Nikotyna jako modulator aktywności fosfatazy kwaśnej oraz
advertisement
PRACE ORYGINALNE Aleksandra MOŹDZIERZ1 Anna RZEPECKA –STOJKO2 Małgorzata JUSZKO-PIEKUT1 Dorota OLCZYK1 Jerzy STOJKO1 Włodzimierz MIERZWA1 Wioleta KOBIELA1 Nikotyna jako modulator aktywności fosfatazy kwaśnej oraz katepsyny D i katepsyny L w wątrobie i nerkach myszy Medical University of Silesia in Katowice, Polandn School of Pharmacy, Department of Hygiene, Bioanalysis and Environmental Studies 3A Kasztanowa St., 41-200 Sosnowiec, Poland Do tej pory nie spotkano doniesień omawiających wpływ nikotyny na aktywność enzymów układu lizosomalnego. Opisane badania są przypuszczalnie jedną z pierwszych analiz dotyczących aktywności modelowych hydrolaz lizosomów wątroby i nerek myszy jako zwierząt doświadczalnych, poddanych działaniu różnych dawek nikotyny. W podjętym eksperymencie celem pracy była analiza wpływ nikotyny podawanej w okresie 4 i 8 dni w dawkach 12 i 20 mg/kg m.c. na aktywność fosfatazy kwaśnej oraz katepsyny D i L - hydrolaz układu lizosomalnego wątroby i nerek myszy. Eksperyment został przeprowadzony na 60 samcach myszy linii Swiss, w wieku 8 - 9 tygodni, o średniej masie ciała 23,4 ± 1,2 gramów. W efekcie prowadzonych prac eksperymentalnych i laboratoryjnych sformułowano następujące wnioski: - nikotyna wprowadzana iniekcyjnie raz dziennie w dawkach 12 mg i 20 mg/kg m.c. w okresie 4 i 8 dni zwiększała istotnie aktywność fosfatazy kwaśnej i katepsyn D i L w wątrobie i nerce badanych myszy. Zakres zaobserwowanych zmian jest zależny od narządu, dawki i czasu; - wzrost aktywności badanych enzymów pod wpływem nikotyny przypuszczalnie może ujawniać destabilizujące działanie tego alkaloidu na błony lizosomalne komórek wątroby i nerki, a tym samym wpływać na szlaki metaboliczne tych narządów. To our knowledge, no reports on the impact of nicotine on the enzyme activity of the lysosomal system have been published yet. The study which is reported here is probably one of the first analyses of the models of lysosomal hydrolases of the liver and kidney of experimental mice which were exposed to various doses of nicotine. The aim of our experimental study was to analyze the impact of nicotine administered for 4 or 8 days in the dosage of 12 and 20 mg/kg body weight, respectively, on the activity of acid phosphatase and cathepsins D and L, i.e. lysosomal hydrolases of the liver and kidney of mice. The experimental group constituted 60 Swiss male mice, aged 8-9 weeks, of average body weight of 23.4 ± 1.2 grams. We came to the following conclusions after the completion of the experimental study and laboratory analyses: - nicotine injected once a day in the dosage of 12 mg and 20 mg/kg body weight for 4 and 8 days caused a significant increase in the activity of acid phosphatase, and cathepsins D and L in the liver and kidney of the studied mice. The range of observed changes was related to the organ, the dosage and administration time; - the increase in the activity of studied enzymes after administering nicotine may indicate that the alkaloid exhibits destabilizing activity in lysosomal membranes of the liver and kidney cells, therefore it may affect metabolic pathways of those organs. Wstęp Biotransformacja nikotyny w wysoce reaktywne substancje – nikotynopochodne czyli nitrozoaminy [NNK i NNN] prowadzi u palaczy do tworzenia kowalencyjnych połączeń z DNA [22]. Kancerogenne działanie tych nitrozoamin zbadano na szczurach. Okazało się, że NNK jest najsilniejszym związkiem indukującym zmiany nowotworowe w płucach, wątrobie i jamie nosowej tych zwierząt [20], a jego kancerogenne działanie związane jest z tworzeniem niebezpiecznych połączeń z DNA pochodnych benzo(α) pirenu i 2-naftyloaminy zawartych w dymie tytoniowym. Nikotyna i jej pochodne, obok niewątpliwego powiązania z procesem nowotworzenia, wywierają szkodliwy wpływ na błonę śluzową żołądka, wywołując zaburzenia ze strony układu pokarmowego. Znaczenie lizosomów opisywało wielu badaczy, którzy uważali, że pełnią one rolę wewnątrzkomórkowego układu trawiennego, degradującego materiał sfagocytowany lub pobrany na drodze pinocytozy [7]. Obecnie wiadomo, że pełnią one również wiele innych ważnych dla życia komórek funkcji [19]. 1 Medical University of Silesia in Katowice, Poland School of Pharmacy, Department of Pharmaceutical Chemistry 4 Jagiellońska St., 41-200 Sosnowiec, Poland 2 Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach Zakład Higieny, Bioanalizy i Badania Środowiska 41-200 Sosnowiec, ul. Kasztanowa 3a Kierownik Zakładu: Dr hab. Jerzy Stojko Dodatkowe słowa kluczowe: nikotyna enzymy lizosomalne fosfataza kwaśna katepsyny D i L myszy Additional key words: nicotine lysosomal enzymes phosphatase cathepsins D and L mice Adres do korespondencji: Mgr Wioleta Kobiela Department of Hygiene, Bioanalysis and Environmental Studies 3A Kasztanowa St., 41-200 Sosnowiec, Poland Telephone number - +48 032 2699826 Fax number - +48 032 2699826 email: [email protected] Przegląd Lekarski 2012 / 69 / 10 The role of nicotine as a modulator of the activity of acid phosphotase and cathepsin D and L in the liver and kidney of mice 833 Heterogenność enzymatyczna lizosomów wiąże się z funkcjonalnym zróżnicowaniem ich enzymów. Układ lizosomalny zawiera blisko 100 różnego rodzaju enzymów hydrolitycznych, wybiórczo reprezentowanych w komórkach różnych tkanek, wykazujących zależnie od ich czynności optimum działania w kwaśnym zakresie wartości pH mieszczących się między 3,5 - 6,5 [7, 11]. Do tej pory nie spotkano doniesień omawiających wpływ nikotyny na aktywność enzymów układu lizosomalnego, dlatego podjęte obserwacje wydają się być jedną z pierwszych analiz dotyczących zmian aktywności fosfatazy kwaśnej oraz katepsyny D i L hydrolaz lizosomów wątroby i nerek myszy jako zwierząt doświadczalnych, poddanych działaniu różnych dawek nikotyny. Celem pracy było określenie wpływu nikotyny podawanej w zróżnicowanych dawkach na aktywność fosfatazy kwaśnej oraz katepsyny D i katepsyny L - hydrolaz układu lizosomalnego wątroby i nerek myszy. Wybrane do badań enzymy lizosomalne zaproponowano ze względu na ich rolę w procesach degradacji zachodzących w komórce oraz ewentualnej modulacji ich aktywności pod wpływem tego alkaloidu. Materiał i metody Eksperyment został przeprowadzony na 60 samcach myszy linii Swiss, w wieku 8 - 9 tygodni, o średniej masie ciała 23,4 ± 1,2 g. Zwierzęta do badań zostały wybrane drogą losowych kojarzeń rodzicielskich z populacji liczącej 1000 osobników. Utrzymywano je w standardowych warunkach zoohigienicznych hodowli Instytutu Genetyki i Hodowli Zwierząt Państwowej Akademii Nauk w Jastrzębcu. Procedura metodyczna eksperymentu została zatwierdzona przez Komisję Etyczną Badań nad Zwierzętami działająca przy Instytucie Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN w Jastrzębcu. Doświadczenia wykonano w Zakładzie Fizjologii Zwierząt Instytutu Biologii Uniwersytetu Humanistyczno-Przyrodniczego Jana Kochanowskiego w Kielcach oraz Zakładzie Higieny, Bioanalizy i Badania Środowiska Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach. Badany alkaloid – (-)- Nicotine([-]-1-Methyl-2[3pyridyl]-pyrrolidinehydrogen tartrate salt; (Sigma Chemical Co. ST. Louis MO. USA) – aplikowano zwierzętom grup doświadczalnych drogą iniekcji dootrzewnowej w objętości 250 µl/mysz w dawkach: 12 mg/kg m.c. i 20 mg/kg m.c. jeden raz w ciągu doby o stałej porze, przez okres 4 i 8 dni. Myszy grupy kontrolnej otrzymywały iniekcję dootrzewnową 250 µl/mysz 0,9% roztwór chlorku sodu. Po upływie 12 godzin od ostatniej iniekcji nikotyny lub chlorku sodu, zwierzęta poddawano eutanazji poprzez dekapitację. Zaraz potem pobierano fragmenty wątroby [prawy płat], które perfundowano oziębionym do 40C roztworem 0,9% chlorku sodu oraz lewą nerkę. Zawieszano je w schłodzonym do 40C 100 mM buforze fosforanowym o pH 7,4 w proporcji 500 mg tkanki/5 ml buforu. Całość homogenizowano przy 200 obrotach/ minutę, stosując homogenizator Pottera-Elvehjema z tłokiem teflonowym [3]. Uzyskane homogenaty wirowano a otrzymane osady rozpuszczano w 4 ml schłodzonego do 40C 0,1% Tritonu X-100. Otrzymane roztwory zamrażano kilkakrotnie do -200C i rozmrażano, po czym pozostawiano w stanie zamrożenia do momentu wykonywania analiz. W tak uzyskanych supernatantach lizosomów wątroby i nerek oznaczano aktywność fosfatazy kwaśnej AcP [EC 3.1.3.2] oraz katepsyny D [Cath. D [EC 3.4.23.5] i katepsyny L [EC 3.4.22.15]. Zasady oznaczania aktywności badanych enzymów lizosomalnych polegały na rozkładaniu przez wspomnia- Tabela I Aktywność fosfatazy kwaśnej [nmol/mg/białka/godz.] w wątrobie i nerkach myszy po iniekcji nikotyny. The activity of acid phosphatase (nmol/mg/protein/hour) in the liver and kidneys of mice after nicotine injecting. Czynnik Wątroba Nerka `X SD % `X SD % 4 dni NaCl [kontrola] Nikotyna 12 mg Nikotyna 20 mg 1,658 2,271** 1,884 0,404 0,933 0,615 137 113 8,559 12,583*** 8,702 1,263 1,256 1,561 147 102 8 dni NaCl [kontrola] Nikotyna 12 mg Nikotyna 20 mg 2,651 3,464** 3,381* 0,416 0,904 1,768 131 127 7,513 11,856*** 12,512*** 1,318 2,417 4,968 158 166 * P £ 0,05; ** P £ 0,01; *** P £ 0,001 ne enzymy swoistych substratów i uwalnianiu wolnego p-nitrofenolu - wzorca dla AcP oraz azokazeiny - wzorca dla Cath. D i L. Pomiar ekstynkcji dla AcP przeprowadzono przy długości fali 420 nm; dla Cath. D i L przy 366 nm. W lizosomalnych supernatantach wątroby i nerek oznaczano też poziom białka całkowitego według metody Lowry [14] – zmodyfikowanej przez Kirschke [10]. Aktywność badanych enzymów podawano w nmol/ mg białka/godzinę. Istotność wpływu różnych dawek i czasu podawania nikotyny na aktywność badanych hydrolaz lizosomalnych szacowano stosując analizę wariancji wieloczynnikowej przy zastosowaniu programów SAS/STAT [1999-2001, User’s Guide, SAS Institute Inc., Cary NC, USA] oraz Origin Microcal Software Inc. Northampton, USA. Analizę wariancji przeprowadzono w układach dla zmienności między czynnikami doświadczalnymi (dawki i czas podawania nikotyny); narządami (wątroba i nerka); a także dla interakcji między czynnikami doświadczalnymi i narządami. Wyniki i dyskusja W wyniku przeprowadzonych analiz stwierdzono, że aktywność fosfatazy kwaśnej w wątrobie po 4 dniach iniekcji nikotyny w dawce 12 mg/kg m.c. wzrosła znamiennie z 1,658 do 2,271 nmola/mg białka/godz. [P≤0,01]. Natomiast po 8 dniach podawania w dawce 12 mg/kg m.c. z 2,651 do 3,464 [P≤0,01] a w dawce 20 mg/kg m.c. do 3,381 [P≤0,05]. W nerkach, aktywność fosfatazy kwaśnej uległa statystycznie potwierdzonemu podwyższeniu po iniekcji nikotyny w dawce 12 mg/kg m.c. z 8,559 do 12,583 [P≤0,001] po 4 dniach i z 7,513 do 11,856 [P≤0,001] po 8 dniach oraz w dawce 20 mg/ kg m.c. z 7,513 do 12,512 [P≤0,001] po 8 dniach iniekcji. Nie wykazano istotnych zmian aktywności fosfatazy kwaśnej w wątrobie i w nerkach po 4 dniach iniekcji nikotyny w dawce 20 mg/ kg m.c. (Tab. I, Ryc. 1, 2). Nikotyna w dawce 12 mg/kg m.c. po 4 dniach spowodowała istotne statystycznie zwiększenie aktywności katepsyn D i L w wątrobie z 0,0775 do 0,096 [P≤0,05] oraz z 0,027 do 0,050, [P≤0,001] po 8 dniach. W nerkach zaobserwowano wzrost z 0,014 do 0,024 [P≤0,001] po 4 dniach oraz z 0,024 do 0,043 [P≤0,001] po 8 dniach podawania nikotyny. Iniekcja nikotyny w dawce 20 mg/ kg m.c. spowodowała znamienny wzrost ak- Aktywność kontroli = 100 % Rycina 1 Aktywność kwaśnej fosfatazy [nmol/mg białka/godz.] w wątrobie myszy po iniekcji nikotyny. The activity of acid phosphatse [nmol/mg protein/hour] in the liver of mice after injecting nicotine. 834 Rycina 2 Aktywność kwaśnej fosfatazy [nmol/mg białka/godz.] w nerkach myszy po iniekcji nikotyny. The activity of acid phosphatase [nmol/mg protein/hour] in the kidneys of mice after injecting nicotine. Przegląd Lekarski 2012 / 69 / 10 A. Moździerz i wsp. tywności katepsyn D i L w wątrobie z 0,027 do 0,047 [P≤0,001] po 8 dniach, a w nerkach z 0,014 do 0,018 [P≤0,05] po 4 dniach. Nie wykazano istotnych zmian aktywności tej proteazy po iniekcji nikotyny w dawce 20 mg/ kg m.c. w wątrobie po 4 dniach a w nerkach po 8 dniach (Tab. II, Ryc. 3, 4). Aktywność badanych enzymów w wątrobie i nerkach myszy z grup kontrolnych, którym podawano sól fizjologiczną w postaci 0,9% roztworu NaCl przyjęto za 100%. Dane dotyczące analizy wariancji wieloczynnikowej dla aktywności badanych enzymów lizosomalnych - fosfatazy kwaśnej oraz katepsyn D i L - w wątrobie i nerkach, modyfikowanych podawaniem czynnika doświadczalnego w postaci nikotyny w dawkach 12 i 20 mg/kg m.c. w okresie 4 i 8 dni zebrano w Tab. III. Wyniki badań potwierdzają istotne różnice między zastosowanymi w doświadczeniu czynnikami w postaci różnych dawek i różnych czasów iniekcji nikotyny. Analiza wariancji wieloczynnikowej ujawniła też interakcje między narządami [wątroba i nerki] a czynnikami doświadczalnymi, w przypadku badanych enzymów. Palenie tytoniu jest jednym z podstawowych czynników ryzyka około 30% chorób układu sercowo-naczyniowego, 40% ogólnej liczby nowotworów, 75% przewlekłych schorzeń obturacyjnych układu oddechowego oraz 90% nowotworów płuc. W związku z powyższym, badania mogące sugerować związek pomiędzy chorobami dotyczącymi palenia tytoniu a aktywnością wybranych hydrolaz lizosomalnych, wydają się uzasadnione. Układ lizosomalny komórki, między innymi bierze udział w reakcjach adaptacyjnych mających na celu utrzymanie homeostazy wewnątrzkomórkowej, co stanowi bezpośrednie jej zabezpieczenie przed czynnikami pressingowymi, także przy obciążeniu nikotyną [11,15]. Tak więc nikotyna generująca powstawanie wolnych rodników tlenowych może przyczyniać się również do aktywacji bądź inhibicji wybranych hydrolaz lizosomalnych. Oznaczanie aktywności fosfatazy kwaśnej [AcP, EC 3.1.3.2] w surowicy krwi jest od kilkudziesięciu lat testem pomocniczym w rozpoznawaniu i kontroli leczenia chorych na raka stercza. Uważa się, że wzrost aktywności tego enzymu w surowicy krwi jest też charakterystyczny dla rozwoju procesu nowotworowego wielu innych narządów. Fosfataza kwaśna jest kwaśną fosfomonoesterazą o optimum działania w zakresie pH od 4,5 do 5,0 [2]. Zawiera ona dwa atomy żelaza w centrum aktywnym, a stopień ich utlenienia determinuje jej aktywność katalityczną. Fosfataza kwaśna jest enzymem o małej specyficzności substratowej, mającym zdolność hydrolizowania wielu połączeń fosforanowych o zróżnicowanej budowie cząsteczki [5]. Powszechnie występuje w tkankach, a jej wysoką aktywność zanotowano w gruczole krokowym, wątrobie, nerkach, śledzionie, erytrocytach, granulocytach, osoczu krwi, żółci i moczu [8]. Transport fosfatazy kwaśnej do lizosomów odbywa się dzięki zlokalizowanemu w jej domenie cytoplazma- Tabela II Aktywność katepsyn D i L [nmol/mg/białka/godz.] w wątrobie i nerkach myszy po iniekcji nikotyny. The activity of cathepsins D and L (nmol/mg/protein/hour) in the liver and kidney of mice after nicotine injecting. Czynnik 4 dni 8 dni Wątroba Nerka `X SD % `X SD NaCl [kontrola] Nikotyna 12 mg Nikotyna 20 mg 0,075 0,096* 0,081 NaCl [kontrola] Nikotyna 12 mg Nikotyna 20 mg 0,027 0,050*** 0,047*** 0,015 0,039 0,040 128 108 0,014 0,024*** 0,018* 0,003 0,006 0,003 171 129 0,009 0,012 0,014 185 174 0,024 0,043*** 0,025 0,005 0,010 0,001 179 104 * P £ 0,05; ** P £ 0,01; *** P £ 0,001 Aktywność kontroli = 100 % Rycina 3 Aktywność katepsyn D i L [nmol/mg białka/godz.] w wątrobie myszy po iniekcji nikotyny. The activity of cathepsins D and L [nmol/mg protein/hour] in the liver of mice after injecting nicotine. Przegląd Lekarski 2012 / 69 / 10 % tycznej motywowi konformacyjnemu Gly-Tyr, bez pośrednictwa receptorów błonowych [MPR] [9]. Po dotarciu do lizosomów wiąże się ona bezpośrednio z błoną lizosomową, następnie zostaje uwolniona do światła lizosomów przy udziale katepsyny D, gdzie ulega przekształceniu w dojrzałą aktywną formę fosfatazy kwaśnej. W komórce obecne są dwie formy fosfatazy kwaśnej [AcP], cytoplazmatyczna - A i lizosomowa - B, ale prawie 90% jej aktywności biologicznej dotyczy typu A [6]. W erytrocytach ludzkich występuje tylko typ A, zaś w wątrobie dominuje typ B. Oznaczanie aktywności tej hydrolazy może być uznanym wskaźnikiem wzrostu i dojrzałości układu immunologicznego, jak również odzwierciedleniem stanu czynnościowego limfocytów. Kwaśna fosfataza ułatwia wchłanianie żelaza przez erytrocyty oraz przyswajanie związków wapnia i fosforu przez osteoblasty. Jak wynika z danych zawartych w tabeli I, aktywność fosfatazy kwaśnej podwyższyła się istotnie w wątrobie i w nerce po iniekcji nikotyny w dawce 12 mg/kg m.c. w okresie 4 i 8 dni, również w wątrobie i w nerce po 8 dniach w dawce 20 mg/kg m.c. Podstawowym i jednym z pierwszych efektów oddziaływania substancji szkodliwych zawartych w dymie papierosowym, jest ich toksyczne działanie na komórki wątroby, nerki czy płuc, które prowadzi do rozwoju stanu zapalnego. Z otrzymanych danych wynika, że fosfataza kwaśna, podwyższając w zasadzie swą aktywność Tabela III Analiza wariancji wieloczynnikowej dla badanych enzymów lizosomalnych. Analysis of variance for the studied lysosomal enzymes. Źródło zmienności F Fosfataza kwaśna czynnik [nikotyna – czas * dawki] narząd czynnik * narząd 65,72*** 550,52*** 7,12*** Katepsyny D i L czynnik narząd czynnik * narząd 7,99*** 143,60*** 13,75*** Rycina 4 Aktywność katepsyn D i L [nmol/mg białka/godz.] w nerkach myszy po iniekcji nikotyny. The activity of cathepsins D and L [nmol/mg protein/hour] in the kidneys of mice after injecting nicotine. 835 może brać poważny udział w ochronie przed kancerogennym działaniem dymu tytoniowego. W badaniach przeprowadzonych przez Krasnowską et al. [12] na szczurach drażnionych SO2 stwierdzano wzrost aktywności wszystkich trzech badanych enzymów (fosfatazy kwaśnej, fosfatazy zasadowej i dehydrogenazy kwasu mlekowego). Aktywność AcP zwiększyła się znamiennie po 12 tygodniach eksperymentu, by po dalszych 3 tygodniach ulec normalizacji. Już po 12 tygodniach stwierdzono właśnie objawy zapalne, w postaci nacieków wokół oskrzeli i w miąższu płuca. U palaczy stwierdzono wzrost aktywności AcP, podczas gdy w cytosolu wykazano znamienny spadek aktywności tego enzymu. Zaobserwowany po iniekcji nikotyny wzrost aktywności AcP związany może być także z dużą wrażliwością tej hydrolazy na zmiany potencjału oksydoredukcyjnego komórki wywołane podaniem nikotyny. Nikotyna może uaktywniać działanie tego enzymu na szerokim obszarze przemian metabolicznych estrów fosforanowych, zwłaszcza, że nadmiar nikotyny wiąże się ze zwiększonym zapotrzebowaniu organizmu na estry fosforanowe, co stymuluje jednoczesne podwyższenie aktywności AcP. Katepsyna D [endoproteaza aspartylowa] [Cath. D, EC 3.4.23.5] jest enzymem kaskady proteolitycznej, którego wysoką aktywność stwierdzono u osób z nowotworami [18]. Katepsyna L [Cath. L, EC 3.4.22.15] wykazuje zdecydowaną swoistość dla wiązań peptydowych między aminokwasami hydrofobowymi. Jej substratami są azokazeina, kolagen a także elastyna. Aktywność katepsyny L może być również markerem w diagnostyce nowotworowej, starzenia się komórek czy ciąż powikłanych. Katepsyny D i L syntetyzowane są jako proenzymy o masie cząsteczkowej, odpowiednio 52 kDa i 42 kDa i w tej postaci transportowane do siateczki śródplazmatycznej oraz endosomów [17]. W zakresie pH 4,0-5,0 ujawniają one najwyższą aktywność w lizosomach większości komórek ssaków, głównie w wątrobie, nerce, mózgu, sercu a także w soczewce [16]. Katepsyna D jest glikoproteiną, która składa się z dwóch łańcuchów połączonych N-glikozydowo. Heterogenność tej hydrolazy wynika z budowy części cukrowej, bowiem końcowe reszty mannozy ufosforylowane są do mannozo6-P. Ma dwu-łańcuchową część cukrową występującą w większości tkanek, podczas gdy molekuły pozostałych enzymów tej grupy są jedno-łańcuchowe [21]. Katepsyna D posiada wysoki stopień homologii sekwencyjnej z aspartylowymi proteazami sekrecyjnymi (pepsyna, renina czy chymozyna), pomimo, że nie jest ona enzymem sekrecyjnym. Skutecznymi inhibitorami katepsyny D są pepstatyna, α 2-makroglobulina osocza i tkanek, α1-antytrypsyna, swoiste inhibitory tkankowe, L-arginina [1, 4]. Katepsyna D selektywnie hydrolizując białka zaopatruje komórki w aminokwasy niezbędne do ich resyntezy, uczestniczy również w potranslacyjnych przekształceniach, sekrecji, aktywacji i katabolizmie innych enzymów 836 proteolitycznych oraz w regulacji przepuszczalności ścian naczyń [4 ]. Dane zawarte w tabeli II wskazują, że aktywność katepsyn D i L w wątrobie zwiększyła się istotnie po 4 dniach podawania nikotyny w dawce 12 mg kg/m.c. oraz po 8 dniach iniekcji w obu dawkach [12 i 20 mg kg/m.c.]. W nerce wzrost aktywności zaobserwowano po podaniu nikotyny w dawkach 12 i 20 mg kg/m.c. w okresie 4 dni i po 8 dniowej iniekcji nikotyny w dawce 12 mg kg/m.c. Związki utleniające zawarte w dymie papierosowym są głównym czynnikiem zaburzenia homeostazy pomiędzy aktywnością proteinaz i antyproteinaz. Do naruszenia równowagi dochodzi w wyniku nadmiernego wytwarzania proteinaz, przy jednoczesnym obniżeniu aktywności antyproteinaz. Źródłem tej zwiększonej aktywności proteinaz są makrofagi, neutrofile, komórki nabłonka wątroby i nerki. Stąd zaobserwowana przez nas zwiększona aktywność katepsyn D i L wskazuje zapewne, między innymi, na wyraźne nasilenie procesów proteolizy w wątrobie i w nerkach wynikające z potrzeby degradacji pod wpływem nikotyny białek endogennych. W modelach doświadczalnych wskazano, że u osób palących z prawidłową aktywnością α-1-antytrypsyny [antyproteinazy elastazy neutrofilowej - proteinazy serynowej], enzym ten może być aktywowany przez składniki dymu tytoniowego. Elastaza neutrofilowa indukuje aktywność cytokin zapalnych, szczególnie interleukiny 8 w komórkach nabłonka dróg oddechowych. Makrofagi pęcherzykowe uwalniają katepsyny B, K, L i S, które są zdolne do niszczenia elastyny, jak również kolagenu. Wzrost aktywność katepsyn D i L może być również wskaźnikiem zwiększającego się działania podawanej nikotyny na tkanki badanych obu gruczołów. Lee et al. [13] w przeprowadzonych badaniach indukował apoptozę neuronów oraz generował wolne rodniki tlenowe 6-hydroksydopaminą [6-OHDA]. 6-OHDA poprzez aktywację kaspazy-3, pośredniczy również w aktywacji lizosomowej katepsyny D. Jak wiadomo, kaspaza 3 jest markerem wewnątrz-, jak i zewnątrzpochodnego szlaku apoptotycznego, tj. drogi mitochondrialnej i receptorowej. Wnioski Z przeprowadzonych badań wynika, iż nikotyna wprowadzana iniekcyjnie raz dziennie w dawkach 12 mg i 20 mg/kg m.c. w okresie 4 i 8 dni zwiększała istotnie aktywność badanych enzymów lizosomalnych - fosfatazy kwaśnej i katepsyn D i L - w wątrobie i nerce badanych myszy. Zakres zaobserwowanych zmian jest zależny od narządu, dawki i czasu. Wzrost aktywności badanych enzymów pod wpływem nikotyny przypuszczalnie może ujawniać destabilizujące działanie tego alkaloidu na błony lizosomalne komórek wątroby i nerki, a tym samym wpływać na szlaki metaboliczne tych narządów. Uzyskane wyniki pozwalają na sformułowanie wstępnej hipotezy, iż nikotyna przyśpiesza tempo przemian meta- Przegląd Lekarski 2012 / 69 / 10 bolicznych na poziomie komórkowym, które są związane z hydrolityczną degradacją związków energetycznych w komórce. Piśmiennictwo: 1. Azim M.K., Ahmed W., Khan I.A. et al.: Identification of acridinyl hydrazides as potent aspartic protease inhibitors. Bioorg. Med. Chem. Letters 2008, 18, 3011. 2. Barrett A.J., Heath M.F.: Lysosomal enzymes. W: “Lysosomes, A Laboratory Handbook”, [red. Dingle J.T.] North-Holland Publ. Co., Amsterdam, New York, Oxford, 1977, 19. 3. Beaufay H.: Methods for isolation of lysosomes. W: “Lysosomes. A Laboratory Handbook”, [red. Dingle J.T.], North-Holland Publ. Co., Amsterdam, New York, Oxford, 1972, 1. 4. Benes P., Vetvicka V., Fusek M.: Cathepsin D-many functions of one aspartic protease. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2008, 68, 12. 5. Bielińska E.J.: Oznaczanie aktywności fosfataz. Acta Agrophys. Rozprawy i Monografie 2005, 3, 63. 6. Bull H., Murray P.G., Thomas D. et al.: Acid phosphatases. Mol. Pathol. 2002, 55, 65. 7. Cuervo A.M., Dice J.F.: How do intracellular proteolytic systems change with age? Front Biosci. 1998, 1, D25. 8. De Lorenzo A., Di Renzo L., Puja A. et al.: A study of acid phosphatase locus 1 in women with high fat content and normal body mass index. Metabolism 2009, 58, 351. 9. Himeno M., Tanaka Y.: Biosynthesis, processing, and lysosome targeting of acid phosphatase. Nippon Rinsho 1995, 53, 2898. 10. Kirschke H., Wiederanders B.: Methoden zur Aktivitätsbestimmung von Proteinasen. Martin-LutherUniversität, Halle-Wittenberg Wissenschaftl. Beitr., Halle/Salle, 1984, 11. 11. Kołątaj A., Witek B., Król T., Rafay J.: Activity of lysosomal enzymes in rabbits during postnatal development. II. Peptidases, lipases and acid phosphatase. Polnohospodarstvo 2002, 48, 68. 12. Krasnowska M., Kwaśniewski A., Rabczyński J., Kuryszko J.J.: Aktywność fosfatazy kwaśnej, fosfatazy zasadowej i dehydrogenazy kwasu mlekowego w popłuczynach oskrzelowo-pęcherzykowych (POP) szczurów z doświadczalnym zapaleniem oskrzeli wywołanym dwutlenkiem siarki. Alergia Astma Immunol. 1997, 2, 117. 13. Lee D.C., Close F.T., Goodman C.B. et al.: 2006 - Enhanced cystatin C and lysosomal protease expression following 6-hydroxydopamine exposure. Neurotoxicology 2006, 27, 260. 14. Lowry R.W.G., Rosenbrough L., Furr L., Randall R.J.: Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951, 193, 265. 15. MacNee W.: Oxidative stress and chronic obstructive pulmonary disease. Eur. Respir. Mont. 2006, 38, 100. 16. Mantle D., Saleem M.A., Williams F.M. et al.: Effect of pirimiphos-methyl on proteolytic enzyme activities in rat heart, kidney, brain and liver tissues in vivo. Clin. Chim. Acta 1997, 262, 89. 17. Mayer K., Vreemann A., Qu H., Brix K.: Release of endo-lysosomal cathepsins B, D, and L from IEC6 cells in a cell culture model mimicking intestinal manipulation. Biol. Chem. 2009, 390, 471. 18. Mylonas I., Makovitzky J., Richter D.U. et al.: Cathepsin D expression in normal, hyperplastic and malignant endometrial tissue: an immunohistochemical analysis. Acta Histochem. 2003, 105, 245. 19. Salehi A., Henningsson R., Mosen H. et al.: Dysfunction of the islet lysosomal system conveys impairment of glucose-induced insulin release in the diabetic GK rat. Endocrinology 1999, 140, 3045. 20. Shin V.Y., Cho C.H.: Nicotine and gastric cancer. Alcohol 2005, 35, 259. 21. Williamson A.L., Brindley P.J., Abbenante G. et al.: Hookworm aspartic protease, Na-APR-2, cleaves human hemoglobin and serum proteins in a host-specific fashion. J. Infect. Dis. 2003, 187, 484. 22. Wu H.J.. Chi C.W., Liu T.Y.: Effects of pH on nicotineinduced DNA damage and oxidative stress. J. Toxicol. Environ. Health A. 2005, 68, 1511. A. Moździerz i wsp.
