Agnieszka Suszko

Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
Wydział Medycyny Weterynaryjnej
Katedra Biochemii, Farmakologii i Toksykologii
Agnieszka Suszko
WPŁYW EKSTRAKTÓW Z ZIELA CALTHA PALUSTRIS L. +A
KOMÓRKOWĄ I HUMORAL+Ą ODPOWIEDŹ IMMU+OLOGICZ+Ą
MYSZY W WARU+KACH EKSPERYME+TAL+EJ AUTOAGRESJI
Rozprawa doktorska
Promotor: prof. dr hab. Bożena Obmińska-Mrukowicz
Wrocław 2011
Pracę tę dedykuję swoim ajukochańszym Rodzicom
Pragnę złożyć serdeczne podziękowania Pani Promotor
Prof. dr hab. Bożenie Obmińskiej-Mrukowicz
za pomoc i opiekę oraz cenne wskazówki metodyczne i merytoryczne
w prowadzeniu i opracowaniu wyników badań,
Pani Prof. dr hab. Janinie Kuduk-Jaworskiej
za współpracę i cenne uwagi,
a także wszystkim Pracownikom, Koleżankom i Kolegom z Katedry
za udzielone wsparcie i pomoc
II
SPIS TREŚCI
Spis treści………………………………………………………………………………...III-IV
Wykaz skrótów…………………………………………………………………………..V-VII
Spis tabel zamieszczonych w tekście……………………………………………………..VIII
Spis rycin zamieszczonych w tekście……………………………………………………….IX
Spis zdjęć zamieszczonych w tekście………………………………………………………..X
Spis tabel dokumentacji………………………………………………………………..XI-XII
Wstęp………………………………………………………………………………………1-12
•
Autoagresja…………………………………………………………………………….1
•
Zapalenie stawów indukowane kolagenem - collagen-induced arthritis(CIA) jako
model reumatoidalnego zapalenia stawów ……………………………………….1-10
•
Caltha palustris L. – knieć błotna………………………………………………...10-12
Cel i założenia pracy………………………………………………………………………...13
Materiał i metody………………………………………………………………………...14-29
Wyniki badań:……………………………………………………………………………30-48
1.
Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na obraz kliniczny
zapalenia stawów u myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem
stawów…………………………………………………………………………...30-31
2.
Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na obraz krwi
obwodowej myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów………….31-33
3.
Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na liczbę
limfocytów grasicy, śledziony i węzłów chłonnych krezkowych oraz współczynniki
wagowe narządów limfatycznych myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem
stawów…………………………………………………………………………...33-34
4.
Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na subpopulacje
tymocytów myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów…………..34-37
5.
Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na limfocyty T i B
śledziony myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów…….............37-39
6.
Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na limfocyty T i B
węzłów chłonnych myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów….40-42
III
7.
Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na populację
limfocytów regulatorowych (Treg) myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem
stawów………………………………………………………………………...…42-43
8.
Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na stężenie cytokin
(IL-2, IL-4, IL-6, IFN-γ, TNF- α, IL-10 ) uwalnianych przez limfocyty Th1/Th2
myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów……………………….43-44
9.
Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na syntezę i
uwalnianie interleukiny-1 (IL-1) przez mysie makrofagi otrzewnowe stymulowane in
vitro LPS z E.coli w warunkach autoagresji wywołanej kolagenowym zapaleniem
stawów…………………………………………………………………………..44-45
10. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na wytwarzanie
tlenku azotu (NO) przez mysie makrofagi otrzewnowe stymulowane in vitro LPS z
E.coli w warunkach autoagresji wywołanej kolagenowym zapaleniem
stawów…………........................................................................................................45
11. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na aktywność
fagocytarną granulocytów i monocytów krwi obwodowej myszy z wywołanym
kolagenowym zapaleniem stawów………………………………………………45-46
12. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na zdolność bójczą
granulocytów i monocytów krwi obwodowej myszy z wywołanym kolagenowym
zapaleniem stawów………………………………………………………………….47
13. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na odpowiedź
humoralną myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów i
immunizowanych SRBC………………………………………………………...47-48
Dyskusja…………………………………………………………………………………..49-64
Wnioski…………………………………………………………………………………........65
Piśmiennictwo……………………………………………………………………………66-80
Streszczenie………………………………………………………………………………81-82
Abstract………………………………………………………………………………………83
Dokumentacja-tabele…………………………………………………………………….84-97
IV
WYKAZ SKRÓTÓW
•
aCCP (anti-cyclic citrullinated peptide antibodies ) - przeciwciała przeciwko cyklicznemu
cytrulinowanemu peptydowi
•
AIA (adjuvant-induced arthritis) - adjuwantowe zapalenie stawów
•
AICD (activation induced cell death) – śmierć komórki indukowana aktywacją
•
APC (antigen presenting cell) – komórka prezentująca antygen
•
ARAGAL (complex acidic heteropolysaccharide, containing mainly galactose and
arabinose) - kompleks kwaśnych heteropolisacharydów zawierający galaktozę i arabinozę
z gumy drzewa Anadenanthera colubrina
•
BSA (bovine serum albumine) – albumina bydlęca
•
CD (cluster of differentiation) – antygeny różnicowania
•
CIA (collagen - induced arthritis) – kolagenowe zapalenie stawów
•
CME (Chelidonium majus extract) - ekstrakt z Chelidonium majus
•
COMP (cartilage oligomeric matrix protein) – oligomeryczne białko macierzy chrząstki
•
CTLA-4 (Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4) – antygen 4 związany z limfocytem T
cytotoksycznym
•
DMARD’s (disease modifying antirheumatic drugs) - leki modyfikujące przebieg
choroby
•
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) – test immunoenzymosorbcyjny
•
ESR (erythrocyte sedimentation rate) – wskaźnik sedymentacji erytrocytów
•
EULAR (The European League Against Rheumathism) – Europejska Liga do Walki z
Reumatyzmem
•
Fab (Fragment antigen-binding) – fragment wiążący antygen
•
FACS (fluorescent activated cell sorter ) – sorter komórek aktywowany fluoresceiną
•
Fc ( fragment crystallizable) – fragment zdolny do krystalizacji
•
FCS (fetal calf serum) – płodowa surowica cielęca
•
FITC ( fluorescein isothiocyanate) – izotiocyjanian fluoresceiny
•
fMPL (N-formyl-Met-Leu-Phe) – N-formylometionyloleucylofenyloalanina
•
Foxp3 (forkhead transcriptor factor box P3) – czynnik transkrypcyjny
V
•
GSPE (grape seed proanthocyanidin extract) - proantocyjanidowy ekstrakt z pestek
winogron
•
GvHD (Graft-versus-Host Disease) – choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi
•
HEPp (hydroalcoholic extract of Pterodon pubescens seeds) - hydroalkoholowy ekstrakt z
nasion Pterodon pubescens
•
HLA (human leukocyte antigens) – antygeny ludzkich leukocytów
•
IFN (interferon) - interferon
•
Ig (immunoglobulins) - przeciwciała
•
IL (interleukin) - interleukina
•
IL-1RI (Interleukin-1 Receptor I ) – receptor typu I dla interleukiny-1
•
IPEX (immunodysregulation polyendocrinopathy enteropathy X-linked syndrome) –
zespół dysregulacji immunologicznej, poliendokrynopatii i entropatii sprzężony z
chromosomem X
•
JAK/STAT (Janus activated kinase / Signal Transducer and Activator of Transcription) –
kinaza aktywowana zielenią Janusową / przekaźnik sygnału i aktywator transkrypcji
•
LDL (low density lipoprotein) – lipoproteiny o małej gęstości
•
LPS ( lipopolysaccharide) - lipopolisacharyd
•
MCG – barwienie preparatów metodą May-Grünwald-Giemsa (Pappenheima)
•
MTX (methotrexate) - metotreksat
•
NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells ) - czynnik
jądrowy kappa z aktywowanych limfocytów B
•
NO (nitric oxide) – tlenek azotu
•
NSAIDs (non-steroidal anti-inflammatory drugs) - niesteroidowe leki przeciwzapalne
(NLPZ)
•
OIA (oil-induced arthritis) - olejowe zapalenie stawów
•
PBS (phosphate buffered saline) – zbuforowany fosforanami 0,9% roztwór NaCl
•
PE (phycoerythrin) - fikoerytryna
•
PFC (plaque forming cells) – komórki tworzące łysinki hemolityczne
•
PGE2 (prostaglandin E2) – prostaglandyna E2
•
PHA (phytohaemagglutinin) – fitohemaglutynina
•
PMA (phorbol myristate acetate) – octan mirytynianu forbolu
•
PPE (pine pollen extract) – ekstrakt z pyłku sosny
•
RA (rheumathoid arthritis) – reumatoidalne zapalenie stawów
VI
•
RANKL (receptor activator of F-κB ligand) - ligand receptora aktywującego czynnik
jądrowy kappa B
•
RF (rheumatoid factor) – czynnik reumatoidalny
•
RGSE (red ginseng saponin extract) - ekstrakt saponin z korzenia rośliny Panas ginseng
C.
•
SLE (systemic lupus erythematosus) - toczeń rumieniowaty układowy
•
SPS (salicornia polysaccharides) - polisacharydy Salicornia herbacea
•
SRBC (sheep red blood cells) – erytrocyty owcy
•
TBL-II (Tonbiling II) – wodny ekstrakt chińskiej, tradycyjnej mieszanki ziołowej z:
Ramulus Cinnamomi Cassiae, Paeoniae alba Radix, Radix Aconiti Lateralis Preparata,
Achyrantes bidentata Blume, Celastrus orbiculatus Thunb, Milentia reticulata Benth,
•
Th1 (T-helper cells) – limfocyty pomocnicze wspomagające odporność komórkową
•
Th17(T- helper cells) – limfocyty pomocnicze produkujące IL-17
•
Th2 (T-helper cells) – limfocyty pomocnicze wspomagające odporność humoralną
•
TNF (tumor necrosis factor ) – czynnik martwicy nowotworu
•
Treg (regulatory T cells) – limfocyty T regulatorowe
•
TWH (Tripterygium wilfordii Hook f.) - Tripterygium wilfordii Hook f.
VII
SPIS TABEL zamieszczonych w tekście
•
Tab.1. Ocena kliniczna zapalenia stawów………………………………………………..19
•
Tab.2. Wpływ kolagenowego zapalenia stawów (CIA) na obraz krwi obwodowej
myszy……………………………………………………………………………………..32
•
Tab.3. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na obraz krwi
obwodowej myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów…………………..33
•
Tab.4. Wpływ kolagenowego zapalenia stawów (CIA) na odsetek i liczbę limfocytów T w
grasicy myszy……………………………………………………………………………..35
•
Tab.5. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na odsetek i liczbę
limfocytów T grasicy myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów………...36
•
Tab.6. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na na odsetek i
liczbę limfocytów T grasicy myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów.....37
•
Tab.7. Wpływ wywołanego kolagenowego zapalenia stawów (CIA) na limfocyty T i B
śledziony myszy…………………………………………………………………………..38
•
Tab.8. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na limfocyty T i B
śledziony myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów……………………..39
•
Tab.9. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na limfocyty T i B
śledziony myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów……………………..39
•
Tab.10. Wpływ wywołanego kolagenowego zapalenia stawów (CIA) na limfocyty T i B
węzłów chłonnych krezkowych myszy…………………………………………………..40
•
Tab.11. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na limfocyty T i
B węzłów chłonnych krezkowych myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem
stawów……………………………………………………………………………………41
•
Tab.12. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na limfocyty T i
B węzłów chłonnych krezkowych myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem
stawów……………………………………………………………………………………42
VIII
SPIS RYCI+ zamieszczonych w tekście
•
Ryc.1. Schemat doświadczeń……………………………………………………………. 17
•
Ryc.2. Wpływ ekstraktów C i B z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na obraz
kliniczny eksperymentalnie wywołanego u myszy CIA………………………………….31
•
Ryc.3. Wpływ ekstraktów C i B z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na odsetek
śledzionowych
limfocytów
Treg
(CD4+CD25+Foxp3+)
myszy
z
wywołanym
CIA………………………………………………………………………………………..43
•
Ryc.4. Wpływ ekstraktów C i B z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na
odpowiedź humoralną myszy z wywołanym CIA………………………………………..48
IX
SPIS ZDJĘĆ zamieszczonych w tekście
Zdj.1-7. Ocena punktowa zmian klinicznych w przebiegu CIA.
•
Zdj.1 - 0pkt………………………………………………………………………………..19
•
Zdj.2 - 1pkt………………………………………………………………………………..20
•
Zdj.3 - 2pkt………………………………………………………………………………..20
•
Zdj.4 - 3pkt………………………………………………………………………………..20
•
Zdj.5 - 3pkt………………………………………………………………………………..20
•
Zdj.6 - 4pkt…………………………………….………………………………………….20
•
Zdj.7 - 4pkt………………………………………………………………………………..20
X
SPIS TABEL DOKUME+TACJI
•
Tab.1D. Wpływ ekstraktów B i C z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na obraz
kliniczny zapalenia stawów myszy z wywołanym CIA…………………………………..84
•
Tab.2D. Wpływ ekstraktów B i C z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na obraz
krwi obwodowej myszy z wywołanym CIA ……………………………………………..85
•
Tab.3D. Wpływ ekstraktów B i C z ziela Caltha palustris L.oraz metotreksatu na liczbę
limfocytów grasicy, śledziony i węzłów chłonnych krezkowych oraz indeks wagowy
narządów limfatycznych myszy z wywołanym CIA……………………………………..86
•
Tab.4D. Wpływ ekstraktów B i C z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na liczbę i
subpopulacje limfocytów T grasicy myszy z wywołanym CIA……………………….…87
•
Tab.5D. Wpływ ekstraktów B i C z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na liczbę i
subpopulacje limfocytów T i B śledziony myszy z wywołanym CIA……………………88
•
Tab.6D. Wpływ ekstraktów B i C z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na liczbę i
subpopulacje limfocytów T i B węzłów chłonnych krezkowych myszy z wywołanym
CIA………………………………………………………………………………………..89
•
Tab.7D. Wpływ ekstraktów B i C z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na indeks
CD4+/CD8+ grasicy, śledziony i węzłów chłonnych krezkowych myszy z wywołanym
CIA……………………………………………………………………………………..…90
•
Tab.8D. Wpływ ekstraktów B i C z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na
populację limfocytów regulatorowych śledziony myszy z wywołanym CIA
…………………………………………………………………………………………….91
•
Tab.9D. Wpływ ekstraktów B i C z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na
stężenia cytokin we krwi wytwarzanych przez limfocyty Th1/Th2 myszy z wywołanym
CIA ……………………………………………………………………………………….92
•
Tab.10D. Wpływ ekstraktów B i C z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na
wytwarzanie Il-1 przez makrofagi otrzewnowe stymulowane in vitro lps z E.coli myszy z
wywołanym CIA …………………………………………………………………………93
•
Tab.11D. Wpływ ekstraktów B i C z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na
wytwarzanie tlenku azotu przez makrofagi otrzewnowe stymulowane in vitro LPS z E.coli
myszy z wywołanym CIA ………………………………………………………………..94
XI
•
Tab.12D. Wpływ ekstraktów B i C z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na
aktywność fagocytarną granulocytów i monocytów krwi obwodowej myszy z wywołanym
CIA ………………………………………………………………………………...……..95
•
Tab.13D. Wpływ ekstraktów B i C z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na
zdolność bójczą granulocytów i monocytów krwi obwodowej myszy z wywołanym CIA
………………………………………………………………………………………….…96
•
Tab.14D. Wpływ ekstraktów B i C z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na
odpowiedź humoralną myszy z wywołanym CIA i immunizowanych
SRBC……………………………………………………………………………………..97
XII
WSTĘP
AUTOAGRESJA .
Możliwość rozróżniania przez komórki układu immunologicznego tego co „obce” od tego co
„własne” ma szczególnie istotne znaczenie dla zapewnienia stanu równowagi zdrowotnej
organizmu, czyli jego homeostazy. Oprócz funkcji obronnej polegającej na destrukcji i
eliminacji rozpoznanych struktur obcych, układ odpornościowy zobowiązany jest do
zapewnienia tolerancji i ochrony własnych prawidłowych tkanek, a także do wywierania
protroficznych wpływów polegających na wspieraniu procesów regeneracji własnych,
rozpoznanych tkanek. Dzięki wielu wytworzonym w narządach limfatycznych mechanizmom
możliwe jest utrzymanie stanu tolerancji, czyli braku reaktywności na własne antygeny.
Komórki układu odpornościowego w pierwszej kolejności w czasie dojrzewania nabywają
tolerancji na własne antygeny w procesie tolerancji centralnej (w centralnych narządach
limfatycznych). Jednakże nie wszystkie autoreaktywne limfocyty mogą być eliminowane w
ten sposób i te, które nie poddadzą się temu procesowi nabywają tolerancji obwodowej
poprzez delecję klonalną, anergię i śmierć komórki indukowanej aktywacją (AICD-activation
induced cell death). Mimo tak złożonego systemu selekcji w każdym ustroju znajduje się pula
potencjalnie autoreaktywnych limfocytów T i B oraz autoprzeciwciał. Jeżeli dodatkowo
zawiodą mechanizmy aktywnej supresji przez cytokiny czy supresja z udziałem hormonów
nadnerczy (glikokortykosterydów) to wówczas mogą wystąpić odpowiednie warunki
do
rozwoju chorób autoimmunizacyjnych układowych (systemowych) lub narządowo swoistych.
Autoagresja jest więc nabytą reaktywnością na własne antygeny. Czynniki, które wpływają na
rozwój chorób z autoagresji to między innymi: podłoże genetyczne, wiek i płeć, infekcje oraz
charakter autoantygenu, ale również stosowanie niektórych leków np. prokainamidu [115].
ZAPALENIE STAWÓW INDUKOWANE KOLAGENEM - COLLAGEN-INDUCED
ARTHRITIS (CIA) JAKO MODEL REUMATOIDALNEGO ZAPALENIA STAWÓW.
Modele zwierzęce chorób autoimmunizacyjnych są niezwykle pomocne w rozumieniu
etiologii i mechanizmów patogenezy chorób o podłożu autoimmunologicznym oraz stanowią
1
kluczowe narzędzie służące do wstępnej oceny i przesiewowej weryfikacji nowych,
potencjalnych środków terapeutycznych.
Jednym z takich modeli jest model zapalenia stawów indukowanego kolagenem - collageninduced artritis (CIA), który odpowiada pod względem obrazu klinicznego i występujących
zaburzeń immunologicznych reumatoidalnemu zapaleniu stawów (RZS), schorzeniu
występującemu u ludzi [90]. CIA może być indukowane u wrażliwych szczepów myszy jak i
szczurów przez podskórne podanie heterologicznego (ksenogenicznego) kolagenu typu II w
kompletnym (myszy) lub niekompletnym (szczury) adjuwancie Freunda [69]. W badaniach
eksperymentalnych wykorzystuje się również inne modele zapalenia stawów, jakimi są u
szczurów: zapalenie indukowane COMP (Cartilage oligomeric matrix protein-COMP induced
arthritis), zapalenie adjuwantowe (Adjuvant-induced arthritis - AIA), zapalenie indukowane
awrydyną (Avridine-induced arthritis), olejowe zapalenie stawów (Oil-induced arthritis OIA), streptokokowe zapalenie stawów (Streptococcal cell wall-induced arthritis), natomiast
u myszy : proteoglikanowe zapalenie stawów (Proteoglycan-induced arthritis), gronkowcowe
septyczne zapalenie stawów (S.aureus-induced septic arthritis), boreliozowe zapalenie
stawów (Borrelia burgdorferii-induced arthritis) oraz spontaniczne zapalenie stawów u myszy
modyfikowanych genetycznie [ 33].
Reumatoidalne zapalenie stawów jest chorobą o podłożu autoimmunologicznym występującą
u ludzi jak i zwierząt – często opisywaną u psów [78,102]. Schorzenie to jest przewlekłym,
progresywnym, autoimmunologicznym stanem zapalnym manifestującym się zapaleniem
chrząstki stawowej (synovitis), jej ostrą destrukcją prowadzącą do zniekształcenia i
zniszczenia stawów, a w konsekwencji do niepełnosprawności ruchowej różnego stopnia,
kalectwa, jak również przedwczesnej śmierci.
Immunopatogeneza przebiegu RZS i CIA jest bardzo złożona i wynika z zaburzeń funkcji
wielu komórek takich jak: limfocytów T, zwłaszcza regulatorowych (Treg), limfocytów B,
makrofagów, synowiocytów podobnych fibrolastom, komórek śródbłonka i komórek
dendrytycznych [40,105].
Podobnie jak w przypadku reumatoidalnego zapalenia stawów w rozwoju kolagenowego
zapalenia stawów udział biorą również cząsteczki MHC klasy II. W zależności od rodzaju
szczepu zwierząt i pochodzenia kolagenu typu II podatność na wystąpienie CIA różni się. U
ludzi skłonność do rozwinięcia się reumatoidalnego zapalenia stawów jest ściśle skorelowana
z obecnością molekuł klasy II HLA-DR1 i HLA–DR4, z kolei u myszy szczepu DBA/1 i
B10.Q posiadanie haplotypu H-2q i H-2r (ekspresja molekuł klasy II I-Aq i I-Ar) warunkuje
wysoki stopień podatności do wystąpienia CIA [ 16,30,147].
2
Badania eksperymentalne Sveenssona i wsp. [132], w których autorzy udokumentowali, że u
szczepów myszy z niedoborem limfocytów B nie dochodzi do rozwoju kolagenowego
zapalenia stawów, świadczą o udziale limfocytów B w rozwoju CIA. W przebiegu tego
zapalenia w wyniku niszczenia chrząstki stawowej dochodzi do uwalniania jej składników
takich jak kolagen typu II. Doprowadza to do aktywacji limfocytów B i produkcji
uszkadzających chrząstkę stawową autoprzeciwciał klasy IgG przeciw kolagenowi typu II
(anty-CII). Powstają podklasy immunoglobuliny G tzn. IgG1 oraz IgG2 (IgG2a, IgG2b), a
wielkość stężenia podklasy IgG2, a zwłaszcza IgG2a ściśle koreluje z ciężkością przebiegu
zapalenia stawów [116]. Pasywny transfer surowic, pochodzących od myszy z CIA,
zawierających swoiste przeciwciała skierowane przeciw kolagenowi typu II indukuje
wystąpienie ostrego zapalenia stawów u myszy zdrowych [60,129]. Terato i wsp. [134]
wykazali, że również jednoczesne podanie wielu przeciwciał monoklonalnych anty–CII
indukuje u zdrowych myszy rozwój CIA. Obie subklasy przeciwciał IgG2 tj. IgG2a i IgG2b
są zdolne do aktywacji dopełniacza. Wykazano, że myszy szczepu DBA/1 genetycznie
pozbawione C3 i C5 lub czynnika B pomimo wysokiego stężenia przeciwciał IgG2a anty-CII
są wysoce oporne na indukcję CIA, co dowodzi, że aktywacja komplementu odgrywa istotną
rolę w patogenezie CIA [57,142]. Limfocyty B mogą pełnić także funkcję komórek
prezentujących antygen przez przetwarzanie i
prezentowanie peptydów antygenowych
limfocytom T, które następnie proliferują i manifestują swoje działania prozapalne (produkcja
cytokin
prozapalnych)
[23,94].
Limfocyty
B
są
bezpośrednio
zaangażowane
w
podtrzymywanie ciągłości procesu zapalnego w synowium, jak również od tej populacji
komórek jest zależna stymulacja
Takemury
i aktywacja limfocytów T, czego dowodzą badania
i wsp. [133]. Aktywne limfocyty B produkują czynnik reumatoidalny – RF
(rheumatoid factor) oraz przeciwciała anty-CII i przeciw peptydom cytrulinowym anty-CCP
[114]. Uważa się, że limfocyty B wykazujące zdolność wytwarzania RF mogą migrować do
błony maziowej stawów pacjentów z RZS by przedstawić komórkom T szereg dla nich
właściwych antygenów. To powoduje utrwalenie lokalnej odpowiedzi zapalnej i amplifikację
produkcji RF w błonie maziowej. Czynnik reumatoidalny przedłuża czas przeżycia komórek
B, a tym samym umożliwia utrzymanie własnego wytwarzania, co wraz z aktywacją
dopełniacza przyczynia się do rozwoju kaskady zapalnej [ 35]. RF jest podstawowym i dobrze
zwalidowanym markerem ostrości przebiegu reumatoidalnego zapalenia stawów, chociaż nie
należy do specyficznych markerów tego schorzenia. Obecność czynnika reumatoidalnego
stwierdza się także w modelowym CIA [ 61].
3
Ponadto limfocyty B (zwłaszcza zlokalizowane w błonie stawowej) są czynnikiem
stymulującym makrofagi do wytwarzania cytokin pozapalnych takich jak TNF-α [85,104].
Dowiedziono również możliwość indukcji kilkumiesięcznej remisji u pacjentów z RZS przez
deplecję limfocytów B po zastosowaniu złożonej terapii immunosupresyjnej polegającej na
podawaniu
rituximabu
(przeciwciało
monoklonalne
anty-CD20),
cyklofosfamidu
i
prednizolonu [85]. Skuteczność powyższej terapii jest potwierdzeniem istotnego udziału
limfocytów B w patogenezie tego schorzenia.
Z kolei udział limfocytów T w patogenezie zapalenia stawów o podłożu automunologicznym
jest bardziej złożony i przebiega dwutorowo [59]. Aktywowane limfocyty T zwłaszcza o
funkcji indukująco-wspomagającej, poprzez wytwarzane cytokiny (IL-4 i IL-5) stymulują
limfocyty B do syntezy i uwalniania autoprzeciwciał niszczących chrząstki stawowe [31].
Ponadto limfocyty T wytwarzają szereg innych cytokin takich jak IL-3, IL-6, IL-17 o
bezpośrednim wpływie na rozwój CIA lub też przez produkowane cytokiny aktywują inne
komórki, głównie makrofagi do wytwarzania cytokin prozapalnych (IL-1, IL-6 i TNF-α),
które wywierają działanie niszczące na chrząstki stawowe i kości.
Aktywowane limfocyty T przez prezentację im antygenu przez komórki APC zaczynają
wytwarzać IL-2 i ulegają klonalnej ekspansji, proliferują i zaczynają ekspresjonować na
swojej powierzchni molekuły, takie jak: CD69 - zaangażowaną w aktywację makrofagów,
TNF-α – zaangażowany w aktywację fibroblastów synowium i receptora aktywującego
czynnik jądrowy kappa B (RANKL) – odgrywający rolę w aktywacji osteoklastów.
Jednocześnie zmianom na powierzchni limfocytów T towarzyszy wzrost syntezy i uwalniania
IL-17, cytokiny biorącej udział w procesie aktywacji osteoklastów powodujących resorpcję
kości [79]. Aktywowane limfocyty T wytwarzają IFN-γ , który stymuluje makrofagi do
wydzielania licznych cytokin prozapalnych (IL-1, IL-6, TNF-α) odpowiedzialnych za
stymulację fibroblastów synowium i synowiocytów [17,32]. Te kluczowe cytokiny indukują
zapalenie i powodują uwalnianie metaloproteinaz zrębu (matrix metalloproteinase)
degradujących tkankę łączną i powodujących tworzenie się łuszczki [26]. Aktywowane
komórki T ekspresjonują także ligand dla osteoprotegryny (RANKL), który razem z IL-1
stymuluje osteoklasty, doprowadzając tym samym do erozji kości. Ta sekwencja zdarzeń
prowadzi do chronicznego stanu zapalnego powodującego zniszczenia chrząstki i kości w
przebiegu RZS [ 26,104].
W reumatoidalnym zapaleniu stawów jak i w jego modelu – CIA należy zwrócić szczególną
uwagę na pulę limfocytów T regulatorowych (Treg), których główną rolą jest utrzymanie
stanu tolerancji na obwodzie, a także określenie siły i czasu trwania odpowiedzi
4
immunologicznej. Limfocyty T regulatorowe stanowią od 5 do 10% subpopulacji limfocytów
T CD4+ i ekspresjonują na powierzchni komórek łańcuch alfa dla receptora IL-2 (IL-2R),
czyli CD25+, co stanowi podstawę do ich identyfikacji [58]. Obecność limfocytów T
regulatorowych (Treg) może wpływać hamująco na aktywację i proliferację limfocytów
CD4+, czego dowiedziono w badaniach in vivo [131] i in vitro [136]. Niedobór populacji
limfocytów T (CD4+CD25+) może prowadzić do spontanicznego rozwoju chorób
autoimmunologicznych, a także, czego dowiódł w swoich badaniach Morgan i wsp.[97]
zwiększa ciężkość objawów klinicznych w przebiegu CIA u myszy. Z kolei transfer
adoptywny limfocytów T CD25+ jest efektywny w leczeniu kolagenowego zapalenia stawów
[98]. Natomiast upośledzenie funkcji tej populacji, udokumentowane u chorych z RZS , jest
efektem braku hamowania wytwarzania cytokin pozapalnych przez limfocyty efektorowe oraz
monocyty, co wykazano w mieszanych hodowlach z limfocytami CD4+CD25+ [36]. Autorzy
powyższych badań wykazali także, że przywrócenie ochronnej funkcji limfocytom T
CD4+CD25+ jest możliwe przez zablokowanie syntezy i uwalniania TNF-α – cytokiny
odpowiedzialnej za rozwój zapalenia stawów o podłożu autoimmunologicznym, jak i
ciężkość przebiegu autoagresji. Ponadto istotne jest upośledzenie interakcji między
limfocytami T regulatorowymi a komórkami T efektorowymi i komórkami prezentującymi
antygen (APC) [138,139] . Populacja limfocytów T regulatorowych u myszy zawiera
ponadprzeciętna ilość wewnątrzkomórkowego białka (czynnika transkrypcyjnego ) - Foxp3
[72] . Mutacja genu dla Foxp3 koniecznego dla rozwoju limfocytów T regulatorowych
prowadzi do zaburzeń odpowiedzi immunologicznej u myszy - tzw. scurfy mice oraz ludzi
tzw. IPEX (immunodysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome) zespół dysregulacji immunologicznej, poliendokrynopatii i entropatii sprzężony z
chromosomem X [13,62]. Obserwacje poczynione w tych eksperymentach potwierdzają rolę
komórek Treg w zapewnieniu homeostazy układu odpornościowego. Obecnie przyjmuje się,
że Foxp3 jest czynnikiem przeprogramowującym limfocyty T w limfocyty regulatorowe i jest
regulatorem rozwoju, funkcji i homeostazy komórek tej populacji [42,149].
W przebiegu schorzeń autoimmunologicznych dochodzi do zjawiska dysregulacji w
wytwarzaniu cytokin i zaburzenia równowagi między nimi [24]. Za rozwój reumatoidalnego
zapalenia stawów odpowiedzialne są w szczególności cytokiny prozapalne takie jak IL-1, IL6 i TNF-α [38]. Cytokiny te mają zdolność do aktywacji komórek śródbłonka i krążących
leukocytów oraz powodują
zwiększoną ekspresję wielu molekularnych adhezyn
odgrywających istotną rolę we wzmaganiu przylegania leukocytów do śródbłonka naczyń, co
zapoczątkowuje przechodzenie leukocytów przez ścianę naczynia w drodze do ogniska
5
zapalnego [29]. Cytokiny te, wytwarzane głównie przez aktywowane makrofagi,
przyspieszają resorpcję kości oraz biorą udział w niszczeniu chrząstek stawowych [66].
Zasadniczą rolę pełni wśród nich IL-1 [32]. Cytokina ta w przebiegu zapalenia stawów o
podłożu autoimmunologicznym wykazuje najsilniejsze działanie niszczące kości i chrząstki
oraz upośledza procesy naprawcze chrząstki przez hamowanie syntezy białek macierzy
[55,70,140]. Z kolei plejotropowa IL-6 stymuluje zarówno limfocyty B do produkcji
przeciwciał, jak również jest czynikiem wzrostu i różnicowania dla komórek T (różnicowanie
do Th17), pobudza destrukcję kości przez indukcję proliferacji komórek synowium i
różnicowanie osteoklastów [91].
Z kolei TNF-α powoduje wzrost ekspresji cząsteczek
adhezyjnych śródbłonka naczyniowego zwiększając tym samym przenikanie limfocytów,
makrofagów i neutrofilów do jamy stawowej oraz stymuluje wytwarzanie przez synowiocyty
metaloproteinaz mających destruktywny wpływ na chrząstki i kości. Ponadto czynnik ten
pobudza wytwarzanie i wydzielanie IL-1β i IL-6 czego następstwem jest reakcja ostrej fazy,
a także powoduje wyzwolenie bólu przez uwrażliwienie nocyceptywnych włókien bólowych
na prostaglandyny [17,22,38,51]. Wykazano również istotną rolę
w patogenezie
reumatoidalnego zapalenia stawów IL-17, syntetyzowanej i uwalnianej przez limfocyty T
CD4+. IL-17 pobudza komórki nabłonkowe, śródbłonkowe i fibroblasty do wytwarzania IL-6
i IL-8 oraz prostaglandyny PGE2 - mediatora odczynu zapalnego. Cytokina ta prowadzi
również do pobudzenia wytwarzania mediatorów odczynu zapalnego poprzez zwiększenie
poziomu ICAM-1 na powierzchni komórek docelowych oraz powoduje w tych komórkach
aktywację czynnika jądrowego NF-κB [59,112]. IL-17 jest również silnym stymulatorem
osteoklastogenezy [79,150], co potwierdza jej udział w degradacji chrząstki stawowej.
Aktualnie dowiedziono również, że IL-3 bierze udział w rozwoju CIA u myszy [15]. We
wczesnej fazie rozwoju kolagenowego zapalenia stawów cytokina ta jest odpowiedzialna za
pobudzenie aktywności limfocytów T CD4+ wspomagających limfocyty B do syntezy i
uwalniania autoprzeciwciał.
Podsumowując występowanie obrzęku, naciek komórek złożony z limfocytów T i B,
plazmocytów neutrofilów, makrofagów, mastocytów oraz komórek NK w obrębie błony
maziowej, powstanie łuszczki , degradacja chrząstki i kości oraz udział MHC II to główne
cechy CIA stanowiące o podobieństwie do RZS.
Obecnie w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów stosuje się następujące grupy leków:
1) leki modyfikujące przebieg choroby (LMPCh z ang. DMARDs - disease modifying
antirheumatic drugs) o działaniu immunosupresyjnym, 2) leki o działaniu przeciwzapalnym i
6
immunosupresyjnym lub
o działaniu przeciwzapalnym i przeciwbólowym, 3) leki
biologiczne. Do pierwszej grupy należą: sole złota, azatiopryna, cyklosporyna, penicylamina,
lefunomid, metotreksat, sulfasalazyna, cyklofosfamid. Do drugiej grupy leków stosowanych
w terapii RZS należą glikokortykosteroidy i niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ z ang.
NSAID’s) Z kolei do najnowocześniejszej grupy leków biologicznych stosowanych w terapii
RZS należą inhibitory TNF (infliksymab, adalimumab, etanercept), anakinra - inhibitor IL-1,
rytuksymab - przeciwciało monoklonale anty CD-20 przeciwko komórkom B, abatacept –
inhibitor stymulacji komórek T, tocilizumab - bloker dla IL-6.
Obecnie zgodnie z zaleceniami EULAR (European League Against Rheumatism)
opublikowanymi w 2010 roku lekiem pierwszego rzutu stosowanym w terapii RZS u ludzi
jest metotreksat [126]. Metotreksat (MTX, kwas 4 amino-N10-metylofoliowy) jest analogiem
kwasu foliowego, należącym do grupy antymetabolitów, cytostatyków, lekiem o działaniu
immunosupresyjnym. Metotreksat jest antagonistą syntezy kwasu foliowego wchodzącego w
skład enzymów uczestniczących w syntezie puryn i pirymidyn, a tym samym DNA i RNA w
komórce. Lek ten uniemożliwia redukcję kwasu foliowego do kwasu tetrahydrofoliowego
przez wiązanie się z reduktazą tetrahydrofoliową – enzymem katalizującym tę reakcję. MTX
blokuje kompetencyjnie również syntetazę tymidylową,
inny enzym biorący udział w
syntezie puryn i pirymidyn komórek. Zahamowanie syntezy tych związków prowadzi do
zaburzeń wzrostu, funkcjonowania i w efekcie wywołuje śmierć komórki. Nukleotydy te są
niezbędne także do rozwoju, przeżycia oraz stymulowanej antygenem proliferacji limfocytów
T. Ponadto zahamowanie syntezy pirymidyn indukuje apoptozę [47]. Metotreksat wykazując
zdolność indukcji apoptozy komórek immunologicznych wywołuje efekt immunosupresji.
Zabija komórki znajdujące się w fazie S cyklu komórkowego - jest lekiem swoistym dla fazy
[1,46]. Związek ten poprzez indukcję inhibitorów aktywności cytokin prozapalnych hamuje
ich syntezę i/lub aktywność [49,100]. Metotreksat wywiera działanie hamujące na odpowiedź
humoralną i komórkową. Skuteczność kliniczna tego związku została wykorzystana w terapii
kilku poważnych schorzeń. Najistotniejsze
zastosowanie to terapia reumatoidalnego
zapalenia stawów, gdzie należy do grupy leków modyfikujących przebieg choroby [14].
Metotreksat działa wielokierunkowo , blokując różne składowe procesu chorobotwórczego
przez
wywieranie
działania
immunosupresyjnego,
przeciwzapalnego,
modulowanie
wydzielania cytokin, indukcję apoptozy, czy też działanie cytostatyczne. Stosowany jest też
w leczeniu innego schorzenia z autoagresji tj. układowej postaci tocznia rumieniowatego
(SLE) [146]. Jednoczesne zastosowanie metotreksatu i glikokortykosterydów w terapii
ciężkiej postaci SLE pozwala na redukcję dawki tych ostatnich [76] . Związek ten jest także
7
skuteczny w leczeniu łuszczycy – powoduje hiperplazję komórek nabłonka, co jest związane
z inhibicją syntezy DNA [93,144]. Metotreksat znalazł również zastosowanie kliniczne w
profilaktyce i terapii choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD) oraz w chorobach
nowotworowych w połączeniu z innymi cytostatykami [ 65].
Obecnie pomimo szerokiego wachlarza dostępnych leków stosowanych w terapii
reumatoidalnego zapalenia stawów (RZS), w dalszym ciągu prowadzone są intensywne
poszukiwania nowych substancji czynnych o lepszej skuteczności terapeutycznej i przede
wszystkim mniejszej toksyczności. Jedną z potencjalnych możliwości jest stosowanie w
terapii RZS substancji czynnych, które mogłyby w sposób swoisty interferować z
mechanizmami immunologicznymi charakterystycznymi dla immunopatogenezy RZS,
poprzez blokowanie syntezy i uwalniania cytokin prozapalnych lub wywieranie działań
korygujących funkcje komórek immunologicznych biorących udział w patogenezie tego
schorzenia [119]. Leki biologiczne stały się niezwykle ważnym elementem terapii
zaawansowanego stadium choroby. Pierwsze inhibitory TNF-α zostały opracowane w końcu
lat dziewięćdziesiątych XX wieku i w aktualnie dostępnym piśmiennictwie dostępnych jest
wiele badań potwierdzających ich kliniczną skuteczność. Adalimumab to w pełni
humanizowane przeciwciało monoklonalne anty-TNF-α klasy G1 neutralizujące biologiczną
czynność TNF-α przez inhibicję jego interakcji z receptorami p55 i p75 na powierzchni
komórki oraz modulujące odpowiedzi biologiczne indukowane lub regulowane przez TNF-α
[5,44, 111 ]. Etanercept to z kolei dimer łączący zewnątrzkomórkowy ligand wiążący domenę
receptora 2 ludzkiego TNF (TNF-R2/p75) i region stały ludzkiej immunoglobuliny IgG1.
Związek ten hamuje aktywność biologiczną TNF przez blokowanie wiązania się TNF z jego
receptorem komórkowym [4,143]. Natomiast infliksimab to chimeryczne ludzko-mysie
przeciwciało monoklonalne wiążące rozpuszczalną jak i błonową formę ludzkiego TNF-α tym
samym tworząc stabilne kompleksy powoduje utratę jego aktywności biologicznej [9,145].
Liczba wprowadzonych do terapii inhibitorów TNF-α cały czas ulega poszerzeniu i niedawno
zostały
wprowadzone nowe przeciwciała monoklonalne z tej rodziny: golimumab i
certolizumab pegol [125,151]. Certolizumab pegol to połączony z cząsteczką glikolu
polietylenowego rekombinowany, humanizowany fragment Fab’ przeciwciała przeciwko
TNF-α neutralizujący rozpuszczalną jak i błonową formę ludzkiego TNF-α . Cząsteczka tego
leku to zdekompletowane przeciwciało pozbawione fragmentu Fc i dlatego w badaniach in
vitro nie wiąże dopełniacza, nie powoduje cytotoksyczności komórkowej zależnej od
przeciwciał (ADCC), nie indukuje apoptozy ludzkich monocytów, ani nie powoduje
8
degranulacji neutrofilów [3,99,126]. Natomiast golimumab jest ludzkim przeciwciałem
monoklonalnym, które ma zdolność tworzenia stabilnych kompleksów z przezbłonową oraz z
rozpuszczalną postacią
Kolejnym
TNF-α i tym samym neutralizuje działanie tej cytokiny [71].
rekombinowanym, humanizowanym przeciwciałem monoklonalnym jest
tocilizumab, związek blokujący aktywność biologiczną IL-6 przez swoiste wiązanie się z jej
receptorami rozpuszczalnymi i
anakinra
to
związanymi z błonami komórkowymi [10,80]. Z kolei
lek hamujący biologiczną aktywność IL-1α i IL-1β przez kompetencyjną
inhibicję wiązania z receptorem dla IL-1 typu pierwszego (IL-1RI). Lek ten wykazuje się
skutecznością w terapii umiarkowanego do ostrego RZS, postaci schorzenia wykazujących
oporność na tradycyjne leczenie związkami należącymi do grupy LMPCh. Jednak anakinra
jest mniej skuteczna w terapii RZS w porównaniu do leków biologicznych będących
inhibitorami TNF [6,41,135]. Z kolei rytuksymab jest chimeryzowanym mysio-ludzkim
przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko cząsteczkom CD20 występujących
na powierzchni limfocytów B i jego stosowanie prowadzi do przejściowej deplecji
limfocytów B CD20+ we krwi obwodowej. Rytuksymab jest lekiem stosowanym od lat 90tych w leczeniu chłoniaków, a od 2006 roku jest również wykorzystywany w terapii RZS.
Obecnie rytuksymab jest często stosowany w skojarzeniu z metotreksatem w terapii aktywnej
postaci RZS [7,12,109]. Abatacept to z kolei białko fuzyjne, w którego skład wchodzi
domena pozakomórkowa ludzkiego antygenu CTLA-4 oraz zmodyfikowany fragment Fc
ludzkiej immunoglobuliny IgG1. Lek ten hamuje konieczne do przekazania sygnału i
pobudzenia limfocytów wzajemne oddziaływanie cząstek CD80/CD86 na powierzchni
komórek prezentujących antygen z receptorem CD28 na limfocytach T. Abatacept stosuje się
u pacjentów z aktywnym RZS nie odpowiadających na terapię lekami z grupy LMPCh lub
blokerami TNF-α [8,48].
Aktualnie w trakcie różnych faz badań klinicznych znajduje się wiele substancji mogących w
przyszłości stanowić biologiczną terapię dla chorych na reumatoidalne zapalenie stawów. Są
wśród nich: nowe inhibitory IL-1 (canakinumab), inhibitory cytokin z nadrodziny TNF
(atacicept), inhibitory innych cytokin (AIN457- monoklonalne przeciwciało przeciw IL-17) ,
inhibitory osteoklastogenezy (denosumab), inhibitory limfocytów B dla ich cząsteczek
powierzchniowych (ocrelizumab, ofatumumab), inhibitory małych cząsteczek jak np.
inhibitory ścieżki sygnałowej JAK/STAT, inhibitory kinazy Syk (fostamatinib) [119].
Niestety terapia biologiczna RZS jest bardzo droga, różnie tolerowana przez pacjentów, a
ponadto jej skuteczność jest bardzo zróżnicowana, dlatego wciąż poszukuje się
alternatyw.
9
innych
Taką możliwością jest stosowanie fitoterapii w przebiegu RZS. Aktualnie prowadzonych jest
wiele eksperymentalnych badań wskazujących na możliwość wykorzystania wyciągów
roślinnych w terapii zapaleń stawów o podłożu autoimmunologicznym [25,124]. Wang i wsp.
[141] zbadali wpływ ekstraktu z korzenia ziela Lindera aggragata podawanego doustnie w
dawkach 50, 100 i 200 mg/kg na przebieg kolagenowego zapalenia stawów u myszy szczepu
ICR. Autorzy badań stwierdzili, że wyizolowana frakcja alkaloidów podawana przez 20
kolejnych dni od indukcji zapalenia zmniejsza ostrość przebiegu choroby w sposób
dawkozależny oraz redukuje stężenie przeciwciał anty-CII klasy IgG w surowicy. Ponadto
chroni przed destrukcją stawy, czego dowiodła ocena histopatologiczna, a także hamuje in
vitro proliferację, stymulowanych uprzednio kolagenem (CII) i konkanawaliną-A limfocytów
z okolicznych węzłów chłonnych. Natomiast ekstrakt z pyłku sosnowego – podawany
doustnie w dawce 100 mg/kg przez 49 dni od indukcji CIA u myszy DBA/1J powoduje
umiarkowane zmniejszenie objawów klinicznych oraz zmniejsza w surowicy krwi stężenie
czynnika reumatoidalnego, przeciwciał anty-CII, cytokin TNF, IL-1 i IL-6 i LDL [86]. Z
kolei Cai i wsp. [18] ocenili wpływ mieszanki 5 chińskich ziół w preparacie o nazwie QFGJS
na powstawanie i przebieg kolagenowego zapalenia stawów u szczurów – samic szczepu
Wistar. Zbadano wpływ preparatu w dwóch układach: 1) podawanie profilaktyczne od dnia 0
- czyli indukcji CIA i 2) stosowanie terapeutyczne od pierwszego dnia objawów klinicznych –
dzień 13 doświadczenia. W obydwu układach podawano preparat do dnia 30 eksperymentu,
doustnie, w 3 różnych dawkach. Badacze stwierdzili supresję początku choroby (redukcja
incydentów CIA, redukcja indeksu zapalenia) w przypadku stosowania profilaktycznego i
zmniejszenie opuchnięcia łap oraz wartości OB (Odczyn Biernackiego z ang. ESR erytrocyte sedimentation rate) w przypadku stosowania terapeutycznego. Potwierdzono także
redukcję zmian w obrębie stawów w badaniu radiologicznym i histopatologicznym w
stosunku do kontroli otrzymującej tylko vehiculum, ponadto wykazano spadek stężenia w
surowicy TNF-α, Il-1β i IL-6.
CALTHA PALUSTRIS L.- KNIEĆ BŁOTNA
Caltha palustris L. to inaczej knieć błotna lub kaczeniec – gatunek byliny należący do
rodziny jaskrowatych (Raunculaceae). Jest szeroko rozprzestrzeniona na całej półkuli
północnej: występuje w całej niemal Europie (z wyjątkiem Hiszpanii i południowych Włoch),
Azji i Ameryce Północnej. W Polsce występuje pospolicie na niżu i w niższych położeniach
10
górskich. Rośnie na torfowiskach niskich, podmokłych łąkach i w zaroślach, na bagiennych
brzegach zbiorników, strumieni, rowów i w lasach łęgowych [27,50]. Jest rośliną leczniczą
stosowaną w leczeniu trądu, reumatyzmu, rzeżączki w medycynie ludowej mieszkańców
zachodnich Himalajów w Indiach [121], a także w Korei w leczeniu zapalenia stawów [73].
W kanadyjskiej medycynie ludowej Caltha palustris L. i inne rośliny z rodziny jaskrowatych
wykorzystywane są również do leczenia rozmaitych zmian skórnych (otarć, czyraków,
pęknięć) oraz w przypadkach bólu mięśni, przeziębień, chorób górnych dróg oddechowych,
bólu głowy [137]. W Azji Caltha palustris L. stosowana jest u zwierząt w postaci pasty z
korzenia na rany skórne [53]. Roślina ta zawiera protoanemoniny i świeżo zerwana jest w
większych ilościach trująca, natomiast po wysuszeniu traci te właściwości [137].
Doniesienia o pomyślnym stosowaniu Caltha palustris L. w medycynie ludowej oraz wyniki
badań fitochemicznych i biologicznych wskazywały, że roślina ta może być wartościowym
źródłem standaryzowanych preparatów lub zidentyfikowanych związków o potencjalnych
właściwościach leczniczych. W szczególności z materiału roślinnego wyizolowano wiele
związków o potencjalnej aktywności biologicznej, m.in. należących do klasy alkaloidów,
flawonoidów, triterpenów, karotenoidów i kumaryn [81].
Interesującym materiałem do podjęcia badań biologicznych i farmakologicznych wydają się
być frakcje polisacharydowe pozyskane z kaczeńca (Caltha palustris L.). Kuduk i wsp. [ 81]
uzyskali z suchego ziela Caltha palustris L. 4 polisacharydowe frakcje tj.: frakcję Afpochodząca z ekstrakcji za pomocą wody, frakcję Bf- pochodząca z ekstrakcji za pomocą 0.1
M NaOH, frakcję Cf pochodzącą z ekstrakcji za pomocą 5% CH3COOH oraz frakcję Dfpochodząca z ekstrakcji za pomocą 1 M NaOH . Dokładny opis procedury otrzymywania
ekstraktów i wyodrębnionych z nich frakcji, ich skład, właściwości fizyczne (m.in. wielkości
mas cząsteczkowych i widm spektroskopowych) i chemiczne oraz cytotoksyczność w
stosunku do prawidłowych komórek linii limfocytarnych człowieka zostały opublikowane w
przez Kuduk-Jaworską [81] i Gąsiorowskiego [45].
Na podstawie przeprowadzonych in vitro badań stwierdzono, że istnieją różnice w
efekcie immunotropowego działania frakcji B i C ekstraktów z ziela Caltha palustris L.
Frakcja C wywiera in vitro działanie immunostymulujące tj. nasila aktywność proliferacyjną
prawidłowych limfocytów człowieka po stymulacji fitohemaglutyniną (PHA) oraz zwiększa
aktywność bójczą granulocytów człowieka, zarówno spoczynkowych jak i stymulowanych
octanem mirystynianu forbolu (PMA). Nie wpływa natomiast na zdolność proliferacji i indeks
mitotyczny komórek białaczki człowieka (linii Raji). Z kolei frakcja B wykazuje działanie
supresyjne tj. hamuje aktywność proliferacyjną
11
prawidłowych limfocytów człowieka po
stymulacji PHA, upośledza zdolność wytwarzania reaktywnych form tlenu przez granulocyty
człowieka, zarówno spoczynkowe jak i aktywowane PMA oraz hamuje aktywność
proliferacyjną i zmniejsza indeks mitotyczny komórek linii Raji.
W niniejszej dysertacji doktorskiej dla celów badawczych wykorzystano dwie z czterech w/w
frakcji polisacharydowych: frakcję Cf i frakcję Bf .
12
CEL I ZAŁOŻE+IA PRACY
Celem pracy było określenie immunomodulującego działania dwóch ekstraktów
otrzymanych z ziela Caltha palustris L. na odpowiedź komórkową i humoralną myszy z
wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów, które stanowi eksperymentalny model
reumatoidalnego zapalenia stawów (RZS) występującego u ludzi. W badaniach stosowano
dwie frakcje polisacharydowe otrzymane z suchego ziela Caltha palustris L.: frakcja Cf
pochodząca z ekstrakcji za pomocą 5% CH3COOH – oznaczona jako ekstrakt C i frakcja Bf
pochodząca z ekstrakcji za pomocą 0.1 M NaOH – oznaczona jako ekstrakt B. Wpływ obu
badanych ekstraktów na obraz kliniczny eksperymentalnie wywołanego CIA oraz wskaźniki
immunologicznie został porównany do efektu działania metotreksatu – leku aktualnie
standardowo stosowanego w terapii RZS. Wykazanie, w kompleksowo przeprowadzonych
badaniach podstawowych, immunomodulujacego i korekcyjnego działania aktywnych frakcji
polisacharydowych ekstraktów z ziela Caltha palustris L. na przyjętym modelu badawczym
w porównaniu do metotreksatu może stanowić przesłankę do wykorzystywania w przyszłości
tychże polisacharydów roślinnych w celu restytucji układu odpornościowego w przebiegu
reumatoidalnego
zapalenia
stawów
lub
terapii
innych
schorzeń
o
podłożu
autoimmunologicznym.
Celem poznawczym badań było stwierdzenie u myszy z wywołanym kolagenowym
zapaleniem stawów (CIA) :
1) czy badane ekstrakty wywierają wpływ na obraz kliniczny kolagenowego zapalenia
stawów.
2) czy badane ekstrakty wpływają na subpopulacje limfocytów T grasicy oraz populacje
limfocytów T i B i subpopulacje limfocytów T śledziony i węzłów chłonnych krezkowych a
także odsetek śledzionowych limfocytów T regulatorowych (Treg) wykazujących ekspresję
białka transkrypcyjnego Foxp3 (C25+CD4+Foxp3+).
3) czy badane ekstrakty wywierają wpływ na produkcje cytokin przez limfocyty T, funkcje
wydzielnicze makrofagów otrzewnowych, aktywność fagocytarną i zdolność bójczą
granulocytów i monocytów krwi obwodowej.
4) czy badane ekstrakty wpływają na pierwotną odpowiedź humoralną myszy stymulowanych
antygenem grasiczozależnym jakim są erytrocyty owcy (SRBC).
13
MATERIAŁ I METODY
Badania wykonano in vivo na myszach szczepu wsobnego DBA/1Lac J
samcach i
samicach w wieku 8-10 tyg. i masie ciała ok.20 g. Powyższy szczep myszy jest
akceptowanym szczepem służącym do badań na mysim modelu kolagenowego zapalenia
stawów typu II (CIA II – collagen induced arthritis). Wybrany do badań model autoagresji
jakim jest CIA II u myszy odpowiada pod względem obrazu klinicznego i występujących
zaburzeń immunologicznych reumatoidalnemu zapaleniu stawów (RZS), schorzeniu
występującemu u ludzi [90].
Myszy pochodziły z licencjonowanej hodowli zwierząt laboratoryjnych z Instytutu
Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu. Badania przeprowadzono po
uzyskaniu zgody II Lokalnej Komisji Etycznej do spraw Doświadczeń na Zwierzętach we
Wrocławiu zgodnie z uchwałą nr 95/2009 z dnia 27.07.2009.
Indukcja kolagenowego zapalenia stawów typu II (CIA II - collagen induced arthritis)
została przeprowadzona przez podskórne podanie w okolicę nasady ogona kolagenu typu II
uzyskanego z chrząstki mostka kurcząt (Sigma) w dawce 100 µg/mysz zawieszonego w 50 µl
kompletnego adiuwantu Freunda. Przed podaniem kolagen został rozpuszczony przez okres
12 godzin w 0,05 M kwasie octowym w ilości 4 mg/ml a następnie połączony z kompletnym
adiuwantem Freunda w równych częściach objętościowych tworząc jednolitą emulsję.
Kompletny adiuwant Freunda został przygotowany przez połączenie niekompletnego
adiuwantu Freunda (Difco) z inaktywowanymi prątkami Mycobacterium Tuberculosis H37
Ra w ilości 4 mg/ml (Difco).
Po 3 tygodniach od pierwszego podania kolagenu zwierzęta otrzymały dawkę przypominającą
(booster) tj. 100 µg kolagenu/mysz, zawieszonego w 50 µl niekompletnego adiuwantu
Freunda.
Powyższe czynności zostały wykonane w warunkach znieczulenia ogólnego, tj. po uprzednim
dootrzewnowym podaniu myszom roztworu ketaminy (Ketamina10% - Biowet Puławy) i
ksylazyny (Xylapan20mg/ml – Vetoquinol Biowet) w dawce odpowiednio 100 mg/kg i 10
mg/kg.
Badane ekstrakty z ziela Caltha palustris L., czyli frakcja Cf pochodząca z ekstrakcji za
pomocą 5% CH3COOH – oznaczona jako ekstrakt C i frakcja Bf pochodząca z ekstrakcji za
pomocą 0.1 M NaOH – oznaczona jako ekstrakt B uzyskane zostały wg sposobu otrzymania
przedstawionego przez Kuduk Jaworską i wsp.[81]. Suche rozdrobnione ziele (1000g)
14
poddano ekstrakcji ciągłej metanolem (5dm3) w aparacie Soxhleta, przez 2 dni. Następnie
suchą pozostałość ziela ekstrahowano wodą (10 dm3) w temperaturze 70 °C przez 2 dni i
kolejną suchą pozostałość poddano ekstrakcji 0,1 M NaOH (5dm3) w temperaturze pokojowej
przez 1 dzień. W ten sposób otrzymano ekstrakt B i suchą pozostałość, którą poddano dalszej
ekstrakcji (5% CH3COOH - 5dm3 , temperatura pokojowa, 1 dzień) i otrzymano ekstrakt C.
Pozyskany ekstrakt B zagęszczano w wyparce próżniowej do objętości 2 dm3 , bez
podgrzewania. Następnie traktowano 30 % TCA (kwas trichlorooctowy) (0,7dm3) i
odwirowywano. Supernatant zalewano 3 objętościami acetonu. Surowy produkt rozpuszczano
w wodzie i wytrącano acetonem ( powtarzano 2 razy). Otrzymano jasnobrązową frakcję Bf 2,5 g. Natomiast ekstrakt C zagęszczano w wyparce próżniowej w temperaturze 40°C do
objętość 2dm3 a następnie odwirowywano i supernatant traktowano TCA a potem wytrącano
acetonem, ostatecznie otrzymując 0,6 g frakcji C.
Ekstrakt C i ekstrakt B podawane były codziennie, dootrzewnowo, w dawce 10 mg/kg przez
okres 21 dni, przy czym pierwsza dawka badanych związków została podana 24 godziny po
wstrzyknięciu dawki przypominającej kolagenu. Każdy z ekstraktów rozpuszczany był w
zbuforowanym roztworze soli fizjologicznej – PBS (Instytut Immunologii i terapii
Doświadczalnej PAN we Wrocławiu) i podawany w objętości 0,2 ml/mysz.
Metotreksat (Methotrexat – Ebewe, Ebewe Pharma GmbH Nfg. KG, Austria) podawany był 9
razy w przez okres 21 dni przy czym pierwsza dawka została podana 24 godziny po podaniu
dawki przypominającej kolagenu. Lek podawano dootrzewnowo w cyklach tygodniowych – 3
razy w tyg. co 48 godzin w dawce 6,6 mg/kg, w objętości 0,2 ml/mysz w celu osiągnięcia
całkowitej dawki tygodniowej – 20 mg/kg/mysz. Preparat rozpuszczany był każdorazowo ex
tempore w 0.9% sterylnym roztworze soli fizjologicznej (Inj. Natrii. Chloratii Izotonica,
Polpharma 10 ml).
Część myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów immunizowano antygenem
grasiczozależnym jakim są erytrocyty owcy (SRBC) w dawce 4 x 108 komórek/mysz (0,2 ml
10% zawiesiny erytrocytów owcy). SRBC zostało podane myszom dootrzewnowo po 24
godzinach od momentu podania ostatniej dawki odpowiednich ekstraktów oraz 72 godzinach
od podania ostatniej dawki metotreksatu. Użyta do immunizacji myszy zawiesina erytrocytów
owcy została uprzednio pobrana w sposób sterylny do płynu Alsevera i była przechowywana
w nim co najmniej 3 doby w temperaturze +4°C.
W obydwu układach doświadczalnych prowadzono grupy kontrolne ( kontrola negatywna i
pozytywna) równolegle do grup badanych. Każda grupa kontrolna i doświadczalna zawierała
15
8 myszy. Obie grupy kontrolne otrzymywały jedynie zbuforowany roztwór soli fizjologicznej
– PBS w objętości 0,2 ml.
Schemat I układu doświadczalnego:
1. kontrola negatywna - myszy zdrowe: PBS i.p. 21 x co 24 godz.
2. kontrola pozytywna - myszy z wywołanym zapaleniem stawów (CIA) + PBS i.p. 21 x co
24 godz.
3. myszy z wywołanym zapaleniem stawów (CIA) + Caltha palustris ekstrakt C w dawce 10
mg/kg i.p. 21x co 24 godz.
4. myszy z wywołanym zapaleniem stawów (CIA) + Caltha palustris ekstrakt B w dawce 10
mg/kg i.p. 21x co 24 godz.
5. myszy z wywołanym zapaleniem stawów (CIA) + metotreksat w dawce 6,6mg/kg i.p. 9 x
przez 21 dni , tj. 3 razy w tyg. co 48 godz. przez 3 tyg.
Schemat II układu doświadczalnego:
1. kontrola negatywna - myszy zdrowe PBS i.p. 21 x co 24 godz. + SRBC
2. kontrola pozytywna - myszy z wywołanym zapaleniem stawów (CIA) + PBS i.p.
21 x co 24 godz. + SRBC
3. myszy z wywołanym zapaleniem stawów (CIA) + Caltha palustris ekstrakt C w dawce 10
mg/kg i.p. 21 x co 24 godz. + SRBC
4. myszy z wywołanym zapaleniem stawów (CIA) + SRBC + Caltha palustris ekstrakt B w
dawce 10 mg/kg i.p. 21 x co 24 godz. + SRBC
5. myszy z wywołanym zapaleniem stawów (CIA) + metotreksat w dawce 6,6 mg/kg 9 x
przez 21 dni, tj. 3 razy w tyg. co 48 godz. przez 3 tyg. + SRBC
16
Ryc.1.Schemat doświadczeń.
Pkt.
czasowy 2
Ekstrakty Caltha palustris B i C
Indukcja
CIA
Booster
0 dzień
21
1 iniekcja
1 iniekcja
Pkt.
czasowy 1
21
42 43
47
SRBC
PFC
9
MTX
Punkt czasowy 1- tj. 24 godzina od podania ostatniej dawki ekstraktu C,
24 godzina od podania ostatniej dawki ekstraktu B,
72 godzina od podania ostatniej dawki metotreksatu,
⇒ 43 doba eksperymentu
Punkt czasowy 2- tj. 5 doba od podania ostatniej dawki ekstraktu C,
5 doba od podania ostatniej dawki ekstraktu B,
7 doba od podania ostatniej dawki metotrekstatu,
⇒ 47 doba eksperymentu
W I układzie doświadczalnym oznaczono następujące wskaźniki immunologiczne:
• liczbę leukocytów krwi i odsetek komórek układu białokrwinkowego
• współczynniki wagowe narządów limfatycznych (grasicy, śledziony i węzłów
chłonnych krezkowych): masa badanego narządu limfatycznego (g)/waga myszy(g) x
100
• całkowitą liczbę limfocytów w w/w narządach
• subpopulacje limfocytów T grasicy: odsetek i bezwzględna liczbę limfocytów
podwójnie negatywnych CD4-CD8-, podwójnie pozytywnych CD4+CD8+, pojedynczo
pozytywnych z ekspresją antygenów CD4+CD8- i CD4-CD8+ przy użyciu
17
specyficznych przeciwciał monoklonalnych znakowanych fikoerytryną (PE) lub
fluoresceina (FITC) stosując metodę cytometrii przepływowej
• odsetek i liczbę bezwzgledną limfocytów B (CD19+) i limfocytów T (CD3+) oraz
subpopulacje limfocytów T (CD4+ i CD8+) w śledzionie i węzłach chłonnych przy
zastosowaniu specyficznych przeciwciał monoklonalnych znakowanych PE lub FITC
metodą cytometrii przepływowej
• odsetek śledzionowych limfocytów T regulatorowych (Treg) wykazujących ekspresję
białka transkrypcyjnego Foxp3 (C25+CD4+Foxp3+) przy użyciu zestawu Mouse
Regulatory T Cell Staining Kit #1 (eBioscience) metodą cytometrii przepływowej.
• stężenia cytokin zewnątrzkomórkowych w surowicy krwi uwalnianych przez
limfocyty Th1/Th2/Th17 przy użyciu zestawu Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit
CBA (IL-2, L-4, IL-6, IFN-γ, TNF-α, IL-17a, IL-10) (Becton Dickinson) metodą
cytometrii przepływowej
• syntezę i uwalnianie interleukiny-1 beta (IL-1β) i tlenku azotu (NO) prze mysie
makrofagi otrzewnowe stymulowane in vitro lipopolisacharydem (LPS) z E.coli
(055:B5) odpowiednio metodą ELISA i metodą kolorymetryczną
• aktywność fagocytarną i zdolność bójczą granulocytów i monocytów krwi obwodowej
metodą cytometrii przepływowej przy użyciu zestawów Phagotest i Bursstest (Becton
Dickinson).
Oznaczenia w/w wskaźników immunologicznych wykonano w dwóch punktach czasowych,
tj. po 24 godzinach i 5 dniach licząc od podania ostatniej dawki badanych ekstraktów, czyli w
43 i w 47 dobie od indukcji kolagenowego zapalenia stawów (CIA).
W II układzie doświadczalnym oznaczono następujące wskaźniki:
• liczbę limfocytów śledziony produkujących przeciwciała hemolityczne anty-SRBC
(PFC – plaque forming cells) – metodą Jernego
• miano hemaglutynin całkowitych i opornych na działanie 2-merkoptoetanolu (2-ME),
co odpowiada klasie immunoglobulin IgM i IgG – metodą hemaglutynacji czynnej
przy użyciu mikropłytek.
Powyższa ocena pierwotnej odpowiedzi humoralnej została przeprowadzona w jednym
punkcie czasowym - po 4 dniach od stymulacji układu immunologicznego myszy antygenem
grasiczozależnym (SRBC), czyli w 47 dobie od indukcji kolagenowego zapalenia stawów
(CIA).
18
Kliniczna ocena przebiegu zapalenia
Zwierzęta były badane codziennie (tj. przed podaniem kolagenu oraz pomiędzy 2 a 47
dniem od momentu pierwszego podania kolagenu) pod kątem wystąpienia objawów
klinicznych zapalenia stawów. Ocena stanu zapalnego stawów każdej kończyny została
przeprowadzona wg 5-stopniowej skali (Tab.1) wykorzystywanej m.in. przez Wanga i
wsp.[141], która została zmodyfikowana i uszczegółowiona przez Międzybrodzkiego (dane
niepublikowane).
Uzyskane w trakcie badania punkty były sumowane. Maksymalna liczba punktów / mysz
mogła wynieść 16 pkt., natomiast
maksymalna liczba punktów / łapę wynosiła 4 pkt.
Przeprowadzono 7 niezależnych ocen klinicznych.
Tab. 1. Ocena kliniczna zapalenia stawów.
Liczba
punktów
0
1
Objawy zapalenia stawów
Brak objawów zapalenia stawów.
Izolowane zajęcie 3 palców, słaby obrzęk w okolicy kostki lub słaby w
okolicy kostki z zajęciem 1 palca.
Izolowane zajęcie 4-5 palców lub słaby obrzęk w okolicy kostki z zajęciem
2
palców lub silny obrzęk kostki (zajmujący śródstopie) izolowany lub silny
obrzęk kostki (zajmujący śródstopie) z zajęciem 1 palca.
3
4
Słaby obrzęk kostki z zajęciem 4-5 palców lub silny obrzęk kostki
(zajmujący śródstopie) z zajęciem 2-3 palców.
Silny obrzęk kostki(zajmujący śródstopie) z zajęciem 4-5 palców.
Deformacja stawów (ankylosis) z upośledzeniem funkcji.
Zdj.1-7. Ocena punktowa zmian klinicznych w przebiegu CIA.
Zdj.1 – 0 pkt.
19
Zdj.2 - 1 pkt.
Zdj.3 - 2pkt.
Zdj.4 - 3 pkt.
Zdj.5 - 3 pkt.
Zdj.6 - 4 pkt.
Zdj.7 - 4 pkt.
20
WYKO+A+IE TESTÓW
Oznaczanie subpopulacji limfocytów T grasicy oraz populacji limfocytów T i B w
śledzionie i węzłach chłonnych krezkowych.
Myszy uśmiercano przez dyslokację kręgów szyjnych i przerwanie rdzenia kręgowego po
uprzednim wprowadzeniu ich w stan znieczulenia ogólnego przy użyciu halotanu (Narkotan,
Zentiva). Każdą mysz, jak również pobrane z niej narządy limfatyczne (grasicę, śledzionę i
węzły chłonne krezkowe) ważono. Jednocześnie przez nakłucie mięśnia sercowego pobierano
krew, służącą do oznaczenia liczby leukocytów oraz sporządzenia rozmazu do oceny
komórek układu białokrwinkowego.
Pobrane narządy limfatyczne umieszczano w sterylnym PBS (Instytut Immunologii i Terapii
Doświadczalnej PAN), schłodzonym do temperatury +4°C a następnie przecierano je przez
nylonowe sitko i nawarstwiano w stosunku 1:3 na mieszaninę izolacyjną, którą stanowił 9%
roztwór Ficollu-400 (Pharmacia Fine Chemicals) z diatrizoatem sodowym i megluminy
(Urografin 76% - Bayer Schering Pharma) o gęstości 1,071. Tak przygotowane próby
wirowano w temperaturze +4°C
przez 15 minut przy 2250g a uzyskane w ten sposób
komórki zbierano z interfazy, zawieszano w schłodzonym do temperatury +4°C medium
stanowiącym PBS z 1% dodatkiem albuminy bydlęcej (BSA, Sigma) i dwukrotnie płukano
(wirowanie – 8 minut, 375g, temp. +4°C). Obecne w zawiesinach limfocytów śledziony
erytrocyty poddano lizie przez 5 minutową inkubację zawiesin komórkowych z 0,84%
roztworem chlorku amonu (NH4Cl) w temperaturze 37°C. Po drugim wirowaniu komórki
zawieszano w PBS z 1% BSA i doprowadzano do koncentracji 1x107 komórek/ml.
Żywotność komórek badanych zawiesin oceniano przy użyciu przygotowanego ex tempore
roztworu 0,2% błękitu trypanu (Sigma) z 4,25% chlorkiem sodu w stosunku 4:1, która to
wynosiła 95-100% . Następnie komórki inkubowano przez 30 minut w temperaturze +4ºC,
bez dostępu światła z odpowiednimi przeciwciałami monoklonalnymi znakowanymi
fikoerytryną lub fluoresceiną. W tym celu do 0,1 ml badanej zawiesiny komórek w 0,4 ml
medium (PBS z 1% BSA) dodawano 0,01 ml odpowiedniego przeciwciała. Wykorzystano
następujące przeciwciała monoklonalne: Rat Anti Mouse CD4:FITC/CD8:RPE Clone: YTS
191.1/KT 15 (AbD Serotec) w celu barwienia limfocytów grasicy, śledziony i węzłów
chłonnych krezkowych oraz Anti Mouse CD19:FITC/CD3:RPE – Dual Reagent Clone: 6D5/
KT 3 (AbD Serotec) w celu barwienia limfocytów śledziony i węzłów chłonnych
krezkowych. Przed podjęciem badań zostały ustalone optymalne rozcieńczenia przeciwciał w
jakich zostały użyte w przeprowadzonych testach, tj. : 1:10 dla przeciwciał antyCD4+FITC/CD8+RPE i 1:3 dla przeciwciał anty-CD19+FITC/CD3+RPE. Po zakończeniu
21
inkubacji komórki płukano 3-krotnie w zimnym PBS (wirowanie - 8 minut, 375g, temp.
+4°C) i zawieszano w 0,5 ml PBS. Oznaczenie odsetka poszczególnych subpopulacji
limfocytów T grasicy oraz populacji limfocytów T i B i subpopulacji limfocytów T śledziony
i węzłów chłonnych krezkowych przeprowadzono przy użyciu cytometru przepływowego
(FACS Calibur, Becton Dickinson) za pomocą programu CellQuest wersja 3.1.f.
W grasicy analizowano odsetek subpopulacji tymocytów podwójnie pozytywnych
(CD4+CD8+), podwójnie negatywnych (CD4-CD8-), pojedynczo pozytywnych (CD4+ lub
CD8+) oraz obliczano indeks limfocytarny CD4+/CD8+. Z kolei odsetek subpopulacji
limfocytów T z ekspresją antygenów CD4+, CD8+, CD3+ (Pan-T), limfocytów B z ekspresją
antygenu CD19+ oznaczano w śledzionie i węzłach chłonnych krezkowych. Obliczano
również indeks limfocytarny CD4+/CD8+. Bezwzględne liczby badanych subpopulacji
limfocytów grasicy, śledziony i węzłów chłonnych krezkowych obliczano na podstawie
całkowitej liczby limfocytów oznaczanej w badanych narządach limfatycznych.
Oznaczenie populacji limfocytów T regulatorowych (Treg) wykazujących ekspresję
białka transkrypcyjnego Foxp3 (C25+CD4+Foxp3+) w śledzionie.
W doświadczeniu wykorzystano zestaw Mouse Regulatory T Cell Staining Kit
#1(eBioscience),
którym
można
wyodrębnić
i
oznaczyć
odsetek
limfocytów
T
regulatorowych z użyciem specyficznych przeciwciał monoklonalnych: FITC anti-mouse
CD4 (RM4-5), APC anti mouse CD25 (PC61.5), PE anti-mouse/rat Foxp3 ((FJK-16s).
Myszy wprowadzone w stan znieczulenia ogólnego przy pomocy halotanu (Narkotan,
Zentiva) uśmiercano przez przerwanie rdzenia kręgowego i pobierano śledzionę. Pozyskany
narząd umieszczano w sterylnym PBS , schłodzonym do temperatury 4 ºC i przecierano przez
nylonowa siatkę. Uzyskaną zawiesinę komórek nawarstwiano w stosunku 1:3 na mieszaninę
izolacyjną, którą stanowił 9% roztwór Ficollu-400 (Pharmacia Fine Chemicals) z diatrizoatem
sodowym i megluminy (Urografin 76% - Bayer Schering Pharma) o gęstości 1,071. Tak
przygotowane próby wirowano w temperaturze +4°C przez 15 minut przy 2250g, a uzyskane
w ten sposób komórki zbierano z interfazy, zawieszano w schłodzonym do temperatury 4°C
medium stanowiącym PBS i płukano (wirowanie – 8minut, 375 g). W celu lizy erytrocytów
obecnych w zawiesinach limfocytów śledziony próby inkubowano przez 5 minut z 0,84%
roztworem chlorku amonu (NH4Cl) w temperaturze 37°C. Następnie komórki płukano
dwukrotnie (wirowanie – 8 minut, 375 g) w PBS o temperaturze 4 ºC i doprowadzano do
koncentracji 1x107 komórek/ml. Komórki płukano ponownie (wirowanie – 8minut, 375 g), a
następnie zawieszano w 0,01 ml buforu do barwienia (Flow Cytometry Staining Buffer),
22
koncentracja 1x106 komórek. Dla każdej próby sporządzono próbę kontrolną. Następnie
barwiono molekuły powierzchniowe przez dodanie przeciwciał : anty - CD4 w ilości 0,125
µg/próbę i anty - CD25 w ilości 0,06 µg/próbę. Próby inkubowano przez 30 minut w
temperaturze 4 ºC, bez dostępu światła, po czym dwukrotnie płukano (wirowanie – 5 minut
400g, 4 ºC) w 2 ml buforu do barwienia. W dalszej kolejności zlewano supernatant, rozbijano
peletkę
komórek
i
dodawano
1
ml
roztworu
fiksująco-permeabilizującego
(Fixation/Permeabilization Working Solution), w którym próby inkubowano prze 18 godzin,
bez dostępu światła w temperaturze 4 ºC. Po zakończeniu inkubacji próby dwukrotnie
płukano (wirowanie – 5 minut 400g, temp.pokojowa) w buforze permeabilizującym – 2 ml
(Permeabilization Buffer). Następnie dodano do prób Fc block (CD16/32) - 0,5 µg/próbę w
objętości 0,1 ml buforu permeabilizujacego i inkubowano przez 15 minut w temperaturze 4
ºC. Po tym czasie do prób testowych dodano 0,5 µg/próbę przeciwciała anty-Foxp3 (FJK16s), a do prób kontrolnych PE Rat IgG2a isotype control w ilości 0,5 µg/próbę. Tak
przygotowane próby inkubowano 30 minut, bez dostępu światła w temperaturze 4 ºC.W
dalszej kolejności próby dwukrotnie płukano (wirowanie – 5 minut 400g, temp.pokojowa) w
buforze permeabilizujacym by na końcu zawiesić w odpowiedniej objętości cytometrowego
buforu barwiącego. Próby rejestrowano i analizowano cytometrem przepływowym (FACS
Calibur, Becton Dickinson) z zastosowaniem programu CellQuest wersja 3.1.f.
Oznaczenie stężeń cytokin (IL-2, IL-4, IL-6, IF+-γ, T+F-α, IL-17A, IL-10) uwalnianych
przez mysie limfocyty Th1/Th2/Th17.
Do oznaczenia stężeń
cytokin w krwi obwodowej wykorzystano zestaw Mouse
Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit (Becton Dickinson), zgodnie ze wskazaniami producenta. Myszy
wprowadzano w stan znieczulenia ogólnego przy użyciu halotanu (Narkotan, Zentiva). Krew
pobierano przez ekstyrpację gałki ocznej i umieszczano na 20 minut w cieplarce, a następnie
na 30 minut w lodówce. Po tym czasie próby wirowano 20 minut przy 3500 g w celu
pozyskania surowicy. W każdej probówce służącej do oznaczeń cytokin umieszczano 0,07
ml, przygotowanej ex tempore, zawiesiny 7 odczynników – Mouse Cytokine Capture Beads ,
a następnie dodawano do nich próby testowe i stanowiące standardy (przygotowane w formie
serii rozcieńczeń odczynnika zawierającego rekombinowane mysie cytokiny o oznaczonej
koncentracji - Mouse Th1/Th2/Th17 Cytokine Standards) w objętości 0,05 ml/próbę. Do
wszystkich prób dodawano po 0,05 ml odczynnika Mouse Th1/Th2/Th17 PE Detection
Reagent, zawierającego znakowane fikoerytryną mysie przeciwciała anty-IL-2, anty-IL-4,
anty-IL-6, anty-IFN-γ, anty-TNF, anty-IL-17A, anty-IL-10, po czym próby inkubowano przez
23
2 godziny w temperaturze pokojowej, bez dostępu światła. Następnie płukano w 1 ml
roztworu płuczącego - Wash Buffer (wirowanie - 5 minut, 200g) i zawieszano w 0,3 ml
roztworu płuczącego i rejestrowano w cytometrze przepływowym (FACS Calibur, Becton
Dickinson), z zastosowaniem programu CellQuest wersja 3.1.f. Analiza prób została
wykonana przy użyciu programu BD Cytometric Bead Array Software.
Oznaczanie interleukiny-1 (IL-1) oraz tlenku azotu (+O) wytwarzanych przez mysie
makrofagi otrzewnowe po stymulacji in vitro lipopolisacharydem (LPS) z Escherichia
coli (O55:B5) w stężeniu 2,5 µg/ml hodowli.
Myszy wprowadzone w stan znieczulenia ogólnego przy użyciu halotanu (Narkotan, Zentiva)
uśmiercano przez przerwanie rdzenia kręgowego. Rezydentne makrofagi otrzewnowe
pobierano płucząc jamę otrzewnową jałowym PBS (Instytut Immunologii i Terapii
Doświadczalnej PAN) o temperaturze 4ºC z dodatkiem antybiotyków: penicyliny - 10 U/ml i
streptomycyny - 10 µg/ml (Penicillin - Streptomycin solution stabilized, Sigma). Uzyskaną
zawiesinę komórek wirowano 10 minut przy
375g w temperaturze 4ºC, a następnie
makrofagi zawieszano w medium hodowlanym o składzie : RPMI 1640 (Instytut
Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN) z 10% dodatkiem cielęcej surowicy płodowej
(FCS - Sigma), 10 mM HEPES (Sigma), 2 mM L-glutaminy (Sigma), 10 U/ml penicyliny
oraz 10 µg/ml streptomycyny (Penicillin - Streptomycin solution stabilized, Sigma).
Żywotność makrofagów została oznaczona przez barwienie 0,2% błękitem trypanu z 4,25%
NaCl w stosunku 4:1 i wynosiła 90-95%. Oceniano również czystość otrzymanych z jamy
otrzewnowej zawiesin komórek na rozmazach barwionych metodą Pappenheima (MGG).
Wykazano, że makrofagi stanowiły 65 – 75% populacji komórek. Makrofagi dwukrotnie
poddano płukaniu i zawieszano w w/w medium doprowadzając do koncentracji 1,5 x 106
komórek/ml, a następnie rozdzielano w objętości 100 µl/dołek do płytek z 96 dołkami o
płaskim dnie (Nunc). Próby na płytkach inkubowano przez 3 godziny w temperaturze 37 ºC,
przy stałym 5% przepływie CO2. Po tym czasie usuwano medium z niezaadherowanymi
komórkami, a dołki w płytkach uzupełniano świeżym medium o tym samym składzie. Próby
inkubowano przez 18 godzin (temp. 37 ºC, 5% przepływ CO2). Następnie medium usuwano i
uzupełniano nowym o składzie: RPMI 1640, LPS z E. coli (O55:B5, Sigma) w stężeniu 2,5
µg/ml hodowli, 10 mM HEPES, 2mM L-glutaminy oraz antybiotyki - 10 U/ml penicyliny i 10
µg/ml streptomycyny. Inkubację, w wyżej opisanych warunkach, hodowli makrofagów
symulowanych in vitro LPS z E.coli prowadzono przez następne 24 godziny według metody
24
opisanej przez Chełmońską-Soytę [21]. Wszystkie czynności przeprowadzano w komorze
laminarnej.
Stężenie IL-1 oznaczano metodą ELISA przy użyciu zestawu Quantikine Mouse IL-1β (R&D
Systems). Zgodnie z zaleceniami producenta badane próby, kontrolę i standardy- każda w
objętości 0,05 ml inkubowano z 0,05 ml zbuforowanego roztworu białka (Assay Diluent)
przez 2 godziny, w temperaturze pokojowej. Następnie próby płukano 5-krotnie przy użyciu
roztworu płuczącego (Wash Buffer), dodawano 0,1 ml odczynnika zawierającego
przeciwciało poliklonalne przeciwko mysiej IL-1β (Mouse IL-1β Conjugate) i inkubowano
przez kolejne 2 godziny. Próby ponownie 5-krotnie płukano, dodawano 0,1 ml roztworu
stanowiącego nadtlenek wodoru i chromogen (Substrate Solution), inkubowano 30 minut w
temperaturze pokojowej bez dostępu światła, a następnie dodawano 100 µl roztworu HCl
(Stop Solution). Wykonano dwa powtórzenia każdej próby. Wyniki odczytywano przy użyciu
czytnika Elx800 przy długości fali 450nm z wykorzystaniem programu KC Junior.
Stężenie tlenku azotu oznaczano poprzez pomiar poziomu azotynów wg. metody Stuehra i
Marletta [130]. W tym celu 0,05 ml supernatantu każdej badanej próby inkubowano przez 5
minut, w temperaturze pokojowej z 0,05 ml odczynnika Griessa (1% sulfanilamidu, 0,1%
naftylenu, 2% kwasu fosforowego). Następnie mierzono absorbancję prób przy użyciu
czytnika mikropłytek Elx800 (długość fali 550 nm). Każdą próbę wykonywano w dwóch
powtórzeniach. Stężenie azotynów obliczano w nM na podstawie krzywej standardowej
utworzonej w oparciu o rosnące rozcieńczenia seryjne azotynu sodu w zakresie 0,3125 - 20
nM.
Oznaczanie aktywności fagocytarnej i zdolności bójczej granulocytów i monocytów w
heparynizowanej pełnej krwi mysiej.
W doświadczeniach wykorzystano zestawy Phagotest (ORPEGEN, Pharma) – przeznaczony
do ilościowego badania aktywności fagocytarnej oraz Bursttest (Phagoburst) (ORPEGEN,
Pharma), który jest przeznaczony do badania ilościowego aktywności wybuchu oddechowego
monocytów i granulocytów w heparynizowanej pełnej krwi mysiej. Krew pobierano do
heparynizowanych probówek po ekstyrpacji gałki ocznej myszy wprowadzonych w stan
znieczulenia ogólnego z użyciem halotanu (Narkotan, Zentiva). Zarówno aktywność
fagocytarną jak i zdolność bójczą granulocytów i monocytów krwi obwodowej oznaczano
wg. zaleceń producenta w/w testów.
W celu oznaczenia aktywności fagocytarnej granulocytów i monocytów krwi obwodowej do
0,1 ml próby badanej, schłodzonej do temperatury 0 ºC (inkubacja w łaźni lodowej przez 10
25
minut) dodawano 0,02 ml zawiesiny znakowanych FITC, uprzednio również schłodzonych,
wstrząśniętych i poddanych opsonizacji bakterii E. coli (E.coli FITC Opsonized). Każda
próba badana posiadała próbę kontrolną. Wszystkie próby mieszano na wytrząsarce, po czym
próby testowe inkubowano przez 10 minut w temperaturze 37ºC w łaźni wodnej, natomiast
próby kontrolne pozostawały w tym czasie na lodzie. Następnie w celu zahamowania
fagocytozy, próby testowe umieszczano równocześnie w łaźni lodowej i do wszystkich prób
(również do ujemnych prób kontrolnych) dodawano 0,1 ml roztworu oziębiającego
(Quenching Solution). Następnie próby mieszano na wytrząsarce i płukano (wirowanie - 5
minut, 250g, temp. 4 ºC) dwukrotnie, każdorazowo w 3 ml roztworu do płukania (Washing
Solution). Kolejno próby inkubowano przez 20 minut z roztworem do lizy erytrocytów
(Lysing Solution) w temperaturze pokojowej, odwirowywano (5 minut, 250g, temp. 4ºC),
ponownie płukano. W dalszej kolejności do każdej próby dodawano w ilości 0,1 ml roztwór
barwiący DNA (DNA Staining Solution), próby mieszano i inkubowano przez kolejne 10
minut w temp. 0ºC (łaźnia lodowa), bez dostępu światła. W przeciągu 60 minut gotowe do
pomiaru
próby rejestrowano w cytometrze przepływowym (FACS Calibur, Becton
Dickinson) przy użyciu programu CellQuest wersja 3.1.f. oznaczając wartość procentową
granulocytów i monocytów wykazujących fagocytozę oraz intensywność tej reakcji – ilość
bakterii sfagocytowanych przez komórki (pomiar średniej logarytmicznej wartości
fluorescencji fagocytujących komórek).
W celu oznaczenia aktywności wybuchu tlenowego do każdej schłodzonej (inkubacja w łaźni
lodowej przez 10 minut) próby testowej dodawano 0,02 ml zawiesiny nieznakowanych,
poddanych opsonizacji bakterii E. coli (E. coli Opsonized). Do każdej próby testowej
sporządzano 3 kontrole. Do próby stanowiącej negatywną próbę kontrolną dodawano roztwór
do płukania (Washing Solution), do próby określanej jako słaba próba kontrolna dodawano
rozcieńczony roztwór zawierający chemotaktyczny peptyd fMLP (słaby stymulator wybuchu
tlenowego), natomiast do tzw. silnej próby kontrolnej dodawano przygotowany roztwór PMA
(octan mirystynianu forbolu), który jest silnym stymulatorem wybuchu tlenowego komórek
fagocytujących. Do każdej próby dodawano wymienione odczynniki w ilości 0,02 ml.
Następnie próby inkubowano w łaźni wodnej, w temp. 37ºC przez 10 minut. Po tym czasie
dodawano przygotowany roztwór substratu (Substrate Disk) w ilości 0,02 ml, mieszano i
powtórnie inkubowano w tych samych warunkach. W dalszej kolejności próby wyjmowano z
łaźni, dodawano roztwór do lizy erytrocytów, inkubowano przez 20 minut w temperaturze
pokojowej. Po zakończeniu inkubacji próby wirowano (5 minut, 250 g, temp.4ºC) i płukano z
użyciem roztworu do płukania (Washing Solution). Po czym do każdej próby dodawano
26
roztwór do barwienia DNA w ilości 0,2 ml, mieszano i inkubowano 10 minut w temp. 0ºC,
bez dostępu światła. Gotowe do pomiaru próby analizowano w ciągu 30 minut od
zakończenia inkubacji przy użyciu cytometru przepływowego (FACS Calibur, Becton
Dickinson) z zastosowaniem programu CellQuest wersja 3.1.f. oznaczając odsetek
granulocytów i monocytów, które wytworzyły reaktywne rodniki tlenu a także intensywność
tej reakcji czyli wskaźnik aktywności metabolicznej badanych komórek (pomiar średniej
logarytmicznej wartości fluorescencji komórek wykazujących „wybuch tlenowy”).
Oznaczanie liczby limfocytów śledziony produkujących przeciwciała anty - SRBC
(PFC).
Myszy uśmiercano przerywając rdzeń kręgowy po uprzednim wprowadzeniu w stan
znieczulenia ogólnego poprzez zastosowanie halotanu (Narkotan, Zentiva). Pobierano
śledzionę, którą umieszczano w sterylnym płynie Hanksa (Instytut Immunologii i Terapii
Doświadczalnej PAN) i przecierano przez nylonową siatkę. Uzyskaną zawiesinę komórek
nawarstwiano na mieszaninę izolacyjną składającą się z 9% Ficollu-400 (Pharmacia Fine
Chemicals) z diatrizoatem sodowym i megluminy (Uropolinum 75%) w stosunku 1:3 o
gęstości 1,071. Próby wirowano przez 15minut, w temperaturze +4ºC przy 2250g. Limfocyty
zebrane z interfazy płukano w płynie Hanksa (wirowanie - 8 minut, 375g), inkubowano przez
5 minut z 0,84% chlorkiem amonu w temperaturze 37ºC w celu lizy erytrocytów, wirowano,
a następnie ponownie płukano. Gęstość komórek oznaczano zawieszając je w płynie Hanksa i
doprowadzając do koncentracji 1 x 106 komórek/ml. Oceniano żywotność badanych zawiesin
komórek przy użyciu roztworu 0,2% błękitu trypanu z 4,25% chlorkiem sodu w stosunku 4:1,
która wynosiła 95%-100%. W celu oznaczenia liczby limfocytów śledziony produkujących
przeciwciała anty-SRBC (PFC) wykorzystano metodę miejscowej hemolizy w żelu
agarowym według Jernego i wsp. [67] w modyfikacji Mishella i Duttona [95]. Wykonanie
próby: 0,1 ml 10% SRBC i 0,1 ml splenocytów o ustalonej gęstości dodawano do 0,5 ml 0,5%
roztworu agarozy o temperaturze 45 ºC. Wykonano dwa powtórzenia każdej próby, które
wylewano po obu stronach, pokrytego warstwą agaru, szkiełka podstawowego. Próby
inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37ºC, w cieplarce ze stałym 5% przepływem
CO2. Następnie pokrywano próby dopełniaczem świnki morskiej (Biomed) rozcieńczonym w
stosunku 1:10 płynem Hanksa i powtórnie inkubowano próby przez 2 godziny w tych
samych warunkach. Po tym czasie liczono miejsca hemolizy (łysinki), których liczba
odpowiada liczbie limfocytów śledziony wykazujących zdolność produkcji przeciwciał
hemolitycznych anty-SRBC.
Oznaczenie zostało wykonane na 4 dzień od immunizacji
myszy SRBC.
27
Oznaczanie miana przeciwciał anty - SRBC w surowicy.
Krew pobierano poprzez ekstyrpację gałki ocznej myszy uprzednio wprowadzonej w stan
znieczulenia ogólnego przy użyciu halotanu (Narkotan, Zentiva). Pobraną krew wirowano 20
minut przy 3500 g. Uzyskaną surowicę poddano inaktywacji przez 30 minut w temperaturze
56ºC. Miano przeciwciał całkowitych (IgM + IgG) i opornych na 2-merkaptoetanol (2-ME,
IgG) zostało oznaczone przy użyciu testu hemaglutynacji czynnej z zastosowaniem
mikropłytek [63]. W celu oznaczenia miana przeciwciał całkowitych surowice rozcieńczano z
PBS w szeregu geometrycznym od 1:2 do 1:4096. Natomiast w celu oznaczenia miana
przeciwciał klasy IgG, surowice inkubowano w stosunku 1:1 z rozcieńczonym 2-ME (30
minut, temp. 37 ºC), wirowano 10-15 minut, 375g. Następnie każdą próbę rozcieńczano w
PBS w szeregu geometrycznym od 1:4 do 1:4096. W obu przypadkach po 30 minutach do
prób dodawano 1% SRBC w stosunku 1:1 i inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37
ºC, a następnie płytki z badanymi próbami umieszczano na 24 godziny w temperaturze 4 ºC.
Po tym czasie dokonywano odczytu, uznając za wynik dodatni największe rozcieńczenie
surowicy, w którym obserwowano aglutynację erytrocytów. Wynik wyrażano wielkością
log2.
A+ALIZA STATYSTYCZ+A
Analizę statystyczną wyników wykonano przy użyciu programu Statistica 9.0 firmy StatSoft
oraz programu Excel z pakietu Microsoft Office.
Zebrane w czasie pracy badawczej dane mają charakter zarówno jakościowy (stopień
nasilenia stanu zapalnego) jak i ilościowy (pozostałe dane).
Do oceny danych jakościowych tj. danych uzyskanych w trakcie badania klinicznego
zastosowano (nieparametryczny) test U Manna-Whitney’a. Punktem wyjścia dla tego testu
jest nadanie wynikom rang, czyli przyporządkowanie wartości liczbowych odpowiednim
stopniom nasilenia stanu zapalnego.
Dane uzyskane w poszczególnych
grupach
doświadczalnych (grupa otrzymująca ekstrakt C, grupa otrzymująca ekstrakt B, grupa
otrzymująca metotreksat) porównano z wynikami otrzymanymi podczas obserwacji grupy
kontrolnej pozytywnej (zwierzęta chore).
Dane ilościowe analizowano przy wykorzystaniu (parametrycznego) testu t-Studenta (z
dwiema próbkami o nierównej wariancji). Porównując wyniki pomiędzy grupami
zastosowano rozkład jednośladowy i analizowano je w trzech niezależnych układach
doświadczalnych tj.: grupy doświadczalne (ekstrakt B, C, metotreksat) porównano do grupy
kontrolnej pozytywnej; grupy doświadczalne wraz z grupą kontrolną pozytywną odniesiono
28
do grupy kontrolnej negatywnej oraz grupy otrzymujące ekstrakty do grupy otrzymującej
metotreksat. Ostatnie porównanie miało na celu porównanie ewentualnej skuteczności
podawanych ekstraktów w przeciwdziałaniu rozwoju zapalenia stawów względem grupy
poddanej działaniu metotreksatu.
Różnice między poszczególnymi wynikami oceniano na poziomie istotności p<0,05. W
tabelach przedstawiono średnie arytmetyczne (X) i odchylenia standardowe (SD).
29
WY+IKI BADAŃ
1. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na obraz kliniczny
zapalenia stawów u myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów (wyniki
badań przedstawiono w tabeli nr 1D oraz na rycinie 2).
Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na kliniczny przebieg
eksperymentalnie wywołanego kolagenowego zapalenia stawów u myszy przedstawiono w
postaci średnich arytmetycznych uzyskanych w wyniku przeprowadzenia 7 niezależnych
doświadczeń klinicznych. Uzyskane wyniki badań zostały poddane analizie statystycznej przy
użyciu testu U Manna-Whitney’a w oparciu o sumę rang, nadanych jednostkowym wynikom,
w poszczególnych dniach.
Na podstawie tak przeprowadzonej analizy stwierdzono, że u myszy eksperymentalnie
wywołane kolagenowe zapalenie stawów (CIA) manifestuje się klinicznie : zaczerwienieniem
skóry, obrzękiem, deformacjami kończyn oraz postępującą w czasie wraz ze stopniem
nasilenia zmian klinicznych niesprawnością ruchową zwierząt. Zmiany kliniczne cechują się
dużą dynamiką i nagłością występowania. Pierwsze objawy pojawiają się najczęściej 4-5 dni
po podaniu dawki przypominającej kolagenu, natomiast szczyt stopnia zaawansowania
ciężkości zmian klinicznych przypada na 30-34 dzień.
Podawanie myszom od 22 dnia eksperymentu (po 24 godzinach od iniekcji dawki
przypominającej kolagenu) codziennie przez okres 3 tygodni ekstraktu C z ziela Caltha
palustris L. w dawce 10 mg/kg/dobę nie zmienia w sposób istotny statystycznie obrazu
klinicznego eksperymentalnie wywołanego kolagenowego zapalenia stawów (CIA).
Natomiast podawanie według analogicznego schematu ekstraktu B uzyskanego z ziela Caltha
Caltha palustris L. istotnie zmienia obraz kliniczny przebiegu CIA pomiędzy 31 a 47 dniem
eksperymentu zmniejszając stopień nasilenia procesu zapalnego. Zahamowanie rozwoju
kolagenowego zapalenia stawów u myszy przez podawanie ekstraktu B manifestuje się
redukcją obserwowanego zaczerwienienia skóry, zmniejszeniem obrzęku, deformacji i zmian
zwyrodnieniowych oraz istotnym zmniejszeniem występującej niesprawności ruchowej
zwierząt doświadczalnych. Jednak działanie ekstraktu B z ziela Caltha palustris L. hamujące
rozwój kolagenowego zapalenia stawów u myszy jest zdecydowanie słabsze niż metotreksatu.
Podawanie metotreksatu (MTX) po eksperymentalnym wywołaniu u myszy kolagenowego
zapalenia stawów w istotny sposób hamuje rozwój procesu zapalnego pomiędzy 28 a 47
30
dniem eksperymentu co manifestuje się niedopuszczeniem do wystąpienia u zwierząt
laboratoryjnych ciężkich objawów procesu zapalnego takich jak: rozległy obrzęk, stany
zwyrodnieniowe i deformacje stawów. U myszy poddanych działaniu metotreksatu jedynie w
nieznacznym stopniu upośledzona jest sprawność ruchowa. Efekt działania MTX hamujący
rozwój procesu zapalnego stawów jest silniejszy niż ekstraktu B uzyskanego z ziela Caltha
palustris L.
Ryc. 2. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na obraz kliniczny
eksperymentalnie wywołanego u myszy CIA.
Ocena kliniczna przebiegu CIA u myszy
4,50
4,00
3,50
pkt
3,00
2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
1 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47
dzień
kontrola pozytywna
ekstrakt C
ekstrakt B
MTX
2. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na obraz krwi
obwodowej myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów (wyniki badań
przedstawiono w tabeli nr 2D oraz tabelach nr: 2, 3).
U myszy wywołanie kolagenowego zapalenia stawów powoduje zarówno w 43 jak i 47 dniu
eksperymentu istotny wzrost liczby leukocytów krwi obwodowej. W 43 dniu eksperymentu
zwiększeniu liczby krwinek białych towarzyszy wzrost odsetka limfocytów przy
równoczesnym spadku odsetka neutrofilów pałeczkowatych i segmentowych oraz
monocytów. Z kolei w 47 dniu eksperymentu obserwowany jest spadek odsetka neutrofilów
pałeczkowatych i wzrost odsetka monocytów.
31
Tab.2. Wpływ kolagenowego zapalenia stawów (CIA) na obraz krwi obwodowej myszy.
kontrola
43 dzień
N
doświadczenia kontrola
P
kontrola
47 dzień
N
doświadczenia kontrola
P
LEUKOGRAM
+s
B
%
%
15,78
0,22
±4,49
±0,44
L
tyś/µl
4133,33
±1034,41
Limf
%
77,22
±5,12
+p
%
4,89
±1,83
E
%
0,22
±0,44
M
%
1,44
±0,88
↑
↑
↓
↓
0
0
↓
11000,00
±2823,71
75,60
±3,37
5,60
±1,43
17,70
±2,75
0,10
±0,32
0,40
±0,70
0,90
±0,74
↑
0
↓
0
0
0
↑
kontrola N- kontrola negatywna (myszy zdrowe)
kontrola P – kontrola pozytywna (myszy z wywołanym CIA)
↑ wzrost lub ↓ spadek statystycznie istotny w stosunku do kontroli negatywnej
0 brak potwierdzonych statystycznie zmian w stosunku do kontroli negatywnej
L-leukocyty, Limf-limfocyty, Np-neutrofile pałeczkowate, Ns- neutrofile segmentowane,
B- bazofile, E- eozynofile, M- monocyty
W 43 dniu eksperymentu u myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów podanie
obu badanych ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu (MTX) powoduje
obniżenie liczby krwinek białych w krwi obwodowej czemu towarzyszy spadek odsetka
limfocytów z równoczesnym wzrostem odsetka neutrofilów pałeczkowatych, a przypadku
podawania MTX obserwowany jest również wzrost odsetka neutrofilów segmentowanych.
Z kolei w 47 dniu eksperymentu ekstrakt C z ziela Caltha palustris L. nasila leukocytozę
indukowaną CIA czemu towarzyszy utrzymujący się spadek odsetka limfocytów i
równoczesny wzrost odsetka neutrofilów pałeczkowatych i segmentowanych. Takiego
działania nie obserwowano po podawaniu ekstraktu B z ziela Caltha palustris L. Natomiast
podawanie myszom MTX w przebiegu eksperymentalnie wywołanego CIA powoduje w 47
dniu eksperymentu zahamowanie leukocytozy czemu towarzyszy wzrost odsetka limfocytów
i równoczesny spadek odsetka neutrofilów segmentowanych.
32
Tab.3. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na obraz krwi
obwodowej myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów.
kontrola
P
ekstrakt
C
43 dzień
doświadczenia ekstrakt
B
MTX
kontrola
P
ekstrakt
C
47 dzień
doświadczenia ekstrakt
B
MTX
LEUKOGRAM
+s
B
%
%
11,70
0,00
±4,11
±0,00
L
tyś/µl
7220,00
±1994,33
Limf
%
85,10
±4,56
+p
%
2,40
±1,84
E
%
0,00
±0,00
M
%
0,20
±0,42
0
↓
↑
0
0
0
0
↓
0
↑
0
0
↑
0
↓
↑
↑
0
0
0
15760,00
±3710,41
75,30
±4,16
3,20
±1,32
18,80
±3,05
0,40
±0,70
0,60
±0,84
1,7
±0,95
↑
↓
↑
↑
0
0
0
0
0
0
0
0
0
↓
↑
0
↓
0
0
↓
↓
↓
kontrola P – kontrola pozytywna (myszy z wywołanym CIA)
↑ wzrost lub ↓ spadek statystycznie istotny w stosunku do kontroli pozytywnej
0 brak potwierdzonych statystycznie zmian w stosunku do kontroli pozytywnej
L-leukocyty, Limf.-limfocyty, Np-neutrofile pałeczkowate, Ns- neutrofile segmentowane,
B- bazofile, E- eozynofile, M- monocyty
3. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na liczbę limfocytów
grasicy, śledziony i węzłów chłonnych krezkowych oraz współczynniki wagowe
narządów limfatycznych myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów (wyniki
badań przedstawiono w tabeli nr 3D).
U myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów (CIA) w 43 dobie eksperymentu
stwierdzono istotny wzrost całkowitej liczby limfocytów w grasicy i śledzionie
w
porównaniu do kontroli negatywnej (myszy zdrowe). Równocześnie stwierdzono wzrost
współczynnika wagowego grasicy. Natomiast po kolejnych 5 dobach doświadczenia (47
dzień po wywołaniu CIA) nie zaobserwowano istotnych zmian liczby limfocytów badanych
narządów limfatycznych tj. grasicy, śledzionie i węzłach chłonnych krezkowych. Nie
stwierdzono również zmian współczynników wagowych tych narządów limfatycznych.
33
U myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów podanie ekstraktu C z ziela Caltha
palustris L. istotnie obniża liczbę limfocytów w śledzionie i węzłach chłonnych krezkowych
po 24 godzinach od podania ostatniej dawki, czyli w 43 dniu eksperymentu. Z kolei po
kolejnych 5 dobach od podania ostatniej dawki badanego ekstraktu, czyli w 47 dniu
eksperymentu nie stwierdzono zmian w liczbie limfocytów śledzionowych, natomiast
obserwowano wzrost liczby limfocytów w węzłach chłonnych krezkowych. Nie
obserwowano wpływu ekstraktu B na liczbę limfocytów w badanych narządach
limfatycznych. Natomiast stosowanie MTX w przebiegu kolagenowego zapalenia stawów u
myszy powoduje w 47 dniu eksperymentu wzrost liczby limfocytów w grasicy, śledzionie i
węzłach chłonnych krezkowych.
Stosowanie obu badanych ekstraktów z ziela Caltha palustris L., jak również MTX u myszy
w przebiegu CIA powoduje w 43 dobie eksperymentu istotny spadek współczynnika
wagowego grasicy, przy czym spadek ten utrzymuje się do 47 dnia eksperymentu jedynie u
myszy poddanych działaniu MTX. Z kolei u myszy z wywołanym CIA i poddanym działaniu
ekstraktu B oraz MTX obserwowano w 43 dniu eksperymentu wzrost współczynnika
wagowego śledziony. Wzrost ten jest istotnie wyższy i dłużej utrzymuje się u myszy
poddanych działaniu MTX. Badane ekstrakty z ziela Caltha palustris L., jak również MTX
nie zmieniają współczynnika wagowego węzłów chłonnych krezkowych.
4. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na subpopulacje
tymocytów myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów (wyniki badań
przedstawiono w tabelach nr 4D i 7D oraz w tabelach nr: 4,5,6).
U myszy z eksperymentalnie wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów w 43 dniu
doświadczenia obserwuje się w grasicy spadek odsetka limfocytów niedojrzałych podwójnie
negatywnych CD4-CD8-, wzrost odsetka i liczby bezwzględnej limfocytów podwójnie
pozytywnych CD4+CD8+, czemu towarzyszy spadek odsetka limfocytów dojrzałych
pojedynczo-pozytywnych o funkcji indukująco-wspomagającej CD4+. Wywołanie u myszy
CIA powoduje w 43 dniu doświadczenia przejściowy wzrost bezwzględnej liczby limfocytów
w grasicy, pomimo obserwowanego spadku odsetka limfocytów CD4+ bezwzględna liczba
powyższej populacji wzrasta. Z kolei w 47 dniu doświadczenia u myszy z wywołanym
kolagenowym zapaleniem stawów pomimo braku zmian w bezwzględnej liczbie limfocytów
grasicy w stosunku do myszy zdrowych (kontroli negatywnej) odsetek i liczba bezwzględna
niedojrzałych limfocytów podwójnie negatywnych CD4-CD8- ulega drastycznemu wzrostowi.
Równocześnie istotnie spada odsetek i liczba bezwzględna tymocytów podwójnie
34
pozytywnych CD4+CD8+, czemu towarzyszy spadek odsetka limfocytów dojrzałych
pojedynczo-pozytywnych CD4+. W 47 dniu doświadczenia u myszy z wywołanym CIA ze
względu na istotne zmniejszenie odsetka limfocytów CD4+ w grasicy istotnie ulega obniżeniu
współczynnik CD4+/CD8+ (tab. 7D)
Tab.4. Wpływ kolagenowego zapalenia stawów (CIA) na odsetek i liczbę limfocytów T w
grasicy myszy.
Liczba
limf. x
107
CD4-CD8-
43 dzień
doświadczenia
kontrola
N
47 dzień
doświadczenia
%
kontrola
N
kontrola
P
kontrola
P
1,79
±0,24
↑
2,06
±0,61
0
CD4+CD8+
l.limf
x 107
%
2,06
0,04 85,56
±0,38 ±0,01 ±1,18
0
↑
↑
3,40
0,08 83,54
±1,36 ±0,04 ±1,46
↑
↓
↑
l.limf.
x 107
1,53
±0,20
↑
1,87
±0,48
↓
CD4+
%
CD8+
l.limf
x 107
%
10,79 0,19
1,59
±1,07 ±0,04 ±0,22
↓
↑
0
11,68 0,26
1,39
±1,62 ±0,08 ±0,18
↓
0
0
l.limf.
x 107
0,03
±0,01
↑
0,03
±0,01
0
kontrola N- kontrola negatywna (myszy zdrowe)
kontrola P – kontrola pozytywna (myszy z wywołanym CIA)
↑ wzrost lub ↓ spadek statystycznie istotny w stosunku do kontroli negatywnej
0 brak potwierdzonych statystycznie zmian w stosunku do kontroli negatywnej
l.limf. – liczba limfocytów
Podawanie myszom z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów ekstraktu B z ziela
Caltha palustris L., jak również metotreksatu powoduje obserwowany w 43 dniu
doświadczenia istotny wzrost odsetka i liczby bezwzględnej tymocytów niedojrzałych
podwójnie negatywnych CD4-CD8-, spadek odsetka tymocytów podwójnie pozytywnych
CD4+CD8+ czemu towarzyszy wzrost odsetka i liczby bezwzględnej pojedynczopozytywnych limfocytów grasicy o funkcji indukująco-wspomagającej (komórki CD4+) i
supresyjno-cytotoksycznej ( komórki CD8+). Silniejsze działanie na subpopulacje limfocytów
grasicy wykazuje metotreksat niż ekstrakt B z ziela Caltha palustris L. Z kolei podawanie
ekstraktu C myszom z eksperymentalnie wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów
powoduje w 43 dniu eksperymentu wzrost odsetka tymocytów efektorowych o funkcji
35
supresyjno-cytotoksycznej CD8+. Ponadto efektem stosowania ekstraktu C oraz metotreksatu
obserwowanym w 43 dniu doświadczenia jest spadek współczynnika limfocytarnego
CD4+/CD8+ w grasicy. Z kolei w 47 dobie doświadczenia u myszy z wywołanym
kolagenowym zapaleniem stawów podanie obu ekstraktów z ziela Caltha palustris L., jak
również MTX powoduje istotne obniżenie odsetka i liczby bezwzględnej tymocytów
podwójnie negatywnych CD4-CD8-, które w drastycznie wzrosły na skutek rozwoju
ogólnoustrojowego odczynu zapalnego. Równocześnie obserwuje się istotny wzrost odsetka i
liczby bezwzględnej tymocytów podwójnie pozytywnych CD4+CD8+ populacji komórek
grasicy drastycznie obniżonej w grupie myszy z wywołanym CIA i nie poddanych działaniu
badanych związków. Najsłabsze działanie na obie populacje tymocytów niedojrzałych CD4CD8- i CD4+CD8+ wykazuje ekstrakt C z ziela Caltha palustris L. Natomiast siła
modulującego wpływu na obie populacje tymocytów niedojrzałych ekstraktu B z ziela Caltha
palustris L. jest porównywalna do działania MTX. Ponadto ekstrakt B oraz MTX podawany
myszom z wywołanym CIA powoduje w 47 dniu doświadczenia istotny wzrost odsetka i
liczby
bezwzględnej
tymocytów
pojedynczo-pozytywnych
o
funkcji
indukująco-
wspomagającej CD4+, czego następstwem jest wzrost współczynnika limfocytarnego
CD4+/CD8+ w grasicy.
43 dzień
doświadczenia
Tab.5. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na odsetek i
liczbę limfocytów T grasicy myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów
l.limf
x 107
kontrola 3,00
P
±0,84
ekstrakt
0
C
ekstrakt
0
B
MTX
0
CD4-CD8CD4+CD8+
CD4+
CD8+
l.limf
l.limf
l.limf
l.limf
%
%
%
%
7
7
7
x 10
x 10
x 10
x 107
1,81
0,05 87,70 2,63
9,07
0,27
1,42
0,04
±0,88 ±0,03 ±1,12 ±0,75 ±0,60 ±0,07 ±0,19 ±0,01
0
0
0
0
0
0
↑
0
↑
↑
↓
0
↑
0
↑
↑
↑↑
↑↑
↓↓
0
↑↑
↑↑
↑↑
↑↑
kontrola P – kontrola pozytywna (myszy z wywołanym CIA)
↑ wzrost lub ↓ spadek statystycznie istotny w stosunku do kontroli pozytywnej
najsilniejszy ↑↑wzrost lub ↓↓ spadek statystycznie istotny w stosunku do kontroli pozytywnej
0 brak potwierdzonych statystycznie zmian w stosunku do kontroli pozytywnej
l.limf. – liczba limfocytów MTX – metotreksat
36
47 dzień
doświadczenia
Tab.6. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na na odsetek i
liczbę limfocytów T grasicy myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów.
CD4-CD8l.limf
l.limf
%
x 107
x 107
kontrola 2,24 53,85
1,13
P
±0,61 ±33,24 ±0,73
ekstrakt
0
↓
↓
C
ekstrakt
0
↓
↓
B
MTX
↑
↓↓
↓↓
CD4+CD8+
l.limf
%
x 107
37,77
0,81
±27,77 ±0,5
CD4+
l.limf.
%
x 107
7,09
0,15
±4,90 ±0,12
CD8+
l.limf.
%
x 107
1,30
0,03
±0,73 ±0,02
↑
↑
0
0
0
0
↑
↑
↑
↑
0
0
↑↑
↑↑
↑↑
↑↑
0
0
kontrola P – kontrola pozytywna (myszy z wywołanym CIA)
↑ wzrost lub ↓ spadek statystycznie istotny w stosunku do kontroli pozytywnej
najsilniejszy ↑↑wzrost lub ↓↓ spadek statystycznie istotny w stosunku do kontroli pozytywnej
0 brak potwierdzonych statystycznie zmian w stosunku do kontroli pozytywnej
l.limf. – liczba limfocytów
MTX – metotreksat
5. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na limfocyty T i B
śledziony myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów (wyniki badań
przedstawiono w tabelach nr 5D i 7D oraz tabelach nr: 7,8,9).
U myszy z eksperymentalnie wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów w 43 dniu
doświadczenia nie stwierdza się zmian odsetka limfocytów T (CD3+, CD4+ i CD8+ ) oraz
limfocytów B (CD19+) w śledzionie w porównaniu do kontroli negatywnej (myszy zdrowe).
Ze względu na to, że w 43 dobie doświadczenia obserwuje się wzrost bezwzględnej liczby
limfocytów w śledzionie, pomimo braku zmian odsetka stwierdza się istotny, przejściowy
wzrost liczy bezwzględnej obu subpopulacji limfocytów T (CD4+ i CD8+). Po kolejnych 5
dobach (47 dzień doświadczenia) u myszy z wywołanym CIA stwierdzono spadek odsetka i
liczby bezwzględnej limfocytów T o funkcji indukująco-wspomagającej (CD4+) i supresyjnocytotoksycznej (CD8+) w śledzionie. Odsetek i liczba bezwzględna limfocytów Pan-T (CD3+)
i B (CD19+) oraz współczynnik limfocytarny CD4+/CD8+ w śledzionie nie ulega zmianie.
37
Tab.7. Wpływ wywołanego kolagenowego zapalenia stawów (CIA) na limfocyty T i B
śledziony myszy.
43 dzień
doświadczenia
kontrola
N
47 dzień
doświadczenia
l.limf
x 107
kontrola
N
kontrola
P
kontrola
P
6,75
±1,07
↑
5,29
±1,23
0
CD3+
l.limf
%
x 107
CD4+
l.limf
%
x 107
CD8+
l.limf
%
x 107
CD19+
l.limf
%
x 107
19,84 1,33 9,74 0,66 2,18 0,15 74,17 5,02
±2,46 ±0,23 ±1,28 ±0,17 ±0,14 ±0,02 ±2,62 ±0,86
0
0
0
↑
0
↑
0
0
24,47 1,29 15,14 0,80 3,74 0,20 70,21 3,72
±1,96 ±0,30 ±1,44 ±0,21 ±0,78 ±0,05 ±2,32 ±0,90
0
0
↓
↓
↓
↓
0
0
kontrola N- kontrola negatywna (myszy zdrowe)
kontrola P – kontrola pozytywna (myszy z wywołanym CIA)
↑ wzrost lub ↓ spadek statystycznie istotny w stosunku do kontroli negatywnej
0 brak potwierdzonych statystycznie zmian w stosunku do kontroli negatywnej
l.limf. – liczba limfocytów
Podawanie ekstraktu C z ziela Caltha palustris L. w przebiegu kolagenowego zapalenia
stawów u myszy 24 godziny po podaniu ostatniej dawki przejściowo zmniejsza bezwzględną
liczbę limfocytów w śledzionie efektem czego jest zmniejszenie liczby limfocytów T (CD3+)
i B (CD19+). Z kolei po 5 dobach od podania ostatniej dawki badanego związku (47 doba
doświadczenia) stwierdzono nieznaczny wzrost odsetka splenocytów CD8+, natomiast liczba
bezwzględna tej populacji komórek nie ulega zmianie.
Z kolei podawanie ekstraktu B z ziela Caltha palustris L. w przebiegu kolagenowego
zapalenia stawów u myszy zwiększa w śledzionie odsetek limfocytów CD3+ (po 24 godzinach
od podania ostatniej dawki). Ponadto po 5 dobach od podania ostatniej dawki ekstraktu B
stwierdzono wzrost liczby bezwzględnej splenocytów CD3+ czemu towarzyszy wzrost
odsetka i liczby bezwzględnej śledzionowych limfocytów T o funkcji supresyjnocytotoksycznej (komórki CD8+) do wartości jak u myszy zdrowych.
Podawanie myszom w przebiegu kolagenowego zapalenia stawów metotreksatu powoduje w
43 dobie doświadczenia spadek odsetka i liczby bezwzględnej limfocytów B (CD19+) w
śledzionie oraz wzrost odsetka i liczby bezwzględnej limfocytów T CD3+ czemu towarzyszy
spadek odsetka i liczby bezwzględnej limfocytów T CD4+. Efektem zmniejszenia odsetka i
liczby bezwzględnej limfocytów CD4+ jest obniżenie współczynnika limfocytarnego
38
CD4+/CD8+ w śledzionie. Z kolei w 47 dniu doświadczenia u myszy z wywołanym CIA i
poddanym działaniu metotreksatu spadek odsetka limfocytów B (CD19+) a wzrost odsetka i
liczby bezwzględnej limfocytów CD3+ w śledzionie utrzymuje się. Wzrost odsetka i liczby
bezwzględnej śledzionowych limfocytów T (CD3+) spowodowany jest zwiększeniem odsetka
i liczby bezwzględnej limfocytów T o funkcji supresyjno-cytotoksycznej (komórki CD8+).
43 dzień
doświadczenia
Tab.8. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na limfocyty T i
B śledziony myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów.
CD3+
CD4+
CD8+
CD19+
l.limf
l.limf
l.limf
l.limf
l.limf
%
%
%
%
x 107
x 107
x 107
x 107
x 107
kontrola 7,69 19,68 1,51 10,32 0,79 2,33 0,18 73,11 5,62
P
±1,10 ±1,35 ±0,22 ±1,19 ±0,14 ±0,39 ±0,04 ±1,88 ±0,83
ekstrakt
↓
0
↓
0
0
0
0
0
↓
C
ekstrakt
0
↑
0
0
0
0
0
0
0
B
MTX
0
↑↑
↑
↓
↓
0
0
↓
↓↓
Kontrola pozytywna (myszy z wywołanym CIA)
↑ wzrost lub ↓ spadek statystycznie istotny w stosunku do kontroli pozytywnej
0 brak potwierdzonych statystycznie zmian w stosunku do kontroli pozytywnej
najsilniejszy ↑↑wzrost lub ↓↓ spadek statystycznie istotny w stosunku do kontroli pozytywnej
l.limf. – liczba limfocytów ; MTX – metotreksat
47 dzień
doświadczenia
Tab.9. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na limfocyty T i
B śledziony myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów.
CD3+
CD4+
CD8+
CD19+
l.limf
l.limf
l.limf
l.limf
l.limf
%
%
%
%
x 107
x 107
x 107
x 107
x 107
kontrola 5,02 22,27 1,02 12,28 0,64 2,38 0,12 71,93 3,64
P
±1,12 ±3,24 ±0,27 ±1,06 ±0,12 ±0,91 ±0,08 ±4,05 ±0,86
ekstrakt
0
0
0
0
0
↑
0
0
0
C
ekstrakt
0
0
↑
0
0
↑↑
↑
0
↑
B
MTX
↑
↑
↑↑
0
0
↑↑
↑
↓
0
Kontrola pozytywna (myszy z wywołanym CIA)
↑ wzrost lub ↓ spadek statystycznie istotny w stosunku do kontroli pozytywnej
najsilniejszy ↑↑wzrost lub ↓↓ spadek statystycznie istotny w stosunku do kontroli pozytywnej
0 brak potwierdzonych statystycznie zmian w stosunku do kontroli pozytywnej
l.limf – liczba limfocytów; MTX – metotreksat
39
6. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na limfocyty T i B
węzłów chłonnych myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów (wyniki badań
przedstawiono w tabelach nr 6D i 7D oraz tabelach nr: 10,11,12).
Eksperymentalne wywołanie u myszy kolagenowego zapalenia stawów nie powoduje
zarówno w 43 jak 47 dniu doświadczenia zmian odsetka i liczby bezwzględnej limfocytów T
(CD3+, CD4+ i CD8+) i B (CD19+) w węzłach chłonnych krezkowych.
Tab.10. Wpływ wywołanego kolagenowego zapalenia stawów (CIA) na limfocyty T i B
węzłów chłonnych krezkowych myszy.
43 dzień
doświadczenia
kontrola
N
47 dzień
doświadczenia
l.limf
x 107
kontrola
N
kontrola
P
kontrola
P
2,26
±0,53
0
1,57
±0,42
0
CD3+
l.limf
%
x 107
CD4+
l.limf
%
x 107
CD8+
l.limf
%
x 107
CD19+
l.limf
%
x 107
43,87 0,99 28,44 0,64 9,76 0,21 51,21 1,16
±8,47 ±0,31 ±3,97 ±0,15 ±3,26 ±0,08 ±8,94 ±0,38
0
0
0
0
0
0
0
0
52,30 0,77 35,27 0,55 9,30 0,14 47,30 0,76
±5,45 ±0,17 ±3,54 ±0,12 ±1,70 ±0,04 ±7,82 ±0,33
0
0
0
0
0
0
0
0
kontrola N- kontrola negatywna (myszy zdrowe )
kontrola P – kontrola pozytywna (myszy z wywołanym CIA)
↑ wzrost lub ↓ spadek statystycznie istotny w stosunku do kontroli negatywnej
0 brak potwierdzonych statystycznie zmian w stosunku do kontroli negatywnej
l.limf - liczba limfocytów
Podawanie myszom z wywołanym eksperymentalnie kolagenowym zapaleniem stawów
ekstraktu C z ziela Caltha palustris L. powoduje po 24 godzinach od podania ostatniej dawki
zmniejszenie liczby limfocytów w węzłach chłonnych w stosunku do kontroli pozytywnej
(myszy z wywołanym CIA). Efektem spadku liczby bezwzględnej limfocytów w tym
narządzie limfatycznym jest spadek liczby bezwzględnej limfocytów T CD3+, CD4+ oraz
spadek odsetka i liczby bezwzględnej limfocytów B (komórki CD19+). Z kolei po 5 dobach
od podania ostatniej dawki ekstraktu C stwierdza się wzrost liczby limfocytów węzłów
chłonnych krezkowych, co prowadzi do wzrostu liczby limfocytów B.
40
Z kolei u myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów i poddanym działaniu
ekstraktu B z ziela Caltha palustris L., jak również metotreksatu (MTX) stwierdzono w 43
dobie doświadczenia spadek odsetka limfocytów B (CD19+) oraz wzrost odsetka limfocytów
T CD3+ czemu towarzyszy wzrost odsetka limfocytów T CD4+ i wzrost odsetka i liczby
bezwzględnej limfocytów T CD8+ w węzłach chłonnych krezkowych. Metotreksat wywiera
silniejsze działanie obniżające odsetek limfocytów B w węzłach chłonnych krezkowych niż
ekstrakt B z ziela Caltha palustris L. Ponadto u myszy z wywołanym CIA i poddanym
działaniu MTX stwierdzono w 43 dobie doświadczenia obniżenie współczynnika
limfocytarnego CD4+/CD8+ w węzłach chłonnych krezkowych. Z kolei w 47 dniu
eksperymentu, czyli po 5 dobach od podania ostatniej dawki ekstraktu C z ziela Caltha
palustris L. i 7 dobach od momentu podania ostatniej dawki MTX stwierdzono wzrost liczby
limfocytów w węzłach chłonnych krezkowych. Efektem takiego działania jest wzrost liczby
limfocytów B w węzłach chłonnych krezkowych. Ponadto u myszy z wywołanym CIA i
poddanym działaniu ekstraktu B w 47 dniu eksperymentu stwierdzono również wzrost liczby
limfocytów T CD4+ w tym narządzie limfatycznym.
43 dzień
doświadczenia
Tab.11. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na limfocyty T i
B węzłów chłonnych krezkowych myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem
stawów.
l.limf
x 107
kontrola 1,93
P
±0,47
ekstrakt
↓
C
ekstrakt
0
B
MTX
0
CD3+
CD4+
CD8+
CD19+
l.limf
l.limf
l.limf
l.limf
%
%
%
%
7
7
7
x 10
x 10
x 10
x 107
44,65 0,86 29,74 0,57
9,97 0,19
50,97 0,98
±3,53 ±0,24 ±1,61 ±0,15 ±1,40 ±0,05 ±4,07 ±0,21
0
↓
↑
↓
↑
0
0
↓
↑
0
↑
0
↑↑
↑
↓
0
↑
0
↑
0
↑↑
↑
↓↓
0
kontrola P – kontrola pozytywna (myszy z wywołanym CIA)
↑ wzrost lub ↓ spadek statystycznie istotny w stosunku do kontroli pozytywnej
0 brak potwierdzonych statystycznie zmian w stosunku do kontroli pozytywnej
najsilniejszy ↑↑wzrost lub ↓↓ spadek statystycznie istotny w stosunku do kontroli pozytywnej
l.limf – liczba limfocytów
MTX – metotreksat
41
47 dzień
doświadczenia
Tab.12. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na limfocyty T i
B węzłów chłonnych krezkowych myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem
stawów.
l.
CD3+
CD4+
CD8+
CD19+
limf.
l.limf.
l.limf
l.limf
l.limf
l.limf
%
%
%
%
7
7
7
7
x 10
x 10
x 10
x 107
x 10
kontrola 1,41 54,99 0,87 37,95 0,60 10,49 0,17 41,90 0,64
P
±0,61 ±5,40 ±0,27 ±3,09 ±0,18 ±2,14 ±0,06 ±5,72 ±0,13
ekstrakt
↑
0
0
0
0
↓
0
0
↑
C
ekstrakt
0
0
0
0
↑
0
0
0
↑
B
MTX
↑
0
0
0
0
0
0
0
↑
kontrola P – kontrola pozytywna (myszy z wywołanym CIA)
↑ wzrost lub ↓ spadek statystycznie istotny w stosunku do kontroli pozytywnej
0 brak potwierdzonych statystycznie zmian w stosunku do kontroli pozytywnej
n – liczba limfocytów
MTX – metotreksat
7. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na populację
limfocytów regulatorowych (Treg) myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem
stawów (wyniki badań przedstawiono w tabeli nr 8D oraz na rycinie 3).
U myszy z doświadczalnie wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów w 43 dniu
eksperymentu obserwuje się istotny wzrost odsetka limfocytów regulatorowych (Treg)
wykazujących ekspresję antygenów CD4+CD25+Foxp3+. Natomiast po kolejnych pięciu
dobach (47 doba doświadczenia) nie stwierdzono istotnych różnic pomiędzy kontrolą
pozytywną a negatywną w odsetku limfocytów śledzionowych CD4+CD25+Foxp3+.
Badane ekstrakty C i B z ziela Caltha palustris L., jak również metotreksat (MTX) podawane
myszom w przebiegu kolagenowego zapalenia stawów powodują w 43 dniu doświadczenia
istotne obniżenie odsetka śledzionowych limfocytów T regulatorowych o fenotypie
CD4+CD25+Foxp3+ przy czym siła działania ekstraktu C jest porównywalna do siły działania
MTX, ale utrzymuje się krócej (w 47 dobie doświadczenia nie stwierdzono wpływu ekstraktu
C na odsetek komórek CD4+CD25+Foxp3+ w śledzionie). Natomiast działanie ekstraktu B jest
silniejsze niż MTX. Działanie ekstraktu B i MTX o porównywalnej sile powodujące
obniżenie odsetka śledzionowych limfocytów Treg wykazujących ekspresję antygenów
CD4+CD25+Foxp3+ obserwowane jest również 47 dobie doświadczenia.
42
Ryc.3. Wpływ ekstraktów C i B z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na odsetek
śledzionowych limfocytów Treg (CD4+CD25+Foxp3+) myszy z wywołanym CIA.
+
+
Treg CD4 CD25 Foxp3
+
14,00
12,00
10,00
%
*
#
#$
* *#
#
*#
kontrola N
kontrola P
8,00
ekstarakt C
6,00
ekstrakt B
4,00
MTX
2,00
0,00
43 doba eksperymentu
47 doba eksperymentu
* - zmiana istotna statystycznie przy p < 0.05 w stosunku do kontroli negatywnej (myszy
zdrowe)
# - zmiana istotna statystycznie p < 0.05 w stosunku do kontroli pozytywnej (myszy z
wywołanym CIA)
$ - zmiana istotna statystycznie p < 0.05 w stosunku do metotreksatu (MTX)
8. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na stężenie cytokin
(IL-2, IL-4, IL-6, IF+-γ, T+F- α, IL-10 ) uwalnianych przez limfocyty Th1/Th2 myszy z
wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów (wyniki badań przedstawiono w tabeli nr
9D).
U myszy z eksperymentalnie wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów (CIA) w 43 dniu
doświadczenia we krwi obwodowej stwierdzono wzrost stężenia IL-2 i IFN-γ należących do
cytokin syntetyzowanych i uwalnianych przez limfocyty Th1. Ponadto stwierdzono w krwi
obwodowej wzrost stężenia TNF- α oraz IL-6 syntetyzowanej i uwalnianej przez limfocyty
Th2. W przebiegu CIA u myszy zwiększone stężenie IL-6, TNF- α oraz IFN-γ stwierdzono
również w 47 dniu doświadczenia. Natomiast u myszy w przebiegu eksperymentalnie
wywołanego CIA nie stwierdza się zmian w stężeniu IL-4 i IL-10 we krwi obwodowej (
cytokiny wytwarzane przez limfocyty Th2) w porównaniu do kontroli negatywnej (myszy
zdrowe). Podawanie myszom w przebiegu CIA ekstraktu C z ziela Caltha palustris L.
powoduje jedynie przejściowy spadek stężenia TNF- α w 43 dniu eksperymentu, czyli po 24
godzinach od momentu podania ostatniej dawki badanego preparatu. Natomiast stosowanie u
43
myszy z doświadczalnie wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów ekstraktu B z ziela
Caltha palustris L. powoduje w 43 dniu eksperymentu ( 24 godziny po podaniu ostatniej
dawki badanego związku) wzrost stężenia IL-10 oraz obniżenie stężenia IL-2 i TNF- α.
Działanie ekstraktu B obniżające stężenie IL-2 utrzymuje się do 47 dnia doświadczenia (5
doba po podaniu ostatniej dawki badanego preparatu). Ponadto w 47 dniu doświadczenia u
myszy poddanych działaniu ekstraktu B obserwuje się spadek stężenia IL-4 i wzrost stężenia
TNF- α we krwi obwodowej.
Z kolei stosowanie u myszy z wywołanym CIA metotreksatu (MTX) powoduje w 43 dniu
doświadczenia, czyli po 72 godzinach od podania ostatniej dawki MTX istotny spadek
stężenia IL-2, IFN-γ i TNF- α. Z kolei w 47 dniu doświadczenia, czyli po 7 dobach od
podania ostatniej dawki MTX nie stwierdzono w krwi obwodowej zmian stężeniu badanych
cytokin z wyjątkiem TNF- α, którego stężenie istotnie wzrosło w porównaniu do kontroli
pozytywnej (myszy z wywołanym CIA). Działanie MTX zwiększające stężenie TNF- α w
krwi obwodowej było istotnie wyższe niż ekstraktu B z ziela Caltha palustris L.
9. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na syntezę i
uwalnianie interleukiny-1 (IL-1) przez mysie makrofagi otrzewnowe stymulowane in
vitro LPS z E.coli w warunkach autoagresji wywołanej kolagenowym zapaleniem
stawów (wyniki badań przedstawiono w tabeli nr 10D).
U myszy z eksperymentalnie wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów (CIA)
stwierdzono
w
47
dniu
doświadczenia
istotny
wzrost
syntezy
i
uwalniania
zewnątrzkomórkowej interleukiny- 1β (IL-1β) przez mysie rezydentne makrofagi otrzewnowe
stymulowane in vitro LPS z E.coli (2,5 µg/ml hodowli) w porównaniu do grupy kontrolnej
negatywnej (grupa myszy zdrowych).
Podawanie myszom w przebiegu kolagenowego zapalenia stawów ekstraktu B z ziela Caltha
palustris L. początkowo nasila (43 dzień doświadczenia) a następnie hamuje (47 dzień
doświadczenia) pobudzający wpływ odczynu zapalnego na syntezę i uwalnianie
zewnątrzkomórkowej IL-1β przez mysie rezydentne makrofagi otrzewnowe stymulowane in
vitro LPS z E.coli.
Z kolei podawanie ekstraktu C z ziela Caltha palustris L. podobnie jak stosowanie
metotreksatu powoduje w 43 dobie doświadczenia przejściowe nasilenie pobudzającego
wpływu eksperymentalnie wywołanego kolagenowego zapalenia stawów na zdolność
uwalniania zewnątrzkomórkowej IL-1β przez mysie rezydentne makrofagi otrzewnowe
44
stymulowane in vitro LPS z E. coli. Natomiast w 47 dobie doświadczenia nie obserwuje się
wpływu ekstraktu C jak również metotreksatu na zwiększoną zdolność syntezy i uwalniania
IL-1β przez mysie makrofagi otrzewnowe stymulowane in vitro LPS z E.coli w przebiegu
kolagenowego zapalenia stawów.
10. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na wytwarzanie
tlenku azotu (+O) przez mysie makrofagi otrzewnowe stymulowane in vitro LPS z E.coli
w warunkach autoagresji wywołanej kolagenowym zapaleniem stawów (wyniki badań
przedstawiono w tabeli nr 11D).
U myszy z eksperymentalnie wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów obserwuje się w
47 dobie doświadczenia statystycznie istotny wzrost zdolności wytwarzania tlenku azotu
(NO) przez mysie rezydentne makrofagi otrzewnowe stymulowane in vitro LPS z E. coli (2,5
µg/ml hodowli badanych komórek) w porównaniu do kontroli negatywnej (myszy zdrowe).
Oba badane ekstrakty (C i B) z ziela Caltha palustris L., jak również metotreksat nasilają w
47 dobie doświadczenia pobudzający wpływ przebiegającego odczynu zapalnego na zdolność
wytwarzania NO przez mysie rezydentne makrofagi otrzewnowe stymulowane in vitro LPS z
E. coli. Najsilniejsze działanie obserwuje się po stosowaniu ekstraktu B z ziela Caltha
palustris L. Wysoce istotny wzrost wytwarzania NO przez mysie makrofagi otrzewnowe
obserwowany jest zarówno w 43, jak również w 47 dobie doświadczenia, czyli po 24
godzinach i 5 dniach od podania ostatniej dawki ekstraktu B myszom z eksperymentalnie
wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów.
11. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na aktywność
fagocytarną granulocytów i monocytów krwi obwodowej myszy z wywołanym
kolagenowym zapaleniem stawów (wyniki badań przedstawiono w tabeli nr 12D).
U myszy z wywołanym eksperymentalnie kolagenowym zapaleniem stawów w porównaniu
do grupy myszy zdrowych (kontrola negatywna) stwierdzono w 43 dniu doświadczenia
przemijający
wzrost
odsetka
granulocytów
obojętnochłonnych
krwi
obwodowej
wykazujących aktywność fagocytarną. Z kolei w 47 dniu doświadczenia nie stwierdza się
zmian odsetka granulocytów obojętnochłonnych wykazujących aktywność fagocytarną
natomiast obserwuje się spadek intensywności fluorescencji (średnia FL) tej populacji
komórek, co świadczy o zmniejszeniu liczby sfagocytowanych bakterii przez jeden
45
granulocyt obojętnochłonny. W czasie przebiegu eksperymentalnie wywołanego CIA nie
stwierdza się zmian w odsetku monocytów krwi obwodowej wykazujących zdolność
fagocytozy jak również nie zmienia się intensywność fluorescencji ( średnia FL), co świadczy
o braku wpływu stanu zapalnego na liczbę sfagocytowanych bakterii przez jeden monocyt.
W 43 dniu doświadczenia a więc 24 godziny po podaniu ostatniej dawki badanych ekstraktów
(C i B) z ziela Caltha palustris L. myszom z eksperymentalnie wywołanym CIA nie
obserwowano wpływu na odsetek granulocytów obojętnochłonnych i monocytów krwi
obwodowej wykazujących zdolność fagocytozy. Nie stwierdza się również wpływu badanych
związków na liczbę sfagocytowanych bakterii przez te komórki krwi obwodowej. Natomiast
podawanie myszom z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów metotreksatu powoduje
w 43 dniu doświadczenia przejściowy spadek odsetka granulocytów obojętnochłonnych krwi
obwodowej wykazujących aktywność fagocytarną, a także obserwuje się spadek
intensywności
fluorescencji
monocytów
co
świadczy
o
spadku
liczby
bakterii
sfagocytowanych przez tę populację komórek. Z kolei w 47 dniu doświadczenia, czyli po 5
dobach od podania ostatniej dawki badanych ekstraktów z ziela Caltha palustris L. lub po 7
dobach od momentu podania ostatniej dawki metotreksatu obserwuje się zmiany zarówno w
odsetku granulocytów i monocytów wykazujących zdolność fagocytozy jak również w liczbie
sfagocytowanych bakterii przez te populacje komórek. Najsilniejsze działanie obserwuje się
po stosowaniu ekstraktu B z Caltha palustris L. Stwierdzono bowiem wzrost odsetka
zarówno granulocytów obojętnochłonnych, jak również monocytów wykazujących aktywność
fagocytarną, a także pod wpływem tego związku zwiększa się liczba sfagocytowanych
bakterii przez jeden monocyt. Z kolei stosowanie u myszy w przebiegu kolagenowego
zapalenia stawów metotreksatu powoduje wzrost odsetka monocytów krwi obwodowej
wykazujących aktywność fagocytarną, jak również obserwuje się zwiększenie liczby
sfagocytowanych bakterii przez tę populacje komórek krwi. Najsłabsze działanie w przebiegu
kolagenowego zapalenia stawów wykazuje ekstrakt C z Caltha palustris L. Pięć dni po
podaniu ostatniej dawki badanego związku obserwuje się u myszy z wywołanym CIA wzrost
intensywności fluorescencji monocytów, co świadczy o zwiększeniu liczby sfagocytowanych
bakterii przez jeden monocyt.
46
12. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na zdolność bójczą
granulocytów i monocytów krwi obwodowej myszy z wywołanym kolagenowym
zapaleniem stawów (wyniki badań przedstawiono w tabeli nr 13D).
U myszy z eksperymentalnie wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów stwierdza się w
43 dniu doświadczenia spadek odsetka granulocytów obojętnochłonnych krwi wykazujących
zdolność bójczą natomiast w 47 dobie doświadczenia obserwuje się zmniejszenie odsetka
granulocytów obojętnochłonnych i monocytów wykazujących zdolność do „wybuchu
tlenowego” (zdolność bójcza), jak również obserwuje się spadek intensywności fluorescencji
(średnia FL), co jest wyznacznikiem spadku aktywności metabolicznej badanych populacji
komórek krwi.
Podawanie myszom z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów ekstraktu B z ziela
Caltha palustris L. po 24 godzinach od iniekcji ostatniej dawki (43 doba doświadczenia)
nasila aktywność metaboliczną monocytów, natomiast po 5 dobach od ostatniej dawki (47
doba doświadczenia) nasila aktywność metaboliczną granulocytów obojętnochłonnych oraz
zwiększa odsetek monocytów wykazujących zdolność do wybuchu tlenowego, a także nasila
aktywność metaboliczną tej populacji komórek.
Z kolei podawanie myszom z
eksperymentalnie wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów ekstraktu C z Caltha
palustris L. nie zmienia odsetka granulocytów i monocytów krwi wykazujących zdolność
bójczą, a także nie wpływa na metabolizm tych komórek. Natomiast podawanie myszom w
przebiegu CIA metotreksatu powoduje w 43 dobie doświadczenia wysoce istotny spadek
odsetka
granulocytów
obojętnochłonnych
wykazujących
zdolność
zabijania
przy
jednoczesnym pobudzeniu aktywności metabolicznej tej populacji komórek krwi. W 47 dobie
doświadczenia nie stwierdzono działania metotreksatu podawanego myszom z wywołanym
CIA na zdolność bójczą i aktywność metaboliczną granulocytów obojętnochłonnych i
monocytów krwi .
13. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na odpowiedź
humoralną myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów i immunizowanych
SRBC (wyniki badań przedstawiono w tabeli nr 14D oraz na rycinie 4).
Podanie dootrzewnowe antygenu grasiczozależnego jakim są erytrocyty owcy (SRBC)
myszom z doświadczalnie wywołaną autoagresją, polegającą na indukcji kolagenowego
zapalenia stawów (CIA), istotnie obniża swoistą pierwotną odpowiedź humoralną na
wstrzyknięty antygen. Obniżenie odpowiedzi humoralnej na SRBC u myszy z wywołanym
47
CIA manifestuje się istotnym zmniejszeniem liczby limfocytów śledziony wykazujących
zdolność wytwarzania przeciwciał hemolitycznych anty-SRBC (PFC) oraz spadkiem miana
hemaglutynin całkowitych (IgM + IgG) w surowicy. Nie stwierdzono natomiast zmian w
wysokości miana surowiczych hemaglutynin opornych na 2-mercaptoetanol (przeciwciała
klasy IgG). Podawanie myszom z wywołanym CIA obu ekstraktów C i B uzyskiwanych z
ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu przed immunizacją SRBC istotnie nasila hamujący
wpływ indukowanego procesu zapalnego na swoistą odpowiedź humoralną, co wyrażone jest
istotnym obniżeniem liczby PFC i miana przeciwciał anty-SRBC całkowitych w stosunku do
grupy stanowiącej kontrolę pozytywną (myszy z wywołanym CIA). Najsłabsze działanie
hamujące odpowiedź humoralną na SRBC wykazuje ekstrakt C z ziela Caltha palustris L.
Natomiast siła działania drugiego badanego ekstraktu B jest porównywalna z działaniem
MTX.
Ryc.4. Wpływ ekstraktów C i B z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na odpowiedź
humoralną myszy z wywołanym CIA.
Miana hem aglutynin anty-SRBC całkow itych
PFC
16,00
3500,00
14,00
*
2000,00
12,00
kontrola N
2500,00
miano log 2
PFC/mln komórek
3000,00
kontrola P
*#
1500,00
*#
*#
ekstrakt C
ekstrakt B
*
*#$
10,00
kontrola N
*#
*#
kontrola P
ekstrakt C
8,00
ekstrakt B
6,00
metotreksat
metotreksat
1000,00
4,00
2,00
500,00
0,00
0,00
4 dzień
4 dzień
Kontrola N – kontrola negatywna (myszy zdrowe)
Kontrola P – kontrola pozytywna (myszy z wywołanym CIA)
*- zmiana istotna statystycznie przy p< 0.05 w stosunku do kontroli negatywnej
#- zmiana istotna statystycznie przy p< 0.05 w stosunku do kontroli pozytywnej
$- zmiana istotna statystycznie przy p< 0.05 w stosunku do metotreksatu
48
DYSKUSJA
W prezentowanej pracy badano wpływ ekstraktów C i B uzyskanych z ziela Caltha palustris
L. w porównaniu z metotreksatem (MTX), syntetycznym związkiem immunosupresyjnym
należącym do grupy antymetabolitów, na obraz kliniczny eksperymentalnie wywołanego u
myszy kolagenowego zapalenia stawów (CIA) oraz na odsetek i funkcje efektorowe komórek
układu immunologicznego biorących udział w immunopatogenezie tego schorzenia. Wielkość
stosowanej w doświadczeniu dawki dobowej (10 mg/kg) obu badanych ekstraktów ustalono
na podstawie wcześniej przeprowadzonych badań własnych oceniających wpływ obu
ekstraktów z ziela Caltha palustris L. w zależności od wielkości dawki dobowej (0,1, 1 i 10
mg/kg) i liczby kolejnych podań (podanie jednorazowe lub pięciokrotne w odstępach 24
godzinnych) na odsetek i liczbę subpopulacji limfocytów T (CD3+, CD4+, CD8+) i
limfocytów B (CD19+) w narządach limfatycznych myszy z prawidłowym układem
odpornościowym oraz na pierwotną odpowiedź
humoralną myszy immunizowanych
antygenem grasiczozależnym jakim są erytrocyty owcy (SRBC).
W pracy oceniano wpływ ekstraktów C i B z ziela Caltha palustris L. i metotreksatu na obraz
kliniczny zapalenia stawów u myszy z eksperymentalnie wywołanym schorzeniem
autoimmunologicznym jakim jest kolagenowe zapalenie stawów typu II (CIA). Uzyskane
wyniki badań wskazują na istotny, hamujący wpływ ekstraktu B z ziela Caltha palustris L.
oraz znamiennie silny supresyjny efekt działania metotreksatu na rozwój kolagenowego
zapalenia stawów ocenianego na podstawie 5-stopniowej skali uwzględniającej nasilenie
zmian klinicznych u myszy z CIA.
W dostępnym piśmiennictwie nie znaleziono doniesień dotyczących przeciwzapalnego
działania ekstraktów z ziela Caltha palustris L. Jednakże przeprowadzone zostały badania
nad innymi ekstraktami pochodzenia roślinnego, gdzie oceniony został także ich wpływ na
obraz kliniczny eksperymentalnie wywołanego kolagenowego zapalenia stawów u zwierząt
laboratoryjnych. Cho i wsp. [25] określili wpływ proantocyjanidowego ekstraktu z pestek
winogron (GSPE). Myszom szczepu DBA/1J z wywołanym CIA podawano ekstrakt
dootrzewnowo w dawkach 10, 50 i 100 mg/kg pięć razy co 2 dni przez 2,5 tygodnia,
począwszy od drugiej immunizacji (2 tydzień eksperymentu). Objawy kliniczne
rozwijającego się zapalenia stawów autorzy badań oceniali posługując się skalą 4-stopniową.
49
Ocenę zmian zapalnych stawów przeprowadzano 3 razy w tygodniu przez okres 8 tygodni od
momentu wstrzyknięcia pierwszej dawki kolagenu. Autorzy badań stwierdzili znaczący,
dawko-zależny, supresyjny wpływ badanego ekstraktu z pestek winogron (GSPE) na obraz
kliniczny wyrażony średnią oceną punktową stopnia zapalenia. Z kolei Lee [86] wykazał
hamujący wpływ ekstraktu uzyskanego z pyłku sosny (pine pollen extact , PPE) na kliniczny
przebieg kolagenowego zapalenia stawów u myszy, oceniany za pomocą skali punktowej
uwzględniającej stopień nasilenia zmian klinicznych. W powyższych badaniach myszy
szczepu DBA/1J z wywołanym CIA otrzymywały codziennie, doustnie ekstrakt PPE w
dawkach: 100 i 200 mg/kg, począwszy od 21 dnia aż do 49 dnia eksperymentu. Zmiany
kliniczne były monitorowane cotygodniowo przez okres całego eksperymentu (8 tygodni).
Zastosowano 4 stopniową skalę oceny klinicznych zmian zapalnych. W piśmiennictwie
dostępna jest także praca przedstawiająca hamujący wpływ frakcji polisacharydowej ekstraktu
z Radix astragali na objawy kliniczne zapalenia stawów u szczurów z eksperymentalnie
wywołanym adjuwantowym zapaleniem stawów (AIA) [68].
Z kolei przedstawione w obecnej pracy wyniki badań dotyczące efektu działania metotreksatu
na rozwój i przebieg eksperymentalnie wywołanego CIA u myszy są zgodne z wynikami
badań innych Autorów. Neurath i wsp.[100] badali wpływ MTX na obraz kliniczny zapalenia
stawów myszy szczepu DBA/1J z eksperymentalnie wywołanym
CIA.
Zwierzęta
otrzymywały lek dootrzewnowo w dawkach 0,01, 0,1, 1 i 10 mg/kg, trzy razy w tygodniu
przez okres 2 tygodni, począwszy od 21 dnia od immunizacji kolagenem. Autorzy badań
stwierdzili wystąpienie klinicznej poprawy stanu zapalnego stawów po podawaniu MTX we
wszystkich badanych dawkach, przy czym stwierdzono całkowite zahamowanie rozwoju
zapalenia stawów po stosowaniu MTX w dawkach najwyższych (1 i 10 mg/kg). Z kolei
badania Shahin’a i wsp.[120] przeprowadzone na szczurzym modelu kolagenowego zapalenia
stawów potwierdziły hamujący wpływ MTX na rozwój objawów klinicznych zapalenia.
Immunizowane kolagenem szczury były leczone MTX, który podawano doustnie, codziennie
w dawce 0,1 mg/kg przez 16 kolejnych dni począwszy od 28 dnia doświadczenia (tydzień po
2-giej immunizacji kolagenem). Zahamowanie wystąpienia objawów klinicznych ocenianych
za pomocą 5-stopniowej skali obserwowano pomiędzy 32 a 44 dniem eksperymentu w
stosunku do grupy zwierząt nie poddanych leczeniu. Podobnie stosowanie MTX doustnie w
dawce 0,33 mg/kg co dwa dni (1mg/kg/tydzień) przez okres 4 tygodni u szczurów
50
wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów powoduje wysoce istotną redukcję objawów
klinicznych [148].
W obecnej pracy przedstawiono również wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. i
metotreksatu na obraz krwi obwodowej myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem
stawów. Wykazano supresyjne działanie badanych ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz
metotreksatu w 43 dobie trwania procesu zapalnego stawów na liczbę leukocytów i odsetek
limfocytów, których liczba znacznie wzrosła na skutek przebiegu stanu zapalnego stawów.
Natomiast pod wpływem obu ekstraktów oraz metotreksatu istotnie wzrósł odsetek
młodocianych form neutrofilów z jądrem pałeczkowatym we krwi obwodowej, który w
przebiegu CIA nie poddanego terapią badanymi związkami był istotnie obniżony, co mogło
być wynikiem migracji neutrofilów do ogniska zapalenia. Z kolei w 47 dobie trwania procesu
zapalnego potwierdzono supresyjne działanie MTX na liczbę leukocytów krwi obwodowej u
myszy z wywołanym CIA. Natomiast badane ekstrakty uzyskane z ziela Caltha palustris L.
powodowały w tym punkcie czasowym trwania procesu zapalnego stawów leukocytozę, co
związane było ze wzrostem liczby neutrofilów z jądrem segmentowanym.
W dostępnym piśmiennictwie brak jest danych dotyczących wpływu substancji czynnych
uzyskanych z ziela Caltha palustris L. na obraz białokrwinkowy zwierząt doświadczalnych z
eksperymentalnie wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów.
Fragmentaryczne są również opublikowane dane dotyczące wpływu innych ekstraktów
roślinnych na obraz białokrwinkowy zwierząt laboratoryjnych z doświadczalnie wywołanym
CIA. Myszom szczepu wsobnego DBA/1J z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów
Coelho i wsp.[28] podawali doustnie hydroalkoholowy ekstrakt z nasion Pterodon pubescens
(HEPp) w dawce 5 mg/kg przez okres 30 dni tj. od 21 dnia od pierwszej immunizacji
kolagenem do 50 dnia eksperymentu. Autorzy powyższych badań nie stwierdzili różnic w
obrazie białokrwinkowym (liczbie leukocytów oraz leukogramie) pomiędzy grupą kontrolną
(myszy zdrowe), grupą myszy z wywołanym CIA i grupą myszy z wywołanym CIA i
poddanym działaniu badanego ekstraktu. Z kolei Ekambaram i wsp. [37] zbadali wpływ
ekstraktu uzyskanego z nasion drzewa Strychnos potatorum Linn na innym modelu
reumatoidalnego zapalenia stawów tj. adjuwantowym zapaleniu stawów u szczurów szczepu
Wistar albino. Autorzy powyższych badań obserwowali u szczurów z wywołanym
eksperymentalnie adjuwantowym zapaleniem stawów wzrost liczby leukocytów we krwi
51
obwodowej, natomiast nie stwierdzili wpływu badanego ekstraktu
na leukocytozę
występująca w przebiegu AIA.
Z kolei na podstawie opublikowanych danych można stwierdzić, że metotreksat wpływa na
hemopoezę w sposób zależny od
wielkości dawki.
Wysokie dawki MTX wywierają
cytotoksyczne działanie na komórki hemopoetyczne, natomiast niskie stężenia MTX
stymulują proces hemopoezy [54.108,128]. Wzrost liczby neutrofilów krwi obwodowej
stwierdzono u pacjentek z występującym zespołem Feltiego
poddanych terapii
metotreksatem [ 39].
W obecnej pracy przedstawiono również modulujący wpływ ekstraktów z ziela Caltha
palustris L. i metotreksatu na subpopulacje komórek T grasicy i komórek T i B obwodowych
narządów limfatycznych (śledziony i węzłów chłonnych krezkowych) u myszy z wywołanym
kolagenowym zapaleniem stawów.
W badaniach wykazano, że eksperymentalne wywołanie kolagenowego zapalenia stawów u
myszy powoduje w 47 dobie doświadczenia wysoce istotne zmiany odsetka tymocytów
niedojrzałych tj. wielokrotny wzrost odsetka i liczby tymocytów podwójnie negatywnych
CD4-CD8- i równocześnie wysoce istotny spadek odsetka i liczby tymocytów podwójnie
pozytywnych CD4+CD8+ oraz spadek pojedynczo-pozytywnych limfocytów grasicy CD4+.
Podawanie myszom z wywołanym CIA badanych ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz
metotreksatu powoduje częściową lub całkowitą normalizację odsetka i liczby bezwzględnej
wyżej wymienionych populacji limfocytów grasicy. Najsłabsze działanie immunokorekcyjne
na subpopulacje limfocytów grasicy wykazuje ekstrakt C, natomiast siła działania ekstraktu B
jest porównywalna do siły działania metotreksatu. Stwierdzono również, że eksperymentalne
wywołanie CIA u myszy powoduje spadek odsetka i liczby limfocytów CD4+ i CD8+ w
śledzionie, natomiast nie wpływa na limfocyty B i subpopulacje limfocytów T węzłów
chłonnych krezkowych. Podanie ekstraktu C i B z ziela Caltha palustris L., a także
metotreksatu wywiera działanie korygujące w stosunku do splenocytów CD8+, a ponadto
zwiększa odsetek i liczbę bezwzględną limfocytów CD8+ oraz powoduje wzrost odsetka
limfocytów T CD4+ i spadek odsetka limfocytów B (CD19+) w węzłach chłonnych
krezkowych. Najsłabsze działanie obserwuje się po stosowaniu ekstraktu C. Natomiast siła
modulującego działania ekstraktu B z ziela Caltha palustris L. na wymienione populacje
limfocytów T obwodowych narządów limfatycznych jest porównywalna do siły działania
52
metotreksatu, przy czym lek ten wykazuje najsilniejsze działanie obniżające odsetek
limfocytów B (CD19+) w badanych narządach limfatycznych.
W nie opublikowanych badaniach własnych przeprowadzonych in vivo na myszach szczepu
wsobnego Balb/c, wykazano immunomodulujące ekstraktów B i C uzyskanych z suchego
ziela Caltha palustris L., które zależy zarówno od wielkości podanej dawki (0,1, 1 i 10
mg/kg), jak również od liczby kolejnych podań (podanie jednorazowe lub pięciokrotne w
odstępach 24 godzinnych). W powyższych badaniach wykazano, że pięciokrotne podanie
dootrzewnowe myszom ekstraktu B w badanych dawkach zmniejsza odsetek limfocytów T
CD3+ i CD4+ w węzłach chłonnych krezkowych, natomiast zwiększa odsetek limfocytów B
(CD19+). Z kolei w śledzionie obserwuje się wzrost odsetka limfocytów T a spadek odsetka
limfocytów B. Słabsze działanie na ekspresję receptorów CD3+, CD4+ i CD19+ obserwowano
po jednorazowym podaniu ekstraktu B w badanych dawkach. Wykazano również, że
pięciokrotne podanie myszom zdrowym ekstraktu C w najwyższej badanej dawce (10 mg/kg)
zwiększa odsetek dojrzałych pojedynczo-pozytywnych tymocytów CD4+, odsetek limfocytów
CD4+ i CD19+ w śledzionie oraz odsetek limfocytów CD19+
w węzłach chłonnych
+
krezkowych, natomiast obniża odsetek limfocytów T CD3 CD4+ i CD8+ w węzłach
chłonnych krezkowych. Pięciokrotne podanie ekstraktu C w niższych dawkach (1 i 0,1
mg/kg) wykazuje słabsze działanie na limfocyty T i B narządów limfatycznych, a
jednorazowe podanie ekstraktu C niezależnie od wielkości dawki nie wpływa na odsetek
limfocytów T i B w badanych narządach limfatycznych. Z kolei w opublikowanych
badaniach in vitro przeprowadzonych na hodowlach ludzkich prawidłowych limfocytów a
także na hodowli linii komórek Raji (limfocyty B białaczki człowieka) określono w
zależności od wielkości stężenia aktywność immunotropową obu ekstraktów wyizolowanych
z ziela Caltha palustris L. [45]. Powyższe przeprowadzone badania in vitro dokumentują
różnice w efekcie immunotropowego działania ekstraktu C i B wyizolowanego z ziela Caltha
palustris L. Ekstrakt B wywiera działanie supresyjne manifestujące się zahamowaniem
aktywności
proliferacyjnej
prawidłowych
limfocytów
człowieka
stymulowanych
fitohemaglutyniną (PHA) oraz hamuje również aktywność proliferacyjną komórek linii Raji.
Natomiast ekstrakt C wywiera in vitro działanie immunostymulujące, co wyrażone jest
nasileniem aktywności proliferacyjnej prawidłowych limfocytów człowieka stymulowanych
mitogenem (PHA). Natomiast ekstrakt C nie wpływa na zdolność proliferacyjną i indeks
mitotyczny komórek białaczki człowieka (linii Raji).
53
W dostępnym piśmiennictwie niewiele jest badań dotyczących wpływu ekstraktów roślinnych
na subpopulacje limfocytów T i B myszy z wywołanym CIA. W badaniach
przeprowadzonych przez Lee i wsp. [88] na myszach szczepu wsobnego DBA/1J z
eksperymentalnie wywołanym CIA określono wpływ ekstraktu z Chelidonium majus (CME)
na populacje limfocytów T i B obwodowych narządów limfatycznych. Badany ekstrakt
podawano doustnie, w dawkach 400 i 40 mg/kg, codziennie przez okres 3 tygodni począwszy
od 21 dnia eksperymentu. W badaniach stwierdzono, że stosowanie ekstraktu z Chelidonium
majus w przebiegu CIA powoduje spadek liczby limfocytów śledziony i węzłów chłonnych,
spadek liczby komórek o fenotypie CD4+ w śledzionie (400, 40 mg/kg) i węzłach chłonnych
(400 mg/kg) oraz niezależnie od wielkości podanej dawki obserwowano również spadek
liczby limfocytów B CD19+ w śledzionie i węzłach chłonnych.
Z kolei Park i wsp. [106] w badaniach wykonanych na mysim modelu kolagenowego
zapalenia stawów oceniał efekt działania na populacje limfocytów krwi obwodowej
mieszanki ziołowej SI000413 składającej się z ekstraktów z roślin Pyrolae herba i
Trachelospermi Aulis. W badaniach wykazano, że eksperymentalne wywołanie u myszy CIA
powoduje w krwi obwodowej spadek subpopulacji limfocytów T (CD3+CD4+, CD3+CD8+ )
oraz limfocytów B (CD3-B220+). Natomiast stosowanie w przebiegu CIA mieszanki ziołowej
SI000413 powoduje restytucję limfocytów T do wartości fizjologicznych oraz statystycznie
istotnie zwiększa liczbę limfocytów B w krwi obwodowej.
W dostępnym piśmiennictwie opublikowane są dane dotyczące wpływu metotreksatu na
populacje limfocytów krwi pacjentów chorych na reumatoidalne zapalenie stawów (RZS). I
poddanych terapii metotreksatem. Lacki i wsp. [83] na podstawie przeprowadzonych badań
klinicznych wykazali, że u pacjentów chorych na reumatoidalne zapalenie stawów (RZS)
poddanych terapii metotreksatem przez okres 12 miesięcy dochodzi do istotnego obniżenia
liczby limfocytów B (komórek CD19+) we krwi obwodowej. Z kolei Herman i wsp. [56] na
podstawie przeprowadzonych badań klinicznych zaobserwowali, że u pacjentów z aktywną
postacią reumatoidalnego zapalenia stawów dochodzi do obniżenia liczby limfocytów
wykazujących ekspresję antygenów CD4+CD28+ i CD4+CD28-, natomiast u pacjentów z
występującą nieaktywną postacią tego schorzenia obserwowany jest istotny wzrost liczby
limfocytów CD4+CD28+. W badaniach wykazano, że stosowanie w terapii RZS metotreksatu
nie zmienia liczby limfocytów CD4+CD28-.
54
W obecnej pracy określono wpływ ekstraktów C i B z ziela Caltha palustris L. i metotreksatu
podawanych myszom z eksperymentalnie wywołanym kolagenowym zapalenie stawów na
odsetek limfocytów T regulatorowych (Treg) w śledzionie
wykazujących ekspresję
antygenów CD4+CD25+Foxp3+. W badaniach stwierdzono, że eksperymentalne wywołanie u
myszy CIA powoduje przemijający wzrost odsetka śledzionowych limfocytów T
wykazujących ekspresję antygenów CD4+CD25+Foxp3+. Istotny wzrost odsetka limfocytów T
regulatorowych w śledzionie stwierdzono w 43 dobie doświadczenia, natomiast w 47 dobie
doświadczenia nie obserwowano różnic pomiędzy
odsetkiem Treg w śledzionie myszy
zdrowych a odsetkiem Treg w śledzionie myszy z eksperymentalnie wywołanym CIA. W
obecnych badaniach uzyskane wyniki badań są zbieżne z wynikami otrzymanymi przez
Fujimoto i wsp. [43], którzy stwierdzili, że wywołanie u myszy szczepu wsobnego DBA/1J
powoduje istotny wzrost w śledzionie limfocytów Foxp3+ Treg w porównaniu do grupy
myszy zdrowych. Autorzy badań sugerują, że dodatni bilans (up-regulation) populacji
limfocytów T regulatorowych w przebiegu CIA może być odzwierciedleniem fizjologicznego
zapobiegawczego mechanizmu, który jest odpowiedzialny za regulację niepożądanej
odpowiedzi autoimmunologicznej. Również Ko i wsp. [77] stosując technikę mikroskopii
konfokalnej stwierdzili, że u myszy z wywołanym CIA w porównaniu do grupy zwierząt
zdrowych obserwuje się w śledzionie i stawach wzrost liczby limfocytów T wykazujących
ekspresję antygenów CD4+CD25+Foxp3+. Z kolei Nguyen i wsp. [101]
w badaniach
wykonanych na myszach transgenicznych K/BxN, u których spontanicznie rozwija się
zapalenie stawów stwierdzili , że do wzrostu tej populacji limfocytów T dochodzi już w
początkowym okresie rozwoju stanu zapalnego stawów. Natomiast badania kliniczne
przeprowadzone na pacjentach z występującą aktywną postacią reumatoidalnego zapalenia
stawów charakteryzują się istotnym zróżnicowaniem dotyczącym wpływu toczącego się
procesu zapalnego na liczbę limfocytów T regulatorowych. W badaniach klinicznych
przeprowadzonych na pacjentach z aktywną postacią RZS Han i wsp. [52] stwierdzili wzrost
liczby Treg w krwi obwodowej, z kolei badania kliniczne przeprowadzone przez Liu i wsp.
[92] wskazują, że RZS nie wpływa na liczbę tej populacji komórek, natomiast Lawson i wsp.
[84] udokumentowali, że u pacjentów w przebiegu RZS dochodzi do zmniejszenia w krwi
obwodowej tej populacji limfocytów.
55
W obecnej pracy wykazano, że podawanie obu badanych ekstraktów z ziela Caltha palustris
L. oraz metotreksatu powoduje obniżenie w śledzionie odsetka limfocytów T regulatorowych
wykazujących ekspresję antygenów CD4+CD25+Foxp3+. Najsłabsze i najkrótsze działanie
wykazuje ekstrakt C, natomiast najsilniejsze działanie obniżające odsetek limfocytów T
regulatorowych wykazuje ekstrakt B. W dostępnym piśmiennictwie opublikowane są dane
dotyczące wpływu ekstraktów roślinnych na populacje limfocytów T regulatorowych w
przebiegu CIA. Park i wsp.[107] określili u myszy szczepu wsobnego DBA/1J z wywołanym
CIA wpływ proantycyjanidowego ekstraktu z pestek winogron (GSPE) na różnicowanie
komórek T ekspresjonujących czynnik transkrypcyjny Foxp3. Autorzy stwierdzili stwierdzili
wzrost liczby komórek T CD4+CD25+Foxp3+ po stosowaniu GSPE. Z kolei Lee i wsp. [88]
w badaniach na myszach szczepu wsobnego z eksperymentalnie wywołanym CIA podawali
metanolowy ekstrakt z Chelidonium majus w dawkach 400 i 40 mg/kg. Autorzy badań
stwierdzili stymulujący wpływ badanego ekstraktu na liczbę limfocytów CD4+CD25+ w
śledzionie myszy z wywołanym CIA.
W obecnych badaniach stwierdzono, że stosowanie metotreksatu podobnie jak badanych
ekstraktów obniża odsetek tej populacji komórek w śledzionie. Uzyskane wyniki są sprzeczne
z opublikowanymi badaniami Xinqiang i wsp.[148], którzy wykazali, że podawanie doustne
szczurom z występującą ustabilizowaną postacią CIA metotreksatu w niskich dawkach
(1mg/kg/tydzień) powoduje wzrost odsetka limfocytów T regulatorowych w śledzionie.
Uzyskane działanie obniżające odsetek limfocytów T regulatorowych w śledzionie przez
stosowanie badanych ekstraktów z ziela Caltha palustris L. lub metotreksatu nie jest
korzystne w przebiegu CIA. Niedobór tej populacji limfocytów T (CD4+CD25+) może
powodować spontaniczny rozwój schorzenia autoimmunologicznego a także zwiększać
ciężkość objawów klinicznych w przebiegu kolagenowego zapalenia stawów u myszy [97].
W obecnej pracy przedstawiono również wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz
metotreksatu na aktywność wydzielniczą limfocytów T myszy z wywołanym kolagenowym
zapaleniem stawów. W badaniach wykazano, że wywołanie u myszy CIA powoduje wzrost
stężenia IL-2 i INF-γ oraz cytokin prozapalnych IL-6, a zwłaszcza TNF-α - cytokiny
odpowiedzialnej zarówno za rozwój zapalenia stawów o podłożu autoimmunologicznym, jak
również za ciężkość objawów występujących w przebiegu tego zapalenia. Za rozwój
autoimmunologicznego zapalenia stawów oprócz TNF-α odpowiedzialne są też IL-1 i IL-6
56
[38]. Cytokiny te aktywują komórki śródbłonka i krążące leukocyty oraz prowadzą do
zwiększonej ekspresji licznych molekularnych adhezyn odgrywających istotną rolę we
wzmacnianiu przylegania leukocytów do śródbłonka naczyń, co jest wstępem do
przechodzenia leukocytów przez ścianę naczynia w drodze do ogniska zapalnego [9]. W
obecnych badaniach stwierdzono, że podawanie badanych ekstraktów z ziela Caltha palustris
L. oraz metotreksatu myszom z eksperymentalnie wywołanym kolagenowym zapaleniem
stawów istotnie obniża stężenie
TNF-α w stosunku do kontroli pozytywnej (myszy z
wywołanym CIA). Efekt działania obserwowany jest jedynie bezpośrednio po zakończonej
terapii badanymi związkami (43 doba doświadczenia), natomiast po kolejnych 5 dniach
trwania CIA (47 doba doświadczenia) obserwuje się wzrost stężenia tej cytokiny surowicy
krwi obwodowej w grupach myszy poddanych działaniu ekstraktu B oraz metotreksatu.
Istotnym efektem działania ekstraktu B wyizolowanego z ziela Caltha palustris L. jest
obserwowany w 43 dobie doświadczenia wzrost stężenia w surowicy krwi cytokiny IL-10,
której aktywność biologiczna związana jest z działaniem przeciwzapalnym [19].
W dostępnym piśmiennictwie brak jest opublikowanych badań dotyczących wpływu
ekstraktów z ziela Caltha palustris L. na stężenie cytokin we krwi wytwarzanych przez
limfocyty Th1/Th2 myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów. Natomiast
opublikowano wiele badań określających wpływ ekstraktów uzyskanych z różnych roślin na
aktywność wydzielniczą komórek jednojądrzastych myszy z wywołanym CIA. Shen i wsp. [
122] badali wpływ preparatu TBL-II, będącego mieszanką kilku chińskich ziół, na syntezę i
uwalnianie IL-6 i TNF-α przez komórki jednojądrzaste myszy z CIA. Autorzy badań
porównywali skuteczność terapii po stosowaniu preparatu TBL-II w zależności od wielkości
dawki i czasu stosowania. Badany ekstrakt roślinny podawano doustnie w dwóch dawkach :
niskiej - 100 mg/kg/dobę i wysokiej - 300 mg/kg/dobę przez okres 2 lub 8 tygodni. Wyniki
badań pozwoliły stwierdzić, że stosowanie preparatu TBL-II przez okres 2 tygodni w dawce
wysokiej (300 mg/kg/dobę) powoduje istotny spadek stężenia TNF-α w surowicy myszy,
natomiast stosowanie badanego preparatu w dawce niskiej (100 mg/kg/dobę) nie zmienia
stężenia tej cytokiny. Z kolei stężenia TNF-α oznaczane po ośmiotygodniowym okresie
podawania badanego ekstraktu roślinnego były poniżej granicy oznaczalności.
Z kolei Kim i wsp.[74] wykazali wzrost stężeń cytokin przeciwzapalnych IL-4 i IL-10 w
surowicy myszy z wywołanym CIA, u których przez okres 3 tygodni podawano doustnie
wodny ekstrakt z kory Ulmus davidiana w dawce dobowej 100 mg/kg. Autorzy powyższych
57
badań stwierdzili również istotne obniżenie stężenia TNF-α w płynie stawowym myszy
poddanych działaniu badanego ekstraktu z kory Ulmus davidiana.
Dane z piśmiennictwa potwierdzają zaobserwowany w obecnej pracy efekt hamującego
działania metotreksatu na syntezę i uwalnianie cytokin prozapalnych. Neurath i wps. [100]
zaobserwowali spadek wytwarzania TNF-α i INF-γ przez jednojądrzaste komórki śledziony
myszy szczepu DBA/1J z wywołanym CIA, które były
poddane działaniu MTX
dootrzewnowo, trzy razy w tygodniu przez okres 2 tygodni w dawkach: 10 mg/kg, 1 mg/kg,
0,1 mg/kg lub 0,01 mg/kg. Hodowle wyizolowanych mysich jednojądrzastych komórek
śledziony były stymulowane in vitro przez 48 godzin przeciwciałem anty - CD3/CD28 lub
octanem mirystynianem forbolu (PMA) bądź lipopolisacharydem (LPS). Również
zmniejszenie stężenia w surowicy krwi TNF-α pod wpływem stosowania MTX u szczurów
szczepu Spargue-Dawley z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów potwierdzają
badania wykonane przez Shahin i wsp.[120]. Z kolei Xinqiang i wsp. [148] w badaniach na
szczurach z wywołanym CIA i poddanych terapii metotreksatem przez doustne podawanie
leku w dawce 0,33 mg/kg co dwa dni (1mg/kg/tydzień) przez 4 tygodnie stwierdzili obniżenie
stężenia w surowicy TNF-α, natomiast wzrost stężenia cytokiny przeciwzapalnej jaką jest IL10.
W obecnej pracy określono również wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz
metotreksatu na wytwarzanie IL-1β przez rezydentne makrofagi otrzewnowe stymulowane in
vitro LPS z E.coli wyizolowane od myszy szczepu DBA/1J z wywołanym CIA. W badaniach
stwierdzono, że ekstrakt B z ziela Caltha palustris oraz metotreksat przejściowo (43 doba
doświadczenia) zwiększają syntezę i uwalnianie IL-1β przez mysie makrofagi otrzewnowe
stymulowane in vitro LPS z E.coli., natomiast po kolejnych 5 dobach (47 dzień
doświadczenia) obserwowano zmniejszenie syntezy i uwalniania IL-1β przez mysie
makrofagi otrzewnowe poddane stymulacji in vitro LPS po ich wyizolowaniu od myszy z
wywołanym CIA i poddanych działaniu ekstraktu B.
Przedstawione w pracy wyniki badań są częściowo zbieżne z badaniami innych Autorów ,
którzy określali wpływ na stężenie w surowicy lub wytwarzanie IL-1β przez mysie komórki
jednojądrzaste wyizolowane od myszy z wywołanym CIA i poddanych działaniu różnych
ekstraktów roślinnych. Kim i wsp.[75] badali wpływ ekstraktu saponinowego uzyskanego z
58
korzenia rośliny Panas ginseng C (RGSE) na stężenie IL-1β w surowicy myszy szczepu
DBA/1J z wywołanym CIA. Badany ekstrakt podawany doustnie w dawce 10 mg/kg przez
okres 21 dni, przy rozpoczęciu terapii w 26 dniu od momentu pierwszego wstrzyknięcia
kolagenu, powoduje istotne obniżenie stężenia IL-1β w surowicy krwi. Ponadto w badaniach
wykazano również zmniejszenie syntezy i uwalniania IL-1β przez jednojądrzaste komórki
śledziony wyizolowane od w/w myszy i poddane przez 48 godzin stymulacji in vitro LPS (5
µg/ml hodowli). Również Shen i wsp.[122] stwierdzili obniżenie stężenia IL-1β w surowicy
krwi myszy szczepu DBA/1J z wywołanym CIA, którym podawano doustnie preparat TBL-II
w dawce 300 mg/kg/dzień przez okres 2 tygodni.
Z kolei w dostępnym piśmiennictwie przedstawiony efekt działania metotreksatu na syntezę i
uwalnianie IL-1β różni się od efektu działania leku uzyskanego w obecnych badaniach.
Neurath i wps. [100] nie stwierdzili zmian w syntezie i uwalnianiu IL-1β przez jednojądrzaste
komórki śledziony myszy szczepu DBA/1J z wywołanym CIA, które były poddane działaniu
MTX dootrzewnowo, trzy razy w tygodniu przez okres 2 tygodni w dawkach: 10 mg/kg, 1
mg/kg, 0,1 mg/kg lub 0,01 mg/kg. Hodowle wyizolowanych mysich śledzionowych
jednojądrzastych komórek były stymulowane in vitro przez 48 godzin przeciwciałem anty CD3/CD28 lub octanem mirystynianem forbolu (PMA) bądź lipopolisacharydem (LPS). Z
kolei Shahin i wsp.[120] obserwowali obniżenie stężenia IL-1β w surowicy szczurów z
wywołanym CIA poddanych działaniu MTX w dawce 0,1 mg/kg/dobę przez 16 kolejnych
dni, przy czy metotreksat podawano doustnie od 28 dnia od momentu wstrzyknięcia pierwszej
dawki kolagenu.
W obecnej pracy dla oceny aktywności makrofagów otrzewnowych, stymulowanych in vitro
LPS z E.coli , pochodzących od myszy z wywołanym CIA poddanych wpływowi ekstraktów
z Caltha palustris L. oraz metotreksatu określono również zdolność wytwarzania tlenku azotu
(NO) przez te komórki. W badaniach stwierdzono, że wywołanie autoimmunologicznego
zapalenia stawów u myszy powoduje wzrost powoduje wzrost wytwarzania NO przez mysie
makrofagi otrzewnowe stymulowane in vitro LPS z E.coli. W badaniach wykazano nasilający
wpływ badanych ekstraktów z Caltha palustris L. i metotreksatu na wytwarzanie NO przez
mysie makrofagi otrzewnowe stymulowane in vitro LPS, przy czym najsilniejsze działanie
obserwowano w grupie myszy z wywołanym CIA i poddanych działaniu ekstraktu B. W
dostępnym piśmiennictwie dostępne są prace potwierdzające stymulujący wpływ roślinnych
59
frakcji polisacharydowych na syntezę tlenku azotu. Lee i wsp.[87] opisali znaczący wzrost
produkcji NO przez izolowane mysie (szczep B6C3F1) makrofagi otrzewnowe (nie
stymulowane LPS) poddane działaniu polisacharydowej frakcji ekstraktu z Salicornia
herbacea (SPS) w stężeniach 10 µg/ml, 50 µg/ml, 100 µg/ml przez 24 godziny. Ponadto
Autorzy powyższych badań uzyskali takie same wyniki przeprowadzając analogiczny
eksperyment na linii mysich komórek makrofagowych (RAW 264.7.) Efekt działania SPS
zależy od wielkości stężenia. Z kolei Cheng i wsp.[22] badali wpływ frakcji polisacharydowej
ekstraktu z Bupleurum smythii var. parvifolium w dawkach 20, 40 i 80 mg/kg stosowanego
doustnie przez 6 dni u myszy szczepu Balb/c na wytwarzanie NO przez makrofagi
otrzewnowe. Izolowane komórki inkubowano przez 24 godziny w samym medium lub z
dodatkiem LPS, a następnie mierzono stężenie wydzielonego NO. Autorzy stwierdzili
niezależnie od wielkości podanej dawki stymulację wytwarzania NO przez makrofagi
otrzewnowe po inkubacji w samym medium oraz hamowanie wytwarzania tlenku azotu przez
te komórki po inkubacji z silnym stymulatorem jakim jest LPS, przy czym hamowanie
wytwarzania NO przez mysie makrofagi otrzewnowe obserwowano po podaniu frakcji
polisacharydowej ekstraktu z Bupleurum smythii var. parvifolium w dawce 40 i 80 mg/kg.
Omata i wsp. [103] zbadali wpływ metotreksatu na produkcje ex vivo tlenku azotu przez
makrofagi otrzewnowe pobrane od szczurów zdrowych oraz z wywołanym adjuwantowym
zapaleniem stawów (AIA). Lek podawany był zwierzętom chorym w dwóch dawkach, tj.
0,05 mg/kg i 0,1 mg/kg doustnie codziennie w dwóch schematach tj. profilaktycznie (od 0-22
dnia eksperymentu) i leczniczo (od 14-22 dnia eksperymentu). Natomiast zwierzęta zdrowe
otrzymywały metotreksat w dawce 0,1 mg/kg przez 21 dni (od 0-22 dnia eksperymentu).
Makrofagi zostały wyizolowane od zwierząt w 22 dniu doświadczenia i inkubowane przez 24
godziny z LPS z E.coli
w stężeniu 30 ng/ml hodowli. Następnie mierzono ilość
wytworzonego NO metodą Grieesa. Autorzy badań stwierdzili, że MTX nie wpływa na
produkcję NO przez wyizolowane od zwierząt zdrowych makrofagi otrzewnowe
stymulowane in vitro LPS, a także przez wyizolowane komórki od szczurów z wywołanym
adjuwantowym zapaleniem stawów poddanych terapii metotreksatem. Natomiast stwierdzono
wpływ hamujący metotreksatu, jeżeli lek podawano w dawce 0.1 mg/kg profilaktycznie, czyli
od 0 do 22 dnia eksperymentu.
60
W obecnej pracy stwierdzono niewielki wpływ ekstraktów z Caltha palustris L. na aktywność
fagocytarną granulocytów i monocytów krwi obwodowej myszy z wywołanym kolagenowym
zapaleniem stawów. Jedynie ekstrakt B 5 dni po podaniu ostatniej dawki (w 47 dobie
doświadczenia)
powoduje
wzrost
aktywności
fagocytarnej
monocytów
i
odsetka
fagocytujacych granulocytów (odsetka monocytów fagocytujących i liczby sfagocytowanych
bakterii) w stosunku do kontroli pozytywnej (myszy z wywołanym CIA). Z kolei metotreksat
wykazuje działanie hamujące na odsetek granulocytów fagocytujących i odsetek monocytów
fagocytujacych oraz średniej wartości FL dla monocytów.
W dostępnym piśmiennictwie brak jest doniesień na temat wpływu ziela Caltha palustris L.
na aktywność fagocytarną granulocytów i monocytów krwi myszy z CIA.
Natomiast dostępna jest praca [110] dokumentująca wpływ in vitro frakcji polisacharydowej
ekstraktu z Silene vulgaris na aktywność fagocytarną ludzkich monocytów krwi obwodowej,
w której Autorzy wykazują wzrost aktywności fagocytarnej monocytów krwi obwodowej
poddanych działaniu kilku frakcji z Silene vulgaris w stężeniach 15 lub 50 µg/ml hodowli.
Ponadto należy zwrócić uwagę na szereg danych dostępnych w piśmiennictwie i
dokumentujących w przeważającej większości stymulujący wpływ polisacharydowych frakcji
ekstraktów roślinnych na aktywność fagocytarną makrofagów. Moretao i wsp. [96] w
badaniach na myszach szczepu albino Swiss, którym podawano dootrzewnowo preparat
ARAGAL (frakcję kwaśnych heteropolisacharydów wyizolowanych z gumy drzewa
Anadenanthera colubrina) w dawkach 100, 250, lub 500 mg/kg stwierdzili na podstawie cech
morfologicznych, dawkozależny wzrost liczby aktywnych makrofagów
w porównaniu z
grupa kontrolną. Autorzy badań wykazali również wzrost aktywności fagocytarnej
makrofagów mysich inkubowanych przez 24 godziny z preparatem ARAGAL w stężeniach:
25, 50 lub 100 mg/ml hodowli. Również stymulujący wpływ na aktywność fagocytarną
mysich makrofagów otrzewnowych wywiera kwaśna frakcja polisacharydowa wyizolowana z
korzenia Panax ginseng [123], a także frakcja polisacharydowa ekstraktu z liści Perilla
frutescens var. crispa [82].
W dostępnym piśmiennictwie opublikowane są badania dotyczące hamującego działania
metotreksatu na aktywność fagocytarną prawidłowych ludzkich granulocytów in vitro. W
badaniach wykazano występującą zależność pomiędzy wielkością stężenia metotreksatu a
spadkiem aktywności fagocytarnej komórek [64].
61
W wykonanych badaniach własnych stwierdzono w 47 dobie eksperymentu pod wpływem
ekstraktu B normalizację zdolności bójczej monocytów krwi obwodowej myszy z CIA oraz
hamujący wpływ metotreksatu na ten wskaźnik w 43 dobie doświadczenia.
Wyniki własne w/w zakresie, dotyczące ekstraktów nie potwierdziły danych pochodzących z
badań in vitro wcześniej opublikowanych przez Gąsiorowskiego i wsp. [45]. Autorzy badań
wykazali, że ekstrakt C z ziela Caltha palustris L. wywiera działanie immunostymulujące, co
wyrażone jest zwiększeniem aktywności bójczej granulocytów człowieka, zarówno
spoczynkowych jak i stymulowanych octanem mirystynianu forbolu (PMA). Z kolei wg
Autorów ekstrakt B wywiera działanie supresyjne, co wyrażone jest osłabieniem zdolności
wytwarzania reaktywnych form tlenu przez granulocyty człowieka, zarówno spoczynkowe
jak i aktywowane PMA.
Z kolei hamujący wpływ metotreksatu na zdolność bójczą granulocytów
wykazano w
badaniach Şener’a i wsp.[118], w których stwierdzono upośledzenie funkcji wybuchu
tlenowego neutrofilów (spadek indeksu stymulacji neutrofilów przez PMA) krwi obwodowej
szczurów szczepu Wistar poddanych działaniu metotreksatu w jednorazowej, dootrzewnowej
dawce 20 mg/kg. Taki sam efekt działania MTX opisywany jest również w badaniach Şener
[117] i Cetiner [20].
W obecnej pracy określano także wpływ obu ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz
MTX na odpowiedź humoralną myszy immunizowanych SRBC, u których wywołano
kolagenowe zapalenie stawów. W doświadczeniach przeprowadzonych na myszach z
wywołanym CIA i immunizowanych SRBC wykazano obniżenie liczby komórek
produkujących przeciwciała anty-SRBC oraz spadek miana hemaglutynin całkowitych w
przebiegu stanu zapalenia stawów.
Badane ekstrakty z ziela Caltha palustris L. oraz
metotreksat nasilają supresję pierwotnej odpowiedzi humoralnej na wprowadzony antygen
grasiczozależny co wyrażone jest
istotnym spadkiem liczby limfocytów śledzionowych
produkujących przeciwciała hemolityczne anty-SRBC (PFC)
całkowitych.
62
oraz miana hemaglutynin
W badaniach na myszach szczepu DBA/1J immunizowanych SRBC z wywołanym CIA
Asano i wsp.[11] określali wpływ ekstraktu z Tripterygium wilfordii Hook f. (TWH) na
wielkość miana hemaglutynin anty-SRBC. Myszy były immunizowane SRBC w dniu 0 , a
krew do badań została skolekcjonowana dnia 14, natomiast ekstrakt TWH podawany był w
dawkach: 240, 320, 400, 410, i 420 µg/kg doustnie przez 14 kolejnych dni, począwszy od
dnia immunizacji. Autorzy powyższych badań stwierdzili istotne działanie supresyjne
ekstraktu TWH podawanego w najwyższych dawkach 400, 410, i 420 µg/kg.
Z kolei w dostępnym piśmiennictwie opublikowane są prace wskazujące na zróżnicowane
efekty działania metotreksatu na odpowiedź humoralną. Efekt działania metotreksatu na
odpowiedź humoralną jest zależny przede wszystkim od wielkości podanej dawki, liczby
kolejnych dawek oraz momentu podania w stosunku do stymulacji antygenem.
W latach 80-tych Dimitrieva i wsp [34] stwierdziła brak hamowania odpowiedzi humoralnej
po jednorazowym podaniu MTX w dawce 0,5 mg/kg m.c. w czasie 1-10 dni przed
immunizacją. Z kolei zastosowanie MTX 6-9 dni przed podaniem antygenu, powodowało
stymulację odpowiedzi, natomiast stosowanie leku codzienne przez 6 dni przed immunizacją
skutkowało brakiem istotnych zmian. Jedynie podawanie metotreksatu przez 7-8 dni przed
immunizacją znamiennie obniżało odpowiedź humoralną. Autorzy badań uważają, że czas
odnowy populacji komórek immunokompetentnych śledziony myszy to 6-9 dni. Z kolei Lin
[89] zaobserwował zależny od schematu podawania MTX efekt obniżenia liczby PFC u
myszy immunizowanych SRBC w 4 dniu od podania antygenu. Autor powyższych badań
wykazał, że efektem jednorazowej iniekcji MTX 24 godziny po immunizacji jest
zmniejszenie liczby PFC. Również obniżenie odpowiedzi humoralnej po stymulacji SRBC
obserwowano po kilkukrotnym podaniu parenteralnym MTX w odstępach 6 godzinnych. Z
kolei najsilniejsze zahamowanie liczby komórek produkujących przeciwciała anty-SRBC
obserwowano po dwukrotnym w odstępie 14 godzin podaniu MTX. Natomiast stymulujący
wpływ metotreksatu na liczbę PFC wykazali Romanychev’a i wsp. [113] . Badania
przeprowadzono na myszach szczepu DBA, którym podawano MTX w dawce 2,5 mg/kg m.c.
24 lub 72 godziny po immunizacji SRBC. Liczba PFC mierzona była w 4 - godzinnych
odstępach czasowych.
Stwierdzono wzrost odpowiedzi immunologicznej o wzorcu
„falowym”, wyrażonej liczbą PFC, w porównaniu do odpowiedzi humoralnej grupy
kontrolnej o wzorcu „schodkowym” . W godzinach : 60, 70-76, 84-88 po immunizacji
wykazano znaczny wzrost PFC zarówno w grupie kontrolnej, jak i poddanej działaniu MTX.
63
Autorzy badań sugerują, że obniżenie liczby PFC wynikało ze zjawiska tzw.
„niezbilansowanego wzrostu”, a MTX nie zapobiega rekrutacji komórek prekursorowych
PFC czego skutkiem jest wzrost liczby PFC.
64
W+IOSKI
1. Eksperymentalnie wywołane u myszy kolagenowe zapalenie stawów (CIA) wyraża
sie obrzękiem, deformacjami kończyn i niesprawnością ruchową oraz zaburzeniami w
odpowiedzi immunologicznej komórkowej i humoralnej.
2. Ekstrakt B z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksat zmieniają przebieg kliniczny
eksperymentalnie wywołanego u myszy kolagenowego zapalenia stawów (CIA).
Takiego działania nie wykazuje ekstrakt C z ziela Caltha palustris L.
3. Efekt hamującego wpływu ekstraktu B z ziela Caltha palustris L. na rozwój i przebieg
kliniczny eksperymentalnie wywołanego u myszy kolagenowego zapalenia stawów
jest słabszy niż metotreksatu.
4. Badane ekstrakty B i C z ziela Caltha plaustris L. oraz metotreksat wywierają
działanie normalizujące na badane wskaźniki odpowiedzi komórkowej oraz hamują
odpowiedź humoralną myszy z eksperymentalnie wywołanym zapaleniem stawów o
podłożu autoimmunologicznym.
5. Siła i kierunek działania ekstraktu B z ziela Caltha palustris L. na badane wskaźniki
immunologiczne myszy z eksperymentalnie wywołanym kolagenowym zapaleniem
stawów są porównywalne do efektu działania metotreksatu, leku rutynowo
stosowanego w terapii reumatoidalnego zapalenia stawów u ludzi. Efekt działania
ekstraktu C z ziela Caltha palustris L. na odpowiedź immunologiczną myszy w
przebiegu kolagenowego zapalenia stawów jest istotnie słabszy.
65
PIŚMIE++ICTWO
1.
Allison AC.: Immunosuppressive drugs: the first 50 years and a glance forward.
Immunopharmacology. 2000; 47(2-3), 63-83.
2.
Andrade P., Visser-Vandewalle V., Hoffmann C., Steinbusch H .W. M., Daemen
M.A., Hoogland G.: Role of TNF-alpha during central sensitization in preclinical
studies. Neurol Sci 2011; 32(5), 757-771.
3.
Anonim: CIMZIA® - Charakterystyka produktu leczniczego.
http://www.ema.europa.eu/docs/pl_PL/document_library/EPAR__Product_Information/human/001037/WC500069763.pdf
4.
Anonim: ENBREL® - Charakterystyka produktu leczniczego.
http://www.ema.europa.eu/docs/pl_PL/document_library/EPAR__Product_Information/human/000262/WC500027361.pdf
5.
Anonim: HUMIRA® - Charakterystyka produktu leczniczego.
http://www.ema.europa.eu/docs/pl_PL/document_library/EPAR__Product_Information/human/000481/WC500050870.pdf
6.
Anonim: KINERET® - Charakterystyka produktu leczniczego.
http://www.ema.europa.eu/docs/pl_PL/document_library/EPAR__Product_Information/human/000363/WC500042310.pdf
7.
Anonim: MABTHERA® - Charakterystyka produktu leczniczego.
http://www.ema.europa.eu/docs/pl_PL/document_library/EPAR__Product_Information/human/000165/WC500025821.pdf
8.
Anonim: ORENCIA® - Charakterystyka produktu leczniczego.
http://www.ema.europa.eu/docs/pl_PL/document_library/EPAR__Product_Information/human/000701/WC500048935.pdf
9.
Anonim: REMICADE® - Charakterystyka produktu leczniczego.
http://www.ema.europa.eu/docs/pl_PL/document_library/EPAR__Product_Information/human/000240/WC500050888.pdf
10. Anonim: ROACTEMRA® - Charakterystyka produktu leczniczego.
http://www.ema.europa.eu/docs/pl_PL/document_library/EPAR__Product_Information/human/000955/WC500054890.pdf
11. Asano K., Matsuishi J., Yu Y., Kasahara T., Hisamitsu T.: Suppressive effects of
Tripterygium wilfordii Hook f., a traditional Chinese medicine, on collagen arthritis in
mice. Immunopharmacology 1998; 39(2), 117-126.
66
12. Bastian H., Zinke S., Egerer K., Breuer S., Safari F., Burmester GR., Feist E.: Effects
of early rituximab retreatment in rheumatoid arthritis patients with an inadequate
response after the first cycle: retrospective arthritis cohort study. J Rheumatol. 2010;
37(5), 1069-1071.
13. Bennett C.L. Christie J., Ramsdell F., Brunkow M.E., Ferguson P.J., Whitesell L.,
Kelly T.E., Saulsbury F.T., Chance P.F., Ochs H.D.: The immune dysregulation,
polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome (IPEX) is caused by mutations
of FOXP3. Nat Genet. 2001; 27 (1), 20-21.
14. Borchers A.T., Keen C.L., Cheema G.S., Gershwin ME. The use of methotrexate in
rheumatoid arthritis. Semin Arthritis Rheum. 2004; 34 (1), 465-483.
15. Brühl H., Cihak J., Niedermeier M., Denzel A., Rodriguez Gomez M., Talke Y.,
Goebel N., Plachý J., Stangassinger M., Mack M.: Important role of interleukin-3 in
the early phase of collagen-induced arthritis. Arthritis Rheum. 2009; 60 (5), 1352-61.
16. Brunsberg U., Gustafsson K., Jansson L., Michaëlsson E., Ahrlund-Richter L.,
Pettersson S., Mattsson R., Holmdahl R.: Expression of a transgenic class II Ab gene
confers susceptibility to collagen-induced arthritis. Eur J Immunol. 1994; 24 (7),
1698-1702.
17. Butler D.M., Maini
R.N., Feldmann M.,
Brennan F.M.: Modulation of
proinflammatory cytokine release in rheumatoid synovial membrane cell cultures.
Comparison of monoclonal anti TNF-alpha antibody with the interleukin-1 receptor
antagonist. Eur Cytokine Netw. 1995 ; 6 (4), 225-230.
18. Cai X., Zhou H., Wong Y.F., Xie Y., Liu Z.Q., Jiang Z.H., Bian Z.X., Xu H.X., Liu
L.: Suppression of the onset and progression of collagen-induced arthritis in rats by
QFGJS,
a
preparation
from
an
anti-arthritic
Chinese
herbal
formula.
J
Ethnopharmacol. 2007 1; 110 (1), 39-48.
19. Cassatella M.A., Meda L., Bonora S., Ceska M., Constantin G.: Interleukin 10 (IL-10)
inhibits the release of proinflammatory cytokines from human polymorphonuclear
leukocytes. Evidence for an autocrine role of tumor necrosis factor and IL-1 beta in
mediating the production of IL-8 triggered by lipopolysaccharide. J Exp Med. 1993;
178(6), 2207-2211.
20. Cetiner M., Sener G., Sehirli A.O., Ekşioğlu-Demiralp E., Ercan F., Sirvanci S., Gedik
N., Akpulat S., Tecimer T., Yeğen B.C.: Taurine protects against methotrexateinduced toxicity and inhibits leukocyte death. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2005; 209
(1), 39-50.
67
21. Chełmońska-Soyta A., Miller R.B., Ruhnke L., Rosendal S.: Activation of murine
macrophages and lymphocytes by Ureaplasma diversum. Can. J. Vet Res. 1994; 58,
275-280.
22. Cheng X.Q. , Li H., Yue X.L., Xie J.Y., Zhang Y.Y., Di H.Y., Chen D.F.:
Macrophage immunomodulatory activity of the polysaccharides from the rootsof
Bupleurum smithii var. parvifolium. J Ethnopharmacol. 2010; 130 (2), 363-8.
23. Chesnut R.W., Grey H.M.: Antigen presentation by B cells and its significance in T-B
interactions. Adv Immunol. 1986; 39, 51-94.
24. Chizzolini C., Dayer J.M., Miossec P.: Cytokines in chronic rheumatic diseases: is
everything lack of homeostatic balance? Arthritis Res Ther. 2009; 11 (5), 246.
25. Cho M.L., Heo Y..J, Park M.K., Oh H.J., Park J.S., Woo Y.J., Ju J.H., Park S.H., Kim
H.Y., Min J.K.: Grape seed proanthocyanidin extract (GSPE) attenuates collageninduced arthritis. Immunol Lett. 2009; 124 (2), 102-110.
26. Choy E.H., Panayi G.S.: Cytokine Pathways and Joint Inflammation in Rheumatoid
Arthritis. N Engl J Med. 2001; 344 (12), 907-916,
27. Činčura F., Feráková V., Májovský J., Šomšak L., Záborský J.: Pospolite rośliny
środkowej Europy. Warszawa: Państwowe Wydawnictwo Rolnicze i Leśne, 1990.
28. Coelho P. M.G., Marques P.R., Gayer C.R., Vaz L.C., Neto J.F., Sabino K.C.:
Subacute toxicity evaluation of a hydroalcoholic extract of Pterodon pubescens seeds
in mice with collagen-induced arthritis. J Ethnopharmacol. 2001; 77 (2-3), 159-164.
29. Collins T., Read M.A., Neish A.S., Whitley M.Z., Thanos D., Maniatis T.:
Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and
cytokine-inducible enhancers. FASEB J. 1995; 9 (10), 899-909.
30. Cook A.D., Stockman A., Brand C.A., Tait B.D., Mackay I.R., Muirden K.D., Bernard
C.C., Rowley M.J.: Antibodies to type II collagen and HLA disease susceptibility
markers in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 1999; 42 (12), 2569-2576.
31. Corthay A., Johansson A., Vestberg M., Holmdahl R.: Collagen-induced arthritis
development requires alpha beta T cells but not gamma delta T cells: studies with T
cell-deficient (TCR mutant) mice. Int Immunol. 1999; 11 (7), 1065-1073.
32. Dayer J.M.: The pivotal role of interleukin-1 in the clinical manifestations of
rheumatoid arthritis. Rheumatology (Oxford) 2003; 42(2), :ii3-10.
33. Di Paola R., Cuzzocrea S.: Predictivity and sensitivity of animal models of arthritis.
Autoimmun Rev. 2008; 8 (1), 73-75.
68
34. Dmitrieva N.B., Uteshev B.S.: Effect of methotrexate on the early stages of
immunogenesis in mice. Farmakol Toksikol. 1988; 51 (3), 75-78.
35. Edwards J.C., Cambridge G., Abrahams V.M.: Do self-perpetuating B lymphocytes
drive human autoimmune disease? Immunology 1999; 97 (2), 188-196.
36. Ehrenstein M.R., Evans J.G., Singh A., Moore S., Warnes G., Isenberg D.A., Mauri
C.: Compromised function of regulatory T cells in rheumatoid arthritis and reversal by
anti-TNFalpha therapy. J Exp Med. 2004; 200 (3), 277-285.
37. Ekambaram S., Perumal S.S., Subramanian V.: Evaluation of antiarthritic activity of
strychnos potatorun Linn sedes in Freund’s adjuvant induced arthritic rat model. BMC
Complement Altern Med. 2010;10, s.56.
38. Feldmann M., Brennan F.M., Maini R.N.: Role of cytokines in rheumatoid arthritis.
Annu Rev Immunol. 1996 ; 14, 397-440.
39. Fiechtner J.J., Miller D.R., Starkebaum G.: Reversal of neutropenia with methotrexate
treatment in patients with Felty's syndrome. Correlation of response with neutrophilreactive IgG. Arthritis Rheum. 1989; 32 (2), 194-201.
40. Firestein G.S.: Evolving concepts of rheumatoid arthritis. Nature 2003; 423(6937),
356-361.
41. Fleischmann R.M., Tesser J., Schiff M.H., Schechtman J., Burmester G.R., Bennett
R., Modafferi D., Zhou L., Bell D., Appleton B.: Safety of extended treatment with
anakinra in patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 2006 ; 65 (8), 10061012.
42. Fontenot J.D., Gavin M.A., Rudensky A.Y. Foxp3 programs the development and
function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nat Immunol. 2003; 4(4), 330-336.
43. Fujimoto M., Serada S., Mihara M., Uchiyama Y., Yoshida H., Koike N., Ohsugi Y.,
Nishikawa T., Ripley B., Kimura A., Kishimoto T., Naka T.: Interleukin-6 blockade
suppresses autoimmune arthritis in mice by the inhibition of inflammatory Th17
responses. Arthritis Rheum. 2008; 58 (12), 3710-3719.
44. Furst D.E., Schiff M.H., Fleischmann R.M., Strand V., Birbara C.A., Compagnone D.,
Fischkoff S.A., Chartash E.K.: Adalimumab, a fully human anti tumor necrosis factoralpha monoclonal antibody, and concomitant standard antirheumatic therapy for the
treatment of rheumatoid arthritis: results of STAR (Safety Trial of Adalimumab in
Rheumatoid Arthritis). J Rheumatol. 2003; 30 (12), 2563-2571.
45. Gąsiorowski K., Brokos B., Kuduk – Jaworska J., Rułko F.: Searching for
imunologically active polysaccharides . Part II . Boiological activity of
69
polysaccharides fractions isolated from Caltha palustris L. Herba Polonica 1994; XL (
4), 180-187.
46. Genestier L., Paillot R., Fournel S., Ferraro C., Miossec P., Revillard J.P.:
Immunosuppressive properties of methotrexate: apoptosis and clonal deletion of
activated peripheral T cells. J Clin Invest. 1998 ;102 (2), 322-328.
47. Genestier L., Paillot R., Quemeneur L., Izeradjene K., Revillard J.P.: Mechanisms of
action of methotrexate. Immunopharmacology. 2000; 47(2-3), 247-257.
48. Genovese M.C., Schiff M., Luggen M., Becker J.C., Aranda R., Teng J., Li T.,
Schmidely N., Le Bars M., Dougados M.: Efficacy and safety of the selective costimulation modulator abatacept following 2 years of treatment in patients with
rheumatoid arthritis and an inadequate response to anti-tumour necrosis factor
therapy. Ann Rheum Dis. 2008; 67(4), 547-554.
49. Gerards A.H., de Lathouder S., de Groot E.R., Dijkmans B.A., Aarden L.A.:
Inhibition of cytokine production by methotrexate. Studies in healthy volunteers and
patients with rheumatoid arthritis. Rheumatology 2003; 42(10), 1189-1196.
50. Germplasm Resources Information Network (GRIN): http://www.ars-grin.gov/cgibin/npgs/html/taxon.pl?8657
51. Hakim A.W., Dong X., Cairns B.E.: TNFα mechanically sensitizes masseter muscle
nociceptors by increasing prostaglandin E2 levels. J Neurophysiol. 2011; 105(1), 154161.
52. Han G.M., O'Neil-Andersen N.J., Zurier R.B., Lawrence D.A., CD4+CD25high T cell
numbers are enriched in the peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis.
Cell Immunol. 2008; 253(1–2), 92–101.
53. Handoo S.: A Survey of Plants Used for Wound Healings in Animals. Vet Scan 2006;
1 (1), Article 2.
54. Hauser S.P., Udupa K.B., Lipschitz D.A.: Murine marrow stromal response to
myelotoxic agents in vitro. Br J Haematol. 1996; 95(4), 596-604.
55. Henderson B. Thompson R.C., Hardingham T., Lewthwaite J.: Inhibition of
interleukin-1-induced synovitis and articular cartilage proteoglycan loss in the rabbit
knee by recombinant human interleukin-1 receptor antagonist. Cytokine 1991; 3 (3),
246-249.
56. Herman
S.,
Zurgil
N.,
Langevitz
P.,
Ehrenfeld
M.,
Deutsch
M.:
The
immunosuppressive effect of methotrexate in active rheumatoid arthritis patients vs.
70
its stimulatory effect in nonactive patients, as indicated by cytometric measurements
of CD4+ T cell subpopulations. Immunol Invest. 2004; 33(3), 351-362.
57. Hietala M.A., Jonsson I.M., Tarkowski A., Kleinau S., Pekna M.: Complement
deficiency ameliorates collagen-induced arthritis in mice. J Immunol. 2002; 169(1),
454-459.
58. Holm T.L., Nielsen J., Claesson M.H.: CD4+CD25+ regulatory T cells: I. Phenotype
and physiology. APMIS. 2004; 112(10), 629-641.
59. Holmdahl R., Bockermann R., Bäcklund J., Yamada H.: The molecular pathogenesis
of collagen-induced arthritis in mice-a model for rheumatoid arthritis. Ageing Res
Rev. 2002; 1(1), 135-147.
60. Holmdahl R., Jansson L., Larsson A., Jonsson R.: Arthritis in DBA/1 mice induced
with passively transferred type II collagen immune serum. Immunohistopathology and
serum levels of anti-type II collagen auto-antibodies. Scand J Immunol. 1990; 31 (2),
147-157.
61. Holmdahl R., Nordling C., Rubin K., Tarkowski A., Klareskog L.:
Generation of
monoclonal rheumatoid factors after immunization with collagen II-anti-collagen II
immune complexes. An anti-idiotypic antibody to anti-collagen II is also a rheumatoid
factor. Scand J Immunol. 1986; 24(2), 197-203.
62. Hori S., Nomura T., Sakaguchi S.:Foxp3 Control of Regulatory T Cell Development
by the Transcription Factor. Science 2003; 299(5609), 1057-61.
63. Hudson L., Hay F.C.: Practical Immunology. Blackwell scientific Publications,
Oxford London, Edinburgh, Boston, Melbourne, 1970, 247-250.
64. Hyams J.S., Donaldson M.H., Metcalf J.A., Root R.K.: Inhibition of human
granulocyte function by methotrexate. Cancer Res. 1978; 38(3), 650-655.
65. Inamoto Y., Flowers M.E., Appelbaum F.R., Carpenter P.A., Deeg H.J., Furlong T.,
Kiem H.P., Mielcarek M., Nash R.A., Storb R.F., Witherspoon R.P., Storer B.E.,
Martin P.J.: A Retrospective Comparison of Tacrolimus versus Cyclosporine with
Methotrexate
for
Immunosuppression
after
Allogeneic
Hematopoietic
Cell
Transplantation with Mobilized Blood Cells Biol Blood Marrow Transplant. 2011;
17(7), 1088-1092.
66. Isomäki P., Punnonen J.: Pro- and anti-inflammatory cytokines in rheumatoid arthritis.
Ann Med. 1997; 29(6), 499-507.
71
67. Jerne N.K., Nordin A.A., Henry C.: The agar plaque technique for recognizing
antibody-producing cells.w: Cell bound antibodies.Red.: Amosi B., KoprowskiH.,
Wistar Institute Press, 1963,100.
68. Jiang J.B., Qiu J.D., Yang L.H., He J.P., Smith G.W., Li H.Q.: Therapeutic effect of
astragalus polysaccharides on inflammation and synovial apoptosis in rats with
adjuvant-induced arthritis. Int J Rheum Dis. 2010; 13(4), 396-405.
69. Joe B., Griffiths M.M., Remmers E.F., Wilder R.L.: Animal models of rheumatoid
arthritis and related inflammation. Curr Rheumatol Rep. 1999; 1(2), 139-48.
70. Joosten L.A.: IL-1 alpha beta blockade prevents cartilage and bone destruction in
murine type II collagen-induced arthritis, whereas TNF-alpha blockade only
ameliorates joint inflammation. J Immunol. 1999; 163(9), 5049-5055.
71. Keystone E., Genovese M.C., Klareskog L., Hsia E.C., Hall S., Miranda P.C., Pazdur
J., Bae S.C., Palmer W., Xu S., Rahman M.U.: Golimumab in patients with active
rheumatoid arthritis despite methotrexate therapy: 52-week results of the GOFORWARD study. Ann Rheum Dis. 2010; 69(6), 1129-1135. Erratum in: Ann Rheum
Dis. 2011; 70(1), 238-239.
72. Khattri R., Cox T., Yasayko S.A., Ramsdell F.: An essential role for Scurfin in
CD4+CD25+ T regulatory cells. Nat Immunol. 2003; 4(4), 337- 342.
73. Kim H., Song M.J.: Analysis and recordings of orally transmitted knowledge about
medicinal plants in the southern montanious region of Korea. J Ethnopharmacol.
2011; 134, 676-693.
74. Kim K.S., Lee S.D., Kim K.H., Kil S.Y., Chung K.H., Kim C.H.: Suppressive effects
of a water extract of Ulmus davidiana Planch (Ulmaceae) on collagen-induced
arthritis in mice. J Ethnopharmacol. 2005; 97(1), 65-71.
75. Kim K.R., Chung T.Y., Shin H., Son S.H., Park K.K., Choi J.H., Chung W.Y.: Red
ginseng saponin extract attenuates murine collagen-induced arthritis by reducing proinflammatory responses and matrix metalloproteinase-3 expression. Biol Pharm
Bull. 2010; 33(4), 604-610.
76. Kipen Y., Littlejohn G.O., Morand E.F.: Methotrexate use in systemic lupus
erythematosus. Lupus 1997; 6(4), 385-389.
77. Ko H.J., Cho M.L., Lee S.Y., Oh H.J., Heo Y.J., Moon Y.M., Kang C.M., Kwok S.K.,
Ju J.H., Park S.H., Park K.S., Kim H.Y.: CTLA4-Ig modifies dendritic cells from
mice with collagen-induced arthritis to increase the CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T
cell population. J Autoimmun. 2010; 34(2), 111-120.
72
78. Kohn B. Canine immune-mediated polyarthritis. EJCAP 2007; 17(2).
79. Kotake S., Udagawa N., Takahashi N., Matsuzaki K., Itoh K., Ishiyama S., Saito S.,
Inoue K., Kamatani N., Gillespie M.T., Martin T.J., Suda T.: IL-17 in synovial fluids
from patients with rheumatoid arthritis is a potent stimulator of osteoclastogenesis. J
Clin Invest. 1999; 103(9), 1345-1352.
80. Kremer J.M., Blanco R., Brzosko M., Burgos-Vargas R., Halland A.M., Vernon E.,
Ambs P., Fleischmann R.: Tocilizumab inhibits structural joint damage in rheumatoid
arthritis patients with inadequate responses to methotrexate: results from the doubleblind treatment phase of a randomized placebo-controlled trial of tocilizumab safety
and prevention of structural joint damage at one year. Arthritis Rheum. 2011; 63(3),
609-621.
81. Kuduk –Jaworska J., Rułko F., Gąsiorowski K.:Searching for imunologically active
polysaccharides. I preliminary investigations of polysaccharide fractions isolated from
Caltha palustris L. Herba Polonica 1993; XXXIX, (3); 103-112.
82. Kwon K.H., Kim K.I., Jun W.J., Shin D.H., Cho H.Y., Hong B.S.: In vitro and in vivo
effects of macrophage-stimulatory polysaccharide from leaves of Perilla frutescens
var. crispa. Biol Pharm Bull. 2002; 25(3), 367-371.
83. Lacki J.K., Mackiewicz S.H., Wiktorowicz K.E.: Lymphocyte phenotype studies of
rheumatoid arthritis patients treated with methotrexate. Arch Immunol Ther Exp 1994;
42(4), 287-290.
84. Lawson C.A. Brown A.K., Bejarano V., Douglas S.H., Burgoyne C.H., Greenstein
A.S., Boylston A.W., Emery P., Ponchel F., Isaacs JD.: Early rheumatoid arthritis is
associated with a deficit in the CD4+CD25high regulatory T cell population in
peripheral blood. Rheumatology 2006; 45(10), 1210–1217.
85. Leandro M., Edwards J., Cambridge G.: Clinical outcome in 22 patients with
rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion. Ann Rheum Dis. 2002;
61(10), 883–888.
86. Lee K.H., Choi E.M.: Effect of pine pollen extract on experimental chronic arthritis.
Phytother Res. 2009; 23(5), 651-657.
87. Lee K.Y., Lee M.H., Chang I.Y., Yoon S.P., Lim D.Y., Jeon Y.J. :Macrophage
activation by polysaccharide fraction isolated from Salicornia herbacea. J
Ethnopharmacol. 2006 103 (3), 372–378.
73
88. Lee Y.C., Kim S.H., Roh S.S., Choi H.Y., Seo Y.B. :Suppressive effects of
Chelidonium majus methanol extract in knee joint, regional lymph nodes, and spleen
on collagen-induced arthritis in mice. J Ethnopharmacol. 2007; 112(1), 40-48.
89. Lin H. Schedule-dependent effect of phase-specific cytotoxic agents on production of
hemolytic plaque-forming cells. J Natl Cancer Inst. 1976; 56(1), 95-99.
90. Lindqvist A.B, Bockermann R., Johansson Å.C.M, Nandakumar K.S., Johannesson
M., Holmdahl R.: Mouse models for rheumatoid arthritis. Trends in Genetics 2002;
18(6), 7-13.
91. Lipsky P.E.: Interleukin-6 and rheumatic diseases. Arthritis Res Ther. 2006; 8(2), 4.
92. Liu M.F. Wang C.R., Fung L.L., Lin L.H., Tsai C.N.: The presence of cytokinesuppressive CD4+CD25+ T cells in the peripheral blood and synovial fluid of patients
with rheumatoid arthritis. Scand. J. Immunol.2005; 62(3), 312–317.
93. Meephansan J., Ruchusatsawat K., Sindhupak W., Thorner P.S., Wongpiyabovorn J.
Effect of methotrexate on serum levels of IL-22 in patients with psoriasis. Eur J
Dermatol. 2011 Jun 9. [Epub ahead of print].
94. Metlay J.P., Puré E., Steinman R.M.: Control of the immune response at the level of
antigen-presenting cells: a comparison of the function of dendritic cells and B
lymphocytes. Adv Immunol. 1989;47, 45-116.
95. Mishell R.J., Dutton R.W.: Immunization of dissociated spleen cell cultures from
normal mice.J. Exp. Med. 1967; 126, 423-442.
96. Moretão M.P., Buchi D.F., Gorin P.A., Iacomini M., Oliveira M.B. :Effect of an acidic
heteropolysaccharide (ARAGAL) from the gum of Anadenanthera colubrina (Angico
branco) on peritoneal macrophage functions. Immunol Lett. 2003; 89(2-3), 175-185.
97. Morgan M.E. Sutmuller R.P., Witteveen H.J., van Duivenvoorde L.M., Zanelli E.,
Melief C.J., Snijders A., Offringa R., de Vries R.R., Toes R.E.: CD25+ cell depletion
hastens the onset of severe disease in collagen-induced arthritis. Arthritis Rheum.
2003; 48(5), 1452-1460.
98. Morgan M.E., Flierman R., van Duivenvoorde L.M., Witteveen H.J., van Ewijk W.,
van Laar J.M., de Vries R.R., Toes R.E.: Effective treatment of collagen-induced
arthritis by adoptive transfer of CD25+ regulatory T cells. Arthritis Rheum. 2005;
52(7), 2212-2221.
99. Nesbitt A., Fossati G., Bergin M., Stephens P., Stephens S., Foulkes R., Brown D.,
Robinson M., Bourne T.: Mechanism of action of certolizumab pegol (CDP870): in
74
vitro comparison with other anti-tumor necrosis factor alpha agents. Inflamm Bowel
Dis. 2007; 13(11), 1323-1332.
100. Neurath M.F., Hildner K., Becker C., Schlaak J.F., Barbulescu K., Germann T.,
Schmitt E., Schirmacher P., Haralambous S., Pasparakis M., Meyer Zum
Büschenfelde K.H., Kollias G., Märker-Hermann E.: Methotrexate specifically
modulates cytokine production by T cells and macrophages in murine collageninduced arthritis (CIA): a mechanism for methotrexate-mediated immunosuppression.
Clin Exp Immunol. 1999; 115(1), 42-55.
101. Nguyen L.T., Jacobs J., Mathis D., Benoist C.: Where FoxP3-dependent regulatory T
cells impinge on the development of inflammatory arthritis. Arthritis Rheum. 2007;
56(2), 509-520.
102. Ohno K., Yokoyama Y., Nakashima K., Setoguchi A., Fujino Y., Tsujimoto H.: Creactive protein concentration in canine idiopathic polyarthritis. J Vet Med Sci. 2006;
68(12), 1275-1279.
103. Omata T., Segawa Y., Inoue N., Tsuzuike N., Itokazu Y., Tamaki H.: Methotrexate
suppresses nitric oxide production ex vivo in macrophages from rats with adjuvantinduced arthritis. Res Exp Med 1997; 197(2), 81-90.
104. Panayi G.S.: B cells: a fundamental role in the pathogenesis of rheumatoid arthritis?
Rheumatology 2005; 44 (2) :ii3-ii7.
105. Panayi G.S.: T-cell-dependent pathways in rheumatoid arthritis. Curr Opin
Rheumatol. 1997; 9(3), 236-240.
106. Park J.H., Lee J.M., Kim S.N., Lee S.H., Jun S.H., You J.H., Ahn K.S., Kang H.
Treatment with SI000413, a new herbal formula, ameliorates murine collagen-induced
arthritis. Biol Pharm Bull. 2008;31(7), 1337-1342.
107. Park M.K., Park J.S., Cho M.L., Oh H.J., Heo Y.J., Woo Y.J., Heo Y.M., Park M.J.,
Park H.S., Park S.H., Kim H.Y., Min J.K.: Grape seed proanthocyanidin extract
(GSPE) differentially regulates Foxp3(+) regulatory and IL-17(+) pathogenic T cell in
autoimmune arthritis. Immunol Lett. 2011; 135(1-2), 50-58.
108. Pinedo H.M., Chabner B.A., Zaharko D.S., Bull J.M.: Evidence for early recruitment
of granulocyte precursors during high-dose methotrexate infusions in mice. Blood.
1976; 48(2), 301-307.
109. Popa C., Leandro M.J., Cambridge G., Edwards J.C.: Repeated B lymphocyte
depletion with rituximab in rheumatoid arthritis over 7 yrs. Rheumatology 2007; 46
(4), 626-630.
75
110. Popov S.V., Popova G.Y., Ovodova R.G., Bushneva O.A., Ovodov Y.S.: Effects of
polysaccharides from Silene vulgaris on phagocytes . Int. J. Immunopharmacol. 1999;
21(9), 617-624.
111. Rau R., Simianer S., van Riel P.L., van de Putte L.B., Krüger K., Schattenkirchner M.,
Allaart C.F., Breedveld F.C., Kempeni J., Beck K., Kupper H. Rapid alleviation of
signs and symptoms of rheumatoid arthritis with intravenous or subcutaneous
administration of adalimumab in combination with methotrexate. Scand J Rheumatol.
2004; 33(3),145-153.
112. Roark C.L., French J.D., Taylor M.A., Bendele A.M., Born W.K., O'Brien R.L.
Exacerbation of collagen-induced arthritis by oligoclonal, IL-17-producing gamma
delta T cells. J Immunol. 2007; 179(8), 5576-5583.
113. Romanycheva V., Babichev V.A., Uteshev B.S., Kalinkovitch A.G.: The kinetics of
inhibition with methotrexate and vinblastine of the primary immune response to sheep
red blood cells in mice. Folia Biol 1978; 24(5), 343-354.
114. Rowley M.J., Nandakumar K.S., Holmdahl R. The role of collagen antibodies in
mediating arthritis. Mod Rheumatol. 2008; 18(5), 429-441.
115. Rubin RL. : Drug-induced lupus. Toxicology 2005; 209(2), 135-147.
116. Seetharaman R., Mora A.L., Nabozny G., Boothby M., Chen Jin.: Essential Role of T
Cell NF-κB Activation in Collagen-Induced Arthritis. J Immunol 1999; 163(3), 15771583.
117. Sener G., Ekşioğlu-Demiralp E., Cetiner M., Ercan F., Sirvanci S., Gedik N., Yeğen
BC.: L-Carnitine ameliorates methotrexate-induced oxidative organ injury and inhibits
leukocyte death. Cell Biol Toxicol. 2006; 22(1), 47-60.
118. Sener G., Ekşioğlu-Demiralp E., Cetiner M., Ercan F., Yeğen B.C.: Beta-glucan
ameliorates methotrexate-induced oxidative organ injury via its antioxidant and
immunomodulatory effects. Eur J Pharmacol. 2006; 542(1-3), 170-178.
119. Senolt L., Vencovský J., Pavelka K., Ospelt C., Gay S. : Prospective new biological
therapies for rheumatoid arthritis Autoimmun Rev. 2009; 9(2), 102-107.
120. Shahin D., Toraby E.E., Abdel-Malek H., Boshra V., Elsamanoudy A.Z., Shaheen D.:
Effect of peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonist (pioglitazone) and
methotrexate on disease activity in rheumatoid arthritis (experimental and clinical
study).Clin Med Insights Arthritis Musculoskelet Disord. 2011;4, 1-10.
121. Sharma N., Sharma V.K., Seo S.Y.: Screening of some medicinal plants for antilipase activity. J Ethnopharmacol. 2005; 97(3), 453-456.
76
122. Shen X., Li C., Zhao H., Li S., Chen J., Kobayashi Y., Shen W.J.: Inhibitory effects of
a traditional Chinese herbal formula TBL-II on type II collagen-induced arthritis in
mice. Ethnopharmacol. 2011;134(2), 399-405.
123. Shin J.Y., Song J.Y., Yun Y.S., Yang H.O., Rhee D.K,. Pyo S.: Immunostimulating
effects of acidic polysaccharides extract of Panax ginseng on macrophage function.
Immunopharmacol Immunotoxicol. 2002; 24(3), 469-482.
124. Shivaprasad
H.,
Venkatesha,
Rajaiah
R.,
Berman
B.M.,
Moudgil
K.D.:
Immunomodulation of Autoimmune Arthritis by Herbal CAM. Evid Based
Complement Alternat Med 2011; vol. 2011, Article ID 986797, 13 pages.
125. Simsek I.: TNF inhibitors - new and old agents for rheumatoid arthritis. Bull NYU
Hosp Jt Dis. 2010; 68(3), 204-210.
126. Smolen J., Landewé R.B., Mease P., Brzezicki J., Mason D., Luijtens K., van
Vollenhoven R.F., Kavanaugh A., Schiff M., Burmester G.R., Strand V., Vencovsky
J., van der Heijde D. Efficacy and safety of certolizumab pegol plus methotrexate in
active rheumatoid arthritis: the RAPID 2 study. A randomised controlled trial. Ann
Rheum Dis. 2009; 68(6), 797-804.
127. Smolen J.S, Landewé R., Breedveld F.C., Dougados M., Emery P., Gaujoux-Viala C.,
Gorter S., Knevel R., Nam J., Schoels M., Aletaha D., Buch M., Gossec L., Huizinga
T., Bijlsma J.W., Burmester G., Combe B., Cutolo M., Gabay C., Gomez-Reino J.,
Kouloumas M., Kvien T.K., Martin-Mola E., McInnes I., Pavelka K., van Riel P.,
Scholte M., Scott D.L., Sokka T., Valesini G., van Vollenhoven R., Winthrop K.L.,
Wong J., Zink A., van der Heijde D.: EULAR recommendations for the management
of rheumatoid arthritis with synthetic and biological disease-modifying antirheumatic
drugs. Ann Rheum Dis. 2010; 69(6), 964-975.
128. Strømhaug A., Warren D.J., Slørdal L.: Effect of methotrexate on murine bone
marrow cells in vitro: evidence of a reversible antiproliferative action. Exp Hematol.
1995; 23(5), 439-443.
129. Stuart J.M., Dixon F.J.: Serum transfer of collagen-induced arthritis in mice. J Exp
Med. 1983; 158(2), 378-392.
130. Stuerh D.J., Marletta M.A.: Mammalian nitrate biosynthesis: mouse macrophages
produce nitrite and nitrate in response to Escherichia coli lipopolisaccharide. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 1985; 82(2), 7738-7742.
77
131. Suri-Payer E., Amar A.Z., Thornton A.M., Shevach E.M.: CD4+CD25+ T cells inhibit
both the induction and effector function of autoreactive T cells and represent a unique
lineage of immunoregulatory cells. J Immunol. 1998; 160(3), 1212-1218.
132. Svensson, Jirholt, Holmdahl and Jansson L.: B cell-deficient mice do not develop type
II collagen-induced arthritis (CIA). Clin Exp Immunol 1998; 111, 521–526.
133. Takemura S., Klimiuk P.A., Braun A., Goronzy J.J., Weyand C.M.: T Cell Activation
in Rheumatoid Synovium Is B Cell Dependent J Immunol. 2001; 167, 4710-4718.
134. Terato K., Hasty K.A., Reife R.A., Cremer M.A., Kang A.H., Stuart J.M.: Induction of
arthritis with monoclonal antibodies to collagen. J Immunol. 1992;148(7), 2103-2108.
135. Thaler K., Chandiramani D.V., Hansen R.A., Gartlehner G.: Efficacy and safety of
anakinra for the treatment of rheumatoid arthritis: an update of the Oregon Drug
Effectiveness Review Project. Biologics 2009; 3, 485-498.
136. Thornton A.M., Shevach E.M.:CD4+CD25+ immunoregulatory T cells suppress
polyclonal T cell activation in vitro by inhibiting interleukin 2 production. J Exp Med.
1998 ; 188(2), 287-296.
137. Turner N.J.: Counter-irritant and other medicinal uses of plants in ranunculaceae by
native peoples in british columbia and neighbouring areas . J Ethnopharmacol. 1984;
11(2), 181-201.
138. van Amelsfort .JM., van Roon J.A., Noordegraaf M., Jacobs K.M., Bijlsma J.W.,
Lafeber
F.P.,
Taams
L.S.:
Proinflammatory
mediator-induced
reversal
of
CD4+,CD25+ regulatory T cell-mediated suppression in rheumatoid arthritis. Arthritis
Rheum. 2007; 56(3), 732-742.
139. Van Amelsfort J.M., Jacobs K.M., Bijlsma J.W., Lafeber F.P., Taams LS.:
CD4(+)CD25(+) regulatory T cells in rheumatoid arthritis: differences in the presence,
phenotype, and function between peripheral blood and synovial fluid. Arthritis
Rheum. 2004; 50(9), 2775-2785.
140. Van Lent P.L., Van De Loo F.A., Holthuysen A.E., Van Den Bersselaar L.A.,
Vermeer H., Van Den Berg W.B.: Major role for interleukin 1 but not for tumor
necrosis factor in early cartilage damage in immune complex arthritis in mice. J
Rheumatol. 1995; 22(12), 2250-2258.
141. Wang C., Dai Y., Yang J., Chou G., , Wang Z.: Treatment with total alkaloids from
Radix Linderae reduces inflammation and joint destruction in type II collagen-induced
model for rheumatoid arthritis. J Ethnopharmacol. 2007; 111(2), 322-328.
78
142. Wang Y., Kristan J., Hao L., Lenkoski C.S., Shen Y., Matis L.A.: A Role for
Complement in Antibody-Mediated Inflammation: C5-Deficient DBA/1 Mice Are
Resistant to Collagen-Induced Arthritis. J Immunol, 2000, 164: 4340-4347.
143. Weinblatt M.E., Bathon J.M., Kremer J.M., Fleischmann R.M., Schiff M.H., Martin
R.W., Baumgartner S.W., Park G.S., Mancini E.L., Genovese M.C.: Safety and
efficacy of etanercept beyond 10 years of therapy in North American patients with
early and long-standing rheumatoid arthritis. Arthritis Care Res (Hoboken) 2010 Oct
18 [Epub ahead of print].
144. Weinstein G.D., Jeffes E., McCullough J.L.: Cytotoxic and immunologic effects of
methotrexate in psoriasis. J Invest Dermatol. 1990;95(5), 49-52.
145. Westhovens R., Yocum D., Han J., Berman A., Strusberg I., Geusens P., Rahman
M.U.: START Study Group. The safety of infliximab, combined with background
treatments, among patients with rheumatoid arthritis and various comorbidities: a
large, randomized, placebo-controlled trial. Arthritis Rheum. 2006; 54(4), 1075-1086.
Erratum in: Arthritis Rheum. 2007; 56(5), 1675. Dosage error in article text.
146. Winzer M., Aringer M.: Use of methotrexate in patients with systemic lupus
erythematosus and primary Sjögren's syndrome. Clin Exp Rheumatol. 2010; 28(5
Suppl. 61), 156-159.
147. Wooley P.H.., Luthra HS., Stuart J.M., David C.S.: Type II collagen-induced arthritis
in mice. I. Major histocompatibility complex (I region) linkage and antibody
correlates J Exp Med. 1981; 154(3), 688-700.
148. Xinqiang S., Fei L., Nan L., Yuan L., Fang Y., Hong X., Lixin T., Juan L., Xiao Z.,
Yuying S., Yongzhi X. :Therapeutic efficacy of experimental rheumatoid arthritis
with low-dose methotrexate by increasing partially CD4+CD25+ Treg cells and
inducing Th1 to Th2 shift in both cells and cytokines. Biomed Pharmacother. 2010;
64(7), 463-471.
149. Yagi H., Nomura T., Nakamura K., Yamazaki S., Kitawaki T., Hori S., Maeda M.,
Onodera M., Uchiyama T., Fujii S., Sakaguchi S.: Crucial role of FOXP3 in the
development and function of human CD25+CD4+ regulatory T cells. Int Immunol.
2004; 16(11), 1643-56.
150. Yago T., Nanke Y., Ichikawa N., Kobashigawa T., Mogi M., Kamatani N., Kotake S.:
IL-17 induces osteoclastogenesis from human monocytes alone in the absence of
osteoblasts, which is potently inhibited by anti-TNF-alpha antibody: a novel
mechanism of osteoclastogenesis by IL-17. J Cell Biochem. 2009 ; 108(4), 947-955.
79
151. Zhou H., Jang H., Fleischmann R.M., Bouman-Thio E., Xu Z., Marini J.C., Pendley
C., Jiao Q., Shankar G., Marciniak S.J., Cohen S.B., Rahman M.U., Baker D.,
Mascelli M.A., Davis H.M., Everitt D.E.: Pharmacokinetics and safety of golimumab,
a fully human anti-TNF-alpha monoclonal antibody, in subjects with rheumatoid
arthritis. J Clin Pharmacol. 2007; 47(3), 383-396.
80
STRESZCZE+IE
W pracy przedstawiono badania określające wpływ dwóch ekstraktów (C i B) będących
frakcjami polisacharydowymi uzyskanymi z
suchego ziela Caltha palustris L. i
metotreksatu na obraz kliniczny oraz odpowiedź komórkową i humoralną myszy szczepu
DBA/1J z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów (CIA - collagen induced
arthritis), które stanowi eksperymentalny model reumatoidalnego zapalenia stawów (RZS)
występującego u ludzi. Wpływ obu badanych ekstraktów na obraz kliniczny
eksperymentalnie wywołanego CIA oraz wskaźniki immunologicznie został porównany
do efektu działania metotreksatu – leku aktualnie standardowo stosowanego w terapii
RZS. Badane ekstrakty podawane były dootrzewnowo, w dawce 10 mg/kg, codziennie
przez 21 dni, przy czym pierwsza dawka została podana po 24 godzinach po podaniu
dawki przypominającej kolagenu (22 dzień doświadczenia). Z kolei metotreksat
podawany był dootrzewnowo w cyklach tygodniowych – 3 razy w tyg., co 48 godzin w
dawce 6,6 mg/kg, przez okres 3 tygodni. Badane wskaźniki immunologiczne zostały
oznaczone dwukrotnie tj.: w 43 i 47 dniu eksperymentu. Na przyjętym modelu
badawczym wykazano hamujący wpływ ekstraktu B z ziela Caltha palustris L. na rozwój
i przebieg kliniczny eksperymentalnie wywołanego u myszy CIA. Działanie ekstraktu B
hamujące rozwój CIA było słabsze niż metotreksatu. Stwierdzono również, że ekstrakt B
oraz metotreksat hamują leukocytozę we krwi obwodowej indukowaną wywołanym
stanem zapalnym stawów, jednak hamujący wpływ metotreksatu utrzymuje się dłużej niż
ekstraktu B. Ponadto badane ekstrakty z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksat
powodują częściową lub całkowitą normalizację odsetka i liczby bezwzględnej populacji
niedojrzałych limfocytów grasicy u myszy z wywołanym CIA. Ekstrakt C i B, a także
metotreksat zwiększają odsetek i liczbę limfocytów T CD8+ w obwodowych narządach
limfatycznych myszy z wywołanym CIA. W obu przypadkach siła działania ekstraktu B
jest porównywalna do siły działania metotreksatu. Natomiast w niekorzystny sposób
ekstrakt C i B ziela Caltha palustris L. oraz metotreksat obniżają u myszy z wywołanym
kolagenowym zapaleniem stawów odsetek śledzionowych limfocytów T regulatorowych
o fenotypie CD4+CD25+Foxp3+. Z kolei oba ekstrakty oraz metotreksat obniżają
podwyższone przez rozwój CIA stężenie TNF-α w surowicy krwi. Oba badane ekstrakty z
ziela Caltha palustris L. oraz metotreksat nasilają supresyjny wpływ rozwijającego się
procesu zapalenia stawów o podłożu autoimmunologicznym na pierwotną odpowiedź
myszy immunizowanych antygenem grasiczozależnym (SRBC).
81
Badane ekstrakty B i C z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksat wpływają modulująco
na odpowiedź komórkową i humoralną myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem
stawów, przy czym siła i kierunek działania ekstraktu B z ziela Caltha palustris L są
porównywalne do efektu działania metotreksatu.
82
ABSTRACT
The paper presents a study determining the impact of two extracts (C and B) which are
polysaccharide fractions obtained from dry herb Caltha palustris L. and methotrexate on
clinical sings, cellular and humoral immune response in DBA/1J mice with collagen induced
arthritis (CIA) - an experimental model of rheumatoid arthritis (RA) occurs in humans.
The impact of both tested extracts on the clinical sings of experimental CIA and
immunological parameters was compared to the effect of methotrexate - a standard drug
currently used to treat RA. Tested extracts were administered intraperitoneally at a dose of 10
mg/kg daily for 21 consecutive days, the first dose was given 24 hours after the booster dose
of collagen (on day 22 of experiment). The methotrexate was administered intraperitoneally at
3 weekly cycles - 3 times a week, every 48 hours at a dose of 6.6 mg/kg. Examined
immunological parameters were determined twice, on days 43 and 47 of experiment.
On the accepted research model the inhibitory effect of the extract B of herb Caltha palustris
L. on the development and clinical course of experimental CIA in mice was demonstrated.
The inhibiting effect of extract B on the development of CIA was weaker than that of
methotrexate. It was also found that the extract B and methotrexate inhibit leucocytosis in
peripheral blood caused by induced arthritis, however the inhibitory effect of methotrexate
persists longer than of B extract. Moreover, tested extracts from Caltha palustris L. and
methotrexate cause partial or complete normalization of the percentage and absolute number
of immature population of thymus lymphocytes in mice with CIA. Extract C and B, as well as
methotrexate increase the percentage and count of CD8+ T cells in peripheral lymphoid
organs of mice with triggered CIA. In both cases, the potency of the extract B is comparable
to the potency of methotrexate. However, in a negative way C and B extract from Caltha
palustris L. and methotrexate decrease in mice with collagen-induced arthritis splenic
regulatory T cell percentage of phenotype CD4+CD25+Foxp3+. Both extracts and
methotrexate reduce the serum TNF-α concentration previously increased by the development
of CIA. Both tested extracts of the herb Caltha palustris L. and methotrexate intensify the
suppressive impact of the developing autoimmune arthritis on the primary humoral response
in SRBC-immunized mice.
Tested extracts B and C of the herb Caltha palustris L. and methotrexate modulates cellular
and humoral immune response of mice with collagen-induced arthritis, the strength and
direction of action of the extract B from Caltha palustris L. are comparable to the effect of
methotrexate.
83
7DE':3à<:(.675$.7Ï:%,&==,(/$&$/7+$3$/8675,6/25$=0(7275(.6$781$2%5$=./,1,&=1<
=$3$/(1,$67$:Ï:0<6=<=:<:2à$1<0&,$
G]LHĔ
Æ
NRQWUROD3 Æ
“ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “
HNVWUDNW& Æ
HNVWUDNW% Æ
“ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “
“ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “
07;
Æ
“ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “
G]LHĔ
NRQWUROD3 “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “
HNVWUDNW& “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “
HNVWUDNW% “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “
07;
“ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ “ NRQWUROD1NRQWURODQHJDW\ZQDP\V]\]GURZH NRQWUROD3NRQWURODSR]\W\ZQDP\V]\]Z\ZRáDQ\P&,$
07;±PHWRWUHNVDW Z\WáXV]F]RQDF]FLRQND]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRNRQWUROLSR]\W\ZQHMSWHVW80DQQD:KLWQH\¶D
ĞUHGQLHDU\WPHW\F]QHSROLF]RQH]QLH]DOHĪQ\FKGRĞZLDGF]HĔZNDĪG\PQ±OLF]ED]ZLHU]ąWZNDĪGHMJUXSLH 7DE':3à<:(.675$.7Ï:==,(/$&$/7+$3$/8675,6/25$=0(7275(.6$781$2%5$=.5:,2%:2'2:(-
0<6=<=:<:2à$1<0&,$
NRQWUROD
1
NRQWUROD
3
G]LHĔ
HNVWUDNW
GRĞZLDGF]HQLD
&
HNVWUDNW
%
07;
/(8.2*5$0
1(8752),/(
%$=2),/(
VHJPHQWRZDQH
/(8.2&<7<
/,0)2&<7<
W\Ğ—O
“
“
“
“
“
1(8752),/(
SDáHF]NRZDWH
“
“
“
“
“
“
(2=<12),/(
0212&<7<
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
NRQWUROD
1
NRQWUROD
3
G]LHĔ
HNVWUDNW
GRĞZLDGF]HQLD
&
HNVWUDNW
%
07;
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
NRQWUROD1NRQWURODQHJDW\ZQDP\V]\]GURZH NRQWUROD3NRQWURODSR]\W\ZQDP\V]\]Z\ZRáDQ\P&,$
07;±PHWRWUHNVDW Q±OLF]ED]ZLHU]ąWZNDĪGHMJUXSLH ]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRNRQWUROLQHJDW\ZQHMS
]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRNRQWUROLSR]\W\ZQHMS
]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRPHWRWUHNVDWXS
7DE':3à<:(.675$.7Ï:%,&==,(/$&$/7+$3$/8675,6/25$=0(7275(.6$781$/,&=%ĉ/,0)2&<7Ï:
*5$6,&<ĝ/('=,21<,:ĉ=àÏ:&+à211<&+.5(=.2:<&+25$=,1'(.6:$*2:<1$5=Ą'Ï:
/,0)$7<&=1<&+0<6=<=:<:2à$1<0&,$
*5$6,&$
ĝ/('=,21$
:ĉ=à<&+à211(.5(=.2:(
/LF]ED
OLPIRF\WyZ
[
G]LHĔ
GRĞZLDGF]HQLD
,QGHNVZDJRZ\
/LF]ED
OLPIRF\WyZ
[
,QGHNVZDJRZ\
NRQWUROD1 “
NRQWUROD3 “
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
HNVWUDNW& “
HNVWUDNW% “
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
NRQWUROD1 “
NRQWUROD3 “
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
HNVWUDNW& “
HNVWUDNW% “
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
07;
G]LHĔ
GRĞZLDGF]HQLD
,QGHNVZDJRZ\
/LF]ED
OLPIRF\WyZ
[
07;
“
“
“
NRQWUROD1NRQWURODQHJDW\ZQDP\V]\]GURZH NRQWUROD3NRQWURODSR]\W\ZQDP\V]\]Z\ZRáDQ\P&,$
07;±PHWRWUHNVDW Q±OLF]ED]ZLHU]ąWZNDĪGHMJUXSLH ]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRNRQWUROLQHJDW\ZQHMS
]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRNRQWUROLSR]\W\ZQHMS
]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRPHWRWUHNVDWXS
7DE':3à<:(.675$.7Ï:%,&==,(/$&$/7+$3$/8675,6/25$=0(7275(.6$781$/,&=%ĉ,
68%3238/$&-(/,0)2&<7Ï:7*5$6,&<0<6=<=:<:2à$1<0&,$
OLF]ED
&'&'
&'&'
&'
&'
OLPIRF\WyZ
ON[
ON[
ON[ ON[
ON[
“
“
“
“
“ “
“
“
NRQWUROD1 “
“
“
“
“
“ “
“
“
NRQWUROD3 “
G]LHĔGRĞZLDGF]HQLD
HNVWUDNW& “
“
“
“
“
“ “
“
“
HNVWUDNW% “
“
“
“
“
“ “
“
“
07;
“
“
“
“
“
“ “
“
“
“
“
“
“
“ “
“
“
NRQWUROD1 “
“ “
“ “
“ “
“
“
NRQWUROD3 “
G]LHĔGRĞZLDGF]HQLD
HNVWUDNW& “
“ “
“ “
“ “
“
“
HNVWUDNW% “
“
“
“ “
“ “
“
“
07;
“
“
“
“
“
“ “
“
“
NRQWUROD1NRQWURODQHJDW\ZQDP\V]\]GURZH NRQWUROD3NRQWURODSR]\W\ZQDP\V]\]Z\ZRáDQ\P&,$
07;±PHWRWUHNVDW Q±OLF]ED]ZLHU]ąWZNDĪGHMJUXSLH ]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRNRQWUROLQHJDW\ZQHMS
]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRNRQWUROLSR]\W\ZQHMS
]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRPHWRWUHNVDWXS
7DE':3à<:(.675$.7Ï:%,&==,(/$&$/7+$3$/8675,6/25$=0(7275(.6$781$/,&=%ĉ,
68%3238/$&-(/,0)2&<7Ï:7,%ĝ/('=,21<0<6=<=:<:2à$1<0&,$
OLF]ED
&'
&'
&'
&'
OLPIRF\WyZ
ON[
ON[ ON[ ON[
ON[
NRQWUROD1 “
“ “
“ “
“ “
“
“
NRQWUROD3 “
“ “
“ “
“ “
“
“
G]LHĔGRĞZLDGF]HQLD
HNVWUDNW& “
“ “
“ “
“ “
“
“
HNVWUDNW% “
“ “
“ “
“ “
“
“
07;
“
“ “
“ “
“ “
“
“
NRQWUROD1 “
“ “
“ “
“ “
“
“
“ “
“ “
“ “
“
“
NRQWUROD3 “
G]LHĔGRĞZLDGF]HQLD
HNVWUDNW& “
“ “
“ “
“ “
“
“
HNVWUDNW% “
“ “
“ “
“ “
“
“
07;
“
“ “
“ “
“ “
“
“
NRQWUROD1NRQWURODQHJDW\ZQDP\V]\]GURZH NRQWUROD3NRQWURODSR]\W\ZQDP\V]\]Z\ZRáDQ\P&,$
07;±PHWRWUHNVDWQ±OLF]ED]ZLHU]ąWZNDĪGHMJUXSLH ]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRNRQWUROLQHJDW\ZQHMS
]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRNRQWUROLSR]\W\ZQHMS
]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRPHWRWUHNVDWXS
7DE':3à<:(.675$.7Ï:%,&==,(/$&$/7+$3$/8675,6/25$=0(7275(.6$781$/,&=%ĉ,
68%3238/$&-(/,0)2&<7Ï:7,%:ĉ=àÏ:&+à211<&+.5(=.2:<&+0<6=<=:<:2à$1<0&,$
OLF]ED
&'
&'
&'
&'
OLPIRF\WyZ
ON[
ON[ ON[ ON[ ON[
“ “
“ “
“ “
“ “
NRQWUROD1 “
NRQWUROD3 “
“ “
“ “
“ “
“ “
G]LHĔGRĞZLDGF]HQLD
HNVWUDNW& “
“ “
“ “
“ “
“ “
HNVWUDNW% “
“ “
“ “
“ “
“ “
07;
“
“ “
“ “
“ “
“ “
NRQWUROD1 “
“ “
“ “
“ “
“ “
NRQWUROD3 “
“ “
“ “
“ “
“ “
G]LHĔGRĞZLDGF]HQLD
HNVWUDNW& “
“ “
“ “
“ “
“ “
HNVWUDNW% “
“ “
“ “
“ “
“ “
07;
“
“ “
“ “
“ “
“ “
NRQWUROD1NRQWURODQHJDW\ZQDP\V]\]GURZH ]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRNRQWUROLQHJDW\ZQHMS
NRQWUROD3NRQWURODSR]\W\ZQDP\V]\]Z\ZRáDQ\P&,$
]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRNRQWUROLSR]\W\ZQHMS
07;±PHWRWUHNVDWQ±OLF]ED]ZLHU]ąWZNDĪGHMJUXSLH ]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRPHWRWUHNVDWXS
7DE':3à<:(.675$.7Ï:%,&==,(/$&$/7+$3$/8675,6/25$=0(7275(.6$781$,1'(.6&'&'
*5$6,&<ĝ/('=,21<,:ĉ=àÏ:&+à211<&+.5(=.2:<&+0<6=<=:<:2à$1<0&,$
,QGHNV&'&'
:Ċ]á\FKáRQQH
*UDVLFD
ĝOHG]LRQD
NUH]NRZH
NRQWUROD1
“
“
“
G]LHĔ
NRQWUROD3
“
“
“
GRĞZLDGF]HQLD
HNVWUDNW&
“
“
“
HNVWUDNW%
“
“
“
07;
“
“
“
NRQWUROD1
“
“
“
NRQWUROD3
“
“
“
G]LHĔ
HNVWUDNW&
“
“
“
GRĞZLDGF]HQLD
HNVWUDNW%
“
“
“
07;
“
“
“
NRQWUROD1NRQWURODQHJDW\ZQDP\V]\]GURZH ]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRNRQWUROLQHJDW\ZQHMS
NRQWUROD3NRQWURODSR]\W\ZQDP\V]\]Z\ZRáDQ\P&,$
]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRNRQWUROLSR]\W\ZQHMS
07;±PHWRWUHNVDW ]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRPHWRWUHNVDWXS
Q±OLF]ED]ZLHU]ąWZNDĪGHMJUXSLH 7DE':3à<:(.675$.7Ï:%,&==,(/$&$/7+$3$/8675,6/25$=0(7275(.6$781$3238/$&-ĉ
/,0)2&<7Ï:5(*8/$7252:<&+ĝ/('=,21<0<6=<=:<:2à$1<0&,$
&'&')R[S &'&')R[S &'&')R[S &'&')R[S
NRQWUROD1
NRQWUROD3
G]LHĔGRĞZLDGF]HQLD HNVWUDNW&
HNVWUDNW%
07;
“
“
“
“
“
NRQWUROD1
NRQWUROD3
G]LHĔGRĞZLDGF]HQLD HNVWUDNW&
HNVWUDNW%
07;
“
“
“
“
“
NRQWUROD1NRQWURODQHJDW\ZQDP\V]\]GURZH NRQWUROD3NRQWURODSR]\W\ZQDP\V]\]Z\ZRáDQ\P&,$
07;±PHWRWUHNVDW Q±OLF]ED]ZLHU]ąWZNDĪGHMJUXSLH “
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
“
]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRNRQWUROLQHJDW\ZQHMS
]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRNRQWUROLSR]\W\ZQHMS
]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRPHWRWUHNVDWXS
7DE':3à<:(.675$.7Ï:%,&==,(/$&$/7+$3$/8675,6/25$=0(7275(.6$781$67ĉĩ(1,$&<72.,1
:(.5:,:<7:$5=$1<&+35=(=/,0)2&<7<7K7K0<6=<=:<:2à$1<0&,$
,/
SJPO
,/
SJPO
,/
SJPO
,1)Ȗ
SJPO
71)
SJPO
,/
SJPO
NRQWUROD1
“
“
“
“
“
“
NRQWUROD3
“
“
“
“
“
“
G]LHĔGRĞZLDGF]HQLD HNVWUDNW&
“
“
“ “
“
“
HNVWUDNW%
“
“
“
“
“
“
07;
“
“
“ “
“
“
NRQWUROD1
“
“
“
“
“
QLHEDGDQR
NRQWUROD3
“
“
“
“
“
QLHEDGDQR
G]LHĔGRĞZLDGF]HQLD HNVWUDNW&
“
“
“
“
“
QLHEDGDQR
“ “ “
“
“
QLHEDGDQR
“
“
QLHEDGDQR
HNVWUDNW%
07;
“
“
NRQWUROD1NRQWURODQHJDW\ZQDP\V]\]GURZH NRQWUROD3NRQWURODSR]\W\ZQDP\V]\]Z\ZRáDQ\P&,$
07;±PHWRWUHNVDW Q±OLF]ED]ZLHU]ąWZNDĪGHMJUXSLH “
]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRNRQWUROLQHJDW\ZQHMS
]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRNRQWUROLSR]\W\ZQHMS
]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRPHWRWUHNVDWXS
7DE':3à<:(.675$.7Ï:%,&==,(/$&$/7+$3$/8675,6/25$=0(7275(.6$781$:<7:$5=$1,(,/
35=(=0$.52)$*,275=(:12:(67<08/2:$1(,19,752/36=(&2/,0<6=<=:<:2à$1<0&,$
,/SJPO
G]LHĔGRĞZLDGF]HQLD
G]LHĔGRĞZLDGF]HQLD
NRQWUROD1
“
“
NRQWUROD3
“
“
HNVWUDNW&
“
“
HNVWUDNW%
“
“
07;
“
“
NRQWUROD1NRQWURODQHJDW\ZQDP\V]\]GURZH NRQWUROD3NRQWURODSR]\W\ZQDP\V]\]Z\ZRáDQ\P&,$
07;±PHWRWUHNVDW Q±OLF]ED]ZLHU]ąWZNDĪGHMJUXSLH ]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRNRQWUROLQHJDW\ZQHMS
]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRNRQWUROLSR]\W\ZQHMS
]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRPHWRWUHNVDWXS
7DE':3à<:(.675$.7Ï:%,&==,(/$&$/7+$3$/8675,6/25$=0(7275(.6$781$:<7:$5=$1,(
7/(1.8$=27835=(=0$.52)$*,275=(:12:(67<08/2:$1(,19,752/36=(&2/,0<6=<=
:<:2à$1<0&,$
12Q0
G]LHĔGRĞZLDGF]HQLD
G]LHĔGRĞZLDGF]HQLD
NRQWUROD1
“
“
NRQWUROD3
“
“
HNVWUDNW&
“
“
HNVWUDNW%
“
“
07;
“
“
NRQWUROD1NRQWURODQHJDW\ZQDP\V]\]GURZH NRQWUROD3NRQWURODSR]\W\ZQDP\V]\]Z\ZRáDQ\P&,$
07;±PHWRWUHNVDW Q±OLF]ED]ZLHU]ąWZNDĪGHMJUXSLH ]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRNRQWUROLQHJDW\ZQHMS
]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRNRQWUROLSR]\W\ZQHMS
]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRPHWRWUHNVDWXS
7DE':3à<:(.675$.7Ï:%,&==,(/$&$/7+$3$/8675,6/25$=0(7275(.6$781$$.7<:12ĝû
)$*2&<7$51Ą*5$18/2&<7Ï:,0212&<7Ï:.5:,2%:2'2:(-0<6=<=:<:2à$1<0&,$
JUDQXORF\WyZ
IDJRF\WXMąF\FK
ĝUHGQLDZDUWRĞü
)/
PRQRF\WyZ
IDJRF\WXMąF\FK
ĝUHGQLDZDUWRĞü
)/
NRQWUROD1
“
“
“
“
NRQWUROD3
“
“
“
“
HNVWUDNW&
“
“
“
“
HNVWUDNW%
“
“
“
“
07;
“
“
“
“
G]LHĔ
GRĞZLDGF]HQLD
G]LHĔ
GRĞZLDGF]HQLD
NRQWUROD1
“
“
“
“
NRQWUROD3
“
“
“
“
HNVWUDNW&
“
“
“
“
HNVWUDNW%
“
“
“
“
07;
“
“
“
“
NRQWUROD1NRQWURODQHJDW\ZQDP\V]\]GURZH NRQWUROD3NRQWURODSR]\W\ZQDP\V]\]Z\ZRáDQ\P&,$
07;±PHWRWUHNVDW Q±OLF]ED]ZLHU]ąWZNDĪGHMJUXSLH ]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRNRQWUROLQHJDW\ZQHMS
]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRNRQWUROLSR]\W\ZQHMS
]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRPHWRWUHNVDWXS
7DE':3à<:(.675$.7Ï:%,&==,(/$&$/7+$3$/8675,6/25$=0(7275(.6$781$='2/12ĝû%Ï-&=Ą
*5$18/2&<7Ï:,0212&<7Ï:.5:,2%:2'2:(-0<6=<=:<:2à$1<0&,$
JUDQXORF\WyZ
PRQRF\WyZ
Z\ND]XMąF\FK]GROQRĞü ĝUHGQLDZDUWRĞü)/ Z\ND]XMąF\FK]GROQRĞü ĝUHGQLDZDUWRĞü)/
EyMF]ą
EyMF]ą
NRQWUROD1
“
“
“
“
NRQWUROD3
“
“
“
“
G]LHĔGRĞZLDGF]HQLD HNVWUDNW&
“
“
“
“
HNVWUDNW%
“
“
“
“
07;
“
“
“
“
NRQWUROD1
“
“
“
“
NRQWUROD3
“
“
“
“
G]LHĔGRĞZLDGF]HQLD HNVWUDNW&
“
“
“
“
HNVWUDNW%
“
“
“
“
07;
“
“
“
“
NRQWUROD1NRQWURODQHJDW\ZQDP\V]\]GURZH NRQWUROD3NRQWURODSR]\W\ZQDP\V]\]Z\ZRáDQ\P&,$
07;±PHWRWUHNVDW Q±OLF]ED]ZLHU]ąWZNDĪGHMJUXSLH ]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRNRQWUROLQHJDW\ZQHMS
]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRNRQWUROLSR]\W\ZQHMS
]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRPHWRWUHNVDWXS
7DE':3à<:(.675$.7Ï:%,&==,(/$&$/7+$3$/8675,6/25$=0(7275(.6$781$2'32:,('ħ
+8025$/1Ą0<6=<=:<:2à$1<0&,$,,0081,=2:$1<&+65%&
/RJDQW\65%&
3)&[ NRPyUHN
FDáNRZLWH
RSRUQHQD0(
G]LHĔ
G]LHĔ
G]LHĔ
NRQWUROD1
“
“
“
NRQWUROD3
“
“
“
HNVWUDNW&
“
“
“
HNVWUDNW%
“
“
“
07;
“
“
“
NRQWUROD1NRQWURODQHJDW\ZQDP\V]\]GURZH NRQWUROD3NRQWURODSR]\W\ZQDP\V]\]Z\ZRáDQ\P&,$
07;±PHWRWUHNVDW RGPRPHQWXLPPXQL]DFML65%&
Q±OLF]ED]ZLHU]ąWZNDĪGHMJUXSLH ]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRNRQWUROLQHJDW\ZQHMS
]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRNRQWUROLSR]\W\ZQHMS
]PLDQDLVWRWQDVWDW\VW\F]QLHZVWRVXQNXGRPHWRWUHNVDWXS