DETEKCJA KRĄŻĄCYCH KOMÓREK NOWOTWOROWYCH PRZY
advertisement
POSTĘPY BIOLOGII KOMÓRKI TOM 42 2015 NR 3 (401–416) DETEKCJA KRĄŻĄCYCH KOMÓREK NOWOTWOROWYCH PRZY ZASTOSOWANIU TECHNIKI EPISPOT DETECTION OF CIRCULATING TUMOR CELLS USING EPISPOT ASSAY Joanna BUDNA, Monika ŚWIERCZEWSKA, Agnieszka JANKOWIAK, Maciej ZABEL Katedra i Zakład Histologii i Embriologii, Uniwersytet Medyczny w Poznaniu Streszczenie: Odłączanie od guza pierwotnego i migracja krążących komórek nowotworowych jest główną przyczyną tworzenia przerzutów i śmierci. Identyfikacja i monitorowanie liczby tych komórek we krwi obwodowej i/lub szpiku kostnym ma potencjał prognostyczny w raku piersi, jelita grubego, prostaty, dróg moczowych oraz żołądka. Detekcja CTC we krwi obwodowej może być przeprowadzana technikami opartymi na ich właściwościach biologicznych, cechach fizycznych oraz charakterystyce molekularnej. Stosując różne techniki wzbogacania i detekcji CTC wykrywane są ich różne subpopulacje, potwierdzając tym samym heterogenny charakter tych komórek. Uwzględniając proces transformacji mezenchymalno-nabłonkowej, techniki wykrywania krążących komórek nowotworowych powinny być zdolne do rozpoznawania zarówno komórek EpCAM+, jak i EpCAM-, co stwarza potrzebę znalezienia nowych markerów, których ekspresja nie ulega obniżeniu podczas tego procesu. Stosowanie kombinacji markerów nabłonkowych i mezenchymalnych w celu eliminacji tego problemu, stwarza możliwość lepszej charakterystyki zdolności przeżycia, migracji i osiedlania CTC w odległych narządach. Niemniej, rozróżnienie żywych CTC od martwych jest dla diagnozy i rozwoju terapii spersonalizowanej kluczową kwestią, jako że wyłącznie żywe komórki są w stanie utworzyć przerzut. Metoda EPISPOT umożliwia takie zróżnicowanie. Opiera się ona na detekcji nie tyle komórek, co ich produktów, zgodnie z założeniem, że zdolność komórki do produkcji, sekrecji i aktywnego wydzielania białek jest dowodem jej żywotności. Technika EPISPOT została z powodzeniem wdrożona u pacjentów z rakiem piersi, stercza oraz jelita grubego. Optymalne wydaje się połączenie metody EPISPOT wskazującej unikalny “odcisk palca” pojedynczej, żywej komórki nowotworowej z następującą analizą molekularną tych komórek. Słowa kluczowe: krążące komórki nowotworowe, przerzut, metody izolacji i identyfikacji CTC, EPISPOT Summary: Detaching from tumor and invading blood vessels by circulating tumor cells are the most important steps leading to metastasis and cancer death. Identification of CTC and monitoring their numbers in blood and/or bone marrow has a prognostic value in breast, colorectal, urothelial and stomach cancer. CTC detection techniques are based on their biological and physical properties or molecular character- 402 J. BUDNA, M. ŚWIERCZEWSKA, A. JANKOWIAK, M. ZABEL istics. By applying various technologies to enrich and detect CTC different subpopulations could be detected, confirming their heterogeneity. Taking into account possible epithelial to mesenchymal transition, CTC detection techniques should be able to detect both, EpCAM+ and EpCAM- cells thus, new markers that are not downregulated during this process are urgently needed. Using combination of epithelial and mesenchymal markers can eliminate this problem, enabling better characterization of survival, migration and formation of metastasis in distant organs. However, distinguishing between viable and apoptotic cells is of great importance for diagnosis and personalized therapy, as only viable cells are able to form metastasis. EPISPOT enable such a discrimination in accordance with theory that secretion, shedding or active release of specific marker proteins are features of viable cells. EPISPOT was successfully applied to blood samples of patients with breast, prostate and colorectal cancer. The EPISPOT technology revealing a unique “fingerprint” of single viable tumor cell followed by molecular analysis of these tumor cells seems to be the best solution. Key words: circulating tumor cells, metastasis, CTC detection and isolation methods, EPISPOT WSTĘP Rozprzestrzenianie komórek może być zarówno zjawiskiem prawidłowym i niezbędnym, jak w przypadku komórek trofoblastu odpowiadających za prawidłową implantację i morfogenezę zarodka [26], jak i tworzącym przerzuty nowotworowe i być główną przyczyną śmierci [49]. Pod pojęciem przerzutu rozumiemy przemieszczanie się komórek nowotworowych z ogniska pierwotnego do innych, oddalonych nieraz znacznie, narządów. Głównymi etapami tego procesu są: zmiany na poziomie molekularnym i wzrost komórek guza, angiogeneza, odłączanie się komórek od guza, transformacja nabłonkowo-mezenchymalna (EMT), przedostanie się do naczyń krwionośnych i transport, opuszczenie naczyń w miejscu docelowym, transformacja mezenchymalno-nabłonkowa (MET), osiedlenie w narządzie, formowanie guza i jego wzrost (ryc.1). RYCINA 1. Uwalnianie komórek z guza pierwotnego: proliferacja i angiogeneza, inwazja, transport w naczyniach krwionośnych, opuszczenie naczyń krwionośnych, zajęcie narządu, wzrost guza (zmodyfikowano wg. FIDLER IJ. The pathogenesis of cancer metastasis: the ‘seed and soil’ hypothesis revisited. Nat Rev Cancer 2003; 3: 453-458 [21]) FIGURE 1. Detachment of cells from primary tumor: proliferation and angiogenesis, invasion, transport in capillaries, extravasation, arrest in organ, proliferation and tumor growth (modified according to FIDLER IJ. The pathogenesis of cancer metastasis: the ‘seed and soil’ hypothesis revisited. Nat Rev Cancer 2003; 3: 453-458 [21]) DETEKCJA KRĄŻĄCYCH KOMÓREK NOWOTWOROWYCH – TECHNIKA EPISPOT 403 Wybór miejsca docelowego tworzenia przerzutu jest procesem słabo poznanym, uważa się jednak, że ważną rolę odgrywają w nim wydzielane przez narząd specyficzne dla niego cząsteczki, chemokiny, które zwabiają komórki w swoje sąsiedztwo oraz białka błonowe (np. receptory) komórek śródbłonka tych narządów [21]. Wśród pacjentów z rakiem piersi, okrężnicy oraz czerniakiem 20-30% wykazuje obecność przerzutów w momencie diagnozy, co sugeruje, że do ich powstania dochodzi już na wczesnych etapach rozwoju choroby a proces ten może mieć charakter utajony [23]. Szacuje się, że zaledwie 15% komórek guza uwalnianych do krwioobiegu przeżywa w nim dłużej niż 5 minut [11]. Komórki giną w wyniku śmierci apoptotycznej zwanej anoikis, wynikającej z braku możliwości połączenia z innymi komórkami. Procent komórek zdolnych do podjęcia wzrostu w odległych narządach, angiogenezy i rozwoju w makroprzerzuty jest znacznie niższy, gdyż zdecydowana większość tych komórek jest usuwana przez system odpornościowy (np. fagocytoza, efekt cytotoksyczny) [27]. Jednakże, komórki oporne na powyższe zjawiska mogą zasiedlić inne narządy lub pozostawać w uśpieniu latami ze wstrzymanym cyklem komórkowym, a drobny czynnik zaburzający równowagę pomiędzy proliferacją i apoptozą może skutkować rozwojem lub regresją guza [8]. Komórki migrujące z guza pierwotnego i przemieszczające się do nieraz odległych narządów nazywamy krążącymi komórkami nowotworowymi. Obecnie w terminologii pojawia się wiele określeń tych komórek. Najpowszechniejszy – CTC (ang. Circulating Tumor Cells) oznacza komórki, znajdujące się w naczyniach krwionośnych bądź limfatycznych. Natomiast DTC (ang. Disseminated Tumor Cells) oraz ITC (ang. Isolated Tumor Cells), to komórki znajdujące się w narządach, szpiku kostnym i węzłach chłonnych (6). Jednak źródłem przerzutów nie są wyłącznie pojedyncze komórki nowotworowe obecne w krążeniu. Mogą się one przemieszczać również w formie agregatów CTM (ang. Circulating Tumor Microembrioli) w procesie zwanym „kolektywną” migracją. Szacuje się, że w tej formie komórki nowotworowe o charakterze nabłonkowym mają większe szanse na przeżycie, proliferację i tworzenie przerzutów w odległych narządach [12]. W ich przypadku nie jest konieczne pokonanie ściany naczynia krwionośnego aby dostać się do narządu docelowego. Przytwierdzają się one do ścian tętniczek i naczyń włosowatych a następnie intensywnie proliferując prowadzą do uszkodzenia ściany naczynia i zasiedlenia narządu [6]. Dlatego obecność CTM we krwi jest utożsamiana z wysokim potencjałem do tworzenia przerzutów [22]. Co więcej, w wyniku apoptozy i nekrozy krążących komórek nowotworowych do krwiobiegu przedostają się ich składniki wewnątrzkomórkowe, tj. fragmenty komórek (endosomy, ciałka apoptotyczne), DNA czy fragmenty chromatyny, zwane CTMat (ang. Circulating Tumor Materials). Jako, że komórki ulegają ciągłemu odrywaniu z guza pierwotnego oraz rozpadowi, wyżej wymieniony materiał może stanowić niezależne źródło informacji o chorobie przerzutowej i ułatwiać jej monitorowanie [46]. Żaden z powyższych terminów nie powinien być utożsamiany z mikroprzerzutami MIC 404 J. BUDNA, M. ŚWIERCZEWSKA, A. JANKOWIAK, M. ZABEL (ang. Micrometastases), czyli komórkami zasiedlającymi narząd po wcześniejszej wstępnej proliferacji. Ich rozmiar nie przekracza 0.2 cm a ich diagnostyka jest możliwa wyłącznie przy zastosowaniu technik histologicznych. MIC mogą się rozwijać w narządach zarówno z pokonujących ścianę naczynia krwionośnego CTC, jak i z proliferujących i przerywających ją CTM [27, 35]. Wykazano, że identyfikacja i monitorowanie liczby krążących komórek nowotworowych we krwi obwodowej i/lub szpiku kostnym ma potencjał prognostyczny w raku piersi [24], jelita grubego [14], prostaty [17], dróg moczowych oraz żołądka [30]. Zatem oczekiwania względem zastosowania tych komórek jako łatwo dostępnej płynnej biopsji są wysokie. Umożliwiłoby to ocenę potencjału do tworzenia przerzutów i wystąpienia choroby resztkowej, monitorowanie rezultatów terapii, szybką ocenę trafności leczenia oraz oszczędziło pacjentom efektów ubocznych nietrafionej terapii (zastosowanie terapii spersonalizowanej) [9]. Heterogenność raków oraz rzadkość krążących komórek nowotworowych wymaga ciągłego ulepszania i ujednolicania technik ich detekcji. Nie jest to proste zadanie, ponieważ CTC występujące w bardzo małych ilościach nie podlegają tradycyjnym barwieniom immunocytochemicznym ani ocenom mikroskopowym. Jak dotąd detekcja CTC nie stała się rutynowym badaniem, ponieważ w wielu badaniach klinicznych nie zaobserwowano zależności statystycznej pomiędzy ilością CTC i stadium zaawansowania choroby. Przyczyną tych rozbieżności są najprawdopodobniej różnice techniczne i metodologiczne pomiędzy różnymi technikami oraz rozbieżności w sposobie przygotowania próbki. Inną przyczyną może być fakt, że antygeny nabłonkowe, tj. EpCAM (ang. Epithelial Cell Adhesion Molecule), E-kadheryny oraz cytokeratyny podczas EMT mogą ulegać nawet całkowitemu zanikowi a w ich miejsce pojawiać się markery mezenchymalne, tj. wimentyna czy N-kadheryny [36, 51]. Z kolei antygeny mezenchymalne są też obecne na innych komórkach pochodzenia mezenchymalnego, tj. leukocyty, dlatego zarówno antygeny nabłonkowe jak i mezenchymalne nie mogą być podstawą detekcji CTC [35]. Stwarza to potrzebę znalezienia nowych markerów, których ekspresja nie ulega obniżeniu podczas tego procesu. Przykładem może być plastyna-3, która została ostatnio zastosowana jako marker prognostyczny w raku jelita grubego. Ulega ona również ekspresji w innych rakach, włącznie z rakiem piersi i dlatego może stać się użytecznym markerem w detekcji CTC [50]. TECHNIKI IZOLACJI I IDENTYFIKACJI CTC Detekcja CTC/DTC we krwi obwodowej może być przeprowadzana technikami opartymi na ich właściwościach biologicznych (ekspresja białek powierzchniowych, żywotność, przerzutowość), cechach fizycznych (rozmiar, gęstość, ładunek elektryczny, zmiana kształtu) oraz charakterystyce molekularnej [42]. DETEKCJA KRĄŻĄCYCH KOMÓREK NOWOTWOROWYCH – TECHNIKA EPISPOT 405 Detekcja na bazie ekspresji cząsteczek powierzchniowych komórek znalazła szerokie zastosowanie w technikach wykorzystujących znakowanie „magnetyczne” (CellSearch, MagSweeper, AdnaTest), urządzenia mikrofluidyczne (CTC-chip), podłoża nanostrukturalne (Nano Velcro), cytometrię przepływową (LSC, FAST) oraz w testach in vivo (Gilupi CellCollector). Jak dotąd jedynym systemem zaaprobowanym przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (ang. Food and Drug Administration, FDA) do celów diagnostycznych jest CellSearch® (Veridex LLC). Opiera się on na selekcji pozytywnej komórek EpCAM+ poprzez zastosowanie „magnetycznych” kulek pokrytych przeciwciałami anty-EpCAM a następnie ich identyfikacji na podstawie obecności CK 8, 18 i/lub 19 przy jednoczesnym braku markera leukocytarnego – cząsteczki CD45 [37]. Innym testem wykorzystującym system znakowania żelazem i izolacji „magnetycznej” oraz ekspresję cząsteczki EpCAM jest MagSweeper stworzony na uniwersytecie Stanforda. Kulki magnetyczne pokryte przeciwciałami inkubowane są z krwią pacjenta a następnie wyłapywane z mieszaniny za pomocą magnetycznych pręcików omiatających kolistymi ruchami zawartość naczynia. Związane komórki uwalniane są z magnesu po usunięciu z pola magnetycznego [44]. Ciekawym połączeniem technik magnetycznych oraz molekularnych jest AdnaTest (AdnaGen®). Oprócz możliwości zastosowania szerokiego spektrum przeciwciał specyficznych dla komórek raka piersi, prostaty, okrężnicy, jajnika jak również komórek ulegających procesowi EMT oraz komórek macierzystych, technika umożliwia analizę genów związanych z procesem nowotworzenia, tj. HER2, EpCAM czy MUC1 na poziomie mRNA w oparciu o technikę RT-PCR [53]. Wśród systemów mikrofluidycznych można wymienić CTC-chip [29], HB-chip (Herringbone-Chip) [43], Nano-Velcro [48] oraz HTMSU (High-Throughput Microsampling Unit) [19]. Zaletą tych technik jest duża powierzchnia styku komórek krwi z przeciwciałami, skutkująca wydajnością wychwytu ≥60%. LSC (ang. Laser Scanning Cytometry), będąca modyfikacją cytometrii przepływowej umożliwia korelację fluorescencji (np. panel CK i sygnał z jądra komórkowego) z morfologią komórek (wielkość, stosunek jądra komórkowego do cytoplazmy) oraz wielokrotność pomiarów przy zastosowaniu różnych barwników [32]. Oznaczenia są szybkie, ilościowe, umożliwiają jednoczesną analizę wielu parametrów oraz rozróżnienie komórek żywych od apoptotycznych. Jednak niska czułość i wymagana duża objętość krwi doprowadziła do wprowadzenia technologii FAST (ang. Fiber-optic Array Scanning Technology), umożliwiającej szybkie skanowanie do 3x105 komórek na sekundę i pozwalającej wykryć fluorescencyjnie wyznakowane CTC bezpośrednio na szkiełku podstawowym, bez konieczności ich izolacji. Korelacja wszystkich czynników zapewnia wykrywalność CTC tą metodą na wysokim poziomie 86% [25]. Wśród technik bazujących na właściwościach fizycznych separowanych komórek z krwi obwodowej wymienia się: wirowanie w gradiencie gęstości oraz 406 J. BUDNA, M. ŚWIERCZEWSKA, A. JANKOWIAK, M. ZABEL separację na porowatych membranach – OncoQuick® (Grenier BioOne) [38], mikrofiltrację (ang. Isolation by Size of Epithelial Tumor Cells, ISET) [47], urządzenia mikrofluidyczne [45] oraz dielektroforezę, wykorzystującą właściwości elektryczne CTC, poruszających się pod wpływem niejednorodnego pola elektrycznego [7]. Wszystkie powyższe techniki izolacji lub detekcji CTC prowadzone są in vitro, tzn. w ograniczonej do kilku mililitrów próbce krwi. Technika in vivo natomiast, opiera się na zastosowaniu detektora (CellCollector, Gilupi GmbH) pokrytego przeciwciałami anty-EpCAM. Detektor umieszczony na okres 30 minut w żyle przedramienia ma styczność z co najmniej 1,5-3 litrów krwi a wychwycone komórki są następnie analizowane pod kątem obecności cytokeratyn i markerów charakterystycznych dla różnych nowotworów przy jednoczesnym braku markerów leukocytarnych [40]. EPISPOT Wyłącznie żywe komórki CTC są w stanie utworzyć przerzut, natomiast wspomniane techniki wykrywania CTC/DTC bazujące głównie na reakcjach immunopowinowactwa czy metodach biologii molekularnej (np. RT-PCR) nie pozwalają odpowiedzieć na pytanie czy komórka jest żywa czy martwa. Metoda EPISPOT (ang. EPithelial ImmunoSPOT), która jest modyfikacją techniki ELISPOT (ang. Enzyme-Linked ImmunoSPOT) umożliwia takie zróżnicowanie [1]. Opiera się ona na detekcji nie tyle komórek, co ich produktów, zgodnie z założeniem, że zdolność komórki do produkcji, sekrecji i aktywnego wydzielania białek jest dowodem jej żywotności [33]. ETAPY PROCEDURY: Wzbogacenie CTC są obecne we krwi w bardzo małej liczbie jednej komórki na miliony komórek krwi, niezbędne jest więc ich zagęszczenie. Tzw. wzbogacanie może być oparte na wielu fizycznych i biologicznych właściwościach komórek CTC. Większość technik wykorzystuje marker komórek nabłonkowych – antygen EpCAM, jednakże uwzględniając możliwy proces EMT pożądane są techniki rozpoznające również komórki EpCAM-negatywne. Test EPISPOT najczęściej jest łączony z wzbogacaniem opartym na deplecji komórek CD45+ z zastosowaniem systemu RosetteSep (StemCell Technology), pozwalającego na analizę również komórek EpCAM- (ryc. 2a) [1]. DETEKCJA KRĄŻĄCYCH KOMÓREK NOWOTWOROWYCH – TECHNIKA EPISPOT 407 Zasada reakcji Reakcja opiera się na pokryciu błon nitrocelulozowych przeciwciałem przeciwko poszukiwanemu białku. Następnie na każdy dołek płytki wysiewane są wzbogacone wcześniej komórki i hodowane przez 24-48h. Podczas tej inkubacji dochodzi do bezpośredniego wiązania produktów białkowych przez przeciwciała pokrywające błonę. Po upływnie czasu inkubacji komórki są wypłukiwane a produkt białkowy wykrywany przez zastosowanie kolejnego przeciwciała koniugowanego z fluorochromem. Sygnały są zliczane pod mikroskopem fluorescencyjnym według zasady – jeden pozytywny sygnał odpowiada jednej żywej, produkującej białko markerowe komórce CTC/DTC (ryc. 2b). EPISPOT jest techniką zarówno ilościową (sygnały są zliczane), jak i jakościową (analizowane białka są znanymi markerami guzów litych, umożliwiając charakterystykę fenotypową CTC/DTC). Zaletą testu jest możliwość stosowania więcej niż jednego przeciwciała znakowanego różnymi barwnikami, czyli detekcji dwóch a nawet kilku produktów białkowych [1]. RYCINA 2. Procedura techniki EPISPOT: a) wzbogacanie oparte o deplecję komórek CD45+ b) hodowla komórek i barwienie ich związanych na membranie produktów (zmodyfikowano wg. ALIX�-PANABIERES C. EPISPOT Assay: Detection of Viable DTCs/CTCs in Solid Tumor Patients. Recent Res Cancer Res 2012; 195: 69-76 [1]) FIGURE 2. EPISPOT assay procedure: a) enrichment via depletion of CD45+ cells b) cell culture and immunostaining of secreted proteins caught on the membrane (modified according to ALIX-PANABIERES C. EPISPOT Assay: Detection of Viable DTCs/CTCs in Solid Tumor Patients. Recent Res Cancer Res 2012; 195: 69-76 [1]) 408 J. BUDNA, M. ŚWIERCZEWSKA, A. JANKOWIAK, M. ZABEL Żywe komórki podczas hodowli in vitro produkują badane białko, co pozwala na uzyskanie pozytywnego sygnału reakcji. Dzięki temu test nie wykrywa niezdolnych do tego martwych komórek [2]. W celu udowodnienia skuteczności testu, przeprowadzono testy pokazujące, że tylko funkcjonalne CTC/DTC są zdolne do produkcji białka i dawania pozytywnych sygnałów reakcji. Dodatek brefeldyny A spowodował zablokowanie transportu w aparacie Golgiego i kumulację białek w siateczce śródplazmatycznej. Z kolei cykloheksymid całkowicie zablokował biosyntezę białek. W obu przypadkach wykazano brak sygnału reakcji (ryc. 3). Kolejną zaletą testu jest fakt, że rozmiar sygnału z produktu białkowego jest znacznie większy od rozmiaru samej komórki, ułatwiając rozróżnienie pozostałej na membranie martwej komórki nowotworowej i produktu komórki żywej po 48h hodowli [1]. RYCINA 3. Zahamowanie syntezy białek w teście EPISPOT: a) kontrola z medium zawierającym czynniki wzrostu (intensywna synteza białka) – sygnały pozytywne reakcji, b) dodatek cykloheksymidu (inhibicja syntezy białek) oraz c) dodatek brefeldyny A (zahamowanie transportu wyprodukowanych białek w aparacie Golgiego i kumulacja w siateczce śródplazmatycznej) – brak sygnałów reakcji (zmodyfikowano wg. ALIX-PANABIERES C. EPISPOT Assay: Detection of Viable DTCs/CTCs in Solid Tumor Patients. Recent Res Cancer Res 2012; 195: 69-76 [1]) FIGURE 3. Inhibition of protein secretion in EPISPOT assay: a) control with enriched culture medium (intensive production of proteins) – positive signal of the reaction b) addition of cycloheximide (inhibition of protein biosynthesis in vitro) and c) addition of brefeldin A (inhibition of transport in Golgi, proteins accumulation inside the endoplasmic reticulum) – inhibition of immunospots formation (modified according to ALIX-PANABIERES C. EPISPOT Assay: Detection of Viable DTCs/ CTCs in Solid Tumor Patients. Recent Res Cancer Res 2012; 195: 69-76 [1]) DETEKCJA KRĄŻĄCYCH KOMÓREK NOWOTWOROWYCH – TECHNIKA EPISPOT 409 ZASTOSOWANIE KLINICZNE Technika EPISPOT została z powodzeniem wdrożona u pacjentów z rakiem piersi, stercza oraz jelita grubego. Według danych WHO ponad milion kobiet rocznie zapada na raka piersi [15], który w 2014 roku stanowił 15% wszystkich zgonów spowodowanych nowotworami [41]. Pomimo stosowania nowych form leczenia, tj. przeciwciała monoklonalne przeciwko receptorowi ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (HER2) – trastuzumabu, czy inhibitora kinazy tyrozynowej receptora naskórkowego czynnika wzrostu – lapatinibu, ok. 30% kobiet zdiagnozowanych we wczesnym stadium raka rozwija przerzuty, które są praktycznie niewyleczalne. Terapia ma na celu wydłużyć dziesięcioletnią średnią przeżycia (ok. 75% w Europie Zachodniej) oraz jej jakość [31]. Ostatnio dowiedziono, że większość CTC w raku piersi ulega apoptozie [39], stąd idea zastosowania techniki EPISPOT w celu określenia jej przydatności. Jako białka markerowe została wybrana mucyna-1 (MUC1), będąca błonowym białkiem ulegającym nadekspresji i masowo glikozylowanym w komórkach raka piersi oraz cytokeratyna 19 (CK19). CK19 obecna razem z CK8 i CK18 w nabłonkach jedno i wielowarstwowych [4], charakteryzuje się wysoką ekspresją w pierwotnych guzach nabłonkowych, tj. komórkach raka piersi, okrężnicy, płuc oraz wątroby [13], lecz nie w normalnych komórkach mezenchymalnych linii hematopoetycznej. Analiza krwi obwodowej wykazała obecność komórek produkujących MUC1 u wszystkich pacjentek z zaawansowanym, przerzutowym rakiem piersi, co nie było obserwowane u osób zdrowych. Diagnostyka oparta na zliczaniu komórek produkujących zarówno MUC1, jak i CK19 pozwoliła na detekcję żywych CTC/ DTC w szpiku kostnym u 90 i 54% pacjentów odpowiednio z i bez przerzutów [4]. Częstotliwość ta była porównywalna z otrzymaną przy zastosowaniu czułych technik detekcji opartych na RT-PCR [52]. Interesujące okazało się połączenie techniki EPISPOT z uznaną za złoty standard techniką CellSearch w przerzutowym raku piersi. Do badania włączono 254 pacjentek z przerzutowym rakiem piersi w wieku 49-68 lat. Detekcję oparto na wydzielaniu CK19 przez żywe CTC [5]. Stosując technikę EPISPOT 59% pacjentek było pozytywnych pod względem obecności CTC, podczas gdy jedynie 48% stosując CellSearch. Co więcej, zgodność pomiędzy obiema technikami była niska, na poziomie 33%. Dowodzi to, że liczba CTC określona wyłącznie techniką EPISPOT nie może być uznana za niezależny czynnik prognostyczny. Żadna z technik nie miała też zastosowania predykcyjnego dla przeżycia wolnego od progresji – PFS (ang. Progression-free Survival). Według Müllera i wsp. brak korelacji może być częściowo wyjaśniony stosowaniem różnych definicji PFS w różnych ośrodkach [28]. Niemniej, połączenie obu technik miało już silniejsze znaczenie prognostyczne. 410 J. BUDNA, M. ŚWIERCZEWSKA, A. JANKOWIAK, M. ZABEL Podobnym badaniem objęto grupę 75 pacjentów z rakiem jelita grubego. W badanej grupie byli pacjenci zarówno z przerzutami jak i bez oraz 20 zdrowych osób. CTC wykrywano we krwi obwodowej oraz we krwi z żyły krezkowej dwoma technikami. Analiza komórek CK19+ z zastosowaniem techniki EPISPOT wykazała obecność żywych CTC u 66% i 55% pacjentów odpowiednio we krwi z żyły krezkowej i obwodowej, podczas gdy stosując CellSearch u 56% i 29% pacjentów. Dla porównania, CTC nie wykryto u żadnej ze zdrowych osób [18]. Uważa się, że do śmierci w raku jelita grubego dochodzi głównie z powodu przerzutów do wątroby, która jest ważnym narządem filtrującym i zatrzymującym CTC. Uzyskane wyniki wykazały znacznie wyższą liczbę CTC we krwi z żyły krezkowej niż obwodowej, potwierdzając tą hipotezę [10]. Wyniki uzyskane po analizie krwi z żyły krezkowej były porównywalne dla obu technik, natomiast znacznie wyższa liczba CTC została wykryta we krwi obwodowej przy zastosowaniu EPISPOT w stosunku do CellSearch. Może to wynikać ze sposobu pozytywnej selekcji EpCAM+ komórek w CellSearch, podczas gdy EPISPOT odrzuca komórki CD45+, zachowując zarówno CTC EpCAM+, jak i EpCAM- [1]. Podejrzewa się, że nabłonkowe CTC EpCAM+ są mniej plastyczne i sztywniejsze niż mezenchymalne CTC EpCAMi z tego powodu mogą być zatrzymywane w wąskich naczyniach kapilarnych wątroby. Zatem każda z technik wykrywa nieco inne subpopulacje CTC, co tłumaczy brak zgodności pomiędzy nimi. Stosując EPISPOT pokazano po raz pierwszy, że CTC obecne we krwi z żyły krezkowej są żywe a dalsze obserwacje kliniczne wskazały, że tylko CTC znalezione we krwi obwodowej przy pomocy EPISPOT miały charakter prognostyczny u pacjentów w stadium M0 [18]. W raku prostaty z kolei za marker przyjęto białko PSA (ang. Prostate-Specific Antigen) [20]. Analiza krwi obwodowej wykazała obecność komórek produkujących PSA u 83% pacjentów z odległymi przerzutami (M1) i 65% pacjentów bez przerzutów (M0), podczas gdy nie były one obecne u osób zdrowych i pacjentów z łagodnym rozrostem gruczołu krokowego. W przypadku raka prostaty technika EPISPOT została rozszerzona o analizę białka FGF2 (ang. Fibroblast Growth Factor 2), znanego czynnika wzrostu komórek macierzystych oraz odpowiedzialnego za wzrost in vitro komórek przerzutowych raka piersi. Wyniki testu przeprowadzonego na 19 pacjentach pokazały, że znaczny odsetek komórek CTC/DTC produkował oprócz PSA również FGF2, sugerując, że są one zdolne do produkcji czynnika potencjalnie związanego z ich nadmiernym wzrostem [4]. EPISPOT został poddany wstępnym próbom również na pacjentach nienowotworowych. W ostatnim przypadku do badania włączono 53 pacjentów (37,7% kobiet i 62,3% mężczyzn w wieku 18-84 lat) z nienowotworowymi chorobami okrężnicy, tj. chorobą uchyłkową jelit, niezłośliwymi polipami, chorobą Leśniowskiego – Krohna czy wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego (bez wcześniejszej historii nowotworowej) oraz 25 zdrowych osób stanowiących kontrolę. U wszystkich przeanalizowano krew obwodową dwoma technikami – EPISPOT oraz CellSearch. DETEKCJA KRĄŻĄCYCH KOMÓREK NOWOTWOROWYCH – TECHNIKA EPISPOT 411 Wśród testowanych pacjentów komórki uznane za pozytywne były obecne w przypadku testów każdą z technik (EPISPOT – 18,9%, CellSearch – 11,3%), podczas gdy komórki te nie zostały wykryte u osób zdrowych. Tylko u jednego pacjenta stwierdzono sygnały pozytywne obiema technikami. Prawdopodobieństwo, że komórki te są rzadkimi komórkami krwi, przejawiającymi ekspresję nabłonkowych CK jest małe, ponieważ wszystkie komórki CD45+ zostały wyeliminowane z oceny bądź to dzięki równoległym barwieniom (CellSearch), bądź przez deplecję (EPISPOT). Liczba komórek CK+ wykrytych obiema technikami u pacjentów z nienowotworowymi zmianami była znacznie niższa niż w przypadku grupy nowotworowej, użytej w badaniu jako kontrola pozytywna. Ponadto, po 3 latach kontroli żaden z pacjentów biorących udział w badaniu nie zachorował na nowotwór jelit ani inny pochodzenia nabłonkowego [34]. Warto podkreślić, że obie zastosowane techniki używały CK jako markera do rozróżnienia komórek nabłonkowych od leukocytów, jednak CK występują zarówno na powierzchni normalnych jak i rakowych komórek nabłonkowych. Sugeruje to, że komórki nabłonkowe z jelita nieobjętego procesem nowotworowym mogą dostawać się do krążenia w stanach zapalnych, co pozostaje w zgodzie z faktem, że cytokiny prozapalne mogą stymulować migrację komórek nabłonkowych [16]. Wyniki niniejszych badań potwierdzają, że pacjenci z chorobami zapalnymi jelit mogą posiadać żywe krążące komórki nabłonkowe wykrywane technikami detekcji CTC. Nasuwa to konieczność dodatkowego zastosowania analizy molekularnej, jednoznacznie określającej nowotworowy bądź nienowotworowy charakter komórek. PRZYSZŁE KIERUNKI ROZWOJU TECHNIKI EPISPOT Obecnie kładzie się nacisk na rozwój technik stosujących mikrourządzenia, które wymagają dziesięciokrotnie mniejszych objętości krwi niż dotychczas stosowane, skracając tym samym czas testu i obniżając zużycie drogich odczynników. Niemniej, pamiętając o małej zawartości CTC we krwi, techniki analizujące duże objętości krwi są nadal pożądane, szczególnie u pacjentów we wczesnym etapie rozwoju nowotworu i z małą ilością CTC. Sporą zaletą byłaby też możliwość analizy związanych CTC na poziomie molekularnym i porównanie ich charakterystyki z komórkami guza pierwotnego oraz odległych przerzutów. Niemniej, rozróżnienie żywych CTC od martwych jest dla diagnozy i rozwoju terapii spersonalizowanej kluczową kwestią. Dzięki bezpośredniemu wiązaniu produktów komórkowych na membranie czułość techniki EPISPOT jest czterokrotnie wyższa w stosunku do technik mierzących zawartość tych samych białek w supernatantach analizowanych po hodowlach komórkowych [3]. Dane kliniczne pokazują, że żywe CTC/DTC u pacjentów nowotworowych mogą być heterogenne pod kątem wydzielania białek. Jako, że wiele z nich wpływa na tworzenie przerzutów (np. czynni- 412 J. BUDNA, M. ŚWIERCZEWSKA, A. JANKOWIAK, M. ZABEL ki wzrostu, proteazy) i dostępny jest szeroki wachlarz fluorochromów, w przyszłości powinno być możliwe rozszerzenie techniki wieloparametrycznej. Umożliwiłoby to lepsze zrozumienie kaskady tworzenia przerzutów. Optymalne wydaje się zatem połączenie techniki EPISPOT wskazującej unikalny “odcisk palca” pojedynczej, żywej komórki nowotworowej z następującą analizą molekularną tych komórek [1]. PODSUMOWANIE Stosując różne techniki wzbogacania i detekcji CTC wykrywane są ich różne subpopulacje, potwierdzając tym samym heterogenny charakter komórek nowotworowych. Uwzględniając proces EMT, techniki wykrywania CTC powinny być zdolne do rozpoznawania zarówno komórek EpCAM+, jak i EpCAM-, co stwarza potrzebę znalezienia markerów, których ekspresja nie ulega obniżeniu podczas tego procesu. Ponadto, stosowanie kombinacji markerów nabłonkowych i mezenchymalnych stworzyłoby możliwość lepszej charakterystyki CTC. Kwestią kluczową pozostaje określenie czy krążąca komórka nowotworowa jest martwa czy żywa, a tym samym zdolna do tworzenia przerzutów. Technika EPISPOT pozwala odpowiedzieć na to pytanie, co dowiedziono w testach z udziałem pacjentów z rakiem piersi, stercza oraz jelita grubego. Optymalnym rozwiązaniem wydaje się być połączenie techniki EPISPOT z analizą molekularną CTC w celu trafniejszego określenia zdolności przeżycia, migracji i osiedlania CTC w odległych narządach, a tym samym skutecznego rozwoju terapii spersonalizowanej. PODZIĘKOWANIA Praca finansowana z projektu ERA-NET TRANSCAN, pt: „Krążące komórki nowotworowe (CTC) jako biomarker choroby resztkowej (MRD) w raku stercza” LITERATURA [1] [2] [3] Alix-Panabieres C. EPISPOT Assay: Detection of Viable DTCs/CTCs in Solid Tumor Patients. Recent Results Cancer Res 2012; 195: 69-76. Alix-Panabieres C, Brouillet JP, Fabbro M, Yssel H, Rousset T, Maudelonde T, Choquet-Kastylevsky G, Vendrell JP. Characterization and enumeration of cells secreting tumor markers in the peripheral blood of breast cancer patients. J Immunol Methods 2005; 299: 177-188. Alix-Panabieres C, Rebillard X, Brouillet JP, Barbotte E, Iborra F, Segui B, Maudelonde T, Jolivet-Reynaud C, Vendrell JP. Detection of circulating prostate-specific antigen-secreting cells in prostate cancer patients. Clin Chem 2005; 51: 1538-1541. DETEKCJA KRĄŻĄCYCH KOMÓREK NOWOTWOROWYCH – TECHNIKA EPISPOT [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] 413 Alix-Panabieres C, Vendrell JP, Pellé O, Rebillard X, Riethdorf S, Müller V, Fabbro M, Pantel K. Detection and characterization of putative metastatic precursor cells in cancer patients. Clin Chem 2007; 53: 537-539. Alix-Panabieres C, Vendrell JP, Slijper M, Pelle O, Barbotte E, Mercier G. Full-length cytokeratin-19 is released by human tumor cells: a potential role in metastatic progression of breast cancer. Breast Cancer Res 2009; 11: R39. Al-Mehdi AB, Tozawa K, Fisher AB, Shientag L, Lee A, Muschel RJ. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med 2000; 6: 100-102. Becker FF, Wang X-B, Huang Y, Pethig R, Vykoukal J, Gascoyne P. Separation of human breast cancer cells from blood by differential dielectric affinity. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92(3): 860-864. Berezovskaya O, Schimmer AD, Glinskii AB, Pinilla C, Hoffman RM, Reed JC, Glinsky GV. Increased expression of apoptosis inhibitor protein XIAP contributes to anoikis resistance of circulating human prostate cancer metastasis precursor cells. Cancer Res 2005; 65: 2378-2386. Bidard FC, Fehm T, Ignatiadis M, Smerage JB, Alix-Panabieres C, Janni W, Messina C, Paoletti C, Muller V, Hayes DF. Clinical application of circulating tumor cells in breast cancer: overview of the current interventional trials. Cancer Metastasis Rev 2013; 32: 179-188. Chambers AF, Groom AC, Macdonald IC. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer 2002; 2: 563-72. Chang YS, Di Tomaso E, Mcdonald DM, Jones R, Jain RK, Munn LL. Mosaic blood vessels in tumors: frequency of cancer cells in contact with flowing blood. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 14608-14613. Christiansen JJ, Rajasekaran AK. Reassessing epithelial to mesenchymal transition as a prerequisite for carcinoma invasion and metastasis. Cancer Res 2006; 66: 8319-8326. Chu PG, Weiss LM. Keratin expression in human tissues and neoplasms. Histopathology 2002; 40: 403-439. Cohen SJ, Punt CJ, Ianotti N, Saidman BH, Sabbath KD, Gabrail NY, Picus J, Morse M, Mitchell E, Miller MC, Doyle GV, Tissing H, Terstappen LW, Meropol NJ. Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol 2008; 26: 3213-3221. Coughlin SS, Ekwueme DU. Breast cancer as a global health concern. Cancer Epidemiol 2009; 33: 315-318. Coussens LM, Werb Z. Inflammation and cancer. Nature 2002; 420: 860-867. Danila DC, Pantel K, Fleisher M, Scher HI. Circulating tumors cells as biomarkers: progress toward biomarker qualification. Cancer J 2011c; 17: 438-450. Deneve E, Riethdorf S, Ramos J, Nocca D, Coffy A, Daure`S JP, Maudelonde T, Fabre JM, Pantel K, Alix-Panabieres C. Capture of Viable Circulating Tumor Cells in the Liver of Colorectal Cancer Patients. Clin Chem 2013; 59(9): 1384-1392. Dharmasiri U, Witek MA, Adams AA, Soper SA. Microsystems for the capture of low-abundance cells. Ann Rev Anal Chem 2010; 3: 409-431. Doyen J, Alix-Panabières C, Hofman P, Parks SK, Chamorey E, Naman H, Hannoun-Lévi JM. Cir culating tumor cells in prostate cancer: A potential surrogate marker of survival. Crit Rev Oncol Hematol 2012; 81: 241-256. Fidler IJ. The pathogenesis of cancer metastasis: the ‘seed and soil’ hypothesis revisited. Nat Rev Cancer 2003; 3: 453-458. Friedl P, Wolf K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer 2003; 3: 362-374. Gray JW. Evidence emerges for early metastasis and parallel evolution of primary and metastatic tumors. Cancer Cell 2003; 4: 4-6. 414 J. BUDNA, M. ŚWIERCZEWSKA, A. JANKOWIAK, M. ZABEL [24] Hayes DF, Cristofanilli M, Budd GT, Ellis MJ, Stopeck A, Miller MC, Matera J, Allard WJ, Doyle GV, Terstappen LW. Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival. Clin Cancer Res 2006; 12: 4218-4224. [25] Hsieh HB, Marinucci D, Bethel K, Curry DN, Humphrey M, Krivacic RT, Kroener J, Kroener L, Ladanyi A, Lazarus N, Kuhn P, Bruce RH, Nieva J. High speed detection of circulating tumor cells. Biosens Bioelectron 2006; 21: 1893-1899. [26] Kelleher FC, Fennelly D, Rafferty M. Common critical pathways in embryogenesis and cancer. Acta Oncol 2006; 45: 375-388. [27] Luzzi KJ, Macdonald IC, Schmidt EE, Kerkvliet N, Morris VL, Chambers AF, Groom AC. Multistep nature of metastatic inefficiency: dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases. Am J Pathol 1998; 153: 865-873. [28] Muller V, Riethdorf S, Rack B, Janni W, Fasching PA, Solomayer E. Prognostic impact of circulating tumor cells assessed with the CellSearch System™ and AdnaTest Breast™ in metastatic breast cancer patients: the DETECT study. Breast Cancer Res 2012; 14: R118. [29] Nagrath S, Sequist LV, Maheswaran S, Bell DW, Irimia D, Ulkus L, Smith MR, Kwak EL, Digumarthy S, Muzikansky A, Ryan P, Baliss UJ, Tompkins RG, Haber DA, Toner M. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature 2007; 450: 1235-1239. [30] Naoe M, Ogawa Y, Morita J, Omori K, Takeshita K, Shichijyo T, Okumura T, Igarashi A, Yanaihara A, Iwamoto S. Detection of circulating urothelial cancer cells in the blood using the Cell Search System. Cancer 2007; 109: 1439-1445. [31] O’shaughnessy J. Extending survival with chemotherapy in metastatic breast cancer. Oncologist 2005; 10(3): 20-9. [32] Pachmann K, Heiss P, Demel U, Tilz G. Detection and quantification of small numbers of circulating tumor cells in peripheral blood using laser scanning cytometer (LSC). Clin Chem Lab Med 2001; 39: 811-817. [33] Pantel K. Circulating tumour cells in cancer patients: challenges and perspectives. Trends Mol Med 2010; 16: 398-406. [34] Pantel K, Deneve E, Nocca D, Coffy A, Vendrell JP, Maudelonde T, Riethdorf S, Alix-Panabieres C. Circulating Epithelial Cells in Patients with Benign Colon Diseases. Clin Chem 2012; 58(5): 936-940. [35] Paterlini-Brechot P, Benali NL. Circulating tumor cells (CTC) detection: Clinical impact and future directions. Cancer Lett 2007; 253: 180-204. [36] Ramirez JM, Fehm T, Orsini M, Cayrefourcq L, Maudelonde T, Pantel K, Alix-Panabieres C. Prognostic Relevance of Viable Circulating Tumor Cells Detected by EPISPOT in Metastatic Breast Cancer Patients. Clin Chem 2014; 60: 214-221. [37] Riethdorf S, Fritsche H, Muller V, Rau T, Schindlbeck C, Rack B, Janni W, Coith C, Beck K, Janicke F, Jackson S, Gornet T, Cristofanilli M, Pantel K. Detection of circulating tumor cells in peripheral blood of patients with metastatic breast cancer: a validation study of the CellSearch system. Clin Cancer Res 2007; 13: 920-928. [38] Rosenberg R, Gertler R, Friedrichs J, Fuehrer K, Dahm M, Phelps R, Thorban S, Nekarda H, Siewert JR. Comparison of two density gradient centrifugation systems for the enrichment of disseminated tumor cells in blood. Cytometry 2002; 49: 150-158. [39] Rossi E, Basso U, Celadin R, Zilio F, Pucciarelli S, Aieta M. M30 neoepitope expression in epithelial cancer: quantification of apoptosis in circulating tumor cells by CellSearch analysis. Clin Cancer Res 2010; 16: 5233- 5243. [40] Saucedo-Zeni N, Mewes S, Niestroj R, Gasiorowski L, Murawa D, Nowaczyk P, Tomasi T, Wener E, Dworacki G, Morgenthaler N, Jansen H, Propping C, Sterzynska K, Dyszkiewicz W, Zabel M, Kiechle M, Reuning U, Schmitt M, Lucke K. A novel method for the in vivo isolation of circulating DETEKCJA KRĄŻĄCYCH KOMÓREK NOWOTWOROWYCH – TECHNIKA EPISPOT [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] 415 tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire. Int J Oncol 2012; 41: 1241-1250. Siegel R, Ma J, Zou Z, Jemal A. Cancer statistics, 2014. CA Cancer J Clin 2014; 64: 9-29. Sterzyńska K, Zabel M. Metody izolacji i detekcji krążących komórek nowotworowych (CTC). Post Biol Kom 2013; 40(3): 401-419. Stott SL, Hsu CH, Tsukrov DI, Yu M, Miyamoto DT, Waltman BA, Rothenberg SM, Shah AM, Smas ME, Korir GK, Floyd FP, Gilman AJ, Lord JB, Winokur D, Springer S, Irimia D, Nagrath S, Sequist LV, Lee RJ, Isselbacher KJ, Maheswaran S, Haber DA, Toner M. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proc Natl Acad Sci USA 2010; 107(43): 18392-18397. Talasaz AH, Powell AA, Huber DE, Berbee JG, Roh KH, Yu W, Xiao W, Davis MM, Pease RF, Mindrinos MN, Jeffrey SS, Davis RW. Isolating highly enriched populations of circulating epithelial cells and other rare cells from blood using a magnetic sweeper device. Proc Natl Acad Sci USA 2009; 106(10): 3970-3975. Tan S, Yobas L, Lee G, Ong C, Lim C. Microdevice for the isolation and enumeration of cancer cells from blood. Biomed Microdevices 2009a; 11: 883-892. Toss A, Mu Z, Fernandez S, Cristofanilli M. CTC enumeration and characterization: moving toward personalized medicine. Ann Transl Med 2014; 2(11): 108. Vona G, Sabile A, Louha M, Sitruk V, Romana S, Schutze K, Capron F, Franco D, Pazzagli M, Vekemans M, Lacour B, Brechot C, Paterlini-Brechot P. Isolation by size of epithelial tumor cells: a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulating tumor cells. Am J Pathol 2000; 156: 57-63. Wang S, Liu K, Liu J, Yu ZT, Xu X, Zhao L, Lee T, Lee EK, Reiss J, Lee YK, Chung LW, Huang J, Retting M, Seligson D, Duraiswamy KN, Shen CK, Tseng HR. Highly efficient capture of circulating tumor cells by using nanostructures silicon substrates with integrated chaotic micromixers. Angew Chem Int Ed 2011; 50: 3084-3088. Wittekind C, Neid M. Cancer invasion and metastasis. Oncology 2005; 69(1): 14-16. Yokobori T, Iinuma H, Shimamura T, Imoto S, Sugimachi K, Ishii H. Plastin3 is a novel marker for circulating tumor cells undergoing the epithelial-mesenchymal transition and is associated with colorectal cancer prognosis. Cancer Res 2013; 73: 2059-2069. Yu M, Bardia A, Wittner BS, Stott SL, Smas ME, Ting DT. Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition. Science 2013; 339: 580-584. Zach O, Lutz D. Tumor cell detection in peripheral blood and bone marrow. Curr Opin Oncol 2006; 18: 48-56. Zieglschmid V, Hollmann C, Gutierrez B, Albert W, Strothoff D, Gross E, Bocher O. Combination of immunomagnetic enrichment with multiplex RT-PCR analysis for the detection of disseminated tumor cells. Anticancer Res 2005; 25(3A): 1803-1810. Redaktor prowadzący – Michał Nowicki Otrzymano:10.01.2015 Przyjęto: 09.03.2015 Joanna Budna Katedra i Zakład Histologii i Embriologii Uniwersytet Medyczny w Poznaniu ul. Święcickiego 6, 60-781 Poznań email: [email protected]
