Metody badania aktywności leków in vitro

Artur Wnorowski
Zakład Biofarmacji
Uniwersytet Medyczny w Lublinie
Wersja: 1.2
Rok: 2016
Metody badania aktywności leków
in vitro
Cytotoksyczność związków i
żywotność komórek
Oznaczanie żywotności komórek
• Czytnik płytek
(ang. plate-reader)
• Cytometria przepływowa
(ang. flow cytometry)
• Mikroskopia HCI
(ang. high content
imaging)
Oznaczanie żywotności komórek
• Zasada
– Pośredni pomiar liczebności żywych komórek
– Oznaczenie „aktywności znacznikowej”, która jest
związana z żywotnością komórek
measurement of a marker activity associated with viable cell number
• Zastosowanie
– Do pomiaru proliferacji komórek
– Do oznaczania cytotoksyczności związków
– Jako wewnętrzna kontrola podczas innych testów
komórkowych (ang. multiplexing as an internal
control)
Oznaczanie żywotności komórek
• Testy oparte o redukcję soli tetrazolowej
different classes of colorimetric tetrazolium reagents
• Redukcja resazuryny do rezorufiny
resazurin reduction
• Pomiar aktywności proteolitycznej
protease substrates generating a fluorescent signal
• Pomiar stężenia ATP w komórkach
luminogenic ATP assay
Testy kolorymetryczne i oparte o
pomiar fluorescencji
• Dodanie odczynnika właściwego dla danego
testu
• Inkubacja komórek z odczynnikiem; żywe
komórki metabolizują odczynnik do
– Barwnego produktu
– Produktu o innej barwie
– Produktu o właściwościach fluorescencyjnych
• Detekcja produktu przy użyciu czytnika
Testy redukcji soli tetrazolowej
Tetrazolium Reduction Assays
Jak się
nazywam?
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium
bromide
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
Testy redukcji soli tetrazolowej
Tetrazolium Reduction Assays
 Ilość powstającego formazanu ma odpowiadać liczbie
żywych (aktywnych metabolicznie) komórek
 Komórki umierając tracą zdolność to przekształcania
MTT w formazan
 Dokładny mechanizm przemiany MTT w formazan nie
jest znany
 NADH (dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy) lub
inny związek redukujący jako źródło elektronów
 Udział mitochondriów w reakcji
Testy redukcji soli tetrazolowej
Tetrazolium Reduction Assays
• MTT (3-(4,5-dimethylthiazol2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide)
– Pierwszy test zoptymalizowany
do oznaczania żywotności na
płytkach 96-dołkowych
– Stężenie: 0.2 – 0.5 mg/mL;
Inkubacja: 1 – 4 h
– Absorbancja: 570 nm; Długość
kontrolna: 630 nm
– Uwaga na interferencję z
czynnikami redukującymi
Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity
determined by a novel tetrazolium-based assay. Cancer Res. 1989 Aug 15;49(16):4435-40.
Testy redukcji soli tetrazolowej
Tetrazolium Reduction Assays
• Produkt reakcji jest
nierozpuszczalny; w wyniki
reakcji powstają kryształy
formazanu; konieczność
rozpuszczenia przed
pomiarem!
Komórki U937 inkubowane przez 3 h
z odczynnikiem MTT. Widać kryształy
formazanu o rozmiarze większym niż same
komórki.
• Rozpuszczalniki: DMSO,
zakwaszony izopropanol
(wpływa na barwnik w
pożywce!), SDS, inne
rozpuszczalniki organiczne
i detergenty
Testy redukcji soli tetrazolowej
Tetrazolium Reduction Assays
• MTT jako alternatywa
dla inkorporacji
trytowanej tymidyny
Porównanie pomiaru żywotności
techniką redukcji soli tetrazolowej (na
przykładzie odczynnika MTS CellTiter) z
testem inkorporacji radioaktywnie
znakowanej tymidyny ([3H]tymidyny) w
komórkach TF-1 traktowanych
czynnikiem wzrostu.
• Uwaga! MTT nie mierzy
bezpośrednio
proliferacji, lecz tylko
aktywność
metaboliczną
Testy redukcji soli tetrazolowej
Tetrazolium Reduction Assays
komórki NIH3t3
0.5 mg/ml MTT
Bezpośrednio po dodaniu MTT
4 h po dodaniu MTT
 Zmiana w morfologii komórek pod wpływem MTT
 Konieczność optymalizacji stężenia odczynnika MTT
 Testy MTT jako testy typu endpoint (odczyt kończy
eksperyment i uniemożliwia prowadzenia dalszych oznaczeń)
Testy redukcji soli tetrazolowej
Tetrazolium Reduction Assays
• MTT
– Produkt wytrąca się w postaci kryształów
– Ładunek dodatni; łatwo wnika do żywych komórek
(is positively charged and readily penetrates viable eukaryotic cells)
• MTS, XTT i WST
– Produkt rozpuszczalny w pożywce
– Ładunek ujemny; trudno wnikają do komórek
(are negatively charged and do not readily penetrate cells)
– Są używane w połączeniu z akceptorem elektronów,
który pośredniczy w transferze elektronów z komórki
do cząsteczki soli tetrazolowej
(are typically used with an intermediate electron acceptor that can transfer
electrons from the cytoplasm or plasma membrane)
Testy redukcji soli tetrazolowej
Tetrazolium Reduction Assays
• Pośrednie akceptory
elektronów:
– PMS (phenazine methyl
sulfate)
– PES (phenazine ethyl
sulfate, na schemacie)
• Mechanizm działania:
PES przenosi elektrony z komórkowego NADH na
znajdujące się medium cząsteczki MTS, prowadząc do
powstania rozpuszczalnego w fazie wodnej formazanu.
– Wnikają do komórki
– Ulegają redukcji w
cytoplazmie
– Po wydostaniu się z
komórki redukują sole
tetrazolium do
rozpuszczalnego formazanu
Testy redukcji soli tetrazolowej
Tetrazolium Reduction Assays
• Testy z wykorzystaniem odczynników:
MTS: 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium
XTT: 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide
WST-8: 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium
– Prostszy protokół i mniejsze odchylenia pomiędzy
powtórzeniami (brak konieczności rozpuszczania
kryształów formazanu) w porównaniu z MTT
– Możliwość odczytywania absorbancji w różnych
przedziałach czasowych
Redukcja resazuryny do rezorufiny
reduction of resazurin to resorufin
resazuryna: wskaźnik red-ox
redukujące środowisko
żywych komórek
niebieski
Redukcja resazuryny do rezorufiny
reduction of resazurin to resorufin
• Resazuryna
– rozpuszczalna w wodzie
– nie wymaga pośrednich akceptorów elektronów
(ale ich dodatek przyśpiesza generowanie sygnału)
– odczyt fluorescencji przy Ex = 560 nm i Em = 590 nm
Redukcja resazuryny do rezorufiny
reduction of resazurin to resorufin
sekwencyjne łączenie testów (sequential multiplex)
pomiar cytotoksyczności w oparciu o resazurynę oraz pomiar aktywności caspazy-3
Redukcja resazuryny do rezorufiny
reduction of resazurin to resorufin
Bezpośrednio
po dodaniu
resazuryny
4 h po
dodaniu
resazuryny
Cytotoksyczność resazuryny
mierzona jako spadek zawartości
ATP w komórkach HepG2
cytotoksyczność resazuryny per se
zmiana morfologii komórek oraz uszczuplenie komórkowych zapasów ATP
Aktywność proteolityczna
protease viability marker assay
• Substrat: GF-aminofluorocoumarin
(glycylphenylalanyl-aminofluorocoumarin; GlyPhe-AFC; GF-AFC)
• Krótsza inkubacja niż w przypadku testów z
wykorzystaniem MTT/resazuryny (0.5 – 1 h)
• Odczyt:
Ex = 380 - 400 nm
Em = 505 nm
Aktywność proteolityczna
protease viability marker assay
AFC
Assay chemistry. The cell-permeant substrate enters the cell, where it is cleaved by
the live-cell protease activity to produce the fluorescent AFC. The live-cell protease is
labile in membrane-compromised cells and cannot cleave the substrate.
Aktywność proteolityczna
protease viability marker assay
Assay Multiplexing. The CellTiter-Fluor™ Reagent was added to wells and viability
measured after incubation for 30 minutes at 37°C. Caspase-Glo® 3/7 Reagent was
added and luminescence measured after a 30-minute incubation (10,000 cells/well).
Aktywność proteolityczna
protease viability marker assay
Bezpośrednio po dodaniu
GF-AFC
4 h po dodaniu GF-AFC
 brak wyraźnych zmian w morfologii komórek traktowanych odczynnikiem GF-AFC
 brak cytotoksyczność pochodzącej od odczynnika GF-AFC mierzonej jako zmiana
wewnątrzkomórkowego stężenia ATP
 dobry test na żywotność do sprzęgania z innymi oznaczeniami (np. z
fluorescencyjnym testem na aktywność kaspaz)
Pomiar stężenia ATP w komórkach
luminogenic ATP assay
• Żywe komórki produkują ATP, martwe nie produkują ATP.
• Ilość ATP zależy od liczby komórek.
• Im więcej ATP tym więcej utlenionej lucyferyny, a w konsekwencji
większa intensywność luminescencji.
Pomiar stężenia ATP w komórkach
luminogenic ATP assay
• Skład odczynnika:
– detergent do lizy komórek
– inhibitory ATPaz (stabilizacja ATP uwolnionego z
komórek)
– lucyferyna (substrat)
– lucyferaza (enzym katalizujący reakcję świetlną)
Pomiar stężenia ATP w komórkach
luminogenic ATP assay
• Szybki odczyt (maksimum sygnału po 10 min)
• Brak etapu inkubacji (możliwość
automatyzacji)
• Bardzo duża czułość – detekcja nawet poniżej
10 komórek/dołek (możliwość miniaturyzacji,
płytki 1536-dołkowe)
• Drogi (rekombinowany enzym), wymaga
luminometru
Pomiar stężenia ATP w komórkach
luminogenic ATP assay
(antagonista receptorów estrogenowych)
Oznaczanie żywotności komórek
Oznaczanie żywotności komórek
• Lektura dodatkowa:
– Is Your MTT Assay Really the Best Choice?
http://pl.promega.com/resources/pubhub/is-your-mtt-assay-really-the-best-choice/
– Multiplexing Cell-Based Assays: Get More
Biologically Relevant Data
http://pl.promega.com/resources/pubhub/multiplexing-cell-based-assays-get-morebiologically-relevant-data/
– Cell Viability Assays
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065/
– Viability and Cytotoxicity Assay Reagents
https://www.lifetechnologies.com/pl/en/home/references/molecular-probes-thehandbook/assays-for-cell-viability-proliferation-and-function/viability-and-cytotoxicityassay-reagents.html