2004 OEPP/EPPO, Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 34, 155 –157
advertisement
© 2004 OEPP/EPPO, Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn 34, 155 –157 Organisation Européenne et Méditerranéenne pour la Protection des Plantes Europejska I Śródziemnomorska Organizacja Ochrony Roślin Normes OEPP EPPO Standardy Protokół diagnostyczny dla agrofagów podlegających przepisom Protocoles de diagnostic pour les organismes réglementés PM 7/20 Organization Européenne et Méditerranéenne pour la Protection des Plantes 1, rue Le Nôtre, 75016 Paris, France 155 156 Protokół diagnostyczny Standardy są zatwierdzone przez Radę EPPO. Na każdym ze standardów umieszczona jest data zatwierdzenia. W znaczeniu Artykułu II IPPC, Standardy EPPO są uznane za Regionalne Standardy dla członków EPPO. wyposażenia nie znaczą wykluczenia innych odczynników czy wyposażenia, które również mogą być przydatne • procedury laboratoryjne przedstawione w protokołach mogą być dostosowane do standardów poszczególnych laboratoriów, pod warunkiem, że są one odpowiednio zwalidowane lub, że zostały włączone stosowne kontrole pozytywne i negatywne. Recenzja Materiały źródłowe Standardy EPPO podlegają okresowej recenzji i poprawkom. Data następnej recenzji tego Standardu została uzgodniona na spotkaniu grupy roboczej EPPO dotyczącym działań fitosanitarnych. Rozprowadzanie Standardów EPPO do władz państw członkowskich odbywa się poprzez Sekretariat EPPO. Egzemplarze standardów dostępne są wg szczegółowych zasad na indywidualna prośbę skierowaną do Sekretariatu EPPO. EPPO/CABI (1996) Agrofagi kwarantannowe Europy, Wydanie II. CAB International, Wallingford (Wielka Brytania). EU (2000) Dyrektywa Rady 2000/29/EC z 8 Maja 2000 r dotycząca środków zapobiegających wprowadzeniu na teren Wspólnoty organizmów szkodliwych dla roślin lub produktów roślinnych i ich rozprzestrzenieniu w obrębie Wspólnoty Official Journal of the European Communities L169, 1 –112. FAO (1997) Międzynarodowa Konwencja Ochrony Roślin (tekst nowy, poprawiony). FAO, Rzym (Włochy). IPPC (1993) Zasady kwarantanny roślin w odniesieniu do handlu międzynarodowego ISPM no. 1. Sekretariat IPPC, FAO, Rzym (Włochy). IPPC (2002) Słownik terminów fitosanitarnych ISPM no. 5. Sekretariat IPPC , FAO, Rzym (Włochy). OEPP/ EPPO (2003) Standardy EPPO PM 1/2(12): EPPO Lista A1 i A2 agrofagów podlegających obowiązkowi zwalczania. Standardy EPPO PM1 Główne środki fitosanitarne, 5 –17. OEPP/ EPPO, Paryż. Zakres Definicje Protokoły diagnostyczne EPPO dotyczące agrofagów podlegających przepisom są przeznaczone do użytku dla Państwowych Organizacji Ochrony Roślin (NPPO) jako ciał odpowiedzialnych za stosowanie działań fitosanitarnych w celu wykrycia i zidentyfikowania agrofagów podlegających przepisom w EPPO i/lub liście Unii Europejskiej. W 1998 EPPO rozpoczęła nowy program przygotowywania protokołów diagnostycznych dla agrofagów podlegających przepisom w regionie EPPO (włączając kraje Unii Europejskiej). Pracą kieruje Panel Diagnostyczny EPPO oraz inne specjalistyczne Panele. Celem programu jest utworzenie dla każdego agrofaga podlegającego przepisom zatwierdzonego międzynarodowego protokołu diagnostycznego. Protokoły bazują na wieloletnich doświadczeniach ekspertów EPPO. Pierwsze projekty są przygotowywane przez wyznaczonego eksperta – autora(ów). Są one napisane zgodnie z „ogólnym formatem i zawartością protokołu diagnostycznego”, zatwierdzone przez Panel Diagnostyczny, dostosowane odpowiednio do poszczególnych agrofagów, jeśli to konieczne. Główną rolą protokołu jest wskazanie szczegółowych sposobów wykrywania lub identyfikacji, które zostały uznane za lepsze (niezawodność, łatwość w użyciu itd.) od innych metod. Inne metody mogą być również wymienione, wskazując na ich wady i zalety. Jeśli jest wykorzystywana jakaś metoda niewymieniona w protokole należy to wytłumaczyć. We wszystkich EPPO Standardach dotyczących diagnostyki mają zastosowanie następujące ogólne warunki: • testy laboratoryjne mogą wymagać użycia odczynników lub urządzeń, które stanowią określone zagrożenie. We wszystkich przypadkach należy ściśle stosować lokalne procedury dotyczące bezpieczeństwa • użyte w standardach EPPO nazwy odczynników lub Agrofag podlegający przepisom: agrofag kwarantannowy lub agrofag niekwarantannowy podlegający przepisom. Agrofag kwarantannowy: agrofag o potencjalnym znaczeniu ekonomicznym dla zagrożonego obszaru, ale jeszcze nie występujący na tym obszarze lub obecny, ale nie rozprzestrzeniony szeroko i podlegający urzędowemu zwalczaniu. Zatwierdzenie Nowelizacja Jeśli zaistnieje konieczność zostaną wprowadzone ponumerowane i datowane poprawki. Na każdym ze standardów (jeśli to konieczne) umieszczone są daty nowelizacji. Rozprowadzanie Zarys wymagań Protokoły diagnostyczne EPPO dotyczące agrofagów podlegających przepisom dostarczają wszystkich niezbędnych informacji dotyczących określonego agrofaga w celu jego wykrycia i prawidłowej identyfikacji dokonanej przez eksperta (np. specjalisty w dziedzinie entomologii, mikologii, wirusologii, bakteriologii itp.). Każdy protokół rozpoczyna się krótką ogólną informacją dotyczącą agrofaga (jego występowania, stosunku do innych organizmów, zakresu żywicieli, uszkodzeń powodowanych na żywicielach, rozmieszczenia geograficznego oraz jego tożsamości) a następnie opisuje szczegóły dotyczące wykrywania, identyfikacji, porównania z podobnymi gatunkami, wymagane w celu przeprowadzenia prawidłowej diagnozy, zawiera wykaz instytucji lub osób gdzie można uzyskać więcej informacji i opinii na temat określonego organizmu, (na temat diagnozy, wykrywania/ metody ekstrakcji, metod testowych). Istniejące Standardy EPPO w tej serii Do tej pory zostało zatwierdzonych i opublikowanych dziewiętnaście standardów i protokołów diagnostycznych EPPO. Każdy ze standardów jest ponumerowany w następujący sposób PM 7 / 4 (1), co oznacza, że jest © 2004 OEPP/EPPO, Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn 34, 155-157 Standardy EPPO 1 to standard EPPO dotyczący środków fitosanitarnych (PM), numer serii 7 (Protokoły Diagnostyczne), w tym przypadku – standard numer 4, wersja pierwsza. Istnieją następujące standardy: PM 7/1 (1) Ceratocystis fagacearum. Biuletyn OEPP/ EPPO Biuletyn 31, 41– 44 PM 7/ 2 (1) Tobacco ringspot nepovirus. Biuletyn OEPP/ EPPO Biuletyn 31, 45 – 51 PM 7/3 (1) Thrips palmi. Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn 31, 53–60 PM 7/4 (1) Bursaphelenchus xylophilus. Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn 31, 61– 69 PM 7/5 (1) Nacobbus aberrans. Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn31, 71–77 PM 7/6 (1) Chrysanthemum stunt pospiviroid. Biuletyn OEPP/ EPPO Biuletyn 32, 245 – 253 PM 7/7 (1) Aleurocanthus spiniferus. Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn 32, 255 –259 PM 7/ 8 (1) Aleurocanthus woglumi. Biuletyn OEPP/ EPPO Biuletyn 32, 261 – 265 PM 7/9 (1) Cacoecimorpha pronubana. Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn 32, 267 –275 PM 7/10 (1) Cacyreus marshalli. Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn32, 277 –279 PM 7/11 (1) Frankliniella occidentalis. Biuletyn OEPP/ EPPO Biuletyn 32, 281– 292 PM 7/12 (1) Parasaissetia nigra. Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn32, 293 – 298 PM 7/13 (1) Trogoderma granarium. Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn 32, 299 –310 © 2004 OEPP/EPPO, Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn 34, 155 –157 PM 7/14 (1) Ceratocystis fimbriata f. sp. platani. Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn 33, 249 – 256 PM 7/15 (1) Ciborinia camelliae. Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn 33, 257 – 264 PM 7/16 (1) Fusarium oxysporum f. sp. albedinis. Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn 33, 265 – 270 PM 7/17 (1) Guignardia citricarpa. Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn 33, 271– 280 PM 7/18 (1) Monilinia fructicola. Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn 33, 281 – 288 PM 7/19 (1) Helicoverpa armigera. Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn 33, 289 – 296 Niektóre z istniejących Standardów są wynikiem różnych projektów i konsultacji dotyczących procedur. Są wynikiem projektu Komisji Unii Europejskiej DIAGPRO (nr SMT 4-CT 98-2252). Projekt ten obejmował cztery wyznaczone laboratoria (w Anglii, Holandii, Szkocji, Hiszpanii) i 50 laboratoriów porównawczych z wielu krajów europejskich (w obrębie i spoza Unii Europejskiej), które były zaangażowane w badania porównawcze projektu protokołu. Projekt DIAGPRO został utworzony na bazie pełnej wiedzy równoległych działań Grupy Roboczej EPPO dotyczącej Przepisów Fitosanitarnych w projektach protokołów diagnostycznych i obejmującej agrofagi podlegające przepisom, które z tego powodu nie zostały włączone do programu EPPO. Protokoły DIAGPRO zostały zatwierdzone przez Radę EPPO jako Standardy EPPO z serii PM 7. W przyszłości będą one przeznaczone do poprawy przez procedury EPPO w tym samym czasie jak inne z tej samej serii. Europejska I Śródziemnomorska Organizacja Ochrony Roślin Organisation Européenne et Méditerranéenne pour la Protection des Plante PM 7/20(1) Protokół Diagnostyczny dla agrofagów podlegających przepisom1 Protocoles de diagnostic pour les organismes réglementés Erwinia amylovora Właściwy zakres Zgodność i akceptacja Standard opisuje protokół diagnostyczny dla Erwinia amylovora. Standard jest wynikiem projektu UE DIAGPRO Projekt (SMT 4-CT98-2252) wykonanego przy współpracy laboratoriów i wzajemnego porównania wyników laboratoriów w krajach Unii Europejskiej. Zatwierdzony jako Standard EPPO w 200309. Wstęp Rozwój objawów zarazy ogniowej związany jest z sezonowością wzrostu rozwoju z rośliny żywicielskiej. Rozpoczyna się on wiosenną produkcją pierwotnego inokulum i infekcją kwiatów, kontynuowany jest latem infekcją gałązek i owoców, i kończy się jesienią rozwojem zrakowaceń. Patogen może być widocznie w stanie spoczynku w żywicielu przez pewien okres (van der Zwet & Beer, 1995). Erwinia amylovora jest czynnikiem sprawczym zarazy ogniowej większości gatunków podrodziny Maloideae rodziny Rosaceae. Z ekonomicznego punktu widzenia najważniejszymi żywicielami są: Pyrus spp., Malus spp., Cydonia spp., Eriobotrya japonica, Cotoneaster spp., Crataegus spp., Pyracantha spp. i Sorbus spp. Do innych żywicieli zaliczamy Chaenomeles, Mespilus i Photinia. Forma specialis była opisana na Rubus spp. (Starr et al., 1951; EPPO/CABI, 1997). Wyczerpująca lista porażanych roślin, włącznie z wrażliwymi po sztucznej inokulacji była podana przez van der Zwet & Keil (1979) i Bradbury (1986). Zawiera ona ponad 180 gatunków z 39 rodzajów Rosaceae. E. amylovora była pierwszą z bakterii opisaną jako czynnik sprawczy chorób roślin przez Burrill (1883). Była uznana za rodzimą dla Ameryki Północnej a potem wykryta w Nowej Zelandii w 1920 roku. Zaraza ogniowa była zanotowana w 1957 roku W Anglii i była wykryta na większości obszarów w Europie, gdzie uprawiano wrażliwe rośliny żywicielskie, za wyjątkiem Portugalii ( w UE). E. amylovora jest obecna w 43 krajach, (van der Zwet, 2002), ale nie była nigdy zanotowana w którymkolwiek kraju Ameryki Południowej i w większości krajów Afrykańskich i Azjatyckich (za wyjątkiem kilku krajów Śródziemnomorskich), i tylko jednorazowo w Australii (Bonn & van der Zwet, 2000). It represents a threat to the pome fruit industry of all these countries. Szczegóły dotyczące rozmieszczenia geograficznego można znaleźć w EPPO/CABI (1998). Zaraza ogniowa jest prawdopodobnie najpoważniejszą chorobą atakującą uprawy grusz i jabłoni w wielu krajach. Aczkolwiek cykl życiowy bakterii nie jest w pełni zrozumiały, wiadomo, że może ona przeżywać jako endofit lub epifit przez zmienny okres czasu zależny od czynników środowiskowych. Tożsamość Nazwa: Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. Synonimy: Micrococcus amylovorus Burrill Bacillus amylovorus (Burrill) Trevisan Bacterium amylovorus (Burrill) Chester Erwinia amylovora f.sp. rubi Starr, Cardona & Falson Pozycja taksonomiczna: Bacteria, Gracilicutes, Proteobacteria, Subdivision, Enterobacteriales, Enterobacteriaceae Komputerowy kod Bayera: ERWIAM Klasyfikacja fitosanitarna: EPPO lista A2 list nr 52, EU Załącznik II /A2 Wykrywanie Objawy Objawy chorobowe zarazy ogniowej na głównych żywicielach są względnie podobne i łatwe do rozpoznania (Web ryc. 1 i 2). Nazwa choroby opisowo oddaje ich główną charakterystykę aspekt brązowienia gałązek, kwiatów i liści jako spalone ogniem. Do typowych objawów na drzewach pestkowych należą: czernienie liści na porażonych pędach, produkcja wydzielin i typowe zakrzywienie gałązek na kształt ‘pastorału’. W zależności od zaatakowanej chorobą części rośliny, choroba nosi nazwę Dane przedstawione w tym Standardzie oznaczone ‘Web ryc.’ zostały opublikowane na stronach EPPO http://www.eppo.org. © 2004 OEPP/EPPO, Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn 34, 159 – 171 159 160 Erwinia amylovora zaraza kwiatów, gałązek lub pędów, liści, owoców, konarów i pnia, pierścienia lub podkładek (van der Zwet & Keil, 1979; van der Zwet & Beer, 1995). Na jabłoni i gruszy, pierwsze objawy chorobowe pojawiają się zwykle wczesną wiosna, podczas ciepłej i wilgotnej pogody. Kwiaty wyglądają jakby nasiąknięte wodą, następnie więdną, usychają i stają się brązowe do czarnych. Ogonki mogą również wyglądać jakby nasiąknięte wodą, stają się ciemnozielone a ostatecznie brązowe lub czarne, czasami z kroplami śluzu lub lepkiej wydzieliny bakteryjnej. Liście więdną, usychają i całkowicie brązowieją u jabłoni lub stają się ciemnobrązowe do czarnych u gruszy, ale pozostają przytwierdzone do drzewa przez pewien czas. Zainfekowane niedojrzałe owoce (lub rzadziej częściowo dojrzałe owoce) wykazują zaznaczanie się tłustych lub nasiąkniętych wodą, brązowych do czarnych, często z kroplami śluzu bakteryjnego fragmentów. One również pozostają przytwierdzone do drzewa. Charakterystyczne czerwonawo-brązowe przebarwienia są często znajdowane w tkance podkorowej po odsłonięciu kory z zainfekowanego konaru lub gałązki (van der Zwet & Keil, 1979). Brązowe do czarnych, lekko wklęsłe zrakowacenia rozwijają się w korze gałązek lub koronie drzewa lub aż do pnia. Zrakowacenia te mogą później przekształcać się raki w pobliżu granicy miedzy tkanką zdrową i chorą. (Dye, 1983). Identyfikacja na roślinach żywicielskich z objawami Próbobranie Próby z objawami mogą być traktowane indywidualnie lub w małych grupach. Podczas pobierania prób i procesu ekstrakcji powinny być przedsięwzięte środki zapobiegające kontaminacji pomiędzy próbami. Próby do diagnozowania zarazy ogniowej na roślinach z objawami stanowią kwiaty, gałązki lub pędy, liście, ogonki liściowe (z nekrozami i wyciekami o ile to możliwe) lub przebarwione tkanki podkorowe po zdjęciu kory ze zrakowaceń gałązek, gałęzi, pnia lub pierścienia. Powinny one być poddane obróbce tak szybko, jak to możliwe po pobraniu i przechowywane w temperaturze 4 – 8C. Próby mogą być przechowywane w chłodni po obróbce w celu przyszłej weryfikacji do kilku tygodni. Dalsze szczegóły dotyczące przygotowania prób zawiera Załącznik II. zaawansowane lub, kiedy warunki środowiska nie są sprzyjające dla rozwoju zarazy ogniowej, liczba wyhodowanych komórek E. amylovora może być bardzo niska. Ponadto, w przypadku, gdy spodziewać się można przerośnięcia płytek antagonistycznymi bakteriami, próby powinny zostać powtórnie przebadane z wykorzystaniem i/lub wzbogacania przed izolacją, zgodnie z Załącznikiem IV. Posiew na trzy rodzaje podłoży diagnostycznych jest zalecany w celu uzyskania maksymalnego wzrostu E. amylovora, szczególnie wtedy, gdy próby nie są w najlepszej kondycji. W zależności od liczebności i zróżnicowania mikroorganizmów w próbie, każdy rodzaj podłoża jest bardziej lub mniej wydajny. Trzy rodzaje podłoży (CCT, Lewan i King B) były zwalidowane w ring teście. Najwyższą odzyskiwalność ma podłoże Lewan (Załącznik I). Podczas analizowania prób z objawami chorobowymi spodziewać się można dobrej korelacji pomiędzy izolacją, immunofluorescencją, wzbogaconą DASIELISA i PCR. Identyfikacja w próbach bezobjawowych Próbobranie i przygotowywanie prób Próby bezobjawowe mogą być analizowane indywidualnie lub w grupach do 100 prób (OEPP/EPPO, 1992). Inspekcja powinna być przeprowadzona na statystycznie reprezentatywnych próbach. W przypadku prób pobieranych z materiału przechowywanego należy rozważyć możliwość wyrywkowego poboru prób, natomiast z sadów i szkółek nie jest to możliwe. Podczas pobierania prób i w czasie ekstrakcji powinny być przedsięwzięte środki zapobiegające kontaminacji. Próbobranie i przygotowywanie prób mogą być wykonywane według jednej z metod zawartych w Załączniku II, stosowanych dla prób bezobjawowych Bezpośrednia analiza prób bez objawów chorobowych, przy niskiej populacji bakterii jest na ogół negatywna dla E. amylovora. Dlatego też, zalecane jest przeprowadzenie wcześniejszego wzbogacania prób (Załącznik IV) w buforze antyoksydacyjnym (Gorris et al., 1996a) (Załącznik I). Gdy analizowany jest materiał bezobjawowy, wzbogacanie wykonuje się przez 72 godziny w temperaturze około 25 C. Testy przesiewowe Szybkie testy przesiewowe Testy te ułatwiają domniemaną diagnozę. Aby potwierdzić wykrycie Erwinia amylovora w próbie, należy uzyskać wynik dodatni nie mniej niż dwóch testów serologicznych i testu drugiego opartego na PCR. Szczegóły dotyczące testów zawiera Załącznik III. Izolacja Świeżo przygotowane ekstrakty prób są konieczne do pomyślnej izolacji. Izolacja E. amylovora z prób objawowych jest względnie łatwa, ponieważ liczba wyhodowanych bakterii jest zwykle wysoka. Jakkolwiek, kiedy objawy są bardzo © 2004 OEPP/EPPO, Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn 34, 159 – 171 Powinny być wykonane co najmniej dwa testy przesiewowe. W przypadku testu IF na jedno okienko szkiełka diagnostycznego nanosi się ekstrakt jednej próby przed lub po koncentracji przez wirowanie (ale nie wzbogacany) Dziesięciokrotne rozcieńczenia próby powinny być również utrwalone, zgodnie z protokołem opisanym w Załączniku III. Dla wzbogaconej izolacji, wzbogaconej ELISA i wzbogaconego PCR, powinny być stosowane procedury zawarte w Załączniku III. W ostatnim przypadku, w celu ekstrakcji DNA, zgodnie z Llop et al. (2000) lub innym właściwym protokołem lub zestawem powinno być użyte 500 l próby, wzbogacanej w podłożu King B i w podłożu CCT. W przypadku otrzymania pozytywnego wyniku któregokolwiek testu przesiewowego, powinno się wyizolować patogen z ekstraktu (Załącznik V) lub po wzbogaceniu próby (Załącznik VI). Jeżeli trzy lub cztery testy są pozytywne, a uzyskano negatywny wynik izolacji lub nie była ona przeprowadzana, uzasadnione jest stwierdzenie, że E. amylovora przypuszczalnie jest wykryta w próbie, ale wymagane jest potwierdzenie przez izolację i identyfikację bakterii. Jeżeli jest to konieczne, do rozprowadzenia na podłożu powinien zostać użyty ekstrakt przechowywany w 80 C pod glicerolem (Załącznik II). Trzy rodzaje podłoży (CCT, King B, Lewan) wskazane w Załączniku I powinny być użyte w celu maksymalnego prawdopodobieństwa izolacji E. amylovora, kiedy informacje na temat mikroorganizmów w próbie nie są dostępne. Tabela 1 Odżywcze i enzymatyczne testy identyfikacyjne Test Oczekiwany wynik Barwienie Grama Wytwarzanie lewanu Wytwarzanie fluoryzującego pigmentu na podłożu King B \ (w świetle UV) Oksydacja / Fermentacja test (O/ F) Test Kovac’s na oksydazę Redukcja azotanów Wykorzystanie cytrynianów Wzrost w 39 C Upłynnianie żelatyny Ureaza Indol Redukcja substancji z sacharozy Acetoina – + – O +/ F + – – + – + – – + + Potwierdzenie Czyste kultury przypuszczalnie izolaty E. amylovora powinny być zidentyfikowane w oparciu o co najmniej dwa testy oparte na dwóch różnych charakterystykach (odżywczej, kwasów tłuszczowych, serologicznej lub molekularnej) Odpowiedni test żywicielski powinien być włączony do końcowego potwierdzenia patogeniczności. Znany szczep referencyjny E. amylovora powinien być włączony do każdego wykonywanego testu (Załącznik I ). Odżywcze i enzymatyczne testy identyfikacyjne Rodzaj Erwinia to bakterie Gram ujemne, fakultatywne anaeroby, mające zdolność ruchu dzięki peritrichalnemu urzęsieniu, o kształcie pałeczki, mające zdolność do produkcji kwasu z glukozy, fruktozy, galaktozy i sacharozy. Cechy fenotypowe zawarte są w Tabeli 1 ( Paulin, 2000), są one powszechnie obecne lub nieobecne u E. amylovora, powinny zostać wyznaczone zgodnie z metodami podanymi przez Jones & Geider (2001). Testy w Tabeli 2 pozwalają na odróżnienie E. amylovora od E. pyrifoliae, czynnika sprawczego azjatyckiej zarazy grusz na Pyrus pyrifolia (Kim et al., 1999; Kim et al., 2001) i nowej Erwinia sp. izolowanej ze znekrotyzowanych kwiatów gruszy w Hiszpanii (Roselló et al., 2002), aczkolwiek niektóre charakterystyki fizjologiczne i biochemiczne mogą być zmienne dla niektórych szczepów. Biochemiczna charakterystyka na podstawie systemu API (BioMérieux, Francja) Identyfikacja biochemiczna E. amylovora może być uzyskana przez specyficzny profil uzyskany w teście paskowym API 20 E i API 50 CH . W teście API 20 E, przygotowanie zawiesiny i inokulacja paska powinna być wykonana zgodnie z © 2004 OEPP/EPPO, Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn 34, 159 – 171 instrukcją producenta. Po inkubacji w 25-26 C odczytu pasków dokonuje się po 24 i 48 godzinach (Tabela 3). W przypadku testu API 50 CH powinna zostać przygotowana zawiesina o OD=1.0 w buforze PBS (Załącznik I), a następnie 1 ml zawiesiny powinien zostać dodany do 20 ml podłoża Ayer (Załącznik I). Podczas inokulacji paska testowego należy przestrzegać instrukcji producenta. Po inkubacji w 25-26 C w warunkach tlenowych pasek powinien być odczytany po 24 i 48 godzinach. Wykorzystywanie różnych węglowodanów wskazywane jest przez zmianę zabarwienia w studzience na kolor żółty. Automatyczny system identyfikacji Biolog System identyfikacyjny bazujący na wykorzystywaniu 95 źródeł węgla w mikrostudzienkach płytki jest dostępny w handlu (Biolog, US). Podczas automatycznej identyfikacji przypuszczalnych szczepów E. amylovora powinna być przestrzegana instrukcja producenta. Tabela 3 Typowe odczyty dla Erwinia amylovora w teście API 20E po 48 h Test ONPG ADH LDC ODC CIT SH2 URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA Odczyt (48 h) Zmienna – (lub słaba+) – – – – – – – + (lub zmienna) Zmienna + Zmienna Zmienna Zmienna – + – (lub słaba +) – + (niektóre ) Profil kwasów tłuszczowych (FAP) Lewan dodatnie, nie fluoryzujące kolonie powinny być hodowane na agarze sojowo-tryptonowym przez 48 godzin w 28C, a następnie poddawane stosownej procedurze analizy kwasów tłuszczowych. Wynik testu FAP podejrzanej kultury jest dodatni, gdy zostanie porównywany i uznany za identyczny z kontrolą pozytywną (Sasser, 1990). Identyfikacja serologiczna Test aglutynacji Podejrzane, lewan-dodatnie, nie fluoryzujące na podłożu King B kolonie E. amylovora mogą być badane w teście aglutynacji na szkiełku podstawowym przez zmieszanie ich z kroplą buforu PBS (Załącznik I) i kroplą specyficznych na E. 162 Erwinia amylovora 163 Tabela 2 Różnice pomiędzy Erwinia amylovora, Erwinia pyrifoliae i Erwinia sp. izolowanych ze znekrotyzowanych kwiatów gruszy Testy mikrobiologiczne Upłynnianie żelatyny Erwinia amylovora + Erwinia pyrifoliae – Erwinia sp. – Inozytol1 Sorbitol1 Eskulina1 Melibioza1 D-Rafinoza1 -Gentobioza1 Amplifikacja2 z EP16A/EPI62CCPS1/CPS2C – + V4 – – + – ND3 + – – – – + + – + + + + ND 3 1 = Roselló et al. (2003). Oksydacja substratów w API 50 CH (BioMérieux) wg zmodyfikowanego protokołu. 2 = wg Kim et al. (2001). 3 = ND: nie badano. 4 = V: Zmienne. amylovora przeciwciał (nie rozcieńczone lub tylko w 5 lub 10 krotnym rozcieńczeniu). Przeciwciała monoklonalne mogą być używane tylko w przypadku, gdy wykazują aglutynację z referencyjnymi szczepami. Test biologiczny Testy ELISA Test DASI-ELISA i bezpośredni test ELISA z wykorzystaniem specyficznych monoklonalnych przeciwciał mogą być stosowane do identyfikacji izolatu. Mieszanka przeciwciał monoklonalnych zastała poddana walidacji w ring teście. W przypadku DASI-ELISA, z podejrzanych kolonii przygotowywana jest zawiesina o gęstości około 108 komórek w mililitrze PBS (Załącznik I ). Procedura testu DASI-ELISA (Załącznik III) może być prowadzona bez etapu wstępnego wzbogacania. Gdy przeprowadzone będą tylko dwa testy identyfikacyjne i inokulacja, inne testy serologiczne nie muszą być zastosowane jako dodatkowe do tej metody. W przypadku testu bezpośredniego ELISA, powinna być przeprowadzona odrębna procedura zawarta w Załączniku III. W celu potwierdzenia patogeniczności podejrzanymi po izolacji i wzbogacaniu koloniami E. amylovora powinny być zainokulowane rośliny testowe. Reakcja nadwrażliwości liści tytoniu może być wskaźnikiem obecności genu hrp, ale daje też wynik pozytywny dla wielu bakterii patogenicznych dla roślin. Używa się roślin tytoniu odmiany Xanthi lub Samsun z więcej niż 5-6 liśćmi. Zawiesina bakteryjna o gęstości 109 cfu ml1 (OD przy 620 nm=1.0) jest wstrzykiwana do przestrzeni międzykomórkowej w pełni rozwiniętych przy użyciu igły 25 GA 5/8 0.5 16 i strzykawki. Zupełny rozpad infiltrowanej tkanki po 24 godzinach w temperaturze pokojowej świadczy o pozytywnym wyniku reakcji. Aby potwierdzić patogeniczność podejrzanych kolonii E. amylovora, konieczna jest inokulacja żywiciela zarazy ogniowej. Zawsze powinna być włączona pozytywna kontrola (czysta kultura znanego szczepu E. amylovora) i kontrola negatywna ze sterylnym buforem (Załącznik I). Oprócz tego rośliny zainokulowane kontrolą pozytywną i kontrolą negatywną powinny być trzymane z dala od innych roślin, ale w tych samych warunkach. Metody inokulacji zostały zawarte w Załączniku VI. Kolonie przypominające kolonie E. amylovora powinny być reizolowane z ogonków liściowych, roślin lub gałązek wykazujących typowe objawy choroby powodowanej przez E. amylovora. Identyfikacja molekularna Pomyłki możliwe z podobnymi gatunkami PCR Z lewan dodatnich, nie fluoryzujących kolonii powinna być przygotowana zawiesina o gęstości około 106 komórek w mililitrze sterylnej wody do biologii molekularnej. Zastosowana powinna być właściwa procedura PCR, zgodnie z Załącznikiem III, bez ekstrakcji DNA. Analiza makrorestrykcyjna z Xba i elektroforeza w polu pulsacyjnym (PFGE) Analiza PFGE genomowego DNA po trawieniu enzymem Xba i zgodnie z Jock et al. (2002) daje 6 wzorców dla szczepów europejskich E. amylovora. Pozwala ona na uzyskanie informacji użytecznych do różnicowania szczepów i może być wykorzystana do analizy rozprzestrzeniana sięzarazy ogniowej w Europie. Objawy chorobowe powodowane przez E. amylovora mogą być mylone z tymi, które powoduje Erwinia pyrifoliae, czynnik sprawczy bakteryjnego więdnięcia gałązek gruszy azjatyckiej (Pyrus pyrifolia) (Kim et al., 1999) i z tymi, które powodują nowe gatunki Erwinia izolowane z znekrotyzowanych kwiatów gruszy w Hiszpanii (Roselló et al.,2002). Ostateczna diagnoza powinna zawsze być uzyskana w drodze analiz laboratoryjnych. Test IF Z lewan dodatnich, nie fluoryzujących kolonii przygotowywana jest w buforze PBS (Załącznik I) zawiesina o gęstości około 106 komórek w mililitrze, i stosowana jest procedura opisana w Załączniku III. © 2004 OEPP/EPPO, Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn 34, 159 – 171 Materiał referencyjny Następujące izolaty E. amylovora są rekomendowane do wykorzystania jako kontrole pozytywne: NCPPB683 i CFBP 1430. Następujące kolekcje mogą dostarczyć odmienne szczepy referencyjne E. amylovora: (1) National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York (GB); (2) Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen ( NL); (3) Collection Française de Bactéries Phytopathogènes (CFBP), INRA Station Phytobactériologie, Angers, Francja. Autentyczność szczepów może być zagwarantowana tylko w przypadku bezpośredniego uzyskania z kolekcji kultur. Wymagania dla pozytywnej diagnozy Schematy 3 i 4 przedstawiają odpowiednio schemat testowania pod kątem obecności E. amylovora materiału z objawami choroby i bezobjawowego. Kiedy E. amylovora diagnozowana jest po raz pierwszy, lub w krytycznych przypadkach (import /eksport) wymagane jest stosowanie się do następujących zasad: objawy choroby, morfologiczna, biochemiczna, i molekularna charakterystyka patogenu i właściwości patogeniczne powinny być w zgodzie z opisem zawartym w protokole podczas izolacji bakterii opisane charakterystyki morfologiczna, biochemiczna, molekularna i patogeniczna, i wymagania protokołu powinny być następujące w przypadku infekcji latentnej, po wstępnych testach przesiewowych, patogen powinien zostać wyizolowany i właściwie zidentyfikowany w czystej kulturze, włącznie z testem patogeniczności oryginalna próba (z etykietami, o ile ma to zastosowanie), ekstrakt próby i czysta kultura powinny być przechowywane w odpowiednich warunkach z właściwym zarejestrowaniem i powinny być dostępne w razie wątpliwości. Sprawozdanie z diagnozy Sprawozdanie z wykonania protokołu powinno zwierać: informacje i dokumentację pochodzenia zainfekowanego materiału; opis objawów (o ile to możliwe raczej ze zdjęciami); opis morfologicznej, biochemicznej i patogenicznej charakterystyki bakterii; informacje o rozmiarze infekcji; właściwe komentarze co do pewności lub niepewności identyfikacji. Informacje dodatkowe Dodatkowe informacje na temat tego organizmu można uzyskać od: M. M. López ([email protected]), Bacteriología, Department Protección Vegetal y Biotecnología, Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA), Carretera Moncada-Náquera km 5, 46113 Moncada (Valencia), Spain; M. Keck, Bundesamt und Forschungszentrum für Landwirtschaft, Spargelfeldstrasse191, A-1226 Vienna PO Box 400, Austria. Podziękowania W oryginale protokół ten został napisany przez: M. M. López, © 2004 OEPP/EPPO, Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn 34, 159 – 171 M. Keck, P. Llop, M. T. Gorris, J. Peñalver, V. Donat i M. Cambra., IVIA, Moncada (Valencia) (ES). Protokół ten poddawany był ringtestowi w różnych europejskich laboratoriach2. Referencje Ayers SH, Rupp P & Johnson WT (1919) A Study of Alkali Forming in Milk. USDA Biuletyn no. 782. Washington (US). Bereswill S, Bugert P, Bruchmuller I & Geider K (1995) Identification of the fireblight pathogen, Erwinia amylovora by PCR assays with chromosomal DNA. Applied and Environmental Microbiology 61, 2636 –2642 Bereswill S, Jock S, Aldridge P, Janse JD & Geider K (1997) Molecular characterization of natural Erwinia amylovora strains deficient in levan synthesis. Physiological and Molecular Plant Pathology 51, 215 –225 Bereswill S, Pahl A, Bellemann P, Zeller W & Geider K (1992) Sensitive and species-specific detection of Erwinia amylovora by polymerase chain reaction analysis. Applied and Environmental Microbiology 58, 3522–3526. Bonn WG & van der Zwet T (2000) Distribution and economic importance of fireblight. In: Fireblight, the Disease and its Causative Agent Erwinia amylovora (Ed. Vanneste, J). CAB International, Wallingford (GB). Bradbury JF (1986) Guide to Plant Pathogenic Bacteria. CAB International, Wallingford (GB). Burrill TJ (1883) New species of Micrococcus. American Naturalist 17, 319. Dye DW (1983) Erwinia: the ‘amylovora’ and ‘herbicola’ groups. In: Plant Bacterial Diseases, a Diagnosis Guide (Ed. Fahy PC & Persley GJ). Aca- demic Press, Sydney (AU). EPPO/CABI (1997) Erwinia amylovora. Quarantine Pests for Europe, 2nd edn, pp. 1001–1007. CAB International, Wallingford (GB). EPPO/CABI (1998) Map 257. In: Distribution Maps of Quarantine Pests for Europe. CAB International, Wallingford (GB). EU (1998) Council Directive 98/57 EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum. Official Journal of the European Communities L235, 1–39. Gorris MT, Cambra M, Llop P, López MM, Lecomte P, Chartier R & Paulin JP (1996b) A sensitive and specific detection of Erwinia amylovora based on the ELISA-DASI enrichment method with monoclonal anti- bodies. Acta Horticulturae no. 411, 41– 45. Gorris MT, Cambra E, López MM, Paulin JP, Chartier R & Cambra M (1996a) Production and characterization of monoclonal antibodies spe- cific for Erwinia amylovora and their use in different serological tech- niques. Acta Horticulturae no. 411, 47–51. Guilford PJ, Taylor RK, Clark RG, Hale CN, Forster RLS & Bonn WG (1996) PCR-based techniques for the detection of Erwinia amylovora. Acta Horticulturae no. 411, 53 –56. 2 J. Janse, Plant Protection Service, Wageningen, NL; M. Keck, Bundesamt und Forschungszentrum für Landwirtschaft, Vienna, AT; A. Sletten, Plant Protection Centre, Ås, NO; M. A. Cambra, Centro de Protección Vegetal, Zaragoza, ES; J. L. Palomo, Centro Regional de Diagnóstico, Aldearrubia Salamanca, ES; S. Simpkins, Central Science Laboratory, Sand Hutton, York, GB; T. T. Duarte, Direcção Geral de Protecção das Culturas, Lisbon, PT; F. Poliakoff, LNPV Unité Bactériologie, Angers, FR; J. Van Vaerenbergh, Rijkstation voor Plantenziekten, Merelbeke, BE; M. M. López, Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias, Valencia, ES. 164 Erwinia amylovora Ishimaru ES & Klos EJ (1984) New medium for detection of Erwinia amy- lovora and its use in epidemiological studies. Phytopathology 74, 1342–1345. Jock S, Donat V, López MM, Bazzi C & Geider K (2002) Following spread of fireblight in Western, Central and Southern Europe by molecular dif- ferentiation of Erwinia amylovora strains with PFGE analysis. Environ- mental Microbiology 4, 106 –114. Jones A & Geider K (2001) II Gram negative bacteria. B. Erwinia and Pantoea. In: Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria (Ed. Schaad NW, Jones JB & Chum W), 2nd edn. APS Press, St Paul (US). Kim WS, Gardan L, Rhim SL & Geider K (1999) Erwinia pyrifoliae sp., a novel pathogen that affects Asian pear trees (Pyrus pyrifolia). Interna- tional Journal of Systematic Bacteriology 49, 899 –906. Kim WS, Jock S, Rhim SL & Geider K (2001) Molecular detection and dif- ferentiation of Erwinia pyrifoliae and host range analysis of the Asian pear pathogen. Plant Disease 85, 1183 –1188. King EO, Ward M & Raney DE (1954) Two simple media for the demon- stration of pyocyanin and fluorescein. Journal of Laboratory and Clinical Medicine 44, 301–307. Lecomte P, Manceau C, Paulin JP & Keck M (1997) Identification by PCR analysis on plasmid pE29 of isolates of Erwinia amylovora responsible of an outbreak in Central Europe. European Journal of Plant Pathology 103, 91– 98. Llop P, Bonaterra A, Peñalver J & López MM (2000) Development of a highly sensitive nested-PCR procedure using a single closed tube for detection of Erwinia amylovora in asymptomatic plant material. Applied and Environmental Microbiology 66, 2071–2078. Llop P, Caruso P, Cubero J, Morente C & López MM (1999) A simple extraction procedure for efficient routine detection of pathogenic bacteria in plant material by polymerase chain reaction. Journal of Microbiologi- cal Methods 37, 23–31. Maes M, Garbeva P & Crepel C (1996) Identification and sensitive endo- phytic detection of the fireblight pathogen Erwinia amylovora with 235 ribosomal DNA sequences and the polymerase chain reaction. Plant Pathology 45, 1139 – 1149. © 2004 OEPP/EPPO, Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn 34, 159 – 171 McManus PS & Jones AL (1995) Detection of Erwinia amylovora by nested PCR and PCR-dot-blot and reverse blot hybridisations. Phytopathology 85, 618–623. OEPP/EPPO (1992) EPPO Standards PM 3/40 Erwinia amylovora. Sampling and test methods. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 22, 225–231. Paulin JP (2000) Erwinia amylovora: general characteristics, biochemistry and serology. In: Fireblight, the Disease and its Causative Agent, Erwinia amylovora (Ed. Vanneste, J). CAB International, Wallingford (GB). Roselló M, García-Vidal S, Tarín A, Llop P, Gorris MT, Donat V, Peñalver J, Chartier R, Paulin JP, Gardan L & López MM (2002) Characterization of an Erwinia sp. isolated from necrotic pear blossoms in Valencia, Spain. Acta Horticulturae no. 590, 139–142. Roselló M, Peñalver J, Llop P, Gorris MT, Charter R, Cambra M & López MM (2003) Identification of an Erwinia sp., different from Erwinia amylovora which is responsible for necrosis on pear blossoms. Authors to be contacted (submitted). Sasser M (1990) Identification of bacteria through fatty acid analysis. In: Methods in Phytobacteriology (Ed. Klement F, Rudolf K & Sands DC), pp. 199–204. Akademiai Kiado, Budapest (HU). Starr MP, Cardona C & Folsom D (1951) Bacterial fire blight of raspberry. Phytopathology 41, 951–959. Thomson SV (2000) Epidemiology of fireblight. In: Fireblight, the Disease and its Causative Agent, Erwinia amylovora (Ed. Vanneste, J). CAB International, Wallingford (GB). van der Zwet T (2002) Present worldwide distribution of fire blight. Acta Horticulturae no. 590, 33 –34. van der Zwet T & Beer S (1995) Fire blight – its nature, prevention and control. A Practical Guide to Integrated Disease Management. USDA Agricultural Information Biuletyn no. 631. Washington (US). van der Zwet T & Keil HL (1979) Fire blight: a bacterial disease of rosa- ceous plants. USDA Handbook no. 510. Washington (US). Próba roślin z typowymi objawami (Załącznik II) Wykonać wstępną diagnozę przez szybkie testy przesiewowe co najmniej 2 testy serologiczne i 1 PCR: (Załącznik III) Izolacja lub wzbogacona izolacja1 1 lub 2 dodatnie Wszystkie ujemne Wszystkie 3 dodatnie Identyfikacja kolonii o typowej morfologii Nie 2 Tak Potwierdzenie przez dwa testy i test biologiczny Erwinia amylovora nie wykryto Tak Nie Wykryto Erwinia amylovora Potwierdzono Erwinia amylovora 1. Ryc.3 Schemat wykrywania i identyfikacji Erwinia amylovora w roślinach żywicielskich z objawami choroby. 2. 3. © 2004 OEPP/EPPO, Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn 34, 159 – 171 Patogen jest zwykle łatwo izolowany z materiału roślinnego wykazującego objawy choroby metodą rozcieńczeń płytkowych jak opisano w Załączniku V, czasami może być konieczne wzbogacanie (Załącznik IV). Hodowla może się nie udać w przypadku prób z materiału roślinnego będącego w zaawansowanym stadium infekcji, z uwagi na konkurencję lub przerośnięcie bakteriami saprofitycznymi. Jeżeli objawy choroby są typowe, a izolacja daje wynik ujemny, wtedy izolacja powinna być powtórzona. Wykrywanie przy użyciu szybkich testów przesiewowych jest odpowiednie dla rutynowych inspekcji. W przypadku nowych wykryć konieczne jest potwierdzenie przez izolację. 166 Erwinia amylovora Próba bez objawów chorobowych (Załącznik II) Ekstrakcja patogenu, koncentracja i wzbogacanie (Załączniki II, III) Diagnoza wstępna przez szybkie testy przesiewowe; co najmniej 2 (Załącznik III) Co najmniej 1 test dodatni Wszystkie testy ujemne Trzy testy dodatnie Izolacja i wzbogacona izolacja (Załączniki IV, V) Identyfikacja kolonii o typowej morfologii Erwinia amylovora prawdopodobnie wykryta Nie1 Erwinia amylovora nie wykryto Tak Nie Potwierdzenie przez dwa testy i test biologiczny Tak Erwinia amylovora potwierdzono Ryc. 4 Schemat wykrywania i identyfikacji Erwinia amylovora w próbach bezobjawowych. Hodowla może nie udać się w przypadku obecności lub inhibicji przez bakterie saprofityczne. Gdy w testach przesiewowych uzyskano dodatnie wyniki, ale wynik izolacji jest negatywny, należy powtórzyć izolację. 1 © 2004 OEPP/EPPO, Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn 34, 159 – 171 Załącznik I Materiały Startery Bufory Bufor fosforanowy 10 mM, pH 7.2 (PBS): NaCl 8 g; KCl 0.2 g; Na2HPO4·12H2O 2.9 g; KH2PO4 0.2 g; woda destylowana do 1 l. Antyoksydacyjny bufor do maceracji (Gorris et al., 1996a): polyvynilpyrrolidone (PVP-10) 20 g; mannitol 10 g; ascorbic acid 1.76 g; reduced glutathione 3 g; PBS 10 mm pH 7.2-1 l. Doprowadzić pH do 7. Sterylizować przez filtrację. Bufor węglanowy pH 9.6 : Na2CO3 1.59 g; NaHCO3 2.93 g; Woda destylowana do 1 l. Doprowadzić pH do 9.6. Bufor do płukania (PBS, pH 7.2–7.4 suplementowany 0.05% Tween 20): NaCl 8 g; KCl 0.2 g; Na2HPO4·12H2O 2.9 g; KH2PO4 0.2 g; Tween 20 500 l; woda destylowana do 1 l. Bufor substratowy dla alkalicznej fosfatazy: diethanolamine 97 ml; rozpuścić w 800 ml wody destylowanej. Doprowadzić pH do 9.8 za pomocą stężonego HCl. Dopełnić do 1000 ml wodą destylowaną. Bufor substratowy do strącania dla alkalicznej fosfatazy: Sigma Fast 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitro blue tetrazolium tablets (BCIP-NBT) – Cat No. B-5655 Sigma Aldrich GmbH (Stenheim), Niemcy. Bufor ekstrakcyjny (Llop et al., 1999): Tris HCl, pH 7.5 24.2 g; NaCl 14.6 g; EDTA 9.3 g; SDS 5 g; polyvinylpyrrolidone PVP-10 20 g; woda destylowana do 1l. Sterylizować przez filtrację. 50X TAE bufor: Tris 242 g; 0.5 M Na2EDTA pH 8.0 100 ml;glacial acetic acid 57.1 ml; woda destylowana do 1 l. Bufor obciążajacy: Bromophenol blue 0.025 g; glycerol 3 g; woda destylowana do10 ml. Podłoża Podłoże CCT (Ishimaru & Klos, 1984): sucrose 100 g; sorbitol 10 g; Niaproof 1.2 ml; crystal violet 2 ml (rozp. 0.1% ethanol); nutrient agar 23 g; woda destylowana do 1 l. Doprowadzić pH do 7.0–7.2; sterylizować przez autoklawowanie w 115C przez 10 min. Potem przygotować: thallium nitrate 2 ml (1% w/v wodny roztwór); cycloheximide 0.05g (wysoce toksyczny odczynnik, nosić środki ochrony). Sterylizować przez filtrację (0.45 m). Dodać do 1 l sterylnego podłoża (w około 45 C). Podłoże King B (King et al., 1954): proteose peptone N3 20 g; glycerol 10 ml; K2HPO4 1.5 g; MgSO4 ·7H2O 1.5 g; agar 15 g; woda destylowana do 1 l. Doprowadzić pH do 7.0 –7.2. Sterylizować przez autoklawowanie w 120 C przez 15 min. Podłoże Lewan: yeast extract 2 g; Bactopeptone 5 g; NaCl 5 g; sucrose 50 g; agar 20 g; woda destylowana do 1 1. Doprowadzić pH do 7–7.2. Sterylizować przez autoklawowanie w 120 C przez 15 min. Podłoże Ayers (Ayers et al., 1919): NH4H2PO4 1 g; KCl 0.2 g; MgSO4 0.2 g; bromothymol blue 75 ml (roztwór 0.2%); woda destylowana do 1 l. Doprowadzić pH do 7. Sterylizować przez autoklawowanie w 120 C przez 15 min. © 2004 OEPP/EPPO, Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn 34, 159 – 171 Oligonukleotydowe sekwencje starterów (Bereswill et al., 1992): Starter A: 5-CGG TTT TTA ACG CTG GG Starter B: 5-GGG CAA ATA CTC GGA TT Oligonukleotydowe sekwencje starterów dla nested PCR w pojedynczej zamkniętej probówce (Llop et al., 2000): Startery zewnętrzne AJ75: 5-CGT ATT CAC GGC TTC GCA GAT AJ76: 5-ACC CGC CAG GAT AGT CGC ATA Startery wewnętrzne PEANT1: 5-TAT CCC TAA AAA CCT CAG TGC PEANT2: 5-GCA ACC TTG TGC CCT TTA Dostępny w handlu standaryzowany materiał kontrolny Przeciwciała na E. amylovora powszechnie polecane do wykorzystywania w testach wykrywania i identyfikacji: E. amylovora, poliklonalne, rekomendowane do wykrywania przy użyciu testu IF (walidowane w ring testach), Loewe Biochemica GmbH, Mühlweg 2a, D-82054 Sauerlach (DE). IVIA EPS 1430, poliklonalne, rekomendowane do wykrywania przy użyciu testu IF (zwalidowane w ring testach), Plant Print Diagnostics, S.L., De la March 36, 46512 Faura, Valencia (ES). IVIA Mab 7 A, monoklonalne, rekomendowane do wykrywania przy użyciu testu IF (zwalidowane w ring testach), Plant Print Diagnostics (ES); IVIA Mab 8B + 5H, monoklonalne, rekomendowane do wykrywania przy użyciu testu Wzbogacanej DASIELISA (zwalidowane w ring testach), Plant Print Diagnostics (ES). Uwaga: Po etapie wzbogacania, aby zapobiec wystąpieniu reakcji krzyżowych, rekomendowne jest używanie specyficznych monoklonalnych przeciwciał. Wzbogacany test DASI-ELISA Kompletny zestaw oparty o przeciwciała poliklonalne i monoklonalne (8B + 5H IVIA), włącznie z buforem ekstrakcyjnym, półselektywnym podłożem, płytkami do testu ELISA i odczynnikami jest dostępny w: PLANT PRINT Diagnostics, S.L., De la March 36, 46512 Faura, Valencia (ES). Bezpośredni Tissue print-ELISA Zestaw oparty o specyficzne monoklonalne przeciwciała, włącznie z pozytywną i negatywną kontrolami, nitrocelulozową membraną, alkaliczną fosfatazą skoniugowaną z przeciwciałami i substratem: PLANT PRINT Diagnostics, S.L., De la March 36, 46512 Faura, Valencia (ES). E-mail: [email protected] 168 Erwinia amylovora Przeciwciała • Goat antimouse immunoglobulins (znakowane alkaliczną fosfatazą) Sigma, Steinhein (DE); • Goat antimouse immunoglobulins (znakowane fluoresceiną). Bio-Rad, Marnes-la-Coquette (FR); • Goat antirabbit immunoglobulins (znakowane fluoresceiną). Bio- Rad, Marnes-la-Coquette (FR). Załącznik II Przygotowanie prób do testowania Próby z materiału wykazującego objawy choroby Próby przetwarzane są w różnych buforach zgodnie z używanymi technikami. Antyoksydacyjny bufor do maceracji (Załącznik I) jest rygorystycznie wymagany dla optymalnego wzbogacenia E. amylovora w materiale roślinnym (Gorris et al., 1996b). Próby mogą być również przetwarzane w sterylnym buforze fosforanowym, pH 7.2 10 mM (PBS) (Załącznik I) lub w sterylnej wodzie destylowanej przy izolacji bezpośredniej, immunofluorescencji lub bezpośredniej PCR. Uważnie dokonać selekcji części roślin wykazujących najświeższe objawy, z wyciekami, jeśli to możliwe. Z każdego organu wybrać do analizy i obróbki główny brzeg uszkodzenia. Wycieki mogą być poddawane obróbce odrębnie, w 1– 4.5 ml sterylnej wody lub buforu. W przypadku gałązek, pobrać gałązki z objawami, włącznie z liśćmi, na pograniczu pomiędzy nekrotyczną i zdrową tkanką. W przypadku kwiatów pobrać jeden lub kilka kwiatów z szypułkami. W przypadku liści pobrać jeden lub kilka liści z ogonkami; najlepiej wybierać liście z nekrozami naczyń, ale nie całkowicie znekrotyzowane. W przypadku owoców pobierać jeden lub kilka owoców. Dla łodyg: zdjąć zewnętrzną korę łodygi z objawami choroby używając sterylnego skalpela i pobrać części czyste z typowymi objawami w postaci podkorowych przebarwień. We wszystkich przypadkach, próba powinna składać się z około 0,1g materiału. Gałązki, kwiaty, liście, łodygi lub owoce pocięte na kawałki umieścić w plastikowych woreczkach. Do każdego woreczka dodać 4.5 ml antyoksydacyjnego buforu do maceracji opisanego przez Gorris et al. (1996a) (Załącznik I). Próby macerować nie mniej niż 5 min. Nieznacznie rozdrobnić materiał roślinny w plastikowych woreczkach z użyciem młotka gumowego lub stomachera firmy Bioreba lub podobnego wyposażenia, zapobiegając rozpryskiwaniu kropel na zewnątrz torebki. Trzymać próbę na lodzie przez kilka minut, a następnie przenieść 2 ml, 1 ml i 1 ml każdego maceratu do trzech sterylnych probówek Eppendorfa przez dekantację. Jedną próbówkę zawierającą 1 ml każdej próby przechowywać w - 20 ºC dla celu dalszych analiz lub potwierdzenia, a drugą w 30% glicerolu (Difco) w - 80 ºC. Pozostałe na lodzie probówki użyć do przeprowadzenia badań. Izolacja powinna być wykonana tego samego dnia, co maceracja prób, jak również wzbogacanie i utrwalanie preparatów do immunofluorescencji. Test PCR może być przeprowadzony możliwie najwcześniej, przy wykorzystaniu probówek Eppendorfa przechowywanych w - 20 ºC. Próby z materiału nie wykazującego objawów © 2004 OEPP/EPPO, Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn 34, 159 – 171 Latem lub wczesną wiosną, po potwierdzeniu sprzyjających rozwojowi choroby warunków, pobrać kwiaty, gałązki, szypułki lub fragmenty łodyg do sterylnych woreczków lub pojemników (van der Zwet & Beer, 1995). W przypadku roślin szkółkarskich: odcinać młode gałązki o długości około 20 cm z dostępnych najbardziej wrażliwych roślin żywicielskich, dezynfekować sekator lub nożyce ogrodnicze pomiędzy roślinami. Jeżeli badanie trzeba przeprowadzić zimą, należy pobrać 5-10 pąków na roślinę. W przypadku roślin rosnących w polu, odcinać kwiaty, gdy są dostępne, i/lub młode gałązki o długości około 20 cm, dezynfekować sekator lub nożyce ogrodnicze pomiędzy roślinami. Z wyselekcjonowanych roślin pobrać kwiaty, lub szypułki i nasadę kilku liści, lub fragmenty łodygi. Odważyć 0.1–1 g materiału roślinnego i użyć do maceracji w buforze antyoksydacyjnym (Załącznik I) w ilościach jak dla materiału z objawami choroby (powyżej). Próby poddawać obróbce bezpośrednio po wzbogaceniu, po którym następuje test DASI-ELISA i/lub PCR i/lub izolacja, według protokołów opisanych dla prób materiału z objawami choroby. Test IF powinien być wykonany bezpośrednio z ekstraktów, bez wzbogacania. Procedura fitosanitarna EPPO (OEPP/ EPPO, 1992) zawiera procedurę próbobrania do wykonywania analiz z materiału drzewiastego pędów bez objawów choroby w szkółkach. Próba składa się ze 100 gałązek o długości około 10 cm ze 100 roślin. Jeżeli w partii obecnych jest kilka rodzajów, powinny być one równo reprezentowane w próbie (maksymalnie trzy rodzaje na próbę). Z każdej próby, przypadkowo należy pobrać i pokroić na cztery fragmenty około 30 gałązek (120 części pędów). Umieścić je na 1.5 h na wstrząsarce rotacyjnej w temperaturze pokojowej w sterylnym buforze PBS (Załącznik I) z 0.1% Tween 20 w kolbach Erlenmayera. Filtrować przez bibułę umieszczoną na filtrze ze spiekanego szkła (n◦2 = 40 –100 µm) używając pompy próżniowej i zebrać przesącz. Przesącz użyć bezpośrednio do analizy lub wirować go przez 20 min. w 10.000 g. Osad zawiesić w 4.5 ml sterylnego buforu PBS (Załącznik I). Podobny protokół może być stosowany dla liści, gałązek, kwiatów lub pąków. W zależności od sezonu inspekcji oczekiwana odzyskiwalność E. amylovora może być zmienna, wysoka w lecie (zapewnione korzystne dla E. amylovora warunki pogodowe) i niska zimą. Zgodnie z procedurą, jaka będzie zastosowana, przygotować dla każdej próby 3 probówki Eppendorfa z około 2 ml, 1 ml i 1 ml maceratu i użyć go jak podano dla materiału z objawami (powyżej). Bezpośrednia analiza z materiału nie wykazującego objawów choroby daje na ogół wynik negatywny dla E. amylovora, gdy występuje niska populacja bakterii. Stosowne jest wzbogacenie prób (Załącznik IV) w buforze antyoksydacyjnym (Gorris et al., 1996a) (Załącznik I). Podczas badania materiału bez objawów choroby, wzbogacanie powinno być prowadzone przez 72 h w temperaturze około 25 C. Załącznik III Szybkie testy przesiewowe Bezpośrednia tissue-print ELISA Metoda ta może ułatwi postawienie diagnozy wstępnej w materiale wykazującym objawy choroby, ale wymagane są dalsze testy potwierdzające, ponieważ istnieją specyficzne problemy. Metoda może być również wykorzystana w przypadku punktowych kolonii bakterii lub wycieków jako dodatkowy szybki test identyfikacji serologicznej. Wymagane jest użycie przeciwciał o dobrze znanej specyficzności. Istnieje tylko jeden kompletny zestaw bazujący na specyficznych handlowo dostępnych przeciwciałach monoklonalnych, wskazany w Załączniku I. Do przygotowania odcisku tkanki roślinnej lub plamy (drukowana membrana), powinny być wykonane czyste przecięcia na wykazujących objawy gałązkach, kwiatach, liściach lub szypułkach w polu lub w laboratorium. Świeżo wykonane nacięcia powinny być ostrożnie wtłoczone w membranę nitrocelulozową. Wycieki lub kolonie bakteryjne na podłożu stałym mogą być również drukowane lub nanoszone w postaci plam. Narzędzie do ciecia powinno być dezynfekowane po użyciu, aby zapobiec kontaminacjom. Kontrole pozytywne i negatywne powinny być drukowane, przy użyciu inokulowanych roślin żywicielskich z objawami zarazy ogniowej i roślin zdrowych tego samego gatunku. Odcisk lub druk powinien być zostawiony na kilka minut do wyschnięcia. Z membranami powinno obchodzić się ostrożnie. Zadrukowane membrany powinny być przechowywane przez kilka miesięcy w suchym miejscu w temperaturze pokojowej. Przygotować roztwór 1% albuminy wołowej (BSA) w wodzie destylowanej (mieszać pałeczką). Umieścić membrany w stosownych pojemnikach (taca, hermetyczny pojemnik, plastikowy worek). Wlać, przykrywając go, roztwór albuminy i inkubować 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4C. Nieznaczne mieszanie jest korzystne. Gdy minie czas inkubacji, wylać roztwór albuminy, membranę trzymać w tym samym pojemniku. Rozcieńczyć w buforze PBS specyficzne na E. amylovora monoklonalne przeciwciała (skoniugowane z alkaliczną fosfatazą) (Załącznik I) do właściwego rozcieńczenia. Wlać roztwór na membranę przykrywając go. Inkubować przez 2–3 godziny z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej i wylać roztwór. Przygotować bufor do płukania (Załącznik I). Przepłukać membranę i pojemnik buforem do płukania. Płukać przez wytrząsanie (ręczne lub mechaniczne) z dużą ilością buforu przez 5 min. Usunąć bufor do płukania i powtórzyć operację dwukrotnie. Przygotować bufor substratowy BCIP-NBT (Sigma Fast) (Załącznik I). Wlać powyżej membrany i inkubować aż do czasu pojawienia się purpurowofioletowego zabarwienia w kontroli pozytywnej (w przybliżeniu 10 min.). Zatrzymać reakcję przez płukanie membrany w wodzie wodociągowej. Wysuszyć membranę przez rozłożenie na bibule. Obserwować wydruki przy powiększeniu o małej mocy (X10 lub X20). Test daje wynik pozytywny, kiedy purpurowofioletowy osad występuje w nacięciach materiału roślinnego i w kontroli pozytywnej, i nie występuje w kontroli negatywnej. Jeśli drukowane są wycieki lub kolonie powinny one zabarwiać się na fioletowo, gdy wynik jest dodatni. Kiedy używa się komercyjnie dostępnego zestawu (Załącznik I), zawiera on zadrukowane membrany kontroli pozytywnej i negatywnej. Test daje wynik negatywny, gdy nie obserwuje się osadu o fioletowym zabarwieniu, podobnie jak w kontroli negatywnej. Wzbogacany test DASI-ELISA W handlu dostępny jest tylko jeden zwalidowany w ring testach zestaw do wzbogacanego testu DASI-ELISA (Gorris et al., 1996b). Oparty jest on o przeciwciała monoklonalne i © 2004 OEPP/EPPO, Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn 34, 159 – 171 technikę opisaną przez Gorris et al. (1996a,b). Jako kontrole pozytywne używa się wodne ekstrakty prób, które pierwotnie dały w testach negatywne wyniki, zmieszane z zawiesiną bakterii o gęstości około 108 komórek E. amylovora w mililitrze. Jako kontrole negatywne wykorzystuje się ekstrakty prób, dla których otrzymano wyniki negatywne testów na E. amylovora i zawiesinę w buforze PBS izolatu bakterii nie będącego E. amylovora (Załącznik I). Gotować potrzebną ilość wzbogaconych ekstraktów i kontrole w łaźni wodnej ( lub w termobloku) w 100º C przez 10 min przed testem ELISA, mieć pewność, że próbówki nie otworzyły się podczas gotowania. Pozostały po wzbogaceniu ekstrakt prób przechowywać w celu izolacji i/lub testu PCR. Poddać testowi ELISA gotowane próby (raz w temperaturze pokojowej) tego samego dnia lub zamrozić je w -20ºC w celu późniejszych analiz. Proces gotowania jest konieczny w celu uzyskania optimum czułości i specyficzności przy użyciu przeciwciał monoklonalnych, zgodnie z Gorris et al. (1996a). Przygotować stosowne rozcieńczenia poliklonalnych przeciwciał króliczych w buforze węglanowym, pH 9.6 (Załącznik I). Do każdej studzienki płytki ELISA Nunc Polysorp (lub równoważnej) dodać 200 µl przygotowanych przeciwciał. Inkubować w 37ºC przez 4 h lub w 4 ºC przez 16 h. Wypłukać studzienki płytki trzy razy w buforze do płukania (Załącznik I). Do każdej studzienki dodać 200 µl maceratu roślinnego wzbogaconego wcześniej w dwóch rodzajach podłoży i zagotowanego. Dla jednej próby użyć dwie studzienki płytki na każdy rodzaj podłoża, i po dwie dla kontroli pozytywnej i negatywnej. Konieczne jest również umieszczenie kontroli negatywnej używanego buforu ekstrakcyjnego i wzbogaconego podłoża (przygotowanego wcześniej, jako dodatkowe kontrole negatywne wzbogacania). Inkubować przez 16 h w 4ºC. Wypłukać studzienki trzy razy buforem do płukania (jak wyżej). Przygotować odpowiednie rozcieńczenie specyficznych przeciwciał monoklonalnych na E. amylovora (Załącznik I) w buforze PBS z dodatkiem 0.5% albuminy wołowej (BSA) i dodać do każdej studzienki po 200 l. Inkubować w 37 C przez 2 h. Wypłukać płytkę w buforze PBS Tween trzy razy. Przygotować odpowiednie rozcieńczenie koniugatu z alkaliczną fosfatazą (Sigma) (Załącznik I) w buforze PBS. Dodać 200 l do każdej studzienki. Inkubować w 37C przez 2 h. Wypłukać studzienki trzy razy jak wyżej. Przygotować 1 mg ml 1 substratu alkalicznej fosfatazy (p-nitrofenylofosfat) w buforze substratowym (Załącznik I). Dodać 200 µl do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej i odczytać w 405 nm po 30, 45, i 60 minutach. Test ELISA jest negatywny, jeżeli wartość optycznej gęstości (OD) odczytana w studzienka będących powtórzeniami prób jest < 2x OD od wartości optycznej gęstości w próbie negatywnej kontroli ekstraktu (pod warunkiem, że wartość gęstości optycznej OD dla kontroli pozytywnej jest powyżej 1.0 po 60 minutach inkubacji i jest wyższa niż dwukrotna wartość gęstości optycznej w odniesieniu do ekstraktu próby negatywnej). Test ELISA jest pozytywny, jeżeli wartość gęstości optycznej odczytana ze studzienek bodących powtórzeniami próby jest > 2x OD niż wartość gęstości optycznej ekstraktu próby negatywnej i dwukrotnie wyższa niż wartość gęstości optycznej OD odczytana we wszystkich studzienkach kontroli negatywnej i niższa od wartości w studzienkach kontroli pozytywnej. Negatywny odczyt testu ELISA dla studzienek kontroli pozytywnej wskazuje na niewłaściwe przeprowadzenie testu i nieodpowiednie przygotowanie odczynników. Pozytywny odczyt testu ELISA w studzienkach kontroli negatywnej świadczy o wystąpieniu reakcji 170 Erwinia amylovora krzyżowych lub niespecyficznym wiązaniu koniugatu. W obu przypadkach test powinien zostać powtórzony lub należy wykonać drugi test oparty o inną zasadę biologiczną. Bezpośredni test ELISA Użyć 200 µl wodnej zawiesiny czystej kultury podejrzanego izolatu (po uprzednim poddaniu go gotowaniu w 100 ºC przez 10 minut w łaźni wodnej lub w bloku grzejnym w celu zredukowania reakcji niespecyficznych). Dodać odpowiednią ilość buforu węglanowego (Załącznik I). Zastosować 200 µl zawiesiny wodnej do co najmniej dwóch studzienek płytki Nunc-Polysorp lub równoważnej. Jako kontrolę pozytywną użyć zawiesinę bakterii o gęstości około 109 komórek w mililitrze z czystej kultury E. amylovora a jako kontrolę negatywną podobną zawiesinę innego gatunku bakterii. Inkubować przez 1 h w 37ºC lub przez noc w 4ºC. Wytrząsnąć ekstrakty ze studzienek. Wypłukać studzienki trzy razy buforem do płukania (Załącznik I), ostatni roztwór płuczący pozostawić w studzienkach na co najmniej 5 minut. Przygotować odpowiednie rozcieńczenie przeciwciał przeciwko E. amylovora używając zalecanych rozcieńczeń dla handlowo dostępnych przeciwciał (Załącznik I). Dodać 200 µl do każdej studzienki i inkubować przez 1 h w 37 C. Wytrząsnąć roztwór przeciwciał ze studzienek i wypłukać jak poprzednio. Przygotować odpowiednie rozcieńczenie koniugatu dla alkalicznej fosfatazy (GAM-AP) (Załącznik I) w buforze PBS + 0.5% BSA. Dodać 200 l do każdej studzienki i inkubować przez 1 h w 37C. Wytrząsnąć koniugat ze studzienek jak poprzednio. Przygotować 1 mg ml 1 substratu dla alkalicznej fosfatazy (p-nitrofenylofosfat) w buforze substratowym (Załącznik I). Dodać 200 l roztworu substratu alkalicznej fosfatazy do każdej studzienki. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej i odczytać w 405 nm w regularnych odstępach w ciągu 90 minut. Immunofluorescencja (IF) Wykonywać zgodnie z standardowym protokołem opisanym w UE (1998). Używać zwalidowanych przeciwciał na E. amylovora. W ring testach poddano walidacji trzy komercyjnie dostępne rodzaje przeciwciał. Dla każdej nowej partii przeciwciał zalecane jest wyznaczenie miana i rozcieńczeń roboczych. Test IF powinien być prowadzony na świeżo przygotowanych ekstraktach prób. Jeżeli wykorzystywane będą ekstrakty przechowywane w - 80 ºC pod glicerolem należy usunąć glicerol przez dodanie 1 ml buforu PBS (Załącznik I), wirowanie przez 15 minut z przyspieszeniem 7000 g, wyrzucenie supernatantu i zawieszenie osadu w buforze PBS. Dla każdego zestawu testów przygotować preparat kontroli pozytywnej używając zawiesiny bakterii znanej kultury E. amylovora o gęstości około 106 komórek w mililitrze. W przypadku wykonywania badań zakrojonych na większą skalę zalecane jest dołączenie preparatów ślepych kontroli pozytywnych.. Użyć bufor PBS a jako kontrole negatywne wodne negatywne ekstrakty prób, które przebadane wcześniej kilkoma technikami dały wyniki negatywne. Do nanoszenia na okienka szkiełka do IF używać nie rozcieńczonych maceratów i ich rozcieńczeń 1:10 i 1:100 w buforze PBS (Załącznik I). Dla każdej próby przygotować jeden preparat z rozcieńczeniami. Preparaty pozostawić do wysuszenia na powietrzu i utrwalić przez opalenie lub w alkoholu absolutnym lub 95% etanolu zgodnie z © 2004 OEPP/EPPO, Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn 34, 159 – 171 charakterystyką używanych przeciwciał. Preparaty przechowywać w - 20 ºC. Użyć przeciwciał monoklonalnych lub poliklonalnych w odpowiednich rozcieńczeniach w buforze PBS (Załącznik I). Nanosić po 25 –30 µl na okienko. Preparaty inkubować w wilgotnej komorze przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Zaleca się używanie dwóch rozcieńczeń przeciwciał w przypadku stosowania przeciwciał poliklonalnych, w celu wykrycia reakcji krzyżowych z innymi bakteriami. Strzepnąć krople z preparatów i ostrożnie wypłukać preparaty w buforze PBS w (Załącznik I). Płukać 10 minut używając tego samego buforu. Ostrożnie usunąć nadmiar wilgoci. Rozcieńczyć odpowiedni koniugat FITC w buforze PBS: przeciw mysim przeciwciałom w przypadku przeciwciał monoklonalnych (GAM-FITC) (Załącznik I) i przeciw króliczym przeciwciałom (GAR-FITC) (Załącznik I) lub przeciw kozim przeciwciałom (Załącznik I). Pokryć okienka wszystkich preparatów odpowiednim rozcieńczeniem koniugatu i inkubować w wilgotnej komorze przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Powtórzyć etap płukania. Nanieść pipetą 5–10 µl 0.1 M fosforanowo-glicerynowego buforu zapobiegającego wygaszaniu fluorescencji (0.5% pfenylenodiamina lub inny) na każde okienko i przykryć szkiełkiem nakrywkowym. Oglądać preparaty pod imersją w powiększeniu 500–1000 razy przez przejrzenie okienek w poprzek dwóch średnic pod kątem prostym i wokół obwodu. Przeliczyć liczbę komórek na 1 mililitr próby, zgodnie z UE (1998). Wynik testu jest negatywny, jeżeli w kontroli pozytywnej obserwuje się zielono fluoryzujące komórki o typowej dla E. amylovora morfologii, ale nie ma ich w okienkach prób. Wynik testu jest pozytywny, gdy zielono fluoryzujące komórki o typowej morfologii obserwowane są w kontroli pozytywnej i okienkach prób, ale nie są obecne w okienkach kontroli negatywnej. Populacja 103 komórek na mililitr jest uważana za granicę wiarygodności w teście IF, dla prób z > 103 komórek w mililitrze, test IF uważany jest za dodatni. Dla prób o gęstości < 103 komórek w mililitrze, wynik testu IF może być uważany za wątpliwy. W takim przypadku następne testy lub powtórne próbobrania powinny być przeprowadzone. Próby z duża liczbą niecałkowicie lub słabo fluoryzujących komórek w porównaniu do kontroli pozytywnej wymagają przeprowadzenia dalszych testów, w oparciu o inne rozcieńczenia przeciwciał lub osadu lub o przeciwciała pochodzące z innego źródła. PCR Używać zwalidowanych odczynników do PCR i protokołów. Przedsięwziąć wszelkie środki ostrożności zapobiegające kontaminacji prób. Używać dwóch pozytywnych kontroli z wodnymi ekstraktami próby tego samego żywiciela (który dał wcześniej wynik negatywny testu) o gęstości 10 4 i 106 komórek w mililitrze dodanego znanego szczepu E. amylovora i zawiesiny 104 komórek mililitrze izolatu E. amylovora. Kontrole pozytywne przygotować w laboratorium oddzielonym od tego, gdzie będą testowane próby. Jako kontrolę negatywną użyć co najmniej jeden ekstrakt próby, która wcześniej dała wynik negatywny w badaniu na obecność E. amylovora z wykorzystaniem kilku technik i próby zawierające ultra czystą wodę (odczynnik do PCR). Jeżeli podejrzewa się kontaminację, do każdego etapu ekstrakcji DNA i amplifikacji należy dołączyć więcej kontroli negatywnych. Ekstrakcję DNA z kontroli pozytywnej i negatywnej przeprowadzać w sposób taki sam jak z prób. Dostępny jest jeden protokół ekstrakcji DNA z prób roślin (Llop et al., 1999) i dwa protokoły amplifikacji (Bereswill et al.,1992 i Llop et al., 2000), które zwalidowane zostały w ring testach. Dostępnych jest kilka komercyjnych zestawów do ekstrakcji DNA, ale nie były one poddane walidacji. Ekstrakcja DNA Pobrać bezpośrednio 1 ml każdego maceratu i/lub 1 ml wzbogaconych maceratów, a następnie postępować zgodnie z protokołem ekstrakcji DNA wg Llop et al. (1999). Maceraty wirować w 13.000 obrotów na minutę przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wyrzucić supernatantu, a osad zawiesić w 500 l buforu do ekstrakcji (Załącznik I) i wytrząsać przez 1 h w temperaturze pokojowej. Probówki wirować w 5.000 obrotów na minutę przez 5 minut. Pobrać 450 l supernatantu umieścić go w nowej probówce Eppendorfa. Dodać taką samą objętość izopropanolu, odwrócić kilka razy pozostawić w temperaturze pokojowej na 1 h. Wirować w 13.000 obrotów na minutę przez 5 minut, wyrzucić supernatant i wysuszyć na stole w temperaturze pokojowej. W przypadku obecności zabarwienia osadu w górnej części probówki (brązowe lub zielone) ostrożnie pobrać całość supernatantu, i tak otrzymać czyste DNA. Na ogół, DNA przyczepia się do ścianek probówki bardziej niż do dna. Osad zawiesić w 200 µl wody. Do reakcji PCR użyć 5 lub 1 µl w zależności od rodzaju amplifikacji, która będzie wykonywana. Amplifikacja W celu wykrywania i identyfikacji E. amylovora opisano wiele starterów i protokołów reakcji PCR. Większość z nich może być używana do specyficznej identyfikacji (Bereswill et al., 1992; Bereswill et al., 1995; Guilford et al., 1996;McManus & Jones, 1995). W przypadku niektórych mogą pojawić się specyficzne problemy, jak np. dla starterów wg Maes et al. (1996), które amplifikują Erwinia sp. izolowane ze znekrotyzowanych kwiatów gruszy i inne z E. amylovora (Roselló et al., 2002). Walidacji podlegały startery i protokoły wg Bereswill et al. (1992) i Llop et al. (2000), ponieważ były one uznane za bardziej czułe i silne w konwencjonalnych reakcjach PCR ze sztucznie skontaminowanym materiałem roślinnym we wstępnych doświadczeniach . Niemniej jednak, analiza PCR wg Guilford et al. (1996) lub McManus & Jones (1995) jest również odpowiednia, w tym wypadku do testowania zawiesin bakteryjnych.. Konwencjonalny PCR Zwalidowany konwencjonalny (lub pojedynczy) PCR wykorzystuje startery i warunki opisane przez Bereswill et al. (1992). Sekwencje starterów są następujące (Załącznik I): Starter A: 5-CGG TTT TTA ACG CTG GG Starter B: 5-GGG CAA ATA CTC GGA TT Skład mixu do PCR jest następujący: woda (PCR czystość) 20 l; bufor10 5 l; MgCl2 50 mM 1.5 l; dNTPs 10 mM 1 l; 2- merkaptoetanol 1.4 l; albumina wolowa 1 g l18 l; DMSO 2.5 l; Tween 20 0.5 l; Starter A 10 pmol l12.5 l; Starter B 10 pmol l1 2.5 l; Tth po 5 Ul1 0.1 l. Objętość próby: dodać 5 l to 45 l mixu. © 2004 OEPP/EPPO, Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn 34, 159 – 171 Warunki reakcji: denaturacja 93 C przez 2 minuty, następnie 37 cykli w 93 C przez 1 min, 52 C przez 2 min, i 72 C przez 2 min. Etap końcowy w 72 C przez 10 minut kończący reakcję. Amplikon ma wielkość 900 bp zgodnie z Bereswill et al. (1992), aczkolwiek możliwe są różnice w wielkości amplikonu między 900 a 1100 bp (Lecomte et al., 1997), przy liczbie 8 par zasad sekwencji repetytywnych we fragmencie. (Jones & Geider, 2001). Prostszy mix do PCR daje takie same rezultaty jak oryginalny: woda (PCR czystość) 33.1 l; bufor 10 5 l; MgCl2 50 mM 3 l 3 mM; formamid 2 l 4% (v/v); dNTPs 10 mM 0.5 l; Starter A 10 pmol l1 0.5 l; Starter B 10 pmol l1 0.5 l; Taq polimeraza 5 U l1 0.4 l. Objętość próby: dodać 5 l do 45 l mixu. Warunki reakcji: denaturacja w 93 C przez 5 minut następnie 40 cykli w 93 C przez 30 s, 52 C przez 30 s, i 72 C przez 1 minutę 15 s. Etap końcowy w 72 C przez 10 min kończący reakcję. Pojedyncze składniki mixu mogą być zastąpione przez Ready Mix Taq z MgCl2 lub Ready Mix Red Taq PCR Reaction Mix with MgCl2 (Sigma). Nested PCR Nested PCR w jednej probówce (Llop et al., 2000) z wykorzystaniem dwóch par starterów dodawanych w tym samym czasie. Z powodu ich różnych temperatur anilingu, te dwie reakcje PCR przebiegają kolejno. Startery zewnętrzne wg McManus & Jones (1995), natomiast startery wewnętrzne wg Llop et al. (2000). Sekwencje starterów są następujące (Załącznik I): Startery zewnętrzne AJ75: 5’-CGT ATT CAC GGC TTC GCA GAT AJ76:5’-ACC CGC CAG GAT AGT CGC ATA Startery wewnętrzne PEANT1: 5-TAT CCC TAA AAA CCT CAG TGC PEANT2: 5-GCA ACC TTG TGC CCT TTA Skład mixu do PCR jest następujący: woda (PCR czystość) 34.76 l; Bufor 10 5 l; MgCl2 50 mM 3 l; formamid 2 l; dNTPs 10 mM 1 l; Starter AJ75 0.1 pmol l1 0.32 l; Starter AJ76 0.1 pmol l1 0.32 l; PEANT1 10 pmol l1 1 l; PEANT2 10 pmol l1 1 l; polimeraza 5 U l1 0.6 l. Objętość próby: dodać 1 l do 49 l PCR mixu. Warunki reakcji: denaturacja w 94 C przez 4 minuty następnie 25 cykli w 94 C przez 30 s i 72 C przez 1 minutę. Produkty pierwszej reakcji PCR poddawane sa w tym samym amplifikatorze następnej denaturacji w 94 C przez 4 minuty i 40 cyklom w 94 C przez 30 s, 56 C przez 30 s, i 72C przez 45 s. Etap końcowy w 72 C przez 10 minut kończący reakcję. Wielkość amplikonu wynosi 391 bp, aczkolwiek mogą wystąpić pewne odchylenia. Warunki reakcji zoptymalizowane zostały dla aparatu Perkin- Elmer 9600, niewielkie modyfikacje protokołu mogą być konieczne dla innych amplifikatorów. Gdy PCR wykonywany jest w celu potwierdzenia wyizolowanych kolonii, używa się 1 U Taq polimerazy wg protokołu zaproponowanego przez Bereswill et al. (1992) lub 2 U wg Llop et al., 2000) (zamiast 2 lub 3 U jak dla materiału roślinnego). Elektroforeza Po każdej reakcji PCR przygotować żel agarozowy 1.5% w 172 Erwinia amylovora buforze TAE 0.5 X (Załącznik I). Umieścić 3 l krople buforu obciążającego na parafilmie (Załącznik I), zmieszać 20 l produktu PCR delikatnie przez zasysanie pipetą przed nałożeniem. Wypełnić kieszonki żelu i dołączyć kontrole pozytywną i negatywną. Dołączyć marker DNA 100 bp ladder umieszczając go w pierwszej i ostatniej kieszonce żelu. Rozwijać elektroforezę przez 20 minut w 120 V (średni stolik: 15 10 cm) lub 40 minut w 160 V (duży stolik lub komora elektroforetyczna: 15 25cm). Moczyć żel w roztworze bromku etydyny przez 20 minut. Dokonać wizualizacji zamplifikowanych fragmentów DNA w UV transiluminatorze. Amplikony otrzymane ze starterami wg Bereswill et al. (1992) i amplikony otrzymane w reakcji nested PCR prowadzonej w jednej probówce wg (Llop et al., 2000) mogą być poddane działaniu endonukleaz Dra I i Sma I i uzyskane fragmenty restrykcyjne wykorzystane do potwierdzenia analizy PCR. Interpretacja wyników testu PCR Wynik testu PCR jest ujemny, jeżeli specyficzny dla E. amylovora o przewidywanej wielkości fragment restrykcyjny nie został wykryty dla próby, ale jest wykrywany we wszystkich próbach kontroli pozytywnych. Wynik testu PCR jest dodatni, jeżeli specyficzny o przewidywanej wielkości amplikon został wykryty, pod warunkiem, że nie jest on amplifikowany z żadnej próby kontroli negatywnej i fragmenty restrykcyjne są identyczne jak dla kontroli pozytywnej szczepu. Jeżeli w jednej z kontroli negatywnych stwierdza się obecność prążka o rozmiarze oczekiwanym dla E. amylovora, należy powtórzyć reakcję PCR z nowym mixem i dołączyć kilka kontroli negatywnych, które wykryją kontaminację. Wiarygodne potwierdzenie pozytywnego wyniku może być uzyskane przez powtórzenie testu z drugim zestawem starterów. Inhibicję PCR podejrzewa się wtedy, gdy oczekiwany amplikon jest wykrywany w próbie kontroli pozytywnej zawierającej E. amylovora w wodzie, a wyniki negatywne są otrzymywane z próby kontroli pozytywnej izolatu E. amylovora w ekstrakcie roślinnym. Załącznik IV Wzbogacanie Wzbogacanie jest stosowane w celu namnożenia pierwotnej populacji bakterii E. amylovora w próbie. Jest ono niezbędne przed wykrywaniem testem ELISA, z powodu niskiego poziomu czułości tej techniki podczas używania specyficznych monoklonalnych przeciwciał. Powinno być ono wykonane również przed izolacją lub przed PCR (nawet w próbach bezobjawowych), kiedy spodziewana jest niska liczebność w hodowli E. amylovora (zabiegi miedziowe prób, stare objawy, niekorzystne warunki pogodowe dla zarazy ogniowej, zima, itp.) lub w przypadku podejrzewania wysokiej liczby inhibitorów. W sytuacjach, gdy nieznany jest zróżnicowanie i liczebność populacji mikroorganizmów należy używać dwóch zwalidowanych podłoży, jednego nieselektywnego (King B) i jednego półselektywnego (CCT) (Załącznik I). Wkrótce po przygotowaniu maceratów (Załącznik II), rozlać 0.9 ml każdej próby do dwóch sterylnych 3–5 ml probówek z przygotowaną taką samą objętością każdego wzbogaconego podłoża. Dodatkowo przygotować trzy probówki z 0.9 ml buforu do maceracji, jako kontrole negatywne (Załącznik I) i dodać taką samą objętość buforu i każdego wzbogaconego podłoża (CCT i King B sterylne © 2004 OEPP/EPPO, Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn 34, 159 – 171 podłoża płynne) (Załącznik I). Inkubować w temperaturze 25 C przez 48 h bez wytrząsania. W przypadku, gdy spodziewana jest niska liczebność E. amylovora inkubować przez 72 h, jak wskazano powyżej. Załącznik V Izolacja Izolacja bezpośrednia Użyć podłoża CCT, King B i Lewan (lub Nutrient Agar Sucrose) (Załącznik I). Przygotować rozcieńczenia 1: 10 i 1: 100 każdego maceratu (Załącznik II) w PBS (Załącznik I). Nanieść 50 l rozcieńczonych i nierozcieńczonego maceratu na dwie osobne płytki każdego podłoża. Rozpocząć od rozcieńczenia 1:100 i przechodzić do nierozcieńczonego maceratu. Używać sterylnych ez lub głaszczki lub zanurzanej w etanolu szklanej szpatułki, opalanej i następnie studzonej. Ostrożnie rozprowadzać naniesioną objętość przez trzykrotne rozgłaskanie. Wykonać rozcieńczenia 103, 104 i 105 cfu ml1 czystej kultury E. amylovora jako kontrolę jakości podłoży. Płytki inkubować w temperaturze około 25 C przez 48 –72 h. Końcowy odczyt wykonywany jest po 72–96 h. Kolonie E. amylovora na podłożu CCT pojawiają się po około 48 h i są bladofioletowe, okrągłe, wysoko wypukłe do kopulastych, gładkie i mukoidalne po 72 h, wykazujące powolniejszy niż na podłożu King B i Lewan wzrost. Podłoże CCT hamuje rozwój większości pseudomonad, ale nie Pantoea agglomerans. Kolonie E. amylovora na podłożu King B pojawiają się po 24 h i są one kremowobiałe, okrągłe, z tendencją do rozprzestrzeniania się i nie fluoryzujące w świetle UV przy 366 nm po 48 h. Pozwala to na odróżnienie od fluoryzujących pseudmonad. Kolonie E. amylovora na podłożu Lewan pojawiaja sie po 24 h I są białawe, okrągłe, kopulaste, gładkie I mukoidalne po 48 h. Kolonie lewan ujemne E. amylovora mogą również być notowane (Bereswill et al., 1997). Uzyskać czystą kulturę przez posiew pojedynczych podejrzanych kolonii z każdej próby na podłoże King B. Domniemane kolonie Erwinia amylovora zidentyfikować przez inokulację dostępnych żywicieli E. amylovora, przez DASI-ELISA lub PCR, lub w drodze innego testu (testy biochemiczne, IF, profil kwasów tłuszczowych, itp.) jak jest to wskazane. Kultury przechowywać na skosach z agarem odżywczym pod warstwą oleju mineralnego 10 C lub w celu dłuższego przechowywania w 30% glicerolu w 80 C lub zliofilizować. Wynik izolacji jest negatywny, jeżeli po 96 h inkubacji w żadnym z trzech podłoży nie obserwowano kolonii bakteryjnych o morfologii podobnej do E. amylovora (pod warunkiem że nie podejrzewa się inhibicji z powodu konkurencji lub antagonizmu) a typowe dla E. amylovora kolonie zostały znalezione w kontroli pozytywnej. Wynik izolacji jest pozytywny, jeżeli domniemane kolonie E. amylovora zostały wyizolowane na co najmniej jednym rodzaju używanego podłoża i zidentyfikowane przez potwierdzenie jedną z wskazanych metod. Wzbogacona izolacja Posiać wzbogacenia tylko na płytki z podłożem CCT (Załącznik I). Rozprowadzić 50 µl każdego wzbogaconego ekstraktu i rozcieńczenia 1:10, 1: 100, 1:1000 przygotowane w buforze PBS (Załącznik I) przez trzykrotne rozgłaskanie (jak przy izolacji), w celu uzyskania odizolowanych kolonii. Inkubować w temperaturze około 25ºC przez 72-96 h. Zaleca się używać tylko podłoża półselektywnego i rozcieńczeń, z uwagi na obfite namnażanie się różnych bakterii podczas etapu wzbogacania. Załącznik VI Test biologiczny Inokulacja szypułek (wrażliwych odmian gruszy, jabłoni lub niesplika japońskiego) może być przeprowadzana na zupełnie dojrzałych owocach lub na ich plastrach przy użyciu zawiesiny bakterii o gęstości 109 jednostek tworzących kolonie ml1 w buforze PBS (Załącznik I). Należy dołączyć kontrole pozytywną i negatywną, jak wskazano powyżej. Inkubować w wilgotnej komorze w 25C przez 3–5 dni. Test jest pozytywny, gdy owoce wykazują zbrązowienia wokół miejsc zranienia i wydziela się śluz bakteryjny w ciągu 3 –7 dni (akceptowane jest, że kontrola negatywna daje tylko nekrotyczne obszary). W przypadku inokulacji całych roślin, używać odmian wrażliwych gruszy, jabłoni lub niesplika japońskiego, lub wrażliwych gatunków Crataegus, Cotoneaster lub Pyracantha. W celu inokulacji roślin doniczkowych, nożem zanurzanym w zawiesinie bakterii każdej testowanej kolonii w buforze PBS o gęstości około 109 komórek w mililitrze ciąć młode liście na młodych gałązkach w kierunku głównego unerwienia (Załącznik I). Odcinane młode gałązki z rosnących w szklarni roślin mogą być inokulowane tym samym sposobem, po dezynfekcji przez 30 s 70% etanolem i 3 trzykrotnym płukaniu sterylną destylowaną wodą, i trzymane w próbówkach ze sterylnym 1% agarem. Rośliny utrzymywać w 20–25 C przy wilgotności względnej 80 –100% a probówki w 20–25C przy 16 godzinach światła. Wyniki odczytać po 3, 7 i 15 dniach. Typowe objawy powodowane przez E. amylovora to więdnięcie, przebarwienia, nekrozy tkanki i wycieki śluzu. © 2004 OEPP/EPPO, Biuletyn OEPP/EPPO Biuletyn 34, 159 – 171 A B C D Fig. 1 A: Objawy zarazy ogniowej na kwiatach gruszy (M. Cambra, IVIA, Hiszpania); B: Objawy zarazy ogniowej na pędach jabłoni (M.A.Cambra, D.G.Aragón, Hiszpania); C: Zrakowacenia powodowane przez E. amylovora na pniu gruszy (M. Cambra, IVIA, Hiszpania); D: Objawy zarazy ogniowej na pędach gruszy (M.M.López, IVIA, Hiszpania) A B C D Fig. 2 A: Objawy E. amylovora na Pyracantha (M.M.López, IVIA, Hiszpania) ; B: Inokulacja oderwanych liści pędów gruszy: po lewej kontrola negatywna, po prawej, E. amylovora (P. Llop, IVIA, Hiszpania); C: Objawy E. amylovora zawiązkach owocowych gruszy po inokulacji (V. Donat, IVIA, Hiszpania); D: Kolonie E. amylovora na podłożu CCT (M.M.López, IVIA, Hiszpania).
