Trudności interpretacyjne wyników oznaczeń przeciwciał anty HCV
advertisement
diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics Diagn Lab 2016; 52(4): 263-266 ISSN 0867-4043 Praca oryginalna • Original Article Trudności interpretacyjne wyników oznaczeń przeciwciał anty HCV w surowicy – doświadczenie laboratorium Difficulties in interpretation of HCV antibodies results in serum samples – laboratory experience Urszula Błazucka1, Grażyna Dulny2, Barbara Serafińska1, Dagna Bobilewicz1, Marta Faryna1 Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej Wydział Nauki o Zdrowiu, Warszawski Uniwersytet Medyczny Zakład Profilaktyki Zagrożeń Środowiskowych i Alergologii Wydział Nauki o Zdrowiu, Warszawski Uniwersytet Medyczny 1 2 Streszczenie Diagnostyka zakażenia wątroby wirusem typu C (HCV) w pierwszym rzucie obejmuje przesiewowe testy serologiczne, wykrywające obecność przeciwciał – anty HCV w surowicy. Są to testy jakościowe, których wyniki przedstawiane są w sposób opisowy (ujemny, słabo reaktywny, reaktywny), wykorzystujący kryteria analityczne (S/CO) ściśle określone przez producenta oraz w odpowiednich procedurach diagnostycznych. Kolejnym etapem jest wykrywanie obecności materiału genetycznego wirusa – HCV RNA. Nie jest to z punktu widzenia analitycznego test potwierdzenia, umożliwia jednak, dalszą diagnostykę i monitorowanie. Z założenia wyniki obu testów nie muszą się pokrywać (wczesne stadium wiremii bez przeciwciał, bądź obecność przeciwciał po ustąpieniu wiremii). Należy brać pod uwagę możliwość wyników fałszywie dodatnich anty HCV, spowodowanych przez różne czynniki interferujące, co szczególnie dotyczy populacji pacjentów szpitalnych Summary Laboratory diagnostic of HCV infection in first stage contains screening serological tests based on detection of HCV antibodies. It is a qualitative test and results are presented as negative, reactive or weakly reactive according to analytical procedure. The next stage of laboratory diagnostic of HCV is detection of presence viral RNA by molecular method. From analytical point of view it cannot be treated as confirmatory test, nevertheless its quantitative version is important in diagnosis and follow-up of the HCV infection. Result of the both test may differ ( patient with early stage of viremia without antibodies or detection of antibodies after viremia), occurrence of false positive result in screening test , caused by interfering factors, should be considered especially in hospital population. Słowa kluczowe: HCV, przeciwciała anty-HCV, HCV-RNA, korelacja Key words: HCV, anti– HCV antibodies, HCV RNA, correlation Wstęp Wirusowe zapalenie wątroby typu C (WZWC) stanowi problem dla zdrowia publicznego ze względu na bezobjawowy i długotrwały przebieg oraz powikłania, w postaci marskości wątroby oraz raka wątrobowokomórkowego. Jako czynnik etiologiczny uważany jest wykryty w 1989r wirus HCV (hepatitis C virus) należący do rodziny Flaviviridae [1]. Do zakażenia wirusem HCV dochodzi na drodze krwiopochodnej w wyniku kontaktu z materiałem zakaźnym w trakcie zabiegów medycznych i niemedycznych naruszających ciągłość tkanek [1]. W opublikowanym w 2014 roku Raporcie systemowym na temat WZW C podano, że w Polsce najczęstszą drogę zakażenia HCV stanowią zabiegi medyczne – 84%, dożylne przyjmowanie narkotyków – 10% oraz zabiegi upiększające, w tym kosmetyczne i tatuaże – 3%. Zakażenia HCV w wyniku ekspozycji zawodowej stanowią około 1%. Częstość zakażeń HCV w wyniku innych dróg zakażenia wynosiła odpowiednio: kontakty seksualne – 1%, przebywanie w zakładach karnych – 1%, droga wertykalna <1%, kontakty domowe <1% [2]. Po przedostaniu się wirusa do organizmu jego obecność można wykryć już po kilku do kilkunastu dni od zakażenia przy zastosowaniu czułych metod biologii molekularnej które pozwalaja stwierdzić obecność antygenu rdzeniowego HCV (HCV core antigen), a po około 80 dniach (średnio 7–8 tyg.) dochodzi do serokonwersji i pojawienia się przeciwciał anty-HCV [1]. U 15–45% osób eksponowanych na HCV dochodzi do ograniczenia zakażenia i eliminacji wirusa HCV. Natomiast u 85–55% rozwija się przewlekła postać WZW C [1]. W diagnostyce zakażenia wirusem HCV, poza wywiadem i obrazem klinicznym zasadniczą rolę odgrywają badania laboratoryjne. W pierwszym rzucie obejmują one przesiewowe badania 263 www.diagnostykalaboratoryjna.eu serologiczne, wykrywające obecność przeciwciał anty-HCV w surowicy przy zastosowaniu różnych technik immunochemicznych. Są to testy jakościowe, których wyniki przedstawiane są w sposób opisowy (ujemny, słabo reaktywny, reaktywny), w oparciu o kryteria analityczne, ściśle określone przez producenta. Kryteria te oparte są na stosunku liczby impulsów np. chemiluminescencji – tzw. sygnał próbki (S) do wartości odcięcia CO (cut off). Jednym z szeroko stosowanych testów, którym pracują również autorzy niniejszego opracowania jest oparty na metodzie elektrochemiluminescencji (sandwicz) Anti HCV II firmy Roche wykonywany na analizatorze Cobas e-601. Jest to test trzeciej generacji, w którym do wykrywania przeciwciał anty-HCV użyto peptydy i rekombinowane antygeny, będące odpowiednikami białek rdzenia (dane z ulotki firmowej 2015 r.) Interpretacja zalecana przez firmę to: • próbki o S/CO poniżej 0,9 – niereaktywne, • próbki o S/CO od 0,9 do1,0 – graniczne (szara strefa), • próbki o S/CO powyżej 1,0 – reaktywne. Próbki „graniczne” w żadnym razie nie mogą być traktowane jako niereaktywne i wymagają takiego samego postępowania jak „reaktywne”. Zgodnie z rekomendacjami Polskiej Grupy Roboczej w przypadku uzyskania wyniku reaktywnego w kierunku przeciwciał anty-HCV należy pobrać kolejną próbkę krwi od pacjenta i zbadać ją dwukrotnie tym samym testem. Jeżeli wyniki jednego lub dwóch powtórzonych oznaczeń zostały ocenione jako reaktywne lub graniczne, próbkę należy uznać za powtarzalnie reaktywną [3, 4]. Zarówno dane firmowe, jak i doświadczenia własne potwierdzają praktycznie 100% zgodność wyników uzyskanych według w/w schematu. Ostateczny wynik wydawany przez Laboratorium zawiera również informację, na którym pobraniu jest oparty. W Laboratorium Centralnym SP CSK około 90% wyników jest potwierdzanych przez drugie pobranie, w wyjątkowych przypadkach (w których pacjent jest z różnych powodów niedostępny) wynik jest wydawany w oparciu o jedno badanie, co jest wyraźnie zaznaczone. Badani, u których wykazano obecność przeciwciał anty-HCV, z założenia podlegają dalszej diagnostyce w kierunku zakażenia HCV. Obecnie test potwierdzający obecność p-ciał Western Blot nie jest wykonywany, a kolejnym badaniem w kierunku czynnego zakażenia jest test, wykazujący obecność w surowicy krwi HCV RNA [4]. Badanie obecności HCV RNA u osób z reaktywnym wynikiem w kierunku przeciwciał anty-HCV nie jest z punktu widzenia analitycznego testem potwierdzenia, umożliwia jednak, dalszą diagnostykę a szczególnie jego ilościowa wersja, również monitorowanie leczenia. Wyniki obu testów tj. w kierunku obecności przeciwciał oraz w kierunku obecności materiału genetycznego wirusa HCV nie muszą się pokrywać (wczesne stadium wiremii bez przeciwciał, bądź obecność przeciwciał po ustąpieniu wiremii). Stwierdzenie w surowicy krwi obecności przeciwciał anty-HCV nie jest podstawą do rozpoznania zakażenia HCV a tylko świadczy o kontakcie z wirusem HCV. Rola laboratoriów, wykonujących rutynowo oznaczenia anty-HCV w dalszej diagnostyce jest ograniczona, a praktyce żadna. Po stwierdzeniu obecności anty-HCV nie mają możliwości 264 przekazania próbki do dalszych oznaczeń, a jedynie sugerować lekarzowi kierującemu dalszy tok postępowania. Z tego względu pomimo wykonywania przez duże laboratoria szpitalne relatywnie dużej liczby badań rzędu 20 000 rocznie nie można odnieść uzyskiwanych przez nie wyników do częstości występowania zakażeń HCV w populacji. Dane na temat rozpowszechnienia zakażenia wirusem HCV pochodzą zarówno z rejestrów wtórnych, jak również z przeglądowych badań epidemiologicznych. Według danych Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny w Polsce w 2014 roku zarejestrowano 3551 przypadków WZW C, a w 2015 roku 4284 przypadki [5]. Przypadki WZW C zgłoszone przez lekarzy obejmują tylko osoby, u których występują objawy WZW C lub przypadki rozpoznane w wyniku badań przesiewowych. Rzeczywista liczba osób, które uległy zakażeniu wirusem HCV, oceniania jest w badaniach epidemiologicznych. Flisiak i wsp. w przeprowadzonym w latach 2009–2010 badaniu wykryli obecność anty-HCV u 1,9% badanych (496/29057) z czego aktywne zakażenie wirusem HCV, tj. obecność HCV RNA, potwierdzono u 110 osób, co stanowiło 31% [6] Rozpowszechnienie zakażeń wirusem HCV wśród pracowników służby zdrowia jest podobne jak w populacji ogólnej, niemniej jednak ze względu na częstsze badanie tej grupy osób w kierunku przeciwciał anty-HCV, infekcja jest szybciej rozpoznawana i lepiej kontrolowana. Ślusarczyk i wsp., badając rozpowszechnienie zakażenia HCV w latach 2008–2009 r. wśród pracowników medycznych dwóch warszawskich szpitali, zdiagnozowali obecność przeciwciała anty-HCV u 1,7% badanych (16/961), a aktywne zakażenie z obecnością HCV RNA wykryto tylko u 3 osób, co stanowiło 16% grupy anty-HCV dodatniej [7]. Rozpoznanie czynnego zakażenia HCV u pracowników służby zdrowia jest podstawą do orzekania choroby zawodowej. Liczba stwierdzonych w ostatnich latach WZW C jako choroby zawodowej wyniosła odpowiednio: w 2012 – 59, w 2013 – 44, a w 2014 – 35 [8]. Materiał W sytuacji, w której jedyną informację stanowi reaktywny wynik przesiewowy, stwierdzający obecność p-ciał niemożliwe jest oddzielenie grupy osób rzeczywiście zakażonych od tych, u których nie ma materiału genetycznego wirusa. Jest to problem, szczególnie dotyczący chorych hospitalizowanych, u których oznaczenia samych p-ciał są jednym z rutynowych badań laboratoryjnych, co potwierdzają obserwacje własne. W okresie grudzień 2015 – maj 2016 r. wykonano badania porównawcze w 35 surowicach, skierowanych na rutynowe oznaczenia w kierunku anty-HCV. 30 wyników zostało przez Laboratorium określone jako „słabo reaktywne” (S/CO poniżej 10), 5 natomiast jako „reaktywne” (najniższa wartość S/CO wynosiła 46). Wyniki i dyskusja W żadnej z 30 próbek nie stwierdzono obecności HCV RNA (test Roche Cobas TaqMan HCV Wer. 2.; Zakres liniowości pomiaru 15-1,0 x 108 IU/ml.) czyli nie potwierdzono czynnego zakażenia. Obecność materiału genetycznego wirusa HCV potwierdzono Diagn Lab 2016; 52(4): 263-266 w dwóch z pięciu przypadków surowic „reaktywnych”. Podobne, ujemne wyniki HCV-RNA w surowicach anty-HCV „reaktywnych” (n=10) wykazano w populacji tego samego szpitala w 2010 roku. Laboratorium wydając wynik „reaktywny” nie jest więc w stanie dać praktycznie żadnych informacji odnośnie jego interpretacji. Najprawdopodobniej w większości przypadków będzie on wskazywał na kontakt z wirusem i niekoniecznie potwierdzał obecność czynnego zakażenia. Nie można jednak wykluczyć, szczególnie u pacjentów hospitalizowanych otrzymujących szereg preparatów we wlewach dożylnych, istnienia innych przyczyn, u podłoża, których leżą reakcje nieswoiste. Zjawisko takie można łatwiej prześledzić w przypadku oceny obecności p-ciał anty HIV z tego względu, że laboratorium ma obowiązek, przed wydaniem wyniku, potwierdzić go w oparciu o test Western Blot. Z doświadczeń własnych wynika, że właśnie w populacji szpitalnej w pewnym procencie przypadków dodatni test przesiewowy nie znalazł potwierdzenia metodą Western Blot. W archiwum własnym znajduje się również kilka przypadków utrzymującego się wyniku „słabo reaktywnego” po całkowitym wykluczeniu przyczyn immunologicznych. Testy stosowane do wykrywania obecności przeciwciał anty-HCV są typowymi testami przesiewowymi, które z założenia powinny się cechować wysoką czułością. Podwyższenie czułości testów wiąże się często z przesunięciem punktu odcięcia (cutt of) w kierunku niższych wartości [3]. Niektóre testy przesiewowe nie posiadają tzw. szarej strefy lub może ona być stosunkowo „wąska” albo mało precyzyjnie wykalibrowana [3]. Ponadto podwyższeniu czułości przesiewowych testów serologicznych może towarzyszyć występowanie licznych reakcji krzyżowych. Przeciwciała wykrywane w badaniu przesiewowym mogą być skierowane przeciwko antygenom, które jedynie budową przypominają białka wirusa HCV, ale w rzeczywistości nimi nie są [3]. Badania wykazały, że wyniki fałszywie dodatnie w kierunku obecności przeciwciał anty-HCV mogą być rezultatem np. szczepień ochronnych, chorób alergicznych, chorób z autoagresji oraz chorób przewlekłych [3, 9, 10]. Ownby i wsp. stwierdzili, że wyniki fałszywie dodatnie w kierunku przeciwciał anty-HCV częściej występują np. u osób starszych [11]. Dlatego interpretując wyniki badań w kierunku obecności przeciwciał anty-HCV w surowicy krwi, należy mieć na względzie czułość i swoistość testu stosowanego do diagnostyki zakażenia HCV. Inną kwestią jest reaktywność przeciwciał, związanych z zakażeniem HCV. Badania monitorujące odpowiedź immunologiczną związaną z zakażeniem wirusem HCV wykazały, że po wyeliminowaniu zakażenia poziom przeciwciał anty-HCV spada. Znajduje to odzwierciedlenie w obniżonej wartości S/CO oraz w sukcesywnym zaniku reaktywności przeciwciał w stosunku do poszczególnych antygenów. W przypadku pacjentów, u których doszło do eliminacji wirusa HCV z krążenia, miano przeciwciał anty-HCV stopniowo obniża się i ostatecznie zanika u 6–10% zakażonych osób [12]. Zjawisko to zaobserwowano m. innymi w trakcie monitorowania zakażeń wertykalnych matka–płód. W ocenie możliwości okołoporodowego przeniesienia wirusa HCV stwierdzono zanik przeciwciał matczynych po 12 miesiącach u 90% nie zakażonych niemowląt, zaś u 100% po 18 miesiącach [12, 13]. Grabarczyk i wsp., badając krwiodawców, wykazali, że u osób z powtarzalnie reaktywnymi wynikami EIA, HCV RNA wykryto w 68 na 105 przypadków (64,8%) jeśli S/CO było >4,0 i tylko u 3/287 (1%), jeśli wartość tego parametru była w zakresie 1–3,99 [14]. Uzun i wsp. poddali badaniu w kierunku HCV RNA i WB 55 surowic „słabo reaktywnych” z obecnością przeciwciał anty-HCV w przedziale od 1,15 do 6,15 wartości S/CO. U żadnej badanej osoby, u której uzyskano wartość S/CO w zakresie od 1,15 do 6,15, nie wykryto obecności HCV RNA [15]. Obniżanie się poziomu przeciwciał anty-HCV przy eliminacji RNA wykazał również Netski i wsp., monitorując występowanie markerów zakażenia HCV u osób przyjmujących dożylne środki odurzające. U 3 osób, u których w trakcie obserwacji doszło do wyeliminowania zakażenia HCV, wykazano spadek poziomu przeciwciał, jak również zmienną reaktywność tych przeciwciał w niestosowanym obecnie teście Western Blot [16]. Z obserwacji własnych wynika, że zarówno w 2010 jak i w 2016 roku przy ogólnej liczbie oznaczeń anty-HCV rzędu 20 000 rocznie procent wyników reaktywnych wynosił 4,2 – 4,6%, po uwzględnieniu powtórnych oznaczeń procent pacjentów, u których potwierdzono obecność przeciwciał w teście przesiewowym wynosił ponad 2,3% i był wyższy niż w populacji polskiej. Wyniki te nie mogą być jednoznacznie interpretowane. Stanowią opartą na doświadczeniu informację, jak również mogą wskazywać na możliwość wyników fałszywie dodatnich anty-HCV, spowodowanych, szczególnie w populacji pacjentów hospitalizowanych, interferencją analityczną czynników nieswoistych (substancji/ przeciwciał). Pracę wykonano w ramach Projektu badawczego, realizowanego w latach od 2015 do 2016, finansowanego ze środków dotacji statutowej uzyskanej przez Wydział Nauki o Zdrowiu. Piśmiennictwo 1. Dziubek Z. Choroby zakaźne i pasożytnicze. PZWL, Warszawa, 2012. 2. Jaros P, Kobierski J, Hałdaś M i wsp. Raport systemowy WZW typu C. Konieczność zmian w organizacji systemu ochrony zdrowia. Kraków 2014, http://www.ceestahc.org/pliki/nasze_publikacje/raporty/Raport_systemowy_WZW_typu_C. pdf 3. Godzik P, Kołakowska A, Madaliński K i wsp. Rozpowszechnienie przeciwciał anty-HCV wśród osób dorosłych w Polsce – wyniki badania przekrojowego w populacji ogólnej. Przegl Epidemiol 2012; 66: 575-580. 4. Madaliński K, Flisiak R, Halota W i wsp. Rekomendacje. Diagnostyka laboratoryjna zakażeń wirusem zapalenia wątroby typu C. Rekomendacje Polskiej Grupy Roboczej 2012/2013. Diagn Lab 2013; 49: 65-70. 5. Czarkowski MP. Choroby zakaźne i zatrucia w Polsce w 2014 i 2015 roku. Warszawa NIZP – PZH i GIS 2011. Biuletyny chorób zakaźnych 2014, 2015, www. pzh.gov.pl. 6. Flisiak R, Halota W, Horban A i wsp. Prevalence and risk factors of HCV infection in Poland. Eur J Gastroent Hepatol 2011; 23: 1213–121. 7. Ślusarczyk J, Małkowski P, Bobilewicz D i wsp. Przekrojowe, anonimowe badania przesiewowe bezobjawowych zakażeń HCV, odporności na HBV i utajonego zakażenia HBV wśród pracowników ochrony zdrowia w Warszawie. Przegl Epidemiol 2012; 66: 445–451. 8. Szeszenia-Dąbrowska N, Wilczyńska U. Choroby zawodowe w Polsce w latach: 2012, 2013, 2014. Instytut Medycyny Pracy im. Prof. J. Nofera, Łódź 2013, 2014, 2015. 9. Simonsen L, Buffington J, Shapiro C. et al. Multiple false reactions in viral antibody screening assays after influenza vaccination. Am J Epidemiol 1995; 141: 1089–96. 265 www.diagnostykalaboratoryjna.eu 10. Sharma U, Stramer S, Wright D. et al. Impact of changes in viral marker screening assays. Transfusion 2003; 43: 202–14. 11. Ownby H, Korelitz J, Busch M et al. Loss of volunteer blood donors because of unconfirmed enzyme immunoassay screening results. Retrovirus Epidemiology Donor Study. Transfusion 1997; 37: 199–205. 12. The National Academy of Clinical Biochemistry, Wytyczne laboratoryjne dotyczące badań przesiewowych, rozpoznawania i monitorowania uszkodzeń wątroby. Abbott Laboratories Poland 2001. http://www.prometeusze.pl/tekstowe/ wytyczne_laboratoryjne_abbott.pdf Adres do korespondencji: prof. nadzw. dr hab. med. Dagna Bobilewicz Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej Wydział Nauki o Zdrowiu Warszawski Uniwersytet Medyczny 02-097 Warszawa, ul. Banacha 1a tel. +49 22 5992405 e-mail: [email protected] 13. Aniszewska M, Kowalik-Mikołajewska B, Pokorska-Śpiewak M i wsp. Badanie przeciwciał anty-HCV jako podstawowy standard monitorowania zakażenia odmatczynego HCV: zalety i wady metody. Przegl Epidemiol 2012; 66: 341–345. 14. Grabarczyk P, Medyńska J, Liszewski G i wsp. HCV RNA and HIV RNA detection Otrzymano: 12.11.2016 Akceptacja do druku: 28.11.2016 by Procleix HIV 1/HCV Assay in blood donors with various results of anti-HCV and anti-HIV EIA. J Transf Med 2009; 1: 26–33. 15. Uzun B.K, Er H, Güngör S et al. The evaluation of Recombinant Immunoblot assay (RIBA) and HCV-RNA test results in patients with low titer Anti-HCV positivity. J Clin Exp Inv 2014; 5: 553–556. 16. Netski D.M, Mosbruger T, Depla E et al. Humoral immune response in acute hepatitis C virus infection. Clin Inf Dis 2005; 41: 667–75. 266 Konflikt interesów: nie zgłoszono
