Standardy badania parazytologicznego-wybrane aspekty

Standardy
badania
parazytologicznego-wybrane
aspekty
Diagnostyka parazytologiczna jest ważnym elementem potwierdzenia
przypadku zarażenia danym pasożytem oraz wdrożenia skutecznego
leczenia. Wykorzystywane są metody mikroskopowe, serologiczne,
molekularne oraz hodowla in vitro i/lub in vivo.
Każde laboratorium zajmujące się diagnostyką parazytologiczną powinno
opracować i wdrożyć odpowiednie procedury badawcze oraz udostępnić
zleceniodawcom instrukcje dotyczące badania (przygotowanie pacjenta do
badania, pobieranie materiału, warunki przechowywania, transportu).
Do badań parazytologicznych, w zależności od gatunku oraz poszukiwanej formy
rozwojowej pasożyta, można użyć następujących materiałów diagnostycznych:
-kału
-odcisku/wymazu okołoodbytniczego
-krwi
-moczu
-wydzieliny z dróg moczowo-płciowych
– popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowe
-plwociny
-płynu mózgowo-rdzeniowego
-treści dwunastniczej
-aspiratów z torbieli wątroby
-ropni wątroby/płuc
-materiału z gruczołów limfatycznych, szpiku, śledziony
-materiału aspirowanego ze zmian skórnych
-materiału tkankowego
-innych
Badanie kału
Kał pobiera się przed rozpoczęciem leczenia lub po 1-3 tygodniach od zakończenia
leczenia. Materiał powinien zostać oddany do czystego, suchego papierowego
woskowanego naczynia lub naczynia z tworzywa sztucznego, ewentualnie na
papier, a następnie pobrany patyczkiem z 2-3 miejsc do właściwego pojemnika,
wypełnionego maksymalnie do 2/3 objętości. Zaleca się trzykrotne wykonanie
badania kału w odstępach 2-3 dniowych w przeciągu 10 dni. Taki sposób
postępowania znacznie podnosi prawdopodobieństwo wykrycia pasożytów, przede
wszystkim nieregularnie wydalanych cyst pierwotniaków.
W przypadku badania wymazu okołoodbytniczego w kierunku owsika ludzkiego
(Enterobius vermicularis) materiał pobiera się z okolic odbytu po rozchyleniu
fałdów skórnych rano, przed myciem i oddaniem kału. Wymaz pobiera się w
odstępach 3-5 dniowych za pomocą przylepca celofanowego (metoda Grahama),
bagietki z celofanem (metoda Halla) lub wykorzystując wymazówkę z parafiną i
wazeliną.
Po pobraniu należy materiał niezwłocznie dostarczyć do laboratorium.
Transportować w temperaturze pokojowej lub schłodzone (w przypadku
poszukiwania koproantygenów). W przypadku kału uformowanego materiał może
zostać zbadany do 72 godzin od momentu pobrania, przy czym do tego czasu
powinien być przechowywany w temperaturze lodówki. Dłuższe przechowywanie
umożliwia stosowanie odpowiednich utrwalaczy. Kał wodnisty lub po środkach
przeczyszczających należy zbadać do 30 minut, kał luźny do 60 minut od pobrania
(poszukiwanie trofozoitów pierwotniaków).
Badanie powinno obejmować zarówno ocenę makroskopową (konsystencja kału,
obecność śluzu, krwi, postaci dorosłych lub fragmentów pasożytów) jak i
mikroskopową (możliwe: preparat w soli fizjologicznej, preparat podbarwiany
płynem Lugola, preparaty zagęszczane metoda sedymentacji lub flotacji, preparat
gruby wg Kato i Miura, preparat trwale barwiony, hodowla in vitro).
Informacje zawarte na wyniku badania parazytologicznego powinny obejmować
nazwę gatunkową pasożyta wraz z jego postacią rozwojową, wskazanie
przybliżonej liczby postaci rozwojowych pasożyta (mało-poniżej 2 w 10 polach
widzenia, średnio- 3-9 w 10 polach widzenia, dużo-powyżej 10 w 10 polach
widzenia), określenie innych struktur mogących świadczyć o patologii (np.
erytrocyty, włókna mięsne, kule tłuszczu, makrofagi), formę jaja glisty ludzkiej
(gdy stwierdzono obecność-jajo zapłodnione lub niezapłodnione) oraz żywotność
jaj Schistosoma (gdy stwierdzono obecność- żywe lub martwe).
Badanie krwi
Krew pobiera się przed rozpoczęciem leczenia, natomiast w przypadku
podejrzenia malarii lub babeszjozy materiał pobiera się natychmiast bez względu
na stosowanie środków farmakologicznych. Gdy lekarz podejrzewa leiszmaniozę
lub filariozę materiał można pobrać w późniejszym czasie. Przy badaniu w
kierunku malarii, jeżeli w pierwszej próbie nie wykryto zarodźców malarii,
badania wykonuje się przez kolejne 3 dni co 6 do 8 godzin. Przy badaniu w
kierunku wiciowców tkankowych częstotliwość badań to raz dziennie przez
kolejne 3 dni. W przypadku badań w kierunku filariozy zwykle pobiera się
materiał co 8 do 12 godzin przez 3 kolejne dni.
Rozmazy krwi obwodowej (preparat w soli fizjologicznej, cienki rozmaz krwi,
gruba kropla krwi) powinny zostać wykonane do 30 minut od pobrania i
przechowywane w temperaturze pokojowej. W diagnostyce stosuje się także
metodę zagęszczania mikrofilarii (wg Knott’a lub z zastosowaniem filtrów
membranowych). Do barwienia rozmazów stosuje się zwykle odczynnik Giemzy
lub Wrighta, cienkie rozmazy można barwić metodą May-Grunwald-Giemza,
natomiast w barwieniu mikrofilarii znajduje zastosowanie hematoksylina i eozyna.
Na wyniku badania mikroskopowego pasożytów powinny się znaleźć podstawowe
informacje jak wyżej wymienione, natomiast parazytemię wyraża się w %
zarażonych krwinek lub liczbie pasożytów w 1 µl krwi (inne: Plasmodium-ilość
pasożytów na 200 leukocytów; mikrofilarie-ilość w 1 ml krwi).
Badanie moczu lub wydzieliny z dróg rodnych
Mocz pobiera się jako materiał diagnostyczny w kierunku Schistosoma
haematobium, trofozoidów Trichomonas vaginalis, Dioctophyma renale oraz
mikrofilarii. W kierunku T.vaginalis można także wykorzystać badanie wymazu z
pochwy lub szyjki macicy.
W przypadku badania w kierunku S.haematobium należy pobrać 100-200 ml
moczu (bardzo ważny jest końcowy strumień) lub zastosować DZM. Zaleca się
trzykrotne pobranie w godzinach od 12.00 do 15.00 lub po wysiłku.
Przechowywanie materiału i jego transport powinien odbywać się w temperaturze
lodówki. W badaniu wykonuje się z odwirowanego moczu preparat bezpośredni
lub filtrowany przez filtry membranowe (8 µm).
W przypadku badania w kierunku T.vaginalis pobiera się tzrykrotnie początkowy
strumień moczu. Ocenia się rozmaz bezpośredni oraz barwiony. Wymaz z pochwy
ocenia się wykonując preparat w soli fizjologicznej oraz preparat barwiony
(Giemzą, trichromem lub hematoksyliną, ewentualnie błękitem metylenowym,
zielenią malachitową). Zakłada się również hodowlę in vitro na podłużu Roiron,
Diamond’a lub Simitch’a.
Badania immunologiczne
W parazytologicznej diagnostyce immunologicznej wykorzystuje się:
– wykrywanie przeciwciał w surowicy, które są produkowane przez żywiciela po
kontakcie z pasożytem (podejrzenie toksokarozy, bąblowicy, wągrzycy, włośnicy,
fascjolozy, malarii, leiszmaniozy trzewnej, filarioz, schostosomozy czy
paragonimozy)
-wykrywanie swoistych przeciwciał w płynach ustrojowych (podejrzenie
parazytozy OUN, postaci ocznej toksoplazmozy czy toksokarozy)
– wykrywanie antygenów we krwi (Malaria test)
-wykrywanie antygenów w kale (Giardia, Cryptosporidium, Entamoeba histolytica)
-wykrywanie cyst/oocyst Giardia oraz Cryptosporidium metoda IF bezpośredniej
W przypadku podejrzenia parazytozy, zwłaszcza pozajelitowej, dobrym
uzupełnieniem diagnostyki jest badanie w surowicy swoistych przeciwciał w klasie
IgG, IgM, IgA czy IgE.
Zwykle pobiera się około 3-4 ml krwi na skrzep. Tak uzyskaną surowicę należy
schłodzić i dostarczyć do 24 godzin do laboratorium.
W przypadku poszukiwania antygenów pasożytów wykorzystuje się jako materiał
diagnostyczny kał lub krew pobraną na EDTA.
Diagnostyka molekularna
Badania molekularne wykorzystuje się w diagnostyce parazytologicznej jeżeli
intensywność zakażenia jest poniżej progu wykrywalności metod
mikroskopowych, celem różnicowania gatunków bliźniaczych, celem
potwierdzenia rozpoznania lub okreslenia lekooporności pasożyta.
Wykorzystuje się kilka technik: PCR, RT-PCR, LAMP oraz FISH.
Badania molekularne prowadzone są przy podejrzeniu:
– toksoplazmozy wrodzonej (płyn owodniowy)
– w trudnościach diagnostycznych malarii (krew, szpik)
– różnicowanie Entamoeba histolytica, E.dispar oraz E.moshkovskii (kał)
– diagnozowanie bąblowicy wielojamowej (tkanka)
– inne
Hodowla in vitro i in vivo
W diagnostyce parazytologicznej stosuje się hodowle in vitro w celu zwiększenia
wykrywalności pewnych gatunków pierwotniaków i helmintów oraz różnicowania
niektórych larw filariopodobnych.
Na odpowiednich podłożach istnieje możliwośc hodowli T.vaginalis, Entamoeba
spp., Balantidium coli, Acanthamoeba spp., Naegleria spp., Leishmania spp.,
T.cruzi, T.gondii, Ancylostoma, Strongyloides.
W hodowli in vivo na myszach można wyhodować T.cruzi, T.gondii, Trichinella
spp., na szczurach T.gambiense, T.rhodesiensae, na chomikach Leishamania spp.
Każde laboratorium zajmujące się diagnostyką parazytologiczną powinno
opracować i wdrożyć odpowiednie procedury badawcze
Możliwości diagnostyki parazytoz rodzimych i tropikalnych są coraz szersze.
Jednych z najważniejszych elementów wykrywania chorób pasożytniczych jest
wybranie odpowiedniego materiału do badań. W związku z faktem, iż w ciągu
ostatnich kilkunastu lat znacznie zwiększyła się ilość podróży zagranicznych,
należy pamiętać, że wzrosło również prawdopodobieństwo zarażenia się
pasożytami z rejonów tropikalnych i subtropikalnych, i nie zapominać o
uwzględnieniu ich w dochodzeniu diagnostycznym.
mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny
Piśmiennictwo:
Myjak P. i wsp. Standardy w zakresie laboratoryjnych czynności w parazytologii
medycznej, oceny ich jakości i wartości diagnostycznej oraz laboratoryjnej
interpretacji i autoryzacji wyników badań. Diagnostyka laboratoryjna 2011; 3(47):
341-351.
Data publikacji: 02.04.2013r.