Genom to klucz do zrozumienia struktury, organizacji i funkcji

Dr n.przyr. Ewa Chmara
CZYNNIKI GENETYCZNE WPŁYWAJĄCE NA DZIAŁANIE LEKÓW
Farmakogenetyka - kerunek badań koncentrujący się na:
- dziedzicznie uwarunkowanych różnicach w działaniu leku, a także ich przyczynach na
poziomie molekularnym;
- znaczeniu klinicznym zmienionego działania leku;
- testach umożliwiających identyfikację zagrożonych pacjentów przed rozpoczęciem leczenia
(terapia celowana);
- poszukiwaniu genów oporności;
- mutagennym działaniu leków i ksenobiotyków
„ Głównym celem farmakogenetyki jest zapewnienie pomocy w podawaniu i dawkowaniu
chorym takich leków, których stosowanie stwarza największe prawdopodobieństwo
odniesienia korzyści terapeutycznych i najmniejsze prawdopodobieństwo wystąpienia
reakcji niepożądanych”.
 Farmakogenetyka wychodziła od nietypowej reakcji na lek, aby
przez badanie fenotypu dotrzeć do odpowiedzialnej za tę reakcję
mutacji genu.
 Farmakogenomika jest próbą odwrócenia podejścia do problemu
odmienności osobniczych:
Wychodzi od odkrytych wielu różnic genetycznych, takich jak liczne SNP, aby
poprzez analizę DNA, RNA (transkryptomika) i powstającego białka (proteomika)
dotrzeć do osobniczych reakcji będących sumą tych wszystkich czynników.
Efekt farmakologiczny zależy od:
 genetycznie uwarunkowanej aktywności enzymów metabolizujących leki (procesy I i II
fazy biotransformacji)
 ekspresji genów kodujących białka biorące udział w mechanizmie działania leków
(receptory, kanały jonowe, transportery neuroprzekaźników)
 ekspresji genów kodujących białka transporterów dla leków (gen ABCB1 kodujący
glikoproteinę P)
Procesy farmakokinetyczne determinowane genetycznie:
1. Wchłanianie
2. Dystrybucja
3. Metabolizm
4. Wydalanie
Molekularne mechanizmy polimorfizmu genetycznego mogą polegać na:

Mutacji pojedynczego nukleotydu SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

Mutacjach dotyczących całego genu, jego fragmentu, zwielokrotnienia,
powtórzenia nukleotydu (haplotypy)
Bazy danych NCBI
NCBI (National Center for Biotechnology Information)
bazy danych są ze sobą powiązane poprzez unikalny system wyszukiwania i pobierania, zwany
Entrez:
www.ncbi.nlm.nih.gov
BADANIE GENOTYPU
Precyzyjna ocena, czy zaburzenie szybkości metabolizmu leków jest związane z defektem
genetycznym , czy też wynikiem oddziaływania dodatkowych czynników niegenetycznych takich
jak np.:












Związana z wiekiem niedojrzałość enzymatyczna wątroby,
Wiek, płeć, masa ciała,
Ciąża
Infekcja, choroba, stres
Leki towarzyszące (interakcje)
Zmienność dobowa i sezonowa
Dieta, suplementy diety
Czynność układu sercowo naczyniowego
Czynność układu immunologicznego
Czynność wątroby, nerek, płuc
Spożycie alkoholu, palenie tytoniu
Zanieczyszczenia środowiska
GENETYCZNIE UWARUNKOWANE ZABURZENIA WCHŁANIANIA LEKÓW
Przyczyna - zwiększona ekspresja genu ABCB1 dawniej nazywanego MDR1 (ang.:Multi Drug
Resistance 1, gen oporności wielolekowej) odpowiedzialnego za wytwarzanie białka P
glikoproteiny (20 odmian polimorficznych)
Leki będące substratami podlegającymi transportowi przez P-gp:
- leki sercowo-naczyniowe (digoksyna, chinidyna, celiprolol, talinolol, werapamil)
- leki przeciwnowotworowe (aktynomycyna D, doksorubicyna, daunorubicyna, etopozyd,
irynotekan, paklitaksel, winblastyna)
- leki immunosupresyjne (cyklosporyna A, takrolimus)
- steroidy (aldosteron, hydrokortyzon, deksametazon)
- opioidy (morfina, metadon)
- leki przeciwgruźlicze (ryfampicyna)
- leki różne (cefazolina, kolchicyna, atorwastatyna, erytromycyna, flufenazyna, lowastyna,
perfenazyna, ondansetron, fenytoina, tamoksyfen, tiorydazyna, loperamid).
GENETYCZNIE UWARUNKOWANE ZABURZENIA METABOLIZMU LEKÓW


Polimorfizm utleniania (cytochromu P-450)
Polimorfizm acetylacji
Genotyp utleniania – Cytochrom P-450 (CYP-450)
 Jest hemoproteiną obecną w mikrosomach komórek wątrobowych (także: nabłonek
jelitowy i płuca)
 Funkcja: CYP jest końcową oksydazą, która prowadzi do utleniania wielu leków (ok.
80%)
 Liczba izoenzymów CYP-450 jest olbrzymia, a do klasycznych należą: CYP2D6,
CYP2C19, CYP2C9, CYP1A2, CYP3A4
Antidepresants
Antihypertensives
Anti-arrhytmics
Analgetics, opiates
Antidiabetics,
Beta-blocers…..
EtOH, Antirheumatics….
NSAIDs
Anti-epileptics,
Anticoagulants
Lovastatin, Simvastatin, Atovarstatin
Cyclosporine
HIV protease inhibitors,
Calcium channel blockers
Erythromycin, clarithromycin
SSRI, TCAs…..
TCAs, Theophylline, Estrogens
The percentage of individual isoenzymes
Quantitative differences
www.pharmacologyweekly.com
Farmakogenetyka leków przeciwbólowych
CYP2D6 : kodeina
Hydrokodon
Oksykodon
Metadon
Tramadol
Częstość w populacji:
PM: 5-10%
UM: 2-3%
EM: 80-90%
CYP2C9:
Diklofenak
Ibuprofen
Ketoprofen
Naproksen
Meloksykam
Piroksykam
Indometacyna
Celekoksyb
Częstość w populacji:
CYP2C9*2: 10,7 – 12.5%
CYP2C9*3: 7,4 – 8,5%
Statyny metabolizowane w układzie P-450: fluwastatyna, ceriwastatyna, atorwastatyna,
lowastatyna, simwastatyna
Statyny praktycznie niemetabolizowane w układzie P-450: pitawastatyna, prawastatyna,
rosuwastatyna
Polimorfizm utleniania / fenotypowe grupy:
 EM (Extensive Metabolizers) - szybcy metabolizerzy
(osoby dobrze, w znacznym stopniu utleniający)
 PM (Poor Metabolizers) – osoby wolno, słabo utleniający
 IM (Intermediate Metabolizers) – osoby o pośrednim metabolizmie
 UM (Ultrarapid Metabolizers) – osoby ze zwielokrotnioną liczbą aktywnych
genów
Ważniejsze induktory i inhibitory metabolizmu leków:
Induktory: fenobarbital, fenytoina, karbamazepina, ryfampicyna, aminoglutetimid
Inhibitory: amiodaron, allopurynol, cymetydyna, diltiazem, erytromycyna, disulfiram,
enoksacyna, flukonazol, izoniazyd,ketokonazol, klarytromycyna, metronidazol, omeprazol,
rytonawir, werapamil,
Polimorfizm reakcji II fazy biotransformacji
N-acetylotransferaza (NAT1/2)
S-transferaza glutationowa
UDP-glukuronylotransferaza
S-metylotransferaza tiopuryny
NAT2 – enzym odpowiedzialny za acetylację leków i ksenobiotyków bedacych aryloaminami
lub hydrazynami. Znanych jest ponad 100 odmiennych alleli:
Allel NAT2*4 koduje szybką acetylację;
Allele NAT2*5A, *5B, *5D, *6A, *7A, *7B, *14B są przyczyną wolnej acetylacji.
W populacji kaukaskiej fenotyp „wolno acetylujący”: 40 - 60% ludzi
Przykłady leków metabolizowanych przez N-acetylotransferazę NAT1 i NAT2
NAT1: kwas p-aminosalicylowy, kwas p-aminobenzoesowy, sulfametoksazol, sulfanilamid
NAT2: izoniazyd, sulfametazyna, hydralazyna, dapson, prokainamid, nitrazepam, kofeina, 2aminofluoren
WYBRANE POLIMORFIZMY
1. Paracetamol / S- transferaza glutationowa
Prawidłowy metabolizm paracetamolu:
- utlenianie do bardzo toksycznej N-acetylo-p-benzochinoiminy (NAPQI)
- koniugacja z glutationem.
 Mutacja deaktywująca sprzęganie z glutationem ( GSTM1 i GSTT1)
 Efekt mutacji : już małe dawki paracetamolu mogą prowadzić do objawów zatrucia !
dawka > 10-15 g: hipoglikemia, martwica wątroby, śpiączka, zgon
dawka 6 g (dawka toksyczna): osoby z chorobami wątroby, alkoholicy
Odtrutka N-acetylocysteina (ACC) lub węgiel aktywny
zalecenia Polskiego Towarzystwa Toksykologicznego !!!!
2. Leki przeciwkrzepliwe
Klopidogrel
Polimorfizm genów:
1. ABCB1 związany z absorpcją (Glikoproteina P)
2. CYP3A5, CYP2C19 – związane z aktywacją proleku w aktywny metabolit w wątrobie
3. P2RY12, ITGB3 – związane z aktywnością receptorów płytkowych
Warfaryna i acenokumarol
Optymalizacja leczenia antagonistami witaminy K - rola polimorfizmów genowych (CYP2C9 i
VKORC1) )
 Polimorfizm : CYP2C9
Polimorfizm genetyczny związany z różnym tempem metabolizmu Acenokumarolu i Warfaryny
a wysokością dawki terapeutycznej oraz występowaniem powikłań krwotocznych.
Allele: CYP2C9*2 ( 8-12% chorych) i CYP2C9*3 (3-8% chorych)
– warunkują wolniejszy metabolizm (większe ryzyko krwawień)
Mniejsza dawka jest skuteczna!
 Polimorfizm: VKORC1
Polimorfizm podjednostki 1 reduktazy epoksydu witaminy K (VKORC1) istotnie wpływa na
skuteczność działania antykoagulantów doustnych, antagonistów witaminy K.
Allele:
VKORC1*2
mniejsza o ok. 50% ilość enzym
VKORC1*3 i *4
oporność na VKA
Polimorfizm genów CYP2C9 i VKORC1 łącznie odpowiadają za 50% zmienności
odpowiedzi farmakologicznej na warfarynę – stabilnej dawki antagonistów witaminy K
4. Genetycznie uwarunkowany polimorfizm dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowejG6PD
Istnieje ponad 80 typów G6PD-najbardziej znane:
Afrykański (A) : niedobór – hemoliza powoduje zniszczenie tylko starszych krwinek 63-67
dniowych
Śródziemnomorski (B): niszczone wszystkie krwinki czerwone konieczność przetoczenia krwi
Konsekwencje: nie wolno przyjmować: leków o właściwościach utleniających, bobu (fawizm),
agrestu, czerwonej porzeczki !!!
5. Wrażliwość na sukcynylocholinę
Sukcynylocholina jest lekiem stosowanym pomocniczo w narkozach w celu zmniejszenia
napięcia mięśni szkieletowych. Działanie leku jest zazwyczaj krótkotrwałe (3-5 minut), ponieważ
sukcynyclocholina jest metabolizowana przez cholinoesterazę (ChE).
Nadwrażliwość na sukcynylocholinę jest uwarunkowana genetycznie. U ludzi z tą enzymopatią
prawidłowa dawka sukcynylocholiny może spowodować długotrwały bezdech, prowadzący
niekiedy nawet do śmierci. Reakcja taka spowodowana jest nieprawidłowym genem
cholinesterazy rzekomej. W populacji kaukaskiej u ok. 1 na 3000-3500 osób blokada nerwowomięśniowa po tym leku przedłuża się nawet do 3 - 4 godzin, co z powodu całkowitego porażenia
mięśni oddechowych i bezdechu, stwarza niebezpieczeństwo dla życia ( wystarcza 1/60 zwykłej
dawki leku)!
6. Genetycznie uwarunkowana predyspozycja do hipertermii a stosowanie środków
znieczulenia ogólnego i zwiotczającego
U osób z dziedziczną predyspozycją do złośliwej hipertermii (Malignant Hyperthermia – MH)
gwałtownie wzrasta ciepłota ciała (do 43-44°C), wzrasta napięcie mięśni, pojawia się
przyspieszenie akcji serca, duszność, sinica, rozwija się kwasica metaboliczna i oddechowa,
wzrasta stężenie potasu, zmniejsza się stężenie wapnia we krwi, rozwija rabdomioliza.
U osób będących nosicielami zmutowanego genu RYDR – kodującego wytwarzanie receptora
rianodynowego (Rianodine Receptor - RYDR), kontrolującego kanał wapniowy, zachodzi
niekontrolowany napływ jonów Ca do komórki.
Aktywne usuwanie z komórki jonów Ca przez dążący do homeostazy organizm powoduje
wytwarzanie dużej ilości ciepła.
Częstość występowania hipertermii: 1 / 5000 znieczuleń
Do najsilniejszych aktywatorów należą:
Anestetyki dożylne: ketamina
Anestetyki wziewne: halotan, izofluran, eter dwuetylowy, metoksyfluran
Środki zwiotczajace: suksametonium, deksametonium, galamina
Leki sympatykomimetyczne
Leki nasercowe: glikozydy naparstnicy, wapń
7. Genetycznie uwarunkowany polimorfizm glukuronylotransferazy (UGT1A1)
Substratem UGT1A1 jest Irynotekan.
U słabych metabolizerów (PM) - nosicieli allela UGT1*28 po podaniu leku
przeciwnowotworowego - irynotekanu aktywny metabolit (SN-38) ulega kumulacji, czego
następstwem może być ciężka toksyczność ( biegunka, neutropenia, małopłytkowość).
8. Herceptin (Trastuzumab) - stosowany w leczeniu raka piersi i beta-komórkowego
chłoniaka nieziarniczego.
Jest monoklonalnym przeciwciałem skierowanym swoiście przeciwko receptorowi HER2,
którego białko jest kodowane przez gen ERBB2. Nadekspresja tego receptora obserwowana jest
w 25-30 % przypadków raka piersi i jest skorelowana ze złośliwością nowotworu i zwiększonym
prawdopodobieństwem nawrotu choroby i śmierci.
Trastuzumab wiąże się specyficznie z receptorem, który uległ nadekspresji, wskazując tym
samym komórki rakowe do zniszczenia przez system immunologiczny – specyficznie działający
lek dla nowotworów z nadekspresją HER2/ERBB2
Możliwość skutecznej, celowanej terapii, powstanie nowej grupy leków, takich jak: cetuksymab,
lapatynib i pertuzumab
9. Analiza genu KRAS - analiza 12 i 13 kodonu sekwencji genu (miejsca najczęstszych
mutacji). jakościowo, sekwencjonowanie automatyczne.
Gen KRAS koduje białko, które jest jednym z najczęściej aktywowanych onkoprotein w rakach
trzustki, tarczycy, jelita grubego, płuc oraz białaczkach szpikowych u ludzi.

Forma genu decyduje o powodzeniu terapii celowanej w leczeniu raka jelita
grubego (Panitumumabem, Cetuximabem itd.), opartej na hamowaniu namnażania komórek
poprzez inhibitory receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), epidermal growth
factor receptor)

Określenie statusu genu KRAS jest konieczne przed przystąpieniem do tej terapii,
ponieważ w przypadku występowania mutacji dowiedziono jej nieskuteczność.
 Występowanie zmutowanego genu KRAS stwierdza się u ok.45-50% chorych na raka
jelita grubego !!!!
10. Efektywności Albuterolu w leczeniu astmy
Albuterol (salbutamol): agonista receptora -2 adrenergicznego (ADRB2); łagodzi objawy astmy
Badania wykazały związek pomiędzy polimorfizmem w rejonie kodującym genu ADRB2
(warianty alleliczne Arg-16 lub Gly-16) a odpowiedzią na lek.
Pacjenci homozygotyczni (dwa allele Arg-16) wykazywali pięciokrotnie silniejszą odpowiedź na
leczenie niż homozygoty Gly-16.
U pacjentów heterozygotycznych (Arg-16/Gly-16) odpowiedź na lek była 2.3 razy wyższa w
porównaniu do homozygot Gly-16.
11. Nadwrażliwość na Abacavir
Abacavir – inhibitor transkryptazy, stosowany w terapii AIDS
4.3 % pacjentów leczonych abacavirem – nadwrażliwość: gorączka, wysypka, biegunka, w
ostateczności śmierć. Objawy nadwrażliwości cofały się po zaprzestaniu terapii
Badania genetyczne: rejon HLA: allel HLA-B*5701 jest znacząco skorelowany z
nadwrażliwością. Testy genetyczne mogą okazać się skuteczną metodą uniknięcia przypadków
nadwrażliwości na abacavir .
12. Farmakogenetyka nowotworów
Imatinib (Gleevec): lek stosowany w terapii przewlekłej białczki szpikowej(CML)
Działanie: Wiąże i inaktywuje białko BCR-ABL – kinazę tyrozynową aktywującą proliferację
leukocytów (przyczyna CML).
Problem: mutacje BCR-ABL mogą prowadzić do oporności na imatinib (inhibicja wiązania leku)
Badania farmakogenetyczne: zidentyfikowano kilka somatycznych mutacji w BCR-ABL, z czego
6 stanowi 60-70 % wszystkich obserwowanych mutacji
Wskazania do określenia genotypu metabolizmu leku
1. Leki stosowane w formie proleku lub których metabolit ma istotne znaczenie
farmakologiczne/terapeutyczne: enkainid, proguanil, kodeina;
2. Leki o małej wartości indeksu terapeutycznego lub o dużej farmakokinetycznej zmienności
(czyli takie, dla których jedyna lub główna droga metabolizmu jest katalizowana
przez polimorficzny enzym), wykazujące znaczne/ niebezpieczne efekty uboczne
3. Leki mające możliwość alternatywnego metabolizmu, prowadzącego do powstania związku
toksycznego, np.fenacetyna.
Korzyści wynikające z wykonania testu genotypowania
1. Możliwość szybkiego podjecie decyzji dotyczącej dawki leku, a zatem zwiększenie jego
skuteczności i tolerancji;
2. Osoby „słabo metabolizujące": uniknięcie odstawienia leku z powodu braku jego tolerancji
3. Osoby „ultraszybko metabolizujące": uniknięcie odstawienia prawidłowo wybranego leku
wskutek braku efektu terapeutycznego spowodowanego zbyt małym jego stężeniem w krwi, a
w przypadku monitorowania stężenia leku w osoczu uniknięcie niesłusznego
posądzenia pacjenta o niestosowanie się do zaleceń lekarza (noncompliance);
4. Genotypowanie może w dużym stopniu zastąpić monitorowanie stężenia leku w klinice, co
ma szczególne znaczenie w przypadku pacjentów nie reagujących na lek, nie tolerujących
leku oraz osób starszych ze współistniejącymi schorzeniami układu krążenia, wątroby, nerek;
5. Wykonanie jednego z powyższych testów umożliwia (ułatwia) prawidłowe wprowadzenie
nowego leku do terapii przez zastosowanie bezpiecznej dawki;
6. Ponieważ test taki wystarczy wykonać raz w życiu, czas i koszty są usprawiedliwione,
zwłaszcza w przypadku leczenia długotrwałego lekami nasercowymi lub psychotropowymi.
Zalecenia FDA
Markery farmakogenetyczne – przeprowadzane przed podaniem leków (ponad 150 markerów
farmakogenetycznych na liście FDA)
Farmakogenetyka w grupach etnicznych - zróżnicowanie międzypopulacyjne wpływa również
na działanie niektórych leków
Genotypowanie - etapy
1. Izolacja DNA z materiału biologicznego i kontrola jakości :
Metoda chloroformowo-fenolowa
Metoda wysalania
Adsorpcja na kolumnach z krzemionką i solami chaotropowymi
Z zastosowaniem cząstek magnetycznych (Fe3 O4 z krzemionką)
2. Amplifikacja fragmentu DNA (PCR) – specyficzność procesu.
3. Rozdział elektroforetyczny (na żelach agarozowych i poliakryloamidowych)
4. Wizualizacja (bromek etydyny z dwuniciowym DNA wykazuje zdolność do
fluorescencji w świetle UV )
6. Obliczenia częstości występowania alleli.
Metody analityczne - podstawowe techniki biologii molekularnej
 PCR / RFLP (ang. Polymerase Chain Reaction - Łańcuchowa Reakcja
Polimerazy / ang. Restriction Fragment Length Polymorphismanaliza fragmentów DNA po cięciu enzymami restrykcyjnymi);
 RT/PCR (ang.ReverseTranscription Polymerase Chain Reaction),
Czyli kombinowana metoda z udziałem enzymu odwrotnej transkryptazy w
połączeniu z techniką PCR;
 Real Time PCR daje możliwość detekcji przyrostu ilości produktu PCR w
czasie rzeczywistym;
 Mikromacierze (ang.DNA microarrays), chipy DNA - badanie profilu
molekularnego komórek i tkanek przez równoczesną hybrydyzację izolowanego z
nich RNA do wielu tysięcy sond oligonukleotydowych – możliwość badania
całego genomu podczas jednej analizy!
 Sekwencjonowanie; Pirosekwencjonowanie; Sekwencjonowanie nowej generacji
TORRENT.
Epigenetyka
Pojęcie: „ekspozom” - idea, że środowisko, w którym żyją geny ma większe znaczenie od
samych genów.
Opinie – ponad 70% chorób ma związek z ekspozycją na czynniki środowiskowe.
 Zestaw czynników , które decydują o zdrowiu i chorobach:
toksyny, jedzenie, mikroby, wewnętrzne substancje chemiczne, w tym
wszystkie aktywne biologicznie cząsteczki kontrolujące stany zapalne, stres
oksydacyjny, mikroflora jelitowa i inne naturalne procesy.
 Epigenomika, nutrigenomika, mikrobiomika, toksygenomika…..i inne omiki !!!!