(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 212273 PL 21 2273 B1

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12)
OPIS PATENTOWY
(19)
PL
(21) Numer zgłoszenia: 382192
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej Polskiej
(54)
212273
(13) B1
(11)
(51) Int.Cl.
C12N 5/071 (2010.01)
A61P 35/02 (2006.01)
(22) Data zgłoszenia: 12.04.2007
Sposób oceny efektywności chemioterapii u pacjentów z choroba nowotworową
(73) Uprawniony z patentu:
UNIWERSYTET WROCŁAWSKI, Wrocław, PL
AKADEMIA MEDYCZNA IM. PIASTÓW
ŚLĄSKICH WE WROCŁAWIU, Wrocław, PL
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
13.10.2008 BUP 21/08
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
28.09.2012 WUP 09/12
(72) Twórca(y) wynalazku:
ALEKSANDER F. SIKORSKI, Wrocław, PL
MICHAŁ GRZYBEK, Wrocław, PL
PATRYCJA DUBIELECKA, Wrocław, PL
BEATA HANUS-LORENZ, Wrocław, PL
ADAM KOLONDRA, Wrocław, PL
KAZIMIERZ KULICZKOWSKI, Wrocław, PL
BOŻENA JAŹWIEC, Wrocław, PL
(74) Pełnomocnik:
PL 212273 B1
rzecz. pat. Rafał Witek
2
PL 212 273 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób oceny efektywności chemioterapii polegający na wykrywaniu obecności spektryny w ludzkich komórkach limfoidalnych, która we wczesnym procesie wywołanej
chemioterapeutycznie apoptozy komórek ulega zmianom w organizacji ulegając agregacji.
Podawanie leków przeciwnowotworowych podczas prowadzonej chemioterapii skutkuje wywoływaniem w komórkach procesu apoptozy. Zrozumienie mechanizmów apoptozy indukowanej za pomocą cytostatyków może w znacznym stopniu przyczynić się do postępu w dziedzinie terapii nowotworów. W wielu przypadkach bowiem napotyka się na problem związany z odpornością pacjenta czy
nowotworu na dany lek. Jako że żadna terapia nie pozostaje neutralna w stosunku do całego organizmu, w takich przypadkach podawanie leków jest nie tylko nieefektywne, ale wywołuje jednocześnie
poważne szkody. Ważną kwestią każdej terapii pozostaje również aspekt finansowy i możliwość zredukowania kosztów leczenia, szczególnie wysokich w wypadkach leczenia nowotworów.
Powyższe aspekty mają dla pacjenta szczególnie istotne znaczenie. Stąd istnieje konieczność
opracowania metody pozwalającej na szybkie wykrywanie skuteczności stosowanej terapii w przypadku chorób nowotworowych, w tym białaczek.
Spektryna jest powszechnie występującym, wielodomenowym białkiem cytoszkieletu komórki
wiążącym się z aktyną. Zbudowana jest z dwóch typów podjednostek a i β. Ze stanu techniki wynika,
że spektryna jest obecna nie tylko w komórkach erytrocytów (aI i βI), ale można ją zauważyć w innych
komórkach i tkankach. Spektryna nieerytrocytarna (αll i βΙΙ) jest też bardzo często nazywana fodryną.
Właśnie spektryna αΙΙβΙΙ występuje w komórkach Iimfoidalnych (Glenney and Glenney 1983). Wiele
danych wskazuje jednak na to, że poza funkcjami typowo mechanicznymi, fodryna może mieć udział
w przekazywaniu sygnału oraz pełnić funkcje regulatorowe w różnych typach komórek jak limfocyty.
Wskazują na to głównie badania nad apoptozą limfocytów, czyli programowaną śmiercią komórki
(Mills et al. 1999, Dubielecka et al. 2005). W procesie tym dochodzi do wielu zmian morfologicznych
w komórce.
Obserwacja spektryny w różnych mieloidalnych i Iimfoidalnych liniach komórkowych wykazała
obecność dwóch typów rozmieszczenia spektryny: w wypadku większości linii komórkowych spektryna
była równo rozmieszczona w cytoplazmie, ale w niektórych liniach komórki zawierały agregaty spektryny (Pauly et al. 1986). Dodatkowo, poddanie komórek działaniu PMA i mezerinu doprowadziło do
zaniku skupisk. Kolejno, wykazano, że działanie na linie komórkowe hybrydoma limfocytów angiogenicznymi stymulatorami, takimi jak kurza owoalbumina, konkanwalina A lub jonofor wapnia A231187,
skutkuje odwracalnym ustąpieniem agregatów spektrynowych (Lee et al., 1988). Odkrycia te zapoczątkowały szereg badań nad funkcją spektryny i rolą procesu tworzenia agregatów w limfocytach
(Gregorio et al., 1992, Di et al., 1997).
Jak wyjaśnia Dubielecka et al., agregacja spektryny jest jednym z charakterystycznych znaków
zachodzącej w komórkach Iimfoidalnych apoptozy (Dubielecka et al. 2005). W normalnych komórkach
spektryna widoczna jest na preparatach znakowanych immunofluorescencyjnie jako charakterystyczny pierścień podbłonowy (Gregorio et al. 1992, Dubielecka et al. 2005), ale aktywowane lub wprowadzone za pomocą chemioterapeutyków w apoptozę limfocyty cechują się silną agregacją spektryny
(Wang et al. 1999, Dubielecka et al. 2005). Zaobserwowano, że podczas podawania cytostatyków
(przykładowo fluderabina, mitoksantron, deksametazon) u pacjentów cierpiących na przewlekłą białaczkę limfoblastyczną i chłoniaka grudkowego w komórkach Iimfoidalnych zachodzą zmiany, które są
obrazem wczesnego etapu zachodzącego procesu apoptozy. Zmiany te obejmują rozmieszczenie
spektryny αΙΙβΙΙ i kinazy białkowej Θ (PKC Θ).
Przedmiotem wynalazku jest sposób oceny efektywności chemioterapii u pacjentów z chorobą
nowotworową poprzez śledzenie zmian rozmieszczenia spektryny wywołanych podawaniem cytostatyków w komórkach limfoidalnych, charakteryzujący się tym, że wykrywa się in vitro podjednostki
spektryny αΙΙβΙΙ za pomocą przeciwciała z przyłączonym barwnikiem fluorescencyjnym, skierowanego
na fragment spektryny βΙΙ, wysoce specyficznego, niewykazującego reaktywności ze spektryną al i βI,
a następnie próbki umieszcza się w cytofluorymetrze przepływowym i określa procent komórek wykazujących agregację spektryny.
Korzystnie, sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że agregaty spektryny w limfocytach, w których zachodzi apoptoza nie ulegają rozpuszczeniu w niejonowym detergencie.
Korzystnie, zgodnie ze sposobem według wynalazku, wykrywa się podjednostki αΙΙβΙΙ spektryny
ulegające reorganizacji we wczesnym etapie apoptozy.
PL 212 273 B1
3
Korzystnie, chorobą nowotworową jest przewlekła białaczka limfoblastyczna. Korzystnie, niejonowym detergentem jest zimny 1% Triton Χ-100.
W korzystnej realizacji, postęp apoptozy wykrywa się we wczesnych stadiach terapii cytostatykami.
Jak wspomniano wyżej, wynalazek dostarcza szybki i skuteczny test in vitro oceny działania leków przeciwnowotworowych, pozwalający na ustalenie skuteczności leków już po 2 h prowadzonej
terapii. Zgodnie z testem, komórki poddaje się działaniu buforu zawierającego niejonowy detergent.
W komórkach, w których nie zachodzi apoptoza, a więc w komórkach wykazujących oporność w stosunku do zastosowanych leków, spektryna tworząca szkielet błonowy stanowi frakcję w pełni rozpuszczalną w takich warunkach, podczas gdy w komórkach apoptotycznych, czyli w tych, na które działają
leki, spektryna tworzy nierozpuszczalne w detergencie agregaty. Kolejno, w teście wykorzystuje się
przeciwciała z przyłączonym barwnikiem fluorescencyjnym skierowane na odpowiedni fragment spektryny podbłonowej. Następnie, przy pomocy cytofIuorymetru przepływowego w prosty sposób określa
się w jakim stopniu zastosowany zestaw chemioteraputyków jest efektywny. Korzystnie, cytostatykiem
wykorzystanym w chemioterapii jest mitoksantron, fluderabina lub deksametazon.
W celu zidentyfikowania stopnia procesu apoptozy w komórkach pod wpływem podanych leków, wyizolowane komórki poddaje się działaniu zimnego niejonowego detergentu, korzystnie buforu
zawierającego 1% Tryton Χ-100. Zaobserwowano, iż spektryna tworząca szkielet błonowy stanowi
frakcję w pełni rozpuszczalną w 1% Trytonie Χ-100 w komórkach, w których nie zachodzi apoptoza,
a więc w komórkach wykazujących oporność w stosunku do zastosowanych leków. Przeciwnie,
w komórkach ulegających apoptozie agregaty spektrynowe nie ulegają rozpuszczeniu w Trytonie.
W celu zidentyfikowania nierozpuszczonej w detergencie spektryny stosuje się przeciwciało z przyłączonym barwnikiem fluorescencyjnym skierowane na fragment spektryny all lub βΙΙ, wysoce specyficzne nie wykazujące reaktywności ze spektryną al i βΙ. W przypadku limfocytów apoptotycznych jądra limfocytów wybarwia się barwnikiem DAPI, natomiast spektrynę znakuje się przeciwciałami skierowanymi przeciw spektrynie all i βΙΙ oraz drugorzędowymi przeciwciałami połączonymi z barwnikiem
fluorescencyjnym FILC. Następnie, za pomocą cytofluorymetru przepływowego w prosty sposób określa się efektywność zastosowanego zestawu chemioterapeutyków.
Przykład
Celem testu było określenie czy stosowana u pacjenta z przewlekłą białaczką limfoblastyczną
terapia jest skuteczna. Test wykonuje się w oparciu analizę organizacji spektryny w komórkach limfoidalnych, w których zachodzi apoptoza. Wyizolowane z krwi obwodowej zdrowego dawcy limfocyty
poddano działaniu buforu zawierającego 1% Triton Χ-100. Po 10 minutowej inkubacji komórek na
lodzie (od czasu do czasu mieszając), komórki odwirowano na szkiełka podstawowe w wirówce cytospinowej (800g 5 min 4°C). Osad zawieszono w buforze PBS. Następnie, komórki zostały wyznakowane za pomocą odpowiednich przeciwciał skierowanych na obie podjednostki spektryny.
Aby uzyskać informację, które przeciwciała w sposób wysoce specyficzny rozpoznawałaby
spektrynę nieerytrocytarną, natomiast nie reagowałyby z spektryną erytrocytarną, przeanalizowano za
pomocą odpowiednich programów sekwencję spektryn erytrocytarnych oraz nieerytrocytarnych. Sekwencję białek porównano wzajemnie ze sobą poszukując rejonów niehomologicznych (ClustalW). Na
tej podstawie wytypowano fragmenty białka, przeciwko którym można stworzyć przeciwciała, które
byłyby aktywne w stosunku do jednej z podjednostek spektryny nieerytrocytarnej. W kolejnym etapie,
wybrane fragmenty białek poddano dalszej analizie w celu określenia stopnia immunogenności oraz
prawdopodobieństwa z jakim dany fragment występuje na powierzchni cząsteczki (serwer SwissProt,
Expasy). Po określeniu powyższych, wybrane fragmenty ponownie porównano z bazą Blast
(SIB BLAST Network Service, Swiss Institute of Bioinformatics) poszukując wszystkich białek homologicznych z wybranym fragmentem spektryny. W końcowym etapie wybrano te fragmenty spektryny
nieerytrocytarnej, które były niehomologiczne zarówno względem spektryny erytrocytarnej, jak i innych
białek ale jednocześnie posiadały wysoką immunogenność i wysoki stopień prawdopodobieństwa
wystąpienia na powierzchni w całej cząsteczce spektryny.
Synteza peptydu
Dalszy etap prac polegał na otrzymaniu przeciwciał reaktywnych w stosunku do wybranego
fragmentu. W tym celu zsyntetyzowano (Peptron Inc.) wybrany fragment spektryny βΙΙ o następującej
sekwencji L-T-V-Q-T-K-F-M-E-L, który posłużył do immunizacji.
Otrzymany peptyd rozpuszczono w DMSO według zaleceń producenta. Próbkę, którą szczepiono królika przygotowano zgodnie z następującą procedurą. 300 μg peptydu dodano do 300 μg
niekompletnego adiuwanta Freuda, następnie do takiej mieszaniny dodano PBS'u (10 mM Bufor fosfo-
4
PL 212 273 B1
ranowy, 137 mM NaCI, 2 mM KCI, pH 7,0) w stosunku 1:1 (obj./obj.). Całość mocno wymieszano
(1 min, 1000 obr./min) do czasu otrzymania jednolitej emulsji. Tak przygotowaną próbkę (objętość
końcowa 700 μΙ) podawano podskórnie w kilku miejscach królikowi. Całą procedurę powtórzono dwukrotnie w dwutygodniowych odstępach, z tym wyjątkiem, że niekompletny adiuwant Freuda zastąpiono
kompletnym adiuwantem Freuda. Po tygodniu od ostatniego szczepienia królika skrwawiono. Po wykrzepieniu, krew odwirowano (2000xg 10 min), a zebraną surowicę rozporcjowano po 1 ml w celu
dłuższego przechowania.
Otrzymane przeciwciała łączy się z odpowiednim barwnikiem fluorescencyjnym według znanych
i stosowanych w dziedzinie procedur. Należy dodać tak przygotowane przeciwciała z przyłączonym
barwnikiem fluorescencyjnym izotiocyjanianem FITC skierowane na fragment spektryny βΙΙ, oraz
barwnikiem fluorescencyjnym znakującym jądra komórkowe (DAPI, Hoehst, PI). Całość inkubuje się
15-30 min, po czy próbki odwirowuje się (800 g, 5 min, 4°C), a następnie przemywa buforem PBS.
Kolejno, próbki umieszcza się w cytofluorymetrze przepływowym i określa procent komórek wykazujących 5 agregację spektryny.
Zastrzeżenia patentowe
1. Sposób oceny efektywności chemioterapii u pacjentów z chorobą nowotworową poprzez śledzenie zmian rozmieszczenia spektryny wywołanych podawaniem cytostatyków w komórkach Iimfoidalnych, znamienny tym, że wykrywa się in vitro podjednostki spektryny αΙΙβΙΙ za pomocą przeciwciała z przyłączonym barwnikiem fluorescencyjnym, skierowanego na fragment spektryny βΙΙ, wysoce
specyficznego, niewykazującego reaktywności ze spektryną αl i βΙ, a następnie próbki umieszcza się
w cytofluorymetrze przepływowym i określa procent komórek wykazujących agregację spektryny.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że agregaty spektryny w limfocytach, w których
zachodzi apoptoza nie ulegają rozpuszczeniu w niejonowym detergencie.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wykrywa się podjednostki αΙΙβΙΙ spektryny ulegające reorganizacji we wczesnym etapie apoptozy.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że chorobą nowotworową jest przewlekła białaczka Iimfoblastyczna.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że niejonowym detergentem jest zimny 1%
Triton Χ-100.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że postęp apoptozy wykrywa się we wczesnych
stadiach terapii cytostatykami.
Departament Wydawnictw UP RP
Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)