Dwuwymiarowe mapy rozkładu intensywności wybranych pasm absorpcji:
Blastocysta
kontrolna (K)
Białka, lipidy
(1400cm-1-1300cm-1)
Lipidy
(3020cm-1-2880cm-1)
Blastocysta ze
współhodowli Vero
kontrolna (KV)
Blastocysta (H)
Analiza danych
• Dla każdej blastocysty wyekstrahowano po 40 widm komórek z
rejonu węzła zarodkowego
• Analizowany zakres widma: 900cm-1 – 1850cm-1
• Wykonano korektę ze względu na rozpraszanie fali
elektromagnetycznej na przedmiotach sferycznych o wielkości
porównywalnej do długości fali (Mie scattering, P. Bassan, University
of Manchester, UK)
• Przeprowadzono normalizację wektorową.
Zastosowane metody wielowymiarowej analizy wariancji:
1.Hierarchiczna analiza klastrowa:
- optymalne grupowanie obserwacji (obiekty podobne
znajdują się w obrębie jednego klastra)
-
metoda Warda: analiza wariancji; zmierza do minimalizacji
sumy kwadratów odchyleń dwóch dowolnych skupień
-
Miarą odległości lub rozbieżności między obiektami jest
odległość euklidesowa =
rzeczywista odległość
geometryczna między obserwacjami w przypadku dwóch
lub trzech wymiarów
Hierarchiczna analiza klastrowa z zastosowaniem
metody Warda (dendrodiagram)
Numery widm komórek badanych blastocyst
K - kontrola (40 widm)
KV – kontrola +Vero (40 widm)
H – blastocysta (40widm)
Diagram drzewa
Metoda Warda
Odl euklidesowa
Odległość wiązania [a.u.]
Zastosowane metody wielowymiarowej analizy wariancji:
Analiza składowych głównych (ang. Principal Component
Analysis, PCA):
- PCA pozwala na wizualizację danych oraz analizę
wielowymiarowych danych poprzez ich kompresję
-
zredukowanie liczby czynników losowych; zmienne losowe w danej
grupie stają się od siebie zależne
- wykrywanie struktury w związkach między zmiennymi - klasyfikacja
zmiennych poprzez znalezienie składowych głównych (PC), które
opisują wariancję;
- Określenie zależność między głównymi składowymi a danymi na
podstawie analizy ładunków czynnikowych
Analiza składowych głównych
(ang. Principal Component Analysis, PCA )
Projekcja próbek na przestrzeń zdefiniowaną przez trzy czynniki
główne (obok czynników głównych podano procent opisanej
wariancji danych przez każdy czynnik)
Analiza składowych głównych
(ang. Principal Component Analysis, PCA )
Wartości ładunków czynnikowych
[j.u.]
Ładunki czynnikowe to korelacje między zmiennymi a
czynnikami PC
(92,7%)
(5,8%)
(1,2%)
Amid Irz
Amid IIIrz
Amid IIrz
Liczba falowa [1/cm]
Analiza pików charakterystycznych dla biomolekuł:
Średnie widma komórek blastocyst
Amid IIrz
Lipidy, Amidy IIIrz
(1462 rozciąganie C-N,
1544 zaginanie wiazania N-H)
(1357)
asymetryczne
i symetryczne,
nożycowe drgania w C-H w
wiązaniu CH3
Amid Irz (1654)
Rejon DNA
(950-1250)
80% C=O rozciąganie,
10% C- N rozciąganie,
10% N-H rozciąganie
Literatura:
Stuard,2004;
Socrates Group, 2004
Analiza pików charakterystycznych dla biomolekuł
Kompetencje rozwojowe oocytu są zależne od jakościowego i
ilościowego składu cytoplazmy.
Intensywność pików świadczy o ilościowej zawartości
biokomponentów w komórkach blastocyst
Pola powierzchni pod pikami
[j.u.]
Amid
Amid IIrz
Amid IIrz
IIIrz,
lipidy,
(1462cm-1)
(1544cm-1)
±SD
±SD
Amid Irz
(1654cm-1)
±SD
Suma pól
pod pikami
±SD
(1357cm-1)
±SD
Kontrola
50 x 10-4
30 x10-4
47 x10-4
138 x10-4
87 x10-4
16 x10-4
62 x10-4
25 x10-4
30 x10-4
134 x10-4
71 x 10-4
18 x 10-4
92 x10-4
24 x10-4
34 x10-4
168 x10-4
72 x10-4
1,2 x 10-4
Blasto+
Vero
±SD
10 x 10-4
±0,5 x 10-4
blastoHA
Suma pól
pod pikami
(bez Amidu
IIrz)
1,7 x 10-4
4,4 x 10-4
13,5 x 10-4
20,7 x 10-4
0,8 x 10-4
2,7 x 10-4
3,4 x 10-4
1,5 x 10-4
3,0 x 10-4
4,6 x 10-4
18,4 x 10-4
20,2 x 10-4
34,1 x 10-4
18,4 x 10-4
7,1 x 10-4
8,0 x 10-4
Analiza pasm charakterystycznych dla biomolekuł:
Analiza struktury drugorzędowej białek
(jakościowa analiza,
pozwala wnioskować o zmianach konformacyjnych w białkach):
α helisa
=
β struktura
A(1654cm-1)
A(1635cm-1)
Kontrola
= 1,23
Blasto (HA) = 1,04
Blasto +Vero= 1,11
Analiza stosunku kwasów nukleinowych
procesów replikacji DNA czy transkrypcji RNA):
RNA (uracyl)
DNA (asymetryczne rozc PO2-)
=
A(996cm-1)
A(1230cm-1)
(określenie intensywności
Kontrola
= 0,56
Blasto (HA) = 0,35
Blasto +Vero= 0,26
Podsumowanie

Zastosowanie źródła laboratoryjnego IR i detektora
FPA pozwala obrazować pasma charakterystyczne
dla danej biomolekuły (np. DNA, białek) obecnej w
komórkach blastocyst bydlęcych.
Na tej podstawie można wnioskować jaki jest rozkład danej biomolekuły np.
intensywność pasma DNA - gdzie jest najwięcej komórek lub jaki jest rozkład materiału
zapasowego – lipidy, białka.

Możliwe jest wyekstrahowanie widm pojedynczych
komórek i przeprowadzenie analizy m.in.
statystycznej w celu zbadania czy istnieją różnice
pomiędzy komórkami w badanych blastocystach.
Na podstawie hierarchicznej analizy klastrowej oraz analizy składowych
głównych (PCA) można wnioskować, że komórki blastocysty, której oocyt był
hodowany w pożywce z hialuronianem są bardziej podobne do komórek
blastocysty pochodzącej ze współhodowli Vero niż do komórek blastocysty
kontrolnej.

Podsumowanie
Na podstawie analizy pól powierzchni pod pikami
możliwe jest przeprowadzenie ilościowej analizy
głównych biomolekuł.
Komórki blastocysty hodowanej we współhodowli Vero posiadają ilościowo największe
zasoby biomolekuł, głównie Amidu IIrz. Jeśli wykluczymy Amidy IIrz, wówczas komórki
blastocysty, której oocyt był hodowany w pożywce z hialuronianem posiadają podobne ilości
biomolekuł w porównaniu do blastocyst hodowanych we współhodowli Vero oraz
jednocześnie mniejsze zasoby biomolekuł w porównaniu do komórek blastocysty kontrolnej.

Określenie drugorzędowej struktury białek pozwala
wnioskować o zmianach konformacyjnych w
białkach, co może mieć znaczenie w badaniu
rozwoju blastocyst.
Stosunek α helisy do β struktury jest porównywalny dla wszystkich komórek blastocyst.

Analiza ilościowa kwasów nukleinowych pozwala
określić intensywność procesów replikacji DNA czy
transkrypcji RNA, co może mieć znaczenie w
procesach dojrzewania oocytów.
Wartości stosunków RNA/DNA są porównywalne, co może świadczyć o tym, że intersywne
procesy transkrypcji nie rozpoczęły się jeszcze, komórki blastocyst korzystają z substancji
„odziedziczonych” od oocytów.
Podsumowanie

W celu wyciągnięcia ostatecznych wniosków
na temat wpływu hialuronianu na
kompetencje rozwojowe oocytów potrzebne
są dalsze badania oraz korelacja danych
uzyskanych metodą spektroskopii FTIR z
danymi uzyskanymi metodami
biochemicznymi.
Podziękowania
Dr inż. Jolanta Opiela – Instytut Zootechniki,
Balice
Mgr inż. Ewelina Lipiec – IFJ PAN, Kraków
Dr Lisa Vaccari
Dr Giovani Birarda
Synchrotron ELLETRA,
Triest
Dziękuję Państwu za uwagę