Czynnik wzrostu œródb³onka naczyñ VEGF-A
advertisement
Czynnik wzrostu ródb³onka naczyñ VEGF-A Nr 9/2007 homeostazy oksydacyjnej hepatocytów... Zak³ócenie Osteoporoza Vascular endothelial growth factor VEGF-A Mgr Arkadiusz Gruchlik*, Dr Ewa Chodurek*, Dr S³awek Smolik** Prof. Dr hab. Zofia Dzier¿ewicz* *Katedra i Zak³ad Biofarmacji, **Katedra i Zak³ad Biochemii, l¹ski Uniwersytet Medyczny w Katowicach Kierownik: Prof. dr hab. Zofia Dzier¿ewicz Streszczenie EGF-A jest glikoproteiną należącą do rodziny czynników wzrostu śródbłonka. Ludzki gen VEGFA, zlokalizowany jest na chromosomie 6p21.3 i zawiera 8 eksonów przedzielonych 7 intronami. W wyniku alternatywnego składania może powstawać 7 izoform VEGF-A różniących się budową, występowaniem i funkcją: 121, 145, 148, 165, 183, 189 i 206. VEGF-A wiążę się z receptorami błonowymi o aktywności kinazy tyrozynowej Flt-1 i Flk-1, czego efektem jest aktywacja białek adaptorowych Shc, Grb2, Nic, Nck, Crk, fosfatazy tyrozynowej SHP-1 i SHP-2 oraz białek docelowych, takich jak kinaza białkowa B Akt/PKB, fosfolipaza białkowa C PLCg, kinaza FAK czy p85 PI-3K. Do najsilniejszych induktorów ekspresji VEGF-A należy stan hipoksji. W obrębie promotora genu wykryto sekwencję zależną od hipoksji, z którą wiąże się czynnik transkrypcyjny HIF-1. VEGF-A jest białkiem o szerokim spektrum działania. Pełni wiele różnych funkcji w organizmie, z których najważniejszą jest rola w procesie angiogenezy. Poznanie mechanizmów agniogenezy zaowocowało nową strategią leczenia chorób nowotworowych (terapia antyangiogenna), czy leczenia stanów patologicznych przebiegających z niedotlenieniem i niedokrwieniem (angiogeneza terapeutyczna), np. choroby naczyń wieńcowych, ostrego niedokrwienia mięśnia sercowego czy niedokrwienia mózgu. Abstract VEGF-A is a glycoprotein, which belongs to the vascular endothelial growth factor family. The human VEGF-A gene is composed of 8 exons, separated by 7 introns and is localized in chromosome 6p21.3. Alternative exon splicing of a single VEGF gene results in the generation of the seven different isoforms known as 121, 145, 148, 165, 183, 189 and 206. VEGF-A binds to two tyrosine kinase receptors Flt-1 and Flk-1. Activation of the receptors leads to a rapid recruitment of the adaptor proteins Shc, Grb2, Nic, Nck, Crk, protein tyrosine phosphatases SHP-1 i SHP-2 as well as Akt/ PKB serine/threonine kinase, phospholipase Cg, focal adhesion kinase FAK and PI-3 kinase. Oxygen tension is a key regulator of VEGF gene expression. Hypoxia-inducible transcription of VEGF is mediated, at least in part, by the binding of hypoxiainducible factor 1 HIF-1 to an HIF-1 binding site located in the VEGF promoter. VEGF-A plays very important roles in the organism of which angiogenesis is the most important. The understanding of the mechanisms of angiogenesis can create the basis of new methods of treatment of some diseases with accompanying angiogenesis disturbances, such as antiangiogenic cancer therapy, and therapeutic angiogenesis in case of cardiac, brain and limb ischemia. S³owa kluczowe: czynnik wzrostu śródbłonka naczyń VEGF-A, receptory Flt-1 i Flk-1, czynnik transkrypcyjny HIF-1, mechanizm transdukcji sygnału, angiogeneza terapeutyczna, terapia antyangiogenna. Key words: vascular endothelial growth factor VEGF-A, Flt-1 and Flk-1 receptors, HIF-1 transcription factor, signal transduction, therapeutic angiogenesis, antiangiogenic therapy Budowa genu, ród³o i w³aciwoci bia³ka VEGF- A Historia czynnika wzrostu śródbłonka naczyń VEGF (ang. vascular endothelial growth factor) sięga początku lat osiemdziesiątych, kiedy to intensywnie trwały badania nad procesami nowotworzenia. Sen- ger i wsp. [1] w 1983 badając proces angiogenezy w obrębie guza nowotworowego opisali czynnik zwiększający przepuszczalność naczyń krwionośnych VPF (ang. vascular permeability factor). Kilka lat później odkryto białko wykazujące silne właściwości mitogenne w stosunku do komórek śródbłonka i nazwano je Farmaceutyczny Przegl¹d Naukowy "# Czynnik wzrostu ródb³onka naczyñ VEGF-A VEGF lub waskulotropiną [2]. Po sklonowaniu w 1989 r. VPF [3] i VEGF [4], okazało się, że oba białka są tożsame. O ważnej roli VEGF w procesach fizjologicznych świadczy fakt, że mysie zarodki pozbawione tylko jednego allelu genu VEGF, ginęły jeszcze przed urodzeniem [2]. Do rodziny VEGF należą VEGF-A, VEGF-B, VEGFC, VEGF-D, VEGF-E oraz łożyskowy czynnik wzrostu PIGF (ang. placenta growth factor) [2]. Ludzki gen VEGF-A, zlokalizowany jest na chromosomie 6p21.3 i zawiera 8 eksonów przedzielonych 7 intronami. Region kodujący obejmuje w przybliżeniu 14 kpz. [5]. W obrębie regionu promotora odkryto między innymi sekwencje wiążące czynniki transkrypcyjne: HIF1 , AP-1, AP-2, NFkB, GATA-6 [6, 7]. W wyniku alternatywnego składania może powstawać 10 izoform mRNA VEGF-A: VEGF-A121, VEGF-A138, VEGF-A145, VEGF-A148, VEGF-A162, VEGF-A162b, VEGF-A165 VEGFA183, VEGF-A189 oraz VEGF-A206 Budowę najważniejszych z nich przedstawia ryc. 1. • Eksony od 1 do 5 kodują N-końcowy fragment peptydu, w którym zlokalizowane są domeny PS, A i B. PS jest peptydem sygnałowym, który jest odcinany przy sekrecji cząsteczki, natomiast domeny A i B są odpowiedzialne za wiązanie się z receptorami. Domena A zawiera ujemnie naładowane aminokwasy Asp63, Glu64, Glu67, niezbędne do wiązania się z receptorem Flt-1, natomiast domena B zawiera dodatnio naładowane aminokwasy takie jak Asn82, Lys84, His86, niezbędne do wiązania się z receptorem Flk-1 [8]. Eksony 6 i 7 kodują dwie niezależne domeny w obrębie części C-terminalnej H1 i H2. Są one odpowiedzialne za transport peptydu, transdukcję sy- Nr 9/2007 gnału do wnętrza komórki, powinowactwo do heparyny, interakcje z innymi czynnikami wzrostowymi, aktywność mitogenną oraz za wiązanie z receptorem NRP (ang. neuropilin receptor) [9]. VEGF-A121, VEGF-A165, VEGF-A183, VEGF-A189 występują w większości tkanek. Ilościowo dominują izoformy 121, 165, w mniejszym stopniu 189 [10]. VEGF-A206 wyizolowano z ludzkiej wątroby płodowej [9], VEGF-A145 z niektórych linii komórek nowotworowych oraz z narządów rozrodczych kobiety [11], VEGF-A148 z kłębuszków nerkowych [12], natomiast VEGF-A162 z ludzkich komórek raka jajnika (linia A431) [13]. VEGF-A jest syntetyzowany przez różne typy komórek: mastocyty, komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych VSMC (ang. vascular smooth muscle cell), makrofagi, fibroblasty, komórki nowotworowe, komórki śródbłonka, monocyty, keratynocyty, eozynofile, limfocyty T. Jest również produkowany i magazynowany w ziarnistościach á płytek krwi [14]. W obrębie siatkówki oka znaleziono go między innymi w astrocytach, komórkach Müllera, komórkach nerwowych, komórkach śródbłonka i w nabłonku barwnikowym [9]. Krótsze izoformy, takie jak VEGF-A121 VEGF-A138 znajdują się w macierzy pozakomórkowej, podczas gdy dłuższe (VEGF-A145, VEGF-A189, VEGF-A206) wiążą się z proteoglikanami siarczanu heparanu na powierzchni komórki, co stanowi swoisty zewnątrzkomórkowy magazyn VEGF-A. Z proteoglikanami siarczanu heparanu wiążą się także inne peptydy, między innymi zasadowy czynnik wzrostu bFGF (ang. basic fibroblast growth factor). Wzajemna konkurencja między VEGFA i bFGF o miejsce wiązania częściowo tłumaczy ich Rys.1. Wynik alternatywnego składania mRNA VEGF-A w organizmie ludzkim. PS - peptyd sygnałowy (pierwsze 26 aminokwasów), A - domena odpowiedzialna za wiązanie z receptorem Flt-1, B -domena odpowiedzialna za wiązanie z receptorem Flk1, H1 i H2 - domeny odpowiedzialne za aktywność mitogenną. W obrębie eksonu 6 wykryto miejsca odpowiedzialne za alternatywne składanie, dlatego można go umownie podzielić na części: 6A1, 6A2 i 6B ([2, 28, 9]; w modyfikacji własnej). "$ Farmaceutyczny Przegl¹d Naukowy Nr 9/2007 wzajemny synergizm w indukcji angiogenezy. VEGFA165, ze względu na swoją budowę, jest zlokalizowane w macierzy jak i zakotwiczony w błonie komórkowej. W wyniku działania enzymów proteolitycznych np. plazminy, z cząsteczek związanych na powierzchni komórki zostaje uwalniany aktywny, rozpuszczalny peptyd (110 aminokwasów) zwany VEGF-A110 [10]. Czynniki wpływające na ekspresję genu VEGF-A. Niewątpliwie do najsilniejszych induktorów ekspresji VEGF-A należy stan hipoksji. Poziom ekspresji mRNA VEGF jest odwrotnie proporcjonalny do ciśnienia pO2 na zewnątrz komórki [15]. Zauważono duże podobieństwo mechanizmu ekspresji genu VEGF-A do genu erytropoetyny. W obu przypadkach promotor zawiera zależną od hipoksji sekwencję o konserwatywnym rdzeniu 5’-CGTG-3’ tzw. HRE (ang. hypoxia response element), z którą wiąże się czynnik transkrypcyjny HIF-1 (ang. hipoxia inducible factor 1) [16]. HIF-1 składa się z dwóch podjednostek a i b. Do rodziny białek HIF-1a należą również białka HIF2a oraz HIF-3a. Podjednostki a należą do podrodziny czynników transkrypcyjnych bHLH-PAS zawierających motyw heliks-pętla-heliks bHLH (ang. basic helix– loop–helix) oraz domenę PAS (ang. per-arnt-sim). Motyw bHLH oraz domena PAS, zlokalizowane na Nkońcu łańcucha polipeptydowego, odpowiedzialne są za dimeryzację podjednostek i wiązanie się z DNA. Czynnik wzrostu ródb³onka naczyñ VEGF-A HIF-1a, jak większość czynników transkrypcyjnych, posiada sygnał lokalizacji jądrowej NLS (ang. nucleus localization signal), który jest niezbędny do przemieszczenia się białka z cytoplazmy do jądra komórkowego. Białko HIF-1b (synonim ARNT; ang. aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator protein) występuje w jądrze komórkowym większości komórek, a jego ekspresja, w przeciwieństwie do HIF-1a, nie zależy od pO2 [17]. W warunkach normoksji białko HIF-1a w cytoplazmie prawie w ogóle nie występuje, ponieważ ulega szybkiej proteolitycznej degradacji przez E3 ligazę ubikwitynową zawierającą pVHL (ang. von Hippel-Lindau protein) (ryc. 2). Białko pVHL jest odpowiedzialne za przyłączenie ubikwityny do HIF-1a. Interakcja pomiędzy pVHL a specyficzną domeną podjednostki HIF-1a jest regulowana przez zależną od propylo-4hydroksylazy hydroksylację proliny (Pro564 w HIF-1a). Aktywność tego enzymu jest zależna od stężenia O2 i jonów żelaza. Hipoksja hamuje także zależną od poziomu O2 hydroksylację asparginy (Asn803 w HIF-1a) w domenie transaktywacyjnej białka HIF-1a, co umożliwia przyłączenie specyficznego koaktywatora transkrypcji białka p300/CBP [ang. CREB binding protein]. p300/ CBP z kolei wiąże biało CREB-1 (ang. cAMP response element-binding protein) należące do rodziny czynników wiążących miejsca na DNA zależne od poziomu cAMP zwane CRE (ang. cAMP responsible element). Rys.2. Mechanizm aktywacji czynnika transkrypcyjnego HIF-1 i jego wpływ na ekspresję genu VEGF-A. Farmaceutyczny Przegl¹d Naukowy "% Czynnik wzrostu ródb³onka naczyñ VEGF-A Efektem tego jest powstanie kompleksu CREB-1/HIF1 i zwiększenie aktywności transkrypcyjnej czynnika HIF-1 [18]. HIF-1a wchodzi również w interakcję z białkiem Jab1 (ang. jun-activation domain-binding protein-1), które jest koaktywatorem czynnika transkrypcyjnego AP-1. Jab1 podobnie jak białko p300/CBP zwiększenia aktywność transkrypcyjną czynnika HIF-1 [19]. Fosforylację HIF-1a przeprowadzają kinazy Akt/ PKB (ang. protein kinase B), kinaza p70 S6 i p38 MAPK (ang. mitogen-activated protein kinases). Jednym z czynników aktywujących te kinazy są reaktywne formy tlenu ROS (ang. reactive oxygen species). Synteza ROS zachodzi między innymi podczas hipoksji, w okresie reperfuzji, a także w wyniku zależnej od receptora błonowego sprzęgniętego z białkiem G, aktywacji oksydazy NADPH [20]. Stan hipoksji prowadzi także do indukowanej syntezy tlenku azotu NO przez aktywację syntazy tlenku azotu iNOS (ang. inducible nitric oxide synthase) [21] lub uwalniania już istniejącego NO z połączeń hemowych znajdujących się w cytoplazmy i macierzy mitochondrialnej. Wysoki poziom NO zmniejsza aktywność kompleksu oksydazy cytochromowej, co prowadzi do spadku potencjału błonowego mitochondrium i siły protonowej uniportów dla jonów Ca2+ oraz aktywacji szlaku cyklaza guanylanowa/cGMP/kinaza białkowa G PKG (ang. protein kinase G). Aktywacja PKG zwiększa ekspresję czynnika transkrypcyjnego HIF-1 [22] (ryc. 2). Nie tylko HIF-1 czy CREB1, ale także inne czynniki transkrypcyjne mogą indukować ekspresję genu VEGF. Należą do nich takie czyn- Nr 9/2007 niki jak AP-1, AP-2, SP1, NFkB, p53 oraz czynnik transkrypcyjny ATF-1 [23]. Induktory i inhibitory ekspresji VEGF-A VEGF pełni bardzo ważną rolę w zachowaniu homeostazy organizmu człowieka, czego dowodem jest precyzyjny i skomplikowany mechanizm regulujący jego ekspresję i sekrecję. Na poziom jego stężenia oprócz hipoksji wpływa przede wszystkich szereg cytokin, czynników wzrostowych oraz hormonów. Do najważniejszych należą EGF (ang. epidermal growth factor), TGF-a i a (ang. transforming growth factor a, b), IGF-1 (ang. insulin-like growth factor 1), PDGF (ang. platelet-derived growth factor), bFGF (ang. basic fibroblast growth factor) i KGF (ang. keratinocyte growth factor), które zwiększają ekspresję w keratynocytach czy fibroblastach [24], a także IL-1b [25], IL-6 [26] i prostaglandyny np. PGE2 [27]. W przeciwieństwie do IL-1= oraz IL-6 cytokiny IL-10 i IL-12 hamują uwalnianie VEGF z komórek [8]. Oprócz cytokin ważną rolę odgrywają hormony. Wykazano, że ACTH, LH [15], a także estrogeny [7] indukują ekspresję VEGF. Do stymulatorów ekspresji VEGF należą także: endotelina ET-1, cAMP, Ca 2+, estry forbolu, jony metali ciężkich takie jak Co2+, Cd2+, Ni2+, Mn2+ [28], trombina, angiotensyna II [20] oraz endotoksyny [29]. Na poziom ekspresji genu VEGF mogą mieć wpływ niektóre wirusy, np. RSV (ang. respiratory syncytial virus) [30] oraz wirus opryszczki HSV-8 (ang. herpes simplex virus 8) [31]. Nikotyna i konikotyna Rys.3. Receptory dla VEGF ([8]; w modyfikacji własnej). "& Farmaceutyczny Przegl¹d Naukowy Nr 9/2007 zawarte w dymie tytoniowym [32], a także oxy-LDL [33], mogą zwiększać poziom VEGF w osoczu. Udowodniono ponadto, że, promieniowanie jonizujące zwiększa syntezę VEGF w astrocytach oraz w liniach komórkowych T9 i RT2 chroniąc te komórki przed apoptozą [34]. Zwiększoną ekspresję genu VEGF w komórkach śródbłonka wykryto również podczas mechanicznego rozciągania ścian naczyń krwionośnych w sercu oraz w siatkówce u szczura [35]. Na ekspresję genu VEGF wpływa także adenozyna, prawdopodobnie przez aktywację receptora A2 adenozynowego i wzrostu stężenia cAMP [36]. Kolejną ważną grupą czynników zwiększających poziom ekspresji genu VEGF są mutacje w onkogenach: src, raf, ras czy erbB oraz w genach supresorowych np. w genie p53 [15, 8, 37]. Mutacja w genie p53, a tym samym brak funkcjonalnego białka p53, wiąże się ze zwiększeniem poziomu VEGF i indukcją angiogenezy w rozwijającym się guzie nowotworowym, co prowadzi do zwiększenia stopnia złośliwości nowotworu [38]. Receptory dla VEGF Receptory dla VEGF są błonowymi glikoproteinami. Składają się z trzech części: domeny zewnątrzkomórkowej, transmembranowej i domeny wewnątrzkomórkowej o aktywności kinazy tyrozynowej (ryc. 3). Do rodziny receptorów VEGF należą: • VEGFR-1 (ang. vascular endothelial growth factor receptor 1) – receptor czynnika wzrostu śródbłonka, zwany również Flt-1 (ang. fms-like tyrosine kinase 1), masa 180 kDa; • VEGFR-2 zwany również KDR (ang. kinase domain region); mysi homolog Flk-1 (ang. foetal liver kinase 1) wykazuje 85% podobieństwo z ludzkim receptorem KDR, masa 230 kDa; • VEGFR-3 zwany również Flt-4 (ang. fms-like tyrosine kinase 4); • VEGFRs (sFlt-1) – rozpuszczalna forma receptora Flt-1 (ang. soluble fms-like tyrosine kinase 1) zawiera tylko część zewnątrzkomórkową (6 immunoglobulinopodobnych domen), natomiast nie zawiera fragmentu transmembranowego oraz domeny cytoplazmatycznej [39]. Ekspresja VEGFR-1 zachodzi głównie w komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych, ponadto w monocytach, makrofagach, w trofoblaście łożyska i w komórkach mezangialnych nerki. Ekspresja VEGFR- 2 występuje przede wszystkim w komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych, ale także w megakariocytach, płytkach krwi, w krwiotwórczych komór- Czynnik wzrostu ródb³onka naczyñ VEGF-A kach macierzystych oraz komórkach macierzystych siatkówki [15]. Receptor Flt-4, dla którego ligandami są VEGF-C i VEGF-D pośredniczy w przekazywaniu sygnałów limfangiogennych. Obszerniejsze informacje na temat tego receptora wykraczające poza zakres niniejszej publikacji natomiast można je znaleźć w odpowiednich pracach przeglądowych [15, 39, 37]. Receptor sFlt-1, który powstaje w wyniku alternatywnego składania receptora Flt-1 wiąże się z VEGF-A i B. Jak dotąd nie jest znana rola fizjologiczna tego typu receptora. Prawdopodobnie może on wiązać VEGF w krwi i w ten sposób zapobiegać stymulacji komórek śródbłonka naczyń krwionośnych. W obrębie promotora genu Flt-1, podobnie jak w przypadku VEGF-A, stwierdzono zależną od hipoksji sekwencję HRE, której nie posiada promotor genu Flk-1. Wydaje się, zatem, że ekspresja genu Flk-1 jest niezależna od hipoksji [15]. Oba receptory są niezbędne dla prawidłowego przebiegu angiogenezy, różnią się mechanizmami transdukcji sygnału. Po pobudzeniu receptora Flk-1 zachodzi silna, zależna od ligandu autofosforylacja tyrozyny w obrębie domeny kinazy tyrozynowej, podczas gdy pobudzenie receptora Flt-1 wykazuje bardzo słabą odpowiedź. Sugeruje to, że receptor Flt-1 może negatywnie regulować proces angiogenezy. Aktywacja receptora Flk-1, który prawdopodobnie odpowiedzialny jest za pełne spektrum działania VEGF-A, prowadzi do zwiększenia przepuszczalności naczyń krwionośnych, proliferacji i zahamowania apoptozy komórek śródbłonka oraz angiogenezy [37]. Flt-1 jest odpowiedzialny za regulację syntezy metaloproteinaz w komórkach mięśni gładkich, migrację monocytów/makrofagów i limfocytów oraz wpływa na reorganizację cytoszkieletu [40]. Receptory Flk-1 i Flt-1 wykazują interakcję z neuropiliną 1 i 2 (NRP-1,2) (ang. neuropilin receptor 1, 2), które należą do rodziny białek kollapsyny/semaforyny (Sema) biorących udział w kierowaniu komórek nerwowych podczas tworzenia się układu nerwowego. NRP-1 wiąże Sema-IIIA, Sema-E, Sema-IV, VEGFA165, PIGF-2 i VEGF-B natomiast NRP-2 wiąże SemaE, Sema-IV, VEGF-A165 [41, 37], VEGF-A145 [42] oraz VEGF-E [37]. Mechanizm transdukcji sygna³u do komórki z udzia³em receptora Flk-1 Aby mogło dojść do transdukcji sygnału do komórki, zarówno ligand (VEGF) jak i receptor (Flk-1) muszą ulec dimeryzacji. Po połączeniu się ligandu z zewnątrzkomórkową domeną receptora Flk-1 zachodzi silna, zależna od ligandu, autofosforylacja tyroFarmaceutyczny Przegl¹d Naukowy "' Czynnik wzrostu ródb³onka naczyñ VEGF-A zyn w obrębie domeny kinazy tyrozynowej. Ufosforylowane tyrozyny wiążą białka posiadające domeny SH2 i SH3 (ang. sarcoma homology). Należą do nich białka adaptorowe: Shc, Grb2, Nic, Nck, Crk, białka fosfatazy tyrozynowej SHP-1 i SHP-2 oraz białka docelowe, takie jak kinaza białkowa B Akt/PKB (ang. protein kinase B), fosfolipaza białkowa C PLCg (ang. phospholipase C), kinaza FAK (ang. focal adhesion kinase) oraz białko p85 – podjednostka kinazy PI-3K [30]. Aktywna kinaza FAK (p125) prowadzi do zależnej od paksyliny reorganizacji cytoszkieletu, efektem, czego jest zwiększenie migracji komórek [43] natomiast aktywacja białka adaptorowego Grb2 uruchamia szlak Ras/MAPK, co prowadzi do zwiększenia aktywności proliferacyjnej komórek śródbłonka. W wyniku pobudzenia receptora aktywowana jest także fosfolipaza C, uwalniająca z błony komórkowej przekaźniki II rodzaju, tj. 1,2-diacyloglicerolu (DAG) oraz inozytolo-1,4,5-trisfosforan (IP3). IP3 uwalnia z siateczki śródplazmatycznej, zgromadzone tam jony Ca2+, natomiast DAG w mechanizmie zależnym od kinazy białkowej C, otwiera błonowy kanał wapniowy. Oba szlaki prowadzą do zwiększenia stężenia jonów Ca2+ w cytoplazmie, aktywacji syntazy tlenku azotu NOS, zwiększenia poziomu NO w komórkach śródbłonka i rozkurczu mięśni gładkich naczyń krwionośnych [48, 39]. VEGF wiążąc się z receptorem Flk-1, poprzez aktywację kinazy Akt, (która inaktywuje kaspazę-9) oraz dodatkowo zwiększając ekspresję białek antyapoptycz- Nr 9/2007 nych Bcl-2 i inhibitora kaspazy 3 (surwiwiny), chroni komórki śródbłonka przed apoptozą [39] (ryc. 4). Funkcje VEGF-A. Rola w procesie angiogenezy Naczynia krwionośne formują się na drodze dwóch podstawowych procesów: waskulogenezy i angiogenezy. Waskulogeneza, która polega na tworzeniu się naczyń de novo, natomiast angiogeneza jest procesem tworzenia się nowych naczyń krwionośnych na bazie już istniejących [45]. Proces waskulogenezy dokładnie zbadano na modelach zwierzęcych. U myszy w 7 dniu po zapłodnieniu w pęcherzyku żółtkowym z migrujących komórek mezodermalnych powstają wyspy krwiotwórcze. W ciągu kolejnych 12 godzin komórki te w odpowiedzi na zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów bFGF i białko morfogenetyczne kości BMP4 różnicują się w kierunku komórek hematopoetycznych pnia (HPCs – hematopoietic cells) oraz prekursorowych komórek śródbłonka (EPCs – epithelial precursor cells), które rozmieszczają się odpowiednio w centralnej i obwodowej części wyspy. Z komórek prekursorowych śródbłonka powstają angioblasty, które migrują i agregują tworząc pęcherzyki. Sąsiadujące pęcherzyki zlewają się w cewkowate naczynia krwionośne pierwotne o ścianie utworzonej z jednej warstwy komórek. Proces waskulogenezy prowadzi do powstania pierwszych głównych naczyń krwionośnych: zawiązka serca, aort grzbietowych, żył głów- Rys.4. Mechanizm transdukcji sygnału do wnętrza komórki po związaniu się VEGF z receptorem Flk-1 ([39]; w modyfikacji własnej). # Farmaceutyczny Przegl¹d Naukowy Nr 9/2007 nych, tętnic i żył żółtkowych oraz naczyń w omoczni [46]. Flk-1 jest nie tylko wczesnym markerem dla komórek progenitorowych naczyń i komórek hematopoetycznych, ale jest również niezbędny dla ich prawidłowego rozwoju. Embriony nieposiadające genu Flk-1 umierały w 9 dniu rozwoju z powodu braku waskulogenezy. [47]. Znaleziono także inne specyficzne markery np. receptor EphB4 czy NRP-1 dla angioblastów, z których powstaną tętnice oraz NRP-2 dla angioblastów, z których rozwiną się naczynia żylne [48]. Angiogeneza jest wieloetapowym procesem, podczas którego dochodzi do istotnych zmian w środowisku otaczającym komórki. Zależy od wypadkowego działania czynników pobudzających – angiogennych (m.in. VEGF, FGF-1 i -2, metaloproteinaz MMP) jak i hamujących - antyangiogennych (m.in. angioarestyny, angiopoetyny, kalretikuliny, czy endostatyny), które działają na komórki śródbłonkowe, macierz pozakomórkową i błonę podstawną. W pierwszym etapie angiogenezy dochodzi do aktywacji proteaz, które rozkładają błonę podstawną naczyń krwionośnych i macierz pozakomórkową oraz do aktywacji czynników proangiogennych, które pobudzają komórki śródbłonkowe do proliferacji i migracji. Nowo powstałe komórki śródbłonka formują struktury tubularne dające początek nowym naczyniom krwionośnym. W końcowym etapie dochodzi do odtworzenia błony podstawnej oddzielającej komórki śródbłonka od składników macierzy pozakomórkowej. Naczynia mogą powstawać także w wyniku podłużnego rozszczepienia istniejących naczyń i proliferacji komórek śródbłonkowych wewnątrz naczynia (tzw. proces wgłobienia), a także w wyniku kooptowania naczyń prawidłowych przez naczynia okołonowotworowe (ang. vascular cooption) bądź też przez budowanie naczyń mozaikowych, które tworzone są zarówno z komórek śródbłonkowych jak i komórek nowotworowych [49]. U osób dorosłych w stanach fizjologicznych rzadko dochodzi do powstawania nowych naczyń krwionośnych. Aktywacja angiogenezy jest w większości przypadków efektem toczących się procesów chorobowych, do których można zaliczyć tworzenie się naczyniaków, naczyniowłókniaków, malformacji tętniczożylnych czy blaszki miażdżycowej. Towarzyszy również chorobom oczu (retinopatie proliferacyjne, jaskra naczyniowa, zwłóknienie zasoczewkowe, powstawanie naczyń w rogówce), chorobom stawów, takim jak reumatoidalne zapalenie stawów, chorobom skóry np. łuszczycy i wreszcie procesowi nowotworowemu. Tylko w niewielu przypadkach angiogeneza jest procesem pożądanym tj. związanym z poprawą stanu zdro- Czynnik wzrostu ródb³onka naczyñ VEGF-A wia pacjenta. Mówimy wtedy o tzw. fizjologicznej angiogenezie, którą obserwujemy podczas gojenia się ran, w cyklu włosowym, w przeroście mięśni u sportowców oraz w cyklu płciowym kobiety (tworzenie się ciałka żółtego, doczesnej i łożyska). [50, 25]. Inne funkcja VEGF-A VEGF-A ze względu na swój wpływ na przepuszczalność naczyń krwionośnych, może uczestniczyć w mechanizmie powstawania obrzęków. Uczestniczy również w regulacji odpowiedzi układu immunologicznego podczas stanu zapalnego przez zwiększenie ekspresji białek adhezyjnych VCAM-1 (z ang. vascular cell adhesion molecule 1) i ICAM-1 (z ang. intercellular adhesion molecule 1) w śródbłonku, co umożliwia przyleganie do komórek śródbłonka zaaktywowanych komórek NK (interakcja pomiędzy VCAM-1 i ICAM-1 na powierzchni śródbłonka z CD18 i VLA4 na powierzchni komórek NK), a także przez wpływ na chemotaksję i migrację monocytów oraz indukuję wzrostu koloni makrofagów i granulocytów [51]. Z drugiej jednak strony VEGF-A hamuje dojrzewanie komórek prezentujących antygen np. komórek dendrytycznych [52], zatem może osłabiać odpowiedź humoralną. Hamowanie odpowiedzi humoralnej oraz stymulowanie wzrostu nowych naczyń krwionośnych w obrębie tkanki nowotworowej ułatwia wzrost guza [53]. VEGF-A wpływa na kurczliwość naczyń krwionośnych. Rozszerza naczynia prawdopodobnie przez zwiększenie poziomu ekspresji oraz aktywności syntazy tlenku azotu NOS (z ang. nitric oxide synthase) zarówno indukowanej jak i konstytutywnej [44]. Może brać udział w spontanicznej rewaskularyzacji mięśnia sercowego w przypadku jego niedokrwienia [54]. VEGF-A bierze udział w formowaniu się kości i w procesie kostnienia. Poprzez swój wpływ na osteoklasty zwiększa resorbcję kości oraz umożliwia wnikanie nowopowstających naczyń krwionośnych do nieunaczynionej chrząstki, co zapewniają transport substancji pokarmowych, czynników wzrostowych oraz hormonów [55]. Podsumowanie Rozwój biologii molekularnej przyczynił się do poznania mechanizmów hamowania oraz indukcji angiogenezy. Stworzyło to nowe możliwości leczenia stanów niedokrwiennych, np. zawału mięśnia sercowego (angiogeneza terapeutyczna) jak i związanych z nadmierną angiogenezą, która towarzyszy np. rozwojowi Farmaceutyczny Przegl¹d Naukowy # Czynnik wzrostu ródb³onka naczyñ VEGF-A guzów nowotworowych (terapia antyangiogenna). Największe sukcesy odnosi obecnie terapia antyangiogenna. Jednym z pierwszych leków hamujących zależną od szlaku VEGF/VEGFR angiogenezę był bevacizumab, który został zarejestrowany w lutym 2004 przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Żywienia FDA pod nazwą handlową Avastin (Genentech) jako lek pierwszego rzutu w zaawansowanym raku jelita grubego z przerzutami [56]. Bevacizumab jest mysim humanizowanym przeciwciałem anty-VEGF klasy IgG1. W badaniach przedklinicznych bevacizumab charakteryzował się dobrą tolerancją u pacjentów. Z głównych działań niepożądanych zanotowano wzrost ciśnienia tętniczego i krwawień oraz proteinurię. 31 stycznia 2006 europejski odpowiednik FDA czyli EMEA (European Agency for the Evaluation of Medicinal Products) wprowadził do obrotu preparat pod nazwą Macugen (Pfizer). Macugen jest nazwą handlową pegaptanibu sodu, który znalazł zastosowanie w leczeniu pacjentów cierpiących na wysiękową postać zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem AMD (ang. age-related macular degeneration). W styczniu 2007 roku EMEA zarejestrowała drugi lek w leczenie AMD pod nazwą Lucentis czyli ranibizumabu (Novartis Europharm). Oba leki podawane są w postaci injekcji do gałki ocznej. Do najczęstszych działań niepożądanych podczas stosowania tych leków należą: przekrwienie i ból oka, tzw. męty w ciele szklistym, wylew w obrębie siatkówki, zwiększenie ciśnienia w oku, zapalenie wnętrza gałki oraz ciała szklistego, zaćma, włóknienie podsiatkówkowe, a także ból głowy oraz zwiększone ogólnoustrojowego ciśnienia krwi [57]. Należy pamiętać, że ingerencja w procesy angiogenezy niesie ze sobą wiele niebezpieczeństw. Można mieć nadzieję, że dalsza kontynuacja badań pozwoli na pełne poznanie roli białek regulujących proces angiogenezy, a to pozwoli na opracowanie bardziej bezpiecznej terapii np. przeciwnowotworowej. BIBLIOGRAFIA [1] Senger D.R. i wsp. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science 1983; 219: 983–985. [2] Ferrara N., Henzel W.J. Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun 1989; 161: 851-858. # Farmaceutyczny Przegl¹d Naukowy Nr 9/2007 [3] Keck P.J. i wsp. Vascular permeability factor, an endothelial cell mitogen related to PDGF. Science 1989; 246: 1309–1312. [4] Leung D.W. i wsp. Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen. Science 1989; 246: 13061309. [5] Wei M.H. i wsp. Localization of the human vascular endothelial growth factor gene, VEGF, at chromosome 6p12. Hum Genet 1996; 97: 794-779. [6] Kimura H. i wsp. Hypoxia response element of the human vascular endothelial growth factor gene mediated transcriptional regulation by nitric oxide: control of hypoxia-inducible factor-1 activity by nitric oxide. Blood 2000; 95: 189-197. [7] Mueller M.D. i wsp. Regulation of vascular endothelial growth factor (VEGF) gene transcription by estrogen receptors á and â. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 1097210977. [8] Neufeld G., Cohen T., Gengrinovitch S., Poltorak Z. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptor. FASEB J 1999; 13: 9-22. [9] Jingjing L. i wsp. Human Muller cells express VEGF 183, a novel splicied variant of vascular endothelial growth factor. Invest Ophthalmol Vis Sci 1999; 40: 752-759. [10] Nakamura M. , Abe Y., Tokunaga T. Pathological significance of vascular endothelial growth factor A isoform expression in human cancer. Pathol Int. 2002; 52: 331339. [11] Poltorak Z. i wsp. VEGF145 , a secreted Vascular Endothelial Growth Factor signali that binds to extracellular matrix. J Biol Chem 1997; 272: 7151-7158. [12] Whittle C. i wsp. Heterogeneous vascular endothelial growth factor (VEGF) isoform mRNA and receptor mRNA expression in human glomeruli, and the identification of VEGF148 mRNA, a novel truncated splice variant. Clin Sci (Lond) 1999; 97: 303-312. [13] Lange T. i wsp. VEGF162, a new heparin-binding vascular endothelial growth factor splice form that is expressed in transformed human cells. J Biol Chem. 2003; 278: 17164-17169. [14] Koehne P. i wsp. Lack of hypoxic stimulation of VEGF secretion from neutrophils and platelets. Am J Physiol 2000; 279: H817-H824. [15] Ferrara N. Molecular and biological properties of Vascular Endothelial Growth Factor. J Mol Med 1999; 77: 527-543. [16] Blancher C., Harris A.L. The signaling basis of hypoxia response pathway: Tumor hypoxia as a therapy target. Cancer Metastasis Rev 1998; 17: 187-194. [17] Luo J.C., Shibuya M. A variant of nuclear localization signal of bipartite-type is required for the nuclear translocation of hypoxia inducible factor (1a, 2a, 3a). Oncogene 2001; 20: 1435-1444. [18] Takahashi H., Shibuya M. The vascular endothelial growth factor (VEGF)/VEGF receptor system and its role under physiological and pathological conditions. Clin Sci (Lond) 2005; 109: 227-241. [19] Bae M.K. i wsp. Jab1 interacts directly with HIF-1a and regulates its stability. J Biol Chem 2002; 277: 9-12. [20] Richard D.E., Vouret-Craviari V., Pouysségur J. Angio- Nr 9/2007 genesis and G-protein-coupled receptors : signals that bridge the gap. Oncogene 2001; 20: 1556-1562. [21] Wang F.S. i wsp. Nitric oxide mediates ultrasoundinduced hypoxia-inducible factor-1alpha activation and vascular endothelial growth factor-A expression in human osteoblasts. Bone 2004 Jul; 35: 114-123. [22] Goligorsky M.S. Making Sense out of Oxygen Sensor. Circulation Research 2000; 86: 824-826. [23] Levy A.P. i wsp. Transcriptional Regulation of the Rat Vascular Endothelial Growth Factor Gene by Hypoxia. JBC 1995; 270: 13333-13340. [24] Claffey K.P. i wsp. Fibroblast growth factor 2 activation of stromal cell vascular endothelial growth factor expression and angiogenesis. Lab Invest 2001; 81: 61-75. [25] Zielonka T.M., Demkow U. Angiogeneza w chorobach płuc. Nowa Medycyna 1999; 3: 48-52. [26] Huang S.P. i wsp. Interleukin-6 increases vascular endothelial growth factor and angiogenesis in gastric carcinoma. J Biomed Sci 2004; 11: 517-527. [27] Mauritz I. i wsp. Prostaglandin E(2) stimulates progression-related gene expression in early colorectal adenoma cells. Br J Cancer 2006; 94: 1718-1725. [28] Jośko J., i wsp. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its effect on angiogenesis. Med Sci Monit 2000; 6: 1047-1052. [29] Mittermayer F. i wsp. Marked increase in vascular endothelial growth factor concentrations during Escherichia coli endotoxin-induced acute inflammation in humans. Eur J Clin Invest 2003; 33: 758-761. [30] Knight L.E. i wsp. Chimeric VEGFRs are activated by a small-molecule dimerizer and mediate downstream signaling cascades in endothelial cells. Oncogene 2000; 19: 5398-5405. [31] Rosenkilde M.M. i wsp. Virally encoded 7TM receptors. Oncogene 2001; 20: 1582-1593. [32] Conklin B.S. i wsp. Nicotine and Cotinine Up-Regulate Vascular Endothelial Growth Factor Expression in Endothelial Cells. Am J Pathol 2002; 160: 413-418. [33] Inoue M. i wsp. Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Expression in Human Coronary Atherosclerotic Lesions. Circulation 1998; 98: 2108-2116. [34] Park Jong-Sung i wsp. Ionizing radiation modulates vascular endothelial growth factor (VEGF) expression through multiple mitogen activation protein kinase dependent pathways. Oncogene 2001; 20: 3266-3280. [35] Suzuma I. i wsp. Cyclic Stretch and Hypertension Induce Retinal Expression of Vascular Endothelial Growth Factor and Vascular Endothelial Growth Factor Receptor— 2. Potential Mechanisms for Exacerbation of Diabetic Retinopathy by Hypertension. Diabetes 2001; 50: 444-454. [36] Adair T.H. i wsp. Adenosine infusion increases plasma levels of VEGF in humans. BMC Physiol 2005; 5: 10-16. [37] Saaristo A., Karpanen T., Alitalo K. Mechanism of angiogenesis and their use in the inhibition of tumor growth and metastasis. Oncogene 2000; 19: 6122-6129. [38] Famulski W. i wsp. P53 correlates positively with VEGF in preoperative sera of colorectal cancer patients Neoplasma 2006; 53: 43-48. [39] Karkkainen M.J., Petrova T.V. Vascular endothelial growth factor receptors in the regulation of angiogenesis Czynnik wzrostu ródb³onka naczyñ VEGF-A and lymphangiogenesis. Oncogene 2000; 19: 5598-5603. [40] Shen B.Q. i wsp. Vascular Endothelial Growth Factor KDR Receptor Signaling Potentiates Tumor Necrosis Factor-induced Tissue Factor Expression in Endothelial Cells. J Biol Chem 2001; 276: 5281-5286. [41] Petrova V.T., Makinen T., Alitalo K. Signaling via Vascular Endothelial Growth Factor Receptors. Exp Cell Res 1999; 253: 117-130. [42] Gluzman-Poltorak Z. i wsp. Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 and Neuropilin-2 Form Complexes. J Biol Chem 2001; 276: 18688-18694. [43] Mayo L.D. i wsp. Vascular Endothelial Cell Growth Factor Activates CRE-binding Protein by Signaling through the KDR Receptor Tyrosine Kinase. J Biol Chem 2001; 276: 25184-25189. [44] Fukumura D. i wsp. Predominant role of endothelial nitric oxide synthase in vascular endothelial growth factorinduced angiogenesis and vascular permeability. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98; 2604-2609. [45] Bilińska R.T., Rużyłło W. Angiogeneza. Od eksperymentu do badań klinicznych. Kardiol Pol 2001; 54: 131-136. [46] Coultas L., Chawengsaksophak K., Rossant J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature 2005; 438: 937-945. [47] Shalaby F. i wsp. A requirement for Flk1 in primitive and definitive hematopoiesis and vasculogenesis. Cell 1997; 89: 981-990. [48] Herzog Y., Guttmann-Raviv N., Neufeld G. Segregation of arterial and venous markers in subpopulations of blood islands before vessel formation. Dev Dyn. 2005; 232: 10471055. [49] Hucz J., Szala S. Receptor VEGFR-2 – cel terapii kierowanej w chorobach nowotworowych. Współczesna Onkologia 2006; 10: 506–514. [50] Namiecińska M., Marciniak K., Nowak J.Z. VEGF jako czynnik angiogenny, neurotroficzny i neuroprotekcyjny. Postepy Hig Med Dosw 2005; 59: 573-583 [51] Min J.K. i wsp. Hepatocyte growth factor suppresses vascular endothelial growth factor-induced expression of endothelial ICAM-1 and VCAM-1 by inhibiting the nuclear factor-kappaB pathway. Circ Res 2005; 96: 300-307. [52] Inoshima N. i wsp. The influence of dendritic cell infiltration and vascular endothelial growth factor expression on the prognosis of non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 2002; 8: 3480-3486. [53] Yasui W. i wsp. Molecular-pathological prognostic factors of gastric cancer: a review. Gastric Cancer 2005; 8: 86-94. [54] Dulak J. i wsp. New strategies for cardiovascular gene therapy: regulatable pre-emptive expression of pro-angiogenic and antioxidant genes. Cell Biochem Biophys 2006; 44: 31-42. [55] Sipola A. i wsp. Endostatin inhibits VEGF-A induced osteoclastic bone resorption in vitro. BMC Musculoskelet Disord 2006; 7: 56-63. [56] Dokument elektroniczny : http://www.fda.gov/cder/drug/ infopage/avastin/default.htm. [57] Dokument elektroniczny : http://www.emea.europa.eu/ humandocs/Humans/EPAR/lucentis/lucentis.htm Farmaceutyczny Przegl¹d Naukowy #!
