Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii
advertisement
Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki Recommendations for susceptibility testing to antimicrobial agents of selected bacterial species. Waleria Hryniewicz, Agnieszka Sulikowska, Katarzyna Szczypa, Jolanta Krzysztoń-Russjan, Marek Gniadkowski Krajowy Ośrodek Referencyjny, d/s Lekowrażliwości Drobnoustrojów Centralne Laboratorium Surowic i Szczepionek w Warszawie 00-725 Warszawa, ul. Chełmska 30/34, tel.: + 22 8514670; fax/tel.: + 22 8412949 Streszczenie Oznaczanie lekowrażliwości jest jednym z najważniejszych etapów diagnostyki mikrobiologicznej. Szerokie stosowanie antybiotyków pociąga za sobą ciągły wzrost oporności na leki wśród wielu klinicznie ważnych drobnoustrojów, a także pojawianie się nowych mechanizmów oporności. W związku z tym mikrobiolog jest zobowiązany nie tylko do ich prawidłowego określenia, ale także do ich klinicznej interpretacji. Dlatego, mamy nadzieję, że przedstawione zalecenia pomogą we właściwym wykonywaniu antybiogramów i interpretacji uzyskanego wyniku lekowrażliwości. Summary Susceptibility testing is one of the most important steps in microbiological diagnostics. The widespread use of antimicrobial agents has resulted in the dramatic increase of resistance in many pathogens towards various groups of drugs and in the emergence of new resistance mechanisms. . In this situation microbiologist is obliged not only to perform correctly susceptibility testing but also to be able to provide clinical interpretation of underlying mechanisms of resistance. Thus we hope that the recommendations will help in proper performance and interpretation of the susceptibility testing. 1 Wstęp Jednym z najważniejszych etapów rutynowej diagnostyki mikrobiologicznej zakażeń bakteryjnych jest oznaczanie wrażliwości na leki. W chwili obecnej stosuje się wiele różnych metod identyfikacji oporności, od prostych testów fenotypowych do bardziej skomplikowanych metod, wykorzystujących techniki biologii molekularnej. Prawidłowy schemat oznaczania wrażliwości coraz częściej wymaga łączenia kilku metod w celu dokładnej identyfikacji mechanizmu odpowiedzialnego za oporność. Niniejsze opracowanie omawia zasady doboru testów w rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej. Podstawową i nadal powszechnie stosowaną w oznaczaniu wrażliwości jest opracowana na początku lat sześćdziesiątych metoda dyfuzji antybiotyku z krążka w żelu agarowym [2]. Obecnie, wszystkie istniejące w innych krajach normy oznaczania wrażliwości na leki są pochodnymi tej techniki, z powodzeniem stosowanej od blisko czterdziestu lat [1,4,12,15]. Mimo swej prostoty wymaga ona od mikrobiologa precyzji wykonania i ciągłej kontroli jakości na każdym etapie postępowania. Coraz częściej przyjmuje się jednak, że w przypadku identyfikacji mechanizmów oporności szczególnie groźnych z punktu widzenia terapeutycznego bądź epidemiologicznego, niezbędne jest także rutynowe stosowanie metod przeglądowych [3,12,15], oznaczanie najmniejszego stężenia hamującego leku [12] lub wręcz identyfikacja genu warunkującego oporność [3]. Nie wolno również zapominać, że w przewidywaniu i weryfikowaniu wyniku niezbędna jest identyfikacja gatunku badanego drobnoustroju. Ramy niniejszego opracowania nie pozwalają na zamieszczenie pełnego komentarza, dotyczącego kryteriów wyboru testów. Bezwzględnie jednak należy przyjąć, że zakres badanych leków powinien być indywidualnie dobierany w zależności od stanu chorego, miejsca, w którym toczy się zakażenie oraz drobnoustroju je wywołującego. Konieczna jest również ciągła wewnątrzlaboratoryjna kontrola jakości wykonywanych oznaczeń, regularnie weryfikowana w zewnętrznych sprawdzianach, np. POLMICRO [8]. Należy również pamiętać, że przedstawione tutaj zasady doboru antybiotyków/chemioterapeutyków do oznaczania wrażliwości drobnoustrojów na leki mają służyć jako podstawa wyboru właściwego celowanego postępowania terapeutycznego. Zasady te stale są uaktualniane, co odzwierciedla zarówno pojawiające się nowe mechanizmy oporności jak i zmieniające się w związku z tym kryteria interpretacji klinicznej [8]. Należy pamiętać, że mikrobiolog udziela konsultacji medycznej, a szczególnie ważnym elementem jego pracy jest umiejętność interpretacji wyniku badania mikrobiologicznego. 2 Niniejsze rekomendacje opracowano w Krajowym Ośrodku Referencyjnym d/s Lekowrażliwości Drobnoustrojów powołanym decyzją Ministra Zdrowia i Opieki Społecznej w 1997 r. (Pismo nr.PNN-01-80-EP/96 z dnia 29.01.97r.). Głównym celem powołania Ośrodka jest stała współpraca i konsultacja z wszystkimi placówkami zajmującymi się diagnostyką mikrobiologiczną w kraju. Wszystkie szczepy, u których zidentyfikowano nowe, nie opisywane dotychczas na świecie lub/i w Polsce oraz bardzo rzadkie fenotypy oporności (np. oporne na glikopeptydy enterokoki, gronkowce o obniżonej wrażliwości na leki tej grupy, oporne na karbapenemy pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae itd.), lub sprawiające trudności diagnostyczne powinny być przesyłane do Ośrodka, który dysponuje możliwością wykonania badań potwierdzających takich jak oznaczanie najmniejszego stężenia antybiotyku hamującego wzrost drobnoustroju (ang. minimal inhibitory concentration-MIC), wykrywanie genów oporności. Ośrodek poddaje się zewnętrznej kontroli jakości prowadzonej przez Center for Diseases Control (CDC) w Atlancie i Światową Organizację Zdrowia (WHO), stale współpracując z tymi organizacjami i uczestniczy w organizowaniu Krajowych Zewnętrznych Sprawdzianów Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych (POLMICRO) [8]. Podstawą metodyczną niniejszych rekomendacji w zakresie wykonania, interpretacji i standaryzacji oznaczania lekowrażliwości jest norma National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) [12,14] uzupełniona w niektórych przypadkach o zalecenia Towarzystw Naukowych, dane z publikacji i doświadczenia własne. Wykaz użytych skrótów znajduje się na końcu opracowania. W celu lepszego zrozumienia zagadnień dotyczących oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów zamieszczono w niniejszym opracowaniu podstawowe definicje terminów powszechnie używanych w mikrobiologii i farmakologii odnoszących się do zagadnień lekowrażliwości [6]. Antybiotyk – substancja o aktywności przeciwdrobnoustrojowej, wytwarzana przez mikroorganizmy (bakterie, grzyby) lub uzyskana na drodze półsyntetycznej bądź syntetycznej, lecz mająca naturalny wzorzec Chemioterapeutyk – substancja o aktywności przeciwdrobnoustrojowej, uzyskana na drodze syntezy chemicznej, nie posiadająca naturalnego wzorca Kontrola jakości (ang. quality control – QC)– jest złożonym procesem mającym na celu wykrywanie i korygowanie błędów pojawiających się w procesie diagnostycznym. Prawidłowo przeprowadzany program kontroli jakości gwarantuje, że wyniki badań wydawane przez laboratorium są dokładne, wiarygodne oraz powtarzalne. W programie tym oceniana jest jakość pobranego i dostarczonego do laboratorium materiału, metodologia testów diagnostycznych, podłoża, odczynniki, narzędzia oraz praca personelu laboratoryjnego i umiejętność interpretacji 3 wyniku badania. Bardzo istotne jest również prawidłowe prowadzenie dokumentacji laboratoryjnej. Wrażliwość – termin ten jest używany w dwóch znaczeniach mikrobiologicznym i klinicznym Wrażliwość mikrobiologiczna - oznacza, że dany szczep należy do najbardziej wrażliwej populacji i nie posiada mechanizmów oporności. Wrażliwość kliniczna – oznacza wrażliwość drobnoustroju na standardowe dawki leku. Niektórzy autorzy oddzielają w pełni wrażliwe drobnoustroje od granicznie wrażliwych, które pomimo posiadania oporności niskiego stopnia, zwykle są wrażliwe na standardowe dawki terapeutyczne. Istnieje wiele czynników, modulujących odpowiedź drobnoustroju na leczenie, w związku z tym trudno jest czasem przewidzieć efekt kliniczny. Dlatego też definicja oparta jest na ocenie wrażliwości in vitro na dany antybiotyk, jego właściwościach farmakokinetycznych i farmakodynamicznych, a zwłaszcza na określeniu możliwego do osiągnięcia stężenia antybiotyku w miejscu zakażenia (praktycznie bierze się pod uwagę stężenie możliwe do osiągnięcia w surowicy krwi). Kategorie wrażliwości, według których interpretujemy wynik oznaczania lekowrażliwości są oparte na skuteczności klinicznej. Średnia wrażliwość – bakterie są klasyfikowane jako, średniowrażliwe jeśli należą do grupy szczepów, które znajdują się pomiędzy klinicznie wrażliwymi i klinicznie opornymi. Sukces kliniczny w takich zakażeniach jest trudny do przewidzenia, ale może być osiągnięty, jeśli zastosujemy antybiotyk w wyższej dawce, zwiększymy częstotliwość podawania leku lub, jeśli antybiotyk ulega zagęszczeniu w miejscu zakażenia osiągając wysokie stężenia (np. w układzie moczowym). Wrażliwość w tym przypadku powinna być potwierdzona oznaczeniem MIC. Oporność - termin ten jest używany w trzech znaczeniach: mikrobiologicznym, farmakologicznym i klinicznym. Oporność mikrobiologiczna – oznacza, że dany szczep posiada mechanizm oporności. Może być to oporność niskiego lub wysokiego stopnia. Oporność farmakologiczna – bakterie są oporne w sensie farmakologicznym, jeśli mogą przeżyć w obecności antybiotyku w stężeniu wyższym niż jest możliwy do osiągnięcia in vivo. Oporność kliniczna – oznacza, że sukces terapeutyczny jest niemożliwy do osiągnięcia pomimo zastosowania maksymalnych dawek antybiotyku. Oporność krzyżowa – oznacza niewrażliwość na wszystkie lub niektóre antybiotyki należące do tej samej grupy chemicznej (np. antybiotyki β-laktamowe, aminoglikozydy, makrolidy) lub czasem niespokrewnionej grupy chemicznej, gdy miejsca uchwytu dla antybiotyków znajdują się blisko siebie (np. oporność na makrolidy i linkozamidy). Mechanizmy oporności wynikające z braku przepuszczalności błony komórkowej lub aktywnego wypompowywania leku z komórki 4 mogą powodować oporność na więcej niż jedną grupę chemiczną, zjawisko to jest niekiedy określane jako oporność skojarzona. MIC (ang. minimal inhibitory concentration) określa najmniejsze stężenie leku, wyrażone w mg/l, określone w warunkach in vitro, hamujące wzrost bakterii przy określonej gęstości inokulum i w określonym czasie. MBC (ang. minimal bactericidal concentration) określa minimalne stężenie leku, wyrażone w mg/l, oznaczone w warunkach in vitro, przy którym ginie 99,9% komórek bakteryjnych, przy określonej gęstości inokulum i w określonym czasie. Tolerancja – jest wynikiem braku aktywacji enzymów autolitycznych przez antybiotyk βlaktamowy, który wykazuje spadek lub brak działania bakteriobójczego bez utraty działania hamującego (nie zmienia się wartość MIC). Przyjęta definicja tolerancji oznacza stosunek MBC/MIC 32 lub więcej. Oporność naturalna – stała cecha gatunku, rodzaju, rodziny (itd.) drobnoustrojów. Naturalna oporność wynika z: 1. braku w komórce bakteryjnej celu (“receptora”) dla danego antybiotyku lub niskiego powinowactwa do niego (antybiotyki β-laktamowe – Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae; cefalosporyny i penicyliny izoksazolilowe – Enterococcus spp.) 2. braku lub niskiej penetracji/transportu antybiotyku przez ścianę komórkową (makrolidy, glikopeptydy – Enterobacteriaceae; aminoglikozydy - Enterococcus spp., Streptococcus spp.) 3. wytwarzania enzymu inaktywującego antybiotyk (karbapenemy – karbapenemaza zależna od jonów cynku u Stenotrophomonas maltophilia) Oporność nabyta – nowa cecha szczepu wynikająca ze zmian materiału genetycznego. Metody określania wrażliwości: Dyfuzja z krążka w agarze – dyfuzja antybiotyku z krążka bibułowego na podłożu stałym, na które naniesiono zawiesinę bakteryjną o określonej gęstości. Miarą wrażliwości badanego szczepu jest wielkość średnicy strefy zahamowania wzrostu wokół krążka nasyconego antybiotykiem, która często, ale nie zawsze koreluje z wartością MIC. Metoda rozcieńczeń w bulionie – wykonywana w probówkach (metoda makrorozcieńczeń – minimalna objętość bulionu wynosi 2ml) lub płytkach titracyjnych (metoda mikrorozcieńczeń objętość bulionu w każdej studzience wynosi 100µl). Metoda makrorozcieńczeń jest stosowana tam gdzie pojawia się potrzeba wykonania oznaczenia dla pojedynczego szczepu. Buliony zawierające antybiotyk o znanych malejących stężeniach (zazwyczaj stosuje się podwójne rozcieńczenia) są zaszczepione określoną liczbą komórek bakteryjnych. Odczyt polega na 5 obserwacji zmętnienia podłoża po określonym czasie. Celem tej metody jest określenie najmniejszego stężenia hamującego (MIC) lub najmniejszego stężenia bakteriobójczego (MBC). Metoda rozcieńczeń w agarze – w metodzie tej antybiotyk jest obecny w podłożu agarowym w malejących stężeniach (jedno stężenie na jedną płytkę z agarem), na które posiewana jest zawiesina bakteryjna o określonym inokulum. Celem badania jest określenie najmniejszego stężenia hamującego (MIC). Określanie wartości MIC za pomocą E-testów – polega na dyfuzji antybiotyku z plastikowego paska ze stopniowo zmieniającymi się stężeniami (gradient). Badanie przeprowadza się na podłożu stałym, na które naniesiono zawiesinę bakteryjną o określonej gęstości. Inokulum – liczba komórek bakteryjnych w podłożu płynnym, wyrażana jako liczba jednostek tworzących kolonię na mililitr (ang. colony-forming unit per millilitre CFU/ml). Może być również określane jako zmętnienie lub gęstość optyczna zawiesiny bakteryjnej. Stężenie graniczne (ang. breakpoint) – określona wartość MIC lub określona wielkość strefy zahamowania wzrostu będąca podstawą do zakwalifikowania danego szczepu do jednej z trzech kategorii klinicznych: “wrażliwy”, “średniowrażliwy” lub “oporny”. Aby dokładnie określić stężenie graniczne używamy znaków: < oznacza “mniej niż”, ≤ oznacza “mniejszy lub równy”, > oznacza “większy niż”, ≥ oznacza “większy lub równy”. Spektrum – termin określający zakres aktywności antybiotyku wobec jednego bądź większej liczby gatunków bakterii (np. Gram-dodatnie, Gram-ujemne, tlenowe, względnie beztlenowe, bezwzględnie beztlenowe). Nabycie przez drobnoustrój mechanizmu oporności może zmienić wzór jego wrażliwości na dany antybiotyk, a niekiedy także na inne i w związku z tym zmienić zakres aktywności (spektrum) antybiotyku. Ponadto w tekście użyte są pojęcia: Antybiogram podstawowy - zawiera antybiotyki stosowane jako leki pierwszego rzutu Antybiogram podstawowy dla szczepów z moczu - zawiera antybiotyki stosowane jako leki pierwszego rzutu wobec szczepów izolowanych z zakażeń układu moczowego. Antybiogram rozszerzony - zawiera rozszerzoną listę antybiotyków stosowanych wobec drobnoustrojów (również dla szczepów z zakażeń układu moczowego) wieloopornych i/lub izolowanych z ciężkich zakażeń. 6 1. Oznaczanie wrażliwości szczepów z rodzaju Staphylococcus spp. 1.1. Badanie należy wykonywać na podłożu MHA, inkubować 16-18 godzin, w temperaturze 35oC, w warunkach tlenowych. Dla oksacyliny, meticyliny i wankomycyny inkubację prowadzić pełne 24 godziny. 1.2. Oznaczanie wrażliwości na antybiotyki β-laktamowe. Zawsze należy oznaczać oporność na meticylinę, bowiem szczepy MRSA izoluje się z narastającą częstością z zakażeń pozaszpitalnych. Stosujemy w tym celu jedną z niżej wymienionych metod: 1.2.1. Metoda dyfuzyjno-krążkowa. Oznaczając wrażliwość metodą dyfuzyjną dla Staphylococcus spp. antybiogram inkubuje się 24 godziny, na podłożu MHA, w temperaturze 35oC [14]. Inokulum 0,5 McFarlanda należy przygotować z czystej 18-24h hodowli na płytce agarowej z krwią. Odczyt przeprowadzać w świetle przechodzącym, należy zwrócić uwagę na obecność mikrokolonii w strefie zahamowania wzrostu mogących świadczyć o oporności badanego szczepu, lub zanieczyszczeniu szczepem opornym. UWAGA! W identyfikacji szczepów Staphylococcus aureus należy pamiętać, że istnieją szczepy Staphylococcus aureus nie posiadające clumping factor (CF-ujemne) a wytwarzające koagulazę wolną z opóźnieniem. 7 Kryteria klasyfikacji szczepów gronkowcowych na podstawie wyników oznaczania wrażliwości na meticylinę. Staphylococcus aureus (SA) 1 krążek z antybiotykiem 1 oporny MRSA oksacylina 1 µg [15] ≤10 11-12 meticylina 5 µg [15] ≤9 10-13 wrażliwy średnio 2 MSSA wrażliwy Staphylococcus spp. (koagulazo-ujemne) (CNS) 3 oporny MRCNS wrażliwy MSCNS ≥13 ≤17 ≥18 ≥14 nie stosować nie stosować - nie należy stosować krążków z innymi penicylinami półsyntetycznymi niż oksacylina i meticylina do oznaczania wrażliwości na meticylinę; w żadnym wypadku nie stosować krążka z kloksacyliną. Użycie krążka z oksacyliną jest najwłaściwsze, ponieważ oksacylina jest mniej podatna na degradację przez β-laktamazy. 2 - w przypadku otrzymania wyniku średniowrażliwy dla S. aureus należy wykonać oznaczenie metodą przeglądową, lub stwierdzić obecność genu mecA metodą PCR. 3 - Nie zaleca się testowania wrażliwości na oksacylinę szczepów Staphylococcus. saprophyticus, ponieważ nawet szczepy nie posiadające genu mecA (genu warunkującego oporność na meticylinę) w badaniu in vitro mogą być oporne. Rutynowe oznaczanie wrażliwości szczepów S. saprophyticus izolowanych z moczu nie jest zalecane, ze względu na wysoką koncentrację w moczu leków przeciwbakteryjnych, powszechnie używanych w leczeniu ostrego, niepowikłanego zapalenia pęcherza moczowego (np. trimetoprim, kotrimoksazol, fluorochinolony). 1.2.2. Metoda przeglądowa z oksacyliną dla S. aureus (nie zaleca się stosowania tej metody dla gronkowców koagulazo-ujemnych) Na podłoże MHA z oksacyliną w stężeniu 6 mg/l i dodatkiem 4% NaCl posiać wymazówką zawiesinę o gęstości 0.5 McFarlanda lub nanieść pipetą 50 µl jej stukrotnego rozcieńczenia [12]. Inkubować 24 godziny w temp. 35oC. Odczytywać w świetle przechodzącym, wzrost świadczy o oporności na meticylinę. 1.2.3. Metody komercyjne, na przykład: A.Test ATB OXA lub ATB STAPH (bioMerieux) z użyciem podłoża ATB Na Medium stosować zgodnie z instrukcją producenta [19]. B.Test Cristal MRSA ID (Becton Dickinson) stosować zgodnie z instrukcją producenta [9,18]. 8 C. E-test (AB BIODISK). Stosować zgodnie z instrukcja producenta [5]. Testy oparte o wykrywanie białka PBP2’ (2a), nowego białka, produktu genu mecA, warunkującego oporność na meticylinę [16]: A. MRSA-Screen – Denka Seiken (Innogenetics) B. Slidex MRSA Detection (bioMerieux) C. Oxoid PBP2’- DR900M (Oxoid) 1.3. Metoda przeglądowa z wankomycyną dla S. aureus Z całonocnej hodowli na podłożu agar z krwią baranią przygotować zawiesinę o gęstości 0,5 McFarlanda, nanieść punktowo 10 µl zawiesiny na podłoże BHIA z wankomycyną o stężeniu 6 mg/l (wg Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów zaleca się użycie wankomycyny w stężeniu 4 mg/l), inkubować pełne 24 godziny w temp. 350C (jeśli wynik jest ujemny inkubację przedłużyć do 48 godzin) i oceniać w świetle przechodzącym [12]. 1.3.1. Metoda przeglądowa z wankomycyną dla S. aureus wg Hiramatsu [17] Założyć hodowlę bulionową w podłożu BHI broth, doprowadzić do optycznej gęstości OD = 0.3 przy długości fali 578 nm (108 CFU/ml), rozcieńczyć 10-krotnie (107 CFU/ml), następnie 100 µl tej zawiesiny nanieść i rozprowadzić równomiernie na płytkę BHIA z zawartością 4 mg/l wankomycyny. Inkubować w 37°C przez 24 h, a w przypadku braku wzrostu inkubację przedłużyć do 48 h. Izolaty wrażliwe na wankomycynę nie wykazują wzrostu po 48h hodowli. W przypadku wzrostu drobnoustroju na w/w podłożach szczep taki należy przesłać do laboratorium referencyjnego celem przeprowadzenia dokładnych badań ilościowych. 1.4.Szczepy wzorcowe: Do metody krążkowej: Staphylococcus aureus ATCC 25923 - wrażliwy na meticylinę Escherichia coli ATCC 35218 - służy do kontroli jakości antybiotyków β-laktamowych w połączeniach z inhibitorami β-laktamaz (kwas klawulanowy, sulbaktam, tazobaktam) Do metody przeglądowej z oksacyliną w podłożu: Staphylococcus aureus ATCC 29213 – wrażliwy na meticylinę Staphylococcus aureus ATCC 43300 - oporny na meticylinę lub 9 Staphylococcus aureus MR3 - z kolekcji Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds Lekowrażliwości Drobnoustrojów - szczep o heterogennej ekspresji oporności na meticylinę Do metody przeglądowej z wankomycyną w podłożu: Staphylococcus aureus ATCC 700698 (Mu3) Staphylococcus aureus ATCC 700699 (Mu50) ANTYBIOGRAM PODSTAWOWY oksacylina 1 µg Oznaczenie wrażliwości na meticylinę. erytromycyna 15 µg Wynik oznaczania wrażliwości na erytromycynę jest reprezentatywny dla roksytromycyny, klarytromycyny, azytromycyny i dirytromycyny. linkomycyna 15 µg lub klindamycyna 2 µg Krążek z linkozamidem należy układać obok krążka z erytromycyną w celu identyfikacji indukowalnej oporności na makrolidy, linkozamidy i streptograminy w mechanizmie MLSB; Z doświadczenia Ośrodka Referencyjnego wynika, że linkomycyna jest bardziej przydatna do wykrywania tego typu oporności. Kryteria dla linkomycyny: oporność przy strefie < 16 mm, wrażliwość > 21mm[16]. UWAGA!W związku z wysokim procentem szczepów gronkowców, wytwarzających penicylinazy (ponad 90 % szczepów szpitalnych), można pominąć rutynowe oznaczanie wrażliwości na penicylinę. W przypadku oznaczania wytwarzania penicylinaz należy stosować krążek z nitrocefiną (test cefinazowy) lub oznaczać oporność na penicylinę metodą dyfuzyjną krążkiem z penicyliną 10 IU. SZCZEPY OPORNE NA METICYLINĘ (MRSA i MRCNS) SĄ OPORNE IN VIVO NA WSZYSTKIE ANTYBIOTYKI β-LAKTAMOWE, tj. PENICYLINY, PENICYLINY SKOJARZONE Z INHIBITORAMI β-LAKTAMAZ, CEFALOSPORYNY I KARBAPENEMY. Oporność na meticylinę jest terminem najczęściej używanym, w piśmiennictwie mogą być użyte także określenia: oporność na oksacylinę lub szczepy oporne na oksacylinę (ORSA, ORCNS). Pojęcia te są równoważne. Szczepy homogennie oporne na meticylinę są zwykle wielooporne (i mogą być oporne na tetracykliny, aminoglikozydy, makrolidy, często też na linkosamidy, chloramfenikol, kotrimoksazol i fluorochinolony) [9]. Należy jednak pamiętać, że na podstawie typu ekspresji oporności (heterogenna vs homogenna) nie można wnioskować na temat wrażliwości szczepu. 10 ANTYBIOGRAM PODSTAWOWY DLA SZCZEPÓW IZOLOWANYCH Z MOCZU oksacylina 1 µg Oznaczanie wrażliwości na meticylinę j.w. ofloksacyna 5 µg lub norfloksacyna 10 µg Stosowanie fluorochinolonów nie jest zalecane u pacjentów poniżej 16 roku życia. nitrofurantoina 300 µg Nieaktywna wobec S. saprophyticus i S. epidermidis. trimetoprim/sulfametoksazol 1,25/23,75 µg (kotrimoksazol) trimetoprim 5 µg 11 ANTYBIOGRAM ROZSZERZONY wankomycyna 30 µg Antybiotyk z wyboru w leczeniu zakażeń wywołanych przez MRSA. W związku z doniesieniami o średnio-wrażliwych i opornych na wankomycynę S. aureus (VISA, VRSA) zalecane jest oznaczanie wrażliwości na wankomycynę metodą przeglądową lub za pomocą E-testu (ściśle wg zaleceń producenta). Szczepy mające MIC dla wankomycyny.·4 mg/l należy przesłać do laboratorium referencyjnego. teikoplanina 30 µg Może być mniej aktywna od wankomycyny wobec niektórych szczepów gronkowców, zwłaszcza koagulazo-ujemnych; S. haemolyticus ma naturalnie obniżoną wrażliwość na teikoplaninę. tetracyklina 30 µg Wrażliwość na tetracyklinę jest reprezentatywna dla wszystkich leków z tej grupy. Doksycyklina i minocyklina mogą być nastawiane, ponieważ istnieją szczepy oporne na tetracyklinę, a wrażliwe na doksycyklinę i zwłaszcza na minocyklinę. Minocyklina nie jest zarejestrowana w Polsce. Nie zaleca się stosowania tetracyklin u dzieci poniżej 12 r.ż. chloramfenikol 30 µg Stosować wyjątkowo (ze względu na ciężkie działania niepożądane – anemia aplastyczna) wobec szczepów izolowanych z płynu mózgowo-rdzeniowego lub niewrażliwych na wszystkie inne antybiotyki. Można oznaczać w przypadku zakażeń, w których prowadzi się leczenie miejscowe, np. z oka i z worka spojówkowego, gdy brak innych możliwości terapeutycznych. ciprofloksacyna 5 µg lub ofloksacyna 5 µg Należy pamiętać o szybkim narastaniu oporności na fluorochinolony u gronkowców, nie stosować w monoterapii. Nie zaleca się stosowania fluorochinolonów u dzieci poniżej 16 r.ż. rifampicyna 5 µg Stosować wyjątkowo, wyłącznie w ciężkich zakażeniach wobec szczepów wieloopornych; nie stosować w monoterapii. gentamicyna 10 µg Wynik badania jest reprezentatywny dla wszystkich aminoglikozydów; badać zwłaszcza szczepy izolowane z krwi; leków z tej grupy nie stosować w monoterapii, najlepiej kojarzyć z antybiotykami β-laktamowymi lub glikopeptydami. trimetoprim/sulfametoksazol 1,25/23,75 µg mupirocyna 200 µg Służy do likwidacji nosicielstwa MRSA w nosie (preparat na bazie parafiny), należy ograniczyć stosowanie w szpitalach we wskazaniach dermatologicznych (preparat na bazie glikolu polietylenowego) ze względu na zidentyfikowanie w Polsce epidemicznego, szpitalnego szczepu MRSA o wysokiej oporności na mupirocynę. Strefa zahamowania wzrostu <10 mm świadczy o wysokiej oporności. kwas fusydowy 10 µg Za oporne uważać izolaty o strefie zahamowania < 14 mm, za wrażliwe >22 mm [16]. chinupristyna/dalfopristyna 15 µg Preparat Synercid jest już zarejestrowany w Polsce, może być zastosowany do leczenia zakażeń o etiologii VISA, VRSA. W przypadku szczepu opornego na makrolidy w mechanizmie MLSB. Synercid nie wykazuje działania bakteriobójczego. linezolid 30 µg Preparat Zyvox jest dostępny w imporcie docelowym, może być zastosowany do leczenia zakażeń o etiologii VISA, VRSA. 12 2. Oznaczanie wrażliwości Enterococcus spp. 2.1. Badanie należy wykonywać na podłożu MHA, inkubować 16 - 18 godzin, w temperaturze 35oC, w warunkach tlenowych. Inkubację dla wankomycyny należy prowadzić 24 godziny. 2.2. Szczepy wzorcowe: Do metody krążkowej: Staphylococcus aureus ATCC 25923 Do metody przeglądowej: Enterococcus faecalis ATCC 29212 – szczep wrażliwy na aminoglikozydy i wankomycynę, Do kontroli jakości oznaczania oporności na wysokie stężenia aminoglikozydów. Służy także do kontroli zawartości w podłożu tyminy i tymidyny, przy prawidłowej zawartości strefa wokół krążka z kotrimoksazolem ≥20 mm. Enterococcus faecalis ATCC 51299 – szczep oporny na aminoglikozydy i wankomycynę, służy do kontroli jakości podłoży stosowanych do oznaczania oporności na wankomycynę i wysokiej oporności na aminoglikozydy w metodzie przeglądowej. 13 ANTYBIOGRAM PODSTAWOWY penicylina 10 IU 1 i ampicylina 10 µg 2 1 - oznacza również wrażliwość na aminopenicyliny (ampicylina, amoksycylina) i ureidopenicyliny (piperacylina) oraz na odpowiednie preparaty z inhibitorami βlaktamaz, 2 - oznacza również wrażliwość dla wszystkich aminopenicylin i odpowiednich preparatów skojarzonych z inhibitorami β-laktamaz Preparaty skojarzone z inhibitorami stosować tylko w zakażeniach wywołanych florą mieszaną. gentamicyna 120 µg streptomycyna 300 µg Z klinicznego punktu widzenia istotne jest oznaczanie jedynie tzw. wysokiej oporności na aminoglikozydy (HLAR). Wrażliwość na gentamycynę i streptomycynę oznacza możliwość leczenia skojarzonego z aminopenicylinami, ureidopenicylinami (oraz odpowiednimi preparatami z inhibitorami β-laktamaz) lub z glikopeptydami. W przypadku oporności na wysokie stężenia gentamycyny, a przy wrażliwości na wysokie stężenia streptomycyny, można stosować streptomycynę w terapii skojarzonej z w/w antybiotykami β-laktamowymi i glikopeptydami. Interpretacja wyników oznaczania HLAR metodą dyfuzyjną: strefa > 10 mm szczep bez HLAR, brak strefy zahamowania wzrostu - szczep HLAR; strefa < 9 mm - wynik niejednoznaczny ⇒ badanie należy powtórzyć metodą przeglądową na podłożu BHI agar z gentamycyną w stężeniu 500 mg/l lub/i streptomycyną 2000 mg/l. wankomycyna 30 µg Konieczne jest, aby inkubację prowadzić pełne 24 godziny a odczyty dokonywać w świetle przechodzącym; wzrost mgławicowy lub obecność kolonii w strefie zahamowania wzrostu uznajemy za oporność. Zalecane jest oznaczanie wrażliwości szczepów enterokokowych metodą przeglądową na podłożu BHI agar z wankomycyną w stężeniu 6 mg/l, w temp 35 oC; posiewać inokulum 0,5 Mc Farlanda; inkubację prowadzić 24 godziny, (jeśli wynik jest ujemny inkubację przedłużyć do 48 godzin); w metodzie dyfuzyjnej dokładnie sprawdzić obecność mikrokolonii w strefie zahamowania wzrostu, świadczące o oporności szczepu (oglądać w świetle przechodzącym). teikoplanina 30 µg UWAGA! Należy pamiętać, aby nie oznaczać wrażliwości dla szczepów Enterococcus spp. na cefalosporyny, klindamycynę i kotrimoksazol ponieważ enterokoki posiadają naturalną oporność na te leki. Informacje te można umieszczać pod wynikiem antybiogramu. 14 ATYBIOGRAM PODSTAWOWY DLA SZCZEPÓW IZOLOWANYCH Z MOCZU penicylina 10 IU 1 i ampicylina 10µg 1 2 - oznacza również wrażliwość na aminopenicyliny (ampicylina, amoksycylina) i ureidopenicyliny (piperacylina) oraz na odpowiednie preparaty z inhibitorami β-laktamaz. 2 - oznacza również wrażliwość dla wszystkich aminopenicylin. i odpowiednich preparatów skojarzonych z inhibitorami β-laktamaz. Preparaty skojarzone z inhibitorami stosować tylko w zakażeniach wywołanych florą mieszaną. Można stosować ampicylinę (amoksycylinę) w monoterapii w leczeniu zakażeń układu moczowego o etiologii E. faecalis, ponieważ gatunek ten jest powszechnie wrażliwy na ten antybiotyk. Większość szczepów E. faecium jest opornych na ampicylinę [10]. nitrofurantoina 300 µg tetracyklina 30 µg Wrażliwość na tetracyklinę jest reprezentatywna dla wszystkich leków z tej grupy. Doksycyklina i minocyklina mogą być nastawiane, ponieważ istnieją szczepy oporne na tetracyklinę, a wrażliwe na doksycyklinę i minocyklinę. Nie zaleca się stosowania u dzieci poniżej 12 r.ż. Minocyklina nie jest zarejestrowana w Polsce. ciprofloksacyna 5 µg lub. Nie zaleca się stosowania fluorochinolonów u dzieci poniżej 16 r.ż. norfloksacyna 10 µg trometamol fosfomycyny 200 µg 3 3 Preparat przeznaczony do leczenia ostrego zapalenia pęcherza (cystitis). W zakażeniach wywołanych przez enterokoki stosować tylko wobec E. faecalis. - krążek z fofsomycyną 200µg zawiera 50µg glukozo-6-fosforanu; w przypadku oznaczania MIC fosfomycymy metodą rozcieńczeń w agarze do podłoża należy dodać 25mg/l glukozo-6-fosforanu. Nie oznaczać MIC metodami rozcieńczeń w bulionie. 15 ATYBIOGRAM ROZSZERZONY Jeśli mamy do czynienia ze szczepami wieloopornymi oraz VRE izolowanymi z zakażeń zagrażających życiu (grupa chorych z obniżoną odpornością) należy dodatkowo oznaczyć wrażliwość na inne leki np.: chloramfenikol, rifampicynę, erytromycynę, które nie są stosowane w standardowej terapii zakażeń enterokokowych. Zawsze oznaczać MIC dla takich szczepów! imipenem 10 µg Stosować tylko w wyjątkowych sytuacjach i tylko do leczenia zakażeń wywołanych przez E. faecalis; E. faecium posiada naturalną oporność na imipenem. erytromycyna 15 µg tetracyklina 30 µg Wrażliwość na tetracyklinę jest reprezentatywna dla wszystkich leków z tej grupy. Doksycyklina i minocyklina mogą być nastawiane ponieważ istnieją szczepy oporne na tetracyklinę, a wrażliwe na doksycyklinę i minocyklinę. Minocyklina nie jest zarejestrowana w Polsce. Nie zaleca się stosowania tetracyklin u dzieci poniżej 12 r.ż. chloramfenikol 30 µg Stosować wyjątkowo, zawsze po oznaczeniu MIC. rifampicyna 5 µg Stosować wyjątkowo, tylko wobec szczepów wieloopornych; nie stosować w monoterapii. chinupristyna/dalfopristyna Preparat Synercid jest już zarejestrowany w Polsce, może być stosowany do leczenia zakażeń o etiologii Enterococcus faecium opornego na wankomycynę 15 µg (VRE). E. faecalis chinupristynę/dalfopristynę. linezolid 30 µg posiada naturalną oporność na Preparat Zyvox jest dostępny w imporcie docelowym, może być stosowany wobec E. faecium i E. faecalis opornych na wankomycynę (VRE). 16 3. Oznaczanie wrażliwości Streptococcus pneumoniae. 3.1. Badanie należy wykonywać na podłożu KBMHA, inkubować 20- 24 godziny, w temperaturze 35oC, w atmosferze, 5 % CO2. 3.2. Szczepy wzorcowe: Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 ANTYBIOGRAM PODSTAWOWY oksacylina 1 µg erytromycyna 15 µg Krążkiem z oksacyliną bada się wrażliwość na penicylinę. Wrażliwość na penicylinę oznacza wrażliwość na aminopenicyliny, aminopenicyliny w połączeniu z inhibitorami β-laktamaz, cefalosporyny I,II,III generacji. Nie można podać interpretacji: średniowrażliwy i oporny tylko na podstawie interpretacji wielkości strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z oksacyliną - strefa ≤19mm, dla takich izolatów. W przypadku szczepów izolowanych z zakażeń inwazyjnych oraz szczepów o obniżonej wrażliwości na penicylinę (strefa ≤19mm wokół krążka z oksacyliną) bezwzględnie oznaczać MIC penicyliny i cefalosporyn III generacji (cefotaksymu lub ceftriaksonu)1. Szczepy oporne na penicylinę są oporne na cefalosporyny I i II generacji, a niekiedy nawet III generacji, poza tym mogą wykazywać brak wrażliwości na szereg innych grup terapeutycznych jak: makrolidy, tetracykliny, chloramfenikol, kotrimoksazol. UWAGA! Wybór i skuteczność antybiotyków β-laktamowych w przypadku zakażenia szczepem o średniej wrażliwości na penicylinę jest uzależnione od miejsca toczącego się zakażenia. W takim przypadku możemy je z powodzeniem stosować w zakażeniach dróg oddechowych, pod warunkiem np. podwyższenia dawki. Natomiast stosowanie w zakażeniach OUN cefalosporyny III generacji mogą okazać się skuteczne pod warunkiem zwiększenia dawki bądź w terapii skojarzonej. Wynik badania wrażliwości na erytromycynę jest reprezentatywny roksytromycyny, klarytromycyny, azytromycyny i dirytromycyny. dla trimetoprim/sulfametoksazol Ponad 30% szczepów izolowanych w Polsce jest opornych. 1,25/23,75 µg (kotrimoksazol) 1 - Interpretacja wartości MIC dla penicyliny i cefalosporyn III generacji Wartość MIC (mg/l) Antybiotyk wrażliwy średniowrażliwy oporny penicylina ≤0,06 0,12-1 ≥2 cefotaksym lub ceftriakson ≤0,5 1 ≥2 17 ANTYBIOGRAM ROZSZERZONY klindamycyna 2µg wankomycyna 30 µg Badać rutynowo szczepy izolowane z krwi, płynu mózgowo-rdzeniowego i materiału pochodzącego z groźnych zakażeń; o ile możliwe oznaczać MIC wankomycyny dla takich izolatów. teikoplanina 30 µg j.w., oporność przy strefie zahamowania wzrostu <16 mm. tetracykliny 30 µg Wrażliwość na tetracyklinę jest reprezentatywna dla wszystkich leków z tej grupy. Doksycyklina i minocyklina mogą być nastawiane, ponieważ istnieją szczepy oporne na tetracyklinę, a wrażliwe na doksycyklinę i minocyklinę Minocyklina nie jest zarejestrowana w Polsce. Nie zaleca się stosowania tetracyklin u dzieci poniżej 12 r.ż. moksifloksacyna 5µg Pierwszy fluorochinolon z aktywnością wobec pneumokoków, zarejestrowany tylko do leczenia wybranych zakażeń układu oddechowego. Nie zaleca się stosowania fluorochinolonów u dzieci poniżej 16 r.ż. chloramfenikol 30 µg Stosować wyjątkowo tylko w zakażeniach OUN. Zawsze oznaczyć MIC. rifampicyna 5 µg Stosować wyjątkowo, jedynie w ciężkich zakażeniach wieloopornymi szczepami. Należy umieścić informację, że nie powinna być stosowana w monoterapii. chinupristyna/dalfopristyna Preparat Synercid jest już zarejestrowany w Polsce, może być zastosowany do leczenia ciężkich zakażeń 15 µg linezolid 30 µg Preparat Zyvox jest dostępny w imporcie docelowym. 18 4. Oznaczanie wrażliwości paciorkowców β-hemolizujących i jamy ustnej (ang. oral streptococci), dawniej paciorkowce zieleniące 4.1.Badanie należy wykonywać na podłożu KBMHA, inkubować 20 - 24 godziny, w temperaturze 35oC, w warunkach tlenowych z dodatkiem 5% CO2. 4.2. Szczepy wzorcowe: Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 ANTYBIOGRAM PODSTAWOWY penicylina 10 IU lub ampicylina 10 µg W przypadku paciorkowców zieleniących izolowanych w monokulturze z materiałów jałowych w warunkach fizjologicznych (krew, płyn mózgowo rdzeniowy, kości) zalecane jest oznaczanie MIC penicyliny. W przypadku paciorkowców β-hemolizujących gr. B (S. agalactiae) oznaczać zawsze wrażliwość na ampicylinę (mogą wykazywać obniżoną wrażliwość na penicylinę); S. pyogenes jest powszechnie wrażliwy na penicylinę G, (jeżeli strefa wokół krążka z penicyliną <24mm, taki szczep należy przesłać do laboratorium referencyjnego). erytromycyna 15 µg Wynik oznaczania wrażliwości na erytromycynę jest reprezentatywny dla roksytromycyny, klarytromycyny, azytromycyny i dirytromycyny. klindamycyna 2 µg ANTYBIOGRAM ROZSZERZONY cefotaksym 30 µg lub ceftriakson30µg ofloksacyna 5 µg Badać zwłaszcza izolaty z zakażeń ośrodkowego układu nerwowego. Kryteria interpretacyjne dotyczą jedynie szczepów paciorkowców βhemolizujących. Szybkie narastanie oporności na fluorochinolony. Nie zaleca się stosowania fluorochinolonów u dzieci poniżej 16 r.ż. Nie należy oznaczać wrażliwości w przypadku szczepów izolowanych z układu wankomycyna 30 µg moczowego. lub teikoplanina 30 µg chloramfenikol30µg chinupristyna/dalfopristyna 15 µg tertracyklina 30 µg 19 Paciorkowce βhemolizujących krążek z antybiotykiem strefa w mm O1 Ś1 W1 Paciorkowce jamy ustnej (ang. oral streptococci) MIC O strefa w mm MIC Ś W O Ś W O Ś W penicylina 10UI/ ampicylina 10µg2 - - ≥24 ≤0,12 - - - - - ≤0,12 0,25-2 ≥4 - - ≥24 ≤0,25 - - - - - ≤0,25 0,5-4 ≥8 cefotaksym 30µg ceftriakson 30µg - - ≥24 ≤0,5 - - ≤25 26-27 ≥28 ≤0,5 1 ≥2 ≥24 ≤0,5 - - ≤24 25-26 ≥27 ≤0,5 1 ≥2 cefepim 30µg - ≥24 ≤0,5 - - ≤21 ≥24 ≤0,5 1 ≥2 - 22-23 1 O-oporny, Ś-średniowrażliwy, W-wrażliwy 2 oznaczenie wrażliwości na penicylinę/ampicylinę metodą dyfuzyjno-krążkową tylko dla paciorkowców β-hemolizujących W przypadku zakażeń uogólnionych, wywołanych przez paciorkowce jamy ustnej o obniżonej wrażliwości na penicylinę, antybiotyki ß-laktamowe stosować w terapii skojarzonej z aminoglikozydami. 5. Oznaczanie wrażliwości Moraxella catarrhalis 5.1. Badanie należy wykonywać na podłożu MHA, inkubować 18 - 20 godzin, w temperaturze 35oC, w warunkach tlenowych. 5.2. Wytwarzanie β-laktamaz należy badać krążkiem z nitrocefiną (test cefinazowy). Jest to jedyna wiarygodna metoda. O wytwarzaniu β -laktamaz można pośrednio wnioskować na podstawie oznaczania wrażliwości na penicylinę i ampicylinę metodą dyfuzyjną. Ze względu na powszechne wytwarzanie β-laktamaz (ponad 90% szczepów M. catarrhalis wytwarza β-laktamazę) badanie to można pominąć. W leczeniu zakażeń wywołanych przez M. catarrhalis produkujących β-laktamazę skuteczne są leki: ampicylina/sulbaktam, amoksycylina/kwas klawulanowy, cefalosporyny II (cefaklor, cefuroksym) i III generacji, fluorochinolony, makrolidy, tetracykliny. 20 6. Oznaczanie wrażliwości Haemophilus influenzae 6.1. Badanie należy wykonywać na podłożu HTM. Bardzo ważna jest standaryzacja zawiesiny zwłaszcza, gdy oznaczamy wrażliwość na antybiotyki β-laktamowe, ponieważ przy wyższym inokulum można otrzymać wynik fałszywie wskazujący na oporność. Zawiesinę przygotowujemy bezpośrednio w 0,9% NaCl lub bulionie MuellerHinton z jednodniowej hodowli stałej na agarze czekoladowym. Na posiane płytki o średnicy 9-10 cm z podłożem HTM można nałożyć do 4 krążków. Inkubacja w atmosferze, CO2 (optymalnie 5-7%) przez 16-18 godzin. Skład podłoża HTM: agar Mueller-Hintona; 15 µg/ml hematyny; 15 µg/ml NAD, 5 mg/ml ekstraktu drożdżowego. UWAGA! Podłoże najlepiej przygotować w laboratorium, a jego okres ważności wynosi wówczas około 2-ch tygodni; przechowywać w temperaturze 2-4 °C. 6.2. Szczepy wzorcowe: Haemophilus influenzae ATCC 49766 - służy do kontroli jakości oznaczania wrażliwości na karbapenemy i wybrane cefalosporyny (cefaklor, cefamandol, cefprozil, cefuroksym) Escherichia coli ATCC 35218 - służy do kontroli jakości antybiotyków β-laktamowych w połączeniach z inhibitorami β-laktamaz (kwas klawulanowy, sulbaktam, tazobaktam) Haemophilus influenzae ATCC 49247 – szczep BLNAR, służy do kontroli jakości oznaczania wrażliwości na pozostałe antybiotyki ANTYBIOGRAM PODSTAWOWY ampicylina 10 µg U szczepów niewrażliwych na ampicylinę konieczne jest oznaczanie wytwarzania βlaktamaz krążkiem z nitrocefiną (test cefinazowy). Przy braku cefinazy można użyć krążka z amoksycyliną z kwasem klawulanowym 20µg/10µg. Jeżeli wynik testu jest ujemny a strefa wokół krążka z ampicyliną wskazuje na brak wrażliwosci to należy podejrzewać oporność wynikającą ze zmian w PBP (krążek z 2µg lepiej wykrywa ten typ oporności [1] - brak rekomendacji NCCLS). Szczepy ampicylinooporne, β-laktamazo-ujemne (BLNAR) należy przesyłać do ośrodka referencyjnego. Ten mechanizm oporności występuje bardzo rzadko. trimetoprim/sulfameto ksazol 1,25/23,75 µg (kotrimoksazol) Około 20% szczepów opornych. azytromycyna 15 µg Ze względu na brak szczepów opornych ustalono dla azytromycyny jedynie kategorię “wrażliwy” przy strefie zahamowania wzrostu >12 mm. lub klarytromycyna 15 µg Interpretacja dla klarytromycyny jest następująca: ≤ 10mm oporny; 11mm-12mm średniowrażliwy; ≥ 13mm wrażliwy cefuroksym 30 µg 21 ANTYBIOGRAM ROZSZERZONY Stosować do oznaczeń lekowrażliwości izolatów pochodzących z płynu mózgowordzeniowego, krwi oraz od pacjentów z zagrożeniem życia cefotaksym 30 µg Nie opisano szczepów opornych na cefalosporyny III generacji. chloramfenikol 30 µg Szczepy izolowane z płynu mózgowo-rdzeniowego. rifampicyna 5 µg Stosować wyjątkowo, jedynie w ciężkich zakażeniach wieloopornymi szczepami, należy umieścić informację, że nie powinna być stosowana w monoterapii. tetracyklina 30 µg Wrażliwość na tetracyklinę jest reprezentatywna dla wszystkich leków z tej grupy. Doksycyklina i minocyklina mogą być nastawiane ponieważ istnieją szczepy oporne na tetracyklinę, a wrażliwe na doksycyklinę i minocyklinę Nie zaleca się stosowania u dzieci poniżej 12 r.ż. Minocyklina nie jest zarejestrowana w Polsce. Szczepy oporne na tetracykliny spotyka się sporadycznie. ciprofloksacyna 5 µg Nie zaleca się stosowania fluorochinolonów u dzieci poniżej 16 r.ż. Oporność na fluorochinolony występuje niezwykle rzadko; szczepy oporne należy przesłać do laboratorium referencyjnego. aztreonam 30 µg meropenem 10 µg 7. Wrażliwość pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae. 7.1. Badanie należy wykonywać na podłożu MHA, inkubacja 18-20 godz., w temperaturze 35oC, warunki tlenowe. W przypadku “pełzających” szczepów Proteus spp. ignorować wtórny wzrost w strefach zahamowania wzrostu, jeżeli nie przekracza on 20% wzrostu zasadniczego. 7.2. Szczepy wzorcowe: Escherichia coli ATCC 25922 Escherichia coli ATCC 35218 - służy do kontroli jakości antybiotyków β-laktamowych w połączeniach z inhibitorami β-laktamaz (kwas klawulanowy, sulbaktam, tazobaktam) Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 - służy do kontroli jakości oznaczania ESBL 22 ANTYBIOGRAM PODSTAWOWY ampicylina 10 µg Wynik badania reprezentatywny dla ampicyliny i amoksycyliny, nie oznaczać dla Enterobacter spp., Serratia spp., Morganella spp., Providencia spp. i Citrobacter freundii. amoksycylina/ kw. klawulanowy 20/10µg lub ampicylina/sulbaktam 10/10 µg Nie oznaczać dla Enterobacter spp., Serratia spp., Morganella spp., Providencia spp. i Citrobacter freundii. cefalotyna 30 µg Reprezentatywna dla cefaleksyny, cefradyny, cefakloru i cefadroksylu. Nie oznaczać dla Enterobacter spp., Serratia spp., Morganella spp., Providencia spp. i Citrobacter freundii. cefazolina 30 µg Nie oznaczać dla Enterobacter spp., Serratia spp., Morganella spp., Providencia spp. i Citrobacter freundii. cefuroksym 30 µg Enterobacter spp., Serratia spp., Morganella spp. i Citrobacter freundii wykazują naturalnie obniżoną wrażliwość. lub cefamandol 30 µg gentamicyna 10 µg UWAGA! rutynowo oznaczać wytwarzanie ESBL u Escherichia coli i Klebsiella spp. (zaleca się też u innych Enterobacteriaceae) Oznaczanie wytwarzania ESBL wg NCCLS - wyłącznie u szczepów Escherichia coli i Klebsiella spp. Warunki hodowli, tzn. wielkość inokulum, temperatura, czas hodowli i podłoża pozostają bez zmian. 23 Testy przeglądowe wstępne 1 Testy potwierdzające2 cefpodoksym 10 µg lub gdy strefa ≤ 22 mm wykonać test potwierdzający ceftazydym 30 µg ceftazydym 30 µg lub gdy strefa ≤ 22 mm wykonać test potwierdzający aztreonam 30 µg lub gdy strefa ≤ 27 mm wykonać test potwierdzający cefotaksym 30 µg lub gdy strefa ≤ 27 mm wykonać test potwierdzający i cefotaksym/kwas ceftriakson 30 µg gdy strefa ≤ 25 mm wykonać test potwierdzający klawulanowy 30/10µg 1 i ceftazydym/kwas klawulanowy 30/10µg oraz cefotaksym 30 µg - Dla zwiększenia czułości testu powinno się oznaczać wrażliwość dla kilku cefalosporyn. 2 - Test potwierdzający polega na zastosowaniu następujących krążków: ceftazydym 30 µg i ceftazydym/kwas klawulanowy 30/10µg oraz cefotaksym30 µg i cefotaksym/kwas klawulanowy 30/10µg (Becton Dickinson, Oxoid, MAST Laboratories) Jeśli szczep wytwarza ESBL to strefa wokół krążka zawierającego antybiotyk i inhibitor β-laktamaz jest większa lub równa 5mm od strefy wokół krążka z samym antybiotykiem. Standaryzacja warunków wykonania testów wstępnych powinna być przeprowadzona wraz ze szczepami wzorcowymi: Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 i Escherichia coli ATCC 25922. W przypadku testów potwierdzających z Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 różnica stref dla ceftazydymu powinna być nie mniejsza niż 5mm, a dla cefotaksymu nie mniejsza niż 3mm. Dla szczepu Escherichia coli ATCC 25922 analogiczna różnica stref nie powinna być większa niż 2 mm. 24 Poniższa tabela przedstawia zakresy stref w milimetrach dla wybranych antybiotyków. Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Escherichia coli ATCC 25922 antybiotyk (strefa w mm) (strefa w mm) cefpodoksym 10 µg 9-16 23-28 ceftazydym 30 µg 10-18 25-32 aztreonam 30 µg 9-17 28-36 cefotaksym 30 µg 17-25 29-35 ceftriakson 30 µg 16-24 29-35 Na polskim rynku dostępne są E testy pozwalające wykrywać ESBL zawierające ceftazydym/ceftazydym + kwas klawulanowy (TZ/TZL), produkowane przez firmę AB BIODISK oraz krążki cefpodoksymu z kwasem klawulanowym (10/1µg) produkowane przez firmę Oxoid. Test dwóch krążków (DDST) może być nadal stosowany do wykrywania ESBL. Może być stosowany również u innych gatunków niż Klebsiella spp. i Escherichia coli. SZCZEPY WYTWARZAJĄCE ß-LAKTAMAZY O ROZSZERZONYM SPEKTRUM SUBSTRATOWYM (ESBL) NALEŻY TRAKTOWAĆ JAKO SZCZEPY OPORNE LUB POTENCJALNIE OPORNE NA WSZYSTKIE PENICYLINY (BEZ POŁĄCZEŃ Z INHIBITORAMI), CEFALOSPORYNY (Z WYJĄTKIEM, CEFAMYCYN) I MONOBAKTAMY [7,11]. 25 ANTYBIOGRAM PODSTAWOWY DLA SZCZEPÓW IZOLOWANYCH Z MOCZU ampicylina 10 µg Wynik badania reprezentatywny dla ampicyliny i amoksycyliny. Nie oznaczać dla Enterobacter spp., Serratia spp., Morganella spp., Providencia spp. i Citrobacter freundii. amoksycylina/ kw. klawulanowy 20/10µg lub ampicylina/sulbaktam 10/10 µg Nie oznaczać dla Enterobacter spp., Serratia spp., Morganella spp., Providencia spp. i Citrobacter freundii. cefalotyna 30 µg Reprezentatywna dla cefaleksyny, cefradyny, cefakloru i cefadroksylu. Nie oznaczać dla Enterobacter spp., Serratia spp., Morganella spp., Providencia spp. i Citrobacter freundii. cefuroksym 30 µg lub cefamandol 30 µg Enterobacter spp., Serratia spp., Morganella spp. i Citrobacter freundii wykazują naturalną oporność lub średnią wrażliwość. tetracyklina 30 µg Wrażliwość na tetracyklinę jest reprezentatywna dla wszystkich leków z tej grupy. Doksycyklina i minocyklina mogą być nastawiane, ponieważ istnieją szczepy oporne na tetracyklinę, a wrażliwe na doksycyklinę i minocyklinę. Minocyklina nie jest zarejestrowana w Polsce. Nie zaleca się stosowania tetracyklin u dzieci poniżej 12 r.ż. norfloksacyna 10 µg lub ofloksacyna 5 µg Nie zaleca się stosowania fluorochinolonów u dzieci poniżej 16 r.ż. nitrofurantoina 300 µg Nieaktywna wobec Proteus spp. trimetoprim/sulfametoksazol 1,25/23,75 µg (kotrimoksazol) trometamol fosfomycyny 200µg 1 Stosować tylko w leczeniu ostrego niepowikłanego zapalenia pęcherza o etiologii E.coli. 1 - krążek z fofsomycyną 200µg zawiera 50µg glukozo-6-fosforanu; w przypadku oznaczania MIC metodą rozcieńczeń w agarze do podłoża należy dodać 25mg/l glukozo-6-fosforanu. Nie oznaczać MIC fosfomycymy metodami rozcieńczeń w bulionie. 26 ANTYBIOGRAM ROZSZERZONY piperacylina 100 µg lub mezlocylina 75 µg tikarcylina 75 µg tikarcylina/ kw. klawulanowy 75/10 µg piperacylina/tazobaktam 100/10 µg cefoperazon 75 µg cefoksytyna 30 µg Nie oznaczać u Enterobacter spp., Serratia spp., Morganella spp., Providencia spp. i Citrobacter freundii. cefotaksym 30 µg lub ceftriakson 30 µg Powinny być oznaczane dla szczepów pochodzących z zakażeń ośrodkowego układu nerwowego. ceftazydym 30 µg cefprozil 30 µg Cefalosporyna doustna – nie polecana do oznaczeń dla Providencia spp., przy zakażeniach dróg moczowych, wskazania identyczne jak dla cefuroksymu. cefpodoksym 10 µg Cefalosporyna doustna-nie polecana do oznaczeń Morganella spp., odnośnie zakażeń dróg moczowych wskazania identyczne jak dla cefuroksymu. lorakarbef 30 µg Nie oznaczać wrażliwości dla szczepów Citrobacter spp., Providencia spp., Enterobacter spp. cefepim 30 µg Wykazuje aktywność in vitro wobec szczepów produkujących ESBL oraz cefalosporynazy Amp C, jednakże doświadczenia kliniczne są ciągle niewielkie. aztreonam 30 µg imipenem 10 µg meropenem 10 µg ciprofloksacyna 5 µg lub Nie zaleca się stosowania fluorochinolonów u dzieci poniżej 16 r.ż. amikacyna 30 µg netilmicyna 30 µg Szczepy Serratia spp. mają obniżoną wrażliwość na netilmicynę. tobramycyna 10 µg chloramfenikol 30 µg Stosować wyjątkowo, tylko wobec szczepów wieloopornych, ze względu na poważne działania niepożądane. kotrimoksazol 1,25/23,75 µg 27 7a. Oznaczanie wrażliwości pałeczek Salmonella – Shigella ANTYBIOGRAM PODSTAWOWY ampicylina 10 µg ciprofloksacyna 5 µg lub inne fluorochinolony Nie zaleca się stosowania fluorochinolonów u dzieci poniżej 16 r.ż. trimetoprim/sulfametoksazol 1,25/23,75 µg (kotrimoksazol) UWAGA! W przypadku zakażeń uogólnionych oznaczać wrażliwość na cefalosporyny III-ej generacji i chloramfenikol. Nie oznaczać wrażliwości na cefalosporyny I i II generacji oraz na aminoglikozydy, ponieważ mimo wrażliwości in vitro nie ma skuteczności klinicznej [13,14]. 8. Oznaczanie wrażliwości Pseudomonas spp. i Acinetobacter spp. 8.1.Badanie należy wykonywać na podłożu MHA, inkubować 16 - 18 godzin, w temperaturze 35oC,w warunkach tlenowych. 8.2. Szczepy wzorcowe: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 - służy do kontroli jakości antybiotyków oraz do oznaczania zawartości Ca2+ i Mg2+ w podłożu Escherichia coli ATCC 35218 - służy do kontroli jakości antybiotyków β-laktamowych w połączeniach z inhibitorami β-laktamaz (kwas klawulanowy, sulbaktam, tazobaktam) UWAGA ! W przypadku szczepów Aeromonas spp., Flavobacterium spp., Stenotrophomonas maltophilia i Burkholderia cepacia zawsze oznaczać MIC badanych antybiotyków. Ze względu na wielooporność szczepów Acinetobacter spp. dla nich również badanie wrażliwości na leki powinno polegać na oznaczeniu MIC. 28 ANTYBIOGRAM PODSTAWOWY mezlocylina 75 µg lub tikarcylina 75 µg piperacylina 100 µg ceftazydym 30 µg gentamycyna 10 µg tobramycyna 10 µg Koniecznie dla Pseudomonas aeruginosa ANTYBIOGRAM DLA SZCZEPÓW IZOLOWANYCH Z MOCZU piperacylina 100 µg ceftazydym 30 µg gentamicyna 10 µg tetracyklina 30 µg Może być nastawiana dla S. maltophilia, Acinetobacter spp. i Pseudomonas spp. innych niż P. aeruginosa. Wrażliwość na tetracyklinę jest reprezentatywna dla wszystkich leków z tej grupy. Doksycyklina i minocyklina mogą być nastawiane, ponieważ istnieją szczepy oporne na tetracyklinę, a wrażliwe na doksycyklinę i minocyklinę. Minocyklina nie jest w Polsce zarejestrowana. Nie zaleca się stosowania tetracyklin u dzieci poniżej 12 r.ż. norfloksacyna10µg lub ofloksacyna 5 µg Nie zaleca się stosowania fluorochinolonów u dzieci poniżej 16 r.ż. trimetoprim/sulfametoksaol 1,25/23,75 µg (kotrimoksazol) Może być nastawiany dla S. maltophilia, Acinetobacter spp. i Pseudomonas spp. innych niż P. aeruginosa 29 ANTYBIOGRAM ROZSZERZONY tikarcylina/kw.klawulanowy 75/10µg Dla P. aeruginosa i Acinetobacter spp. ampicylina/ sulbaktam 10/10 µg Oznaczać wrażliwość wyłącznie dla Acinetobacter spp. ze względu na dobrą aktywność sulbaktamu wobec tego rodzaju. piperacylina/tazobaktam 100/10µg Dla P. aeruginosa i Acinetobacter spp. cefepim 30 µg Aktywność zbliżona do aktywności ceftazydymu. cefoperazon 75 µg Wysoki procent szczepów opornych. cefotaksym 30 µg lub ceftriakson Wysoki procent szczepów opornych. 30 µg imipenem 10 µg lub meropenem 10 µg Oznaczać wrażliwość na meropenem w przypadku szczepów opornych na imipenem wg kryterium: wrażliwość na meropenem i imipenem przy strefie zahamowania > 16 mm, oporność <13 mm. aztreonam 30 µg amikacyna 30 µg Szybkie narastanie oporności. netilmicyna 30 µg Szybkie narastanie oporności. Wysoki procent szczepów opornych. ciprofloksacyna 5 µg Szybkie narastanie oporności Nie fluorochinolonów u dzieci poniżej 16 r.ż. trimetoprim/sulfametoksazol 1,25/23,75 µg (kotrimoksazol) Może być badany dla S. maltophilia, Acinetobacter spp. i Pseudomonas spp. innych niż P. aeruginosa. chloramfenikol 30 µg Stosować wyjątkowo, tylko wobec szczepów wieloopornych ze względu na poważne działania niepożądane. Może być badany dla S. maltophilia, Acinetobacter spp. i Pseudomonas spp. innych niż P. aeruginosa. zaleca się stosowania 30 Interpretacja wrażliwości dla Acinetobacter spp. wrażliwy (strefa w mm) średnio-wrażliwy (strefa w mm) oporny (strefa w mm) ampicylina/ sulbaktam 10/10 µg ≥15 12-14 ≤11 piperacylina/tazobaktam 100/10µg ≥21 18-20 ≤17 tikarcylina/kw. klawulanowy 75/10µg ≥20 15-19 ≤14 Antybiotyk Ze względu na wielooporność szczepów Acinetobacter spp. najwłaściwsze jest badanie wrażliwości na leki poprzez oznaczenie wartości MIC. Interpretacja wrażliwości dla Pseudomonas aeruginosa wrażliwy (strefa w mm) oporny (strefa w mm) piperacylina/tazobactam 100/10µg ≥18 ≤17 tikarcylina/kw. klawulanowy 75/10µg ≥15 ≤14 Antybiotyk 31 Skróty użyte w rekomendacjach: BHI wyciąg mózgowo-sercowy BLNAR ang. β-lactamase negative ampicillin resistant - szczepy H. influenzae β-laktamazoujemne oporne na ampicylinę ESBL gextended-spectrum substratowym β-lactamase - β-laktamaza o rozszerzonym spektrum HLAR ang. high-level aminoglycoside-resistance - wysoka oporność na aminoglikozydy HTM ang. haemophilus test medium - podłoże do badania pałeczek hemofilnych IU międzynarodowa jednostka penicyliny KBMHA agar Mueller-Hintona z 5 % odwłóknionej krwi baraniej MHA agar Mueller-Hintona MLSB ang. resistance to macrolide, lincosamide and streptogramin B MRCNS ang. methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci - oporne na meticylinę gronkowce koagulazo-ujemne MRSA ang. methicillin-resistant S.aureus - S. aureus oporny na meticylinę MSCNS ang. methicillin-susceptible coagulase-negative staphylococci - wrażliwe na meticylinę gronkowce koagulazo-ujemne MSSA ang. methicillin-susceptible S. aureus - S. aureus wrażliwy na meticylinę NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards ORCNS ang. oxacillin -resistant coagulase-negative staphylococci - oporne na oksacylinę gronkowce koagulazo-ujemne ORSA ang. oxacillin- resistant S. aureus - S. aureus oporny na oksacylinę PBP ang. penicillin-binding protein - białko wiążące penicylinę TSA agar tryptozowo-sojowy TSB bulion tryptozowo-sojowy VISA ang. vancomycin intermediate S. aureus - S. aureus średniowrażliwy na wankomycynę VRE ang. vancomycin resistance enterococci – enterokoki oporne na wankomycynę VRSA ang. vancomycin resistance S. aureus - S. aureus oporny na wankomycynę 32 Piśmiennictwo: 1. A Guide to sensitivity testing. Report of the Working Party on Antimicrobial Sensitivity Testing of the British Society for Antimicrobial Chemotherapy. Academic Press Ltd.,1991 2. Bauer A.W., W.M.M. Kirby, J.C. Sherris, M. Turck. Antibiotic Susceptibility testing by a standardized single disk method. Amer. J. Clin. Pathol.,1966, 45: 493 3. Current Protocools for Clinical Microbiology. Antimicrobial Susceptibility Testing. red: J. Hindler. ASM,1995 4. Deutsche Institut für Normung, Normenausschuss Medizin: DIN 58940 Methoden der Empfindlichkeisprufung von bakteriellen Krankheitserregern (auβer Mykobakterien) gegen Chemtherapeutika in: DIN-Taschenbuch 222 “Medizinische Mikrobiologie und Immunologie, Normen und weitere Unterlagen” 2. Auflage, Beuth Verlag GmbH Berlin und Köln,1992 5. ETM, Etest Techical Manual, AB BIODISK, Dalvägen 10, S-169 56 Solna, Sweden. Edition 2000. 6. Eucast definitive document Methods for the determination of susceptibility of bacteria to antimicribial agents.Terminology. Clin. Microbiol. Infect.,1998, 4: 291 7. Gniadkowski M., Trzciński K., Pałucha A., Hryniewicz W. Wykrywanie β-laktamaz o rozszerzonym zakresie działania (ESBL) w izolatach klinicznych Klebsiella pneumoniae: test dwóch krążków i test ATB BLSE. Diag. Laborator., 1996, 32: 697 8. Hryniewicz W., Młodzińska E., Żurek E., Fiett J., Gniadkowski M. V Krajowy Zewnętrzny Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych-POLMICRO’98 w Polsce. Mikrobiologia Medycyna ,2000, 2: 23 9. Hryniewicz W., Trzciński K. The current situation and perspectives of standardization in susceptibility testing in Poland. Antiinfect.Drugs Chemother.,1994, 13: 35 10. Hryniewicz W., Zaręba T., Kawalec M. Susceptibility patterns of Enterococcus spp. isolated in Poland during 1996. Int. J. Antimicrob. Ag.,1998,10: 303 11. Livermore D.M .β-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin. Microbiol. Rev., 1995,8: 557 12. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically Approved standard - Fifth edition; NCCLS Document M7-A4, January 2000 13. Miller I. S., Hohman E. L., Pegues D. A. Salmonella (including Salmonella typhi). [W:] Principles and practice of infectious diseases. 4 wyd., red. G.L. Mandell, J.E. Douglas, R. Dolin. Churchil Livingstone, New York, 1995, 2026 33 14. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; Eleventh informational supplement. NCCLS M100-S11; M100-S10, January 2001 15. Report of the Comite de l’Antibiogram de la Societe Francaise de Microbiologie. Clin. Microbiol. Infect., 1996,2, suppl.1,11 16. Russjan-Krzysztoń J., Mrówka A., Hryniewicz W. Szybka identyfikacja oporności Staphylococcus spp. na meticylinę przy użyciu testu lateksowego „MRSA-Screen”. Diag. Laborator. 2000, 36, 219-224. 17. Trakulsomboon S, Danchaivijitr S, Rongrungruang Y, Dhiraputra C, Susaemgrat W, Ito T, Hiramatsu K.: First report of methicillin-resistant Staphylococcus aureus with reduced susceptibility to vancomycin in Thailand. J Clin Microbiol. 2001; 39 (2): 591-5. 18. Trzciński K., Boruc J., Kowalik Z., Tyski S., Zaręba T., Hryniewicz W. Ocena wiarygodności metod oznaczania oporności szczepów Staphylococcus aureus na metycylinę. Med. Dośw. Mikrobiol., 1994, 46: 113 19. Trzciński K, Klarowicz A., Hryniewicz W. Przydatność testów ATB STPH i ATB OXA do identyfikacji oporności na metycylinę szczepów Staphylococcus aureus. Diag. Laborator. 1996, 23: 447. 34
