2a. Podstawy wirusologii Cechy wirusów: specyfika budowy cząstki

2a. Podstawy wirusologii
Cechy wirusów: specyfika budowy cząstki wirusa, budowa morfologiczna (kształt, wymiary),
właściwości struktur wirusa, udział struktur w patomechanizmie zakażenia. Definicja,
budowa wirionu- genom DNA i RNA, struktura i morfologia kapsydu- rodzaje symetrii,
budowa i funkcja osłonki. Enzymy cząstek wirusowych (odwrotna transkryptaza,
neuraminidaza).
Systematyka wirusów- wirusy DNA- Herpesviridae (Herpes simplex, Varicella zoster-VZV,
CMV, EBV, HHV6, HHV7), Adenoviridae, Papovaviridae, (HPV, JC wirus), Parvoviridae
(B19), Hepadnaviridae- WZW typu B (HBV),Poxviridae (Variola- ospy prawdziwej,
Vaccinia- krowianki); wirusy RNA- Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Rabdoviridae,
Filoviridae, Bunyaviridae, Picornaviridae, Retroviridae, Togaviridae, Coronaviridae,
Calciviridae, Flaviviridae, wirusy gorączki krwotocznej, zapalenia opon mózgowordzeniowych, zapalenia mózgu.
Bakterio i mykofagi, liza i lizogenia.
Replikacja wirusowa- fazy replikacji (adsorpcji, penetracji, powielania komponentów wirusa,
dojrzewania, uwolnienia wirionów); Przebieg zakażenia wirusowego- wrota zakażenia,
zakażenie miejscowe, uogólnione,
Relacje wirus- komórka gospodarza- typy zakażeń- lityczne, nielityczne, latentne, apoptoza,
transformacja nowotworowa. Zapobieganie zakażeniom wirusowym- profilaktyka
preekspozycyjna, immunologiczna, chemioprofilaktyka. Uodparnianie czynne, rodzaje
szczepionek- inaktywowane, żywe atenuowane, rekombinowane, zawierające DNA.
Uodpornianie bierne- surowice odpornościowe.
Diagnostyka wirusologiczna- metody: izolacji- hodowle tkankowe, komórkowe, zarodki
ptasie; metody wykrywania namnożonych wirusów: efekt cytopatyczny, metoda łysinkowa,
odczyn hemaglutynacji, hemadsorpcji, bezpośredniego wykrycia wirusa- mikroskopia
elektronowa, EIA, IF, hybrydyzacja in-situ, PCR; serologiczne- wykrycie przeciwciał IgM,
IgG- EIA, IF. Hodowle komórkowe, zmiany w morfologii komórek linii, tworzenie CPE.
Pobieranie i transport próbek klinicznych- w najwcześniejszej fazie zakażenia, czas
dostarczenia próby, podłoża transportowe. Opracowanie materiału klinicznego- usuwanie
bakterii z materiału (filtracja, dodatek antybiotyków), dobór systemu hodowli, metody
idetyfikacji wirusa: amplifikacja-PCR z udziałem odwrotnej transkryptazy; interpretacja
wyników.
Diagnostyka wirusologiczna
1. Metody izolacji i namnażania wirusów.
Wirusy nie replikują poza komórką żywą, zatem hodowla wirusów odbywa się in vivo w
komórkach organizmów żywych lub in vitro poprzez namnażanie cząstek wirusa w
hodowlach komórkowych albo tkankowych.
Metoda namnażania wirusa w zarodkach kurzych.
Rozwijające się zarodki ptasie zakażane są w różnych fazach rozwojowych. Dokonuje się
zakażenia błony kosmówkowo-omoczniowej, jamy owodni, omoczni lub woreczka
żółtkowego. Po określonym czasie inkubacji w odpowiednich warunkach z zakażonego jaja
pobiera się płyn lub tkankę i bada na obecność wirusów.
Metoda namnażania w hodowlach tkankowych, komórkowych- hodowle mogą pochodzić
z tkanek ludzkich lub zwierzęcych świeżo pobranych (hodowle pierwotne), lub z tzw.
heteroploidalnych, ustabilizowanych linii komórkowych- pasażowane in vitro wielokrotnie.
Komórki zmienione są nowotworowo i namnażają się nieograniczenie.
Półciągłe linie komórkowe, diploidalne- zawierają komórki wywodzące się z tkanki płodowej
ludzkiej lub zwierzęcej (fibroblasty), o ograniczonym czasie życia do ok. 30–50 pasaży.
Komórka pozwalająca na namnożenie wirusa to komórka permisywna, zatem hodowla
komórkowa musi być permisywna dla danego wirusa.
2. Metody wykrywania wirusów
Efekt cytopatyczny CPE – zmiany morfologiczne i degeneracyjne w komórkach, w których
zachodzi replikacja wirusa. Cykl ten jest skutkiem zahamowania replikacji RNA i syntezy
białek gospodarza, jak również toksycznego wpływu białek wirusa. Obserwowany może być
jako: - zmiana kształtu, wielkości i typowego układu komórek, zmiany wewnątrzkomórkowe
(zmiany barwliwości i typowej morfologii struktur komórkowych, wewnątrzjądrowe i
wewnątrzplazmatyczne wtręty, wakuolizacja jądra i cytoplazmy), powstanie zespólni
komórkowych.
Metoda łysinkowa.
Łysinka jest to obszar przejaśnienia w hodowli komórkowej (eukariotycznej) lub bakteryjnej,
powstający w wyniku lizy komórek jako skutek działania pojedynczego, wyjściowego
wirionu („negatywna kolonia wirusa”).
Policzenie łysinek umożliwia wyliczenie stężenia wirusów w roztworze (PFU – plaque
forming unit, jednostka tworząca łysinkę).
Hemaglutynacja wirusowa - zachodzi wskutek działania niektórych wirusów na receptory
powierzchni krwinki czerwonej. Enzymatyczna aktywność hemaglutyniny i neuraminidazy
wirusowej wywołuje zjawisko polegające na łączeniu się krwinek czerwonych za pomocą
mostków w większe skupienia. Jest to reakcja odwracalna.
Hemadsorpcja- wykorzystuje zjawisko przylegania erytrocytów (różnych gatunków zwierząt
lub ludzkich) do powierzchni komórek zakażonych wirusem produkującym hemaglutyninę.
Efekt ten wyprzedza w hodowli komórkowej efekt cytopatyczny. Podczas namnażania wirusa
z osłonką i po wbudowaniu jego hemaglutynin w błonę komórkową komórki gospodarza
metoda hemadsorpcji pozwala na pośrednie wykrycie wirusa. Po dodaniu do hodowli
zawiesiny krwinek czerwonych nastąpi w przypadku obecności wirusa hemaglutynującego
adsorpcja erytrocytów do powierzchni komórek widoczna w postaci „kiści winogron”.
Swoiste przeciwciała hamujące ten proces pozwalają na identyfikację gatunkową danego
wirusa.
Hybrydyzacja in situ- metoda wykrywania wirusa w materiale biologicznym. Metoda
cytogenetyczna polegajaca na wykryciu w danym materiale specyficznej sekwencji DNA za
pomocą sond znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym. Odpowiednio przygotowane
komórki lub tkanki do badania umieszcza się szkiełku podstawowym. Fluorescencyjna sonda
jest nanoszona na preparat i całość poddawana jest denaturacji (wysoka temperatura), a
następnie kilkugodzinnej hybrydyzacji. Po przepłukaniu preparatu w celu usunięcia
niezhybrydyzowanych cząstek sondy preparat wybarwia się i analizuje pod mikroskopem
fluorescencyjnym.
Interferencja wirusowa - stosowana do wykrycia wirusa, który nie wywołuje zmian
morfologicznych zakażonych komórek, ale pozwala na zakażenie linii komórkowej innym
wirusem powodującym efekt cytopatyczny. Np. interferencja wirusa różyczki wirusem
ECHO. Komórki zakażone wirusem różyczki nie wykazują zmian cytopatycznych, a taka
linia komórkowa, zakażona również wirusem ECHO zmian takich nadal nie wykazuje,
pomimo faktu, iż wirus ECHO zawsze powoduje efekt cytopatyczny.
3. Izolacja i identyfikacja wirusa
Techniki i metody serologiczne
a) zahamowanie hemaglutynacji- pożywkę z hodowli zakażonej miesza się ze swoistymi
przeciwciałami i z tą mieszaniną wykonuje odczyn hemaglutynacji wirusowej;
b) zahamowanie hemadsorpcji- pożywkę z hodowli zakażonej miesza się ze swoistymi
przeciwciałami i tą mieszaniną zakaża się nową hodowlę. Brak zjawiska hemadsorpcji
takiej hodowli świadczy o neutralizacji przez dodane przeciwciała i pozwoli na
identyfikację wirusa.
c) neutralizacja- dodanie znanych przeciwciał do nieznanego wirusa. Taką mieszaniną
zakaża się nową linię komórkową, gdy nie wystąpią zmiany cytopatyczne świadczy to
o neutralizacji przeciwciałami nieznanego wirusa i umożliwia identyfikację.
d) zahamowanie interferencji wirusowej- dodanie przeciwciał do pożywki hodowli
zawierającej wirus interferujący i zakażenie taką mieszaniną nowej hodowli. Po 2
dniach do hodowli dodany zostaje wirus cytopatyczny. Efekt cytopatyczny to wynik
świadczący o związaniu pierwszego wirusa przez dodane przeciwciała.
e) odczyn immunofluorescencji bezpośredniej - do rozmazu komórek z zakażonej
hodowli komórkowej dodaje się przeciwciała wzorcowe znakowane fluorochromem.
Zakażenie komórki wirusem stwierdza się na podstawie obserwacji fluorescencji
komórek w mikroskopie fluorescencyjnym.
f) odczyn immnoenzymatyczny ELISA- (ang. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
jest testem immunologicznym; reakcją barwną enzymu sprzężonego z przeciwciałami
do jakościowego i ilościowego wykrycia przeciwciał, jak i antygenów. Służy on do
wykrycia określonych białek w badanym materiale z użyciem przeciwciał
skoniugowanych z odpowiednim enzymem. Po utworzeniu kompleksu
immunologicznego-, czyli unieruchomieniu przeciwciała i dodaniu substratu dla
enzymu związanego z przeciwciałem wytworzy się produkt, którego obecność
świadczy o obecności określonego białka- np. wirusowego.
Antygen wirusowy nakłada się na podłoże, dodaje się badana surowicę i swoiste
przeciwciało- jeśli jest w niej obecne to wiąże się z antygenem, następnie dodaje sie
antyglobulinę znakowana enzymem wiążącym się ze związanym przeciwciałem
badanej surowicy. W ostatnim etapie dodaje się substrat enzymu i mierzy
kolorymetrycznie zmianę barwy.
Wykorzystanie odwrotnej transkrypcji w metodzie PCR
Enzym odwrotna transkryptaza - występuje u wirusów RNA np. retrowirusów. Umożliwia
ona przepisanie ich materiału genetycznego z RNA na DNA, który następnie integruje do
genomu gospodarza i wraz z nim ulega replikacji. Również niektóre wirusy DNA
(hepadnawirusy) wykorzystują odwrotną transkrypcję podczas replikacji. Metoda ta
umożliwia: utworzenie DNA na matrycy RNA, ampifikację DNA za pomocą metody PCR.
Hybrydyzacja DNA- wykrycie genomu wirusa za pomocą hybrydyzowania wirusowego
DNA z nicią komplementarną, znakowaną enzymami lub substancjami radioaktywnymi.
Metoda rozdziału elektroforetycznego pozwala na porównanie nici DNA komplementarnej z
powstałym kompleksem DNA wirusa- DNA-komplementarne.
Immunoblotting- technika Western blot polega na rozdzieleniu antygenu na żelu
poliakrylamidowym za pomocą elektroforezy w obecności dodecylu sodu (SDS), co pozwala
na rozdzielenie cząsteczek na podstawie ich wielkości. Cząsteczki te są następnie
przenoszone na błonę nitrocelulozową celu stworzenia identycznego wzoru jak na żelu
(blotting). Kolejnym krokiem jest dodanie surowicy pacjenta przeciwciał znakowanych
enzymem, a przeciwciała niezwiązane są odpłukiwane i dodawana zostaje surowicę
skierowaną przeciwko ludzkim Ig znakowaną enzymem. Znakowane przeciwciała łączą się ze
wszystkimi przeciwciałami wychwyconymi przez antygen. Dodany na końcu substrat
pozwala na wizualizację. Kompleksy antygen- przeciwciało przejawiają się jako plamy(spots). Test ten pozwala na stworzenie profilu przeciwciał obecnych w badanej surowicy
przeciwko określonym białkom jak również pozwala na potwierdzenia obecności przeciwciał
np przeciwko wirusowi HIV.
Najczęściej stosowane metody wykrywania przeciwciał p/wirusowychRozpoznanie zakażenia wirusowego ustala się serologicznie przez wykazanie wzrostu miana
przeciwciał skierowanych przeciw wirusowi lub przez wykazanie obecności przeciwciał klasy
IgM. Metody ilościowej oceny przeciwciał polegają na reakcjach pomiędzy antygenem a
przeciwciałem. Stosuje się przede wszystkim odczyny:





neutralizacji- dodanie surowicy badanej do zawiesiny wirusa i zakażenie tą mieszanką
wrażliwej hodowli komórkowej. Brak efektu cytopatycznego (względem kontroli
dodatniej z surowica bez przeciwciał) świadczy o obecności przeciwciał
zobojętniających. Odczyn taki wykonuje się również z użyciem zwierząt
doświadczalnych- np. diagnostyka w kierunku Coxackie wirus typu A, lub z użyciem
zarodków kurzych- wirus świnki.
wiązania dopełniacza- antygeny wirusowe uzyskuje się w hodowlach komórkowych,
zarodków kurzych czy tkanek zakażonych zwierząt. Przeciwciała przeciw antygenom
wirusowym mogą występować w różnych okresach zakażenia. Interpretacja wyników
odczynu dopełniacza zależy od użytego antygenu i wzrostu miana przeciwciał.
hamowania hemaglutynacji
immunofluorescencji- służy do wykrywania obecności przeciwciała swoistego w
seryjnych rozcieńczeniach surowicy przy użyciu znanego antygenu wirusowego.
immunoenzymatyczne
Do rzadziej stosowanych technik należą:




odczyn biernej hemaglutynacji
techniki immunodyfuzyjne- antygen i przeciwciało dyfundują ku sobie w półstałym
ośrodku np. agarze tworząc linię precypitacyjną
immunoelektroforeza przeciwbieżna- stosowana gdy antygen wirusowy ma ładunek
ujemny, porusza sie w kierunku anody, globulina z kolei porusza się w przeciwnym
kierunku; w miejscu spotkania antygenu z przeciwciałem tworzy się w żelu
agarozowym linia precypitacyjna (np. wykrywanie przeciwciał przeciwko WZW typu
B)
techniki radioimmunologiczne- do oceny aktywności immunologicznej, są szeroko
stosowane do wykrywania przeciwciał (znakowanych radioizotopem) w ilościach
pikogramowych
Interpretacja wyników na przykładzie enterowirusa
Izolacja Przeciwciało Przeciwciało
wirusa
wiążące
zobojętniające
IgM
Zakażenie
+
+
-
dopełniacz
+
+
-
+
+
+
+
+
-
brak
wczesny okres
w toku
świeże
stare