Spis treści WPROWADZENIE MIKROSKOPIA
advertisement
Spis treści 1 WPROWADZENIE 2 MIKROSKOPIA 2.1 Świetlna 2.2 Elektronowa 2.2.1 Transmisyjna 2.2.2 Skaningowa 3 INNE METODY 3.1 Badania genetyczne i cytogenetyczne 3.2 Metody immunocytochemiczne 3.3 Metody autoradiograficzne 3.4 Metoda kultury komórkowej (hodowla) 4 ROZDZIELANIE ORGANELLI KOMÓRKOWYCH WPROWADZENIE Badaniem komórek zajmuje się cytologia. Jest to nauka o budowie wewnętrznej i funkcji podstawowej jednostki budulcowej organizmów żywych jaką jest komórka. Badania komórek pozwalają nie tylko na ich dokładniejsze poznanie, ale także znalazły zastosowanie w szeroko rozumianej diagnostyce medycznej. Kliniczne dyscypliny zainteresowane badaniami wnętrza komórek to np. biochemia (zajmująca się w szczególności biosyntezą, strukturą, stężeniem, funkcjami i przemianami substancji chemicznych w organizmach), cytochemia (zajmująca się składem chemicznym organellum i komórki oraz procesami chemicznymi zachodzącymi w organellum oraz w całej komórce) czy cytogenetyka (dział genetyki zajmujący się badaniem chromosomów). Do podstawowych technik cytologicznych należy mikroskopia i analiza biochemiczna poszczególnych frakcji komórkowych. MIKROSKOPIA Świetlna Mikroskop świetlny wykorzystuje światło naturalne lub sztuczne, dostarczane do układu optycznego. Światło może padać na oglądany obiekt z góry (odbiciowy mikroskop optyczny) lub z dołu (w tym przypadku obiekt musi być półprzezroczysty). Tkanka tłuszczowa żółta człowieka wyługowana w skrawku parafinowym Komórki mięśni gładkich Preparat cytologiczny wymazu z szyjki macicy (H+E) Komórki nabłonka z wybarwioną keratyną (czerwony) i DNA (zielony), obraz mikroskopowy Elektronowa Transmisyjna Transmisyjny mikroskop elektronowy jest odpowiednikiem mikroskopu świetlnego — strumień elektronów przechodzi przez preparat (stąd nazwa mikroskopu — transmisyjny) analogicznie do strumienia promieni świetlnych w mikroskopie optycznym. Rejestrowane są elektrony przechodzące przez próbkę (o grubości mniejszej od 0,1 mikrometra). W przypadku dostatecznie cienkich preparatów część elektronów przechodzi przez preparat, gdzie zachodzi szereg efektów. Barwnikami dla preparatów badanych w transmisyjnym mikroskopie elektronowym są związki metali ciężkich (liczba rozproszonych elektronów i ich tory zależne są od liczby atomowej pierwiastka, przez który przechodzi wiązka elektronów). Parapoxvirus (obraz trójwymiarowy) Poliovirus Bacterium Bacillus subtilis Plazmidy (cząsteczki DNA występujące w komórce poza chromosomem, zdolne do autonomicznej replikacji) Skaningowa W mikroskopach skaningowych wiązka elektronów bombarduje próbkę, skanując jej powierzchnię linia po linii. Pod wpływem wiązki elektronów próbka emituje różne sygnały (m. in. elektrony wtórne, elektrony wstecznie rozproszone, charakterystyczne promieniowanie rentgenowskie), które są rejestrowane za pomocą odpowiednich detektorów, a następnie przetwarzane na obraz próbki lub widmo promieniowania rentgenowskiego. Film rozpoczyna się powiększeniem 25x (około 6 mm w całym polu widzenia) i dochodzi do 12000x (około 12 mikrometrów w całym polu widzenia). Kuliste obiekty to szklane kulki o średnicy 10 mikrometrów, podobne do średnicy krwinek czerwonych Ziarna pyłku, czyli męskie elementy rozrodcze roślin nasiennych, słonecznika, wilca purpurowego, malwy, lilii złocistej, pierwiosnka bezłodygowego oraz rącznika pospolitego widziane pod 500x powiększeniem, obraz uzyskany w skaningowym mikroskopie elektronowym. Okrzemki (powiększenie 5000x) Omatidium (podstawowy element budowy oka złożonego) oka kryla antarktycznego (rodzaj skorupiaka) INNE METODY Badania genetyczne i cytogenetyczne Metody immunocytochemiczne Reakcja immunocytochemiczna jest to reakcja polegająca na wykrywaniu i lokalizacji składników komórek i tkanek na zasadzie antygen-przeciwciało. Antygen to substancja, która wykazuje: immunogenność — zdolność wzbudzenia przeciwko sobie odpowiedzi odpornościowej swoistej, antygenowość — zdolność do reagowania z przeciwciałami. Przeciwciało to białko syntetyzowane w odpowiedzi na obecność obcej substancji zwanej antygenem. Białka te posiadają zdolność swoistego rozpoznania antygenu i wiązania się z jego determinantami (determinanta antygenowa). Białka, polisacharydy i kwasy nukleinowe są efektywnymi antygenami. W wyniku trawienia odpowiednim enzymem, cząsteczka przeciwciała rozpada się na fragment Fc oraz dwa jednakowe fragmenty Fab, które zawierają miejsca wiążące antygen. Fragmenty Fab rozpoznają i wiążą się jedynie z niewielkim fragmentem cząsteczki antygenu (kilka-kilkanaście aminokwasów w przypadku białek), który nazywamy determinantą antygenową. W warunkach fizjologicznych układ immunologiczny reaguje na "obce" antygeny, które dostały się do organizmu w sposób naturalny (infekcja bakteryjna, wirusowa, pasożytnicza, itp.). Uwidocznienie miejsca wiązania się przeciwciała z antygenem zlokalizowanym w komórce możliwe jest jedynie pod warunkiem odpowiedniego znakowania przeciwciała. Przeciwciała mogą być znakowane: fluorochromami — barwnikami fluorescencyjnymi — preparat bada się w mikroskopie fluorescencyjnym; metoda immunofluorescencyjna; izotiocyjanian fluoresceiny (zielona), tetrametylo-izotiocyjanian rodaminy (czerwona), czerwień teksańska (czerwona), aminometylokumaryna (niebieska); enzymami — badania na poziomie mikroskopu świetlnego i elektronowego; metoda immunoenzymatyczna; po przeprowadzeniu reakcji należy dodatkowo przeprowadzić reakcję histochemiczną uwidaczniającą aktywność enzymu, którym znakowane było przeciwciało; najczęściej stosowane enzymy to peroksydaza i fosfataza zasadowa; metalami — badania na poziomie mikroskopu elektronowego; na poziomie mikroskopu elektronowego najczęściej stosuje się przeciwciała znakowane koloidalnym złotem. Test ELISA: Służy do wykrycia określonych białek w badanym materiale z użyciem przeciwciał skoniugowanych z odpowiednim enzymem. Przeciwciało (związane z określonym enzymem) może specyficznie rozpoznawać dane białko, które zawarte jest w materiale biologicznym; białko to zostało wcześniej unieruchomione na podłożu. Po dodaniu przeciwciał przeciwciało także zostaje unieruchomione i następuje utworzenie kompleksów immunologicznych. Po wypłukaniu niezwiązanego przeciwciała i dodaniu substratu (dla enzymu związanego z przeciwciałem) zachodzi reakcja enzymatyczna, towarzyszy temu pojawienie się produktu. Wykrycie obecności produktu (np. produkt barwny) świadczy o obecności danego białka w badanym materiale. Za pomocą pomiaru ilości powstającego produktu można przeprowadzić analizę ilościową danego białka. Metody autoradiograficzne Autoradiografia to metoda, która umożliwia zlokalizowanie izotopów promieniotwórczych lub znakowanych nimi substancji w komórkach i tkankach. Substancje te wprowadzane są do żywego organizmu lub żywych komórek, gdzie gromadzą się lub włączają w procesy metaboliczne. W metodzie tej istotne jest to, że substancje chemiczne, które zawierają izotopy promieniotwórcze nie są odróżniane w procesach metabolicznych od substancji nie znakowanych. Po wprowadzeniu znakowanych substancji, z materiału biologicznego będącego przedmiotem badań należy wykonać preparat mikroskopowy. Preparaty mikroskopowe mogą być przygotowywane zarówno do celów mikroskopii świetlnej jak i elektronowej. Pokrywa się je w ciemni warstwą emulsji fotograficznej — od nałożenia emulsji do jej obróbki fotograficznej autoradiogram nie może być wystawiony na działanie światła. Nałożenie emulsji fotograficznej na przygotowany preparat znajdujący się na szkiełku podstawowym, nakrywkowym, lub na siatce do transmisyjnego mikroskopu elektronowego, jest momentem istotnym. Istnieją dwie techniki: technika emulsji płynnej stosowana do mikroskopii świetlnej, preparat zanurza się emulsji w formie zawiesiny bromku srebra w żelu, który podgrzany do 40 stopni Celsjusza przyjmuje postać płynną, skrawek stawia się pionowo by nadmiar substancji spłynął, na skrawku pozostaje ściśle przylegająca warstwa, stosowana także do mikroskopii elektronowej, w płynnej emulsji zawiesza się niewielką pętlę z drutu platynowego, w pętli pozostaje cienka błona emulsji, nakłada się ją na powierzchnię siatki ze skrawkami, wada tej techniki: nierówna grubość emulsji, uzależniona głównie od procesu jej wysychania, technika emulsji zdzieranej, stosowana do mikroskopii świetlnej, preparaty biologiczne pokrywa się paskami emulsji, które są zdzierane ze szklanych płyt, technika ta wymaga utrzymania stałych warunków wilgotności(60‑65%), zaleta tej techniki: jednolita grubość emulsji gwarantująca powtarzalność wyników badań. W preparacie biologicznym substancje radioaktywne są przyczyną miejscowej zmiany w kryształach bromku srebra emulsji, co po wywołaniu i utrwaleniu emulsji prowadzi do powstania w tych miejscach strątu metalicznego srebra (widocznego w mikroskopie w formie czarnych ziarenek) → reakcja ta zachodzi w emulsji bezpośrednio nad miejscem, w którym umiejscowione są substancje promieniotwórcze. Zastosowanie: śledzenie dróg migracji komórek przemieszczających się, śledzenie populacji komórek intensywnie namnażających się, poprzez wbudowywanie znakowanych nukleotydów do nowo syntetyzowanych łańcuchów DNA, badanie sposobu namnażania się organelli komórkowych. Czas ekspozycji, który jest konieczny do wytworzenia wystarczająco intensywnego obrazu utajonego, zależy od: energii emisji izotopu, jego ilości w danym materiale, własności i grubości emulsji, autoradiogramy do celów mikroskopii świetlnej — kilka dni, autoradiogramy do celów mikroskopii elektronowej — do kilku miesięcy, Po obróbce fotograficznej autoradiogram można już bez ograniczeń eksponować na światło. Substancje znakowane izotopami promieniotwórczymi można podawać albo zwierzęciu doświadczalnemu (przeważnie do krwiobiegu), albo do hodowli komórkowej lub tkankowej (do płynu hodowlanego). W przypadku śledzenia przemian metabolicznych (a także rozwoju i losów organelli lub komórek), stosuje się najczęściej znakowanie pulsacyjne, które polega na jednorazowym podaniu preparatu izotopowego w ciągu bardzo krótkiego czasu. W kolejnym kroku obserwuje się lokalizację znakowanych struktur w odpowiednich przedziałach czasowych. Metoda kultury komórkowej (hodowla) Hodowla komórek jest to utrzymywanie oddzielonych od organizmu komórek w warunkach sztucznych (in vitro) przez okres dłuższy niż doba. Stwarza ona unikalną możliwość obserwacji zachowania się żywych komórek pozbawionych kontrolnego i regulacyjnego wpływu całego organizmu. Zagadnienia badane przy użyciu hodowli komórek: funkcjonowanie aparatu genetycznego komórki, wpływ na komórki substancji regulacyjnych, toksycznych, rakotwórczych lub leków, aberracje chromosomowe, genetycznie uwarunkowane zaburzenia metabolizmu i wyposażenia komórek, produkowanie przez komórki substancji czynnych biologicznie, odpowiedź komórek na stymulację antygenem, Wyróżnia się: hodowlę pierwotną — jest ona zapoczątkowana pobraniem komórek bezpośrednio z organizmu, linię komórkową — powstaje ona przez przeniesienie części hodowli pierwotnej do odrębnej hodowli. Jest to kultura dzielących się komórek, powstałych z podziału jednej lub kilku komórek wyselekcjonowanych z organizmu wielokomórkowego. Jeżeli mozliwe jest wielokrotne przenoszenie materiału do kolejnych hodowli, mówimy wtedy o ustalonej linii komórkowej. Dwa rodzaje: linie komórkowe diploidalne, czyli takie, w których 75% lub więcej komórek wykazuje diploidalną liczbę chromosomów, linie heteroploidalne — charakteryzują się często nieograniczonym czasem wzrostu i łatwo ulegają transformacji nowotworowej. Według obecnego stanu wiedzy linie komórek nowotworowych są nieśmiertelne, a zatem mogą przechodzić nieskończenie wiele podziałów. Jednak ze względu na wysoką niestabilność genetyczną nowotworów, po kilkunastu latach pasażowania komórki zmieniają swoje pierwotne właściwości. Do najbardziej znanych linii komórkowych należą linie powstałe z około 60 rodzajów nowotworów złośliwych (przechowywane są przez National Cancer Institute) → wśród nich również linia HeLa (linia komórkowa wywodzącą się z komórek raka szyjki macicy, patrz. zdjęcie) szczep komórkowy — wyprowadzony z hodowli pierwotnej lub linii komórkowej poprzez wyodrębnienie komórek o określonej charakterystyce, np. zdolności do produkcji specyficznego związku chemicznego lub braku określonych organelli. Utrzymuje się ona w trakcie dalszych pasaży szczepu, klon komórkowy — populacja komórek wywodząca się z jednej komórki macierzystej (powstała na drodze jej wielokrotnych podziałów). Podstawowe warunki hodowli: dostarczenie komórkom składników niezbędnych do ich rozwoju i wzrostu: specjalne pożywki, zastępujące żywym komórkom ich naturalne środowisko: substancje odżywcze i energetyczne takie jak aminokwasy, glukoza i lipidy, witaminy, sole mineralne, będące źródłem jonów koniecznych dla licznych procesów czynnościowych takich jak np. migracja; pH pożywki musi być zbliżone do naturalnego pH komórek, ochrona przed zanieczyszczeniem hodowli mikroorganizmami, innymi komórkami lub substancjami toksycznymi: bezwzględna jałowość całej procedury hodowlanej, do samych pożywek można dodać antybiotyki (takie jak: penicylina, streptomycyna, chloramfenikol lub mykostatyna), w celu zabezpieczenia hodowli przed rozrostem bakterii, grzybów czy wirusów. Systemy hodowli: system otwarty — hodowla w naczyniach, w których materiał hodowany kontaktuje się ze środowiskiem zewnętrznym, system zamknięty — hodowanie materiału w hermetycznie zamkniętych naczyniach, zapewniające komórkom stałe warunki środowiska, system mieszany — przeważnie badając wzajemne oddziaływanie na siebie komórek różnych rodzajów, w naczyniu przedzielonym na odrębne komory. Komory mogą być oddzielone od siebie siatkami pozwalającymi na wymianę produkowanych przez hodowane komórki substancji. Jednocześnie komórki nie mają możliwości przechodzenia pomiędzy komorami. ROZDZIELANIE ORGANELLI KOMÓRKOWYCH Jest to metoda polegająca na rozdzieleniu zawartości komórki na poszczególne elementy, wykorzystująca zjawisko wirowania (organelle cięższe opadają na dno, natomiast lekkie pozostają na powierzchni — dzięki sile odśrodkowej wytwarzanej w wirówce można wyróżnić poszczególne frakcje). Aby tego dokonać, komórka pozbawiona być musi zarówno ściany jak i błony komórkowej (poprzez homogenizatory, ultradźwięki, czy wysokie ciśnienie). Całą procedurę prowadzi się w temperaturze kilku stopni powyżej 0°C, pH 7,4 i w obecności inhibitorów enzymów rozkładających białka. Wyróżniamy: wirowanie frakcjonujące z różną prędkością (różnicowe) — wirowanie ze wzrastającym przyspieszeniem; wirowanie to wykonuje się każdorazowo zlewając supernatant (roztwór znad osadu) i wirując powtórnie, aż do uzyskania oczekiwanej frakcji, wirowanie w gradiencie stężeń — w procesie wirowania następuje migracja cząsteczek w gradiencie, gdy ich molekularna gęstość jest zrównoważona gęstością separującego roztworu dana grupa molekuł zajmuje zwarte określone miejsce (struktury komórkowe opadają do momentu, gdy gęstość soli lub cukru zrówna się z ich gęstością).
