Ocena aktywności lipolitycznej szczepów Enterococcus faecium The

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2013, 65: 87 - 91
Ocena aktywności lipolitycznej szczepów Enterococcus faecium
The evaluation of lipolytic activity of strains of Enterococcus faecium
Joanna Wróblewska, Sylwia Kożuszko, Eugenia Gospodarek
Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy
Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu
Oceniono lipolityczną aktywność 45 szczepów Enterococcus faecium izolowanych z krwi, płynów z jamy brzusznej oraz materiału ropnego (wymaz
z rany i ropy), na podłożu agarowym wzbogaconym estrem kwasu tłuszczowego (Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80) oraz egg yolk. Szczepy
E. faecium istotnie częściej wykazywały aktywność lipolityczną na podłożu
wzbogaconym w Tween 20 niż z dodatkiem Tween 40, Tween 60, Tween
80 i egg yolk. Nie wykazano statystycznie istotnych różnic w zależności od
miejsca izolacji badanych szczepów.
Słowa kluczowe: aktywność lipolityczna, Enterococcus faecium
ABSTRACT
Introduction: Little is known about the involvement of hydrolytic enzymes such as lipases
as virulence factors in infections involving Enterococcus spp.
Methods: A total of 45 isolates of E. faecium were investigated. Lipolytic activity of enterococcal strains was determined by Tryptic Soy Agar containing Tween 20, Tween 40,
Tween 60, Tween 80 and egg yolk.
Results: We detected that E. fecium strains produced lipases more frequently on Tween
20 agar (71.1% strains) than on Tween 40 agar, Tween 60 agar, Tween 80 agar, egg yolk
agar (respectively 33.3%, 24.4%, 20.0%, 31.1%). Our results indicate that lipase may be a
virulence factor in E. faecium.
Conclusions: Studies suggest that source of isolation from clinical materials (blood, wound
and fluid from the abdominal cavity) does not have an influence on the ability hydrolysis
esters.
Key words: lipolytic activity, Enterococcus faecium
88
J. Wróblewska, S. Kożuszko, E. Gospodarek
Nr 2
WSTĘP
Paciorkowce z rodzaju Enterococcus uznawane są za fizjologiczną mikroflorę dolnego
odcinka układu pokarmowego. W ciągu ostatnich dwóch dekad stały się istotnym czynnikiem zakażeń szpitalnych o wzrastającej częstości występowania, co wiąże się z narastającą
opornością na antybiotyki, jak również obecnością czynników wirulencji, które wpływają
na przebieg zakażenia (3, 5, 9).
Enzymy zewnątrzkomórkowe, np. lipazy uważane są za istotny czynnik wirulencji bakterii. Lipazy to enzymy hydrolityczne, które są odpowiedzialne, między innymi, za hydrolizę
estrów. Zdolność szczepów bakteryjnych do hydrolizy substratów tłuszczowych może mieć
wpływ na umożliwienie przeżycia bakterii w różnych warunkach środowiskowych (15).
Celem pracy była ocena wpływu rodzaju substratu na aktywność lipolityczną badanych
szczepów E. faecium, oraz porównanie aktywności lipolitycznej badanych szczepów w zależności od ich miejsca izolacji.
MATERIAŁ I METODY
S z c z e p y b a k t e r i i. Badaniem objęto 45 szczepów E. faecium izolowanych
z materiału klinicznego w Zakładzie Mikrobiologii Klinicznej Szpitala Uniwersyteckiego
nr 1 im. dr. A. Jurasza Collegium Medicum w Bydgoszczy, Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu i poradniach przyklinicznych tego szpitala. Każdy izolat pochodził od
innego pacjenta. Z materiału ropnego (wymaz z rany, ropy) zidentyfikowano 24 szczepy,
z krwi - 11 i 10 szczepów z płynów z jamy brzusznej. Szczepy do gatunku identyfikowano
na podstawie wyników reakcji biochemicznych ujętych w kartach GP systemu VITEK 2
Compact (bioMérieux).
W y t w a r z a n i e e n z y m ó w l i p o l i t y c z n y c h. Zdolność do wytwarzania
enzymów lipolitycznych oceniono według metody Burbianka i wsp. (4). Szczepy enterokoków posiewano poprzez wkłucie w podłoże TSA (Tryptic Soy Agar, Becton-Dickinson)
z dodatkiem 1% roztworu: Tween 20 (roztwór zawierający ester kwasu laurynowego, o liczbie
atomów węgla w reszcie kwasu tłuszczowego 12) (Sigma), Tween 40 (roztwór zawierający
ester kwasu palmitynowego, o liczbie atomów węgla w reszcie kwasu tłuszczowego 16)
(Sigma), Tween 60 (roztwór zawierający ester kwasu stearynowego, o liczbie atomów węgla
w reszcie kwasu tłuszczowego 18) (Sigma) lub Tween 80 (roztwór zawierający ester kwasu
oleinowego, o liczbie atomów węgla w reszcie kwasu tłuszczowego 18) (Sigma) oraz 0,5%
egg yolk (Sigma). Kontrolę stanowiły te same szczepy posiane na podłożu TSA bez dodatku
substratów kwasu tłuszczowego. Po 6 dobach inkubacji w temperaturze 37oC oceniono
zdolność badanych szczepów do hydrolizy tłuszczów w warunkach tlenowych. O wyniku
dodatnim, uwarunkowanym zdolnością danego szczepu do wytwarzania zewnątrzkomórkowej lipazy, świadczyło pojawienie się stref zmętnienia wokół kolonii bakterii.
O b l i c z e n i a s t a t y s t y c z n e. Zastosowano test dwóch frakcji, w modyfikacji
uwzględniającej próbki o niskiej liczebności. W celu weryfikacji hipotezy o równości frakcji
obliczano wartość statystyki U opartej na przekształceniu arcus sinus. Funkcja arc sin x
jest wyrażona w stopniach. Statystyka U ma w przybliżeniu rozkład normalny (Gaussa),
a wartości p < 0,04 są istotne statystycznie (11).
Nr 2
89
Lipolityczna aktywność E. faecium
WYNIKI
Lipolityczne właściwości badanych szczepów E. faecium przedstawiono w tabeli I.
Wśród szczepów E. faecium ogółem aktywność lipolityczną wykazywało 32 (71,1%) szczepy.
Wszystkie szczepy wykazujące aktywność lipolityczną na podłożu z dodatkiem Tween 20,
hydrolizowały również Tween 40, Tween 60, Tween 80 i egg yolk. Dwa szczepy izolowane z płynu z jamy brzusznej hydrolizowały estry kwasów tłuszczowych i egg yolk. Żaden
szczep izolowany z krwi nie wykazywał aktywności lipolitycznej na wszystkich badanych
podłożach. Cztery (16,6%) szczepy wyosobnione z materiału ropnego hydrolizowały Tween
20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 i egg yolk. Dodatek substratu umożliwiającego ocenę
aktywności lipolitycznej wpływał znacząco na ocenę zdolności hydrolizy estrów kwasów
tłuszczowych i egg yolk przez szczepy E. faecium, tzn. szczepy E. faecium znamiennie
częściej wykazywały aktywność lipolityczną, gdy w ocenie uwzględniono podłoże wzbogacone w Tween 20 w porównaniu z Tween 40, Tween 60, Tween 80 i egg yolk (p < 0,0001).
Tabela I. Aktywność lipolityczna E. faecium.
Rodzaj
materiału
Płyn z jamy
brzusznej
Krew
Materiał
ropny
Ogółem
Ogólna
liczba
szczepów
TSA z dodatkiem:
Tween 60
Tween 80
n
%
n
%
Tween 20
n
%
Tween 40
n
%
Egg yolk
n
%
10
7
70,0
2
20,0
2
20,0
2
20,0
3
30,0
11
8
72,7
4
36,7
2
18,2
0
0,0
2
18,2
24
17
70,8
9
37,5
7
29,1
7
29,1
9
37,5
45
32
71,1
15
33,3
11
24,4
9
20,0
14
31,1
n - liczba szczepów wykazujących aktywność lipolityczną
Nie wykazano statystycznie istotnych różnic porównując aktywność lipolityczną szczepów izolowanych z wymazów z ran i ropy w porównaniu do szczepów, które pochodziły
z krwi i płynów z jamy brzusznej (p > 0,05).
DYSKUSJA
Dane o lipolitycznej aktywności enterokoków są ograniczone i często sprzeczne, a aktywność lipolityczna określana jest najczęściej dla gatunków niechorobotwórczych izolowanych ze środków spożywczych (1, 7, 14) i porównywana do aktywności lipolitycznej
szczepów z rodzaju Lactococcus sp. i Lactobacillus sp. (10).
Do badania lipolitycznej aktywności w niniejszej pracy wykorzystano podłoże TSA
odpowiednio wzbogacone w Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 i egg yolk. Wzrost
liczby atomów węgla w kwasie tłuszczowym wchodzącym w skład Tween, wpłynął znacząco
w sposób hamujący na zdolność hydrolizy danego estru, co jest zgodne z wynikami badań
innych autorów (10). Moreno i wsp. (10) wykazali, że krótkie kwasy tłuszczowe o liczbie
atomów węgla w reszcie kwasu tłuszczowego 3, 4, 6 i 10, stymulują aktywność lipolityczną
szczepów E. faecalis, natomiast nienasycone kwasy tłuszczowe, np. kwas oleinowy nie są
90
J. Wróblewska, S. Kożuszko, E. Gospodarek
Nr 2
dobrym substratem dla oceny aktywności lipolitycznej. Odmienne wyniki otrzymali Sarantinopoulos i wsp. (12), którzy badali 129 szczepów enterokoków i wykazali, że 90,0%
szczepów E. faecium hydrolizowało estry zawierające kwasy tłuszczowe o liczbie atomów
węgla od czterech do 18.
Barbosa i wsp. (2) badali 44 szczepy E. faecium izolowane z tradycyjnie fermentowanych produktów mięsnych. Zastosowali oni hodowlę z dodatkiem substratu umożliwiającego ocenę hydrolizy estrów kwasów tłuszczowych (autorzy nie podali w publikacji jaki
to substrat). Żaden szczep E. faecium nie wykazywał aktywności lipolitycznej. Arizcun
i wsp. (1) oceniając częstość występowania lipaz u enterokoków, badali dwa szczepy E.
faecium, które nie wykazywały aktywności lipolitycznej. Wyniki uzyskali posługując się
komercyjnymi testami Api - zym. Nieliczni autorzy opublikowali wyniki dotyczące oceny
zdolności hydrolizy estrów przez szczepy z rodzaju Enterococcus m.in. E. faecalis i E. fecium
wyosobnione z materiału klinicznego. Z badań własnych wynika, że w ocenie aktywności
lipolitycznej nie jest istotne pochodzenie szczepu. Semedo i wsp. (13) porównali aktywność
lipolityczną enterokoków izolowanych z materiału klinicznego i z żywności. Stwierdzili, że
aktywność lipolityczna ogółem występuje u 49,0% szczepów, przy czym 63,0% szczepów
izolowano z żywności. Odsetek szczepów rozkładających estry kwasów tłuszczowych był
następujący: 51,0% u E. faecalis, 16,0% u E. durans i 11,0% u E. faecium. Aktywności
lipolitycznej nie stwierdzono wśród następujących gatunków enterokoków: E. avium, E.
durans, E. faecium, E. hirae, E. mundtii, E. pseudoavium i E. sulfureus. Elsner i wsp. (6)
wykazali, że 31 (35,0%) szczepów E. faecalis i jeden szczep E. faecium, które izolowano
z krwi wykazywały aktywność lipolityczną. Były to odsetki znacznie niższe niż otrzymane
w obecnych badaniach.
Przeprowadzone w niniejszej pracy badania sugerują, że aktywność lipolityczna jest
powszechną cechą szczepów E. faecium. Nasze wyniki wskazują, że lipazy mogą być czynnikiem wirulencji u E. faecium. Różnice w otrzymanych wynikach mogą być związane z
tym, że bakteryjne lipazy według Hasan i wsp. (8), wykazują różnice we właściwościach
biochemicznych i katalitycznych, spowodowanych wybiórczością substratu. W dalszych
badaniach należy wyjaśnić znaczenie omawianego czynnika wirulencji w patogenezie
zakażeń enterokokowych.
WNIOSKI
1. Aktywność lipolityczna jest cechą powszechną wśród szczepów E. faecium.
2. Rodzaj materiału, z którego izolowano szczepy E. faecium nie ma bezpośredniego
wpływu na ujawnienie zdolności hydrolizy estrów kwasów tłuszczowych oraz egg yolk.
3. Najlepszym substratem w ocenie aktywności lipolitycznej szczepów E. faecium okazał
się ester kwasu laurynowego.
PIŚMIENNICTWO
1. Arizcum C, Barcina Y, Torre P. Identification and characterization of proteolytic activity of Enterococcus spp. isolated from milk and Roncal and Idiazábal cheese. Int J Food Microbiol 1997,
38: 17– 24
Nr 2
Lipolityczna aktywność E. faecium
91
2. Barbosa J, Gibbs PA, Teixeira P. Virulence factors among enterococci isolated from traditional
fermented meat products produced in the North of Portugal. Food Control 2010, 21: 651–6
3. Bronk M, Samet A. Szpitalne bakteriemie enterokokowe. Post Mikrobiol 2008, 47: 339-44
4. Burbianka M, Pliszka A, Burzyńska S. Mikrobiologia żywności. Wydawnictwo Lekarskie PZWL.
Warszawa 1983
5. Cetinkaya Y, Falk P, Mayhall CG. Vancomycin-resistant enterococci. Clin Microbiol Rev 2000,
13: 686-707
6. Elsner HA, Sobottka I, Mack D i inni. Virulence factors of Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium blood culture isolates. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2000, 19: 39–42
7. Giraffa G. Functionality of enterococci in dairy products. Int J Food Microbiol 2003, 88: 215–22
8. Hasan F, Shah AA, Hameed A. Methods for detection and characterization of lipases: A comprehensive review. Biotechnol Adv 2009, 27: 782–98
9. Jett BD, Huycke MM, Gilmore MS. Virulence of enterococci. Clin Microbiol Rev 1994, 7: 462-78
10. Moreno MRF, Sarantinopoulos P, Tsakalidou E, De VuystL. The role and application of enterococci
in food and health. Int J Food Microbiol 2006, 106: 1 – 24
11. Sachs L. Applied Statistics. Berlin Springer Verlg 1982.
12. Sarantinopoulos P, Kalantzopoulos G, Tsakalidou E. Effect of Enterococcus faecium on microbiological, physicochemical and sensory characteristics of Greek Feta cheese. Int J Food Microbiol
2002, 76: 93– 105
13. Semedo T, Santos MA, Lopes MFS i inni. Virulence Factors in Food, Clinical and Reference
Enterococci: A Common Trait in the Genus? System Appl Microbiol 2003, 26: 13–22
14. Serio A, Chaves-López C, Paparella A., Suzzi G. Evaluation of metabolic activities of enterococci
isolated from Pecorino Abruzzese cheese. Int Dairy J 2010, 20: 459- 64
15. Stehr F, Kretschar M, Kröger C i inni. Microbial lipases as virulence factors. J Mol Catal B-Enzym
2002: 22: 347–55
Otrzymano: 4 VII 2013 r.
Adres Autora: 85-094 Bydgoszcz, ul. Skłodowskiej-Curie 9, Katedra i Zakład Mikrobiologii,
Collegium Medium im. L. Rydygiera w Bydgoszczy,
Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu