Pranobeks inozyny - działanie cytotoksyczne oraz wpływ na

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2015, 67: 107 - 113
Pranobeks inozyny - działanie cytotoksyczne oraz wpływ na replikację
ludzkich wirusów paragrypy (HPIV-2, HPIV-4), enterowirusów
(CA16, EV71) i adenowirusów (HAdV-2, HAdV-5) w badaniu in vitro
Inosine pranobex - cytotoxic activities and effect of on replication of
human parainfluenza viruses (HPIV-2, HPIV-4), entroviruses
(CA16, EV71) and adenoviruses (HAdV-2, HAdV-5) in vitro
Anna Majewska1, Witold Lasek2, Grażyna Młynarczyk1
Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny
Zakład Immunologii Centrum Biostruktury, Warszawski Uniwersytet Medyczny
1
2
Pranobeks inozyny wykazuje aktywność przeciwwirusową, posiada również
potwierdzone w badaniach in vitro i in vivo działanie immunomodulujące.
W przeprowadzonym badaniu oceniono wpływ pranobeksu inozyny na redukcję mian zakaźnych wirusów chorobotwórczych dla człowieka (HPIV-2,
HPIV-4, CA16, EV71, HAdV-2, HAdV-5). Adenowirusy (HAdV-2, HAdV-5)
wykazały najwyższą wrażliwość na przeciwwirusowe działanie pranobeksu
inozyny.
Słowa kluczowe: adenowirusy, aktywność przeciwwirusowa, enterowirusy, pranobeks
inozyny, wirusy paragrypy
ABSTRACT
Introduction: There are no specific antivirals designed for many viral infections. Inosine
pranobex (PI) is a purine nucleoside that is involved in a wide variety of intracellular biochemical processes. The mechanism of action in human body is still unclear but numerous
studies have demonstrated that this drug inhibits viral replication and exhibit pleiotropic
effect. We evaluated in vitro effect of inosine pranobex (PI) on replication of human viruses:
parainfluenza viruses (HPIV-2, HPIV-4), entroviruses A (CA16, EV71) and adenoviruses
C (HAdV-2, HAdV-5).
Materials and Methods: In the present study, cytotoxic effect of inosine pranobex was
assessed using A549 cell line exposed to different concentrations of compound (PI: 50-800
108
A. Majewska, W. Lasek, G. Młynarczyk
Nr 2
µg/mL) for 48 hours. Cytotoxic effect of inosine pranobex was assessed visually using light,
inverted microscopy Olympus CK2 under 400x magnification and by the MTT colorimetric
assay. Antiviral effect was estimated according to the reduction of virus titer. The yield reduction assay (YRA), which evaluates the ability of the PI (50-800 µg/mL) to inhibit virus
multiplication in cell cultures, was applied. The cytopathic effect of the virus was evaluated
48 h after infection of A549 cell cultures with viruses by means of light, inverted microscopy. The Reed–Muench statistical method was used to determine the 50% end point (IC50)
(yield reduction assay, YRA) in the presence of inosine pranobex with the controlled one.
Results: There were no morphological changes, as assessed visually, in cell cultures treated
with PI. MTT cytotoxicity assay confirmed microscopic observations. The viability of cells
in the presence of the tested compounds was average 98, 36 %. After conducting the experiments and analyzing the results we noticed that higher concentrations of PI strongly inhibited
multiplication of all viruses. PI weakly reduced the titer of infectious enteroviruses and
HPIV-4 as compared with the control. Adenoviruses showed the highest sensitivity to the
antiviral activity of PI, however, increasing concentrations of PI up to 800 µg /ml slightly
enhanced the antiviral activity of 400 µg/ml PI.
Conclusions: Our study demonstrated that inosine pranobex shows no cytotoxic activity
on the A549 cell line. In conducted study was observed that adenoviruses (HAdV-2 and
HAdV-5) and HPIV-2 have the highest sensitivity to the antiviral activity of inosine pranobex
from all tested viral strains.
Keywords: adenoviruses, antiviral activity, enteroviruses, inosine pranobex, parainfluenza
viruses
WSTĘP
Pomimo faktu, że obecnie dostępnych jest około 60 leków przeciwwirusowych, blisko
połowa z nich zarejestrowana jest do leczenia zakażeń HIV. Pozostałe wykorzystywane są
w terapii wirusowego zapalenia wątroby (HBV, HCV), zakażeń spowodowanych ludzkimi
herpeswirusami i wirusami grypy. Nadal brakuje możliwości kontrolowania wielu istotnych
klinicznie i epidemiologicznie zakażeń wirusowych (3).
Infekcje wywołane przez enterowirusy, adenowirusy czy wirusy paragrypy to powszechnie występujące, zwykle łagodne, samoograniczające się zakażenia. U pacjentów z supresją
układu odpornościowego mogą być jednak przyczyną poważnych komplikacji.
Adenowirusy zakażają pierwotnie lub ulegają reaktywacji u 20-50% osób z immunosupresją, powodując zakażenia narządowe lub uogólnione (19). Enterowirusy, u osób
należących do skrajnych grup wiekowych oraz z osłabioną odpornością są etiologicznie
związane z neuroinfekcjami, zapaleniem mięśnia sercowego, zakażeniem górnych i dolnych
dróg oddechowych (18). Wirusy paragrypy, w sytuacji osłabionych mechanizmów odporności organizmu powodują ostre zapalenie płuc, wymagające sztucznej wentylacji i w części
przypadków (5-35%) skutkujące zgonem (2, 12). Żaden z dotychczas znanych preparatów
przeciwwirusowych nie posiada rejestracji do leczenia zakażeń wymienionymi wirusami.
W piśmiennictwie opisywane są wprawdzie przypadki zastosowania u pacjentów z upośle-
Nr 2
Wpływ pranobeksu inozyny na replikację wirusów
109
dzoną funkcją układu odpornościowego, pantropowo działających, jednak toksycznych dla
człowieka: cidofowiru i rybawiryny, jednak bez terapeutycznego powodzenia w większości
przypadków (12, 20, 21, 23).
Pranobeks inozyny (PI; synonimy: isoprinosine, methisoprinol, inosinex, immunovir)
jest kompleksem inozyny, p-acetamidobenzoesanu i diamidopropanolu – lekiem należącym do grupy farmaceutyków przeciwwirusowych ogólnego zastosowania (11). PI oprócz
aktywności przeciwwirusowej posiada potwierdzone zarówno w badaniach in vitro, jak
i w próbach klinicznych, działanie immunomodulujące (5, 6, 14). Mechanizm działania PI
nie został w pełni wyjaśniony. Prawdopodobnie związek ten bierze udział w hamowaniu
syntezy wirusowego RNA. Stymuluje układ odpornościowy wpływając na dojrzewanie oraz
aktywację limfocytów. W licznych badaniach (in vitro i in vivo) wykazano, że PI zwiększa
wytwarzanie cytokin, takich jak interleukina 1 (IL-1) i interleukina 2 (IL-2), interleukina
12 (IL-12), TNF- α i interferonu γ (IFN-γ), hamuje wytwarzanie IL-10, nasila działanie
cytotoksyczne komórek NK (natural killer) oraz pobudza chemotaksję i fagocytozę (1, 4,
5, 8, 14).
Celem badania była ocena działania pranobeksu inozyny na replikację wirusów paragrypy (ludzki wirus paragrypy 2; HPIV-2, ludzki wirus paragrypy 4; HPIV-4), entrowirusów
A (wirus Coxsackie A16; CA16 i enterowirus 71; EV71) oraz ludzkich adenowirusów C
(ludzki adenowirus 2; HAdV-2 i ludzki adenowirus 5; HAdV-5) w warunkach in vitro.
MATERIAŁ I METODY
Pranobeks inozyny (Gedeon Richter, Polska) w dawce 5,0 mg zawieszono w 5,0 ml PBS
(zbuforowany fizjologiczny roztwór soli, pH 6,9), filtrowano przy użyciu filtra miliporowego
(Millex-FG Filter Unit, 0,2 µm). Przygotowano stężenia: 50-800 µg/ml, których działanie
cytotoksyczne i przeciwwirusowe oceniano w badaniu. Jako rozpuszczalnika użyto podłoża
hodowlanego (DMEM; Biological Industries, Israel).
Oceniano wpływ PI na redukcję mian zakaźnych klinicznych szczepów wirusów
(z kolekcji Katedry i Zakładu Mikrobiologii Lekarskiej) chorobotwórczych dla człowieka.
W badaniu wykorzystano wirusy RNA: paragrypy (ludzki wirus paragrypy 2; HPIV-2, ludzki
wirus paragrypy 4; HPIV-4), entrowirusy A (wirus Coxsackie A16; CA16, enterowirus 71;
EV71) oraz ludzkie adenowirusy C: 2 (HAdV-2) i 5 (HAdV-5), należące do wirusów DNA.
Wirusy namnażano w linii komórkowej A549 (komórki nowotworowe wywodzące się z nabłonka płuc człowieka, ATCC® CCL -185TM). Komórki hodowano w pożywce zawierającej
10% surowicy płodowej cielęcej (Fetal bovine serum, FBS; Biological Industries, Israel)
oraz 1% mieszaniny antybiotyków i antymikotyku w temperaturze 37°C, w atmosferze 5%
CO2. Do namnażania wirusów, oceny cytotoksyczności oraz działania przeciwwirusowego
używano pożywki płynnej o zredukowanym do 2% stężeniu FBS.
Badanie cytotoksyczności PI w hodowli A549 zostało przeprowadzone metodą jakościową przy użyciu mikroskopu optycznego odwróconego (OLYMPUS CK2), obraz
powiększono 400x oraz metodą ilościową z wykorzystaniem testu redukcji soli tetrazolowej
w mitochondriach komórek, MTT Cell Proliferation Assay (ATCC bioproducts™, USA).
Metoda jakościowa polegała na obserwacji morfologii komórek. Podstawą testu ilościo-
110
A. Majewska, W. Lasek, G. Młynarczyk
Nr 2
wego było przekształcenie soli tetrazolowych MTT (bromku 3[4,5-dimetylo-2-ilo]-2,5-difenylotetrazolu) do formazanu (15).
W badaniu aktywności przeciwwirusowej komórki A549 (1x105 komórek/ml) zakażano
w odrębnych eksperymentach każdym z wirusów w dawce 100 TCID50/ml (Tissue Culture
Infectious Dose). Po 60 min. inkubacji wirusów z komórkami osadzonymi w mikropłytkach
(w objętości 0,2 ml w płytkach 96-studzienkowych płaskodennych, MEDLAB-PRODUCTS,
Polska) niezwiązane z komórkami wirusy usunięto, dwukrotnie płucząc jałowym roztworem
PBS. Następnie do komórek dodawano PI w stężeniach od 50 do 800 µg/ml w pożywce płynnej DMEM lub dodawano pożywkę bez dodatku PI (kontrola). Czas ekspozycji wynosił 48
godz. Następnie mikropłytki z hodowlami komórkowymi zamrażano i rozmrażano trzykrotnie
(w celu uwolnienia wirusów z komórek), wirowano przez 10 minut (3000 rpm, temp. 4ºC).
Supernatant wykorzystano do oceny miana wirusów według metody Reeda-Muencha (17).
Miano zakaźne wyrażono w TCID50/ml. Każde badanie wykonano w trzech powtórzeniach.
Wyniki oceniano statystycznie z wykorzystaniem metody korelacji Pearsona (r-Pearsona) do
pomiaru zależności pomiędzy dawkami PI, a mianem wirusów. Wartość współczynnika korelacji w zakresie od 0,4-0,7 interpretowano jako zależność umiarkowaną, 0,7-0,9 zależność
znaczącą, powyżej 0,9 jako bardzo silną zależność. Istotność współczynnika korelacji oceniano
za pomocą dwustronnego testu istotności dla małych próbek (t-Studenta) (7).
WYNIKI
Nie stwierdzono działania toksycznego pranobeksu inozyny w stężeniach od 50 do 800
µg/ml na hodowlę komórek A549 zarówno w badaniu mikroskopowym jak i metodą MTT.
Żywotność komórek eksponowanych na PI wynosiła 96,70 - 99,90% (średnio 98,36%).
Uzyskane wyniki z trzech serii eksperymentów poddano analizie statystycznej. Test Shapiro-Wilka wykazał rozkład normalny, a test Bartlett’a – brak istotności różnic wariancji
(P<0,05). Ponieważ przeżywalność komórek była tak wysoka nie wyznaczano wartości
CC50 (CC - stężenie cytotoksyczne dla 50% komórek), nie obliczano również wartości SI
– indeksu selektywności (stosunek CC50 do IC50).
Na rycinie 1. przedstawiono zakaźne miana badanych enterowirusów, wirusów paragrypy
i adenowirusów redukowane pod wpływem działania różnych dawek pranobeksu inozyny.
W prowadzonym badaniu zaobserwowano, że wyższe stężenia PI silniej redukują
miano zakaźne badanych wirusów. Analizując współczynnik korelacji Pearsona wykazano
znaczącą (P<0,05) zależność zakaźnego miana EV-71 i HPIV-4 od dawki PI w hodowlach
A549. Podobnie, wysoki współczynnik korelacji (jednak nie istotny statystycznie) obliczono
dla pozostałych wirusów RNA: CA-16 i HPIV-2.
PI najsilniej redukował miana zakaźne HAdV-2 i HAdV-5 w stosunku do kontroli (średnio redukcja mian wyniosła odpowiednio 1,68log10 i 1,86 log10TCID50/ml) jednak zwiększenie
stężenia PI do 800 µg/ml nieznacznie wzmocniło przeciwwirusowe działanie 400 µg/ml PI.
DYSKUSJA
Wirusy Coxsackie A opisano po raz pierwszy pod koniec lat 40 XX w. Doniesienia o wirusach paragrypy oraz ludzkich adenowirusach pojawiły się w latach 50 zeszłego stulecia.
Nr 2
Wpływ pranobeksu inozyny na replikację wirusów
111
*P< 0 , 0 5 d l a E V-7 1 i H P IV-4 , P > 0 , 0 5 d la CA - 16, H IPV-2, H A dV-2 i H A dV-5
Ryc. 1.
Redukcja zakaźnych mian badanych enterowirusów, wirusów paragrypy i adenowirusów
pod wpływem różnych dawek pranobeksu inozyny (PI) w hodowli komórek A549 in vitro.
Kilkanaście lat później (1969 r.) wykryto enterowirusa 71. Pomimo, że patogeny te znane
są od kilkudziesięciu lat i wiadomym jest, że zakażenia przez nie wywoływane występują
powszechnie w populacji, a u pacjentów z obniżoną odpornością mogą być przyczyną
poważnych komplikacji, nie ma możliwości swoistej profilaktyki ani leczenia przyczynowego tych zakażeń. Nisza istniejąca w tej dziedzinie, ze względu na realną potrzebę, budzi
zainteresowanie wielu badaczy (9, 16, 23).
Pranobeks inozyny wykazuje aktywność przeciwwirusową, posiada również potwierdzone działanie immunomodulujące (5, 6, 14). Jego skuteczność została opisana w randomizowanych i podwójnie zaślepionych badaniach klinicznych. Deroń analizując wyniki
eksperymentów Ginsberga i wsp. potwierdza dobrą tolerancję leku w makroorganizmie.
PI po osiągnięciu wysokiego stężenia w tkankach metabolizowany jest do kwasu moczowego i całkowicie eliminowany drogą nerek (4). W przeprowadzonym badaniu wykazano,
że pranobeks inozyny nie wykazuje działania cytotoksycznego wobec komórek A549. PI
w dawce 800 µg/ml również nie zmienia morfologii i nie zaburza aktywności biologicznej
(w badaniu metodą MTT) komórek linii HEp-2 and HEL 299 (9).
Oceniając wpływ pranobeksu na replikację wirusów paragrypy, entrowirusów i oraz
adenowirusów wykazano, że PI po 48 godz. ekspozycji w zakażonych wirusami komórkach
A549 zredukował zakaźne miano wszystkich wirusów w stosunku do kontroli. PI najsłabiej
(o 1.00 log10TCID50/ml) zredukował zakaźne miano enterowirusów. W piśmiennictwie brak
jest danych na temat skuteczności PI w hamowaniu namnażania ludzkich enterowirusów in
vitro. Badano wprawdzie skuteczność leku w zakażeniach wywołanych przez rinowirusy,
jednak nie została ona potwierdzona klinicznie (13, 22). Zgodnie z naszą wiedzą, brak jest
112
A. Majewska, W. Lasek, G. Młynarczyk
Nr 2
także doniesień na temat przeciwwirusowej aktywności PI w hodowlach komórkowych
zakażonych wirusami paragrypy. W prowadzonym eksperymencie zaobserwowano redukcję
miana zakaźnego HPIV-2 o 1,30 log10TCID50/ml i HPIV-4 o 1,19 log10 TCID50/ml.
Wykazano również, że adenowirusy (HAdV-2, HAdV-5) cechują się najwyższą wrażliwością na przeciwwirusowe działanie pranobeksu inozyny spośród wszystkich wykorzystanych w badaniu szczepów wirusów. W prowadzonych wcześniej w Katedrze i Zakładzie
Mikrobiologii Lekarskiej WUM eksperymentach in vitro wykazano, że PI jeszcze silniej
redukuje zakaźne miana adenowirusów w obecności interferonu-α (IFN-α). Jednoczesne
dodanie do zakażonych adenowirusami komórek A549 2000 IU/mL IFN-α i PI skutkowało
redukcją wartości IC50 (medialne stężenie inhibitora hamujące w 50 % miano zakaźne)
z 1965,4 µg/mL i 1467,8 µg/mL do 963,2 µg/mL i 694,8 µg/mL dla odpowiednio, HAdV-2
i HAdV-5 (9). Wzmocnienie działania pranobeksu inozyny w obecności INF-α wykazano
również wobec referencyjnego szczepu HHV-1McIntyre (10). Okazuje się także, że jednoczesne
podanie IFN-α i PI powoduje poprawę kondycji neurologicznej pacjentów z podostrym
stwardniającym zapaleniem mózgu (powikłanie po zakażeniu wirusem świnki) oraz wspomaga konwencjonalne metody leczenia miejscowych zakażeń wywołanych przez ludzkie
wirusy brodawczaka (HPV) (1, 4, 11).
Z powodu ograniczonej możliwości kontrolowania wielu zakażeń wirusowych wydaje
się zasadne wykonanie kolejnych eksperymentów celem potwierdzenia skuteczności pranobeksu inozyny w hamowaniu replikacji ważnych klinicznie lub epidemiologicznie wirusów
chorobotwórczych dla człowieka.
PIŚMIENNICTWO
1. Campoli-Richards DM, Sorkin EM, Heel RC. Inosine pranobex. A preliminary review of its
pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and therapeutic efficacy. Drugs 1986; 32:
383-424.
2. Chemaly RF, Hanmod SS, Rathod DB i inni. The characteristics and outcomes of parainfluenza
virus infections in 200 patients with leukemia or recipients of hematopoietic stem cell transplantation. Blood 2012; 119: 2738-45.
3. De Clercq E. Antivirals: past, present and future. Biochem Pharmacol 2013; 15, 85(6): 727-44.
4. Deroń Z. Izopirnozyna - lek o działaniu przeciwwirusowym i immunomodulacyjnym. Wiad Lek
1984; 17: 1355-61.
5. Gołębiowska-Wawrzyniak M, Markiewicz K, Kozar A i inni. Immunologiczne i kliniczne badania
nad przydatnością terapeutyczną inozyny pranobeks. Pol Merkur Lekarski 2005; 19: 379-82.
6. Gołębiowska-Wawrzyniak M, Markiewicz K, Kozar A i inni. The study on therapeutic efficacy of
inosine pranobex in children. Pol J Food Nutr Sci 2004; 13, 54: 33–6.
7. Kośny M, Peternek P. Wielkość próby a istotność wnioskowania statystycznego. Didactics of
mathematic 2011; 8: 71-80.
8. Lasek W, Jayst, M, Wolny R i inni. Immunomodulatory effects of inosine pranobex on cytokine
production by human lymphocytes. Acta Pharm 2015; 65: 171-180.
9. Majewska A, Lasek W, Janyst M i inni. In vitro inhibition of HHV-1 replication by inosine pranobex and interferon- α. Acta. Pol. Pharm. Drug Res 2016; 2 (w druku).
10. Majewska A, Lasek W, Janyst M i inni. Anti-adenoviral effect of inosine pranobex and interferon-α
in vitro. 25th Annual Meeting of the Society for Virology. Bochum, 18–21 March 2015.
11. Mohamed TA. Validated analytical method development of inosine pranobex in drug products by
thin layer chromatography. SJAC 2014; 2: 59-66.
Nr 2
Wpływ pranobeksu inozyny na replikację wirusów
113
12. Moss RB, Steigbigel RT, Sanders RL, Fang F. Perspective: Emerging Challenges in the Treatment of Influenza and Parainfluenza in Transplant Patients. Adv Virol 2011, ID 910930,
doi:10.1155/2011/910930.
13. Pachuta DM, Togo Y, Hornick RB i inni. Evaluation of isoprinosine in experimental human
rhinovirus infection. Antimicrob Agents Chemother 1974; 5: 403-8.
14. Petrova M, Jelev D, Ivanova A, Krastev Z. Isoprinosine affects serum cytokine levels in healthy
adults. J Interferon Cytokine Res 2010; 30 (4):223-8.
15. Pranczyk J, Jacewicz D, Wyrzykowski D, Chmurzynski L. Platinum(II) and Palladium(II) Complex
Compounds as Anti-cancer Drugs. Methods of Cytotoxicity Determination. Curr Pharm Anal
2015; 10, 2-9.
16. Przybylski M, Borysowski J, Jakubowska-Zahorska R i inni. T4 bacteriophage-mediated inhibition of adsorption and replication of human adenovirus in vitro. Future Microbiol 2015; 4, 10,
453-60.
17. Reed LJ, Muench H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints, Am. J. Epidemiol
1938; 27(3): 493-7.
18. Rhoades RE, Tabor-Godwin JM, Tsueng G, Feuer R. Enterovirus Infections of the Central Nervous
System Review. Virology 2011; 411: 288-305.
19. Rynans S, Dzieciątkowski T, Młynarczyk G. Adenovirus infection in immunocompromised patients.
Postepy Hig Med Dosw 2013; 11:964-72.
20. Tan CW, Chan YF, Sim KM i inni. Inhibition of Enterovirus 71 (EV-71) infections by a novel antiviral peptide derived from EV-71 capsid protein VP1. PLoS ONE 2012; 7: e34589. doi:10.1371/
journal.pone.0034589.
21. Tan CW, Lai JKF, Sam I-C, ChanYF. Recent developments in antiviral agents against enterovirus
71 infection. J Biomed Sci 2014; 21:14 doi:10.1186/1423-0127-21-14.
22. Waldman RH, Ganguly R. Therapeutic efficacy of inosiplex (Isoprinosine) in rhinovirus infection.
Ann N Y Acad Sci 1977: 4; 284:153-60.
23. Waye MMY, Sing CW. Anti-Viral Drugs for Human Adenoviruses. Pharmaceuticals 2010; 3(10):
3343-54.
Otrzymano: 12 VI 2015 r.
Adres Autora: 02-091 Warszawa, ul. Żwirki i Wigury 61, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny