Metody obrazowania in vivo

www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
21-22 lutego 2012
Ultrasonografia małych zwierząt laboratoryjnych
z wykorzystaniem systemu VEVO 2100 (Visual Sonics)
Mgr Krzysztof Szade
Zakład Biotechnologii Medycznej
Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii
Uniwersytet Jagiellooski
email: [email protected]
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
21-22 lutego 2012
Ultrasonografia – zasada działania
 Wytworzenie fali akustycznej o częstotliwości ultradźwiękowej
(w medycynie zazwyczaj 2-18 MHz)
– wykorzystanie kryształów piezoelektrycznych
 Na granicy struktur o różnej gęstości w tkance częśd fali ulega
odbiciu i jest rejestrowana przez głowicę
(zjawisko piezoelektryczne)
 Niższe częstotliwości
– obrazowanie struktur głębiej położonych,
niższa rozdzielczośd
 Wyższe częstotliwości
– obrazowanie struktur płytko położonych,
wyższa rozdzielczośd
 Małe zwierzęta laboratoryjne
– wysokie częstotliwości (20-70 MHz)
– możliwa rozdzielczośd 30 µm
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
nowackia.googlecode.com/svn-history/r22/trunk/.../technika2.pdf
21-22 lutego 2012
Elementy systemu VEVO 2100
Zestaw głowic
Główna platforma
http://www.visualsonics.com/
System do anestezji
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
Stacja obrazowania:
ruchomy statyw, podgrzewana płytka, sondy EKG,
system do nakierowywanej iniekcji, termometr
21-22 lutego 2012
B-Mode:
Tryby obrazowania w systemie VEVO 2100
Obrazowanie 2D – obraz złożony z białych punktów odpowiadających obszarom
echogenicznym – jasnośd odpowiada amplitudzie zarejestrowanego sygnału.
Zastosowanie:
Analiza struktur anatomicznych:
 Możliwa ocena i pomiar zmian nowotworowych, miażdżycowych itp.
 Nakierowywane iniekcje, biopsje
Iniekcja do
żyły
wrotnej
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
21-22 lutego 2012
Tryby obrazowania w systemie VEVO 2100
M-Mode:
Zapis ruchu struktur w czasie (1000 fps) wzdłuż pojedynczej wiązki ultradźwiękowej
Zastosowanie:
Analiza wykorzystywana głównie
w kardiologii:
 Ocena funkcji mięśnia
sercowego i zastawek
 Analiza elastyczności aorty
i dużych naczyo
http://www.visualsonics.com/
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
21-22 lutego 2012
Color Doppler Mode:
Obrazowanie kierunku oraz średniej prędkości przepływu.
Zastosowanie:
Możliwa identyfikacja małych naczyo krwionośnych
 Czerwony i niebieski kolor oznaczają przeciwstawny kierunek przepływu
 Czułośd detekcji szybkości przepływu może byd automatycznie dostosowane (serce,
nerki, aorta, małe naczynia)
Pieo aorty
prawidłowy
Nieprawidłowy przepływ
turbulentny
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
Śledziona myszy
http://www.visualsonics.com/
Image courtesy of Dr Attila Kovacs, Washington University.
21-22 lutego 2012
Pulsed-Wave (PW) Doppler Mode:
Ocena hemodynamiki przepływu krwi
w tętnicach i żyłach.
Zastosowanie:
 Możliwa ilościowa analiza kierunku,
prędkości przepływu w wybranym
naczyniu podczas cyklu pracy serca
 Pomiar prędkości przepływu
w zakresie od mm/s do kilku m/s
 Rozpoznawanie zaburzonej kinetyki
przepływu w naczyniu
Analiza przepływu w tętnicy płucnej
http://www.visualsonics.com
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
21-22 lutego 2012
3D-Mode:
Półautomatyczny tryb trójwymiarowego
obrazowania
 Zaznaczenie miejsca początkowego i
koocowego skanowanego obszaru
 Automatyczne skanowanie
http://www.visualsonics.com
 Możliwośd połącznia obrazowania 3D
z trybami B-Mode, PowerDopplerMode, Contrast-Mode
 Dokładny pomiar wielkości badanych
struktur
Pomiar podskórnych guzów czerniaka w trybie 3D
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
21-22 lutego 2012
PowerDoppler:
Wizualizacja stopnia unaczynienia badanych struktur :
 Ilościowy pomiar unaczynienia badanej struktury w połączniu z trybem
obrazowania 3D
 Parametr stopnia unaczynienia jest miarą gęstości naczyo w danym obszarze
 Zastosowanie w detekcji zmian patologicznych organów
oraz pomiaru progresji angiogenezy w trakcie wzrostu guza.
Postępująca angiogeneza
w trakcie rozwoju
czerniaka
http://www.visualsonics.com
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
21-22 lutego 2012
Wczesne zmiany nowotworowe,
silnie ukrwiony niewielki guz
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
Zaawansowany guz
z nekrotycznym rdzeniem
21-22 lutego 2012
Contrast Mode:
 Struktury wielkości ~1 µm zawierające echogenny gaz
zamknięty w warstwie lipidowej
 Udoskonalenie detekcji przepływu w naczyniach
 Możliwośd połączenia ze specyficznymi przeciwciałami
 Pomiar kinetyki przypływu w zmianach patologicznych
http://www.visualsonics.com
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
21-22 lutego 2012
Model niedokrwienia kooczyny tylnej:
Kooczyna zdrowa
Kooczyna niedokrwiona
Upośledzone ukrwienie mięśnia po zabiegu podwiązania tętnicy
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
Dr Agnieszka Jaźwa
21-22 lutego 2012
VevoStrain – oprogramowanie do analizy ruchliwości ściany serca (tryb B-Mode):
 Monitorownie dystansu pomiędzy dwoma
zaznaczonymi na obrazie obszarami podczas cyklu
pracy serca
 Wysoko czuła analiza parametrów pracy serca,
uwzględniająca synchronicznośd ruchu ściany serca
 Zastosowanie w wykrywaniu kardiotoksyczności
potencjalnych nowych leków
Synchroniczna praca lewej komory serca
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
Desynchronizacja pracy serca po zawale
powodująca zaburzenia w przepływie
http://www.visualsonics.com/
21-22 lutego 2012
Obrazowanie in vivo – cd.
IVIS, Laser Doppler
Dr Agnieszka Jaźwa
Zakład Biotechnologii Medycznej
Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii
Uniwersytet Jagiellooski
email: [email protected]
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
21-22 lutego 2012
Bioluminescencja
 Luminescencja to określenie nadane emisji fotonów w widzialnym zakresie
widma.
 Bioluminescencja, czyli wytwarzanie światła przez żywe organizmy, jest
procesem rozpowszechnionym w przyrodzie.
 Do emisji światła zdolne są bakterie, grzyby i zwierzęta
(zarówno bezkręgowce jak i kręgowce).
 Podstawą wytwarzania światła przez organizmy
jest reakcja utleniania związku zwanego luceferyną
przez enzym – lucyferazę.
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
21-22 lutego 2012
Pomiar luminescencji in vivo
IVIS® Lumina from Caliper Life Sciences
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
21-22 lutego 2012
Przykładowe białka luminescencyjne
Lucyferaza
świetlika
560nm
d-Luciferin
Oxyluciferin
Lucyferaza
Renilla
480nm
Coelenterazine
Coelenteramide
http://www.biotium.com/product/product_info/Protocol/30005.pdf (modified)
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
21-22 lutego 2012
Pomiar bioluminescencji in vivo
Porównanie
iniekcji dootrzewnowej (IP)
z iniekcją dożylną (IV)
Keyaerts et al, Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2008
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
21-22 lutego 2012
Bardzo czuły system detekcji
Caliper Life Sciences
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
21-22 lutego 2012
Zastosowanie bioluminescencji w badaniach naukowych
 Badanie komórek po transplantacji (ocena żywotności, proliferacji,
migracji)
 Analiza ekspresji genów (warunkowa, stała, tkankowo-specyficzna)
 Ocena skuteczności terapii genowej (nadekspresja oraz wyciszenie funkcji
genu)
 Śledzenie interakcji białkowych, ocena stabilności i funkcji białek in vivo
 Monitorowanie postępu choroby lub skuteczności leczenia (np. wzrost i
przerzutowanie nowotworów, stany zapalne, infekcje)
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
21-22 lutego 2012
Aktywnośd lucyferazy mierzona in vivo z użyciem
systemu IVIS Lumina - obrazowanie
day 2
total luciferase activity
[RLU]
HO-1 zwiększa żywotnośd i stymuluje proliferację mioblastów podanych
do mięśnia szkieletowego po uszkodzeniu kardiotoksyną
20000000
16000000
Luc-GFP-HO1
Luc-GFP
*
12000000
*
8000000
4000000
0
0
2
11
22
days after transplantation
day 11
day 22
C2C12-Luc-GFP
Kozakowska et al., ARS, 2011
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
C2C12-Luc-GFP-HO1
Luciferase activity
[RLU/mg of protein]
Analiza homogenatów tkankowych
4000000
Muscles
*
3000000
2000000
1000000
0
Luc-GFP
Luc-GFP-HO1
21-22 lutego 2012
Living Image software
Analiza
obrazu
Parametry wpływające
na czułośd
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
21-22 lutego 2012
Metoda laserowo-dopplerowskiego
pomiaru przepływów naczyniowych
(Laser-Doppler Flowmetry- LDF)
Ryniewicz&Loster,
Implantoprotetyka, 2008
Aparaty Laser Doppler działają na zasadzie znanego efektu
Dopplera, wykorzystując wytwarzane przez diodę laserową
monochromatyczne światło o długości fali 780 nm
(podczerwieo), umożliwiające wykrycie ruchu elementów
morfotycznych w łożysku naczyniowym.
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
Powierzchnia skanowania
obejmuje 4096 punktów
PeriScan PIM II (Perimed)
Powierzchnia skanowania
obejmuje 65 000 punktów
PeriScan PIM 3 (Perimed)
21-22 lutego 2012
Metoda laserowo-dopplerowskiego pomiaru przepływów
naczyniowych (Laser-Doppler Flowmetry- LDF)
Promieniowanie odbite od nieruchomych
struktur zachowuje częstotliwośd źródła
laserowego, zaś promieniowanie odbite od
będących w ruchu elementów morfotycznych
krwi zmienia swoją częstotliwośd zgodnie ze
zjawiskiem Dopplera.
Aparat przekształca promieniowanie w sygnał
elektryczny, który zostaje zobrazowany w
formie spektrum przepływu oraz wartościach
bezwzględnych PU (ang. Perfusion Units).
Badanie jest całkowicie nieinwazyjne.
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
21-22 lutego 2012
Laser Doppler
Penetracja światła lasera w głąb tkanki zależy od:
 właściwości badanej tkanki (budowa i gęstośd łożyska naczyniowego,
pigmentacja, natlenowanie krwi, etc.)
 długości światła lasera
 odległości pomiędzy laserem a detektorem
W przypadku urządzeo Laser Doppler firmy Perimed (odległośd lasera od detektora 0.25 mm
oraz długośd fali 780 nm) penetracja monochromatycznego światła laserowego w głąb zdrowej
skóry wynosi 0.5-1 mm.
Należy pamiętad, że w silnie ukrwionych narządach tj. nerki, czy wątroba światło lasera ma
znacznie mniejszą zdolnośd penetracji (<1 mm).
Z kolei w słabo ukrwionych lub niedokrwionych regionach głębokośd pomiaru będzie większa,
gdyż wiązka światła nie będzie pochłaniana i odbijana przez elementy morfotyczne krwi.
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
21-22 lutego 2012
Zastosowanie metody Laser Doppler w medycynie
W diagnostyce medycznej – ocena mikrokrążenia naczyo skóry:






w schorzeniach dermatologicznych (tj. nowotwory, sklerodermia, oparzenia)
w chronicznym niedokrwieniu kooczyn
monitorowanie reperfuzji przeszczepów po operacjach plastycznych i rekonstrukcyjnych
w niedokrwieniu błon śluzowych górnego i dolnego odcinka przewodu pokarmowego
w mikroangiopatiach w przebiegu cukrzycy
stosując sondy igłowe można zbadad ukrwienie narządów wewnętrznych
(np. wątroby i nerek)
W stomatologii – badanie ukrwienia:
 ocena żywotności miazgi w zębach po urazach
 badanie przepływów w naczyniach błony śluzowej
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
21-22 lutego 2012
Chirurgiczne wywołanie niedokrwienia kooczyny tylnej u myszy
poprzez jednostronne podwiązanie tętnicy udowej
Reprezentatywne zdjęcie z laserowego
przepływomierza dopplerowskiego bezpośrednio
po zabiegu niedokrwienia
min
max
Stosunek wartości w nodze niedokrwionej (1)
do wartości w nodze bez niedokrwienia (2)
ROI 1/ROI 2 = 0,14
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
21-22 lutego 2012
LDPIwin software
Statystyka
obrazu
Parametry
obrazu
Skala barwna
perfuzji
Okno
obliczeo
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
21-22 lutego 2012
Zalety obrazowania in vivo
 Możliwośd śledzenia zmian (progresji choroby lub poprawy) w czasie
 Metody nieinwazyjne, bezpieczne dla badanego osobnika oraz dla
eksperymentatora
 Urządzenia łatwe w obsłudze
 Pozwalają znacznie ograniczyd liczbę zwierząt w eksperymencie
Contag PR, Drug Discovery Today, 2002
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
21-22 lutego 2012
Dziękujemy za uwagę
i zapraszamy na zajęcia praktyczne!
www.wbbib.uj.edu.pl/bmz
21-22 lutego 2012