Szczepionki acelularne

Szczepionki zawierające
rekombinantowe antygeny białkowe
Szczepionki zawierające
rekombinantowe antygeny białkowe
Charakterystyka szczepionek
 Ściśle zdefiniowany skład
 Bezpieczeństwo produkcji
•
•
wyeliminowanie
konieczności
hodowli
mikroorganizmów
chorobotwórczych w celu izolacji antygenów szczepionkowych
mikroorganizmy stosowane do produkcji antygenów rekombinantowych o
statusie GRAS (Generally Recognized as Safe)
 Bezpieczeństwo stosowania
•
•
brak możliwości wywołania choroby
niska odczynowość
 Wymagają stosowania adiuwantów
 Koszt produkcji uzależniony od stosowanego systemu produkcji
Szczepionki zawierające
rekombinantowe antygeny białkowe
Charakterystyka gospodarzy ekspresyjnych
 Bakterie
•
•
•
•
•
dobrze scharakteryzowane
łatwość przeprowadzenia manipulacji genetycznych
wydajne systemy ekspresyjne
brak modyfikacji posttranslacyjnych
możliwość produkcji białek w postaci nierozpuszczalnych ciał
inkluzyjnych
• możliwość produkcji białek fuzyjnych posiadających domeny
ułatwiające oczyszczanie białek, zwiększające rozpuszczalność,
zwiększające immunogenność
Szczepionki zawierające
rekombinantowe antygeny białkowe
Charakterystyka gospodarzy ekspresyjnych
 Drożdże
•
•
•
•
dobrze scharakteryzowane
łatwość przeprowadzenia manipulacji genetycznych
wydajne systemy ekspresyjne
trwałe rekombinanty – integracja plazmidów ekspresyjnych z
genomem gospodarza
• modyfikacje posttranslacyjne – tworzenie mostków disiarczkowych,
glikozylacja, przyłączanie kwasów tłuszczowych
• możliwość produkcji białek fuzyjnych posiadających domeny
ułatwiające oczyszczanie białek, zwiększające immunogenność
Szczepionki zawierające
rekombinantowe antygeny białkowe
Charakterystyka gospodarzy ekspresyjnych
 Komórki owadzie
• systemy ekspresyjne oparte na plazmidach lub bakulowirusie
• modyfikacje posttranslacyjne – glikozylacja inna niż w komórkach
ssaczych
• wrażliwe na zakażenia wirusowe
 Komórki ssacze
• modyfikacje
posttranslacyjne
–
glikozylacja,
fosforylacja,
przyłączanie
kwasów
tłuszczowych,
tworzenie
mostków
disiarczkowych
• droga hodowla
• stabilne produkcyjne linie komórkowe trudne do otrzymania
Szczepionki zawierające
rekombinantowe antygeny białkowe
Charakterystyka gospodarzy ekspresyjnych
 Rośliny transgeniczne
•
•
•
•
•
manipulacje genetyczne trudne do przeprowadzenia
tania produkcja
modyfikacje posttranslacyjne
szczepienie drogą pokarmową
wywołanie odporności błon śluzowych
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu
wątroby typu B
Czynnik etiologiczny – wirus HBV
 Rodzina: Hepadnaviridae
 Rodzaj: Orthohepadnavirus
 Struktura: ikosaedralny nukleokapsyd
otoczony podwójną osłonką; kulisty; śr. 42
nm
 Kwas nukleinowy: DNA
 Replikacja: hepatocyty
 Rezerwuar: człowiek
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu
wątroby typu B
 Droga przenoszenia: krew i płyny
ustrojowe, w tym wydzielina szyjki
macicy, nasienie
 Wysoka zakaźność – nawet 0,1 μl
krwi może spowodować zakażenie
 Hodowla
w
warunkach
laboratoryjnych – nie zakaża
zarodków kurzych i powszechnie
stosowanych linii komórkowych
We krwi do 1010 wirusów/ml
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu
wątroby typu B
Ostre wirusowe zapalenie wątroby typu B
 Okres wylęgania 2 – 3 miesiące
 Początkowe objawy: złe samopoczucie, utrata apetytu, gorączka
 Żółtaczka
Wyzdrowienie
(90%)
Antygenemia
brak uszkodzenia
wątroby
Przewlekłe zakażenie (10%)
Przetrwałe
zapalenie wątroby
Nadostre
zapalenie wątroby
(0,1%)
Aktywne zapalenie
wątroby
niewielkie uszkodzenie
wątroby
Marskość wątroby
Pierwotny rak wątroby
Zgon
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu
wątroby typu B
Wirusowe zapalenie wątroby typu B
zakażenie okołoporodowe
 Dzieci urodzone przez matki w ostrej fazie wzw B
 zakażenie z ostrymi objawami choroby
 Dzieci urodzone przez matki z przewlekłym aktywnym wzw B
 zakażenie bez ostrych objawów choroby
 nosicielstwo HBV
 śmierć z powodu marskości wątroby lub raka wątroby (50% chłopców, 15%
dziewczynek)
Na świecie 200 mln nosicieli HBV
z tego 75% ulega zakażeniu podczas porodu
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu
wątroby typu B
Antygeny wirusa HBV
 HBcAg – białko rdzenia
 HBeAg – białko rdzenia
 HBsAg – białko powierzchniowe
•
•
tworzy zewnętrzną osłonkę wirusa
nadmiar białka obecny we krwi w postaci
kulistych lub pałeczkowatych agregatów
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu
wątroby typu B
Gen kodujący antygen HBsAg – koduje 3 polipeptydy
 preS1
 preS2
S
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu
wątroby typu B
Odpowiedź immunologiczna na
zakażenie HBV
 Odpowiedź humoralna
•
•
•
przeciwciała anty-HBsAg (preS1, preS2 i S)
przeciwciała anty-HBcAg
przeciwciała anty-HBeAg
 Odpowiedź komórkowa
•
limfocyty Tc
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu
wątroby typu B
Szczepionki I generacji
(plazmatyczne)
 Substancja czynna – białkowy
antygen powierzchniowy HBsAg
•
•
•
białko S
śladowe ilości białka preS1
śladowe ilości białka preS2
 Sposób otrzymywania – izolacja ciał
kulistych i pałeczkowatych z krwi
bezobjawowych
nosicieli
HBV,
inaktywacja formaldehydem
 Bezpieczeństwo – ryzyko transmisji
patogenów przenoszonych przez
krew
Nie są stosowane w Polsce
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu
wątroby typu B
Szczepionki II generacji
(rekombinowane)
Pierwsza szczepionka
zarejestrowana w 1986 r.
 Substancja czynna – białkowy antygen
powierzchniowy HBsAg
•
białko S
 Sposób otrzymywania – produkcja białka
S w komórkach drożdży S. cerevisiae
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu
wątroby typu B
Szczepionki II generacji
(rekombinowane)
Pierwszy układ ekspresyjny
opublikowany w 1982 r.
(P. Valenzuela, A. Medina, W.J.
Rutter, Nature, 289, 347 – 350)
 wektor ekspresyjny – pHBS-16
•
•
•
•
•
•
autonomiczna replikacja
ori replikacji pBR322
gen oporności na ampicylinę
ori replikacji plamidu 2μ
gen trp1
sekwencja kodująca białko S pod
kontrolą
promotora
ADH
I
dehydrogenazy alkoholowej I
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu
wątroby typu B
Szczepionki II generacji
(rekombinowane)
 gospodarz – S. cerevisiae XV610-8C
•
szczep auksotroficzny – brak zdolności do
wzrostu na podłożu nie zawierającym
tryptofanu
 białko S produkowane w postaci
kulistych agregatów
(agregaty 1000x bardziej immunogenne
niż pojedyncze cząsteczki białka S)
 2 – 5 μg białka z 200 ml hodowli
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu
wątroby typu B
Szczepionki II generacji (rekombinowane)
Adiuwant – wodorotlenek glinu
Postać szczepionki – płynna
Temperatura przechowywania – 2-8°C
Sposób podawania – domięśniowo
Dawkowanie – 3 dawki (1 - dzień 0; 2 – po 6 tyg.; 3 – po 6 m-cach
od pierwszego szczepienia)
 Skuteczność szczepionki





•
•
•
•
•
u 95% szczepionych ochronny poziom przeciwciał po 3 dawkach
u 95 – 100% szczepionych skuteczna ochrona przed zachorowaniem
95% noworodków od matek nosicielek HBV – zabezpieczenie przed
zakażeniem
98% noworodków od matek nosicielek HBV – zabezpieczenie przed
zakażeniem po podaniu szczepionki i HBIg w dniu urodzenia
indukuje powstanie trwałej pamięci immunologicznej
Narastanie stężenia i powinowactwa przeciwciał
w cyklu szczepień przeciwko WZW typu B
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu
wątroby typu B
Szczepionki II generacji (rekombinowane)
 Bezpieczeństwo szczepionki – wysokie
•
•
•
może być stosowana u kobiet ciężarnych
matek karmiących piersią
osób z niedoborami odporności
 Niepożądane odczyny poszczepienne
•
•
łagodne miejscowe odczyny poszczepienne
rzadko występujące odczyny ogólne – powiększenie węzłów chłonnych,
wymioty, biegunka, nudności, obniżenie ciśnienia krwi, zaburzenia ze strony
układu nerwowego
 Przeciwwskazania do szczepień
•
nadwrażliwość na składniki szczepionki
•
ciężkie choroby przebiegające z wysoką gorączką
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu
wątroby typu B
Szczepionki II generacji (rekombinowane)
 Skuteczne w szczepieniu poekspozycyjnym – uodpornienie czynnobierne (4 dawki – 0, 1, 2, 12 m-cy; HBIg równocześnie z pierwszą
dawką szczepionki)
 Dostępne w postaci szczepionek monowalentnych
•
•
Engerix B, GlaxoSmithKline
H-B-VAX, Merck Sharp Dohme
 Dostępne w postaci szczepionek skojarzonych
•
•
•
Hexavac, Aventis Pasteur (błonica, tężec, krztusiec, polio, Hib, WZW B)
Ambirix, GlaxoSmithKline (WZW A, WZW B)
Procomvax, Merck Sharp Dohme (WZW B, Hib)
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu
wątroby typu B
Szczepionki II generacji (rekombinowane)
 Białko S produkowane w komórkach drożdży metylotroficznych
Hansenula polymorpha (Hepavax Gene, Green Cross Vaccine, Korea)
 Białko S produkowane w komórkach drożdży metylotroficznych Pichia
pastoris
Szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu
wątroby typu B
Szczepionki III generacji
(rekombinowane)
 Białka S i preS2 produkowane w
linii komórkowej CHO (Chinese
Hamster
Ovary
cells),
Heprecombe, Swiss Serum and
Vaccine Institute
Saccharomyces cerevisiae




Niski poziom produkcji i
sekrecji białek
Niestabilność plazmidów
rekombinantowych
Hiperglikozylacja białek
Wąski zakres
metabolizowanych źródeł
węgla
Pichia pastoris i Hansenula polymorpha
- podstawowa charakterystyka biochemiczna
P. pastoris
H. polymorpha
Źródła węgla
i energii
glukoza
glicerol
metanol
glukoza
glicerol
metanol
Źródła azotu
jony amonowe
jony amonowe
sole kwasu
azotowego (V)
Optymalna
temperatura
wzrostu
30 °C
37-43 °C
Metabolizm metanolu
1 – oksydaza alkoholowa, 2 – katalaza, 3 – syntaza dihydroksyacetonu, 4 dehydrogenaza formaldehydowa, 5 – dehydrogenaza mrówczanowa, 6 - kinaza
dihydroksyacetonu, 7- aldolaza fruktozo-1,6-bisfosforanu, 8 – fosfataza fruktozo1,6-bisfosforanu
Drożdżowe systemy ekspresyjne


•
•
•
•
•
Szczepy gospodarzy
ekspresyjnych
Wektory ekspresyjne
bakteryjne ori replikacji
bakteryjny marker selekcyjny
sekwencja
umożliwiająca
utrzymanie się wektora w
komórce drożdży
drożdżowy marker selekcyjny
drożdżowy
promotor
i
terminator transkrypcji
AmpR
PTEF1
ColE1
ori
Drożdżowy
wektor
ekspresyjny
PHO5t
25S
rDNA
URA3
Szczepy ekspresyjne Pichia pastoris
Szczep
Fenotyp
Uwagi
X-33, Y-11430
szczep dziki
Selekcja antybiotykowa
GS115
His-, Mut+
Selekcja na podłożu bez histydyny;
szybki metabolizm metanolu
KM71
His-, Muts
Selekcja na podłożu bez histydyny;
wolny metabolizm metanolu
SMD1168
His-, Pep4-, Mut+
Selekcja na podłożu bez histydyny;
brak aktywności proteazy A; szybki
metabolizm metanolu
JC300
Ade-, Arg-, His-
Selekcja na podłożu bez adeniny,
argininy i histydyny
JC308
Ade-, Arg-, His-,
Ura-
Selekcja na podłożu bez adeniny,
uracylu, histydyny i argininy
Szczepy ekspresyjne Hansenula polymorpha
Szczep
Fenotyp
Uwagi
DL-1,
NCYC495,
CBS4732
szczep dziki
Selekcja antybiotykowa
DL10
Leu-, Ura-
Selekcja na podłożu bez leucyny i
uracylu
uDLB11
Leu-, Ura-, Pep4-
Selekcja na podłożu bez leucyny i
uracylu; brak aktywności proteazy A
L1
Leu-
Selekcja na podłożu bez leucyny
A11
Ade-
Selekcja na podłożu bez adeniny
LR9
Ura-
Selekcja na podłożu bez uracylu
Promotory transkrypcji P. pastoris
Promotor
Uwagi
AOX1 (genu oksydazy
alkoholowej)
Indukowany metanolem; represja
w obecności glukozy i glicerolu
FLD1 (genu dehydrogenazy
formaldehydowej)
Indukowany metanolem i
metyloaminą; represja w
obecności glukozy i glicerolu
PEX8 (genu kodującego białko
tworzące matrix peroksysomów)
Słaba aktywność w obecności
glukozy; wzrost aktywności w
obecności metanolu
GAP (genu dehydrogenazy
aldehydu 3-fosfoglicerynowego)
Konstytutywny, aktywny w
obecności glukozy i glicerolu
YPT1 (genu GTPazy niezbędnej w
sekrecji białek)
Konstytutywny, aktywny w
obecności glukozy i metanolu
Promotory transkrypcji H. polymorpha
Promotor
Uwagi
MOX (genu oksydazy
metanolowej)
Indukowany metanolem; represja w
obecności glukozy; aktywny w obecności
glicerolu
DHAS (genu syntazy
dihydroksyacetonu)
Indukowany metanolem; represja w
obecności glukozy; aktywny w obecności
glicerolu
FMD (genu dehydrogenazy
mrówczanowej)
Indukowany metanolem; represja w
obecności glukozy; aktywny w obecności
glicerolu
AMO (genu oksydazy aminowej)
Indukowany metylo- i etyloaminą; represja
w obecności jonów amonowych
YNT1, YNI1, YNR1 (genów
kodujących białka niezbędne w
metabolizmie azotanów)
Indukowane solami kwasu azotowego (V),
represja w obecności jonów amonowych
GAP (genu dehydrogenazy
aldehydu 3-fosfoglicerynowego)
Konstytutywny
PMA1 (genu ATPazy błony
cytoplazmatycznej)
Konstytutywny
Drożdżowe markery selekcyjne
P. pastoris

geny oporności na antybiotyki
•
gen oporności na zeocynę

markery auksotroficzne
•
gen HIS4 P. pastoris lub S. cerevisiae
gen ARG4 S. cerevisiae
gen URA3 P. pastoris
gen ADE1 P. pastoris
•
•
•
Drożdżowe markery selekcyjne
H. polymorpha

geny oporności na antybiotyki
•
•
gen oporności na zeocynę
gen oporności na fleomycynę

markery auksotroficzne
•
gen LEU 1.1 H. polymorpha
gen URA3 H. polymorpha
gen ADE11 H. polymorpha
gen LEU2 S. cerevisiae
gen URA3 S. cerevisiae
gen LEU2 C. albicans
•
•
•
•
•
Sekwencje umożliwiające utrzymanie się
wektora ekspresyjnego w komórce drożdży
P. pastoris

Sekwencje umożliwiające rekombinację
homologiczną z genomem drożdży
•
5’ fragment promotora AOX1
5’ fragment promotora GAP
gen HIS4 P. pastoris
•
•
Sekwencje umożliwiające utrzymanie się
wektora ekspresyjnego w komórce drożdży
H. polymorpha

Sekwencje umożliwiające rekombinację
homologiczną wektora z genomem drożdży
•
gen MOX H. polymorpha
gen AMO H. polymorpha
gen LEU2 S. cerevisiae
gen URA3 S. cerevisiae
•
•
•

Sekwencje umożliwiające autonomiczną replikację
wektora w komórkach drożdży
•
sekwencje ARS H. polymorpha
Zewnątrzkomórkowa produkcja białek
Sekwencje sygnalne
 obcego białka
 α-faktora S. cerevisiae
 kwaśnej fosfatazy
Zwiększenie poziomu sekrecji białek przez
komórki drożdży
Wprowadzenie do komórek drożdży dodatkowych
genów kodujących białka opiekuńcze obecne w
retikulum endoplazmatycznym

•

•
•
Foldazy
izomerazy disulfidowe
Białka opiekuńcze
kalneksyna
kalretikulina
Kierowanie białek do peroksysomów
Peroksysomy


•
•
•
Zdolne do akumulacji dużej
ilości białek
Nie zawierają enzymów
modyfikujących białka
fosfokinaz
glikozylaz
proteaz
Umożliwiają produkcję
niezmodyfikowanych białek
Sekwencja kierująca do
peroksysomów
-Ser-Lys-Leu-COOH
peroksysomy
H. polymorpha rosnąca w
pożywce z metanolem
Szczepionki przeciwko wirusowi HPV
(wirusowi ludzkiego brodawczaka)

Silgard (MSD)
Substancja czynna – białko L1
czterech typów HPV (16, 18, 6 i 11)
Adiuwant – sole glinu

Cervarix (GlaxoSmithCline)
Substancja czynna – białko L1
dwóch typów HPV (16 i 18)
Adiuwant – sole glinu + MPL
(monofosforylowany lipid A)
Białko L1 produkowane w drożdżach S. cerevisiae