Udział chitozanu w indukcji odpowiedzi immunologicznej podczas
advertisement
Uniwersytet Warszawski Wydział Biologii Klaudia Brodaczewska Nr albumu: 217 273 Udział chitozanu w indukcji odpowiedzi immunologicznej podczas zarażenia myszy nicieniami Rozprawa doktorska w zakresie nauk biologicznych dyscyplinie biologia Praca wykonana pod kierunkiem Prof. dr hab. Maria Doligalska Zakład Parazytologii, Wydział Biologii Warszawa, lipiec 2015 Chciałabym złożyć serdeczne podziękowania wszystkim, którzy wspierali mnie w czasie powstawania tej pracy: Prof. dr hab. Marii Doligalskiej- za cierpliwość i zaufanie Dr Katarzynie Donskow-Łysoniewskiej- za WSZYSTKO Współpracownikom z Zakładu, w szczególności Małej Kasi, Kindze, Maćkowi i pani Danusi- za pomoc techniczną, merytoryczną i duchową Pracownikom i doktorantom innych ZakładówImmunologii, Fizjologii Zwierząt, Cytologiiza gotowość do pomocy i otwartość Studentom Zakładu-szczególnie Natalii W. i Sylwii S.za udział w doświadczeniach i wnoszenie różnorodności do codziennej pracy Moim znajomym i przyjaciołom, Asi K., Dorocie i Krzyśkowi S., Patrycji i Szymonowi H., Asi i Piotrkowi O.- za wiarę we mnie A przede wszystkim mojej Rodzinie- za to, że mnie nie ocenia, tylko znosi i wspiera, niezależnie od okoliczności I moim Rodzicom, bez których moja praca naukowa i spełnianie marzeń nie byłoby możliwe Oświadczenie kierującego pracą Oświadczam, że niniejsza praca została przygotowana pod moim kierunkiem i stwierdzam, że spełnia ona warunki do przedstawienia jej w postępowaniu o nadanie stopnia doktora nauk biologicznych w zakresie biologii. Data Podpis kierującego pracą Oświadczenie autora pracy Świadom odpowiedzialności prawnej oświadczam, że niniejsza rozprawa doktorska została napisana przeze mnie samodzielnie i nie zawiera treści uzyskanych w sposób niezgodny z obowiązującymi przepisami. Oświadczam również, że przedstawiona praca nie była wcześniej przedmiotem procedur związanych z uzyskaniem stopnia doktora w innej jednostce. Oświadczam ponadto, że niniejsza wersja pracy jest identyczna z załączoną wersją elektroniczną. Data Podpis autora pracy Słowa kluczowe Nicienie pasożytnicze, odpowiedź immunologiczna, chitozan, odpowiedź Th2- zależna, stan zapalny, immunosupresja, przeciwciała, cytokiny, komórki prezentujące antygen Tytuł pracy w języku angielskim The role of chitosan in the induction of immune response in mice infected with nematodes Spis treści: Oświadczenie kierującego pracą ................................................................................................ 3 Oświadczenie autora pracy ........................................................................................................ 3 1. Streszczenie........................................................................................................................... 8 2. Wykaz skrótów ................................................................................................................... 10 3. Wstęp................................................................................................................................... 13 3.1 Nicienie pasożytnicze ................................................................................................. 14 3.2 Odpowiedź przeciwpasożytnicza ............................................................................... 15 3.2.1 Indukcja odpowiedzi immunologicznej typu 2 .......................................................... 16 3.2.2 Mechanizmy efektorowe odpowiedzi Th2 ................................................................. 17 3.2.3 Immunosupresja w czasie zarażeń nicieniami............................................................ 20 3.3 Rola chityny i chitozanu w indukcji odpowiedzi immunologicznej .......................... 23 3.3.1 Odpowiedź immunologiczna na chitynę .................................................................... 24 3.4 Właściwości i zastosowania chitozanu....................................................................... 25 5. Materiały i metody ............................................................................................................. 31 5.1 Myszy, pasożyty i linie komórkowe........................................................................... 31 5.2 Odczynniki ................................................................................................................. 31 5.3 Schemat doświadczeń in vivo ..................................................................................... 33 5.4 Analiza NMR ............................................................................................................. 34 5.5 Ocena pobudzenia immunologicznego ...................................................................... 34 5.6 Izolacja komórek ........................................................................................................ 35 5.7 Izolacja nicieni ........................................................................................................... 36 5.7.1 Heligmosomoides polygyrus....................................................................................... 36 5.7.2 Trichinella spiralis ..................................................................................................... 37 5.7.3 Otrzymywanie roztworów antygenów nicieni ........................................................... 37 5.8 Analiza cytometryczna ............................................................................................... 37 5.9 Hodowle komórkowe ................................................................................................. 42 5.10 Testy kolorymetryczne ............................................................................................... 43 5.11 Analiza białek metodą Western blot .......................................................................... 45 5.12 Badania histochemiczne ............................................................................................. 46 5.13 Analiza statystyczna ................................................................................................... 47 6. Wyniki ................................................................................................................................. 48 6.1 Właściwości immunostymulacyjne chitozanu in vitro........................................... 48 6.1.1 Wprowadzenie ............................................................................................................ 48 6.1.2 Wyniki ........................................................................................................................ 50 6.1.2.1 Cytotoksyczność ................................................................................................. 50 6.1.2.2 Apoptoza............................................................................................................. 51 6.1.2.3 Fenotyp komórek ................................................................................................ 53 6.1.2.4 Produkcja cytokin ............................................................................................... 55 6.1.3 Dyskusja ..................................................................................................................... 57 6.2 Właściwości immunostymulacyjne chitozanu in vivo............................................ 60 6.2.1 Wprowadzenie ............................................................................................................ 60 6.2.2 Wyniki ........................................................................................................................ 60 6.2.2.1 Wpływ chitozanu na stan fizjologiczny myszy .................................................. 60 6.2.2.2 Charakterystyka widm NMR chitozanu z jamy otrzewnej ................................. 64 6.2.2.3 Wpływ chitozanu na komórki jamy otrzewnej ................................................... 66 6.2.2.4 Wpływ chitozanu na komórki krwi obwodowej ................................................ 73 6.2.2.5 Wpływ chitozanu na poziom cytokin ................................................................. 74 6.2.3 Dyskusja ..................................................................................................................... 77 6.3 Wpływ chitozanu na odpowiedź przeciwpasożytniczą.......................................... 82 6.3.1 Wprowadzenie ............................................................................................................ 82 6.3.2 Wyniki ........................................................................................................................ 86 6.3.2.1 Heligmosomoides polygyrus ............................................................................... 86 6.3.2.1.1 Reakcja lokalna w jamie otrzewnej ................................................................ 87 6.3.2.1.2 Reakcja obwodowa w krwi ............................................................................. 92 6.3.2.2 Trichinella spiralis ............................................................................................. 94 6.3.2.2.1 Reakcja lokalna w jamie otrzewnej ................................................................ 95 6.3.2.2.2 Reakcja obwodowa w krwi ............................................................................. 99 6.3.3 Dyskusja ................................................................................................................... 102 6.4 Wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą ............................................................... 106 6.4.1 Wprowadzenie .......................................................................................................... 106 6.4.2 Wyniki ...................................................................................................................... 107 6.4.2.1 Wpływ chitozanu na odpowiedź limfocytów w MLN ..................................... 107 6.4.2.2 Wpływ chitozanu na proliferację limfocytów T CD4+ w MLN ...................... 108 6.4.2.3 Odpowiedź limfocytów w płynie otrzewnowym.............................................. 110 6.4.2.4 Wpływ chitozanu na produkcję przeciwciał ..................................................... 112 6.4.2.4.1 Poziom specyficznych przeciwciał IgG1 i IgE ............................................. 113 6.4.2.4.2 Poziom i specyficzność przeciwciał IgA oznaczany metodą ELISA ........... 114 6.4.2.4.3 Specyficzność przeciwciał IgA oznaczana metodą Western blot ................. 116 6.4.3 Dyskusja ................................................................................................................... 118 7. Podsumowanie i wnioski ................................................................................................. 126 7.1 Immunostymulacyjne właściwości chitozanu .......................................................... 126 7.2 Wpływ na odpowiedź przeciwpasożytniczą............................................................. 126 7.3 Różnice między gatunkami pasożyta w odpowiedzi na chitozan ............................ 127 7.4 Wnioski końcowe ..................................................................................................... 127 8. Spis literatury ................................................................................................................... 131 1. Streszczenie Odpowiedź obronna przeciwko nicieniom pasożytniczym zależna jest zwykle od mechanizmów regulowanych przez limfocyty Th2. Wzbudzenie tej populacji następuje w wyniku aktywacji komórek odpowiedzi wrodzonej, jednak wiele pasożytów moduluje reakcje układu odpornościowego wywołując immunosupresję, aby utrzymać się w żywicielu. Prowadzi to do chronicznego zarażenia i znacznie utrudnia kontrolę inwazji, zarówno u ludzi, jak i zwierząt hodowlanych. Poza podawaniem leków przeciwpasożytniczych, strategią zwalczania/ kontrolowania nicieni pasożytniczych może być wzmacnianie naturalnych mechanizmów obronnych żywiciela. Istnieje wiele związków, które mogą polaryzować odpowiedź immunologiczną w kierunku Th2 zależnej i jednym z nich jest chitozan. Jest to naturalny polimer, deacetylowana pochodna chityny, która występuje m. in. w strukturach nicieni. Uważa się, że związek ten może być rozpoznawany przez układ odpornościowy żywiciela i aktywować go, wpływając na równowagę odpowiedzi immunologicznej. Celem pracy było określenie w jaki sposób chitozan, polimer N-acetyloglukozaminy i glukozaminy, wpływa na odpowiedź immunologiczną oraz czy może on zwiększać skuteczność odpowiedzi przeciwpasożytniczej. W badaniach in vitro i in vivo oceniano jak chitozan aktywuje komórki odpowiedzi immunologicznej oraz czy wpływa na przebieg zarażenia nicieniami: Heligmosomoides polygyrus i Trichinella spiralis. Stwierdzono, że chitozan, w zależności od masy cząsteczkowej, wykazuje odmienne właściwości aktywowania in vitro komórek odpowiedzi wrodzonej. Podany in vivo dootrzewnowo, chitozan o dużej masie cząsteczkowej wywołał początkowo silny stan zapalny charakteryzujący się napływem neutrofilów i niedojrzałych monocytów oraz produkcją cytokin prozapalnych, jak i regulatorowych. Po zaprzestaniu podawania chitozanu obserwowano pojawianie się mechanizmów związanych z gojeniem tkanek; alternatywną aktywację makrofagów oraz wydzielanie TGF-β i IL-10. Zarażenie H. polygyrus myszy, którym podawano chitozan, skutkowało zahamowaniem objawów stanu zapalnego, bez znacznego wpływu na przebieg zarażenia. Z kolei u myszy, którym podawano chitozan, w czasie inwazji T. spiralis występował wyższy poziom zarażenia, a odpowiedź na polimer zdominowała odpowiedź przeciwpasożytniczą i obniżyła efektywność mechanizmów obronnych. Stan zapalny wywołany przez chitozan wpływał także na odpowiedź nabytą; zahamował proliferację limfocytów T CD4+, ale wzbudził produkcję przeciwciał IgA krzyżowo rozpoznających antygeny nicieni oraz sam polimer. Uzyskane wyniki wskazują, że chitozan nie jest specyficznym adiuwantem odpowiedzi Th2 zależnej; przetwarzany przez komórki może wywoływać stan zapalny, który ma długotrwały wpływ na mechanizmy odpornościowe żywiciela. 8 1. Streszczenie Abstract Protective immune response against parasitic nematodes is usually mediated by Th2 dependant mechanisms. Induction of those is initiated by activated cells of innate immunity, however many parasites modify immune response leading to immunosuppression and maintain within the host. This leads to chronicity and hampers control of infections both in humans and livestock. Apart from drug therapy, amplification of natural immunity may be a strategy to limit parasitic infections. Among compounds that polarise immune response towards Th2 mechanisms, chitosan may be listed. It is a naturally occurring polymer derived from chitin, that is present also in nematode structures. It is suggested that it can be recognised by the immune system and activate immune response causing its polarisation. Aim of this thesis was to establish how chitosan, polymer of N-acetyloglucosamine and glucosamine, influences immune system and antiparasitic responses. In in vitro and in vivo models it was evaluated how chitosan activates immune cells and affects the course of infection with nematodes: Heligmosomoides polygyrus or Trichinella spiralis. It was observed that chitosan activates innate immunity and this effect depends on molecular weight of the polymer. After intraperitoneal injections, high molecular weight chitosan induced inflammation characterized by influx of neutrophils and immature monocytes and production of proinflammatory and regulatory cytokines. After the treatment was terminated, tissue healing processes were observed; alternative activation of macrophages and secretion of TGF-β and IL-10. Infection of mice that obtained chitosan with H. polygyrus alleviated inflammation but the invasion was unchanged. However when chitosan treated mice were infected with T. spiralis, increased level of infection was observed as response to the polymer dominated and decreased protection. Chitosan induced inflammation altered also adaptive responses; proliferation of CD4+ T lymphocytes was reduces but secretion of IgA occurred that were cross-reactive to nematode antigens and polymer itself. Obtained results suggest that chitosan is not a specific adjuvant of Th2 responses; processed by cells it induces inflammation that alters host immunity in long-term perspective. 9 2. Wykaz skrótów AAMf- Alternatively Activated Macrophages; makrofagi aktywowane alternatywnie; M2 ADCC- Antibody Dependant Cell-mediated Cytotoxicity; cytotoksyczność zależna od przeciwciał AdOH- kwas adypinowy Ag- antygen AMCase- Acidic Mammalian Chitinase; kwaśna chitynaza ssacza AP- Alkaline Phosphatase; alkaliczna fosfataza APC- Antigen Presenting Cell; komórki prezentujące antygen lub allophycocyanin; allofikocyjanina ATR- Attenuated Total Reflectance; wielokrotne odbicie osłabione BCIP- 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate; 5-bromo, 4-chloro, 3-indolylofosforan BMDMf- Bone Marrow Derived Macrophages; makrofagi otrzymywane ze szpiku BSA- Bovine Serum Albumin ; albumina surowicy bydlęcej CAMf- Classically Activated Macrophages; makrofagi aktywowane klasycznie; M1 CD- Cluster of Differentiation; antygen różnicowania komórkowego; oznaczane kolejno numerami CFSE- CarboxyFluorescein Succinimidyl Ester; ester karboksyfluoresceiny ChaFF- Chitinase and Fizz Family members Cht- chitozan CLP- Chitinase-like Proteins; białka podobne do chitynaz COS- Chitosan Oligosaccharides; oligosacharydy chitozanu DAB- 3, 3'-diaminobenzidine; 3,3-diaminobenzydyna DAPI- 4',6-diamidino-2-phenylindole; 4',6-diamidyno-2-fenyloindol DC- Dendritic Cell; komórka dendrytyczna DC-SIGN- Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin; CD209 DD- Deacetylation Degree; stopień deacetylacji DMSO- dimethyl sulfoxide; dimetylosulfotlenek dpz- dzień po zarażeniu ELISA- enzyme-linked immunosorbent assay EPG- Eggs per Gram; liczba jaj na gram kału EPO- Eosinophil Peroxidase; peroksydaza eozynofilowa ES- Excretory-Secretory; wydalniczo-wydzielnicze; dotyczy antygenów pasożytniczych FACS- Fluorescence-activated cell sorting FIBCD1- fibrinogen C domain-containing protein 1 FITC- Fluorescein isothiocyanate; izotiocyjanian fluoresceiny FTIR- Fourier Transform Infrared Spectroscopy G- Gate; bramka; podział komórek na populacje w analizie FACS Gen- Generation; pokolenie- dotyczy komórek potomnych, oznaczane kolejno numerami GH18- Glycoside Hydrolase Family 18 GM-CSF- Granulocyte-Macrophage Colony-stimulating Factor; czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów HMW- High Molecular Weight; duża masa cząsteczkowa; dotyczy chitozanu 10 2. Wykaz skrótów Hp- Heligmosomoides polygyrus HRP- Horseradish Peroxidase; peroksydaza chrzanowa IBD- Inflammatory Bowel Disease; nieswoiste zapalenie jelit Ig- Immunoglobulin; immunoglobulina; także przeciwciało IL- Interleukin; interleukina iNOS- Inducible Nitric Oxide Syntethase; indukowana syntaza tlenku azotu K- grupa kontrolna; myszy niezarażone lub nietraktowane kDa- kilo Daltony LMW- Low Molecular Weight; mała masa cząsteczkowa; dotyczy chitozanu LPS- Lipopolysaccharide; lipopolisacharyd M- masa MBP- Major Basic Protein; główne białko zasadowe M-CSF- Macrophage Colony-stimulating Factor; czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów MCP-1- Monocyte Chemoattractant Protein-1 Mf- makrofag MHC- Major Histocompatibility Complex; główny układ zgodności tkankowej MLN- Mesenteric Lymph Nodes; krezkowe węzły limfatyczne MPO- Myeloperoxidase; mieloperoksydaza MR- Mannose Receptor; receptor dla mannozy, fukozy i N-acetyloglukozaminy, CD206 MTS3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2Htetrazolium Mw- Molecular weight; masa cząsteczkowa N- liczebność grupy; liczba powtórzeń NBL- New-borne Larvae; larwy nowonarodzone; dotyczy T. spiralis NMR- Nuclear Magnetic Resonance; spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego NO- Nitric Oxide; tlenek azotu OD- Optical Density; gęstość optyczna, absorbancja p- p- value; p-wartość; prawdopodobieństwo popełnienia błędu pierwszego rodzaju; dotyczy analizy statystycznej PAMP- Pathogen Associated Molecular Patterns; wzorce molekularne związane z patogenami PBS- Phosphate-Buffered Saline; roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami PE- Phycoerythrin; fikoerytryna PercP- Peridinin chlorophyll PI- Proliferation Index; indeks proliferacji; dotyczy analizy CFSE PRR- Pattern Recognition Receptors; receptory rozpoznające wzorce r- współczynnik korelacji Pearsona ROS- Reactive Oxygen Species; reaktywne formy tlenu rpm- revolutions per minute; obroty na minutę RPMI- Roswell Park Memorial Institute medium SD- Standard Deviation; odchylenie standardowe TBS- Tris-Buffered Saline; roztwór soli fizjologicznej buforowany tris Tc- cytotoxic T cell; limfocyt T cytotoksyczny 11 2. Wykaz skrótów TCR- T Cell Receptor; receptor limfocytów T TGF-β- Transforming Growth Factor beta; transformujący czynnik wzrostu Th- T helper cell; limfocyt T pomocniczy; oznaczane kolejno numerami TLR- Toll-like Receptor; receptor Toll-like; oznaczane kolejno numerami TNF-α- Tumour Necrosis Factor alpha; czynnik martwicy nowotworu Treg- T regulatory cell; limfocyt T regulatorowy Ts- Trichinella spiralis TSLP- Thymic Stromal Lymphopoietin vs- versus; przeciw, dotyczy analizy statystycznej, porównanie 2 grup badanych WGA- Wheat Germ Agglutinin; lektyna rozpoznająca N-acetyloglukozaminę 12 3. Wstęp Zarażenia helmintami stanowią poważny problem zarówno w medycynie, jak i weterynarii (Torgerson, 2013). Inwazje u ludzi, występujące głównie w krajach rozwijających się, choć są rzadko śmiertelne, przyczyniają się do obniżenia aktywności układu odpornościowego np. zmniejszając skuteczność szczepień (Borkow & Bentwich, 2008). Wysoka prewalencja zarażeń stanowi problem także w krajach uprzemysłowionych; obniża produktywność zwierząt hodowlanych powodując poważne straty ekonomiczne (Charlier et al., 2014). Dodatkowo, choroby pasożytnicze przenoszone ze zwierząt na ludzi stanowią ryzyko skażenia żywności i obniżenia jej wartości konsumpcyjnej (Alvin & Angeli, 2001). Zasięg szkód ekonomicznych wywoływanych przez wybrane helminty przedstawia Tabela 1. Problemy wynikające z zarażeń pasożytniczych stanowią poważne wyzwanie dla nauki: konieczne jest opracowanie skutecznych metod zapobiegania, leczenia oraz kontrolowania chorób pasożytniczych (Waller, 2003). Tabela 1. Przykłady strat ekonomicznych związanych z zarażeniem helmintami. Pasożyt Żywiciel Epidemiologia Skutek Szacowane zarażenia straty/koszty Anemia, N. americanus/ A. duodenale Człowiek 500 mln osób niedożywienie, na świecie zaburzenie rozwoju 30-70% T. circumcincta/ Trichostrongylus Owca stad zarażonych w południowej Zmniejszona produkcja wełny Australii 0,0007% prób pozytywnych T. spiralis Świnia w badanych rzeźniach UE w 402-952 USD/ osobę chorą rocznie (Lee et al., 2011) Roczne zyski pomniejszone 153 mln o AUD (Sackett et al., 2006) 25-400 mln EUR w Konieczność UE rocznie (EFSA, badania mięsa 2006, Murrell & Pozio, 2011) 13 3. Wstęp 3.1 Nicienie pasożytnicze Nicienie pasożytnicze to wielokomórkowe bezkręgowce charakteryzujące się różnorodnością budowy, strategii życiowych i patogenności względem żywicieli. Większość z nich ma skomplikowane cykle rozwojowe, w czasie których może następować zmiana żywiciela, lokalizacji w organizmie i stadium pasożyta. Cechy te sprawiają, że zarażenia nicieniami stanowią wyjątkowe wyzwanie dla układu odpornościowego żywiciela. W odróżnieniu od patogenów takich jak bakterie, wirusy czy pierwotniaki, nicienie zwykle nie namnażają się w swoim żywicielu (z nielicznymi wyjątkami; np. Strongyloides; Grove & Northern, 1989), dlatego wykształciły różnorodne strategie zapewniające im sukces rozprzestrzeniania się (Rys. 1). Wiele gatunków, np. nicienie żołądkowo-jelitowe, bytuje w przewodzie pokarmowym żywiciela, a formy dyspersyjne osiągają inwazyjność w środowisku zewnętrznym, gdzie oczekują na kolejnego żywiciela (Necator, Ascaris). Różne gatunki filarii w cyklu życiowym wymagają udziału wektora, który przenosi larwy nowego pokolenia do kolejnych żywicieli. Nieliczne gatunki, np. z rodzaju Trichinella, cały cykl życiowy odbywają w jednym osobniku żywicielskim (Despommier, 2005). Nicienie mogą zasiedlać różne narządy żywiciela i kolejne stadia rozwojowe mogą występować w różnych tkankach. Wiele gatunków pasożytuje w jelicie cienkim, gdzie osiedlają się po przejściu przez inne narządy, jak skóra, układy krwionośny czy oddechowy (Toxocara). Zmiana zasiedlanej tkanki zwykle wiąże się ze zmianą stadium i/lub antygenów powierzchniowych, co obniża skuteczność reakcji komórek układu odpornościowego. Charakterystyczne jest także aktywne modulowanie odpowiedzi immunologicznej żywiciela, dlatego wiele zarażeń nicieniami ma przebieg chroniczny (Patel et al., 2009). W warunkach naturalnych często występują ko-infekcje różnymi gatunkami patogenów, dlatego w środowisku trudno jest ustalić swoistość reakcji na poszczególne rodzaje/gatunki pasożytów. Z tego względu interakcje pasożyt-żywiciel najlepiej badać w warunkach laboratoryjnych podczas inwazji eksperymentalnych. Opracowano wiele modelowych układów przy użyciu zwierząt laboratoryjnych zarażanych nicieniami, co umożliwia charakteryzowanie zjawisk zachodzących w czasie inwazji (Patel et al., 2009 i Rozdział 6.3). 14 3. Wstęp Legenda: Rys. 1 Biologia i związki filogenetyczne pasożytniczych nicieni; zróżnicowanie żywicieli, cykli życiowych i znaczenie dla człowieka. Za: Gilabert & Wasmuth, 2013, zmienione. 3.2 Odpowiedź przeciwpasożytnicza Pomimo różnorodności biologii, nicienie pasożytnicze wywołują zwykle zbliżone reakcje odpornościowe u żywicieli (ssaków). Określa się je mianem odpowiedzi Th2-zależnej lub typu 2 (Grencis, 1997), która charakteryzuje się między innymi: eozynofilią i mastocytozą, alternatywną aktywacją makrofagów, dojrzewaniem limfocytów B i produkcją przeciwciał, głównie klas IgE i IgG1, oraz aktywacją limfocytów Th2 produkujących IL-4, IL-5 i IL-13 (Maizels et al., 2004). Obserwuje się także zmiany fizjologiczne w tkankach zasiedlanych przez pasożyty, np. zwiększenie wydzielania śluzu w układzie pokarmowym czy oddechowym (Soga et al., 2013). Co ciekawe, podobna odpowiedź pojawia się w czasie reakcji alergicznej (Annunziato et al., 2014). Rozwinięcie odpowiedzi typu Th2 w czasie zarażenia może odpowiadać za: 1) hamowanie rozwoju kolejnych stadiów w pierwszym i po 15 3. Wstęp ponownym zarażeniu (Voehringer et al., 2006), 2) usuwanie form dorosłych z jelita (Finkelman et al., 2004), 3) ograniczanie stanu zapalnego, gdy pasożyt nie może być usunięty, co zapewnia przeżywanie żywiciela (Herbert et al., 2004), ale także 4) reakcje patologiczne w tkankach (fibroza) zasiedlanych przez pasożyta (Wynn et al., 2004). Zatem odpowiedź Th2 może zarówno warunkować obronność, jak i poprzedzać objawy chorobowe i komplikacje związane z parazytozami. 3.2.1 Indukcja odpowiedzi immunologicznej typu 2 Rozwój odpowiedzi typu Th2, podobnie jak w przypadku stanu zapalnego Th1-zależnego, jest determinowany już na poziomie komórek odpowiedzi wrodzonej. Są to głównie komórki dendrytyczne (Dendritic Cells; DC) i makrofagi rozpoznające charakterystyczne struktury patogenów (Pathogen Associated Molecular Patterns; PAMP) poprzez receptory PRR (Pattern Recognition Receptors, receptory rozpoznające wzorce). W zależności od rodzaju patogenu, wzbudzane i podtrzymywane są takie mechanizmy odpowiedzi immunologicznej, które będą najskuteczniej zwalczać dany czynnik chorobotwórczy (Netea et al., 2005). Wiadomo, że odpowiedź immunologiczna może ulegać polaryzacji, np. w kierunku Th1, Th2, Th17, Treg i in., ale mechanizm tego zjawiska nie jest jeszcze dokładnie znany. Przypuszcza się, że to struktura PAMP indukuje w komórkach wymaganą ścieżkę aktywacji. Powinowactwo ligandów do receptorów PRR uruchamia różne ścieżki sygnałowe w komórce i w konsekwencji inne mechanizmy efektorowe. O ile PAMP i PRR wzbudzające odpowiedź Th1-zależną są dość dobrze opisane (Kay et al., 2013), mechanizmy uruchamiające pozostałe typy odpowiedzi nie są jasne. W przypadku odpowiedzi Th2-zależnej, zaproponowanej już w latach 80-tych XX wieku (Mosmann et al., 1986), funkcjonują obecnie 2 dominujące hipotezy: 1) rozwija się ona przy braku lub niepełnej indukcji stanu zapalnego typu Th1 lub 2) istnieją odrębne receptory i ścieżki sygnałowe odpowiedzialne za rozpoznawanie PAMP patogenów indukujących odpowiedź Th2. Oba wyjaśnienia wydają się możliwe. Stwierdzono, że aktywacja komórek dendrytycznych jest kluczowa dla rozwinięcia odpowiedzi Th2 in vivo (Phythian-Adams et al., 2010), a ich fenotyp wskazuje wtedy na niedojrzałość. Pod wpływem czynników wzbudzających odpowiedź Th1 (np. LPS, Lipopolysaccharide) następuje wzrost ekspresji cząsteczek związanych z prezentacją antygenu limfocytom T (MHC klasy II- 1. sygnał oraz CD40, CD80 i CD86- 2. sygnał) oraz produkcja IL-12 (3. sygnał), co świadczy o dojrzałości tych komórek (Vieira et al., 2000). Zaobserwowano natomiast, że indukcja mechanizmów typu 2 zachodzi, gdy DC nie ulegają pełnej aktywacji; nie następuje lub jest 16 3. Wstęp niewystarczająca prezentacja antygenu i nie pojawia się IL-12, co indukuje dojrzewanie limfocytów Th2 (Jankovic et al., 2004). Jednak obserwuje się wzbudzenie specyficznej odpowiedzi Th2-zależnej także w obecności stymulantów typu Th1 (Cervi et al., 2004), co sugeruje istnienie oddzielnych ścieżek aktywacji dla różnych rodzajów odpowiedzi. Wykazano, że DC stymulowane antygenami pasożytów rozpoznawanymi przez receptory takie jak: MR (Mannose Receptor; receptor dla mannozy, fukozy i N-acetyloglukozaminy, CD206), dektyna 1 i 2, DC-SIGN czy TLR 4, indukują dojrzewanie limfocytów Th2. Te PRR rozpoznają reszty cukrowe, które licznie występują w antygenach nicieni i sugeruje się, że takie cząsteczki mogą być swoistymi adiuwantami odpowiedzi typu 2 (Hussaarts et al., 2014). Cechą charakterystyczną inwazji helmintów, która ma duży wpływ na indukcję odpowiedzi Th2, jest migracja pasożytów przez tkanki żywiciela w czasie zarażenia. Jako organizmy wielokomórkowe, helminty przedzierają się przez tkanki i narządy powodując uszkodzenia mechaniczne indukujące wydzielanie różnych czynników alarmujących układ odpornościowy. Szczególnie dobrze poznana jest w tym aspekcie rola nabłonka jelita; komórki epitelialne zwykle jako pierwsze mają kontakt z nicieniami żołądkowo-jelitowymi, gdy te wnikają w nabłonek układu pokarmowego. Przerwanie ciągłości tkanki, a także rozpoznawanie czynników pochodzenia pasożytniczego, indukuje wydzielanie przez komórki nabłonkowe alarmin- TSLP (Thymic Stromal Lymphopoietin), IL-33 i IL-25- cytokin, które sygnalizują uszkodzenie komórek. Cytokiny te przyciągają komórki odpowiedzi Th2, związane także z gojeniem (Gause et al., 2013). Czynniki te prowadzą do rozwoju odpowiedzi Th2 poprzez hamowanie wydzielania IL-12 przez komórki dendrytyczne (Zaph et al., 2007), indukcję degranulacji komórek tucznych (Allakhverdi et al., 2007), a także przez bezpośredni wpływ na limfocyty T powodując ich polaryzację (Owyang et al., 2006). Poprzez te mechanizmy, inwazja pasożytnicza może być rozpoznana przez żywiciela i następuje indukcja reakcji Th2. 3.2.2 Mechanizmy efektorowe odpowiedzi Th2 Aktywacja komórek odpowiedzi wrodzonej przez antygeny pasożytów oraz czynniki wydzielane po uszkodzeniu tkanki, poprzedza aktywację komórek odpowiedzi nabytej, specyficznej wobec antygenów pasożyta. Pobudzone w narządach komórki APC (Antigen Presenting Cells; komórki prezentujące antygen) migrują do węzłów limfatycznych i poprzez interakcje z naiwnymi limfocytami Th (helper; pomocniczymi, CD4+) indukują ich dojrzewanie. Komórki Th specyficzne wobec prezentowanych antygenów są aktywowane i 17 3. Wstęp wykazują fenotyp Th2, o czym świadczy produkcja cytokin: IL-4, IL-5, IL-9 i IL-13 (Paul, 2010). Komórki te są kluczowe w odpowiedzi obronnej przeciwko nicieniom; deplecja limfocytów CD4+ w czasie zarażenia uniemożliwia rozwinięcie odpowiedzi obronnej (Koyama et al., 1995). Jednak odpowiedź przeciwpasożytnicza nie jest jednoskładnikowa i wymaga uruchomienia różnych mechanizmów efektorowych, które unieszkodliwią pasożyta. Reakcje te kontrolowane są właśnie przez limfocyty Th2; wydzielane cytokiny aktywują kolejne populacje komórek: komórki tuczne, eozynofile, makrofagi aktywowane alternatywnie (Alternatively Activated Macrophages; AAMf lub M2) i limfocyty B oraz wywołują zmiany fizjologiczne w tkankach (Anthony et al., 2007), które to mechanizmy wspólnie przyczyniają się do usunięcia inwazji. W czasie zarażeń zwykle obserwuje się eozynofilię w krwi i narządach. Eozynofile, aktywowane przez IL-5, GM-CSF i eotaksynę, migrują do miejsca, gdzie przebywa pasożyt i wydzielają czynniki prozapalne oraz cytokiny (Klion & Nutman, 2004). W czasie degranulacji uwalniane są białka, takie jak: rybonukleazy, peroksydaza eozynofilowa (eosinophil peroxidase; EPO) i główne białko zasadowe (major basic protein; MBP) oraz reaktywne formy tlenu, które uszkadzają powierzchnię pasożyta (Kita, 2011). Czynniki te są szczególnie ważne w przypadku nicieni migrujących, jak Toxocara czy filarie, gdyż znacząco przyczyniają się do zabijania larw tych pasożytów (Meeusen & Balic, 2000). Eozynofile pełnią także ważną funkcję regulatorową; są źródłem cytokin, jak IL-4 i IL-13, i wzmacniają odpowiedź Th2 zależną (Spencer, 2014). Jako komórki obecne w narządach (tissue-dwelling cells) jako pierwsze mogą reagować na docierające pasożyty i sygnały z uszkodzonych tkanek. Choć eozynofilom przypisuje się także rolę w powstawaniu zmian patologicznych i nadmiernego uszkodzenia tkanek, zarówno w czasie zarażeń pasożytami jak i reakcji alergicznej, podkreśla się znaczenie tej populacji komórek w procesie przebudowy oraz gojenia tkanek (Lee & Lee, 2005). Te same mechanizmy, które mogą uszkadzać patogeny, biorą udział w przekształcaniu tkanek żywiciela, jak degradacja białek macierzy zewnątrzkomórkowej czy uwalnianych przez komórki nekrotyczne. Dzięki właściwościom efektorowym i regulacyjnym, eozynofile biorą zatem udział wielokierunkowo w odpowiedzi typu 2- wpływając bezpośrednio na pasożyta, ale także na tkanki żywiciela. Kolejną populacją komórek pojawiającą się w czasie zarażenia nicieniami są makrofagi, które pod wpływem czynników pochodzenia pasożytniczego i/lub środowiska Th2 (IL-4/IL-13) ulegają aktywacji alternatywnej. U myszy, charakteryzuje się ona obniżoną aktywnością indukowanej syntazy tlenku azotu (iNOS) na rzecz arginazy-1 (Sica & Mantovani, 2012). 18 3. Wstęp Enzymy te konkurują o substrat, L-argininę; iNOS katalizuje reakcję, w której powstaje tlenek azotu (nitric oxide; NO), jeden z mediatorów stanu zapalnego. Natomiast arginaza-1, poprzez wytwarzanie L-ornitryny włączona jest w szlak syntezy poliamin, czynników przeciwzapalnych, oraz kolagenu, niezbędnego do gojenia tkanek. Ponadto, AAMf w odróżnieniu od makrofagów aktywowanych na drodze klasycznej (CAMf, Classically Activated Macrophages, M1) nie wydzielają prozapalnych IL-1 i IL-12, lecz cytokiny regulatorowe- IL-10 i TGF-β. Komórki te wydzielają także białka z rodziny ChaFF (Chitinase and Fizz Family members), takie jak kwaśna chitynaza ssacza (acidic mammalian chitinase; AMCase) Ym1, Fizz1 czy Fizz2 (Nair et al., 2005). Czynniki te mogą wiązać niektóre cząsteczki pasożytów, indukować migrację innych leukocytów oraz wspomagać procesy gojenia tkanki. AAMf różnią się od CAMf także ekspresją markerów powierzchniowych; obserwuje się na nich zwiększoną ekspresję takich PRR jak: MR i dektyna 1 (receptor dla βglukanu) oraz receptory-zmiatacze (scavenger receptors; Gordon & Martinez, 2010). Dokładna rola obronna AAMf w czasie inwazji nie jest poznana, wykazano jednak, że usunięcie tej populacji zaburza pierwotną i wtórną odpowiedź przeciwko nicieniom jelitowym (Anthony et al., 2006, Zhao et al., 2008). Prawdopodobnie wpływają one na procesy fizjologiczne jelita wspomagając usuwanie pasożytów, ale także mogą bezpośrednio uszkadzać pasożyty i wpływać na ich płodność (Bonne-Année et al., 2013). Zwraca się również uwagę na ich rolę regulacyjną; hamując stan zapalny typu Th1 mogą pozytywnie wpływać na rozwój i utrzymanie mechanizmów obronnych typu 2 (Herbert et al., 2004). W czasie inwazji nicieni, szczególnie jelitowych, ważną funkcję w reakcji obronnej pełnią komórki tuczne, u myszy zwykle warunkujące wyrzucanie pasożytów z jelita (Shintoku et al., 2013). Ulegają one degranulacji, zależnej i niezależnej od IgE, uwalniając histaminę, proteazy i cytokiny. Komórki tuczne mogą bezpośrednio uszkadzać powierzchnię pasożyta, ale równocześnie pełnią funkcje regulatorowe; są źródłem cytokin chemotaktycznych dla limfocytów T, komórek dendrytycznych i innych (Hepworth et al., 2012). Produkty komórek tucznych wpływają także na nabłonek jelita; zwiększa się jego przepuszczalność, co razem ze wzmożoną produkcją śluzu i napięciem mięśni ułatwia migrację komórek układu odpornościowego, a także utrudnia utrzymanie się nicieni w jelicie (Onah & Nawa, 2000). Kolejny mechanizm efektorowy w czasie odpowiedzi typu 2 wynika z aktywacji limfocytów B. Pod wpływem IL-4 oraz oddziaływań z limfocytami Th2 następuje przełączanie klas przeciwciał i produkowane są IgE oraz IgG1- zarówno specyficzne wobec antygenów nicieni, jak i poliklonalne (Harris & Gause, 2011). IgE bierze udział w aktywacji komórek tucznych i 19 3. Wstęp bazofilów, natomiast IgG1 aktywuje komórki takie jak makrofagi czy neutrofile. Uważa się, że przeciwciała klasy IgG chronią przed kolejnym zarażeniem niektórymi gatunkami nicieni, a w pierwotnej inwazji obniżają płodność pasożytów (McCoy et al., 2008). Ponadto, odporność przeciwko helmintom może być biernie przenoszona poprzez transfer surowicy lub samych IgG (Harris & Gause, 2011). Cytotoksyczność zależna od przeciwciał (Antibody Dependant Cell-mediated Cytotoxicity; ADCC) z udziałem immunoglobulin i różnych komórek posiadających receptor dla fragmentu Fc przeciwciał różnych klas, umożliwia specyficzny atak na pasożyta; uwalniane czynniki toksyczne uszkadzają pasożyty lub zatrzymują ich migrację obniżając negatywny wpływ na żywiciela. Przeciwciała neutralizują także produkty pasożytów osłabiając ich wpływ na żywiciela (Moreau & Chauvin, 2010). Ze względu na rozmiary, nicienie pasożytnicze nie są fagocytowane przez komórki żerne. Wymienione wyżej mechanizmy obronne typu 2 polegają zatem na uwalnianiu cząsteczek efektorowych, które uszkadzają powierzchnię nicieni lub blokują funkcje ich układu pokarmowego (Knox et al., 2003) oraz na zmianie warunków fizjologicznych tkanki na mniej sprzyjające pasożytowi. Równocześnie, uruchamiane mechanizmy zmniejszają skutki uszkodzeń tkanek powodowanych przez przemieszczające się nicienie. Dlatego u myszy, szczepy charakteryzujące się efektywniejszą indukcją mechanizmów Th2 zależnych, np. BALB/c, są zwykle bardziej odporne na zarażenia nicieniami niż zwierzęta z tendencją do odpowiedzi Th1, np. C57Bl6, AKR (Behnke et al., 2009). Jednak gatunki nicieni pasożytniczych różnią się wrażliwością na wymienione reakcje obronne żywiciela; nie każda reakcja mechanizmu typu 2 warunkuje obronność w czasie różnych inwazji. Różne mechanizmy są skuteczne w zwalczaniu poszczególnych gatunków pasożytów, zatem dynamika i równowaga reakcji są kluczowe dla kontrolowania zarażenia (Patel et al., 2009). 3.2.3 Immunosupresja w czasie zarażeń nicieniami Ko-ewolucja układu pasożyt-żywiciel doprowadziła do wykształcenia przez helminty mechanizmów regulujących i hamujących reakcje układu odpornościowego. Sprzyja to przeżywaniu zarówno pasożyta, jak i żywiciela, przez ograniczanie stanu zapalnego (MacDonald et al., 2002). Immunosupresja pojawiająca się w czasie zarażeń nicieniami stanowi dodatkowe utrudnienie w zwalczaniu inwazji. Obserwuje się hamowanie reakcji specyficznych wobec pasożyta, ale także obwodowych na inne antygeny, dlatego immunosupresja może być także korzystna dla żywiciela, jak w przypadku helmintoterapii, gdy obserwuje się łagodzenie objawów chorób zapalnych podczas zarażenia (Elliott & 20 3. Wstęp Weinstock, 2009). Nicienie pasożytnicze indukują naturalne mechanizmy regulatorowe na każdym poziomie odpowiedzi immunologicznej: wrodzonej i nabytej, komórkowej i humoralnej (Maizels et al., 2004). Jedną ze strategii unikania reakcji obronnej żywiciela jest ograniczanie rozpoznania pasożyta przez układ odpornościowy oraz hamowanie mechanizmów efektorowych. Obserwuje się hamowanie aktywacji limfocytów T; pasożytnicze inhibitory proteaz zaburzają przetwarzanie peptydów w procesie prezentacji antygenów (Manoury et al., 2001). Pasożyty wydzielają także wiele enzymów hamujących mechanizmy efektorowe żywiciela; u filarii opisano wiele genów, których produkty bezpośrednio ochraniają te nicienie przed reaktywnymi formami tlenu czy elastazami wydzielanymi przez neutrofile (Maizels et al., 2001). Poza unikaniem reakcji obronnych, nicienie pasożytnicze wykształciły mechanizmy umożliwiające im aktywne modulowanie odpowiedzi immunologicznej żywiciela. Wykazano, że w czasie zarażenia indukowane są naturalne mechanizmy regulatorowe, które dla żywiciela stanowią zabezpieczenie przed zbyt intensywnym stanem zapalnym lub reakcjami autoimmunizacyjnymi; np. limfocyty T regulatorowe (Treg) odpowiadają za tolerancję na auto-antygeny oraz za ograniczanie nadmiernych reakcji na cząsteczki obce (Wing & Sakaguchi, 2010). Wykazano, że helminty stymulują różnicowanie Treg, które poprzez wydzielanie cytokin supresorowych (IL-10 i TGF-β) oraz bezpośrednie oddziaływania z komórkami, ograniczają funkcje efektorowe (Maizels et al., 2004). Obniżają proliferację i aktywność limfocytów Th2, szczególnie specyficznych wobec antygenów nicieni; hamowana jest produkcja cytokin IL-4 i IL-5. Po zahamowaniu aktywności limfocytów Treg zwykle następuje przywrócenie reakcji obronnej i zwalczenie zarażenia (Taylor et al., 2005). Ponadto, produkty pasożytnicze bezpośrednio wpływają na limfocyty T- mogą powodować ich areaktywność (Telford et al., 1998) i zmieniać ich zdolność do proliferacji czy apoptozy (Doligalska et al., 2012), co wpływa na równowagę odpowiedzi Th1/Th2/Treg. Innym źródłem cytokin regulatorowych jest populacja makrofagów aktywowanych alternatywnie. Chociaż, jak opisano wcześniej, komórki te pełnią funkcje obronne w czasie odpowiedzi typu 2, uważa się, że mogą także hamować reakcje odpornościowe. Komórki te produkują TGF-β i prostaglandyny oraz hamują proliferację limfocytów T (Rückerl & Allen, 2014), jak również przyspieszają gojenie tkanek. Czynniki, które odpowiadają za wzbudzenie immunosupresji w czasie zarażeń helmintami, nie są jeszcze dokładnie opisane. Wiadomo jednak, że niektóre pasożyty produkują homologi cytokin ssaków, którymi mogą regulować odpowiedź żywiciela; np. u filarii obecne są 21 3. Wstęp homologi TGF-β (Gomez-Escobar et al., 2000), cytokiny przeciwzapalnej, która może hamować odpowiedź obronną. Natomiast S. mansoni wydziela prostaglandyny, które nie dopuszczają do pełnej aktywacji komórek dendrytycznych (Angeli et al., 2001). Choć immunosupresja indukowana przez helminty powoduje ograniczenie odpowiedzi obronnej, to wydaje się być ona pewnego rodzaju kompromisem osiągniętym pomiędzy żywicielem a pasożytem. Blokowanie mechanizmów regulatorowych może okazać się dla żywiciela szkodliwe; u myszy zarażonych S. mansoni doprowadza to do groźnego stanu zapalnego (Herbert et al., 2004). Z tego powodu kontrola zarażenia wymaga równowagi między odpowiedzią obronną typu 2, mechanizmami gojenia a immunosupresją. Taki stan zapewnia żywicielowi przeżywanie zarażenia, które często przebiega bezobjawowo, a równocześnie ogranicza nadmierną jego eksploatację przez pasożyta. Mechanizmy odpowiedzi immunologicznej, obronnej i regulatorowej, pojawiające się w czasie zarażenia nicieniami pasożytniczymi podsumowano na Rys. 2. Efekt dla pasożyta Aktywacja mechanizmów regulatorowych/ Indukcja immunosupresji/ Hamowanie mechanizmów Hamowanie rozpoznania obronnych Odpowiedź regulatorowa Eozynofil Makrofag Limfocyt B TGF-β i IL-10 Wydzielanie cytokin Komórka dendrytyczna Limfocyt T Antygeny ES i somatyczne Pasożyt Treg i Th2 TGF-β i IL-10 Th1 i Th17 IL-12 Makrofag Komórki nabłonkowe Cytokiny alarmujące (IL-33, IL-25, TSLP) Efekt dla żywiciela Rozpoznanie patogenu Oddziaływania receptorowe Aktywacja mechanizmów obronnych M2 M1 Obronna odpowiedź Th2 Rys. 2. Mechanizmy odpowiedzi immunologicznej indukowane w czasie zarażenia nicieniami. Rysunek własny. 22 3. Wstęp 3.3 Rola chityny i chitozanu w indukcji odpowiedzi immunologicznej Chityna to drugi po celulozie najliczniej występujący w przyrodzie naturalny polimer. Zbudowany jest z podjednostek β-1,4-N-actetyloglukozaminy połączonych wiązaniami glikozydowymi i charakteryzuje się dużą wytrzymałością (Rys. 3a). Wchodzi w skład szkieletu zewnętrznego stawonogów, a także wzmacnia strukturę kutykuli nicieni oraz ściany komórkowej grzybów (Merzendorfer, 2013). Często formuje kompleksy z białkami oraz innymi cząsteczkami, będąc elementem bardziej złożonych struktur (Free, 2013). U nicieni wykazano obecność tego polimeru w osłonkach jajowych, gardzieli (Wharton, 1983), a w czasie linienia obserwuje się wzmożoną aktywność szlaku metabolicznego chityny. W genomie różnych gatunków nicieni, np. wolno żyjącego C. elegans (Veronico et al., 2001) i pasożytniczych, np. Ascaris suum, Brugia malayi (Foster et al., 2005), identyfikuje się wiele genów kodujących syntazę chityny- enzym katalizujący polimeryzację reszt β-1,4-N-actetyloglukozaminy i powstawanie łańcuchów polimeru. Jej aktywność wykazano na różnych etapach ontogenezy. W czasie wykluwania się z jaj oraz linienia larw obserwuje się dodatkowo aktywność chitynaz, enzymów rozkładających chitynę (Tachu et al., 2008). U zwierząt kręgowych, a także roślin, chityna nie jest syntetyzowana, jednak stwierdzono u nich homologi/analogi chitynaz, z których część zachowała aktywność chitynolityczną (Adrangi & Faramarzi, 2013). U myszy chitynazy oraz białka podobne do chitynaz (chitinaselike proteins; CLP) należące do rodziny GH18 (glycosyl hydrolases; hydrolazy glikozylowe) są białkami wydzielniczymi i występują m. in. w układzie oddechowym, pokarmowym i rozrodczym oraz odpornościowym. Należą do nich: aktywne enzymatycznie chitotriosydaza i kwaśna chitynaza ssacza oraz chi-lektyny; wiążące chitynę, lecz bez aktywności enzymatycznej: Ym1 (Chil3), Ym2, BRP-39 i owiduktyna (Bussink et al., 2007). Uważa się, że białka te pełnią głównie funkcje odpornościowe; biorą udział w rozkładaniu i wiązaniu chityny, co można uznać za strategię obronną żywiciela przed patogenami zawierającymi ten polimer (Nair et al., 2005). Receptory, które mogą rozpoznawać chitynę występują na różnych komórkach ssaków. Najwięcej z nich obserwuje się na komórkach układu odpornościowego i są to: MR, TLR2 i dektyny (Brinchmann et al., 2011), ale występują także np. na komórkach nabłonka układu oddechowego czy pokarmowego, jak np. fibrinogen C domain-containing protein 1 (FIBCD1; Schlosser et al., 2009) czy secreted C-type lectin RegIIIγ (Cash et al., 2006). Wykazano także, że chityna może bezpośrednio aktywować układ dopełniacza (Roy et al., 2013b). 23 3. Wstęp a b Rys. 3 Wzór strukturalny podjednostek a) chityny i b) chitozanu. Czerwonymi ramkami oznaczono różnice wynikające z acetylacji grupy aminowej. 3.3.1 Odpowiedź immunologiczna na chitynę Chityna obecna w patogenach oraz ich metabolitach, może być rozpoznawana przez układ odpornościowy żywiciela, a co za tym idzie, indukować odpowiedź immunologiczną (Brodaczewska et al., 2015). Ze względu na szerokie rozpowszechnienie polimeru w naturze, ekspozycja układu odpornościowego na chitynę jest wysoka. Uważa się, że chityna jest rozpoznawana przede wszystkim przez komórki w narządach bezpośrednio kontaktujących się ze środowiskiem zewnętrznym, jak jelito lub płuca, gdzie polimer może aktywować zarówno odpowiedź wrodzoną, jak i nabytą (Lee et al., 2008). Zaobserwowano, że chityna aktywuje komórki charakterystyczne dla alergii i odpowiedzi typu 2, jak: eozynofile (O’Dea et al., 2014), makrofagi (Satoh et al., 2010) i limfocyty Th2 produkujące IL-4/IL-13 (Reese et al., 2007). Pod wpływem chityny następuje też wzmożona produkcja cytokiny regulatorowej IL-10 (Wagener et al., 2014), a także nieznacznie zwiększa się produkcja przeciwciał (Tokura et al., 1999). Jak wykazano wcześniej, wymienione mechanizmy są charakterystyczne dla zarażeń nicieniami, ale także grzybami oraz pasożytniczymi stawonogami, które są uważane za patogeny wzbudzające odpowiedź typu 2 (Liu et al., 2004, Kreindler et al., 2010, Walton et al., 2010, Chen et al., 2012), a posiadają w swojej strukturze chitynę, co może sugerować udział polimeru w naturalnej polaryzacji immunologicznej. Co więcej, u roślin chityna stanowi PAMP i warunkuje odporność na infekcje grzybicze, owadami i nicieniami pasożytniczymi (Malinovsky et al., 2014). Makrofagi mogą w dużym stopniu odpowiadać za rozpoznawanie patogenów zawierających chitynę (Reese et al., 2007). W wielu badaniach stwierdzono, że ekspozycja na chitynę skutkuje aktywacją alternatywną makrofagów. Obserwowano wzrost ekspresji arginazy-1, markerów Ym1, Fizz1 i MR (Satoh et al., 2010), produkcję IL-10 (Wagener et al., 2014) oraz leukotrienu B4, który jest chemoatraktantem dla eozynofilów (Reese et al., 2007). Obserwacje 24 3. Wstęp te potwierdzono zarówno in vitro (Wagener et al., 2014), jak i w warunkach in vivo w płucach (Reese et al., 2007) oraz w jamie otrzewnej (Satoh et al., 2010). Aktywacja alternatywna makrofagów może prowadzić do gromadzenia się eozynofilów i wydzielania IL-4/IL-13 tworząc środowisko typowe dla odpowiedzi Th2 (Satoh et al., 2010). W wyniku rozkładu chityny, przez enzymy wydzielane przez pasożyty jak i żywiciela, uwalniane są jej mniejsze fragmenty; oligosacharydy oraz pojedyncze reszty N-acetyloglukozaminy, a także, w mniejszym stopniu, inne jej pochodne, jak chitozan (Rys. 3b). Jest to polimer, który powstaje przez deacetylację chityny; uznaje się, że terminem chitozan można nazywać polimer o stopniu deacetylacji powyżej 60% (Bueter et al., 2011). Różnice w strukturze chitozanu względem chityny zadecydowały o większym zainteresowaniu tym polimerem- jest on rozpuszczalny w słabych kwasach, a także łatwiej poddaje się modyfikacjom chemicznym. Dzięki temu to chitozan, a nie chityna, jest szeroko badany jako biomateriał. 3.4 Właściwości i zastosowania chitozanu Chitozan jest otrzymywany przez chemiczną (stężony NaOH) lub enzymatyczną (deacetylazy chityny) deacetylację chityny, pozyskiwanej na skalę przemysłową zwykle ze szkieletów morskich skorupiaków. Ma on formę proszku, który jest rozpuszczalny przy pH~6. Preparaty polisacharydu dostępne na rynku mogą posiadać różną masę cząsteczkową (molecular weight; Mw) oraz stopień deacetylacji (deacetylation degree; DD), które w dużym stopniu decydują o jego właściwościach, zarówno fizycznych, chemicznych, jak i biologicznych. Polimer ten ma wysoki wskaźnik pęcznienia oraz pojemność sorpcyjną i właściwości chelatujące. Może być łatwo mieszany z innymi substancjami oraz modyfikowany chemicznie i może być wytwarzany w postaci żeli, włókien, błon polimerowych czy nano- i mikrocząsteczek. Cechy te sprawiają, że znalazł on zastosowanie jako: substancja chelatująca i filtrująca przy oczyszczaniu wody, dodatek do kosmetyków i żywności, materiał wzmacniający papier lub tkaniny czy nawóz dla roślin. Jako polimer stanowi także potencjalny materiał do wytwarzania złoży chromatograficznych, nici chirurgicznych czy różnego rodzaju błon (Dutta, 2004). Jako substancja bio-kompatybilna, chitozan wykorzystywany jest także w przemyśle biomedycznym; testuje się go jako element rusztowań dla komórek i tkanek (scaffolds) oraz opatrunków (Dutta, 2004). Chitozan wykazuje bardzo ciekawe właściwości biologiczne; ze względu na obecność wolnych grup aminowych ma ładunek dodatni i może się łączyć z 25 3. Wstęp powierzchniami naładowanymi ujemnie, jakimi są np. powierzchnia nabłonka jelitowego czy oddechowego (Garg et al., 2010). Mikro- lub nano-cząsteczki chitozanu mogą także chronić transportowane substancje, dlatego polimer ten testuje się jako nośnik leków, antygenów czy transfekcyjnego DNA; szczególnie podawanych drogą pokarmową (Islam et al., 2012). Wykazano, że preparaty chitozanu osłabiają połączenia międzykomórkowe w nabłonku, zwiększając wchłanialność podawanych związków (Hsu et al., 2012). Cechy te mogą być wykorzystywane w szczepionkach śluzówkowych- przedłużona ekspozycja antygenu szczepionkowego oraz ułatwiony kontakt z komórkami M mogą przyczyniać się do większej skuteczności szczepienia (Yoo et al., 2010). Polimer ten wykazuje też bezpośrednie działanie na komórki układu odpornościowego; w różnych modelach in vitro i in vivo wykazano immunostymulacyjne właściwości chitozanu. Struktura chitozanu jest podobna do części cukrowej LPS ścian bakteryjnych; może być zatem rozpoznawany przez te same receptory (TLR4) i podobnie aktywować komórki (Otterlei et al., 1994). Sugeruje się także, że chitozan, podobnie jak chityna, może być rozpoznawany przez MR (Mori et al., 2005). Receptory te obecne są m. in. na komórkach dendrytycznych oraz makrofagach, na których chitozan indukuje ekspresję markerów związanych z prezentacją antygenu oraz produkcję cytokin, co może prowadzić też do aktywacji limfocytów (Villiers et al., 2009, Jia et al., 2014). Sugerowano, że chitozan działając poprzez komórki APC może wzbudzać zarówno odpowiedź Th1, jak i Th2, i może to zależeć od jego masy cząsteczkowej. Oligosacharydy oraz polimer o małej masie (ok. 5 kDa) in vitro i in vivo indukuje stan zapalny (Mei et al., 2013, Zhang et al., 2014), natomiast chitozan o większej masie aktywuje mechanizmy typu 2. Po podawaniu chitozanu drogą pokarmową obserwuje się wzrost produkcji IL-10 i TGF-β, a także IL-4 i IL-6 (Porporatto et al., 2005, Canali et al., 2010). Immunostymulacyjne właściwości chitozanu są wykorzystywane do wzmacniania odpowiedzi przeciwko komórkom nowotworowym czy w czasie zakażeń bakteryjnych i wirusowych (Mann et al., 2014, Azuma et al., 2015.). Natomiast indukcja odpowiedzi Th2 zależnej może być wykorzystana do wzmacniania odpowiedzi humoralnej (Zaharoff et al., 2007), leczenia ran (Barreto et al., 2014) lub łagodzenia chorób zapalnych. Chitozan podawany drogą pokarmową łagodzi objawy stanu zapalnego jelit (Xiao et al., 2014), co może mieć zastosowanie w leczeniu IBD (Inflammatory Bowel Disease; nieswoiste zapalenia jelit). Uważa się, że chitozan może wywoływać podobne reakcje immunologiczne jak chityna, m. in. aktywację alternatywną makrofagów, która jest jednym z mechanizmów odpowiedzi Th2 zależnej (Fong et al., 2015). 26 3. Wstęp Połączenie właściwości immunostymulacyjnych chitozanu, mukoadhezyjności i funkcji nośnika leków sprawia, że polimer ten spełnia kryteria adiuwantu, szczególnie dla szczepionek przeciwko chorobom wymagającym odpowiedzi typu 2 oraz dostarczanych przez nabłonki, jak np. zarażenia nicieniami jelitowymi. 27 4. Założenia i cele pracy Zwalczanie zarażeń nicieniami opiera się obecnie przede wszystkim na podawaniu leków. Jednak występujące re-inwazje, związane z dużym skażeniem środowiska pasożytami, znacznie zwiększają koszty oraz ograniczają skuteczność terapii. Część żywicieli eksponowanych na powtórne zarażenie pasożytem jest odporna, co sugeruje że szczepienia mogą ograniczyć szerzenie się parazytoz (Maizels et al., 1999). Dotychczas niewiele jest dostępnych na rynku szczepionek przeciwko helmintom; jest to zaledwie kilka preparatów chroniących zwierzęta hodowlane przed niektórymi tasiemcami i 2 gatunkami nicieni jelitowych (Bergquist & Lustigman, 2010, Harris & Gause, 2011). Choć wiele szczepionek znajduje się w fazie badań klinicznych, trudno jest uzyskać preparat o zadowalającej skuteczności (Hewitson & Maizels, 2014). Spowodowane jest to m. in. immunosupresją wywoływaną przez pasożyty, ale także koniecznością wzbudzenia silnej odpowiedzi Th2 zależnej na podawane antygeny szczepionkowe. Wywołanie takiej odpowiedzi jest możliwe po zastosowaniu odpowiedniego adiuwantu- substancji niespecyficznie wzmacniającej odpowiedź immunologiczną (Pashine et al., 2005). Obecnie, dopuszczone do użytku u ludzi są tylko 3 adiuwanty: sole glinu oraz emulsje MF59 i AS03 (Fierens & Kool, 2012). Poszukuje się nowych związków, które przy niewielkich skutkach ubocznych, umożliwią polaryzację odpowiedzi immunologicznej i skuteczne rozwinięcie odpowiednich mechanizmów obronnych przeciwko patogenom. Dobranie adiuwantu aktywującego mechanizmy Th2 zależne, wydaje się być kluczowe dla opracowania wydajnych szczepionek przeciwko helmintom, ponieważ same antygeny są zwykle mało immunogenne. Podobieństwa w odpowiedzi immunologicznej wywoływanej przez nicienie pasożytnicze oraz chitynę/chitozan (podsumowane w Tabeli 2) sugerują udział tego polimeru w indukcji i kształtowaniu reakcji przeciwpasożytniczych. Ponadto, właściwości biologiczne oraz zalety związane z jego przetwarzaniem, sprawiają że chitozan może mieć zastosowanie jako nośnik leków/antygenów lub substancja wzmacniająca odpowiedź immunologiczną nie tylko w czasie zarażeń nicieniami pasożytniczymi, ale także innymi patogenami wywołującymi odpowiedź typu 2. W badaniach wstępnych stwierdziłam, że podawanie chitozanu wpływa na funkcje makrofagów otrzewnowych wskazując na ich alternatywną aktywację (Brodaczewska & Doligalska, 2012). Zmniejszenie produkcji NO przy wzroście aktywności arginazy 1 i ekspresji receptora dla IL-4 pod wpływem chitozanu sugeruje, że polimer ten może działać 28 4. Założenia i cele pracy jako stymulator odpowiedzi typu 2, a przez to może przyczyniać się do wzmacniania odpowiedzi obronnej przeciwko helmintom. Tabela 2. Podobieństwa w odpowiedzi immunologicznej wywoływanej przez nicienie pasożytnicze oraz chitynę i chitozan. Mechanizm odpowiedzi Nicienie pasożytnicze Chityna Chitozan AAMf ++ + + Eozynofilia + ++ + Produkcja IL-4/IL-13 +++ ++ + Produkcja IL-10 + + + Odpowiedź humoralna ++ + ++ W oparciu o wyniki własnych badań wstępnych oraz dane literaturowe, sformułowałam hipotezę niniejszej rozprawy zakładającą, że: chitozan zmieniając aktywność komórek odpowiedzi immunologicznej wpływa na poziom odpowiedzi przeciwpasożytniczej w czasie zarażenia myszy nicieniami Heligmosomoides polygyrus i Trichinella spiralis. Właściwości biologiczne chitozanu sugerują, że może on wzbudzać mechanizmy immunologiczne przydatne do wzmocnienia odpowiedzi przeciwpasożytniczej. Potwierdzenie działania tego polimeru jako adiuwantu odpowiedzi Th2 zależnej w czasie inwazji nicieniami jelitowymi, może stanowić podstawę do badań nad szczepionkami lub nośnikami związków przeciwpasożytniczych z wykorzystaniem chitozanu. Dlatego w swoich badaniach podjęłam próbę określenia, jak chitozan wpływa na odpowiedź immunologiczną na różnych jej poziomach. 29 4. Założenia i cele pracy Przeprowadzone badania, prezentowane w niniejszej pracy miały na celu: 1. Charakterystykę wpływu chitozanu na układ odpornościowy u myszy. 2. Określenie wpływu polimeru na odpowiedź przeciwpasożytniczą w czasie zarażenia H. polygyrus i T. spiralis na poziomie mechanizmów wrodzonych oraz nabytych. Przeprowadzone doświadczenia są próbą określenia udziału polimeru N-acetyloglukozaminy i glukozaminy w indukcji odpowiedzi przeciwko nicieniom oraz przydatności tego biomateriału w zwalczaniu/kontrolowaniu inwazji. 30 5. Materiały i metody 5.1 Myszy, pasożyty i linie komórkowe Doświadczenia prowadzono na samcach myszy szczepu C57Bl6, które są wrażliwe na zarażenie nicieniami, a inwazja jest chroniczna. Zwierzęta w wieku 6 tygodni lub starsze pochodziły ze Zwierzętarni Instytutu Medycyny Eksperymentalnej i Klinicznej Polskiej Akademii Nauk w Warszawie lub Centrum Medycyny Doświadczalnej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku. Myszy utrzymywano w Zwierzętarni Wydziału Biologii UW w warunkach standardowych przy fotoperiodzie 12/12 godzin, ze swobodnym dostępem do wody i karmy. Po aklimatyzacji trwającej 1 tydzień, rozpoczynano doświadczenia. Myszy usypiano mieszaniną powietrza i 70% dwutlenku węgla (CO2). Doświadczenia wykonywano zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Lokalną Komisję Etyczną ds. Doświadczeń na Zwierzętach nr 1 w Warszawie (uchwała nr 216/2011). Doświadczenia przeprowadzano na myszach zarażonych nicieniami pasożytniczymi: Heligmosomoides polygyrus lub Trichinella spiralis. Oba gatunki pasożytów utrzymywane są w Zakładzie Parazytologii w ciągłym pasażu na samicach myszy szczepów, odpowiednio C57Bl6 i BALB/c. Myszy zarażano za pomocą sondy doprzełykowej podając 200 larw stadium L3 H. polygyrus lub 400 larw mięśniowych (L1) T. spiralis w 250 μl wody. Linię komórkową JAWS II (ATCC, nr kat. CRL-1190) otrzymano od Zakładu Immunologii Wydziału Biologii. Są to unieśmiertelnione niedojrzałe komórki dendrytyczne uzyskane ze szpiku kostnego myszy C56Bl/6 z knockout białka p53. Podziały tych komórek zachodzą w obecności czynnika wzrostu GM-CSF (MacKay & Moore, 1997). Komórki te są wykorzystywane m. in. w badaniach nad nowotworami (Xu et al., 2007) czy szczepionkami (Otsu et al., 2006). 5.2 Odczynniki Wykorzystano 3 rodzaje chitozanu: oligosacharydy (COS- Chitosan OligoSaccharides; 2-6 reszt N-acetyloglukozaminy, Amicogen, nr kat. ChitoOligo-100) oraz polimer o małej (Low Molecular Weight; LMW; Mw= 50-190 kDa, DD >75%, Sigma, nr kat. 448869) i dużej (High 31 5. Materiały i metody Molecular Weight; HMW; Mw= 190-375 kDa, DD >75%, Sigma, nr kat. 419419) masie cząsteczkowej. Przygotowywano roztwory wyjściowe polimerów o stężeniu 1% w 0,75% kwasie adypinowym (StanLab) lub w wodzie dejonizowanej (dla COS), które autoklawowano i przechowywano w lodówce (przez maksymalnie 2 miesiące) do czasu wykorzystania w doświadczeniach. Zawartość endotoksyn w roztworach wyjściowych wynosiła <0,2 EU/ml w teście LAL (Thermo). Tabela 3. Lista i skład stosowanych buforów Skład PBS Pełna nazwa; wykorzystanie Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Roztwór NaCl Sól fizjologiczna NaCl (POCh) 0,9% w wodzie destylowanej RPMI Pożywka do izolacji RPMI-1640, L-glutamina 2 komórek płynu penicylina/streptawidyna 100 otrzewnowego Wszystkie odczynniki Invitrogen RPMI pełna Pożywka do hodowli RPMI-1640, L-glutamina 2 mM, penicylina/streptawidyna 100 U/ml, inaktywowana komórek płodowa surowica bydlęca (FCS; Invitrogen) 10% Nazwa skrócona NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM, pH=7,2 w wodzie dejonizowanej Wszystkie odczynniki POCh mM, U/ml RPMI JAWS Pożywka do hodowli RPMI-1640, L-glutamina 2 mM, penicylina/streptawidyna 100 U/ml, nieII komórek JAWS II inaktywowana płodowa surowica bydlęca (FCS) 20%, pirogronian sodu (Invitrogen) 1 mM, GM-CSF (Peprotech) 5 ng/ml RPMI nicieni do Pożywka do hodowli RPMI-1640 Glutamax, penicylina/streptawidyna 100 nicieni U/ml. Wszystkie odczynniki Invitrogen Roztwór trawiący Roztwór do Pepsyna bydlęca (Sigma) 0,5%, HCl (Chempur) 1% trawienia mięśni w wodzie destylowanej PBS/BSA Bufor do oznaczeń NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM, pH=7,2, albumina bydlęca (BSA; cytometrycznych Sigma) 0,1% w wodzie dejonizowanej PBS Tween Bufor do płukania NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM, pH=7,2, Tween 20 (Serva) 0,05% membrany w wodzie dejonizowanej Odczynnik Griessa Pomiar tlenku azotu Sulfamilamid 1%, naftylendiamina 0,1%, kwas ortofosforowy 2% w wodzie destylowanej Wszystkie odczynniki Chempur Żel 5% Żel zagęszczający Tris-HCl (Serva) 0,125 M, akrylamid/ bis-akrylamid (37:1,Sigma) 5%, SDS (dodecylosiarczan sodu, Sigma) 0,0125%, APC (nadsiarczan amonu, Serva) 0,006%, TEMED (tetrametyloetylenodiamina, Serva) 0,2% w wodzie dejonizowanej 32 5. Materiały i metody Żel 12% Żel rozdzielający Tris-HCl (Serva) 0,375 M, akrylamid/ bis-akrylamid (37:1,Sigma) 12%, SDS (dodecylosiarczan sodu, Sigma) 0,0125%, APC (nadsiarczan amonu, Serva) 0,006%, TEMED (tetrametyloetylenodiamina, Serva) 0,2% w wodzie dejonizowanej Bufor do Rozdział elektroforetyczny elektoforezy białek Glicyna (Serva) 200 mM, Tris (Serva) 25 mM, SDS (dodecylosiarczan sodu, Sigma) 10% w wodzie dejonizowanej Bufor transferu do Transfer białek na Glicyna (Serva) 40 mM, Tris (Serva) 50 mM, membranę Metanol (Chempur) 20% w wodzie dejonizowanej nitrocelulozową TBS Sól fizjologiczna Tris (Serva) 20 mM, NaCl (POCh) 0,9%, pH=7,4, w buforowana Tris wodzie dejonizowanej TBS Tween Bufor do płukania Tris (Serva) 20 mM, NaCl (POCh) 0,9%, pH=7,4, membrany Tween 20 (Serva) 0,01% w wodzie dejonizowanej Bufor Laemmli Bufor do przygotowania prób do rozdziału elektroforetycznego DAB/H2O2 Substrat peroksydazy Western blot Tris-HCl (Serva) 0,125 M, glicerol (Chempur) 25%, SDS (dodecylosiarczan sodu, Sigma) 5%, βmerkaptaetanol (Serva) 15%, błękit bromofenolowy (POCh) 0,01% w wodzie dejonizowanej dla DAB (3,3-diaminobenzydyna, Sigma) 2,5%, H2O2 w (Chempur) 0,01% w wodzie dejonizowanej 5.3 Schemat doświadczeń in vivo Chitozan HMW, 500 μg w 0,35% kwasie adypinowym, podawano myszom w objętości 200 μl codziennie dootrzewnowo przez 10 dni. Następnie, w różnych dniach doświadczenia (wg Rys. 4) wykonywano sekcje w celu określenia wzbudzonych po podaniu chitozanu reakcji układu odpornościowego. Myszy, którym podawano sam kwas adypinowy (200 μl, 0,35%) oraz myszy, którym nie wstrzykiwano roztworów do jamy otrzewnej stanowiły 2 grupy kontrolne, oznaczane odpowiednio: AdOH i K. Sekcja 1 Cht1 0 10 Sekcja 2 Cht2 25 Sekcja 3 Cht3 35 dni Podawanie chitozanu Rys. 4. Schemat doświadczeń, w których określano przebieg odpowiedzi immunologicznej po podaniu chitozanu. 33 5. Materiały i metody W celu określenia wpływu chitozanu na odpowiedź przeciwpasożytniczą, w 5 dniu podawania polimeru zwierzęta zarażano Heligmosomoides polygyrus (wg Rys. 5a) lub Trichinella spiralis (wg Rys. 5b) i w zależności od gatunku nicienia wykonywano sekcje w różnych dniach po zarażeniu (dpz). a Zarażenie Sekcja 1 Sekcja 2 L4 0 5 11 dorosłe 27 dni Podawanie chitozanu b 0 Zarażenie 5 Sekcja 1 dorosłe 10 Sekcja 2 L1 35 dni Podawanie chitozanu Rys. 5. Schemat doświadczeń, w których określano wpływ chitozanu na przebieg zarażenia myszy a) Heligmosomoides polygyrus lub b) Trichinella spiralis. Na niebiesko oznaczono stadia rozwojowe nicieni obecne w żywicielu w badanym dniu zarażenia. 5.4 Analiza NMR Analizę chitozanu metodą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (Nuclear Magnetic Resonance; NMR) wykonywano we współpracy z dr Katarzyną Lewandowską z Katedry Chemii Biomateriałów i Kosmetyków Wydziału Chemii Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu. Wylewano krople roztworu na płytkę z CaBr2 i suszono układ wytwarzając cienkie filmy. Następnie wykonywano pomiar widm w podczerwieni w zakresie od 4000- 600 cm-1 w spektrofotometrze FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy) Genesis II (Mattson, USA) wyposażonym w układ ATR (Attenuated Total Reflectance; wielokrotne odbicie osłabione; MIRacleTM PIKE Technologies). 5.5 Ocena pobudzenia immunologicznego W czasie trwania doświadczenia oceniano kondycję myszy na podstawie ich zachowania i wyglądu. Co 2 lub 3 dzień myszy z wszystkich grup doświadczalnych ważono, a następnie 34 5. Materiały i metody dla każdego zwierzęcia określano % zmiany masy ciała względem dnia 0 doświadczenia. W dniach sekcji izolowano: serce, lewą nerkę, śledzionę, płuca oraz wątrobę i ważono narządy. Następnie określano ich relatywną masę względem serca, według wzoru: Mrel= Mnarządu . Mserca Co 2 lub 3 dzień wykonywano rozmaz z kropli krwi pobranej z ogona każdej myszy. Następnie wysuszone rozmazy utrwalano w 90% metanolu przez 5 min i barwiono metodą DiffQuik (Merck)- komercyjnym zestawem do zmodyfikowanego barwienia Giemsa. Rozmazy zanurzano 5-krotnie w kominkach zawierających barwniki I i II, a następnie szkiełka płukano w bieżącej wodzie. Preparaty obserwowano w mikroskopie świetlnym przy powiększeniu x100. Dla każdego preparatu liczono min. 200 komórek, a następnie obliczano odsetek różnych populacji. 5.6 Izolacja komórek Żywotność oraz gęstość komórek w zawiesinach określano w barwieniu błękitem trypanu w automatycznym liczniku komórek Countess (Invitrogen). Do doświadczeń wykorzystywano próby, w których żywotność komórek wynosiła >90%. Krew obwodową pobierano z serca igłą do strzykawki przepłukanej roztworem heparyny (50 U/ml). Następnie próby wirowano przy 250 g w 4°C przez 10 min. Oddzielone osocze zbierano i przechowywano w -20°C, a osad komórek inkubowano przez 10 min w temperaturze pokojowej w 5 ml buforu lizującego, aby usunąć erytrocyty. Otrzymane leukocyty płukano trzykrotnie w zimnym PBS/BSA i wykorzystywano do oznaczeń cytometrycznych. Komórki otrzewnowe otrzymywano po płukaniu jamy otrzewnej; wstrzykiwano dootrzewnowo 5 ml pożywki RPMI o temperaturze 37°C, a następnie masowano brzuch myszy przez 1 min. Płyn otrzewnowy (o objętości ok. 4 ml) pobierano szklaną pipetą, oddzielnie od każdej myszy, do probówek trzymanych na lodzie. Próby wirowano 200 g przez 7 min w 4°C, otrzymany supernatant zbierano i przechowywano w -20°C, a osad komórek płukano trzykrotnie w PBS/BSA (do oznaczeń cytometrycznych) lub sterylnej pożywce RPMI (do hodowli in vitro). Dodatkowo z zawiesiny komórek wykonywano rozmaz, który barwiono metodą DiffQuik. 35 5. Materiały i metody Krezkowe węzły limfatyczne (Mesenteric Lymph Nodes; MLN) izolowano oddzielnie od każdej myszy i umieszczano w PBS w temperaturze 4°C. Następnie narządy przecierano przez sterylne sitko (100 μm, BD Sciences) w pełnej pożywce RPMI. Otrzymane zawiesiny komórek wirowano 220 g przez 7 min w 4°C i płukano trzykrotnie w PBS/BSA (do oznaczeń cytometrycznych) lub sterylnej pełnej pożywce RPMI (do hodowli in vitro). 5.7 Izolacja nicieni 5.7.1 Heligmosomoides polygyrus Liczbę jaj w kale określano metodą flotacji; próbki kału pobierano oddzielnie od każdej myszy, ważono i umieszczano w szklanej probówce zawierającej 1 ml wody destylowanej. Kał rozcierano bagietką, a następnie zalewano nasyconym roztworem NaCl do menisku wypukłego. Na probówkę nakładano szkiełko nakrywkowe na 30 min, a następnie liczono jaja przyklejone do szkiełka. Liczbę jaj przeliczano na 1 g kału (Eggs per Gram; EPG). Larwy inwazyjne L3 otrzymywano z koprokultur; kał myszy C56Bl6 zbierano między 4-12 tygodniem po zarażeniu i mieszano z wodą. Otrzymaną zawiesinę nakładano na wilgotną bibułę w szalce Petriego i inkubowano w 21°C. Po 7 dniach hodowli brzeg bibuły opłukiwano, a zebrane larwy L3 przemywano wielokrotnie wodą i przechowywano w 4°C do czasu zarażenia. W 6 dpz izolowano jelito cienkie myszy, które umieszczano w szalce Petriego, końce jelita wiązano nitką, aby uniemożliwić wydostawanie się treści. Szalkę z jelitem zalewano pożywką RPMI do nicieni i inkubowano w 37°C przez minimum 3 h; w tym czasie larwy stadium L4 opuszczały ścianę jelita i wydostawały się do pożywki. Larwy zbierano, liczono i mrożono w PBS w -20°C. W celu wyizolowania form dorosłych nicienia metodą Baermanna od myszy w 22 dpz pobierano jelito cienkie. Rozcinano je wzdłuż, a następnie odcinano 1 cm fragmenty, które umieszczano na sitku w krystalizatorze i zalewano roztworem NaCl. Po 2 h inkubacji w 37°C nicienie, które opadały na dno krystalizatora zbierano, liczono i mrożono w PBS w -20°C lub 36 5. Materiały i metody hodowano in vitro w pożywce RPMI do nicieni, 20 samic/ dołek. Po 48 h liczono jaja i przeliczano ich ilość na 1 samicę. 5.7.2 Trichinella spiralis W celu wyizolowania form dorosłych nicienia metodą Baermanna od myszy w 5 dpz izolowano jelito cienkie. Rozcinano je wzdłuż, a następnie odcinano 1 cm fragmenty, które umieszczano na sitku w krystalizatorze i zalewano roztworem NaCl. Po 4 h inkubacji w 37°C nicienie, które opadały na dno krystalizatora zbierano, liczono i mrożono w PBS w -20°C. Część samic (po 10 od każdej myszy) umieszczano oddzielnie w dołkach płytki. Po trzykrotnym wypłukaniu nicieni sterylną pożywką RPMI do nicieni, zalewano je 200 μl pożywki i hodowano 48 h w 37°C, 5% CO2. Następnie dołki obserwowano w mikroskopie odwróconym i liczono nowonarodzone larwy L1 (New-borne Larvae; NBL). Larwy mięśniowe L1 izolowano od myszy w 30 dpz; po usunięciu narządów i skóry, mięśnie rozdrabniano za pomocą blendera i próby inkubowano mieszając w roztworze trawiącym przez 30 min w 37°C. Próby dekantowano wielokrotnie roztworem NaCl. Larwy L1 liczono w binokularze, określając całkowitą liczbę nicieni na 1 mysz. 5.7.3 Otrzymywanie roztworów antygenów nicieni Frakcję rozpuszczalnych w wodzie białek nicieni otrzymywano poprzez sonikację; zawiesiny nicieni rozmrażano i rozdrabniano ultradźwiękami, na lodzie w urządzeniu VibraCell przez 6 min w trybie 20 s ON: 20 s OFF. Próby wirowano 1000 g przez 15 min w 4°C i poziom białka mierzono w supernatancie we fluorymetrze Qubit (Invitrogen). Następnie próby porcjowano, przechowywano w -80°C i używano do dalszych doświadczeń. Antygeny przeznaczone do hodowli in vitro sterylizowano przepuszczając przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,22 μm (Millipore). 5.8 Analiza cytometryczna Badania wykonywano na cytometrze przepływowym FACSCalibur (BD Sciences) znajdującym się na wyposażeniu Zakładu Immunologii Wydziału Biologii UW. Cytometr 37 5. Materiały i metody wyposażony jest w lasery 488 nm i 635 nm, umożliwiające wykonywanie oznaczeń 4-kolorowych. Przygotowywano mieszaniny przeciwciał sprzężonych z fluorochromami (Tabela 4), zgodnie z zaleceniami producentów, umożliwiające znakowania 4-kolorowe: FITC/PE/PercP/APC obserwowane odpowiednio w kanałach FL-1/FL-2/FL-3/FL-4 cytometru. Dla każdego rodzaju komórek, pochodzących z różnych tkanek, wykonywano barwienia pojedyncze umożliwiające wykonanie ustawień cytometru. Pół miliona komórek zawieszano w 50 μl PBS/BSA i dodawano 50 μl odpowiedniej mieszaniny przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie. Próby inkubowano 30 min w 4°C w ciemności, odpłukiwano niezwiązane przeciwciała dodając 500 μl PBS i wirując próby 200 g przez 7 min w 4°C. Komórki utrwalano w 500 μl 1% formaliny przez minimum 24 h w 4°C w ciemności. Analizę cytometryczną wykonywano w przeciągu tygodnia; próby wirowano i zawieszano w 250 μl PBS i oznaczano w cytometrze. W przypadku komórek jamy otrzewnej blokowano receptor dla fragmentu Fc przeciwciał, aby zahamować wiązania niespecyficzne; przed znakowaniem inkubowano komórki przez 15 min z 0,15 μg przeciwciał antyCD16/CD32 (eBioscience). Tabela 4. Markery wykrywane przez przeciwciała w oznaczeniach cytometrycznych. Marker CD11b MR Dectin1 CD14 CD4 CD19 F4/80 MHC II CD80 CD40 CD86 Gr-1 Identyfikowana populacja komórek/ funkcja Komórki mieloidalne; monocyty, eozynofile, neutrofile CD206, receptor mannozowy Lektyna, PRR Ko-receptor dla LPS Limfocyty Th Limfocyty B Makrofagi Prezentacja antygenu; makrofagi, komórki dendrytyczne, limfocyty B Prezentacja antygenu; makrofagi, komórki dendrytyczne, limfocyty B Prezentacja antygenu; makrofagi, komórki dendrytyczne, limfocyty B Prezentacja antygenu; makrofagi, komórki dendrytyczne, limfocyty B Monocyty i neutrofile Fluorochrom Producent PercP lub APC eBioscience FITC PercP APC PercP FITC, PE lub PercP PE FITC BioLegend eBioscience eBioscience BD Pharmigen eBioscience eBioscience eBioscience PE eBioscience PercP eBioscience APC eBioscience APC eBioscience 38 5. Materiały i metody IL-4R IgM IgD CD23 Receptor dla IL-4; AAMf Limfocyty B Limfocyty B Receptor o słabym powinowactwie dla IgE; monocyty i limfocyty B PE APC FITC PE BD Pharmigen eBioscience eBioscience AbSerotec Analizę wykonywano w cytometrze za pomocą oprogramowania CELLQuest (BD Sciences). Przy użyciu znakowań pojedynczych dla każdego rodzaju zawiesiny komórek określano wartości napięć na detektorach oraz procent kompensacji. Dla każdej próby wciągano min. 30 tysięcy komórek, które następnie analizowano w programie FCS Express 4Flow (DeNovo Software). Komórki identyfikowano na podstawie morfologii na wykresie SSC/FSC (Side Scatter Chanel/Forward Scatter Chanel) obrazującym odpowiednio ziarnistość/wielkość komórek (Rys. 6a). Analiza taka umożliwia wstępne rozróżnienie eozynofilów (E), monocytów/makrofagów (M), limfocytów (L) i neutrofilów (N). Rys. 6b przedstawia przykładowe wyniki otrzymywane dla komórek płynu otrzewnowego. Następnie, komórki z bramki G1 (Rys. 6a) analizowano pod względem fluorescencji, na wykresach typu „dot plot” (Rys. 6d) umożliwiających określenie odsetka komórek pozytywnych lub negatywnych dla danego fluorochromu, lub histogramach (Rys. 6c) umożliwiających dodatkowo określenie intensywności fluorescencji (Mean Fluorescence Intensity; MFI). W danym doświadczeniu, dla jednego rodzaju narządu, dla wszystkich powtórzeń używano takich samych ustawień bramek. 1024 c SSC-H 768 29 Count a G1 512 22 5.07 15 52.14% 372.06 33.22% 7 0 256 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 F4/80 0 0 256 512 768 1024 FSC-H 39 5. Materiały i metody b 1024 d 4 10 5.05% 43.99% 32.63% 18.33% 768 F4/80 SSC-H 3 10 E 512 M N 256 2 10 1 10 L 0 0 256 512 0 768 FSC-H 1024 10 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 CD11b Rys. 6. Przykładowe wykresy z analizy cytometrycznej komórek płynu otrzewnowego: a) zasięg bramki G1, b) wstępne rozróżnienie subpopulacji leukocytów na podstawie morfologii, c) histogram z określonymi odsetkiem (czarna czcionka) oraz średnią intensywnością fluorescencji (czerwona czcionka) danej populacji i d) wykres typu „dot plot” przedstawiający odsetki populacji o różnej intensywności fluorescencji dla 2 markerów/fluorochromów. Poziom apoptozy oznaczano przy użyciu zestawu Annexin V Apoptosis Kit (BD Pharmigen). Ćwierć miliona komórek zawieszano w 50 μl 1X Binding Buffer, do których dodawano po 1 μl Annexin V-FITC i 7-AAD (7-Aminoactinomycin D). Próby inkubowano przez 15 min w ciemności w temperaturze pokojowej, a następnie barwienie zatrzymywano dodając 300 μl 1X Binding Buffer. Próby analizowano w cytometrze w przeciągu godziny. Wykonywano także znakowania pojedyncze. Proliferację komórek metodą cytometryczną mierzono z użyciem barwnika fluorecencyjnego CFSE (ester karboksyfluoresceiny), który umożliwia śledzenie podziałów komórkowych. Dziesięć milionów komórek MLN otrzymanych jak w pkt 5.6 zawieszano w 2 ml pełnej pożywki RPMI i dodawano barwnika CFSE rozpuszczonego w DMSO do końcowego stężenia 1 μM. Próby inkubowano przez 20 min w 37°C w ciemności. Następnie barwienie zatrzymywano dodając 10 ml pełnej pożywki RPMI w temperaturze 4°C i komórki trzykrotnie płukano, w celu usunięcia niezwiązanego barwnika. Wybarwione komórki hodowano wg pkt 5.9, a po zakończonej hodowli zebrane komórki analizowano w cytometrze przepływowym, po uprzednim wyznakowaniu ich mieszaniną przeciwciał anty-CD4 wg pkt 5.8. Rys. 7 przedstawia zasadę działania testu CFSE oraz przykładowy histogram 40 5. Materiały i metody otrzymywany w analizie cytometrycznej. Populacje komórek po kolejnych podziałach (kolejne generacje; Gen 1-5) określano na podstawie dwukrotnego spadku intensywności fluorescencji CSFE w stosunku do poziomu fluorescencji poprzedniej populacji. Zakres populacji komórek matczynych (Gen 0) określano na podstawie intensywności fluorescencji CSFE komórek w 0 dniu hodowli (zielone pole na wykresie Rys. 7b). Indeks proliferacji (Proliferation Index; PI) liczono według wzoru: k potomne k matczyne , (Lk- liczba komórek), gdzie: Lk matczyne=Lk Gen0+ Lk Gen1 2 + Lk Gen2 4 + Lk Gen3 Lk Gen4 8 Lk Gen5 32 , a Lk potomne=Lk analizowane-Lk Gen0. dzielące się komórki a Komórka matczyna Komórki potomne b 100 Count 75 50 25 54 3 21 0 10 0 10 1 10 0 2 Gen 10 3 10 Liczba komórek CFSE Intensywność fluorescencji Intensywność fluorescencji Liczba podziałów Rys. 7 Zasada działania testu proliferacji z użyciem barwnika CFSE: a) schemat rozdziału barwnika między komórki potomne i związany z nim spadek intensywności fluorescencji oraz b) przykładowy histogram przedstawiający analizę cytometryczną komórek po 4 dniach hodowli z oznaczonym podziałem na generacje komórek (na zielono oznaczono komórki z 0 dnia hodowli). 41 4 5. Materiały i metody 5.9 Hodowle komórkowe Komórki linii JAWS II pasażowano co 7 dni; zakładano hodowle 100 tysięcy komórek w butelkach T25 w 5 ml pożywki RPMI JAWS II. Komórki odklejano od powierzchni hodowlanej za pomocą skrobaka; wirowano je, zawieszano w świeżej pożywce i przenoszono do nowej butelki. Do doświadczeń, komórki hodowano na płytkach 24- lub 96- dołkowych; nakładano odpowiednio 100 tysięcy komórek w 0,5 ml lub 10 tysięcy komórek w 80 μl na dołek i hodowano 24 h w pożywce RPMI JAWS II. Następnie dodawano odpowiednio 0,5 ml lub 20 μl czynnika stymulującego: LPS (końcowe stężenie 0,5 μg/ml) lub chitozanu i hodowano komórki przez kolejne 48 h. Po zakończonej hodowli zbierano i zamrażano płyn hodowlany (w celu oznaczenia poziomu cytokin), a komórki zeskrobywano, zawieszano w PBS/BSA i wykorzystywano do oznaczeń cytometrycznych. Hodowle prowadzone na płytkach 96-dołkowych wykorzystywano w teście MTS (pkt 5.10). Makrofagi otrzymywano z komórek szpiku kostnego myszy C57Bl6 (Bone Marrow Derived Macrophages; BMDMf). Od myszy kontrolnej (niezarażonej) izolowano kość udową, przepłukiwano jej kanał PBS za pomocą igły i strzykawki, a otrzymaną zawiesinę wirowano 200 g przez 7 min w 4°C. Komórki płukano 3-krotnie sterylną pełną pożywką RPMI w temperaturze 4°C, a następnie zakładano hodowle; na szalki Petriego o średnicy 60 mm nakładano 5 ml zawiesiny komórek o gęstości 5x104/ml i dodawano czynnik wzrostu M-CSF do końcowego stężenia 10 ng/ml. Hodowlę prowadzono przez 6-7 dni bez zmiany pożywki; po tym czasie 95% komórek adherujących stanowią makrofagi (identyfikowane na cytometrze jako F4/80+). Tak otrzymane makrofagi zeskrobywano z powierzchni szalki i nakładano na płytki do hodowli w pożywce RPMI pełnej (bez dodatku M-CSF); 200 tysięcy/500 μl na płytkę 24-dołkową lub 20 tysięcy/80 μl na płytkę 96-dołkową. Po 24 h hodowli do dołków dodawano 0,5 ml lub 20 μl czynnika stymulującego: LPS (końcowe stężenie 0,5 μg/ml) lub chitozanu i hodowano komórki przez kolejne 48 h. Po zakończonej hodowli zbierano i zamrażano płyn hodowlany (w celu oznaczenia poziomu cytokin), a komórki zeskrobywano, zawieszano w PBS/BSA i wykorzystywano do oznaczeń cytometrycznych. Hodowle prowadzone na płytkach 96-dołkowych wykorzystywano w teście MTS (pkt 5.10). Komórki płynu otrzewnowego otrzymane wg pkt 5.6 doprowadzano w pożywce RPMI do gęstości 2,5x106 komórek/ml i nakładano 200 μl zawiesiny na dołki płytki 96-dołkowej. 42 5. Materiały i metody Komórki inkubowano przez 2 h w 37°C; po tym czasie odpłukiwano pożywką RPMI w temperaturze w 37°C komórki nieprzylegające, a do przylegających makrofagów dodawano 200 μl pożywki RPMI zawierającej czynniki stymulujące: bakteryjny LPS, o końcowym stężeniu 0,5 μg/ml, HMW chitozan, 5 μg/ml lub antygen nicieni, 5 μg/ml. Hodowle prowadzono przez 48 h, a następnie płytki wirowano; zbierano płyn hodowlany, a w komórkach mierzono aktywność arginazy (pkt 5.10). Dołki 96-dołkowej płytki hodowlanej opłaszczano czynnikami stymulującymi: przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28 (0,5 μg/ml), chitozanem HMW (5 μg/ml) lub antygenem nicieni (5 μg/ml) w 50 μl sterylnego PBS, przez noc w 4°C. Komórki MLN otrzymane wg pkt 5.6 wybarwione CFSE wg pkt 5.8 zawieszano w pełnej pożywce RPMI i nakładano na dołki płytki hodowlanej w objętości 200 μl, 0,5 x106 komórek na dołek. Hodowle prowadzono przez 96 h w 37°C, 5% CO2. Po zakończonej hodowli płytki wirowano i komórki zawieszano w buforze PBS/BSA i wykorzystywano do oznaczeń cytometrycznych. 5.10 Testy kolorymetryczne Poziom katabolizmu L-argininy określano mierząc aktywność enzymów, dla których aminokwas ten jest substratem: syntazy tlenku azotu (iNOS; EC 1.14.13.39) oraz arginazy 1 (EC 3.5.3.1). Mierzono poziom specyficznych produktów reakcji enzymatycznych, odpowiednio tlenku azotu (NO) i mocznika. Tlenek azotu mierzono metodą kolorymetryczną w reakcji Griessa oznaczającej stężenie jonów azotanowych (NO2-), które są stabilną pochodną NO. W kwaśnym środowisku NO2reagują z kwasem sulfanilowym, tworząc kwas diazobenzenosulfonowy, który następnie sprzęgany z α-naftyloaminą daje purpurowy barwnik azowy absorbujący światło o λ= 540 nm. Reakcja ta jest specyficzna dla jonów azotanowych. Czterdzieści μl badanej próby, płynu hodowlanego, mieszano z odczynnikiem Griessa w proporcji 1:1 w dołku płytki 96-dołkowej i inkubowano w temperaturze pokojowej, w ciemności przez 10 min. Następnie mierzono gęstość optyczną produktu reakcji w czytniku spektrofotometrycznym (μQuant, BIO-TEK Instruments INC) przy λ= 540 nm. Ilość NO2-, a pośrednio NO, świadczy o aktywności iNOS w komórkach. 43 5. Materiały i metody Poziom mocznika mierzono metodą kolorymetryczną w komórkach z hodowli in vitro; osad komórek lizowano za pomocą 0,1% Triton X w PBS przez 30 min w 4°C. Następnie do lizatu dodawano MnCl2 w końcowym stężeniu 7,5 mM i aktywowano enzym przez 15 min w 56°C. Następnie przeprowadzano reakcję enzymatyczną przez 1 h w 37°C po dodaniu substratuL-argininy o stężeniu 250 mM. Reakcję zatrzymywano dodając mieszaniny kwasów: H2SO4, H3PO4 i H2O (1:3:1), a ilość produktu reakcji, mocznika, oznaczano inkubując próby w 96°C przez 1 h w obecności α-izonitrozopropiofenonu rozpuszczonego w 99% etanolu w końcowym stężeniu 1%. Po wystudzeniu, 100 μl mieszaniny przenoszono na 96-dołkową płytkę titracyjną i mierzono gęstość optyczną barwnego produktu reakcji w czytniku spektrofotometrycznym (μQuant, BIO-TEK Instruments INC) przy λ= 550 nm. Ilość mocznika świadczy o poziomie aktywności arginazy-1 obecnej w lizacie komórek. Proliferację komórek określano testem MTS (redukcja soli tetrazolowej do formazanu), który mierzy ilość żywych komórek w hodowli. Komórki hodowano na płytkach 96-dołkowych jak w pkt 5.9 w całkowitej objętości 100 μl (10 lub 20 tys. komórek/dołek) przez 48 h. Cztery godziny przed końcem hodowli dodawano 20 μl odczynnika CellTiter (Promega) zawierającego rozpuszczalną sól MTS, która w żywych komórkach jest przekształcana przez oksydoreduktazy do brązowego produktu. Po zakończeniu hodowli mierzono gęstość optyczną mieszaniny w czytniku spektrofotometrycznym (μQuant, BIO-TEK Instruments INC) przy λ=490 nm. Poziom cytokin mierzono w teście immunoenzymatycznym ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) przy wykorzystaniu komercyjnych testów wykrywających mysie IL-1β, IL-4, IL-10, IL-12p70, MCP-1, TGF-β (eBioscience) i IL-5, IL-6 (BD Sciences) oraz MPO (MyeloPeroxidase; R&D) zgodnie z procedurą zalecaną przez producentów. Płytki 96-dołkowe Maxisorp opłaszczano przeciwciałami Capture w 50 μl Coating Buffer w czasie całonocnej inkubacji w 4°C. Następnie odpłukiwano niezwiązane przeciwciała 250 μl PBS Tween i blokowano dołki 150 μl 1X Assay Diluent (bufor zawierający 10% FCS) przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po odpłukaniu płytki, nakładano badane próby: surowicę (rozcieńczoną 5X w Assay Diluent), płyn otrzewnowy lub płyn hodowlany w objętości 50 μl. W przypadku pomiaru TGF-β, do prób dodawano najpierw 10 μl 0,5 M HCl w celu otrzymania aktywnej formy cytokiny, a po 10 min inkubacji reakcję zatrzymywano 10 μl 0,5 M NaOH. Badane próby inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Po 44 5. Materiały i metody 3-krotnym płukaniu dołków nakładano 50 μl biotynowanych przeciwciał Detection i inkubowano przez 1 h. Po 3-krotnym płukaniu płytki, nakładano na 30 min 50 μl kompleksu streptawidyna-HRP (HorseRadish Peroxidase; peroksydaza chrzanowa). Następnie dołki płukano 5-krotnie PBS Tween i nakładano 100 μl substratu dla peroksydazy, TMB i inkubowano przez 20 min. Po zatrzymaniu reakcji 50 μl 2 N H2SO4, dokonywano pomiaru gęstości optycznej w czytniku spektrofotometrycznym (μQuant, BIO-TEK Instruments INC) przy λ=450 nm. Stężenie obliczano na podstawie krzywej wzorcowej wykonanej dla standardów każdej z cytokin. Poziom i specyficzność przeciwciał mierzono metodą ELISA; płytki 96-dołkowe Polysorp opłaszczano różnymi roztworami antygenów nicieni lub chitozanem w stężeniu 5 μg/ml w 50 μl Coating Buffer (z zestawów ELISA eBioscience) w czasie całonocnej inkubacji w 4°C. Następnie odpłukiwano niezwiązane białka 250 μl PBS Tween i blokowano dołki 150 μl 5% odtłuszczonego mleka przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po płukaniu płytki, nakładano badane próby: surowicę (rozcieńczoną 5X lub 200X w 1% odtłuszczonym mleku) lub płyn otrzewnowy w objętości 50 μl. Badane próby inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Po 3-krotnym płukaniu, do dołków nakładano na 1 h 50 μl przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z HRP rozpoznających mysie IgA, IgE lub IgG1 (1: 5 000; Novus Biologicals lub Sigma). Następnie dołki płukano 5-krotnie i nakładano 100 μl substratu dla peroksydazy, TMB, i inkubowano przez 20 min. Po zatrzymaniu reakcji 50 μl 2 N H2SO4, dokonywano pomiaru gęstości optycznej w czytniku spektrofotometrycznym (μQuant, BIO-TEK Instruments INC) przy λ=450 nm. Kontrole stanowiły dołki nieopłaszczone żadnym antygenem, ale blokowane 5% odtłuszczonym mlekiem, dzięki którym odejmowano tło (wiązanie niespecyficzne) dla każdej próby. 5.11 Analiza białek metodą Western blot Dokonywano rozdziału białek nicieni metodą SDS-PAGE. Zastosowano poliakrylamidowe żele nieciągłe (5% zagęszczający, 12% rozdzielający) z 10 studzienkami i nakładano 10 μg/dołek mieszaniny białek nicieni w buforze Laemmli lub 5 μl wzorca masy cząsteczkowej Prestained Protein Ladder (Thermo). Żele w pojemniku zalewano buforem do elektroforezy i prowadzono rozdział przez 45-50 min przy stałym napięciu 200 V. Następnie białka przenoszono na membranę nitrocelulozową w aparacie do transferu półsuchego (BioRad) w buforze do transferu, przez 1,5 h przy 15 V. 45 5. Materiały i metody W celu wykrycia białek immunogennych, membranę blokowano w 5% odtłuszczonym mleku w PBS przez 2 h w temperaturze pokojowej, a następnie nakładano nierozcieńczony płyn otrzewnowy myszy i inkubowano w 4°C przez noc. Następnie membrany płukano w PBS Tween i nakładano przeciwciało anty-IgA sprzężone z HRP (Novus Biologicals) zawieszone w 1% odtłuszczonym mleku. Po 2 h inkubacji membrany płukano, a następnie wywoływano białka rozpoznane przez mysie IgA dodając roztwór DAB/H2O2 (3,3-diaminobenzydyna, Sigma), substrat dla HRP, do momentu pojawienia się brązowych prążków. Nadmiar substratu odpłukiwano wodą, membrany suszono i wykonywano zdjęcia w aparacie GelDoc (BioRad). Przeprowadzano analizę w programie QuantityOne (BioRad) określając masę cząsteczkową wykrytych prążków w odniesieniu do wzorca masy. W celu wykrycia w białkach reszt cukrowych membranę blokowano 1% BSA w TBS przez 2 h w temperaturze pokojowej, a następnie membranę zalewano biotynowaną lektyną WGA (Wheat Germ Agglutinin; 1:1000, rozpoznająca N-acetyloglukozaminę, Biotinylated Lectin Kit I, Vector) w 0,1% BSA w TBS i inkubowano w 4°C przez noc. Następnie membrany płukano intensywnie w TBS Tween i nakładano kompleks streptawidyna-AP (Alkaline Phosphatase; alkaliczna fosfataza, 1:10 000) zawieszony w 0,1% BSA w TBS. Po 2 h inkubacji membrany płukano, a następnie wizualizowano białka dodając wodny roztwór BCIP (5-bromo, 4-chloro, 3-indolylofosforan, Sigma), substrat dla AP, aż były widoczne fioletowe prążki. Nadmiar substratu odpłukiwano wodą, membrany suszono i wykonywano zdjęcia w aparacie GelDoc (BioRad). Wykonywano analizę w programie QuantityOne (BioRad) określając masę cząsteczkową wykrytych prążków w odniesieniu do wzorca masy. 5.12 Badania histochemiczne Narządy izolowano, natychmiast zatapiano w preparacie Neg-50 (Richard-Allan Scientific) i mrożono w ciekłym azocie. Próby przechowywano w -80°C, a następnie cięto w kriomikrotomie w temperaturze -20°C na skrawki o grubości 10 μm, które utrwalano w 90% metanolu przez 5 min. Następnie wykonywano standardowe barwienia hematoksyliną Cole`a i kwaśną eozyną Y. Preparaty obserwowano w mikroskopie świetlnym. Wykonywano także barwienia immunofluorescencyjne: utrwalone preparaty inkubowano w Assay Diluent (z zestawu ELISA eBioscience) przez 1 h w 4°C, aby uniemożliwić wiązania niespecyficzne. Następnie nakładano przeciwciała w buforze Assay Diluent: anty-CD68-Alexa488 (Genetex i Biotium) i biotynowane anty-CD11b (eBioscience). Po 2 h inkubacji w 4°C preparaty 46 5. Materiały i metody płukano wielokrotnie w PBS Tween i nakładano kompleks streptawidyna-eFluor570 (eBioscience) na 30 min, 4°C. Po dokładnym odpłukaniu, na szkiełka nakładano DAPI mounting medium (Vector), zakrywano preparat szkiełkiem nakrywkowym i obserwowano w mikroskopie fluorescencyjnym (Nikon) przy użyciu kamery i oprogramowania Lucia. 5.13 Analiza statystyczna Grupy zwierząt doświadczalnych liczyły 3-5 osobników, a wyniki analizowano indywidualnie dla każdej myszy. Doświadczenia in vitro przeprowadzano w 3 powtórzeniach technicznych. Każde z prezentowanych doświadczeń przeprowadzano minimum dwukrotnie, ale przedstawiono wyniki dla jednego z nich. Wyniki prezentowane są jako średnie ± odchylenie standardowe (Standard Deviation; SD). Analizę statystyczną wykonywano w programie Microsoft Excel przy użyciu Analysis ToolPack. Wykonywano test ANOVA dla określenia wpływu czasu i grupy na badane parametry. Istotność statystyczną jednej pary zmiennych pomiędzy grupami stwierdzano w teście parametrycznym T-Studenta. Różnice wyników przy p<0,05 uznawano za istotne statystycznie i oznaczano je * na wykresach. 47 6. Wyniki 6.1 Właściwości immunostymulacyjne chitozanu in vitro 6.1.1 Wprowadzenie Podczas odpowiedzi immunologicznej zachodzi rozpoznanie patogenu atakującego żywiciela, co następnie decyduje o mechanizmach, jakie są uruchamiane. Komórkami, które w najwyższym stopniu wpływają na przebieg odpowiedzi, są komórki prezentujące antygen, do których zalicza się między innymi komórki dendrytyczne oraz makrofagi (Xu, 2013). Jako komórki niedojrzałe, ale o silnych właściwościach fagocytujących, stale przebywają w kwi i tkankach, a po kontakcie z antygenem/patogenem dojrzewają i migrują do narządów limfatycznych (Geissmann et al., 2010), gdzie dostarczają 3 sygnały niezbędne do aktywacji limfocytów T i B. Są to: antygen w kontekście MHC II, sygnał ko-stymulacyjny oraz cytokiny. Dzięki temu zarówno makrofagi jak i komórki dendrytyczne łączą odpowiedź wrodzoną i nabytą. Receptory PRR umożliwiają tym komórkom rozpoznawanie patogenów, w wyniku czego ulegają one aktywacji i dojrzewając zapoczątkowują reakcje odpornościowe (Stuart et al., 2013). Komórki dendrytyczne produkują cytokiny, takie jak IL-1, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15 i IL-18, a makrofagi dodatkowo pełnią funkcje efektorowe i regulatorowe wydzielając m. in. tlenek azotu (Nitric Oxide; NO) i reaktywne formy tlenu (Reactive Oxygen Species; ROS). Komórki te różnią się skutecznością prezentacji antygenów naiwnym limfocytom T; makrofagi wykazują w tym mniejszą wydajność, ale silniej wpływają na funkcje aktywowanych limfocytów T i B (Hashimoto et al., 2011). Pomimo tych różnic, obie populacje komórek w znacznym stopniu biorą udział w inicjacji i regulacji odpowiedzi immunologicznej. Rodzaj aktywacji komórek APC, o którym świadczą poziom ekspresji i rodzaj markerów powierzchniowych oraz wydzielane cytokiny, decyduje o tym, jak będą aktywowane następne populacje komórek. Dokładny mechanizm polaryzacji odpowiedzi immunologicznej nie jest dobrze poznany, wiadomo jednak, że to komórki odpowiedzi wrodzonej warunkują rozwinięcie się odpowiedzi Th1, Th2, Th17 lub Treg (Phythian-Adams et al., 2010). Wzbudzenie odpowiedzi limfocytów typu Th2 następuje z udziałem komórek APC o niższej ekspresji MHC II oraz cząsteczek ko-stymulacyjnych oraz słabszym wydzielaniu IL-12 niż w przypadku aktywacji prowadzącej do odpowiedzi typu 1 (MacDonald & Maizels, 2008). Próbuje się ustalić jakie cząsteczki pochodzenia pasożytniczego przyczyniają się do nabywania takiego fenotypu przez komórki APC; sugeruje się, że będą to związki typu PAMP. Są to najbardziej charakterystyczne struktury patogenów, konserwowane ewolucyjnie, które są rozpoznawane przez komórki odpowiedzi 48 6.1 Wyniki; właściwości chitozanu in vitro wrodzonej. Większość PAMP stanowią cząsteczki strukturalne, które nie ulegają znaczącym zmianom i są podobne u różnych gatunków danej grupy patogenów. Rozpoznawanie tych wzorców przez komórki odpowiedzi wrodzonej decyduje o szybkości reakcji przy zachowaniu specyficzności; możliwe jest rozpoznanie elementów obcych bez naruszania zdrowych tkanek (Venugopal et al., 2009). Wiadomo, że mieszaniny antygenów różnych pasożytów, poprzez komórki prezentujące antygen, indukują mechanizmy odpowiedzi Th2, ale tylko nieliczne poszczególne PAMP charakterystyczne dla helmintów są poznane. Zalicza się do nich m. in.: lizofosfatydyloserynę (van der Kleij et al., 2002), lakto-N-fukopentozę (Thomas et al., 2003), ES-62 (fosforylocholina, Goodridge et al., 2005) czy Lewis x (van Die et al., 2003). Są to związki o bardzo różnej budowie chemicznej; lipidy i cukry, które jak wykazano są ligandami dla takich PRR jak TLR2, TLR4 czy DC-SIGN. Cukry oraz związki modyfikowane resztami cukrowymi, licznie występujące w antygenach somatycznych i wydzielniczych helmintów, są niewątpliwie ciekawym obiektem badań nad polaryzacją odpowiedzi komórek APC; wiele receptorów PRR rozpoznaje glikany. Także chitozan, jako pochodna chityny i polisacharyd, spełnia kryteria PAMP charakterystycznego dla patogenów wzbudzających odpowiedź Th2-zależną. Wykazano, że N-acetyloglukozamina i glukozamina, monomery chitozanu, mogą być rozpoznawane przez receptor mannozowy (MR, CD206, East & Isacke, 2002), CD14 (ko-receptor TLR4, Muzzarelli, 1997) lub CR3 (receptor dla komplementu, Thornton et al., 1996). Są one także związkami budującymi ściany komórkowe chorobotwórczych grzybów, które podobnie jak helminty, wywołują odpowiedź typu Th2 (Lenardon et al., 2010). Można zatem założyć, że chitozan rozpoznany przez komórki APC będzie induktorem mechanizmów związanych z odpowiedzią Th2. Zbadano czy chitozan aktywuje in vitro komórki odpowiedzi wrodzonej: makrofagi oraz komórki dendrytyczne. Aktywność komórek dendrytycznych badano na linii komórkowej JAWS II pochodzącej z myszy C57Bl6. Natomiast w celu określenia zmian funkcji makrofagów, indukowano dojrzewanie tych komórek in vitro ze szpiku myszy C57Bl6 za pomocą czynnika M-CSF, otrzymując Bone Marrow Derived Macrophages- BMDMf (Wang et al., 2013). Do badań in vitro wykorzystano 3 rodzaje chitozanu: oligosacharydy (2-6 reszt cukrowych; COS), polimer o małej (Mw= 50-190 kDa; LMW) oraz dużej (Mw= 190-375 kDa; HMW) masie cząsteczkowej, aby ocenić jak i który rodzaj chitozanu wpływa na aktywację komórek prezentujących antygen. 49 6.1 Wyniki; właściwości chitozanu in vitro 6.1.2 Wyniki 6.1.2.1 Cytotoksyczność Test redukcji soli formazanu, MTS, jest standardową metodą określania biokompatybilności różnych produktów używanych w medycynie (Sharifi et al., 2012). Pozwala stwierdzić czy badana substancja wpływa na przeżywalność komórek w hodowli in vitro, a zatem czy jest dla nich toksyczna. Komórki żywe są zdolne do enzymatycznej redukcji soli MTS, co powoduje zmianę koloru odczynnika. Zmiana wartości OD (Optical Density, gęstość optyczna) barwnika świadczy zatem o zmianie liczby żywych komórek w hodowli pod wpływem badanego czynnika. Wzrost lub brak zmiany wartości OD względem komórek kontrolnych świadczy o braku cytotoksyczności danego związku, a obniżenie OD wiąże się ze spadkiem żywotności komórek. Użyto komórek dendrytycznych i makrofagów, aby wstępnie ocenić wpływ chitozanu na przeżywalność komórek, a także wyznaczyć stężenie polimeru, które będzie używane w dalszych doświadczeniach. Chitozan nie wykazywał toksycznego wpływu na niedojrzałe komórki dendrytyczne linii JAWS II (Wykres 1.1a). Niezależnie od masy polimeru i jego stężenia nie obserwowano obniżonej żywotności komórek w hodowli. Chitozan HMW, przy małych stężeniach (0,1252,5 μg/ml), wykazywał nawet nieznaczny pozytywny wpływ na te komórki; OD hodowli wzrosło, co wskazywało na proliferację komórek, jednak różnice te nie były istotne statystycznie. Także kwas adypinowy, rozpuszczalnik chitozanu, nie miał wpływu na stan hodowli. Makrofagi otrzymane z komórek szpiku (BMDMf) były bardziej wrażliwe na działanie chitozanu; wpływ polimeru zależny był od jego masy cząsteczkowej oraz użytego stężenia (Wykres 1.1b). Chitozan HMW i LMW przy dużych stężeniach (>10 μg/ml) okazał się toksyczny dla tych komórek. Natomiast COS nie był toksyczny dla makrofagów; przy stężeniach >10 μg/ml nawet stymulował proliferację komórek. Rozpuszczalnik chitozanu, kwas adypinowy, nie miał wpływu na żywotność komórek w hodowli. 50 6.1 Wyniki; właściwości chitozanu in vitro GM-CSF a HMW LMW COS AdOH 1,2 1 OD 0,8 0,6 0,4 0,2 0 GM-CSF 0 M-CSF b 0,125 1,25 HMW 2,5 5 LMW 10 20 COS 40 stężenie μg/ml AdOH 1,2 1 OD 0,8 * * 0,6 0,4 * 0,2 * * 0 M-CSF 0 0,125 1,25 2,5 5 10 20 * * * stężenie 40 μg/ml Wykres 1.1 Wpływ stężenia i masy cząsteczkowej chitozanu na żywotność a) komórek linii JAWS II lub b) makrofagów BMDMf. * oznaczono p<0,05 względem stężenia „0”, n=3. Ponieważ stężenie chitozanu 5 μg/ml jest pierwszym w szeregu rozcieńczeń, które nie wywoływało zmian w komórkach, wybrano je do kolejnych doświadczeń in vitro dla obu populacji komórek i wszystkich rodzajów chitozanu. 6.1.2.2 Apoptoza Poziom apoptozy w hodowli oznaczano w cytometrze przepływowym po wyznakowaniu komórek aneksyną oraz 7-AAD (Wlodkowic et al., 2012). Metoda ta pozwala odróżnić wczesną i późną fazę apoptozy od nekrozy komórek. Komórki wyznakowane aneksyną 51 6.1 Wyniki; właściwości chitozanu in vitro (Annexin V), połączoną z fosfatydyloseryną przemieszczoną na stronę zewnętrzną błony komórkowej, znajdują się we wczesnej fazie apopozy, natomiast komórki wiążące aneksynę oraz 7-AAD (7-Aminoactinomycin D), barwnik łączący się z DNA- w późnej apoptozie. Komórki pojedynczo pozytywne dla 7-AAD uznawano za nekrotyczne, a negatywne dla obu odczynników za żywe. Pomimo nie stwierdzonego toksycznego wpływu chitozanu na komórki JAWS II w teście MTS, analiza cytometryczna wykazała, że polimer HMW i LMW w stężeniu 5 μg/ml zmniejszył odsetek komórek żywych w hodowli o 20% (Wykres 1.2a). Wzrósł jednocześnie odsetek komórek nekrotycznych oraz we wczesnej fazie apoptozy. Natomiast COS, podobnie jak to obserwowano w teście MTS, nie wpływał na żywotność komórek. Rozpuszczalnik chitozanu, kwas adypinowy, nie miał wpływu na żywotność komórek w hodowli. Żywotność makrofagów ze szpiku kostnego także była mniejsza, szczególnie po hodowli z chitozanem LMW (Wykres 1.2b). Obniżony o 50% odsetek komórek żywych w tej hodowli związany był ze wzrostem liczby komórek nekrotycznych oraz w późnej fazie apoptozy. Jednak apoptozę nieznacznie wzbudzał także LPS, zastosowany jako kontrola pozytywna. COS oraz chitozan HMW nie wpływały znacząco na żywotność komórek, nieznacznie zwiększały jedynie odsetek komórek nekrotycznych. Rozpuszczalnik chitozanu, kwas adypinowy, nie miał wpływu na żywotność komórek w hodowli. a RPMI % 120 HMW LMW COS LPS AdOH 100 80 * * 60 40 * * 20 * * 0 Żywe Wczesna apoptoza Późna apoptoza Nekroza 52 6.1 Wyniki; właściwości chitozanu in vitro b % 100 RPMI HMW LMW COS LPS AdOH 80 60 * * 40 * 20 * * * * 0 Żywe Wczesna apoptoza Późna apoptoza Nekroza Wykres 1.2 Wpływ chitozanu o różnej masie cząsteczkowej na odsetek a) komórek linii JAWS II lub b) makrofagów BMDMf w różnej fazie apoptozy po 48 h hodowli. * oznaczono p<0,05 względem komórek niestymulowanych (RPMI), n=3. Chitozan HMW i LMW w stężeniu 5 μg/ml wykazywał nieznaczne właściwości cytotoksyczne wobec komórek linii JAWS II. Natomiast dla makrofagów ze szpiku tylko polimer LMW był toksyczny. 6.1.2.3 Fenotyp komórek Poziom aktywacji komórek w hodowli określano na podstawie zmian w ekspresji markerów komórkowych. Metodą cytometrii przepływowej określono odsetek komórek pozytywnych dla receptorów związanych z prezentacją antygenu (MHC II, CD80, CD40 i CD86), których ekspresja zwiększa się u dojrzewających i aktywowanych komórek dendrytycznych i makrofagów. Wzrost odsetka komórek pozytywnych uznawano za wzrost ekspresji danego markera powierzchniowego w populacji. Dodanie do hodowli każdego rodzaju chitozanu skutkowało wzrostem odsetka komórek JAWS II z ekspresją MHC II na powierzchni (Wykres 1.3a). Taki sam wpływ wykazywał LPS, który zastosowano jako kontrolę pozytywną. Chitozan HMW oraz LPS wykazywały podobną siłę oddziaływania, zwiększając o połowę odsetek komórek MHC II+. Natomiast chitozan LMW oraz COS działały silniej; zwiększyły dwukrotnie odsetek komórek 53 6.1 Wyniki; właściwości chitozanu in vitro pozytywnych dla MHC II. Wzrosła także ekspresja CD86, jednak jego poziom nie zależał od masy chitozanu- wszystkie badane czynniki wzbudziły ekspresję CD86 na podobnym poziomie. Natomiast pozostałe cząsteczki ko-stymulacyjne (CD80 i CD40) wykazywały zróżnicowaną reakcję na chitozan HMW, LMW i COS. Chitozan HMW spowodował nieznaczny wzrost ekspresji CD80, podobnie jak LPS, natomiast chitozan LMW oraz COS obniżyły odsetek komórek CD80+. W przypadku markera CD40 obserwowane zmiany były inne; chitozan HMW obniżył odsetek komórek pozytywnych dla CD40, a chitozan LMW i COS go zwiększył. Rozpuszczalnik chitozanu, kwas adypinowy, nie miał wpływu na ekspresję markerów komórkowych. Ekspresja MHC II na makrofagach ze szpiku uległa zwiększeniu tylko pod wpływem chitozanu HMW i LMW; COS nie aktywował komórek (Wykres 1.3b). Odsetek komórek MHC II pozytywnych był podobny po LPS jak po chitozanie HMW i LMW. Jednak poziom ekspresji cząsteczek ko-stymulujących nie zwiększył się pod wpływem chitozanu, choć komórki reagowały na LPS. Ekspresja CD80 i CD40 nie uległa zmianie, a odsetek komórek pozytywnych dla CD86 został dodatkowo obniżony przez wszystkie rodzaje chitozanu. Choć LPS zwiększał ekspresję wszystkich badanych markerów, chitozan LMW i HMW zwiększył tylko poziom MHC II. Rozpuszczalnik chitozanu, kwas adypinowy, nie miał wpływu ekspresję markerów komórkowych. a % 120 RPMI HMW LMW * 100 COS LPS AdOH * * * * * * * * * 80 60 40 * * * * 20 * 0 MHC II CD80 CD40 CD86 54 6.1 Wyniki; właściwości chitozanu in vitro b RPMI % 120 HMW LMW COS * LPS AdOH * 100 80 * 60 * * 40 * * * * 20 0 MHC II CD80 CD40 CD86 Wykres 1.3 Wpływ chitozanu o różnej masie cząsteczkowej na odsetek a) komórek linii JAWS II lub b) makrofagów BMDMf pozytywnych dla markerów powierzchniowych związanych z prezentacją antygenu. * oznaczono p<0,05 względem komórek niestymulowanych, n=3. 6.1.2.4 Produkcja cytokin W płynach hodowlanych zmierzono metodą ELISA poziom cytokin prozapalnych i regulatorowych oraz chemokiny MCP-1, które mogą świadczyć o zróżnicowanym pobudzeniu komórek. Komórki dendrytyczne JAWS II w odpowiedzi na LPS zwiększają produkcję MCP-1, IL-1β, IL-6 oraz IL-12 (Wykres 1.4a). Chitozan także nieznacznie aktywował komórki, a efekt ten zależał od masy polimeru. COS obniżył tylko produkcję IL-10, a rozpuszczalnik polimeru, kwas adypinowy nie wpłynął na poziom cytokin. Pozostałe rodzaje chitozanu, LMW i HMW, istotnie zwiększyły produkcję chemokiny MCP-1. Natomiast ich wpływ na cytokiny był odmienny; LMW silnie zwiększył wydzielanie IL-12 jednocześnie obniżając nieznacznie poziom IL-6. Natomiast chitozan HMW nieistotnie zwiększał produkcję IL-6 i IL-10, ale nie wpływał na wydzielanie IL-12. Makrofagi, w odpowiedzi na LPS, ulegają aktywacji i zwiększa się sekrecja wszystkich badanych cytokin; zarówno prozapalnych jak i regulatorowych (Wykres 1.4b). Na poziomie 55 6.1 Wyniki; właściwości chitozanu in vitro cytokin reakcja tych komórek na chitozan była zróżnicowana, a największy wpływ wykazywał chitozan HMW. Chitozan HMW zwiększył wydzielanie prozapalnych IL-1β i regulatorowej IL-10 oraz nieznacznie IL-6, ale równocześnie obniżył o połowę poziom chemokiny MCP-1. Chitozan LMW zwiększył tylko poziom IL-12. COS spowodował natomiast obniżenie wydzielania chemokiny MCP-1 i IL-10. Rozpuszczalnik chitozanu, kwas adypinowy, miał niewielki wpływ na produkcję cytokin; tylko MCP-1 uległa obniżeniu. RPMI a HMW LMW COS LPS AdOH 6000 * 5000 * 4000 pg/ml ** * 3000 * 2000 ** 1000 * 0 MCP-1 b RPMI IL-1β HMW IL-6 LMW COS IL-10 LPS IL-12 AdOH 180 * 150 * pg/ml 120 * 90 60 * * * 30 * * * * * * 0 MCP-1 IL-1β IL-6 IL-10 IL-12 Wykres 1.4 Wpływ chitozanu o różnej masie cząsteczkowej na produkcję cytokin przez a) komórki linii JAWS II lub b) makrofagi BMDMf. * oznaczono p<0,05 względem komórek niestymulowanych, n=3. 56 6.1 Wyniki; właściwości chitozanu in vitro Podsumowując, zarówno komórki JAWS II jak i makrofagi w odpowiedzi na chitozan zmieniały poziom ekspresji receptorów powierzchniowych oraz produkcji cytokin, a efekt ten zależał od masy chitozanu. Polimer LMW silniej zwiększał ekspresję MHC II oraz wzbudzał produkcję IL-12. Natomiast HMW słabiej aktywował MHC II oraz nie wpływał na wydzielanie IL-12, natomiast nieznacznie wzbudzał produkcję IL-10 i IL-6. COS nie aktywował istotnie komórek. 6.1.3 Dyskusja Makrofagi i komórki dendrytyczne, jako komórki prezentujące antygen, odgrywają ważną rolę w aktywacji, a następnie różnicowaniu limfocytów T pomocniczych w komórki typu Th1, Th2, Th17 lub Treg. W celu określenia roli chitozanu w polaryzacji odpowiedzi poprzez aktywację komórek APC, makrofagi i komórki dendrytyczne hodowano in vitro w obecności chitozanu o różnej masie cząsteczkowej, a następnie określano ich aktywność. Chitozan testowany w różnych zastosowaniach wykazywał niską toksyczność (Molinaro et al., 2002, Vandevord et al., 2002, Lim et al., 2007). Podobnie było w prezentowanym doświadczeniu; używając standardowego testu określającego cytotoksyczność (redukcja soli MTS), wszystkie rodzaje chitozanu, w stężeniu do 5 μg/ml, były mało toksyczne dla badanych komórek. Jednak dokładniejsza analiza wykazała wpływ polimeru na aktywność komórek, a efekt ten zależał od masy chitozanu. Polimer HMW i LMW wpływał na żywotność komórek wywołując ich apoptozę, a także nekrozę. Jedynie COS nie był cytotoksyczny; przy żadnym stężeniu nie powodował śmierci komórek. Równocześnie ze zmianą żywotności, następował wzrost ekspresji markerów związanych z prezentacją antygenu oraz produkcji cytokin, co świadczy o dojrzewaniu i aktywacji komórek. Efekt ten był zależny nie tylko od masy chitozanu, ale także rodzaju użytych komórek. Różnice w reaktywności na chitozan komórek dendrytycznych i makrofagów miały głównie charakter ilościowy, a nie jakościowy i wynikają zapewne nie tylko z różnych właściwości tych populacji, a także z ich różnego pochodzenia. Makrofagi otrzymywano in vitro ze szpiku myszy i stanowiły hodowlę pierwotną. Natomiast komórki dendrytyczne JAWS II to linia komórkowa, o większej przeżywalności, jako komórki unieśmiertelnione, co obserwowano w teście MTS; nawet duże stężenia polimeru nie były toksyczne dla tych komórek. Wykazano jednak, że linia JAWS II pomimo braku p53 ma podobne właściwości jak pierwotne komórki dendrytyczne, dlatego może być używana w badaniach modelowych dla tej populacji komórek (Jiang et al., 2008). Zarówno hodowle pierwotne jak i linie 57 6.1 Wyniki; właściwości chitozanu in vitro komórkowe posiadają zalety, jak i wady (Stacey, 2001), jednak stanowią bardzo ważne narzędzie w biologii, ponieważ umożliwiają badanie mechanizmów komórkowych w kontrolowanych warunkach. Choć badania in vitro nie oddają w pełni skomplikowanych zjawisk zachodzących w całym organizmie, stanowią dogodny model do określania funkcji różnych komórek i tkanek (Pan et al., 2008). Pomimo różnego pochodzenia makrofagów i komórek dendrytycznych w prezentowanym doświadczeniu, charakter zmian pod wpływem chitozanu był podobny. Zarówno komórki dendrytyczne jak i makrofagi różnie reagowały na chitozan LMW i HMW, co obserwowano głównie w odmiennym profilu produkcji cytokin; chitozan LMW indukował produkcję IL-12, natomiast HMW wpływał na IL-10 i IL-6. Wielkość cząsteczek pobieranych przez komórki ma wpływ na rodzaj indukowanej odpowiedzi immunologicznej zarówno in vitro jak i in vivo (Mant et al., 2012). Obserwowano, że cząsteczki małe (<50-100 nm) aktywują reakcje zapalne typu 1, natomiast większe cząsteczki (> 200 nm) indukują mechanizmy odpowiedzi typu 2. Związane jest to z inną bio-dystrybucją w organizmie substancji o różnej wielkości (Manolova et al., 2008), ale także różnym sposobem ich pobierania przez komórki (Mant et al., 2012). Może to być jednym z mechanizmów rozpoznawania rodzaju patogenów; cząsteczki <50-100 nm indukujące odpowiedź zależną od IFN-α odpowiadają wielkością niektórym wirusom, wobec których skuteczna jest odpowiedź komórkowa Th1 zależna (Xiang et al., 2006). Choć w prezentowanym doświadczeniu nie mierzono wielkości cząsteczek badanego chitozanu, masa polimeru również różnicowała aktywowane mechanizmy. Chitozan HMW (190-375 kDa) in vitro wykazał częściowo cechy adiuwantu odpowiedzi typu Th2 lub regulatorowej; słabiej indukował ekspresję MHC klasy II na komórkach APC i produkcję cytokiny prozapalnej IL12 równocześnie wywołując sekrecję IL-10. Natomiast chitozan LMW (50-190 kDa) silnie wzbudzał ekspresję markerów związanych z prezentacją antygenu i produkcję prozapalnej IL-12 (cytokiny Th1 zależnej), sugerując typowe dojrzewanie komórek APC. Komórki linii JAWS II okazały się nieco bardziej wrażliwe na aktywację przez chitozan niż makrofagi, ponieważ wykazywały zmianę poziomu także cząsteczek ko-stymulacyjnych pod wpływem polimeru. Podsumowując, chitozan LMW aktywował zarówno komórki dendrytyczne jak i makrofagi, co obserwowano jako wzrost ekspresji MHC II i produkcji IL-12. Taki fenotyp komórek APC oznacza ich dojrzałość po aktywacji prozapalnej. Natomiast w przypadku chitozanu HMW efekt był odmienny; wzrost poziomu MHC II był zdecydowanie słabszy, a równocześnie komórki wydzielały IL-10 i IL-6 świadczące o potencjalnej aktywacji odpowiedzi Th2 lub 58 6.1 Wyniki; właściwości chitozanu in vitro regulatorowej. Dlatego do dalszych doświadczeń wykorzystano chitozan HMW (polimer o dużej masie cząsteczkowej), aby sprawdzić czy po podaniu in vivo (dootrzewnowo) zaindukuje mechanizmy odpowiedzi typu 2 i poprzez to wpłynie na skuteczność odpowiedzi obronnej w czasie zarażenia nicieniami pasożytniczymi. 59 6.2 Właściwości immunostymulacyjne chitozanu in vivo 6.2.1 Wprowadzenie Immunostymulacyjne właściwości chitozanu badano in vivo, w modelu mysim; samcom szczepu C57Bl6 podawano dootrzewnowo polimer HMW (o dużej masie cząsteczkowej; Mw= 190-375 kDa,), który zaktywował komórki in vitro, co przedstawiono w Rozdziale 6.1. Jama otrzewnej to przestrzeń otoczona błoną, w której znajdują się narządy oraz płyn surowiczy. Do jamy otrzewnej napływają różne populacje komórek układu odpornościowego, z których u myszy największy odsetek stanowią limfocyty B (40-50%) i makrofagi (30-40%) (Ghosn et al., 2010, Ray & Dittel, 2010, Misharin et al., 2012). W odpowiedzi na patogeny pojawiające się w jamie otrzewnej lub w znajdujących się w niej narządach, obecne tam komórki ulegają aktywacji; wydzielane są mediatory stanu zapalnego, np. NO, prostaglandyny oraz chemokiny i cytokiny. Do jamy otrzewnej napływają komórki z krwi, głównie neutrofile i monocyty, ale także rozwija się odpowiedź nabyta; aktywowane komórki migrują do lokalnych węzłów limfatycznych, gdzie prezentują antygeny naiwnym limfocytom indukując ich klonalną proliferację (Martín-Fontecha et al., 2009). Z tego powodu jama otrzewnej to dogodne miejsce do badania różnorodnych reakcji układu odpornościowego na podawane związki. Celem badań była ocena wskaźników odpowiedzi wrodzonej u myszy; lokalnie (w jamie otrzewnej) oraz obwodowo (w krwi) po długotrwałym dootrzewnowym podawaniu chitozanu (przez 10 dni). Chitozan ulega biodegradacji, dlatego taki schemat podawania polimeru zapewniał przedłużone oddziaływanie niezmienionego polimeru. 6.2.2 Wyniki 6.2.2.1 Wpływ chitozanu na stan fizjologiczny myszy Oceniono wpływ chitozanu na stan fizjologiczny zwierząt; co 2/3 dni myszy ważono oraz pobierano krew z ogona w celu oznaczenia odsetka różnych populacji komórek w rozmazach. Wykres 2.1 przedstawia bezwzględną (a) oraz procentową (b) zmianę masy ciała w czasie doświadczenia. Podanie chitozanu spowodowało istotny spadek masy ciała zwierząt tylko w 2, o 5%, i 4 dniu doświadczenia; około 8 dnia masa zwierząt powróciła do wartości wyjściowej i przyrastała w sposób porównywalny do grupy kontrolnej. U myszy, którym podawano chitozan, nie obserwowano zmian w zachowaniu; zwierzęta nie były osowiałe, 60 6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo sierść i odchody były niezmienione i żadne ze zwierząt nie padło. Podawanie chitozanu nie spowodowało choroby i jest potencjalnie bezpieczne. K a Cht Masa ciała (g) 30 * * * * * 2 4 6 8 11 15 18 ANOVA Cht F=7,007, P<0,01 22 * * * 20 10 0 0 b K 25 29 dni Cht % zmiany masy ciała 10 * 5 * 0 -5 -10 0 2 4 6 8 11 15 18 22 25 29dni Wykres 2.1 Zmiana masy ciała myszy pod wpływem chitozanu; a) bezwzględne wartości w gramach, b) procent zmiany względem 0 dnia doświadczenia. * oznaczono p<0,05 Cht vs K dla danego punktu czasowego doświadczenia, n=4. Analiza składu komórek w rozmazach krwi z ogona (Wykres 2.2) wykazała, że chitozan spowodował w 6 dniu doświadczenia 3-krotny wzrost odsetka neutrofilów, który utrzymywał się do 20 dnia, 10 dni po zakończeniu podawania chitozanu. W tym samym czasie nastąpił spadek odsetka limfocytów, z 70% do około 50%, który powrócił do poziomu wyjściowego po 12 dniach od zakończenia podawania polimeru i przez następne dni nieznacznie wzrastał. Wprawdzie odsetki pozostałych populacji komórek nie zmieniały się istotnie w czasie podawania chitozanu, obserwowano jednak nieznacznie obniżony odsetek monocytów od 5 dnia po zakończeniu podawania chitozanu, który utrzymał się do końca doświadczenia. Odsetek eozynofilów w krwi nie zmienił się pod wpływem chitozanu. 61 6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo Neutrofile Monocyty Limfocyty Eozynofile 100 Odsetek komórek * 80 * * * * * 60 40 * * * * 20 * * * * 0 0 2 4 6 8 11 15 18 22 25 29 dni Wykres 2.2 Zmiany odsetka różnych populacji komórek w krwi myszy, którym podawano chitozan. * oznaczono p<0,05 względem wartości wyjściowej (dzień 0), n=4. Zmiana masy narządów znajdujących się w jamie otrzewnej jest jednym ze wskaźników intensywności stanu zapalnego otrzewnej (peritonitis, Jansen et al., 1997). Określano masy śledziony i wątroby, a także płuc i nerek, ponieważ ich uszkodzenie jest częstym powikłaniem peritonitis (Tsujimoto et al., 2002). Wykres 2.3 przedstawia relatywne masy tych narządów określone względem masy serca. Podanie chitozanu spowodowało tylko wzrost relatywnej masy śledziony na początku doświadczenia (o ok. 60%), tuż po zakończeniu podawania polimeru, co świadczy o pobudzeniu tego narządu. Masa pozostałych narządów nie uległa zmianie; wątroba ani płuca nie były zmienione. 62 6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo K Cht1 Cht3 AdOH 1,2 * 1 0,8 0,6 * 0,4 0,2 0 Śledziona Wątroba Nerka Płuca Wykres 2.3 Zmiana relatywnej- względem serca, masy narządów w czasie podawania chitozanu. * oznaczono p<0,05 względem grupy kontrolnej (K), n=4. Po 3 tygodniach od podawania chitozanu obserwowano uformowane białe struktury wewnątrz jamy otrzewnej (Fot. 2.1a i b). Były one przytwierdzone do narządów wewnętrznych; śledziony, jelit i wątroby, a także do błony otrzewnej. U niektórych myszy (szczególnie gdy doświadczenia prowadzono na szczepie BALB/c) obserwowano liczne zrosty jelita cienkiego (wyniki nieprzedstawione). Barwienie hematoksyliną i eozyną 10 μm skrawków tych struktur, wyizolowanych razem z fragmentem wątroby, wykazały, że są to grudki odłożonego chitozanu otoczone grubą warstwą gęstej tkanki łącznej tworzącej ziarniniak (Fot. 2.1c). Wśród regularnie ułożonych komórek identyfikowano fibroblasty; wrzecionowate komórki o okrągłym jądrze, oraz makrofagi epitelioidalne; ciasno ułożone komórki o wydłużonym jądrze, a także komórki olbrzymie; kuliste skupiska jąder komórkowych (Shadman et al., 2009, Ramakrishnan, 2012). Na dolnej części preparatu widać grubą warstwę kolagenu, a wewnątrz ziarniniaka nieregularne masy chitozanu, wybarwione intensywnie różowo, z uwięzionymi komórkami. W barwieniu fluorescencyjnym (Fot. 2.1d) w miejscu połączenia ziarniniaka z wątrobą wykazano obecność największej liczby komórek CD11b+CD68+, które mogą być komórkami Kupffera (makrofagi wątroby). Obserwowano je w niewielkiej ilości także na całym obwodzie ziarniniaka, ale dominowały tam komórki CD11b+CD68- oraz komórki podwójnie negatywne. 63 6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo a c W Cht W Cht b W d W Cht Fot. 2.1 Zmiany w jamie otrzewnej pod wpływem chitozanu, a) trzy tygodnie po podaniu polimeru, b) tuż po zakończeniu nastrzykiwania oraz barwione c) hematoksyliną i eozyną lub d) fluorescencyjnie (niebieski- DAPI, czerwony- CD11b, zielony- CD68, żółty- podwójnie pozytywny) 10 μm skrawki ziarniniaka wyizolowanego od myszy po 3 tygodniach od podania chitozanu. W- wątroba, Cht- ziarniniak z chitozanem. Powiększenie x10. 6.2.2.2 Charakterystyka widm NMR chitozanu z jamy otrzewnej Płyn otrzewnowy wyizolowany po ostatnim wstrzyknięciu chitozanu, poddano analizie NMR (Nuclear Magnetic Resonance; spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego) w celu potwierdzenia obecności polimeru. Wykres 2.4a przedstawia widma NMR w transformacji Fourier’a materiałów wyjściowych: pożywki RPMI (różowa linia), rozpuszczalnika; kwasu 64 6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo adypinowego (AdOH, czerwona linia) oraz chitozanu, który był podawany myszom (HMW chitosan, niebieska linia). Używany chitozan zawierał wszystkie charakterystyczne dla tego polimeru pasma: 3400 – 3100 cm-1 (pasmo drgań rozciągających grup OH), 3365 cm-1 (pasmo amidowe), 3292 cm-1 (pasmo rozciągające N-H), 2878 cm-1 (pasmo rozciągające C-H, obecne także w kwasie adypinowym), 1640 cm-1 (pasmo amidowe I), 1563 cm-1 (pasmo amidowe II), 1550 cm-1 (pasmo asymetryczne NH3+), 1155 cm-1 (pasmo rozciągające O-C-O), 1100-1020 cm-1 (C-O rozciągające grup: C-OH, C-O-C pierścień, CH2OH). Wykres 2.4b przedstawia przykładowe widmo płynu otrzewnowego (z pożywką RPMI) izolowanego w 10 dniu doświadczenia. Widoczne są w nim charakterystyczne pasma chitozanu, co oznacza, że jest on tam obecny. Pasmo przy 1700cm-1 w tej próbie nie występuje jako samodzielny pik, tak jak to było w materiale wyjściowym chitozanu (wskazane strzałkami). Jest ono zawarte w szerokim zakresie 1690-1550cm-1, co świadczy o zmianie charakteru oddziaływań. Pojawiło się także nowe pasmo 1742cm-1, co może świadczyć o powstaniu wolnych grup karboksylanowych nie zaangażowanych w wiązania wodorowe czy oddziaływania jonowe z 3500 3000 2500 916.25 917.03 2000 1500 928.98 881.72 843.98 773.94 1068.65 1044.19 1025.52 1119.49 1193.69 1278.26 690.44 733.99 1189.58 1273.64 1356.63 1314.33 1461.10 1428.02 1406.51 1537.95 1914.30 2343.53 HMW chitosan 4000 1461.95 1432.01 1408.43 1693.04 2498.43 2665.53 2614.05 2951.43 2874.05 2932.62 2873.15 AdOH 3128.67 3064.09 3034.38 RPMI medium 3211.27 A b s o r b a n c e 807.85 766.37 1304.78 1595.37 1488.12 1437.31 1714.86 1698.26 1684.09 2949.59 2899.71 3218.06 3416.40 3316.02 a 1217.16 1180.20 1111.53 1071.65 1036.51 1003.89 chitozanem. 1000 Wavenumbers 65 6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo b representative peritoneal fluid sample 1651.86 2951.65 2888.27 2852.22 766.39 833.41 928.37 903.85 1007.93 1042.71 1182.97 1127.03 1745.45 0.04 1457.72 1557.68 1541.40 2982.01 3394.52 3366.47 A 0.08 b s o r b a 0.06 n c e 3296.48 3245.01 3184.26 3131.33 2920.02 0.10 0.02 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 Wavenumbers Wykres 2.4 Przykładowe widma FTIR chitozanu a) przed oraz b) po podaniu myszom. Różowa linia to widmo RPMI, pożywki, którą płukano jamę otrzewnej, czerwona liniawidmo kwasu adypinowego (AdOH), rozpuszczalnika chitozanu. 6.2.2.3 Wpływ chitozanu na komórki jamy otrzewnej Sekcje wykonano w 4 punktach czasowych doświadczenia: 0 (K; kontrola, bez chitozanu), 10 (Cht1; ostatni dzień podawania chitozanu), 25 (Cht2; 2 tygodnie po zakończeniu podawania chitozanu) oraz 35 (Cht3; 3 tygodnie po zakończeniu podawania chitozanu) dniu doświadczenia. Zaobserwowano bardzo silny napływ komórek do jamy otrzewnej pod wpływem chitozanu (Wykres 2.5); komórek było ponad siedmiokrotnie więcej niż u myszy kontrolnych. Z czasem, liczba komórek obecnych w płynie otrzewnowym zmniejszała się aż w 35 dniu doświadczenia powróciła do poziomu kontrolnego. Kwas adypinowy nie wpłynął na liczbę komórek izolowanych z jamy otrzewnej. 66 6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo K Cht1 Cht 2 Cht3 AdOH 15 komórki x106 * 10 * 5 0 Wykres 2.5 Zmiana liczby komórek w jamie otrzewnej pod wpływem chitozanu. * oznaczono p<0,05 względem grupy kontrolnej (K), n=4. Skład komórkowy płynu otrzewnowego analizowano po wybarwieniu rozmazów oraz metodą cytometrii przepływowej na podstawie ekspresji markerów F4/80 i CD11b oraz morfologii komórek (Wykres 2.6c). Komórki F4/80hiCD11bhi (bramka G1) identyfikowano jako dojrzałe makrofagi tkankowe. W populacji F4/80loCD11b+ (bramka G2) rozróżniano eozynofile na podstawie ziarnistości (SSChi, bramka G3), a pozostałe komórki (bramka G4) uznawano za monocyty napływowe (80% komórek z G4 było Ly6C+; wyniki nieprzedstawione). Pozostałe komórki CD11b+ (bramka G5) identyfikowano jako neutrofile (95% wykazywało ekspresję markera Gr1; wyniki nieprzedstawione). Wykazano, że pod wpływem chitozanu do jamy otrzewnej napływają głównie neutrofile, które identyfikowano na rozmazach (Wykres 2.6a). Także analiza cytometryczna potwierdziła znaczny udział tej populacji w odpowiedzi na chitozan- stanowiły one ok. 40% komórek otrzewnowych, podczas gdy u myszy kontrolnychtylko 5-10%. Dodatkowo wykazano obniżenie odsetka tkankowych makrofagów otrzewnowych przy równoczesnym wzroście odsetka napływowych monocytów (Wykres 2.6b); rozróżnienie tych populacji możliwe było tylko za pomocą cytometrii przepływowej. 67 6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo a K % 80 Cht1 Cht3 AdOH 60 * * 40 20 * 0 Monocyty b Neutrofile K % 50 Cht1 Eozynofile Cht2 Cht3 Limfocyty AdOH * 40 * 30 * * 20 * 10 * * * 0 Makrofagi Eozynofile Monocyty Neutrofile Cht1 K CD11b FSC SSC F4/80 SSC F4/80 c CD11b FSC Wykres 2.6 Zmiany odsetka różnych populacji komórek w płynie otrzewnowym pod wpływem chitozanu; a) identyfikowanych na rozmazach barwionych metodą DiffQuik, b) analizowanych metodą cytometrii przepływowej, c) przykładowe wykresy przedstawiające sposób analizy komórek. * oznaczono p<0,05 względem grupy kontrolnej (K), n=4. 68 6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo Ze względu na silny wzrost liczby komórek w jamie otrzewnej po podaniu chitozanu, analizowano także całkowitą liczbę komórek poszczególnych populacji (Wykres 2.7). Potwierdzono, że na początku doświadczenia w jamie otrzewnej gromadzą się neutrofile i monocyty, jednak zaobserwowano także dodatkowo napływ eozynofilów tuż po zakończeniu podawania chitozanu. Natomiast populacja tkankowych makrofagów nie zmieniła się; polimer nie spowodował ich deplecji. Ilość komórek powróciła do stanu kontrolnego pod koniec doświadczenia. K Cht1 Cht2 Cht3 AdOH 5 * komórki x 106 4 3 * 2 * * 1 * 0 Makrofagi Eozynofile Monocyty Neutrofile Wykres 2.7 Zmiany liczby komórek poszczególnych populacji identyfikowanych metodą cytometrii przepływowej w płynie otrzewnowym. * oznaczono p<0,05 względem grupy kontrolnej (K), n=4. Następnie analizowano fenotyp monocytów/makrofagów CD11bhi (Wykres 2.8c); metodą cytometrii przepływowej określano odsetek komórek posiadających markery powierzchniowe związane z dojrzałością oraz aktywacją monocytów (Wykres 2.8a i b). Na początku doświadczenia, 10 dnia podawania chitozanu, wykazano spadek ekspresji wszystkich markerów na monocytach otrzewnowych; chitozan obniżył odsetek komórek pozytywnych dla MHC II, CD80 i CD86, cząsteczek związanych z prezentacją antygenu oraz MR, dektyny-1, CD23 i IL-4R, wskazujących na alternatywną aktywację, a także CD14, ko-receptora dla LPS. Taki poziom aktywacji monocytów utrzymywał się do 25 dnia doświadczenia, 15 dni po podaniu chitozanu. W 35 dniu doświadczenia, czyli 25 dni po zakończeniu podawania polimeru, poziom ekspresji większości markerów powrócił do stanu kontrolnego, jednak ekspresja MHC II nadal była niższa niż przed podaniem chitozanu, 69 6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo natomiast poziom ekspresji receptorów CD86, MR oraz dektyny-1 i, nieznacznie, IL-4R (p<0,1), markerów charakteryzujących alternatywnie aktywowane makrofagi, wzrósł, choć CD14 powróciło do poziomu kontrolnego. a K % 100 Cht1 Cht2 Cht3 AdOH * 80 * * 60 * * * * 40 * 20 0 MHC II b % 100 K CD80 Cht1 Cht2 CD86 Cht3 AdOH ** 80 * * 60 * * 40 * * 20 * * 0 CD14 MR Dektyna 1 IL-4R CD23 70 6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo c K FL1 SSC Count Cht1 CD11b FSC CD14 Wykres 2.8 Zmiana odsetka monocytów pozytywnych dla markerów powierzchniowych a) związanych z prezentacją antygenu, b) związanych z rodzajem aktywacji pod wpływem chitozanu. c) przykładowe wykresy analizy komórek. * oznaczono p<0,05 względem grupy kontrolnej (K), n=4. Komórki przylegające płynu otrzewnowego hodowano in vitro w celu określenia poziomu metabolizmu L-argininy; zmierzono ilość NO-2 (Wykres 2.9a) oraz mocznika (Wykres 2.9b), które świadczą o aktywności indukowanej syntazy tlenku azotu (iNOS) oraz arginazy 1. Jako kontrolę pozytywną podano bakteryjny LPS, który zwiększa w komórkach aktywność obu enzymów. W 10 dniu doświadczenia chitozan nie wpłynął na aktywność niestymulowanych komórek, jednak obniżył poziom aktywności arginazy 1 po stymulacji LPS; komórki wykazywały wtedy zmianę aktywności enzymów; z arginazy 1 na iNOS. Natomiast w 35 dniu doświadczenia zaobserwowano zwiększoną aktywność arginazy 1; zarówno spontaniczną, jak i po aktywacji LPS (Wykres 2.9b). Obserwowano wówczas również wyższy poziom NO po stymulacji LPS (Wykres 2.9a). Rozpuszczalnik chitozanu, kwas adypinowy AdOH także wpłynął na badane wskaźniki komórek przylegających; zmniejszył aktywność iNOS po stymulacji LPS, ale równocześnie zwiększył aktywność arginazy 1. Zmieniła się również produkcja cytokin in vitro. Komórki izolowane od myszy, którym podawano chitozan, najpierw wykazywały obniżoną spontaniczną produkcję zarówno IL-6 i IL-10, ale pod wpływem stymulacji LPS dominowała produkcja cytokiny prozapalnej (Wykres 2.9c i d). Z czasem, produkcja IL-6 przez komórki izolowane od myszy po 71 6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo 3 tygodniach od podania chitozanu, w 35 dniu doświadczenia, powróciła do stanu kontrolnego, ale komórki te produkowały mniej IL-10 w odpowiedzi na LPS. Kwas adypinowy nie wpłynął znacząco na aktywność komórek; obserwowano nieznacznie słabszą reakcję na LPS, ale tylko na poziomie aktywności iNOS i arginazy 1. a 0,4 K Cht1 Cht3 b AdOH Cht1 Cht3 OD OD 0,4 * 0,3 * 0,2 0,2 * 0,1 * * 0,1 0 0 RPMI c 3000 K Cht1 LPS Cht3 AdOH RPMI d 3000 * 2500 Cht1 Cht3 AdOH * pg/ml 2000 1500 1000 500 K LPS 2500 2000 pg/ml AdOH * * 0,3 K 0,5 1500 * 1000 500 * 0 0 RPMI LPS * RPMI LPS Wykres 2.9 Wpływ chitozanu na poziom aktywności a) iNOS mierzonego stężeniem NO-2 oraz b) arginazy 1 mierzonego stężeniem mocznika oraz produkcję cytokin c) prozapalnej IL6 i d) regulatorowej IL-10 w hodowli komórek przylegających płynu otrzewnowego. * oznaczono p<0,05 względem grupy kontrolnej (K), n=3. Podsumowując, chitozan istotnie wpłynął na aktywność komórek jamy otrzewnej; początkowo spowodował napływ neutrofilów i niedojrzałych monocytów, które wydzielały jednak NO i IL-6 w odpowiedzi na stymulację in vitro, natomiast wykazywały obniżoną 72 6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo produkcję IL-10 i aktywność arginazy 1. Z czasem, liczba komórek w jamie otrzewnej powróciła do poziomu kontrolnego, jednak fenotyp monocytów wskazywał na ich aktywację na drodze alternatywnej, choć komórki te były zdolne do produkcji mediatorów stanu zapalnego w odpowiedzi na stymulację LPS in vitro. 6.2.2.4 Wpływ chitozanu na komórki krwi obwodowej Określano wpływ chitozanu na odsetek różnych populacji komórek w krwi pobranej z serca. Tuż po zakończeniu podawania polimeru obserwowano zmniejszenie o 1/3 odsetka limfocytów przy wzroście udziału pozostałych populacji (Wykres 2.10). Najsilniejsze zmiany dotyczyły monocytów (wzrost z 4 do 13%) i neutrofilów (z 5 do 18%). % 100 K Cht1 Cht2 Cht3 AdOH 80 * 60 40 20 * * * 0 Monocyty Neutrofile Eozynofile Limfocyty Wykres 2.10 Zmiany odsetka różnych populacji komórek w krwi pod wpływem chitozanu analizowanych metodą cytometrii przepływowej. * oznaczono p<0,05 względem grupy kontrolnej (K), n=4. Oznaczono także wpływ chitozanu na poziom ekspresji CD14 na monocytach i neutrofilach (Wykres 2.11), markera który pojawia się na komórkach reagujących na czynniki patogenów, głównie LPS, a którego poziom zwiększa się na komórkach prozapalnych. Podawanie chitozanu spowodowało krótkotrwały wzrost ekspresji CD14 tylko na neutrofilach krwi; komórek CD14-pozytywnych było 2 razy więcej. Na koniec doświadczenia ekspresja CD14 powróciła do poziomu kontrolnego, co wskazuje na tymczasowe wzbudzenie komórek prozapalnych przez chitozan. 73 6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo % CD14+ K Cht1 Cht2 Cht3 AdOH 20 * * 15 10 5 0 Monocyty Neutrofile Wykres 2.11 Zmiana odsetka monocytów i neutrofilów CD14+ w krwi pod wpływem chitozanu, analizowanych metodą cytometrii przepływowej. * oznaczono p<0,05 względem grupy kontrolnej (K), n=4. 6.2.2.5 Wpływ chitozanu na poziom cytokin Poziom cytokin w płynie otrzewnowym oraz w krwi mierzono metodą ELISA. Podanie kwasu adypinowego nie wpłynęło na poziom cytokin, dlatego wyniki dla tej grupy nie są prezentowane. Chitozan istotnie zwiększył produkcję cytokin prozapalnych w płynie otrzewnowym, poza IL-1β, tylko tuż po zakończeniu iniekcji. Produkcja cytokin powróciła do poziomu kontrolnego w ciągu 2 tygodni (Wykres 2.12a). Także poziom cytokin przeciwzapalnych, TGF-β i IL-10 uległ zmianie (Wykres 2.12b). Na początku doświadczenia chitozan wywołał aż 60-krotny wzrost produkcji TGF-β oraz w nieco mniejszym stopniu podniósł poziom IL-10. Zmiany te utrzymywały się i do końca doświadczenia nie powróciły do poziomu kontrolnego. Podanie chitozanu spowodowało także 10-krotny wzrost produkcji chemokiny MCP-1, czynnika chemotaktycznego dla monocytów i makrofagów (Wykres 2.12c). Wysoka produkcja tego białka nie utrzymała się jednak po zakończeniu podawania polimeru. Podobną dynamikę wykazywała produkcja mieloperoksydazy (Myeloperoxidase; MPO), wydzielanej głównie przez neutrofile (Wykres 2.12d). Na koniec doświadczenia, w 35 dniu, zaobserwowano także zwiększone wydzielanie IL-4. 74 6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo a TNF-α IL-1β IL-6 IL-12 400 * 350 300 pg/ml 250 200 150 * 100 * * 50 0 0 10 TGF-β b 500 25 IL-10 35 dni IL-4 * pg/ml 400 * 300 * 200 100 * * * 25 35 0 0 c K Cht1 160 Cht2 10 Cht3 AdOH d 100 * 80 Cht1 Cht3 * 80 pg/ml pg/ml 120 K dni 60 40 40 20 0 0 Wykres 2.12 Wpływ chitozanu na produkcję a) cytokin prozapalnych, b) cytokin regulatorowych i Th2, c) chemokiny MCP-1 oraz d) mieloperoksydazy w płynie otrzewnowym. * oznaczono p<0,05 względem grupy kontrolnej (K), n=5. 75 6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo Podawanie chitozanu istotnie wpłynęło na poziom cytokin także na poziomie obwodowym (Wykres 2.13a i b); w krwi obserwowano wzrost poziomu niektórych cytokin prozapalnych (IL-6 i IL-1β), a także regulatorowych (TGF-β i IL-10). Obserwowano silniejszą indukcję IL-10 (wzrost 5-krotny) niż TGF-β (wzrost 2-krotny). Już 2 tygodnie po zakończeniu iniekcji poziom tych cytokin powrócił po stanu kontrolnego, jednak na koniec doświadczenia zaobserwowano wzrost IL-4. IL-1β a 1200 IL-6 IL-12 * 1000 pg/ml 800 600 * 400 200 0 0 10 IL-4 b 25 IL-10 35 TGF-β 4000 * pg/ml 3000 2000 * 1000 * 0 0 10 25 35 dni Wykres 2.13 Wpływ chitozanu na produkcję a) cytokin prozapalnych, b) cytokin regulatorowych i Th2 w krwi. * oznaczono p<0,05 względem grupy kontrolnej (K), n=4. 76 6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo Podsumowyjąc, początkowo chitozan spowodował wzrost produkcji zarówno cytokin prozapalnych jak i regulatorowych, zarówno w jamie otrzewnej jak i w krwi. Z czasem stężenie cytokin powróciło do poziomu kontrolnego, jednak w jamie otrzewnej nadal obserwowano silniejszą produkcję TGF-β i IL-10. 6.2.3 Dyskusja W jamie otrzewnej myszy obecne są różne komórki odpornościowe, zdolne do rozpoznawania i neutralizowania patogenów oraz ich metabolitów. Odpowiedź immunologiczna rozwija się szybko i łączy różne mechanizmy; wrodzone i nabyte. Celem badań było stwierdzenie czy pod wpływem chitozanu zmienia się poziom aktywacji komórek odpowiedzi wrodzonej w jamie otrzewnej myszy. Badania wykazały immunostymulacyjne właściwości chitozanu; podany dootrzewnowo wywołał silną odpowiedź immunologiczną. Była ona obserwowana zarówno lokalnie, w jamie otrzewnej, jak i obwodowo, w krwi. Podczas podawania chitozanu nastąpiło wzbudzenie ostrego stanu zapalnego, który z czasem, po ok. 3 tygodniach, uległ zahamowaniu. Chitozan spowodował silny napływ komórek do jamy otrzewnej, prawdopodobnie w odpowiedzi na wzrost produkcji MCP-1. Jest to chemokina wydzielana przez różne komórki; monocyty, fibroblasty, komórki śródbłonka, mięśniowe i nabłonkowe. Działa jako czynnik chemotaktyczny głównie dla monocytów, ale także dla neutrofilów i limfocytów T pamięci (Deshmane et al., 2009). Indukcja produkcji MCP-1 przez chitozan spowodowała napływ głównie neutrofilów oraz monocytów, a także eozynofilów. Reakcja taka nastąpiła już w 24 h po podaniu chitozanu (wyniki nieprzedstawione). Neutrofile jako jedne z pierwszych komórek pojawiają się w miejscu wniknięcia czynnika obcego. W różnych doświadczalnych modelach zapalenia otrzewnej, np. wywoływanego tioglikolatem, LPS lub zymosanem, obserwuje się napływ tej populacji komórek do jamy otrzewnej oraz otaczających narządów już w 4 h po podaniu czynnika prozapalnego (Tsujimoto et al., 2002). Neutrofile migrowały do jamy otrzewnej jeszcze do 2 tygodni po zaprzestaniu nastrzyknięć chitozanu. Komórki te wykazywały silne właściwości prozapalne; aktywność MPO była wysoka. Reakcja obwodowa, w krwi, na podanie chitozanu pojawiła się później; wzrost odsetka neutrofilów obserwowano dopiero około 5-6 dnia doświadczenia i była to prawdopodobnie odpowiedź organizmu na wzmożoną migrację tej populacji do tkanek. Jednak wysoki poziom neutrofilów w krwi utrzymywał się krócej niż w jamie otrzewnej; przed upływem 2 tygodni powrócił do 77 6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo poziomu kontrolnego. Jednak spadek masy ciała zwierząt, obserwowany już w 2 dniu doświadczenia, sugeruje silny stan zapalny głównie na początku podawania chitozanu (Granger et al., 2013). Komórkami migrującymi do jamy otrzewnej pod wpływem chitozanu były także monocyty. Tradycyjnie, jama otrzewnej jest źródłem dojrzałych makrofagów tkankowych (Resident Macrophages; Wang et al., 2013), które po stymulacji LPS produkują mediatory stanu zapalnego i cytokiny prozapalne. Podanie chitozanu spowodowało napływ monocytów o niskiej ekspresji F4/80, co wskazuje na ich niedojrzały fenotyp (Hettinger et al., 2013). Komórki te wykazywały również niski poziom markerów związanych z prezentacją antygenu (MHC II i cząsteczek ko-stymulacyjnych) i alternatywną aktywacją (MR, dektyna 1, CD23). Pomimo niskiej ekspresji CD14, komórki te pozostały reaktywne; w hodowli in vitro po podaniu LPS produkowały znaczną ilość NO i IL-6 przy równocześnie obniżonej aktywności arginazy 1 i produkcji IL-10. Sugeruje to, że chitozan spowodował napływ niedojrzałych monocytów pro-zapalnych do jamy otrzewnej, ale sam nie wywołał ich aktywacji ani dojrzewania. Nie zaburzył jednak zdolności komórek do reagowania na czynniki prozapalne. Gdy chitozan nie był już podawany, liczba komórek oraz poziom MCP-1 zaczęły powracać do poziomu kontrolnego. Skład komórkowy płynu otrzewnowego po 3 tygodniach powrócił do stanu fizjologicznego; główne populacje stanowiły limfocyty oraz makrofagi tkankowe. Jednak fenotyp monocytów/makrofagów obecnych w jamie otrzewnej został zmieniony pod wpływem chitozanu; obniżony poziom MHC II, przy wzroście CD86, MR, dektyny 1 oraz, nieznacznie, receptora dla IL-4, sugeruje aktywację tych komórek na drodze alternatywnej (Gordon, 2002). Aktywacja supresorowa tych komórek była jednak niepełna; choć in vitro aktywność arginazy 1 była wysoka, monocyty nie produkowały zwiększonej ilości IL-10. Równocześnie ekspresja CD14 powróciła do poziomu fizjologicznego i wzrosła produkcja NO po stymulacji LPS tych komórek. Wykazano, że makrofagi charakteryzują się dużą plastycznością fenotypową; AAMf pomimo odmiennych funkcji są zdolne ponownie do klasycznej aktywacji w odpowiednim środowisku, np. w odpowiedzi na PAMP lub cytokiny (Stout & Suttles, 2004, Guiducci et al., 2005). Zmieniony przez chitozan fenotyp mógł zatem być modyfikowany przez inne czynniki, jak np. LPS w hodowli, aby zapewnić optymalną odpowiedź na czynniki stymulujące. Chitozan wzbudził produkcję różnych cytokin; początkowo obserwowano równoczesny wzrost wydzielania cytokin prozapalnych (TNF-α, IL-6 i IL-12), jak i regulatorowych (TGF-β i IL-10) w jamie otrzewnej. TNF-α jest cytokiną produkowaną m. in. przez monocyty i 78 6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo neutrofile w odpowiedzi na patogeny i jest bardzo silnym czynnikiem pro-zapalnym; może indukować apoptozę różnych komórek. IL-12 to cytokina charakterystyczna dla odpowiedzi typu Th1 i jest wydzielana głównie przez makrofagi aktywowane klasycznie oraz komórki dendrytyczne. Wykazano, że TNF-α i IL-6 produkowane przez otrzewnowe komórki tuczne powodują napływ neutrofilów oraz wzrost ich aktywności prozapalnej w różnych modelach stanów zapalnych, w tym peritonitis (Doener et al., 2013). Te cytokiny świadczą o ostrym stanie zapalnym oraz pośredniczą w rekrutacji leukocytów. Ich wysoki poziom, zaindukowany przez chitozan, mógł spowodować zatem napływ neutrofilów i monocytów w reakcji na czynnik prozapalny jakim okazał się polimer. Podobne skutki obserwowano w przypadku innych polisacharydów pochodzenia naturalnego; wykazano że niektóre roślinne polimery stymulują in vitro i in vivo produkcję IL-6, IL-12 i TNF-α, co przyczyniało się m. in. do hamowania wzrostu guzów i zwiększenia przeżywalności zwierząt z nowotworami (Bao et al., 2013, Huang et al., 2014). Wyniki przedstawione wcześniej, w Rozdziale 6.1, wskazywały, że chitozan o dużej masie cząsteczkowej może indukować in vitro mechanizmy związane z odpowiedzią Th2/Treg. Jednak po podaniu polimeru in vivo obserwowano raczej mieszaną reakcję; chitozan HMW wzbudził w jamie otrzewnej produkcję IL-6 i IL-10, podobnie jak in vitro, ale równocześnie wzrósł poziom IL-12, jak w przypadku LMW in vitro. Może to być związane z degradacją polimeru i zmianami w jego strukturze, co stwierdzono w analizie NMR. Pojawiające się nowe pasma w widmie chitozanu sugerują zmiany w oddziaływaniach cząsteczkowych tego związku, co mogło mieć konsekwencje w jego właściwościach biologicznych. Polimer podawany był przez 10 dni, aby zapewnić kontakt leukocytów z chitozanem HMW, jednak aktywność komórek mogła powodować pojawianie się mniejszych jego fragmentów o silnych właściwościach prozapalnych (jak chitozan LMW, co wykazano w badaniach in vitro). Z czasem produkcja cytokin prozapalnych w jamie otrzewnej wywołana przez chitozan zaczęła się obniżać; w 3 tygodniu doświadczenia wszystkie powróciły do poziomu kontrolnego. Jednak wpływ chitozanu na wydzielanie cytokin regulatorowych był bardziej długotrwały; poziom IL-10 i TGF-β wzrósł znacząco na początku doświadczenia i do końca doświadczenia był podwyższony. TGF-β to czynnik wzrostu, który wykazuje działanie supresyjne na komórki układu odpornościowego (Yi et al., 2013). Hamuje stan zapalny warunkując równocześnie pojawianie się procesów gojenia tkanek (Kim et al., 2006). Wykazano również, że TGF-β zwiększa produkcję macierzy zewnątrzkomórkowej przez komórki mezenchymalne, co w przeprowadzonym doświadczeniu mogło powodować formowanie się ziarniniaka (Lin et al., 1998). Ponadto wykazano, że chroniczne wydzielanie 79 6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo TGF-β powoduje silne włóknienie tkanek, obserwowane w różnych modelach peritonitis, także u ludzi. Powoduje to zmiany w obrębie jamy otrzewnej; zaburza dyfuzję oraz migrację komórek (Yung et al., 2012). Dlatego, zwiększona produkcja TGF-β wywołana przez chitozan mogła mieć dwojaki efekt: działać jako czynnik regulatorowy ograniczający stan zapalny, ale równocześnie wywoływać bliznowacenie tkanek ograniczając ich funkcje. Lokalne podawanie chitozanu wywołało efekt obwodowy; na początku doświadczenia w krwi obserwowano wzrost poziomu cytokin prozapalnych i regulatorowych. Jednak na poziomie ogólnoustrojowym długotrwały wpływ polimeru był słabiej zaznaczony; spowodował tylko wzrost IL-4, bez podwyższonego poziomu TGF-β i IL-10 jak to było widoczne w jamie otrzewnej. Dynamika komórek w krwi była podobna jak w miejscu podawania chitozanu; silna migracja monocytów, neutrofilów i eozynofilów do jamy otrzewnej spowodowała wzrost odsetka tych populacji w krwi. Dodatkowo podawanie chitozanu zwiększyło odsetek neutrofilów CD14+, co potwierdza ich udział w indukcji stanu zapalnego. Odpowiedź immunologiczna wywoływana przez chitozan bardzo przypomina reakcje, jakie obserwuje się po podaniu zymosanu. Jest to glukan otrzymywany z grzybów, który podany dootrzewnowo wywołuje stan zapalny charakteryzujący się silnym napływem neutrofilów i monocytów (Volman et al., 2005), podobnie jak to obserwowano po podaniu chitozanu. Jednak model stanu zapalnego z wykorzystaniem zymosanu wiąże się z wysoką śmiertelnością zwierząt (30-40%), podczas gdy podanie chitozanu nie wpłynęło znacząco na kondycję myszy, pomimo wysokiej dawki i długiego czasu podawania, i żadne ze zwierząt nie padło w czasie prowadzenia doświadczeń. Podsumowując, wykazano, że chitozan o dużej masie cząsteczkowej wywołuje in vivo stan zapalny jamy otrzewnej charakteryzujący się intensywnym napływem neutrofilów i monocytów oraz równoczesną wysoką produkcją cytokin prozapalnych, jak i regulatorowych. Prozapalny wpływ chitozanu był obserwowany także obwodowo. Pomimo, że indukowany przez chitozan stan zapalny nie był wysoce patogenny, wywołał długotrwałe zmiany w miejscu podania. Przy utrzymującym się wzroście TGF-β i IL-10 wytworzony został ziarniniak otaczający polimer, a monocyty zasiedlające jamę otrzewną wykazywały zmieniony fenotyp, sugerując ich alternatywną aktywację. Efekt in vivo był inny niż ten obserwowany w badaniach in vitro (Rozdział 6.1). Inaczej niż zakładano, chitozan o dużej masie nie indukował mechanizmów typu 2. Może to być efektem degradacji polimeru; pojawiające się krótsze łańcuchy chitozanu powodowały reakcję zapalną typu 1, tak jak sugerowały badania in vitro chitozanu LMW. Chociaż polimer nie wykazywał 80 6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo własności adiuwantu odpowiedzi Th2 zależnej, ze względu na silną aktywację komórek odpowiedzi wrodzonej, zbadano wpływ tego polimeru na przebieg odpowiedzi przeciwpasożytniczej. 81 6.3 Wpływ chitozanu na odpowiedź przeciwpasożytniczą 6.3.1 Wprowadzenie Badano czy stan zapalny wywołany przez chitozan zmienia skuteczność odpowiedzi przeciwpasożytniczej. W tym celu wykonano doświadczenia z wykorzystaniem dwóch gatunków nicieni pasożytniczych: wyłącznie jelitowego Heligmosomoides polygyrus oraz jelitowego z migrującą larwą Trichinella spiralis. Pasożyty te różnią się biologią; cyklem życiowym i miejscem zasiedlania w żywicielu, jednak oba gatunki indukują odpowiedź obronną typu Th2 oraz modyfikują reakcje immunologiczne żywiciela. Heligmosomoides polygyrus (dawniej Nematospiroides dubius, Baylis, 1926) należący do rodziny Trichostrongylidae, to nicień pasożytujący w jelicie myszy i myszowatych. Jego cykl życiowy (Rys. 3.1) odbywa się w jednym żywicielu, do którego rozwijająca się w środowisku zewnętrznym larwa inwazyjna L3 dostaje się drogą pokarmową. Larwy wnikają do błony śluzowej i osiedlają się w mięśniach jelita cienkiego. W ciągu około 8 dni po zarażeniu (dpz) larwy przechodzą 2 linienia osiągając stadium przeddorosłe (L5), które powraca do światła jelita i migruje do dwunastnicy (Liu, 1965). Tam nicienie osiągają dojrzałość i po kopulacji samice składają jaja, które razem z kałem myszy usuwane są do środowiska zewnętrznego, w którym rozwijają się stadia wolno żyjące (Fahmy, 1956). Ze względu na lokalizację pasożyta w żywicielu rozróżnia się 2 fazy zarażenia H. polygyrus: histotropową (tkankową), kiedy larwy L4 znajdują się w mięśniach jelita (ok. 6 dpz) oraz jelitową; która może stać się chroniczna, kiedy formy dorosłe znajdują się w świetle jelita. Zarażenie myszy laboratoryjnej nicieniem H. polygyrus stanowi model do badania zarażeń ludzi tęgoryjcami (Necator americanus i Ancylostoma duodenale) oraz nicieniami żołądkowo-jelitowymi u przeżuwaczy (Haemonchus contortus i Teladorsagia circumcincta), a także mechanizmów immunoregulacji wywoływanej przez pasożyty jelitowe (Reynolds et al., 2012). H. polygyrus wykazuje wysoki stopień dostosowania do żywiciela i hamuje wiele mechanizmów odpowiedzi immunologicznej, zapobiegając usuwaniu go z jelita. Odporność na zarażenie jest warunkowana genetycznie i różni się u różnych szczepów myszy laboratoryjnej; u szczepów odpornych obserwuje się adaptację mniejszej liczby nicieni oraz ich niższą płodność (Zhong & Dobson, 1996). Wnikanie larw do błony śluzowej jelita wzbudza odpowiedź immunologiczną; migrujące do lamina propria i mięśniówki jelita leukocyty mogą zapobiegać zasiedlaniu jelita przez larwy 82 6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie lub wstrzymywać ich rozwój. Nicienie, które osiągają postać dorosłą, powracają do światła jelita i silnie hamują stan zapalny- nie tylko w jelicie, ale także w całym organizmie (Reynolds et al., 2012). 11 dpz do 7 miesięcy Formy dorosłe 6 dpz 2 linienia L4 ŻYWICIEL L3 (inwazyjna) jajo ŚRODOWISKO ZEWNĘTRZNE L2 L1 Rys. 3.1 Schemat cyklu życiowego Heligmosomoides polygyrus. Zdjęcia własne. Zarażenie H. polygyrus wzbudza odpowiedź już na poziomie mechanizmów wrodzonych; następuje aktywacja komórek dendrytycznych, komórek tucznych i makrofagów, a także, choć w mniejszym stopniu, eozynofilów i neutrofilów (Reynolds et al., 2012). Wszystkie te komórki mają właściwości regulacyjne; wpływają na reakcje fizjologiczne jelita oraz pośredniczą w aktywacji komórek odpowiedzi nabytej, ale pełnią także wiele funkcji efektorowych. W czasie zarażenia H. polygyrus obserwuje się aktywację makrofagów na drodze alternatywnej; produkowana przez nie arginaza 1 może bezpośrednio przyczyniać się do zabijania nicieni i obecność AAMf wydaje się być kluczowa dla odpowiedzi obronnej (Anthony et al., 2006). Antygeny H. polygyrus zmieniają również poziom aktywacji komórek dendrytycznych, które zarówno in vivo jak i in vitro, stymulują dojrzewanie limfocytów Th2 oraz aktywację Treg (MacDonald & Maizels, 2008). 83 6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie Trichinella spiralis (Owen, 1835) jest nicieniem pasożytniczym o szerokim kręgu żywicielskim. Jest to pasożyt wewnątrzkomórkowy, wszystkie stadia rozwojowe występują w tym samym żywicielu; od formy inwazyjnej do wykształcenia kolejnego stadium zdolnego do zarażania, nie występują stadia wolno żyjące, a formą inwazyjną jest larwa L1 w cyściekomórce piastunce (Rys. 3.2). Kiedy mięśnie zawierające larwy L1 dostaną się do żołądka kolejnego żywiciela, otoczka cysty zostaje strawiona, a larwy przedostają się do jelita cienkiego, gdzie linieją i już po ok. 36-48 h dojrzewają do formy dorosłej (Shanta & Meerovitch, 1967). Dorosłe nicienie zasiedlają błonę śluzową jelita przewiercając się przez komórki nabłonka, a po kopulacji (ok. 4-5 dpz) samice rodzą larwy, opuszczające osłonki jajowe wewnątrz macicy, do przestrzeni limfatycznych. Nowo narodzone larwy (New-born Larvae; NBL) stadium L1 migrują przez organizm żywiciela docierając do mięśni poprzecznie prążkowanych; tam wnikają do włókien mięśniowych i indukują proces tworzenia komórki-piastunki (nurse-cell; Despommier et al., 1991). Ok. 21-30 dpz larwy L1 uzyskują inwazyjność i są zdolne zarażać kolejnych żywicieli. Zarażenie T. spiralis wywołuje chorobę zwaną trichinellozą, która objawia się już 1-2 dni po zarażeniu dysfunkcją układu pokarmowego. Objawy uogólnione, jak ból mięśni, gorączka, opuchlizna i zmęczenie, obserwuje się 2, czasami aż do 8 tygodni po zarażeniu. Przebieg choroby i nasilenie objawów zależy od ilości połkniętych nicieni, a larwy w mięśniach mogą utrzymywać się przez całe życie żywiciela. Bardzo często choroba pozostaje niezdiagnozowana ze względu na niespecyficzne objawy (Knopp et al., 2012). W warunkach laboratoryjnych, przebieg trichinellozy można badać u myszy lub szczurów zarażanych eksperymentalnie larwami mięśniowymi . Faza jelitowa zarażenia, w czasie której larwy inwazyjne dojrzewają i jako formy dorosłe produkują nowe pokolenie larw, jest zwykle krótka; u większości szczepów myszy nicienie są usuwane z jelita w ciągu paru tygodni (Wakelin & Donachie, 1983). Wyrzucanie pasożytów następuje w wyniku jelitowej mastocytozy oraz eozynofilii i związanej z nimi zwiększonej kurczliwości jelit (Bruschi & Chiumiento, 2012). W fazie mięśniowej, larwy wnikając do włókien mięśniowych, wywołują stan zapalny w mięśniach oraz eozynofilię w krwi (Bruschi et al., 2008). Zarówno w fazie jelitowej, jak i mięśniowej, decydujące dla reakcji obronnej żywiciela jest zaangażowanie limfocytów CD4+ i ich dojrzewanie w kierunku Th2, jednak to komórki odpowiedzi wrodzonej decydują o ich aktywacji (Netea et al., 2005). Podobnie jak w przypadku H. polygyrus, wykazano, że antygeny T. spiralis mają zdolność modulowania aktywności komórek dendrytycznych; indukują ich niepełne dojrzewanie, czego 84 6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie konsekwencją jest aktywacja typu Th2 naiwnych limfocytów CD4+. Taką właściwość, choć o różnym nasileniu, wykazują antygeny wszystkich stadiów T. spiralis (larwy mięśniowe, formy dorosłe i nowonarodzone larwy, Ilic et al., 2012). Podobny wpływ T. spiralis wykazuje na makrofagi; antygeny nicienia hamują aktywność prozapalną tych komórek (Bai et al., 2012). Jednak in vivo pasożyt odmiennie aktywuje makrofagi; w fazie jelitowej obserwuje się hamowanie aktywności tych komórek, a na początku mięśniowej następuje wzrost ich aktywacji; komórki produkują NO i inne mediatory stanu zapalnego sprzyjające adaptacji larwy (Kołodziej-Sobocińska et al., 2006). Larwy mięśniowe stają się inwazyjne po ok. 3 tygodniach i mogą zarazić kolejnego żywiciela Inwazyjne larwy mięśniowe L1 21 dpz do kilku lat Larwy L1 osiedlają się w mięśniach żywiciela (komórka piastunka) Larwy dostają się do jelita cienkiego, gdzie dojrzewają do form dorosłych 2 dpz Formy dorosłe 5- 21 dpz Samice rodzą larwy L1 5- 15 dpz Nowonarodzone larwy (NBL) dostają się do krążenia i migrują po żywicielu Rys. 3.2 Schemat cyklu życiowego Trichinella spiralis. Zdjęcia własne. Zwiększenie aktywności komórek odpowiedzi wrodzonej, głównie DC i makrofagów, pośredniczących w odpowiedzi Th2, może być sposobem na wzmocnienie naturalnej odporności w zarażeniu zarówno H. polygyrus jak i T. spiralis. Ze względu na immunostymulacyjne właściwości chitozanu stwierdzone w Rozdziale 6.1 i 6.2, możliwe że 85 6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie polimer ten poprzez aktywację DC i makrofagów wpłynie na skuteczność odpowiedzi przeciwpasożytniczej. Myszy, którym podawano chitozan, w 5 dniu doświadczenia zarażano jednym z nicieni. Obserwacje przeprowadzano w 2 punktach czasowych odpowiadających obecności w żywicielu różnych stadiów pasożyta, a także różnemu czasowi jaki upłynął od podania chitozanu. Określono wpływ polimeru na poziom zarażenia oraz przebieg odpowiedzi przeciwpasożytniczej na poziomie mechanizmów wrodzonych. Podawanie kwasu adypinowego nie wpływało na badane wskaźniki, dlatego wyniki dla tych grup nie zostały przedstawione. 6.3.2 Wyniki 6.3.2.1 Heligmosomoides polygyrus Chitozan nie wpłynął na poziom zarażenia H. polygyrus; we wszystkich badanych grupach izolowano taką samą liczbę nicieni z jelita cienkiego, zarówno form L4, jak i dorosłych (Wykres 3.1a). Stwierdzono jednak nieznaczne różnice w płodności samic; in vitro nicienie uzyskane od myszy, którym podawano chitozan, produkowały nieznacznie mniej jaj (Wykres 3.1c, p=0,07). Także in vivo między 11 a 21 dpz w próbach koproskopowych produkcja jaj/g kału (Eggs per Gram; EPG) zmieniała się w czasie. Produkcja jaj H. polygyrus wykazuje zmiany skokowe; co 4-6 dni następuje wzrost liczby jaj w kale (Wykres 3.1b grupa Hp oraz Doligalska et al., 2006). Chitozan zmienił ten wzór; szczyt produkcji obserwowano w 15 dpz, a ponowny wzrost nastąpił 2 dni później niż u myszy kontrolnych. Hp Hp/Cht Hp a 180 400 liczba jaj/samicę liczba nicieni 150 120 90 60 30 Hp/Cht 500 c ** 300 200 100 0 6 dpz 22 dpz 0 86 6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie b Hp Hp/Cht 100000 * * EPG 80000 60000 ** 40000 20000 0 11 13 15 17 19 21 dpz Wykres 3.1 Wpływ chitozanu na wskaźniki parazytologiczne w zarażeniu H. polygyrus: a) liczbę nicieni różnych stadiów oraz płodność samic b) in vivo w czasie doświadczenia oraz c) in vitro po 48 h hodowli. * oznaczono p<0,05, ** oznaczono p<0,1 Hp/Cht vs Hp dla danego punktu czasowego doświadczenia, n=4. Właściwości immunostymulacyjne chitozanu, wykazane w Rozdziale 6.2; związane z napływem komórek i produkcją cytokin w jamie otrzewnej, nie wpłynęły na liczbę H. polygyrus w jelicie. Zbadano czy podawanie chitozanu modulowało odpowiedź wrodzoną indukowaną przez pasożyta. 6.3.2.1.1 Reakcja lokalna w jamie otrzewnej W czasie zarażenia H. polygyrus nie obserwuje się silnych zmian w obrębie jamy otrzewnej; w 6 dpz populacja makrofagów otrzewnowych nieznacznie maleje, a w fazie chronicznej obserwuje się lekki napływ monocytów (Wykres 3.2). Pod wpływem chitozanu następuje silny napływ monocytów i neutrofilów oraz nieznacznie zwiększa się liczebność eozynofilów (Tabela 3.1). Zarażenie H. polygyrus osłabiło napływ komórek indukowany przez polimer; do jamy otrzewnej napłynęło ponad 2 razy mniej monocytów i neutrofilów u myszy w 6 dpz niż po samym podaniu chitozanu. Jednocześnie istotnie liczniejsza była populacja makrofagów otrzewnowych, o 40%, choć ani samo zarażenie ani podawanie chitozanu nie wpływały na liczbę tych komórek. W fazie chronicznej, 2 tygodnie po ostatnim podaniu chitozanu, populacja makrofagów otrzewnowych była mniej liczna niż w kontrolnym zarażeniu; zahamowany był napływ komórek (Wykres 3.2), ale ich liczba była podobna jak u myszy 87 6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie niezarażonych (K i Cht2). Także populacja monocytów indukowanych przez chitozan utrzymywała się na 3-krotnie niższym poziomie po zarażeniu. Zarażenie przyspieszyło także spadek liczby neutrofilów; 2 tygodnie po podaniu polimeru utrzymywała się podwyższona liczba tych komórek, natomiast przy równoczesnym zarażeniu powróciła już do stanu kontrolnego. 6 dpz 6 dpz/Cht 22 dpz 22 dpz/Cht Liczba komórek x 106 4 * 3 2 * 1 * * * * 0 Mf otrzewnowe Monocyty Eozynofile Neutrofile Wykres 3.2 Wpływ chitozanu na liczbę komórek w jamie otrzewnej myszy zarażonych H. polygyrus. Czerwoną kreską poziomą oznaczono poziom fizjologiczny, u myszy kontrolnych (K) * oznaczono p<0,05 względem grupy z danego dpz bez chitozanu, n=4. Tabela 3.1 Liczba komórek (x 106) ± SD w jamie otrzewnej myszy, którym podawano chitozan. * oznaczono p<0,05 między grupami (zarażone vs niezarażone). 6 dpz/ Cht Cht1 22 dpz/ Cht Cht2 Mf otrzewnowe *1,05 ± 0,11 0,6 ± 0,07 0,76 ± 0,07 0,83 ± 0,15 Monocyty *0,82 ± 0,17 1,71 ± 0,05 *0,07 ± 0,03 0,22 ± 0,04 Eozynofile 0,18 ± 0,01 0,24 ± 0,04 *0,01 ± 0,01 0,02 ± 0,01 Neutrofile *2,40 ± 0,26 4,16 ± 0,59 0,01 ± 0,01 0,02 ± 0,00 Monocyty jamy otrzewnej pod wpływem chitozanu miały także zmieniony fenotyp (Wykres 3.3). W fazie jelitowej zarażenia monocyty ulegają aktywacji, o czym świadczy zwiększona ekspresja MHC II (do prawie 100% komórek) i CD86, co zostało zahamowane przez chitozan (Wykres 3.3a). Jednak obserwowano nieznaczną stymulację komórek przez 88 6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie pasożyta; monocyty izolowane od myszy zarażonych, którym podawano chitozan, miały wyższy poziom MHC II (p<0,1), CD80 i CD86, niż u myszy, którym podawano tylko polimer (Tabela 3.2). W fazie jelitowej poziom markerów związanych z prezentacją antygenów jest podobny jak w fazie histotropowej. W tym czasie chitozan, 2 tygodnie po podaniu, utrzymuje obniżoną ekspresję tych cząsteczek, ale zarażenie przywróciło aktywację komórek (Wykres 3.3a i Tabela 3.2). Także ekspresja pozostałych markerów aktywacji monocytów w czasie zarażenia była inna niż u myszy, którym podawano sam polimer (Tabela 3.2). Początkowo podanie chitozanu, jak i zarażenie H. polygyrus powodują obniżenie odsetka komórek CD14+ i efekt ten został pogłębiony przy równoczesnym zarażeniu i podaniu chitozanu osiągając jedynie 74% (Wykres 3.3a). W fazie jelitowej zarażenia następuje dalszy spadek ekspresji CD14, ale podanie chitozanu odwróciło ten efekt; komórek CD14+ było o 8% więcej niż w kontrolnym zarażeniu. W fazie histotropowej zarażenia zwiększa się nieznacznie poziom ekspresji niektórych markerów związanych z alternatywną aktywacją makrofagów- dektyny 1 i CD23 (p<0,1, Wykres 3.3b). Podanie chitozanu spowodowało w tym czasie 6-krotny wzrost poziomu IL-4R oraz spadek tylko dektyny 1, choć u myszy niezarażonych polimer bardzo silnie obniża ekspresję wszystkich tych markerów. W fazie jelitowej zarażenia, odsetek komórek pozytywnych dla markerów alternatywnie aktywowanych makrofagów jest podobny jak u myszy niezarażonych (o 1/3 więcej jest tylko komórek CD23+), a podanie chitozanu, silniej niż u myszy niezarażonych, dodatkowo zwiększył poziom dektyny 1. a 6 dpz % 6 dpz/Cht 22 dpz 22 dpz/Cht 100 * * 80 * 60 40 20 0 MHC II CD80 CD86 89 6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie b 6 dpz % 100,0 6 dpz/Cht 22 dpz 22 dpz/Cht * * * 80,0 * 60,0 40,0 * 20,0 0,0 CD14 IL-4R MR Dektyna 1 CD23 Wykres 3.3 Wpływ chitozanu na fenotyp otrzewnowych monocytów/makrofagów myszy zarażonych H. polygyrus; a) odsetek komórek pozytywnych dla markerów związanych z prezentacją antygenu, b) odsetek komórek pozytywnych dla markerów związanych z rodzajem aktywacji. Czerwoną kreską poziomą oznaczono poziom fizjologiczny. * oznaczono p<0,05 względem grupy z danego dpz bez chitozanu. Tabela 3.2 Odsetek ± SD monocytów pozytywnych dla wybranych markerów powierzchniowych w jamie otrzewnej myszy, którym podawano chitozan. * oznaczono p<0,05 między grupami (zarażone vs niezarażone). 6 dpz/ Cht Cht1 22 dpz/ Cht Cht2 MHC II *80,1 ± 4,9 62,5 ± 5,9 *95,1 ± 3,4 57,5 ± 7,7 CD80 *62,3 ± 8,7 47,7 ± 5,8 86,1 ± 5,1 81,8 ± 0,4 CD86 *55,3 ± 7,2 33,0 ± 4,2 *85,9 ± 3,8 44,6 ± 1,8 CD14 *74,1 ± 3,8 93,1 ± 0,7 88,9 ± 1,9 89,7 ± 0,7 IL-4R *18,7 ± 6,6 0,7 ± 0,2 5,1 ± 2,1 5,7 ± 0,2 MR *41,9 ± 5,8 19,4 ± 3,3 59,4 ± 4,9 50,2 ± 0,8 Dektyna 1 45,3 ± 7,1 39,6 ± 5,7 *80,4 ± 5,9 54,7 ± 0,6 CD23 *20,9 ± 1,9 9,3 ± 1,2 *27,5 ± 1,0 21,1 ± 1,5 Obserwowano także wpływ chitozanu na lokalną produkcję cytokin w czasie zarażenia (Wykres 3.4). W fazie histotropowej, H. polygyrus indukuje wzrost produkcji IL-6, co zostało wzmocnione przez chitozan i to 2-krotnie silniej niż u myszy niezarażonych (Tabela 3.3). W czasie podawania chitozanu następuje wzrost poziomu także chemokiny MCP-1, prozapalnej 90 6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie IL-12 oraz regulatorowego TGF-β, które były hamowane w czasie zarażenia. Chitozan zablokował natomiast produkcję IL-4 w czasie zarażenia utrzymując ją na poziomie kontrolnym, ale zwiększył poziom IL-10 i to 2-krotnie silniej niż u myszy niezarażonych, choć sam H. polygyrus nie wpływa istotnie na produkcję tego czynnika na początku inwazji. W fazie jelitowej zarażenia obserwuje się w jamie otrzewnej wzrost produkcji IL-4 i IL-10, a chitozan zatrzymał produkcję IL-4, choć sam polimer o 20% stymulował wydzielanie tej cytokiny. Dwa tygodnie po podaniu chitozanu utrzymuje się także podwyższony poziom TGF-β i IL-12, ale zarażenie obniżyło produkcję tych czynników. 6 dpz 6 dpz/Cht 22 dpz 22 dpz/Cht 1600 * pg/ml 1200 * 800 400 * * * * * * 0 MCP-1 IL-1 IL-12 IL-4 TGF-β IL-10 IL-6 Wykres 3.4 Wpływ chitozanu na poziom cytokin w płynie otrzewnowym myszy zarażonych H. polygyrus. Czerwoną kreską poziomą oznaczono poziom fizjologiczny. * oznaczono p<0,05 względem grupy z danego dpz bez chitozanu, n=4. Tabela 3.3 Stężenie (pg/ml) ± SD cytokin w jamie otrzewnej myszy, którym podawano chitozan. * oznaczono p<0,05 między grupami (zarażone vs niezarażone). 6 dpz/ Cht Cht1 22 dpz/ Cht Cht2 MCP-1 *212,2 ± 21,4 426,1 ± 25,3 41,6 ± 7,5 40,6 ± 6,9 IL-1 43,6 ± 9,8 35,2 ± 11,8 23,4 ± 3,8 26,8 ± 7,2 IL-12 *47,8 ± 9,9 162,6 ± 29,5 *60,6 ± 13,9 87,8 ± 5,2 IL-4 129,6 ± 7,1 109,0 ± 12,1 *81,3 ± 8,6 103,8 ± 12,8 TGF-β 106,9 ± 9,0 1004,8 ± 49,1 *167,4 ± 15,4 511,5 ± 34,1 IL-10 *833,6 ± 32,9 364,2 ± 26,1 230,1 ± 64,5 222,6 ± 42,9 IL-6 *1240,8 ± 70,7 649,3 ± 61,1 39,1 ± 10,0 45,8 ± 8,5 91 6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie 6.3.2.1.2 Reakcja obwodowa w krwi Podanie chitozanu spowodowało nieznaczne zmiany odpowiedzi na poziomie obwodowym, w krwi myszy zarażonych. Odsetek komórek różnych populacji u myszy, którym podawano chitozan w 6 i 22 dpz był taki jak u myszy niezarażonych po takim samym czasie od podania polimeru (Tabela 3.4). Odpowiedź na polimer nie została zmodyfikowana przez zarażenie; wzrósł odsetek eozynofilów i trzykrotnie zwiększył się odsetek monocytów i neutrofilów, przy równoczesnym zmniejszeniu odsetka limfocytów w krwi (Wykres 3.5). W 22 dpz i 2 tygodnie po podaniu chitozanu odsetek komórek powrócił do stanu fizjologicznego. 6 dpz % 6 dpz/Cht 22 dpz 22 dpz/Cht 100 80 * 60 40 20 * * * 0 Monocyty Eozynofile Neutrofile Limfocyty Wykres 3.5 Wpływ chitozanu na odsetek komórek różnych populacji w krwi myszy zarażonych H. polygyrus. Czerwoną kreską poziomą oznaczono poziom fizjologiczny. * oznaczono p<0,05 względem grupy z danego dpz bez chitozanu, n=4. Tabela 3.4 Odsetek ± SD komórek różnych populacji w krwi myszy, którym podawano chitozan. * oznaczono p<0,05 między grupami (zarażone vs niezarażone). 6 dpz/ Cht Cht1 22 dpz/ Cht Cht2 Monocyty 11,9 ± 2,2 13,3 ± 4,2 4,8 ± 2,4 4,5 ± 2,5 Eozynofile 1,3 ± 0,4 1,6 ± 0,6 0,8 ± 0,2 0,9 ± 0,1 Neutrofile 19,5 ± 1,0 17,5 ± 3,0 1,9 ± 0,7 1,9 ± 0,4 Limfocyty 59,7 ± 4,3 50,3 ± 8,8 90,5 ± 4,1 84,4 ± 11,7 92 6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie W fazie histotropowej zarażenia następuje ponad 3-krotny wzrost poziomu TGF-β, który został zahamowany po podaniu chitozanu, chociaż sam polimer także indukuje syntezę tej cytokiny (Wykres 3.6 i Tabela 3.5). Obserwowano także 2-krotnie niższy niż w kontroli (grupa Cht1) poziom IL-10 po chitozanie w czasie zarażenia. Równocześnie znacznie wzrósł poziom IL-6, 5-ciokrotnie bardziej niż u myszy niezarażonych, chociaż zarażenie nie wpływa na tę cytokinę. Produkcja pozostałych cytokin we wszystkich grupach była na poziomie fizjologicznym. W fazie jelitowej zarażenia 2-krotnie zwiększa się wydzielanie IL-10, a podanie chitozanu utrzymało produkcję tej cytokiny na poziomie fizjologicznym. Zamiast tego, zaobserwowano wzrost produkcji TGF-β podobnie jak u myszy niezarażonych po długotrwałym podawaniu chitozanu. 6 dpz 6 dpz/Cht 22 dpz 22 dpz/Cht 2000 * 1600 pg/ml 1200 * * 800 400 * * * 0 IL-1 IL-12 IL-4 TGF-β IL-10 IL-6 Wykres 3.6 Wpływ chitozanu na poziom cytokin w krwi myszy zarażonych H. polygyrus. Czerwoną kreską poziomą oznaczono poziom fizjologiczny. * oznaczono p<0,05 względem grupy z danego dpz bez chitozanu, n=4. Tabela 3.5 Stężenie (pg/ml) ± SD cytokin w krwi myszy, którym podawano chitozan. * oznaczono p<0,05 między grupami (zarażone vs niezarażone). 6 dpz/ Cht Cht1 22 dpz/ Cht Cht2 IL-1 52,1 ± 19,4 71,4 ± 21,8 *49,6 ± 7,1 83,3 ± 12,5 IL-12 293,5 ± 72,6 200,8 ± 29,7 147,5 ± 75,3 131,1 ± 42,9 IL-4 44,8 ± 6,7 52,9 ± 9,9 105,5 ± 76,6 100,9 ± 51,4 TGF-β *218,5 ± 2,6 488,7 ± 19,5 588,3 ± 118,9 628,3 ± 74,6 93 6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie IL-10 *890,0 ± 13,3 1729,5 ± 51,2 547,3 ± 52,2 553,6 ± 81,5 IL-6 *1626,7 ± 185,4 472,2 ± 36,9 227,6 ± 40,5 272,9 ± 56,8 U myszy zarażonych H. polygyrus, którym podawano chitozan obserwowano wpływ polimeru na odpowiedz przeciwpasożytniczą, jednak inwazja pasożytnicza także modyfikowała przebieg stanu zapalnego indukowanego przez chitozan. Napływ komórek do jamy otrzewnej w odpowiedzi na chitozan był słabszy u myszy zarażonych. Fenotyp monocytów otrzewnowych pod wpływem chitozanu wskazywał na ich niski stopień dojrzałości, jednak zarażenie nieznacznie powodowało ich aktywację. Zarażenie obniżyło także lokalną produkcję IL-12 i TGF-β w odpowiedzi chitozan, ale zwiększyło poziom IL-6 i IL-10. Pomimo zmian w odpowiedzi immunologicznej wywołanej przez chitozan, podanie polimeru nie wpłynęło na poziom zarażenia. 6.3.2.2 Trichinella spiralis Podanie chitozanu istotnie wpłynęło na poziom zarażenia T. spiralis; od myszy, którym podawano chitozan, izolowano więcej nicieni obu stadiów (Wykres 3.7a). W fazie jelitowej izolowano o 40% więcej form dorosłych od myszy, którym podawano chitozan. Płodność samic in vitro nie została zmieniona (Wykres 3.7b), jednak w fazie mięśniowej obserwowano dwa razy więcej larw L1 w mięśniach żywiciela (Wykres 3.7a). Ts a Ts Ts/Cht b Ts/Cht 50 150 dorosłe/ L1 x 102 120 * 90 60 30 0 liczba NBL/samicę * 40 30 20 10 0 5 dpz 30 dpz Wykres 3.7 Wpływ chitozanu na a) liczbę nicieni T. spiralis różnych stadiów oraz b) płodność samic in vitro po 24 h hodowli. * oznaczono p<0,05 względem grupy kontrolnej dla danego dpz, n=4. 94 6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie Podawanie dootrzewnowo chitozanu, jak wykazano w Rozdziale 6.2, wywołuje silny napływ komórek oraz produkcję cytokin w jamie otrzewnej. W przypadku T. spiralis takie warunki immunologiczne okazały się korzystne dla pasożyta i sprzyjały jego przeżywaniu. Zbadano jak chitozan wpłynął na odpowiedź immunologiczną wzbudzaną przez pasożyta. 6.3.2.2.1 Reakcja lokalna w jamie otrzewnej Chitozan spowodował napływ komórek do jamy otrzewnej w fazie jelitowej zarażenia. Obserwowano intensywną migrację neutrofilów, monocytów i eozynofilów, a populacja makrofagów otrzewnowych znacznie się zmniejszyła (Wykres 3.8). Jednak dynamika komórek była podobna jak u myszy niezarażonych, w czasie podawania chitozanu; odpowiedź na polimer zdominowała tę indukowaną przez nicienia (Tabela 3.6). Zarażenie dodatkowo obniżyło 5-krotnie liczbę makrofagów otrzewnowych, czego nie obserwowano w czasie kontrolnego zarażenia ani po podaniu chitozanu. Po dłuższym czasie podawania obserwowano silniejszy wpływ chitozanu na odpowiedź przeciwpasożytniczą; podobny jak u myszy niezarażonych. W fazie mięśniowej inwazji T. spiralis następuje napływ komórek do jamy otrzewnej; eozynofilów oraz monocytów, a także znacząco (10-krotnie) zwiększa się populacja otrzewnowych makrofagów. Podanie chitozanu istotnie zahamowało migrację komórek i ich liczba pozostała na poziomie kontrolnym; polimer hamował reakcje wzbudzane przez larwy L1. 5 dpz 5dpz /Cht 30 dpz 30dpz /Cht 7 * Liczba komórek x106 6 5 4 3 * 2 1 * * 0 Mf otrzewnowe * * * Eozynofile Monocyty Neutrofile Wykres 3.8 Wpływ chitozanu na liczbę komórek w jamie otrzewnej myszy zarażonych T. spiralis. Czerwoną kreską poziomą oznaczono poziom fizjologiczny. * oznaczono p<0,05 względem grupy z danego dpz bez chitozanu, n=5. 95 6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie Tabela 3.6 Liczba komórek (x 106) ± SD w jamie otrzewnej myszy, którym podawano chitozan. * oznaczono p<0,05 między grupami (zarażone vs niezarażone). 5 dpz/ Cht Cht1 30 dpz/ Cht Cht3 Mf otrzewnowe *0,13 ± 0,06 0,46 ± 0,04 0,93 ± 0,49 0,83 ± 0,15 Monocyty 1,59 ± 0,54 1,47 ± 0,42 0,20 ± 0,11 0,22 ± 0,09 Eozynofile 0,35 ± 0,24 0,21± 0,06 0,06 ± 0,04 0,02 ± 0,00 Neutrofile 4,12 ± 1,76 3,66 ± 1,34 0,23 ± 0,20 0,22 ± 0,04 Monocyty obecne w jamie otrzewnej miały także zmieniony przez chitozan fenotyp (Wykres 3.9). W fazie jelitowej zarażenia następuje wzrost odsetka komórek pozytywnych dla MHC II oraz ponad 2-krotny spadek CD86 (Wykres 3.9a). Podanie chitozanu w tym czasie powoduje spadek ekspresji markerów związanych z prezentacją antygenu; w czasie zarażenia zahamowało wzrost poziomu MHC II, silniej obniżyło CD86, a dodatkowo wpłynęło na 2-krotne obniżenie CD80 i to silniej niż u myszy niezarażonych (Cht1; Tabela 3.7). W fazie mięśniowej pasożyt utrzymuje wysoką ekspresję MHC II, a chitozan, inaczej niż w grupie kontrolnej, nie zaburzył tego procesu. Poziom CD80 był taki sam we wszystkich 3 grupach, a CD86, które jest obniżane w czasie zarażenia, pod wpływem chitozanu nie zwiększyło poziomu ekspresji, choć miało to miejsce w grupie kontrolnej (Cht3). Także poziom markerów związanych z rodzajem aktywacji monocytów został zmieniony przez chitozan (Wykres 3.9b). Chitozan w fazie jelitowej zarażenia obniżył odsetek monocytów CD14+, podobnie jak po samym podaniu polimeru (Tabela 3.7). Nicienie wywołują wzrost ekspresji niektórych markerów związanych z alternatywną aktywacją monocytów: dektyny 1 i IL-4R. Chitozan, który powoduje napływ niedojrzałych monocytów, spowodował obniżenie odsetka komórek pozytywnych dla MR, dektyny 1 i CD23, ale nie IL-4R; wpływ zarażenia na poziom tego markera był silniejszy i odsetek komórek IL-4R+ był taki jak w kontrolnym zarażeniu. W fazie mięśniowej następuje nieznaczna redukcja odsetka komórek CD14+; efekt ten został dodatkowo pogłębiony przez chitozan, choć przy podawaniu polimeru u myszy niezarażonych, ekspresja tego markera powróciła do poziomu kontrolnego. Indukcja IL-4R pojawiająca się w fazie mięśniowej została dodatkowo wzmocniona przez chitozan (o ok. 25%), natomiast poziom dektyny 1 i CD23 był podobny w obu grupach myszy zarażonych, a także porównywalny z myszami niezarażonymi, którym podawano chitozan. Jednak odsetek komórek MR+, który jest obniżony w czasie zarażenia wzrósł 2-krotnie po chitozanie, tak jak u myszy kontrolnych. 96 6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie 5 dpz a 5dpz /Cht 30 dpz 30dpz /Cht 120 100 * 80 60 * * 40 * 20 0 MHC II b CD80 5 dpz 120 5dpz /Cht CD86 30 dpz 30dpz /Cht * 100 * * * 80 60 * 40 * * 20 0 CD14 IL-4R MR Dektyna 1 CD23 Wykres 3.9 Wpływ chitozanu na fenotyp otrzewnowych monocytów/makrofagów myszy zarażonych T. spiralis; a) odsetek komórek pozytywnych dla markerów związanych z prezentacją antygenu, b) odsetek komórek pozytywnych dla markerów związanych z rodzajem aktywacji. Czerwoną kreską poziomą oznaczono poziom fizjologiczny. * oznaczono p<0,05 względem grupy z danego dpz bez chitozanu, n=5. Tabela 3.7 Odsetek ± SD monocytów pozytywnych dla wybranych markerów powierzchniowych w jamie otrzewnej myszy, którym podawano chitozan. * oznaczono p<0,05 między grupami (zarażone vs niezarażone). 5 dpz/ Cht Cht1 30 dpz/ Cht Cht3 MHC II 55,4 ± 13,0 66,0 ± 6,2 86,3 ± 5,6 86,2 ± 2,9 CD80 *39,2 ± 2,8 47,7 ± 3,8 94,9 ± 2,7 96,9 ± 0,6 97 6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie CD86 14,3 ± 1,3 15,9 ± 2,1 36,0 ± 3,2 36,7 ± 1,3 CD14 94,2 ± 0,7 93,1 ± 0,7 *74,0 ± 5,8 88,3 ± 2,2 IL-4R *13,4 ± 3,8 2,6 ± 1,0 *67,2 ± 4,8 13,7 ± 1,4 MR *32,5 ± 6,1 21,2 ± 2,7 66,5 ± 6,8 57,5 ± 8,7 Dektyna 1 21,5 ± 7,0 15,4 ± 6,3 *34,2 ± 1,0 57,1 ± 2,1 CD23 6,6 ± 3,3 5,6 ± 0,8 *27,1 ± 4,7 23,0 ± 1,8 Podawanie chitozanu istotnie wpłynęło na produkcję cytokin w jamie otrzewnej myszy zarażonych (Wykres 3.10). W fazie jelitowej obserwuje się tylko wzrost TGF-β, natomiast podanie chitozanu spowodowało silny wzrost produkcji cytokin prozapalnych (oprócz IL-1β). Kinetyka zmian była taka jak u myszy niezarażonych, którym podawano chitozan, jednak w niektórych przypadkach osiągane stężenie cytokin było inne u myszy zarażonych (Tabela 3.8). T. spiralis wzmocnił 2-krotnie produkcję MCP-1 zaindukowaną przez chitozan, choć samo zarażenie nie wpływa na poziom tej chemokiny. Ponadto pasożyt zahamował nieco wydzielanie IL-1, IL-12 i IL-6 stymulowanych przez chitozan, mimo że w czasie kontrolnego zarażenia nie obserwuje się spadku produkcji tych cytokin. Poziom cytokin regulatorowych, pomimo indukcji syntezy TGF-β przez pasożyta, nie uległ zmianie względem myszy niezarażonych po podaniu chitozanu. W fazie mięśniowej następuje zwiększenie produkcji MCP-1 i IL-6, a chitozan dodatkowo zwiększył poziom tych cytokin, pomimo że u myszy niezarażonych (grupa Cht3) ich produkcja wróciła już w tym czasie do poziomu kontrolnego. Indukcja IL-10 następuje w tym czasie zarówno pod wpływem zarażenia, jak i chitozanu, i efekt ten nałożył się; produkcja IL-10 miała w grupie zarażonej po chitozanie najwyższy poziom, 6-krotnie wyższy od fizjologicznego. Inaczej było w przypadku IL-4; pomimo że chitozan zwiększał jej produkcję, w czasie zarażenia jej poziom się nie zmienił. 98 6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie 5 dpz 5 dpz /Cht 30 dpz 30 dpz /Cht 500 * pg/ml 400 300 * * * 200 * * 100 * * 0 MCP-1 IL-1β IL-12 IL-4 TGF-β IL-10 IL-6 Wykres 3.10 Wpływ chitozanu na poziom cytokin w płynie otrzewnowym myszy zarażonych T. spiralis. Czerwoną kreską poziomą oznaczono poziom fizjologiczny. * oznaczono p<0,05 względem grupy z danego dpz bez chitozanu, n=5. Tabela 3.8 Stężenie (pg/ml) ± SD cytokin w jamie otrzewnej myszy, którym podawano chitozan. * oznaczono p<0,05 między grupami (zarażone vs niezarażone). 5 dpz/ Cht Cht1 30 dpz/ Cht Cht3 MCP1 *199,9 ± 25,3 93,8 ± 16,0 *146,2 ± 22,7 9,9 ± 3,6 IL-1β *17,9 ± 0,6 23,9 ± 1,0 *27,0 ± 4,6 42,0 ± 4,7 IL-12 *209,3 ± 11,8 312,2 ± 29,5 181,5 ± 13,7 232,7 ± 33,7 IL-4 24,6 ± 7,3 23,6 ± 6,8 *28,6 ± 4,6 60,6 ± 5,0 TGF-β 359,7 ± 24,4 376,2 ± 29,1 14,0 ± 1,9 15,1 ± 1,4 IL-10 327,5 ± 31,0 282,8 ± 26,1 *70,8 ± 25,7 36,9 ± 6,7 IL-6 27,6 ± 5,2 39,3 ± 12,6 *99,4 ± 21,2 6,1 ± 0,8 6.3.2.2.2 Reakcja obwodowa w krwi Chitozan wpłynął na odsetek komórek różnych populacji w krwi tylko w czasie fazy jelitowej zarażenia (Wykres 3.11). Zwiększył się 2-krotnie odsetek monocytów i neutrofilów oraz nieznacznie eozynofilów, ale zmiany te były na takim samym poziomie jak u myszy niezarażonych (Tabela 3.9), choć samo zarażenie indukuje wzrost odsetka monocytów, a zmniejsza liczbę eozynofilów w krwi. W fazie mięśniowej odsetek komórek we krwi był taki 99 6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie sam w obu grupach myszy zarażonych; inwazja spowodowała wzrost odsetka eozynofilów i chitozan nie zaburzył tego procesu. 5 dpz % 100 5 dpz/Cht 30 dpz 30 dpz/Cht 80 * 60 40 20 * * * 0 Monocyty Neutrofile Eozynofile Limfocyty Wykres 3.11 Wpływ chitozanu na odsetek komórek różnych populacji w krwi myszy zarażonych T. spiralis. Czerwoną kreską poziomą oznaczono poziom fizjologiczny. * oznaczono p<0,05 względem grupy z danego dpz bez chitozanu, n=5. Tabela 3.9 Odsetek ± SD komórek różnych populacji w krwi myszy, którym podawano chitozan. * oznaczono p<0,05 między grupami (zarażone vs niezarażone). 5 dpz/ Cht Cht1 30 dpz/ Cht Cht3 Monocyty 13,5 ± 3,1 13,3 ± 3,0 10,5 ± 3,2 6,1 ± 1,7 Neutrofile 13,5 ± 3,2 17,5 ± 0,7 13,7 ± 1,3 14,1 ± 3,7 Eozynofile 1,3 ± 0,3 1,6 ± 0,3 *11,6 ± 2,9 4,4 ± 2,8 Limfocyty 49,9 ± 11,7 50,3 ± 8,2 60,7 ± 5,3 72,3 ± 7,0 Wpływ chitozanu na poziom cytokin w krwi myszy zarażonych obserwowany był tylko w przypadku cytokin regulatorowych (Wykres 3.12). W fazie jelitowej polimer zwiększył aż 100-krotnie wydzielanie IL-10; silniej niż to miało miejsce u myszy niezarażonych (Tabela 3.10), choć nie obserwuje się indukcji tej cytokiny przez samego pasożyta. Równocześnie nie obserwowano zwiększonej produkcji TGF-β pod wpływem chitozanu; zarażenie zahamowało ten proces. Efekt ten nie był obserwowany w fazie mięśniowej; w czasie zarażenia następuje wtedy zmniejszenie wydzielania TGF-β, a chitozan zaindukował produkcję tej cytokiny, choć słabiej niż u myszy niezarażonych. 100 6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie 5 dpz 5 dpz/Cht 30 dpz 30 dpz/Cht 9000 * 7500 * pg/ml 6000 4500 3000 1500 0 IL-1 IL-6 IL-12 IL-4 IL-10 TGF-β Wykres 3.12 Wpływ chitozanu na poziom cytokin w krwi myszy zarażonych T. spiralis. Czerwoną kreską poziomą oznaczono poziom fizjologiczny. * oznaczono p<0,05 względem grupy z danego dpz bez chitozanu, n=5. Tabela 3.10 Stężenie (pg/ml) ± SD cytokin w krwi myszy, którym podawano chitozan. * oznaczono p<0,05 między grupami (zarażone vs niezarażone). 5 dpz/ Cht Cht1 30 dpz/ Cht Cht3 IL-1 183,5 ± 20,5 202,3 ± 11,8 266,0 ± 28,1 251,0 ± 26,2 IL-6 1524,2 ± 262,6 1248,1 ± 25,3 553,1 ± 11,1 606,4 ± 55,4 IL-12 165,2 ± 62,8 196,2 ± 74,8 434,9 ± 22,9 404,1 ± 25,2 IL-4 35,2 ± 4,0 28,3 ± 5,3 55,8 ± 6,9 68,0 ± 15,9 IL-10 *6189,4± 551,9 3085,9 ± 152,0 514,9 ± 18,7 453,2 ± 39,5 TGF-β *917,1 ± 113,8 5130,2 ± 391,3 *5952,2 ± 297,0 8163,4 ± 447,6 W czasie zarażenia T. spiralis obserwowano podobny wpływ chitozanu jak u myszy niezarażonych. Do jamy otrzewnej w fazie jelitowej po podaniu chitozanu napływały niedojrzałe monocyty, neutrofile i eozynofile oraz występowało wysokie stężenie cytokin prozapalnych i regulatorowych. W fazie mięśniowej 3 tygodnie po podaniu chitozanu obserwowano zahamowanie napływu komórek, jednak obecne w jamie otrzewnej komórki reagowały na antygeny pasożytnicze; następowała produkcja cytokin (MCP-1, IL-6 i IL-10) oraz ekspresja markerów powierzchniowych (MHC II, CD80 i IL-4R). 101 6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie 6.3.3 Dyskusja Badano, jak chitozan wpływa na skuteczność odpowiedzi przeciwpasożytniczej wobec dwóch gatunków nicieni: T. spiralis oraz H. polygyrus. Stan zapalny wywołany przez chitozan (scharakteryzowany w Rozdziale 6.2) miał różny wpływ na poziom zarażenia; nie zmienił liczby nicieni H. polygyrus, ale był korzystny dla T. spiralis. Większa liczba dorosłych form T. spiralis dojrzewała w jelicie myszy, którym podawano chitozan. Mimo, że płodność samic nie została zmieniona, to większa liczba nicieni dostarczała więcej larw L1, które migrowały przez narządy. Efekt ten był widoczny 3 tygodnie później; ponad dwukrotnie więcej larw L1 izolowano z mięśni myszy, które otrzymały chitozan podczas fazy jelitowej zarażenia. Wzrost liczby komórek w jamie otrzewnej pod wpływem chitozanu wskazuje, że dzięki jego właściwościom chemotaktycznym komórki obronne gromadziły się raczej w miejscu podania polimeru, a nie docierały do jelita czy nie podążały za migrującymi larwami. Mogło to obniżyć poziom stanu zapalnego wokół larw, który zazwyczaj cechuje eozynofilia i napływ komórek tucznych (Helmby & Grencis, 2002). W przypadku H. polygyrus, choć poziom zarażenia nie został zmieniony pod wpływem polimeru, pojawiający się stan zapalny nie był obojętny dla nicieni i zmienił ich płodność. Zaburzona była produkcja jaj in vivo, a także in vitro, gdy nicienie nie znajdowały się już w żywicielu, w środowisku stanu zapalnego. Komórki napływające do jamy otrzewnej pod wpływem chitozanu, choć reagowały na stymulację in vitro, nie zapewniły ochrony przed T. spiralis. Możliwe, że chitozan był silniejszym bodźcem dla komórek niż pasożyty, przez co usuwanie polimeru było pierwszoplanowe dla migrujących komórek. Z tego powodu odpowiedź przeciwpasożytnicza została zakłócona, być może przez zaburzenie równowagi immunologicznej. Usuwanie dorosłych nicieni podczas fazy jelitowej zarażenia T. spiralis, zależy głównie od działania komórek tucznych i limfocytów T CD4+, które są aktywowane przez cytokiny Th2-zależne; IL-4 i IL-13 (Helmby & Grencis, 2002). Wykazano, że odpowiedź Th1 i Th2 hamują się wzajemnie, tj. IL-12 zapobiega odpowiedzi Th2, która pośredniczy w usuwaniu pasożyta (Finkelman et al., 1994), dlatego indukowana przez chitozan IL-12 mogła obniżyć obronną odpowiedź Th2. Choć podczas zarażenia produkcja IL-12 była niższa niż w czasie podawania polimeru u myszy niezarażonych, jej poziom był wyższy niż w stanie fizjologicznym sugerując dominację odpowiedzi typu 1. Mogło to sprzyjać osiedlaniu się większej liczby nicieni i doprowadzić do wydłużenia fazy jelitowej, co później przyczyniło się do wzrostu liczby larw L1 w mięśniach. Dodatkowo, chitozan zaburzył pojawiający się w fazie mięśniowej napływ komórek (makrofagów) do jamy otrzewnej. Prawdopodobnie było to związane z chronicznym wysokim poziomem TGF-β, który mógł powodować bliznowacenie 102 6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie tkanek (w tym błony otrzewnej, Lin et al., 1998, Yung et al., 2012), co ograniczyło później migrację komórek w 30 dpz. Efekt ten był raczej lokalny, gdyż wzrost odsetka eozynofilów w krwi nie został zmieniony przez chitozan. Wykazano, że makrofagi oraz monocyty i produkowany przez nie NO odgrywają bardzo ważną rolę w czasie ustalania się poziomu zarażenia w fazie mięśniowej; ich napływ koreluje ze zmniejszeniem liczby larw mięśniowych między 20 a 60 dpz (Kołodziej-Sobocińska et al., 2006). Dlatego zahamowanie napływu tych komórek oraz ich aktywności pro-zapalnej, o czym świadczy obecność markerów alternatywnej aktywacji, i to pomimo wysokiej produkcji MCP-1, mogło się dodatkowo przyczynić do wyższego poziomu zarażenia T. spiralis po podaniu chitozanu. Odmiennie, w przypadku zarażenia H. polygyrus podawanie chitozanu w czasie zarażenia nie wywołało tak silnego stanu zapalnego typu Th1. Dlatego nie została zakłócona odpowiedź przeciwpasożytnicza i poziom zarażenia, zarówno w 6 jak i 22 dpz pozostały bez zmian. Co ciekawe, niektóre badania wskazują, że zarażenia pasożytnicze mogą wpływać na zapalenie otrzewnej, łagodząc objawy i zwiększając przeżywalność żywiciela (Sutherland et al., 2011). W przeprowadzonym badaniu, także obserwowano hamujący wpływ nicieni na stan zapalny. Zarażenie H. polygyrus istotnie zmniejszyło napływ monocytów i neutrofilów do jamy otrzewnej wywoływany przez chitozan, pomimo bardzo wysokiego stężenia IL-6; cytokiny rekrutującej neutrofile (Fielding et al., 2008). W fazie histotropowej nastąpiło także obniżenie produkcji cytokin prozapalnych (MCP-1 i IL-12) i zwiększenie produkcji regulatorowej IL-10, choć równocześnie spadek zaindukowanego przez chitozan TGF-β. Podobny wpływ larw L4 obserwowany jest w czasie hamowania objawów nieswoistego zapalenia jelit (colitis) czy eksperymentalnego zapalenia mózgu i rdzenia u myszy (EAE). W tkankach, w których występuje stan zapalny, w czasie zarażenia już w 6 dpz wzrasta produkcja IL-6 i IL-10, co koreluje z zahamowaniem objawów choroby (Donskow-Łysoniewska et al., 2012, 2013). Po zakończeniu podawania chitozanu skład komórkowy powraca do poziomu fizjologicznego dopiero po 3 tygodniach, a zarażenie H. polygyrus przyspieszyło ten proces; już w 2 tygodnie od zakończenia podawania polimeru, u myszy zarażonych nie obserwowano napływu komórek do jamy otrzewnej. Jednak ze względu na obniżoną podczas zarażenia liczbę komórek w czasie podawania chitozanu, nie wiadomo czy efekt w 22 dpz wynika z immunosupresyjnego działania form dorosłych pasożyta. Możliwe, że obniżony w 6 dpz stan zapalny został szybciej zakończony i obserwowano raczej immunosupresyjny wpływ larw L4 niż stadiów dorosłych. W cytowanych wcześniej badaniach (Donskow-Łysoniewska et al., 2012, 2013), obserwowano także wpływ stanu zapalnego na nicienie; w przypadku colitis więcej pasożytów adaptowało się w żywicielu, a w czasie EAE mniej. Stan zapalny w 103 6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie układzie pokarmowym (w jelicie grubym przy colitis) był korzystny dla nicienia; w przypadku chitozanu podobny efekt obserwowano w czasie zarażenia T. spiralis. Larw L1, które mogą migrować także przez jamę otrzewnej lub osiedlać się w okolicznych mięśniach (np. w przeponie), było więcej po podaniu chitozanu, ale także więcej form dorosłych zasiedliło jelito. Równocześnie jednak, w przypadku T. spiralis nie obserwowano łagodzącego wpływu zarażenia na toczący się stan zapalny; napływ komórek do jamy otrzewnej pod wpływem chitozanu był taki sam u myszy niezarażonych jak i w 5 dpz. Na poziomie produkcji cytokin, zarażenie T. spiralis ograniczyło nieco produkcję IL-12 indukowaną przez chitozan, ale dodatkowo zwiększyło sekrecję chemokiny MCP-1. Wydaje się, że większy potencjał w łagodzeniu peritonitis może mieć faza mięśniowa zarażenia, która jak wykazano chroni myszy przed colitis (Ashour et al., 2013). W 30 dpz, choć pierwotny stan zapalny wywołany przez polimer jest już złagodzony, obserwowano wzrost poziomu IL-6 i IL-10 po chitozanie, co sugeruje że zapalenie otrzewnej zaindukowane w czasie już rozwiniętej fazy mięśniowej mogło by być hamowane przez zarażenie. W czasie zarażenia H. polygyrus obserwowano hamujący wpływ nicienia także na poziomie ekspresji markerów powierzchniowych. Larwy L4 silnie wzbudziły ekspresję receptora dla IL-4 na komórkach jamy otrzewnej oraz osłabiły hamujący wpływ chitozanu na poziom markerów związanych z alternatywną aktywacją makrofagów. Natomiast w fazie jelitowej fenotyp tych komórek jest bardzo podobny w czasie zarażenia jak i po długotrwałym podawaniu polimeru i wykazuje cechy alternatywnej aktywacji. Choć wskazuje się, że AAMf pełnią funkcje obronne w czasie zarażenia H. polygyrus (Anthony et al., 2006) ich indukcja przez chitozan nie wpłynęła na poziom zarażenia. Podawanie chitozanu indukuje napływ monocytów o niedojrzałym fenotypie, ale zarażenie nicieniami wpływa na ekspresję markerów powierzchniowych i efekt ten jest zależny od gatunku pasożyta. Zarówno H. polygyrus i T. spiralis zwiększają na tych komórkach ekspresję MHC II, ale tylko H. polygyrus zdołał przełamać wpływ polimeru i zwiększyć odsetek komórek pozytywnych, także tych o ekspresji cząsteczek ko-stymulacyjnych (CD80 i CD86). Efekt stymulacji antygenami pasożyta był widoczny zarówno w 6 jak i 22 dpz. W czasie zarażenia T. spiralis dopiero w fazie mięśniowej obserwowano stymulacyjny wpływ pasożyta; zwiększył się odsetek komórek z ekspresją MHC II, a poziom CD86 był taki jak u myszy zarażonych, a nie jak po podaniu polimeru. Ekspresja MHC II i prezentacja antygenu jest kluczowa dla aktywacji limfocytów T i rozwoju odpowiedzi typu 2. W czasie fazy jelitowej zarażenia T. spiralis zwiększa się ekspresja MHC klasy II w jelicie, między innymi na makrofagach (F4/80+). Obecność komórek prezentujących antygen jest konieczna dla 104 6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie reakcji obronnej w jelicie; myszy pozbawione komórek MHC II+ mają wydłużoną fazę jelitową zarażenia, co jest związane z zaburzeniem kurczliwości jelit i brakiem ekspulsji (Vallance et al., 1999). Zmiany w poziomie ekspresji MHC II wywołane przez chitozan w jamie otrzewnej mogły mieć wpływ na zaburzenie reakcji komórek APC w jelicie, co wpłynęło na obniżenie skuteczności odpowiedzi obronnej. Także obniżenie poziomu ekspresji pozostałych markerów powierzchniowych przez chitozan wystąpiło w czasie zarażenia T. spiralis. Wyjątkiem był receptor dla IL-4; w fazie jelitowej następuje wzrost ekspresji tego markera i nie zostało to zahamowane przez polimer. Po długotrwałym podawaniu chitozanu na monocytach wzrasta ekspresja markerów związanych z alternatywną aktywacją i podobny fenotyp komórki te wykazywały w czasie zarażenia. W fazie mięśniowej następuje silny wzrost ekspresji IL-4R i, podobnie jak w fazie jelitowej, efekt ten został wzmocniony przez chitozan. Przy jednoczesnym spadku odsetka komórek CD14+ wyniki te wskazują, że zarażenie T. spiralis w fazie mięśniowej wzmocniło alternatywną aktywację monocytów wywołaną pierwotnie przez chitozan. Zwiększenie przez chitozan produkcji IL-10 w płynie otrzewnowym i TGF-β w surowicy oraz aktywacja AAMf mogły mieć korzystny wpływ na żywiciela; mogą świadczyć o uruchomieniu mechanizmów gojenia tkanek, uszkadzanych przez wysoką liczbę migrujących i mięśniowych larw L1. Wykazano, że migrujące larwy T. spiralis przy niedoborze IL-10 powodują silne patologie w tkankach (Bliss et al., 2003), dlatego chitozan i indukowana pod jego wpływem produkcja cytokin regulatorowych mogły sprzyjać hamowaniu patologii u żywiciela. Podsumowując, stan zapalny wywołany podaniem chitozanu nie wzmocnił obronnych mechanizmów typu Th2 w czasie zarażenia myszy nicieniami. Przeciwnie, w przypadku T. spiralis aktywacja przez chitozan komórek w jamie otrzewnej znacznie zwiększyła poziom zarażenia. Nie obserwowano adiuwantowych właściwości chitozanu przeciwko nicieniom wywołującym odpowiedź Th2. Zaobserwowano jednak wpływ zarażenia nicieniami na przebieg stanu zapalnego indukowanego przez chitozan. Wykazano, że zarażenie H. polygyrus także w czasie peritonitis łagodzi przebieg stanu zapalnego już w fazie histotropowej, podobnie jak to wykazywano dla innych chorób zapalnych. W przypadku T. spiralis formy dorosłe nie hamowały objawów stanu zapalnego, jednak u tego pasożyta silniejsze właściwości supresyjne obserwuje się w fazie mięśniowej. Aktywacja przez chitozan komórek odpowiedzi wrodzonej była zmieniana pod wpływem dodatkowego bodźca antygenowego jakim było zarażenie nicieniem. Dlatego dalej zbadano, jak podanie chitozanu wpłynęło na elementy odpowiedzi nabytej, w tym specyficznej wobec antygenów nicieni. 105 6.4 Wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą 6.4.1 Wprowadzenie Aktywacja komórek odpowiedzi wrodzonej poprzedza wzbudzenie odpowiedzi nabytej, która w przypadku zarażeń nicieniami jelitowymi charakteryzuje się polaryzacją Th2 zależną. Aktywowane limfocyty T migrują ze śluzówki jelita do lokalnych węzłów limfatycznych już w 2-4 dpz, gdzie produkują IL-4 i IL-13. Cytokiny te aktywują komórki efektorowe, posiadające na swojej powierzchni receptor IL-4Rα, przyczyniając się do usuwania nicieni z jelita. Egzogenne podawanie IL-4 i IL-13, nawet u myszy nieposiadających limfocytów T ani B, jest wystarczające do obniżenia poziomu zarażenia, co świadczy o regulatorowej roli IL-4 i/lub IL-13 (Finkelman et al., 2004). Aktywują one m. in. limfocyty B powodując zwiększenie na nich poziomu ekspresji MHC II oraz wydzielanie przeciwciał klasy IgE (Shimoda et al., 1996). Pod wpływem IL-4 i IL-13 następuje też aktywacja eozynofilów i komórek tucznych oraz zwiększa się aktywność komórek nabłonkowych i mięśniowych jelita (Liu et al., 2004). Nie wszystkie te mechanizmy efektorowe są równocześnie niezbędne do usuwania T. spiralis i H. polygyrus, jednak IL-4 i/lub IL-13 są konieczne dla reakcji obronnej (Patel et al., 2009). W czasie zarażenia różnymi gatunkami nicieni obserwuje się także wzrost produkcji IgG1 i IgE w surowicy oraz IgA w śluzówce jelita; zarówno przeciwciał specyficznych, jak i całkowitych. Mechanizmy immunologiczne zależne od przeciwciał obniżają m. in. płodność pasożytów, przyczyniając się do zmniejszania ilości form dyspersyjnych. Mają one jednak zwykle ograniczony wpływ na osiedlanie się pasożytów przy pierwotnym zarażeniu (Harris & Gause, 2011). Produkcja przeciwciał wiąże się z aktywacją limfocytów B, które odpowiadają także za podtrzymywanie środowiska Th2; produkują cytokiny, które regulują odpowiedź limfocytów T i innych komórek. Ponadto wykazano, że prezentacja antygenu przez komórki B często skutkuje polaryzacją odpowiedzi limfocytów w kierunku Th2 (Lindell et al., 2008). Indukcja mechanizmów Th2 jest skomplikowanym, wielopoziomowym procesem, zależnym od wielu populacji komórek oraz antygenów patogenu. Jej podtrzymanie, szczególnie na poziomie odpowiedzi nabytej, może w istotny sposób wpływać na obniżanie kondycji pasożyta, skracanie fazy chronicznej, a także zwiększać skuteczność pamięci immunologicznej (Holland et al., 2000). Ze względu na lokalną aktywację komórek odpowiedzi wrodzonej po podaniu chitozanu określono wpływ polimeru na przebieg odpowiedzi nabytej przeciwko pasożytom, specyficznej wobec antygenów pasożytniczych, a także samego polimeru. 106 6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą 6.4.2 Wyniki 6.4.2.1 Wpływ chitozanu na odpowiedź limfocytów w MLN Podanie chitozanu wpłynęło na odsetek limfocytów różnych populacji w MLN (Mesenteric Lymph Nodes; krezkowe węzły limfatyczne), ale efekt ten był różny w czasie zarażenia H. polygyrus i T. spiralis (Wykres 4.1). W przypadku H. polygyrus wpływ chitozanu obserwowano tylko w fazie histrotropowej zarażenia (Wykres 4.1a); wzrasta wtedy o 10% odsetek limfocytów CD4, a chitozan zmienił tę kinetykę; obniżył odsetek limfocytów Th (CD4+), ograniczył też udział Tc (cytotoksycznych, CD8+) oraz nieznacznie zwiększył odsetek limfocytów B (CD19+, p=0,15). W fazie jelitowej zarażenia H. polygyrus odsetek limfocytów nie zmienił się pod wpływem chitozanu. W czasie inwazji T. spiralis wpływ chitozanu był także obserwowany tylko na początku doświadczenia, jednak efekt ten był inny niż w przypadku H. polygyrus. Zarażenie T. spiralis powoduje wzrost o 10% odsetka komórek CD8+, a chitozan znacznie wzmocnił to zjawisko i komórki CD8 stanowiły połowę limfocytów w MLN (Wykres 4.1b). Ponadto chitozan zwiększył też o 10% udział limfocytów Th. W fazie mięśniowej odsetek limfocytów po chitozanie był taki, jak w kontrolnym zarażeniu. 6 dpz % a 6 dpz/Cht 22 dpz 22 dpz/Cht 40 30 * * 20 10 0 CD4 CD8 CD19 107 6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą b 5 dpz % 60 5 dpz/Cht 30 dpz 30 dpz/Cht * 50 * 40 30 20 10 0 CD4 CD8 CD19 Wykres 4.1 Wpływ chitozanu na odsetek różnych populacji limfocytów w MLN myszy zarażonych a) H. polygyrus lub b) T. spiralis. Czerwoną kreską poziomą oznaczono poziom fizjologiczny. * oznaczono p<0,05 wzg. danego dpz bez podawania chitozanu, n=5. 6.4.2.2 Wpływ chitozanu na proliferację limfocytów T CD4+ w MLN Test CFSE umożliwia śledzenie podziałów komórkowych; barwnik fluorescencyjny CFSE (ester karboksyfluoresceiny) łączy się z białkami cytosolu, a wraz z każdym podziałem komórki słabnie intensywność jego świecenia. Obserwując „rozcieńczanie” CFSE w komórkach potomnych można określać odsetek komórek ulegających podziałom, a także liczbę podziałów, które przeszła każda komórka. Dodatkowo, znakując na komórkach markery powierzchniowe, można określić proliferację różnych populacji komórek w mieszanej hodowli. Komórki otrzymane z krezkowych węzłów limfatycznych myszy zarażonych hodowano w obecności antygenów pasożytniczych lub chitozanu. Kontrole stanowiły komórki niestymulowane, ulegające proliferacji spontanicznej, oraz hodowane w obecności przeciwciał anty-CD3 i anty-CD28, które indukują silną proliferację komórek poprzez aktywację TCR. Następnie oceniano poziom proliferacji limfocytów CD4+. Podanie chitozanu istotnie wpłynęło na proliferację in vitro komórek CD4+ (Wykres 4.2). W czasie zarażenia H. polygrus chitozan początkowo obniżył ilość podziałów komórek niestymulowanych i w odpowiedzi na antygen form dorosłych (AgHp) oraz polimer in vitro (HMW), jednak nie wpłynął istotnie na zdolność komórek do reakcji na stymulację TCR (Wykres 4.2a). W fazie jelitowej zarażenia chitozan wpłynął tylko na proliferację komórek stymulowanych anty-TCR, zwiększając o prawie 20% ich zdolność do podziału. 108 6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą W czasie zarażenia T. spiralis efekt polimeru był obserwowany tylko w fazie jelitowej; chitozan znacząco zmniejszył ilość podziałów komórek (Wykres 4.1b). Polimer obniżył spontaniczną proliferację limfocytów oraz tę w odpowiedzi na antygen pasożytniczy (larwy mięśniowe L1; AgL1) i polimer in vitro (HMW), a także znacznie osłabił ich reakcję na stymulację TCR; indeks stymulowanej proliferacji był o ¼ niższy niż w czasie kontrolnego zarażenia. W fazie mięśniowej obserwuje się zahamowanie zdolności proliferacyjnych komórek CD4+; limfocyty nie proliferowały nawet po stymulacji TCR, a chitozan nie wpłynął na ten proces. a DI 3 6 dpz 6 dpz/Cht 22 dpz/Cht # * 2,5 2 1,5 22 dpz # * # # * * 1 0,5 0 RPMI b 5 dpz DI 3,5 5 dpz/Cht AgHp 30 dpz HMW 30 dpz/Cht # 3 2,5 2 a-TCR * # * # # * 1,5 # * 1 0,5 0 RPMI a-TCR AgL1 HMW Wykres 4.2 Wpływ chitozanu na proliferację limfocytów CD4+ myszy zarażonych a) H. polygyrus lub b) T. spiralis. * oznaczono p<0,05 wzg. danego dpz bez podawania chitozanu, # oznaczono p<0,05 wzg. komórek niestymulowanych (RPMI) w danej grupie, n=8. 109 6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą 6.4.2.3 Odpowiedź limfocytów w płynie otrzewnowym Chitozan istotnie wpłynął na skład limfocytów w jamie otrzewnej myszy zarażonych nicieniami (Wykres 4.3). W fazie histotropowej zarażenia H. polygyrus nie następuje istotny napływ limfocytów do jamy otrzewnej, ale podanie chitozanu spowodowało silną migrację komórek CD4 i CD8, jednocześnie zmniejszając o połowę populację komórek CD19 (Wykres 4.3a). W fazie chronicznej, następuje migracja limfocytów CD19 i CD4 do jamy otrzewnej i zjawisko to zostało przez chitozan zatrzymane. W inwazji T. spiralis obserwowano podobny wpływ polimeru (Wykres 4.3b). W fazie jelitowej zarażenia T. spiralis obserwuje się napływ limfocytów B. Podanie chitozanu zmieniło tę dynamikę; polimer zahamował migrację komórek B, ale zwiększył 4-krotnie udział limfocytów CD4 i CD8. W fazie mięśniowej zarażenia następuje napływ wszystkich populacji limfocytów, co zostało zahamowane przez chitozan. 6 dpz a 6 dpz/Cht 22 dpz 22 dpz/Cht 2 * komórki x106 1,6 1,2 0,8 0,4 * * * * 0 CD19 CD4 CD8 110 6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą 5 dpz b 5 dpz/Cht 30 dpz 30 dpz/Cht 6 komórki x106 5 4 3 2 1 * * * * * * 0 CD19 CD4 CD8 Wykres 4.3 Wpływ chitozanu na napływ limfocytów do jamy otrzewnej myszy zarażonych a) H. polygyrus lub b) T. spiralis. Czerwoną kreską oznaczono poziom fizjologiczny komórek (u myszy niezarażonych). * oznaczono p<0,05 wzg. danego dpz bez podawania chitozanu, n=4. Chitozan zaburzył także równowagę między limfocytami B1 i B2 w jamie otrzewnej, w której w warunkach fizjologicznych te pierwsze stanowią ponad 60% limfocytów CD19 (Wykres 4.4a i b). W fazie jelitowej zarażenia T. spiralis i histotropowej oraz jelitowej H. polygyrus nie obserwuje się zmian w odsetku i liczbie komórek B1 (IgD+IgM+) i B2 (IgD+). Podanie chitozanu powodowało na początku doświadczeń zmniejszenie liczebności obu populacji oraz odwrócenie ich proporcji; większość, 65-80% komórek B stanowiła populacja B2. Z czasem odsetek komórek zaczął powracać do stanu kontrolnego, ale nie osiągnął go nawet 2 tygodnie po podaniu. Choć odbudowała się populacja komórek B2, liczebność limfocytów B1 nie osiągnęła stanu fizjologicznego, mimo że po zarażeniu zwiększała się liczba tych komórek. W fazie mięśniowej zarażenia T. spiralis następuje wyrównanie udziału komórek B1 i B2 i taki sam odsetek tych komórek obserwowano po 2-3 tygodniach od podania chitozanu, także u myszy zarażonych H. polygyrus. Jednak podawanie chitozanu silnie zaburzyło zwiększanie liczebności komórek obu populacji, szczególnie u myszy w fazie mięśniowej zarażenia T. spiralis. 111 6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą a 6 dpz 6 dpz/Cht 22 dpz 22 dpz/Cht 0,4 (71) komórki x106 0,3 (70) 0,2 * (52**) * 0,1 (29) (48**) (30) * (86*) (14*) 0 B1 5 dpz b B2 5 dpz/Cht 2 30 dpz 30 dpz/Cht (45) (55) komórki x106 1,6 1,2 * * (60) 0,8 (65) 0,4 (40) * (35*) (35) (65*) 0 B1 B2 Wykres 4.4 Wpływ chitozanu na liczbę i odsetek limfocytów B1 i B2 w płynie otrzewnowym myszy zarażonych a) H. polygyrus lub b) T. spiralis. W nawiasach podano odsetek populacji. Czerwoną kreską oznaczono poziom fizjologiczny komórek (u myszy niezarażonych). * oznaczono p<0,05, ** oznaczono p<0,1 wzg. danego dpz bez podawania chitozanu, n=4. 6.4.2.4 Wpływ chitozanu na produkcję przeciwciał Określano wpływ chitozanu na wydzielanie przeciwciał 3 klas: IgG1 i IgE w krwi oraz IgA w płynie otrzewnowym. Metodą ELISA mierzono poziom immunoglobulin specyficznych wobec antygenów nicieni. Dodatkowo, określano masę cząsteczkową rozpoznawanych epitopów antygenów metodą Western blot. 112 6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą 6.4.2.4.1 Poziom specyficznych przeciwciał IgG1 i IgE Podanie chitozanu nie wpłynęło istotnie na poziom specyficznych IgG1 i IgE w krwi myszy zarażonych (Wykres 4.5a i b). Zarówno w czasie zarażenia T. spiralis jak i H. polygyrus poziom przeciwciał tych dwóch klas nie zmienił się pod wpływem podawania chitozanu, ani na początku doświadczenia ani po 2-3 tygodniach od podawania polimeru. a OD 1,6 6 dpz 6 dpz/Cht 22 dpz 22 dpz/Cht 1,2 0,8 0,4 0 IgG1 b OD 2,5 5 dpz IgE 5 dpz/Cht 30 dpz 30 dpz/Cht 2 1,5 1 0,5 0 IgG1 IgE Wykres 4.5 Wpływ chitozanu na poziom IgG1 (rozcieńczenie 400x) i IgE (rozcieńczenie 20x) specyficznych wobec antygenów nicieni a) form dorosłych w czasie zarażenia H. polygyrus lub b) L1 w czasie zarażenia T. spiralis w krwi, n=4. 113 6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą 6.4.2.4.2 Poziom i specyficzność przeciwciał IgA oznaczany metodą ELISA Podanie chitozanu zwiększyło poziom otrzewnowej IgA u myszy zarażonych T. spiralis i H. polygyrus we wszystkich badanych dniach po zarażeniu (Wykres 4.6a i b). Efekt ten był silniejszy w chronicznej fazie zarażeń; 2-3 tygodni po podaniu chitozanu, gdy poziom przeciwciał był 2-krotnie wyższy po chitozanie. Obserwowano wyższy poziom przeciwciał rozpoznających antygeny obu gatunków nicieni, a także zmienił się współczynnik korelacji poziomu przeciwciał z liczbą nicieni. W przypadku zarażenia H. polygyrus wpływ chitozanu obserwowano tylko w fazie chronicznej zarażenia; polimer wywołał bardzo silną negatywną korelację (r22dpz= 0,11, r22dpz/Cht= -0,98). W fazie jelitowej zarażenia T. spiralis chitozan zwiększył korelację między produkcją przeciwciał i poziomem zarażenia (współczynnik korelacji Pearsona r5dpz= 0,16, r5dzp/Cht= 0,65). Jeszcze silniejszy efekt był obserwowany w fazie mięśniowej; w kontrolnym zarażeniu występuje słaba negatywna korelacja ilości przeciwciał i liczby larw L1 (r30dpz= -0,65), a podanie chitozanu odwróciło tę zależność (r30dpz/Cht= 0,77). Istotność statystyczna (p<0,05) dla korelacji Pearsona przy df=3 występuje, gdy r>0,87 lub r<-0,87. a OD 6 dpz 6 dpz/Cht 0,5 22 dpz 22 dpz/Cht * 0,4 0,3 0,2 * 0,1 0 114 6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą b OD 1 5 dpz 5 dpz/Cht 30 dpz 30 dpz/Cht * * 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Wykres 4.6 Wpływ chitozanu na poziom otrzewnowej IgA specyficznej wobec antygenów nicieni a) form dorosłych w czasie zarażenia H. polygyrus lub b) L1 w czasie zarażenia T. spiralis. * oznaczono p<0,05 wzg. danego dpz bez podawania chitozanu, n=4. Zaobserwowano, że chitozan indukuje produkcję IgA rozpoznającej sam polimer. U myszy niezarażonych, którym podawano chitozan stwierdzono produkcję IgA rozpoznającej zarówno antygeny nicieni i chitozan już na początku doświadczenia i efekt ten utrzymywał się do jego końca (Wykres 4.7). Rozpuszczalnik chitozanu, kwas adypinowy, nie wpłynął istotnie na poziom IgA. K OD 2,5 Cht1 Cht3 AdOH * 2 * 1,5 1 * * * * 0,5 0 Hp Ts HMW Wykres 4.7 Wpływ chitozanu na poziom otrzewnowej IgA specyficznej wobec nicieni H. polygyrus (Hp) i T. spiralis (Ts) oraz polimeru (HMW) u myszy niezarażonych. * oznaczono p<0,05 wzg. K, n=4. 115 6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą 6.4.2.4.3 Specyficzność przeciwciał IgA oznaczana metodą Western blot Specyficzność otrzewnowych IgA indukowanych przez chitozan oceniano metodą Western blot; określano jakie antygeny form dorosłych H. polygyrus oraz larw mięśniowych L1 T. spiralis są rozpoznawane przez otrzewnowe IgA myszy z różnych grup badanych (Zdjęcie 4.1 i Tabela 4.1). a) kDa M Hp b) Ts Hp c) Ts Hp d) Ts Hp Ts 100 70 50 40 35 25 15 Zdjęcie 4.1 Białka antygenu somatycznego form dorosłych H. polygyrus (Hp) i larw L1 T. spiralis (Ts) rozpoznawane przez IgA pochodzące od myszy a) niezarażonych, 3 tygodnie po podawaniu chitozanu (Cht3), b) zarażonych H. polygyrus w 22 dpz lub c) zarażonych T. spiralis w 30 dpz, analizowane metodą Western blot oraz d) reszty acetylo-glukozaminy w antygenach nicieni rozpoznawane przez lektynę WGA. M- marker wielkości białek wyrażonej w kDa. Wykazano, że IgA od myszy niezarażonych, którym podawano 3 tygodnie wcześniej chitozan (grupa Cht3), rozpoznaje epitopy antygenów nicieni; więcej prążków obserwowano w 116 6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą antygenie T. spiralis niż H. polygyrus (Zdjęcie 4.1a). Antygen H. polygyrus jest słabiej rozpoznawany przez IgA; w czasie zarażenia powstaje niewiele specyficznych przeciwciał tej klasy (8 prążków), w odróżnieniu od antygenu larw mięśniowych T. spiralis (21 prążków). Jednak w przypadku obu gatunków stwierdzono wiele białek glikolizowanych (reszty acetyloglukozaminy; H. polygyrus 16 prążków, T. spiralis 18 prążków). W antygenie dorosłych H. polygyrus IgA indukowane przez chitozan rozpoznawały tylko jedno białko, o masie 65 kDa, wykrywane także przez IgA zwierząt zarażonych, które było krzyżowo rozpoznane przez IgA myszy zarażonych T. spiralis oraz lektynę WGA, co świadczy o obecność reszt acetylo-glukozaminy w tym białku (Tabela 4.1). W antygenie T. spiralis IgA indukowane przez polimer rozpoznawały więcej białek (15 prążków), w tym białko o masie ok. 65 kDa, podobne jak w antygenie H. polygyrus, widoczne także w naturalnym zarażeniu, posiadające reszty acetylo-glukozaminy. Pozostałe IgA indukowane przez chitozan rozpoznawały w antygenie T. spiralis szereg białek o masie 30-40 kDa, z których większość rozpoznawana była w naturalnym zarażeniu oraz przez lektynę WGA. Tabela 4.1 Masy cząsteczkowe (kDa) białek antygenów H. polygyrus i T. spiralis rozpoznawanych przez IgA z płynu otrzewnowego od myszy z różnych grup (Ts- T. spiralis 30 dpz, hp- H. polygyrus 22 dpz, Cht- 3 tygodnie po podaniu chitozanu) oraz lektynę WGA. PO Ag Ts Hp Cht T. spiralis WGA Hp Ts Cht H. polygyrus 192,0 154,9 WGA 196,9 174,0 149,1 126,7 126,3 124,6 121,8 109,9 93,0 95,1 85,5 66,7 64,7 94,1 65,7 57,1 82,6 66,3 70,6 65,9 59,0 56,5 52,0 49,9 82,7 83,7 73,2 64,9 65,1 63,5 57,7 54,1 52,2 117 6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą 48,2 47,1 44,1 43,5 42,4 40,2 37,1 33,8 30,4 44,0 41,6 40,1 37,1 33,6 40,4 39,7 38,4 35,6 33,6 30,6 40,3 38,3 36,0 39,1 34,9 29,1 27,4 24,4 23,0 21,5 20,0 17,8 16,2 6.4.3 28,6 26,8 24,6 21,8 20,1 17,9 15,0 28,9 23,5 24,5 21,2 18,8 17,2 15,3 15,3 Dyskusja Określono wpływ chitozanu na mechanizmy odpowiedzi nabytej, tj. proliferację limfocytów T oraz odpowiedź limfocytów B i produkcję przeciwciał. Chitozan nie wpływał na poziom zarażenia H. polygyrus, jednak zaburzył naturalną odpowiedź limfocytów na zarażenie. W fazie histotropowej inwazji obserwuje się zwiększenie odsetka komórek CD4+ w MLN; podanie chitozanu zablokowało to zjawisko. Mogło to być związane z obniżoną zdolnością tych komórek do proliferacji; zarówno spontanicznej jak i po aktywacji TCR. Jednak zmniejszony odsetek komórek CD8 oraz niewielki wzrost odsetka limfocytów B sugeruje napływ do lokalnych węzłów limfatycznych innych, nie identyfikowanych komórek z pobudzonych tkanek, tj. jamy otrzewnej. Pojawiające się w niej pod wpływem chitozanu monocyty i/lub inne komórki (Rozdział 6.3) mogą po aktywacji migrować do MLN, gdzie będą funkcjonować jako APC i aktywować specyficzne limfocyty T. Te z kolei opuszczą węzeł i będą migrować do tkanek, w których występuje stan zapalny i wysokie stężenie chemokin/cytokin (Stein & Nombela-Arrieta, 2005). Było to obserwowane w prezentowanym doświadczeniu; do jamy otrzewnej napłynęły limfocyty CD4+ i CD8+. Równocześnie po podaniu chitozanu u myszy zarażonych 118 6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą H. polygyrus obserwowano wysokie stężenie IL-6 w jamie otrzewnej. Wykazano, że cytokina ta nie tylko hamuje apoptozę limfocytów T, sprzyja ich proliferacji (Ayroldi et al., 1998), ale także polaryzuje je w kierunku Th2 (Rincón et al., 1997). Napływowe limfocyty mogły w tych warunkach dłużej przeżywać i/lub proliferować. U myszy zarażonych H. polygyrus pod wpływem chitozanu obserwowano najsilniejszy wśród badanych grup napływ limfocytów CD8+ do jamy otrzewnej, przy równocześnie mniejszym udziale procentowym pozostałych komórek (neutrofilów i monocytów, Rozdział 6.3, ale też CD4+). U pacjentów, u których przeprowadza się dializy otrzewnowe stwierdza się w jamie otrzewnej liczne limfocyty Tc, które charakteryzują się aktywacją typu 2; produkują IL-4, IL-5, IL-6 i IL-10. Wzmacniają one produkcję przeciwciał przez limfocyty B oraz mają obniżone właściwości cytotoksyczne (Wang et al., 2003). Podobny fenotyp mogły mieć limfocyty CD8 indukowane przez chitozan. Możliwe, że zarażenie H. polygyrus w czasie podawania chitozanu łagodzi stan zapalny wcześniej wywołany przez polimer poprzez przełączanie odpowiedzi z Th1 zależnej na Th2/Treg także z udziałem komórek Tc. Wykazano także, że H. polygyrus indukuje komórki CD8+, które odpowiadają za hamowanie objawów colitis (Metwali et al., 2006), więc również te komórki mogły brać udział w immunomodulacji podczas peritonitis. W czasie zarażenia T. spiralis środowisko cytokinowe w jamie otrzewnej po podaniu chitozanu było inne; występowało wysokie stężenie IL-12, IL-6 i TGF-β. Wykazano, że IL-6 w połączeniu z TGF-β jest czynnikiem stymulującym dojrzewanie limfocytów Th17 (Korn et al., 2009). Ta subpopulacja limfocytów obserwowana jest w czasie różnych chorób autoimmunizacyjnych, ale uważa się że odpowiada za usuwanie patogenów (głównie bakterii i grzybów) w nabłonkach. Komórkami efektorowymi związanymi z odpowiedzią Th17 są między innymi neutrofile oraz limfocyty B produkujące IgM i IgA. Komórki te pojawiały się licznie po podaniu chitozanu myszom kontrolnym oraz w czasie zarażenia T. spiralis. Natomiast w przypadku H. polygyrus obserwowano słabszy napływ tych komórek, co było prawdopodobnie związane z niskim poziomem TGF-β; IL-6 towarzyszyła produkcja IL-10. W czasie peritonitis obserwuje się hamowanie proliferacji limfocytów T oraz zwiększony udział komórek B w węzłach limfatycznych i krwi (Gore, 2014). Podanie chitozanu wywołało podobny efekt, zarówno u myszy zarażonych H. polygyrus i T. spiralis. W przypadku H. polygyrus pomimo supresji odpowiedzi limfocytów CD4+ w MLN na stymulację, nie zaobserwowano wpływu chitozanu na poziom zarażenia. Jednak fazie histotropowej zarażenia obserwuje się hamowanie proliferacji komórek w MLN (Donskow-Schmelter et al., 2007) pod wpływem pasożyta, dlatego niewykluczone, że zaburzenie tego mechanizmu przez 119 6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą chitozan nie miało wpływu na adaptację pasożyta. Inaczej było w czasie zarażenia T. spiralis; w fazie jelitowej limfocyty w MLN intensywnie proliferują i areaktywność tych komórek wywołana przez chitozan istotnie wpłynęła na obronność żywiciela. Wykazano, że u szczepów myszy odpornych na zarażenie T. spiralis limfocyty MLN silniej proliferują (Zhu et al., 1990). Zahamowanie odpowiedzi proliferacyjnej komórek mogło zatem wpłynąć na poziom odpowiedzi Th2 i przez to obniżyć jej skuteczność. Jednak proliferację limfocytów CD4+ oznaczano w zawiesinie komórek MLN, w których znajdują się różne populacje; limfocyty T i B, ale także takie komórki jak makrofagi, DC i inne, które mogą zarówno wzbudzać jak i hamować aktywność limfocytów. Dlatego na podstawie otrzymanych wyników nie można stwierdzić z jakich mechanizmów wynikał hamujący wpływ chitozanu na proliferację limfocytów. Po dłuższym czasie od podania chitozanu (2-3 tygodni), zarówno u myszy zarażonych H. polygyrus jak i T. spiralis, nie obserwowano znacznego wpływu polimeru na odpowiedź limfocytów w MLN. Zarówno odsetek, jak i proliferacja komórek CD4+ były takie, jak w kontrolnym zarażeniu, co sugeruje, że wpływ chitozanu na limfocyty był krótkotrwały. Jednak, podobnie jak to obserwowano w Rozdziale 6.3, w 2 i 3 tygodniu po podaniu polimeru napływ komórek do jamy otrzewnej (makrofagów, monocytów i eozynofilów) był zaburzony. W czasie zarażenia H. polygyrus i T. spiralis obserwuje się napływ do jamy otrzewnej limfocytów B i Th, a wcześniejsze podanie chitozanu uniemożliwiło ten proces, co mogło być związane z zaburzoną funkcją komórek mezotelialnych otrzewnej, jak to się obserwuje w czasie peritonitis (Yung et al., 2012). Chitozan wpłynął także na odpowiedź limfocytów B. W czasie inwazji obu pasożytów pod wpływem polimeru zmniejszyła się liczba komórek CD19 w jamie otrzewnej. Mogło być to związane z migracją lub apoptozą komórek populacji B1, której odsetek znacznie się zmniejszył. Limfocyty B1 i B2 różnią się fenotypem, pochodzeniem oraz pełnionymi funkcjami. Komórki subpopulacji B2 powstają w szpiku kostnym i migrują między krwią a obwodowymi narządami limfatycznymi, gdzie uczestniczą w odpowiedzi humoralnej zależnej od limfocytów T. Zachodzi u nich przełączanie klas przeciwciał, charakteryzują się ich dużą zmiennością oraz rozwijają się w komórki pamięci. Z kolei limfocyty B1 uważa się za element odpowiedzi wrodzonej; powstają w czasie życia płodowego i lokalizują się płynach surowiczych, gdzie ich populacja jest odnawiana głównie przez lokalną proliferację (Hayakawa et al., 1986). Produkują przeciwciała klasy IgM o ograniczonej, choć wielorakiej specyficzności i małym powinowactwie, nazywane „naturalnymi”. Część z nich jest 120 6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą autospecyficzna, ale rozpoznają także wzorce molekularne patogenów, szczególnie te o powtarzającej się strukturze, jak DNA czy LPS (Tangye, 2013). Limfocyty B1 umożliwiają szybką reakcję na patogen; już 1 dzień po aktywacji produkują przeciwciała (Itakura et al., 2005), podczas gdy rozwinięcie odpowiedzi nabytej limfocytów B2 wymaga tygodni (Martin & Kearney, 2001). Limfocyty B1 po aktywacji intensywniej migrują poza jamę otrzewnej niż B2 (Moon et al., 2012) między innymi w odpowiedzi na stymulację przez TLR (Ha et al., 2006). Podanie chitozanu także spowodowało intensywną migrację komórek B1 z jamy otrzewnej, a efekt ten był silniejszy w czasie zarażenia H. polygyrus, u których zmniejszyła się także populacja B2. Ponadto u tych myszy populacja B1 nie odbudowała się nawet po 2 tygodniach od podania polimeru mimo, że pasożyt nieznacznie zwiększa wtedy liczbę tych komórek. W czasie zarażenia T. spiralis ubytek komórek B1 był mniejszy, ale po 3 tygodniach również dominowała populacja B2. W tym czasie, w fazie mięśniowej obserwuje się w jamie otrzewnej wzrost liczby limfocytów B obu populacji. Indukcję limfocytów B obserwuje się także w czasie zarażeń innymi helmintami; liczba komórek B1 w jamie otrzewnej zwiększa się w odpowiedzi na antygeny cukrowe Schistosoma mansoni (Velupillai et al., 1997) czy zarażenie filarią (Ramalingam et al., 2003). Podawanie chitozanu w perspektywie długoterminowej zaburzyło zatem napływ komórek B2 oraz proliferację/apoptozę limfocytów B1 w odpowiedzi na stymulację antygenową (zarażenie). Migracja aktywowanych przez chitozan limfocytów poza jamę otrzewnej, szczególnie komórek B1, może się wiązać z silną produkcją IL-10 w narządach obwodowych (Maseda et al., 2013), co mogło także wpływać na obniżenie proliferacji limfocytów CD4+ obserwowane w MLN. Zaburzenie odpowiedzi limfocytów w jamie otrzewnej było długotrwałe, jednak nie wiązało się ze zmianą odsetka komórek B w lokalnych węzłach limfatycznych 2 i 3 tygodnie po podaniu chitozanu, również w odpowiedzi na zarażenie. Dlatego wydaje się, że długotrwały wpływ chitozanu na odpowiedź komórek w jamie otrzewnej związany był raczej z zaburzoną homeostazą i migracją komórek w tym miejscu. Wszystkie populacje komórek indukowanych w fazie chronicznej zarażeń (makrofagi, monocyty, eozynofile, limfocyty Th, Tc i B) po zaprzestaniu iniekcji chitozanu słabiej migrowały do jamy otrzewnej. Podanie chitozanu i wywołana przez to zmiana odpowiedzi limfocytów B miały wpływ na produkcję przeciwciał, ale tylko lokalnej IgA, jednak już od początku doświadczenia (w 5 i 6 dpz, ok. 10 dni po pierwszym podaniu polimeru). Zwiększone miano przeciwciał tej klasy wiązało się z indukcją Ig krzyżowo rozpoznających zarówno antygeny nicieni, jak i sam polimer, również u myszy niezarażonych. Przeciwciała klasy IgA są głównym komponentem odpowiedzi humoralnej w śluzówkach, a w jelicie plazmocyty wydzielające IgA pochodzą 121 6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą zarówno z jamy otrzewnowej (komórki B1) jak z prekursorów ze szpiku (komórki B2) zasiedlających kępki Peyer’a (Kroese et al., 1989). Wykazano, że IgA jest też ważnym czynnikiem umożliwiającym rozwój tolerancji wobec bakterii komensalnych zasiedlających jelito i pojawia się niezależnie od limfocytów T, ale dopiero w odpowiedzi na stymulację antygenem. Dlatego uważa się, że IgA, nawet produkowane przez limfocyty B1, nie reprezentują „naturalnych” przeciwciał (Macpherson et al., 2000). Limfocyty B2 IgA+ aktywowane w kępkach Peyer’a migrują do krezkowych węzłów limfatycznych, gdzie przekształcają się w plazmocyty, które następnie migrują do lamina propria jelita cienkiego (Fagarasan & Honjo, 2003), a produkcję IgA indukuje IL-6 (Beagley et al., 1989). Natomiast komórki B1 aktywowane m. in. poprzez TLR mogą opuszczać jamę otrzewnej i bezpośrednio zasiedlać śluzówkę jelita lub migrować do śledziony (Ha et al., 2006), a przełączanie klas przeciwciał z IgM na IgA zachodzi pod wpływem IL-5 produkowanej przez limfocyty Th (Bao et al., 1998) oraz TGF-β (Roy et al., 2013). Ilość komórek B1 IgA+ w jamie otrzewnej myszy różni się między szczepami i jest mała u myszy C57Bl6 (<1%), których użyto w doświadczeniach (Beagley et al., 1995). W prezentowanych doświadczeniach nie jest jednak możliwe wykazanie, która populacja limfocytów B była źródłem IgA indukowanej przez chitozan. Jednak indukcja IL-6 przy niewykrywalnym poziomie IL-5 (wyniki nieprzedstawione; w każdej z grup badanych poziom IL-5 był poniżej progu detekcji stosowanego testu ELISA) w jamie otrzewnej, może sugerować ważniejszą rolę komórek B2 w sekrecji IgA. Podanie chitozanu już po 10 dniach wzbudziło produkcję IgA zarówno u myszy kontrolnych jak i zarażonych nicieniami, a efekt ten utrzymywał się przez cały czas doświadczenia. Przeciwciała te rozpoznawały białka pasożytów, z których wiele ma w swojej strukturze reszty acetylo-glukozaminy, ale także sam polimer. IgA o krzyżowej specyficzności była wykrywana zarówno w płynie otrzewnowym, jak i homogenacie śluzówki jelita cienkiego (wyniki nieprzedstawione). W czasie zarażenia H. polygyrus obserwuje się wzrost produkcji całkowitej IgG1 i IgA, z której część jest specyficzna wobec nicieni i w dużym stopniu warunkuje obronność w fazie jelitowej zarażenia. Wykazano, że surowicza IgG1 zapewnia bierną odpowiedź przeciwpasożytniczą (Ben-Smith et al., 1999), ale znacznie mniej wiadomo o roli IgA w reakcji na zarażenie H. polygyrus. Zaobserwowano, że więcej komórek produkujących IgA w kępkach Peyer’a i MLN występuje u myszy odpornych na zarażenie, natomiast u szczepów wrażliwych wzrasta produkcja tej Ig w surowicy (Monroy & Enriquez, 1992). IgA 122 6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą specyficzne wobec nicienia rozpoznaje niewiele antygenów, wśród których znajdują się białka Venom Allergen Like (VAL) zawierające reszty cukrowe. Białka te okazały się skutecznym antygenem szczepionkowym, obniżającym poziom zarażenia (Hewitson et al., 2011). Wśród antygenów o podobnej masie cząsteczkowej (ok. 65 kDa) znajduje się także Glycan B (HM-65); epitop nie będący białkiem, ale zawierający fosfatydylo-serynę, który wykrywany jest wewnątrz nicienia (Hewitson et al., 2011). Podanie chitozanu myszom niezarażonym powodowało pojawianie się IgA rozpoznającej w antygenie H. polygyrus epitop o podobnej masie (65 kDa), a poziom całkowitej specyficznej IgA u myszy zarażonych wzrósł, więc możliwe jest, że w czasie zarażenia nicieniem po podaniu chitozanu pojawiły się dodatkowe przeciwciała rozpoznające struktury pasożyta. Choć zwiększenie ilości IgA specyficznej wobec nicienia nie skutkowało obniżeniem poziomu zarażenia, obserwowano zmiany w produkcji jaj. Może to wskazywać, że mechanizmy zależne od IgA uszkadzające ciało pasożyta, mogły być nieznacznie wzmocnione pod wpływem chitozanu. Co ciekawe podobny epitop (65 kDa) został krzyżowo rozpoznany przez IgA myszy zarażonych T. spiralis co wskazuje, że białko to może być strukturą konserwowaną ewolucyjnie. Ponadto, po podaniu chitozanu, zarówno u myszy kontrolnych jak i zarażonych, obserwowano obecność IgA rozpoznającej sam polimer, co może wskazywać, że epitop o masie 65 kDa może mieć podobną do chitozanu, powtarzającą się strukturę lub reszty N-acetylo-glukozaminy. W antygenie larw mięśniowych T. spiralis IgA zaindukowana przez chitozan rozpoznawała więcej epitopów, jednak dominowały wśród nich białka o małej masie cząsteczkowej (15-40 kDa), z których większość miała reszty N-acetylo-glukozaminy. Widoczny był także glikozylowany prążek o masie 65 kDa, podobnie jak w antygenie H. polygyrus. Podobne epitopy były rozpoznawane przez surowiczą IgG w antygenie somatycznym oraz wydalniczowydzielniczym larw mięśniowych L1, jednak nie wszystkie zostały zidentyfikowane (Cui et al., 2013). Wykazano jednak, że białka o masie ok. 40 kDa należą do rodziny deoksyrybonukleazy II, natomiast wśród białek o masie ok. 62-70 kDa zidentyfikowano proteazy serynowe. W antygenie somatycznym mogą się znajdować białka wydalniczowydzielnicze, wśród których IgA indukowane przez chitozan mogły rozpoznawać białka 21 kDa ES i 45 kDa antigen (Robinson et al., 2005, 2007). Wykazano, że przeciwciała przeciwko proteazie serynowej T. spiralis obniżają liczbę nicieni wszystkich stadiów w czasie zarażenia następującego po podaniu rekombinowanego białka (Wang et al., 2013). Wśród białek larw mięśniowych T. spiralis licznie występują antygeny TSL-1 (Trichinella spiralis larvae 1), które są bardzo immunogenne i charakteryzują się obecnością nietypowej reszty 123 6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą cukrowej; tywelozy. Ponadto w antygenie somatycznym larw L1 25% glikozylacji białek związanych jest z resztami N-acetylo-glukozaminy (Wisnewski et al., 1993). Wykazano, że przeciwciała specyficzne wobec antygenów T. spiralis, w tym klasy IgA (Inaba et al., 2003), znacząco obniżają inwazyjność nicieni, nawet bez obecności leukocytów (McVay et al., 1998). Obserwowano także, że wcześniejsze zarażenie myszy przywrą Clonorchis sinensis, której antygeny są krzyżowo rozpoznawane razem z antygenami T. spiralis (Chu et al., 2014), zwiększa skuteczność odpowiedzi wobec T. spiralis (Chen et al., 2013). Jednak produkcja przeciwciał IgA, która pojawiła się po podaniu chitozanu, miała odwrotny skutek w czasie zarażenia T. spiralis; więcej larw dojrzewało do form dorosłych. Być może IgA wzbudzane przez chitozan, mimo że rozpoznają epitopy nicienia, charakteryzują się słabszym powinowactwem, co jest typowe dla przeciwciał przeciwko cukrom (Heimburg-Molinaro & Rittenhouse-Olson, 2009). Słabsze oddziaływanie przeciwciał ze strukturami pasożyta lub ich nieznacznie zmieniona specyficzność mogły mieć wpływ na mechanizmy komórkowe zależne od przeciwciał, co mogło skutkować obniżoną odpornością żywiciela na zarażenie. Wskazuje się także, że przeciwciała przeciw cukrom mogą wiązać się raczej z ucieczką immunologiczną pasożyta; u szympansów zarażonych Schistosoma mansoni pojawiają się przeciwciała skierowane przeciwko epitopom węglowodanowym w czasie, gdy zarażenie staje się chroniczne (Eberl et al., 2001). Autorzy sugerują, że antygeny cukrowe pasożyta stanowią „zasłonę dymną”; indukowane przeciwciała przeciwko tym epitopom, odwracają uwagę mechanizmów obronnych żywiciela od ważniejszych struktur tej przywry. Podobny efekt mógł wywołać chitozan; zwiększona produkcja przeciwciał nie przyczyniała się do obronności, ponieważ rozpoznawane struktury nie były kluczowe dla przeżycia pasożyta. Równocześnie zaburzenie odpowiedzi limfocytów B skutkowało także zakłóconą produkcją przeciwciał, które normalnie zapewniają skuteczną odpowiedź przeciwpasożytniczą. Ponadto wykazano udział komórek B produkujących IgA w indukcji odpowiedzi limfocytów Treg (Kim & Kim, 2014), co mogło dodatkowo sprzyjać odpowiedzi regulatorowej, a nie obronnej po podaniu chitozanu. Podsumowując, wpływ chitozanu na odpowiedź przeciwpasożytniczą był bardziej długotrwały na poziomie mechanizmów nabytych, szczególnie humoralnych. Początkowo obserwowano zmiany w reakcji limfocytów T; komórki te opuszczały lokalne węzły limfatyczne lub pozostawały areaktywne. Równocześnie następował intensywny napływ komórek CD4+ i CD8+ do miejsca podania polimeru, co mogło zaburzyć rozwój odpowiedzi Th2 w jelicie, gdzie znajdowały się pasożyty. Odwrotną dynamikę obserwowano w przypadku limfocytów B; komórki te opuszczały jamę otrzewnej (szczególnie populacja B1) i 124 6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą częściowo mogły lokalizować się w MLN. Pomimo zmniejszenia puli tych komórek, w jamie otrzewnej następowała intensywna produkcja przeciwciał klasy IgA rozpoznających krzyżowo antygeny nicieni i sam polimer. Produkcja tej immunoglobuliny wzrastała z czasem, ale nie obserwowano wpływu chitozanu na produkcję pozostałych badanych klas przeciwciał. Odpowiedź przeciwpasożytnicza limfocytów w fazie chronicznej zarażeń była zmieniona tylko lokalnie, w jamie otrzewnej, prawdopodobnie ze względu na zaburzone przez długi stan zapalny funkcje nabłonka i migrację komórek. 125 7. Podsumowanie i wnioski W niniejszej pracy zaprezentowano wyniki dotyczące immunostymulacyjnych właściwości chitozanu oraz udziału tego polimeru w indukcji odpowiedzi przeciwpasożytniczej. Wykazano, że polimer ten wpływa na aktywność komórek odpowiedzi immunologicznej, w tym tych włączonych w reakcje przecipasożytnicze. Otrzymane wyniki nie potwierdzają jednak przyjętych na początku założeń, że chitozan wzmocni odpowiedź typu Th2 i przyczyni się do zwiększonej odporności na zarażenie nicieniami. 7.1 Immunostymulacyjne właściwości chitozanu W badaniach in vitro stwierdzono różnice w rodzaju aktywacji komórek APC w zależności od masy cząsteczkowej chitozanu. Polimer zmieniał ekspresję markerów powierzchniowych na tych komórkach, a charakter tych zmian sugerował różny rodzaj aktywacji, mogący promować odpowiedź Th1 lub Th2 zależną, odpowiednio przez chitozan o małej lub dużej masie cząsteczkowej. Jednak in vivo efekt był odmienny; chitozan o dużej masie, wybrany jako stymulator odpowiedzi typu 2, wywołał po podaniu dootrzewnowym silny lokalny stan zapalny charakteryzujący się napływem neutrofilów i monocytów oraz produkcją cytokin prozapalnych Th1 zależnych. Równocześnie jednak podanie chitozanu zwiększyło poziom TGF-β i IL-10, co skutkowało bliznowaceniem tkanek i tworzeniem ziarniniaków, prawdopodobnie przez aktywację mechanizmów związanych z gojeniem, co następnie zaburzało napływ komórek niezbędnych do zwalczania zarażenia. 7.2 Wpływ na odpowiedź przeciwpasożytniczą Myszy, u których za pomocą chitozanu wywołano stan zapalny jamy otrzewnej, zarażano jednym z 2 gatunków nicieni pasożytniczych, H. polygyrus lub T. spiralis, aby określić wpływ mechanizmów zaindukowanych przez polimer na przebieg odpowiedzi przeciwpasożytniczej. Indukcja odpowiedzi immunologicznej przez chitozan nie zwiększyła reakcji obronnych żywiciela; poziom zarażenia H. polygyrus się nie zmienił, a T. spiralis się zwiększył. Mechanizmy wzbudzone przez chitozan nie sprzyjały zatem zwalczaniu pasożytów. Napływające komórki, pomimo nieznacznej aktywacji pod wpływem antygenów nicieni, nie spełniały funkcji obronnych, prawdopodobnie przez dominację odpowiedzi Th1, która nie jest skuteczna w zwalczaniu badanych pasożytów. Pomimo wzbudzenia stanu zapalnego odpowiedź limfocytów CD4 została zahamowana; komórki nie 126 7. Podsumowanie i wnioski proliferowały w lokalnych węzłach limfatycznych, co znacznie zaburzyło rozwój specyficznej odpowiedzi Th2. Chitozan miał natomiast inny wpływ na limfocyty B; komórki te ulegały aktywacji i produkowały IgA, krzyżowo rozpoznające struktury pasożytów i sam polimer. 7.3 Różnice między gatunkami pasożyta w odpowiedzi na chitozan Podanie chitozanu inaczej wpływało na przebieg zarażenia dwoma badanymi nicieniami; w przypadku H. polygyrus nie obserwowano zmian w poziomie zarażenia, natomiast więcej nicieni T. spiralis zasiedlało żywiciela po podaniu polimeru. Różnice te są związane z nieco inną dynamiką odpowiedzi przeciwpasożytniczej wywoływanej przez te nicienie. Może to być też związane z różnicami w budowie tych pasożytów, ponieważ IgA indukowane przez chitozan rozpoznawało więcej epitopów T. spiralis, przez co mogły silniej wzbudzać mechanizmy tolerancji. Ponadto w przypadku zarażenia H. polygyrus obserwowano łagodzący wpływ nicienia na przebieg stanu zapalnego zaindukowanego przez chitozan. U myszy zarażonych mniej neutrofilów i monocytów napływało do jamy otrzewnej, co wiązało się także z obniżoną produkcją cytokin prozapalnych. Efekt ten nie był obserwowany w czasie zarażenia T. spiralis; w czasie zarażenia stan zapalny wywoływany przez chitozan nie zmieniał się. Możliwe, że ten gatunek nicienia mógłby wykazywać łagodzący wpływ na objawy peritonitis w fazie mięśniowej. Interesującym byłoby podanie chitozanu ok. 30 dpz T. spiralis i określić wtedy przebieg stanu zapalnego otrzewnej. 7.4 Wnioski końcowe Chitozan zmieniając aktywność komórek odpowiedzi immunologicznej wpłynął odmiennie na poziom odpowiedzi przeciwpasożytniczej w czasie zarażenia myszy nicieniami Heligmosomoides polygyrus i Trichinella spiralis, jednak nie zwiększał skuteczności odpowiedzi przeciwpasożytniczej. Przeprowadzone doświadczenia nie potwierdzają początkowych założeń wynikających z danych literaturowych, że chitozan jest induktorem odpowiedzi Th2 zależnej. Stan zapalny wywołany po podaniu dootrzewnowym polimeru wykazywał cechy odpowiedzi Th1 oraz aktywację mechanizmów supresorowych, które miały zapewne chronić żywiciela przez reakcjami patologicznymi. Po zarażeniu, taki stan nie wpływał lub uniemożliwiał skuteczne zwalczanie inwazji, ponieważ układ odpornościowy uczestniczył w neutralizacji polimeru. Takie wyniki sugerują ostrożność w używaniu 127 7. Podsumowanie i wnioski chitozanu jako składnika leków czy szczepionek; podany w nieodpowiedniej formie może stać się dla organizmu czynnikiem szkodliwym, zaburzając funkcjonowanie układu odpornościowego. Ciekawym wynikiem otrzymanym w niniejszej pracy jest stwierdzenie indukcji przez chitozan IgA krzyżowo specyficznych wobec antygenów H. polygyrus, T. spiralis i samego polimeru. Interesującym byłoby zidentyfikowanie jakie struktury pasożyta są przez te przeciwciała rozpoznawane oraz czy mają one funkcje supresorowe. Przedstawione wyniki pokazują jak skomplikowane relacje łączą różne mechanizmy odpowiedzi immunologicznej. Podanie chitozanu wpłynęło na odpowiedź wrodzoną i nabytą oraz lokalną i obwodową zarówno u zwierząt zdrowych, jak i zarażonych nicieniami. Określenie mechanizmu działania tego polimeru na odpowiedź immunologiczną wymaga dalszych badań, aby określić wzajemne relacje między różnymi wzbudzanymi populacjami komórek oraz bezpośredni wpływ chitozanu na komórki odpornościowe. Wyniki uzyskane w prezentowanej pracy pozwalają stwierdzić, że: chitozan o różnej masie cząsteczkowej wykazuje odmienne właściwości aktywowania in vitro komórek odpowiedzi wrodzonej chitozan o dużej masie cząsteczkowej podawany dootrzewnowo wywołuje początkowo silny stan zapalny charakteryzujący się napływem neutrofilów i niedojrzałych monocytów oraz produkcją cytokin prozapalnych jak i regulatorowych po zaprzestaniu podawania chitozanu obserwuje się wzbudzenie mechanizmów związanych z gojeniem tkanek; alternatywną aktywację makrofagów oraz wydzielanie TGF-β i IL-10 zarażenie H. polygyrus myszy, którym podawano chitozan skutkuje złagodzeniem objawów stanu zapalnego u myszy, którym podawano chitozan, w czasie inwazji T. spiralis obserwuje się wyższy poziom zarażenia, a odpowiedź na polimer dominuje odpowiedź przeciwpasożytniczą stan zapalny wywołany przez chitozan hamuje proliferację limfocytów T CD4+, ale także wzbudza produkcję przeciwciał IgA krzyżowo rozpoznających antygeny nicieni oraz sam polimer 128 7. Podsumowanie i wnioski Wyniki, stanowiące podstawę przedstawionej pracy prezentowano na konferencjach: XVI Seminarium Robocze pt. „Nowe aspekty w chemii i zastosowaniu chityny i jej pochodnych”, Zakopane, 22-24.09.10 Plakat: Klaudia Brodaczewska, Katarzyna Donskow, Kinga Jóźwicka, Maria Doligalska „In vitro action of chitosan on immune cells of mice infected with parasitic helminth Heligmosomoides bakeri.” XVII Seminarium Robocze pt. „Nowe aspekty w chemii i zastosowaniu chityny i jej pochodnych”, Warszawa, 21-23.09.11. Prezentacja ustna: Klaudia Brodaczewska, Maria Doligalska „Effect of chitosan on activity of myeloid cells during Heligmosomoides bakeri infection in mice” XI European Multicolloquium of Parasitology, Cluj Napoca, Romania, 25-28.07.12. Plakat: Klaudia Brodaczewska, Katarzyna Donskow-Lysoniewska and Maria Doligalska “Screening for immunostimulant activity of chitosan during Trichinella spiralis infection in mice” XVIII Seminarium Robocze pt. „Nowe aspekty w chemii i zastosowaniu chityny i jej pochodnych”, Bochnia, 19-21.09.12. Prezentacja ustna: Klaudia Brodaczewska, Maria Doligalska, „Zróżnicowany efekt chitozanu o małej i dużej masie cząsteczkowej u myszy zarażonych H. polygyrus. 16th International Congress of Mucosal Immunology, 17-20 lipca 2013, Vancouver, Kanada Plakat: Klaudia Brodaczewska, Natalia Wolaniuk, Katarzyna Donskow-Lysoniewska, Maria Doligalska “Chitosan alters activity of innate immune cells in mice infected with Trichinella spiralis” 15th International Congress of Immunology, 22-27 sierpnia 2013, Mediolan, Włochy Brodaczewska K., Wolaniuk N., Donskow-Łysoniewska K., Doligalska M. (2013) “Chitosan administration stimulates lymphocyte proliferation during muscle phase of infection with Trichinella spiralis infection in mice” EPNOE 2013: "Polysaccharides and polysaccharide-derived products, from basic science to applications", 21-24 Października 2013, Nicea, Francja Prezentacja ustna: Klaudia Brodaczewska, Katarzyna Donskow-Lysoniewska, Maria Doligalska „The in vivo isolation of chitosan by cells in the peritoneal cavity” Plakat: Klaudia Brodaczewska, Natalia Wolaniuk, Katarzyna Donskow-Lysoniewska, Maria Doligalska “Chitosan injections attract cells of innate immunity in mice” XIX Seminarium Robocze pt „Nowe aspekty w chemii i zastosowaniu chityny i jej pochodnych”, 18-20 września 2013 r Żywiec Prezentacja ustna: Klaudia Brodaczewska, Sylwia Szkudlarek, Maria Doligalska „Dendritic cell activation depends on chitosan size” XX Seminarium Robocze pt „Nowe aspekty w chemii i zastosowaniu chityny i jej pochodnych”, 24-24 września 2014 r Łódź Prezentacja ustna: Klaudia Brodaczewska, Katarzyna Donskow-Łysoniewska and Maria Doligalska “Cross-reactivity of IgA induced by chitosan in nematode infection” oraz w publikacjach: Brodaczewska K., Doligalska M. (2012) ”In vivo stimulation of peritoneal cells by chitosan administered in drinking water to mice”. Progress on Chemistry and Application of Chitin and Its Derivatives, Vol. XVII, p.107-112. 129 7. Podsumowanie i wnioski Brodaczewska K., Doligalska M. (2013). “Differential effects of low and high molecular weight chitosan administered intraperitoneally to mice infected with Heligmosomoides polygyrus.” Progress on Chemistry and Application of Chitin and Its Derivatives, Vol. XVIII, p 77-84. Brodaczewska, K., Donskow-Łysoniewska, K., & Doligalska, M. (2015). „Chitin, a key factor in immune regulation: lesson from infection with fungi and chitin bearing parasites.” Acta Parasitologica, 60(2), 337-344. 130 8. Spis literatury 1. Adrangi, S., and Faramarzi, M.A. (2013). From bacteria to human: A journey into the world of chitinases. Biotechnol. Adv. 31, 1786–1785. 2. Allakhverdi, Z., Smith, D.E., Comeau, M.R., and Delespesse, G. (2007). Cutting edge: The ST2 ligand IL-33 potently activates and drives maturation of human mast cells. J. Immunol. 179, 2051–2054. 3. Alvin, A.G., and Angeli, V.F. (2001). Trichinella diagnostics and control: Mandatory and best practices for ensuring food safety. Vet. Parasitol. Role Parasitederived Prostaglandin D2 Inhib. Epidermal Langerhans Cell Migr. Dur. Schistosomiasis Infect. J. Exp. Med. 11351148 193, 3–4. 4. Angeli, V., Faveeuw, C., Roye, O., Fontaine, J., Teissier, E., Capron, a, Wolowczuk, I., Capron, M., and Trottein, F. (2001). Role of the parasite-derived prostaglandin D2 in the inhibition of epidermal Langerhans cell migration during schistosomiasis infection. J. Exp. Med. 193, 1135–1147. 5. Annunziato, R.A., Parbhakar, M., Helcer, J., Kapoor, K., Henkel, K., and Arnon, R. (2014). Strategies for measuring quality of life among pediatric solid-organ transplant recipients. Prog. Transplant. 24, 247–256. 6. Anthony, R.M., Urban, J.F., Alem, F., Hamed, H. a, Rozo, C.T., Boucher, J.-L., Van Rooijen, N., and Gause, W.C. (2006). Memory T(H)2 cells induce alternatively activated macrophages to mediate protection against nematode parasites. Nat. Med. 12, 955–960. 7. Anthony, R.M., Rutitzky, L.I., Urban, J.F., Stadecker, M.J., and Gause, W.C. (2007). Protective immune mechanisms in helminth infection. Nat. Rev. Immunol. 7, 975–987. 8. Ashour, D.S., Othman, a a, Shareef, M.M., Gaballah, H.H., and Mayah, W.W. (2013). Interactions between Trichinella spiralis infection and induced colitis in mice. J. Helminthol. 88, 1–9. 9. Ayroldi, E., Zollo, O., Cannarile, L., D’ Adamio, F., Grohmann, U., Delfino, D. V, and Riccardi, C. (1998). Interleukin-6 (IL-6) prevents activation-induced cell death: IL-2independent inhibition of Fas/fasL expression and cell death. Blood 92, 4212–4219. 10. Azuma, K., Osaki, T., Minami, S., and Okamoto, Y. (2015). Anticancer and antiinflammatory properties of chitin and chitosan oligosaccharides. J. Funct. Biomater. 6, 33–49. 11. Bai, X., Wu, X., Wang, X., Guan, Z., Gao, F., Yu, J., Yu, L., Tang, B., Liu, X., Song, Y., et al. (2012). Regulation of cytokine expression in murine macrophages stimulated by excretory/secretory products from Trichinella spiralis in vitro. Mol. Cell. Biochem. 360, 79–88. 12. Bao, S., Beagley, K.W., Murray, a. M., Caristo, V., Matthaei, K.I., Young, I.G., and Husband, a. J. (1998). Intestinal IgA plasma cells of the B1 lineage are IL-5 dependent. Immunology 94, 181–188. 13. Bao, X., Yuan, H., Wang, C., Liu, J., and Lan, M. (2013). Antitumor and immunomodulatory activities of a polysaccharide from Artemisia argyi. Carbohydr. Polym. 98, 1236–1243. 14. Barreto, R.S., Quintans, J.S., Barreto, A.S., Albuquerque-Júnior, R.L., Galvão, J.G., Gonsalves, J.K., Nunes, R.S., Camargo, E.A., Lucca-Júnior, W., Soares, R.C., et 131 8. Spis literatury al.(2014). Improvement of wound tissue repair by chitosan films containing (-)-borneol, a bicyclic monoterpene alcohol, in rats. Int. Wound J. 15. Beagley, K.W., Eldridge, J.H., Lee, F., Kiyono, H., Everson, M.P., Koopman, W.J., Hirano, T., Kishimoto, T., and McGhee, J.R. (1989). Interleukins and IgA synthesis. Human and murine interleukin 6 induce high rate IgA secretion in IgA-committed B cells. J. Exp. Med. 169, 2133–2148. 16. Beagley, K.W., Murray, a M., McGhee, J.R., and Eldridge, J.H. (1995). Peritoneal cavity CD5 B cells: cytokine induced IgA secretion and homing to intestinal lamina propria in SCID mice. Immunol. Cell Biol. 73, 425–432. 17. Behnke, J.M., Menge, D.M., and Noyes, H. (2009). Heligmosomoides bakeri: a model for exploring the biology and genetics of resistance to chronic gastrointestinal nematode infections. Parasitology 136, 1565–1580. 18. Ben-Smith, a., Wahid, F.N., Lammas, D. a., and Behnke, J.M. (1999). The relationship between circulating and intestinal Heligmosomoides polygyrus-specific IgG1 and IgA and resistance to primary infection. Parasite Immunol. 21, 383–395. 19. Bergquist, R., and Lustigman, S. (2010). Control of Important Helminthic Infections. VaccineDevelopment as Part of the Solution. Adv. Parasitol. 73, 297–326. 20. Bliss, S.K., Alcaraz, A., and Appleton, J. a (2003). IL-10 prevents liver necrosis during murine infection with Trichinella spiralis. J. Immunol. 171, 3142–3147. 21. Bonne-Année, S., Kerepesi, L. a., Hess, J. a., O’Connell, A.E., Lok, J.B., Nolan, T.J., and Abraham, D. (2013). Human and mouse macrophages collaborate with neutrophils to kill larval strongyloides stercoralis. Infect. Immun. 81, 3346–3355. 22. Borkow, G., and Bentwich, Z. (2008). Chronic parasite infections cause immune changes that could affect successful vaccination. Trends Parasitol. 24, 243–245. 23. Brinchmann, B.C., Bayat, M., Brøgger, T., Muttuvelu, D.V., Tjønneland, A., and Sigsgaard, T. (2011). A possible role of chitin in the pathogenesis of asthma and allergy. Ann. Agric. Environ. Med. 18, 7–12. 24. Brodaczewska, K., and Doligalska, M. (2012). In vivo stimulation of peritoneal cells by chitosan administered in drinking water to mice. Prog. Chem. Appl. Chitin Its Deriv. 17, 107–112. 25. Brodaczewska, K., Donskow-Łysoniewska, K., and Doligalska, M. (2015). Chitin, a key factor in immune regulation: lesson from infection with fungi and chitin bearing parasites. Acta Parasitol. 60, 337–344. 26. Bruschi, F., and Chiumiento, L. (2012). Immunomodulation in Trichinellosis: Does Trichinella Really Escape the Host Immune System? Endocrine, Metab. Immune Disord. - Drug Targets 12, 4–15. 27. Bruschi, F., Korenaga, M., and Watanabe, N. (2008). Eosinophils and Trichinella infection: toxic for the parasite and the host? Trends Parasitol. 24, 462–467. 28. Bueter, C.L., Lee, C.K., Rathinam, V. a K., Healy, G.J., Taron, C.H., Specht, C. a., and Levitz, S.M. (2011). Chitosan but not chitin activates the inflammasome by a mechanism dependent upon phagocytosis. J. Biol. Chem. 286, 35447–35455. 29. Bussink, A.P., Speijer, D., Aerts, J.M.F.G., and Boot, R.G. (2007). Evolution of mammalian chitinase(-like) members of family 18 glycosyl hydrolases. Genetics 177, 959–970. 132 8. Spis literatury 30. Canali, M.M., Porporatto, C., Aoki, M.P., Bianco, I.D., and Correa, S.G. (2010). Signals elicited at the intestinal epithelium upon chitosan feeding contribute to immunomodulatory activity and biocompatibility of the polysaccharide. Vaccine 28, 5718–5724. 31. Cash, H.L., Whitham, C. V, Behrendt, C.L., and Hooper, L. V (2006). Symbiotic bacteria direct expression of an intestinal bactericidal lectin. Science 313, 1126–1130. 32. Cervi, L., MacDonald, A.S., Kane, C., Dzierszinski, F., and Pearce, E.J. (2004). Cutting edge: dendritic cells copulsed with microbial and helminth antigens undergo modified maturation, segregate the antigens to distinct intracellular compartments, and concurrently induce microbe-specific Th1 and helminth-specific Th2 responses. J. Immunol. 172, 2016–2020. 33. Charlier, J., van der Voort, M., Kenyon, F., Skuce, P., and Vercruysse, J. (2014). Chasing helminths and their economic impact on farmed ruminants. Trends Parasitol. 30, 361–367. 34. Chen, F., Liu, Z., Wu, W., Rozo, C., Bowdridge, S., Millman, A., Van Rooijen, N., Urban, J.F., Wynn, T. a, and Gause, W.C. (2012). An essential role for TH2-type responses in limiting acute tissue damage during experimental helminth infection. Nat. Med. 18, 260–266. 35. Chen, Y., Huang, B., Huang, S., Yu, X., Li, Y.Y., Song, W., and Lu, F. (2013). Coinfection with Clonorchis sinensis modulates murine host response against Trichinella spiralis infection. Parasitol. Res. 112, 3167–3179. 36. Chu, K.-B., Kim, S.-S., Lee, S.-H., Lee, H.-S., Joo, K.-H., Lee, J.-H., Lee, Y.-S., Zheng, S., and Quan, F.-S. (2014) Enhanced protection against Clonorchis sinensis induced by co-infection with Trichinella spiralis in rats. Parasite Immunol. 36, 522–530. 37. Cui, J., Liu, R.D., Wang, L., Zhang, X., Jiang, P., Liu, M.Y., and Wang, Z.Q. (2013). Proteomic analysis of surface proteins of Trichinella spiralis muscle larvae by twodimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Parasit. Vectors 6, 355. 38. Darwin Murrell, K., and Pozio, E. (2011). Worldwide occurrence and impact of human trichinellosis, 1986-2009. 39. Deshmane, S.L., Kremlev, S., Amini, S., and Sawaya, B.E. (2009). Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1): an overview. J. Interferon Cytokine Res. 29, 313– 326. 40. Despommier, D.G. V (2005). The Nematodes. W D G Apple Trees Prod. 41. Despommier, D., Symmans, W.F., and Dell, R. (1991). Changes in nurse cell nuclei during synchronous infection with Trichinella spiralis. J. Parasitol. 77, 290–295. 42. Van Die, I., van Vliet, S.J., Nyame, A.K., Cummings, R.D., Bank, C.M.C., Appelmelk, B., Geijtenbeek, T.B.H., and van Kooyk, Y. (2003). The dendritic cell-specific C-type lectin DC-SIGN is a receptor for Schistosoma mansoni egg antigens and recognizes the glycan antigen Lewis x. Glycobiology 13, 471–478. 43. Doener, F., Michel, A., Reuter, S., Friedrich, P., Böhm, L., Relle, M., Codarri, L., Tenzer, S., Klein, M., Bopp, T., et al. (2013). Mast cell-derived mediators promote murine neutrophil effector functions. Int. Immunol. 25, 553–561. 44. Doligalska, M., Rzepecka, J., Drela, N., Donskow, K., and Gerwel-Wronka, M. (2006). The role of TGF-beta in mice infected with Heligmosomoides polygyrus. Parasite Immunol. 28, 387–395. 133 8. Spis literatury 45. Doligalska, M., Brodaczewska, K., and Donskow- Lysoniewska, K. (2012). The antiapoptotic activity of Heligmosomoides polygyrus antigen fractions. Parasite Immunol. 34, 589–603. 46. Donskow-Łysoniewska, K., Krawczak, K., and Doligalska, M. (2012). Heligmosomoides polygyrus: EAE remission is correlated with different systemic cytokine profiles provoked by L4 and adult nematodes. Exp. Parasitol. 132, 243–248. 47. Donskow-Łysoniewska, K., Bien, J., Brodaczewska, K., Krawczak, K., and Doligalska, M. (2013). Colitis Promotes Adaptation of an Intestinal Nematode: A Heligmosomoides Polygyrus Mouse Model System. PLoS One 8. 48. Donskow-Schmelter, K., Doligalska, M., Rzepecka, J., and Jedlina-Panasiuk, L. (2007). Heligmosomoides polygyrus: Decreased apoptosis in fast responder FVB mice during infection. Exp. Parasitol. 117, 149–156. 49. Dutta, P.K. (2004). Chitin and chitosan: Chemistry, properties and applications. J. Sci. Ind. Res. (India). 63, 20–31. 50. East, L., and Isacke, C.M. (2002). The mannose receptor family. Biochim. Biophys. Acta 1572, 364–386. 51. Eberl, M., Langermans, J. a, Vervenne, R. a, Nyame, a K., Cummings, R.D., Thomas, a W., Coulson, P.S., and Wilson, R. a (2001). Antibodies to glycans dominate the host response to schistosome larvae and eggs: is their role protective or subversive? J. Infect. Dis. 183, 1238–1247. 52. Elliott, D.E., and Weinstock, J. V. (2009). Helminthic therapy: Using worms to treat immune-mediated disease. Adv. Exp. Med. Biol. 666, 157–166. 53. European Food Safety Authority (EFSA) (2006). The Community Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents, Antimicrobial Resistance and Foodborne Outbreaks in the European Union in 2005. EFSA J. 94, 288. 54. Fagarasan, S., and Honjo, T. (2003). Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3, 63–72. 55. Fahmy, M. a M. (1956). An investigation on the life cycle of Nematospiroides dubius (nematoda: heligmosomidae) with special reference to the free-living stages. Zeitschrift F??r Parasitenkd. 17, 394–399. 56. Fielding, C. a, McLoughlin, R.M., McLeod, L., Colmont, C.S., Najdovska, M., Grail, D., Ernst, M., Jones, S. a, Topley, N., and Jenkins, B.J. (2008). IL-6 regulates neutrophil trafficking during acute inflammation via STAT3. J. Immunol. 181, 2189–2195. 57. Fierens, K., and Kool, M. (2012). The Mechanism of Adjuvanticity of AluminiumContaining Formulas. Curr. Pharm. Des. 18, 2305–2313. 58. Finkelman, F.D., Madden, K.B., Cheever, a W., Katona, I.M., Morris, S.C., Gately, M.K., Hubbard, B.R., Gause, W.C., and Urban, J.F. (1994). Effects of interleukin 12 on immune responses and host protection in mice infected with intestinal nematode parasites. J. Exp. Med. 179, 1563–1572. 59. Finkelman, F.D., Shea-Donohue, T., Morris, S.C., Gildea, L., Strait, R., Madden, K.B., Schopf, L., and Urban, J.F. (2004). Interleukin-4- and interleukin-13-mediated host protection against intestinal nematode parasites. Immunol. Rev. 201, 139–155. 60. Fong, D., Ariganello, M.B., Girard-Lauzière, J., and Hoemann, C.D. (2015) Biodegradable chitosan microparticles induce delayed STAT-1 activation and lead to 134 8. Spis literatury distinct cytokine responses in differentially polarized human macrophages in vitro. Acta Biomater. 12, 183–194. 61. Foster, J.M., Zhang, Y., Kumar, S., and Carlow, C.K.S. (2005). Parasitic nematodes have two distinct chitin synthases. Mol. Biochem. Parasitol. 142, 126–132. 62. Free, S.J. (2013). Chapter Two - Fungal Cell Wall Organization and Biosynthesis. Adv. Genet. 81, 33–82. 63. Garg, N.K., Mangal, S., Khambete, H., Sharma, P.K., and Tyagi, R.K. (2010). Mucosal delivery of vaccines: role of mucoadhesive/biodegradable polymers. Recent Pat. Drug Deliv. Formul. 4, 114–128. 64. Gause, W.C., Wynn, T. a, and Allen, J.E. (2013). Type 2 immunity and wound healing: evolutionary refinement of adaptive immunity by helminths. Nat. Rev. Immunol. 13, 607–614. 65. Geissmann, F., Manz, M.G., Jung, S., Sieweke, M.H., Merad, M., and Ley, K. (2010). Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science 327, 656–661. 66. Ghosn, E.E.B., Cassado, A. a, Govoni, G.R., Fukuhara, T., Yang, Y., Monack, D.M., Bortoluci, K.R., Almeida, S.R., Herzenberg, L. a, and Herzenberg, L. a (2010). Two physically, functionally, and developmentally distinct peritoneal macrophage subsets. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 2568–2573. 67. Gilabert, A., and Wasmuth, J.D. (2013). Unravelling parasitic nematode natural history using population genetics. Trends Parasitol. 29, 438–448. 68. Gomez-Escobar, N., Gregory, W.F., and Maizels, R.M. (2000). Identification of tgh-2, a filarial nematode homolog of Caenorhabditis elegans daf-7 and human transforming growth factor ??, expressed in microfilarial and adult stages of Brugia malayi. Infect. Immun. 68, 6402–6410. 69. Goodridge, H.S., Marshall, F. a, Else, K.J., Houston, K.M., Egan, C., Al-Riyami, L., Liew, F.-Y., Harnett, W., and Harnett, M.M. (2005). Immunomodulation via novel use of TLR4 by the filarial nematode phosphorylcholine-containing secreted product, ES62. J. Immunol. 174, 284–293. 70. Gordon, S. (2002). Pattern recognition receptors: Doubling up for the innate immune response. Cell 111, 927–930. 71. Gordon, S., and Martinez, F.O. (2010). Alternative activation of macrophages: Mechanism and functions. Immunity 32, 593–604. 72. Gore, D.P. (2014). L. . In vitro hyporesponsiveness of CD4+ and CD8+ T cells in septic patients with faecal peritonitis. 1851 192 SRC -. 73. Granger, J.I., Ratti, P.L., Datta, S.C., Raymond, R.M., and Opp, M.R. (2013). Sepsisinduced morbidity in mice: Effects on body temperature, body weight, cage activity, social behavior and cytokines in brain. Psychoneuroendocrinology 38, 1047–1057. 74. Grencis, R.K. (1997). Th2-mediated host protective immunity to intestinal nematode infections. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 352, 1377–1384. 75. Grove, D.I., and Northern, C. (1989). Dissociation of the protective immune response in the mouse to Strongyloides ratti. J. Helminthol. 63, 307–314. 76. Guiducci, C., Vicari, a P., Sangaletti, S., Trinchieri, G., and Colombo, M.P. (2005). Redirecting in vivo elicited tumor infiltrating macrophages and dendritic cells towards tumor rejection. Cancer Res 65, 3437–3446. 135 8. Spis literatury 77. Ha, S., Tsuji, M., Suzuki, K., Meek, B., Yasuda, N., Kaisho, T., and Fagarasan, S. (2006). Regulation of B1 cell migration by signals through Toll-like receptors. J. Exp. Med. 203, 2541–2550. 78. Harris, N., and Gause, W.C. (2011). To B or not to B: B cells and the Th2-type immune response to helminths. Trends Immunol. 32, 80–88. 79. Hashimoto, D., Miller, J., and Merad, M. (2011). Dendritic Cell and Macrophage Heterogeneity In Vivo. Immunity 35, 323–335. 80. Hayakawa, K., Hardy, R.R., Stall, a. M., Herzenberg, L. a., and Herzenberg, L. a. (1986). Immunoglobulin-bearing B cells reconstitute and maintain the murine Ly-1 B cell lineage. Eur. J. Immunol. 16, 1313–1316. 81. Heimburg-Molinaro, J., and Rittenhouse-Olson, K. (2009). Glycomics. Methods 534, 341–357. 82. Helmby, H., and Grencis, R.K. (2002). IL-18 regulates intestinal mastocytosis and Th2 cytokine production independently of IFN-gamma during Trichinella spiralis infection. J. Immunol. 169, 2553–2560. 83. Hepworth, M.R., Maurer, M., and Hartmann, S. (2012). Regulation of type 2 immunity to helminths by mast cells. Gut Microbes 3, 476–481. 84. Herbert, D.R., Hölscher, C., Mohrs, M., Arendse, B., Schwegmann, A., Radwanska, M., Leeto, M., Kirsch, R., Hall, P., Mossmann, H., et al. (2004). Alternative macrophage activation is essential for survival during schistosomiasis and downmodulates T helper 1 responses and immunopathology. Immunity 20, 623–635. 85. Hettinger, J., Richards, D.M., Hansson, J., Barra, M.M., Joschko, A.-C., Krijgsveld, J., and Feuerer, M. (2013). Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nat. Immunol. 14, 821–830. 86. Hewitson, J.P., and Maizels, R.M. (2014). Vaccination against helminth parasite infections. Expert Rev. Vaccines 13, 473–487. 87. Hewitson, J.P., Filbey, K.J., Grainger, J.R., Dowle, A.A., Pearson, M., Murray, J., Harcus, Y., and Maizels, R.M. (2011). Heligmosomoides polygyrus elicits a dominant nonprotective antibody response directed against restricted glycan and peptide epitopes. J. Immunol. 187, 4764–4777. 88. Holland, M.J., Harcus, Y.M., Riches, P.L., and Maizels, R.M. (2000). Proteins secreted by the parasitic nematode Nippostrongylus brasiliensis act as adjuvants for Th2 responses. Eur. J. Immunol. 30, 1977–1987. 89. Hsu, L.W., Lee, P.L., Chen, C.T., Mi, F.L., Juang, J.H., Hwang, S.M., Ho, Y.C., and Sung, H.W. (2012). Elucidating the signaling mechanism of an epithelial tight-junction opening induced by chitosan. Biomaterials 33, 6254–6263. 90. Huang, D., Nie, S., Jiang, L., and Xie, M. (2014). A novel polysaccharide from the seeds of Plantago asiatica L. Induces dendritic cells maturation through toll-like receptor 4. Int. Immunopharmacol. 18, 236–243. 91. Hussaarts, L., Yazdanbakhsh, M., and Guigas, B. (2014). Priming Dendritic Cells for Th2 Polarization: Lessons Learned from Helminths and Implications for Metabolic Disorders. Front. Immunol. 5, 499. 92. Ilic, N., Gruden-Movsesijan, A., and Sofronic-Milosavljevic, L. (2012). Trichinella spiralis: shaping the immune response. Immunol. Res. 52, 111–119. 136 8. Spis literatury 93. Inaba, T., Sato, H., and Kamiya, H. (2003). Monoclonal IgA antibody-mediated expulsion of Trichinella from the intestine of mice. Parasitology 126, 591–598. 94. Islam, M.A., Firdous, J., Choi, Y.J., Yun, C.H., and Cho, C.S. (2012). Design and application of chitosan microspheres as oral and nasal vaccine carriers: An updated review. Int. J. Nanomedicine 7, 6077–6093. 95. Itakura, A., Szczepanik, M., Campos, R.A., Paliwal, V., Majewska, M., Matsuda, H., Takatsu, K., and Askenase, P.W. (2005). An hour after immunization peritoneal B-1 cells are activated to migrate to lymphoid organs where within 1 day they produce IgM antibodies that initiate elicitation of contact sensitivity. J. Immunol. 175, 7170–7178. 96. Jankovic, D., Kullberg, M.C., Caspar, P., and Sher, A. (2004). Parasite-induced Th2 polarization is associated with down-regulated dendritic cell responsiveness to Th1 stimuli and a transient delay in T lymphocyte cycling. J. Immunol. 173, 2419–2427. 97. Jansen, M.J., Hendriks, T., Verhofstad, A.A., Lange, W., Geeraedts, L.M., and Goris, R.J. (1997). Gradual development of organ damage in the murine zymosan-induced multiple organ dysfunction syndrome. Shock 8, 261–267. 98. Jia, L., Gao, X., Wang, Y., Yao, N., and Zhang, X. (2014). Structural, phenotypic and functional maturation of bone marrow dendritic cells (BMDCs) induced by Chitosan (CTS). Biologicals 42, 334–338. 99. Jiang, X., Shen, C., Rey-Ladino, J., Yu, H., and Brunham, R.C. (2008). Characterization of Murine Dendritic Cell Line JAWS II and Primary Bone Marrow-Derived Dendritic Cells in Chlamydia muridarum Antigen Presentation and Induction of Protective Immunity. Infect. Immun. 76, 2392–2401. 100. Kay, E., Scotland, R.S., and Whiteford, J.R. (2013). Toll-like receptors: Role in inflammation and therapeutic potential. Biofactors 40, 284–294. 101. Kim, M.S., and Kim, T.S. (2014). IgA+ plasma cells in murine intestinal lamina propria as a positive regulator of Treg differentiation. J. Leukoc. Biol. 95, 461–469. 102. Kim, J.-S., Kim, J.-G., Moon, M.-Y., Jeon, C.-Y., Won, H.-Y., Kim, H.-J., Jeon, Y.-J., Seo, J.-Y., Kim, J.-I., Kim, J., et al. (2006). Transforming growth factor-beta1 regulates macrophage migration via RhoA. Blood 108, 1821–1829. 103. Kita, H. (2011). Eosinophils: Multifaceted biological properties and roles in health and disease. Immunol. Rev. 242, 161–177. 104. Van der Kleij, D., Latz, E., Brouwers, J.F.H.M., Kruize, Y.C.M., Schmitz, M., KurtJones, E.A., Espevik, T., de Jong, E.C., Kapsenberg, M.L., Golenbock, D.T., et al. (2002). A novel host-parasite lipid cross-talk. Schistosomal lyso-phosphatidylserine activates toll-like receptor 2 and affects immune polarization. J. Biol. Chem. 277, 48122–48129. 105. Klion, A.D., and Nutman, T.B. (2004). The role of eosinophils in host defense against helminth parasites. J. Allergy Clin. Immunol. 113, 30–37. 106. Knopp, S., Steinmann, P., Keiser, J., and Utzinger, J. (2012). Nematode infections: soiltransmitted helminths and trichinella. Infect. Dis. Clin. North Am. 26, 341–358. 107. Knox, D.P., Redmond, D.L., Newlands, G.F., Skuce, P.J., Pettit, D., and Smith, W.D. (2003). The nature and prospects for gut membrane proteins as vaccine candidates for Haemonchus contortus and other ruminant trichostrongyloids. Int. J. Parasitol. 33, 1129–1137. 137 8. Spis literatury 108. Kołodziej-Sobocińska, M., Dvoroznakova, E., and Dziemian, E. (2006). Trichinella spiralis: macrophage activity and antibody response in chronic murine infection. Exp. Parasitol. 112, 52–62. 109. Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., and Kuchroo, V.K. (2009). IL-17 and Th17 Cells. Annu. Rev. Immunol. 27, 485–517. 110. Koyama, K., Tamauchi, H., and Ito, Y. (1995). The role of CD4+ and CD8+ T cells in protective immunity to the murine nematode parasite Trichuris muris. Parasite Immunol. 17, 161–165. 111. Kreindler, J.L., Steele, C., Nguyen, N., Chan, Y.R., Pilewski, J.M., Alcorn, J.F., Vyas, Y.M., Aujla, S.J., Finelli, P., Blanchard, M., et al. (2010). Vitamin D3 attenuates Th2 responses to Aspergillus fumigatus mounted by CD4+ T cells from cystic fibrosis patients with allergic bronchopulmonary aspergillosis. J. Clin. Invest. 120, 3242–3254. 112. Kroese, F.G., Butcher, E.C., Stall, A.M., Lalor, P.A., Adams, S., and Herzenberg, L.A. (1989). Many of the IgA producing plasma cells in murine gut are derived from selfreplenishing precursors in the peritoneal cavity. Int. Immunol. 1, 75–84. 113. Lee, J.J., and Lee, N. a. (2005). Eosinophil degranulation: An evolutionary vestige or a universally destructive effector function? Clin. Exp. Allergy 35, 986–994. 114. Lee, B.Y., Bacon, K.M., Bailey, R., Wiringa, A.E., and Smith, K.J. (2011). The potential economic value of a hookworm vaccine. Vaccine 29, 1201–1210. 115. Lee, C.G., Da Silva, C. a., Lee, J.Y., Hartl, D., and Elias, J. a. (2008). Chitin regulation of immune responses: an old molecule with new roles. Curr. Opin. Immunol. 20, 684– 689. 116. Lenardon, M.D., Munro, C.A., and Gow, N.A.R. (2010). Chitin synthesis and fungal pathogenesis. Curr. Opin. Microbiol. 13, 416–423. 117. Lim, C.K., Halim, a S., Lau, H.Y., Ujang, Z., and Hazri, A. (2007). In vitro cytotoxicology model of oligo-chitosan and n, o-carboxymethyl chitosan using primary normal human epidermal keratinocyte cultures. J. Appl. Biomater. Biomech. 5, 82–87. 118. Lin, C.Y., Chen, W.P., Yang, L.Y., Chen, A., and Huang, T.P. (1998). Persistent transforming growth factor-beta 1 expression may predict peritoneal fibrosis in CAPD patients with frequent peritonitis occurrence. Am. J. Nephrol. 18, 513–519. 119. Lindell, D.M., Berlin, A.A., Schaller, M.A., and Lukacs, N.W. (2008). B cell antigen presentation promotes Th2 responses and immunopathology during chronic allergic lung disease. PLoS One 3, e3129. 120. Liu, S.K. (1965). Pathology of Nematospiroides dubius. I. Primary infections in C3H and Webster mice. Exp. Parasitol. 17, 123–135. 121. Liu, Q., Arseculeratne, C., Liu, Z., Whitmire, J., Grusby, M.J., Finkelman, F.D., Darling, T.N., Cheever, A.W., Swearengen, J., Urban, J.F., et al. (2004a). Simultaneous deficiency in CD28 and STAT6 results in chronic ectoparasite-induced inflammatory skin disease. Infect. Immun. 72, 3706–3715. 122. Liu, Z., Liu, Q., Pesce, J., Anthony, R.M., Lamb, E., Whitmire, J., Hamed, H., Morimoto, M., Urban, J.F., and Gause, W.C. (2004b). Requirements for the development of IL-4-producing T cells during intestinal nematode infections: what it takes to make a Th2 cell in vivo. Immunol. Rev. 201, 57–74. 138 8. Spis literatury 123. MacDonald, A.S., and Maizels, R.M. (2008). Alarming dendritic cells for Th2 induction. J. Exp. Med. 205, 13–17. 124. MacDonald, A.S., Araujo, M.I., and Pearce, E.J. (2002). Immunology of parasitic helminth infections. Infect. Immun. 70, 427–433. 125. MacKay, V.L., and Moore, E.E. (1997). Immortalized dendritic cells. US Pat. 5,648,219. 126. Macpherson, A.J., Gatto, D., Sainsbury, E., Harriman, G.R., Hengartner, H., and Zinkernagel, R.M. (2000). A primitive T cell-independent mechanism of intestinal mucosal IgA responses to commensal bacteria. Science 288, 2222–2226. 127. Maizels, R.M., Holland, M.J., Falcone, F.H., Zang, X.X., and Yazdanbakhsh, M. (1999). Vaccination against helminth parasites - The ultimate challenge for vaccinologists? Immunol. Rev. 171, 125–147. 128. Maizels, R.M., Blaxter, M.L., and Scott, A.L. (2001). Immunological genomics of Brugia malayi: Filarial genes implicated in immune evasion and protective immunity. Parasite Immunol. 23, 327–344. 129. Maizels, R.M., Balic, A., Gomez-Escobar, N., Nair, M., Taylor, M.D., and Allen, J.E. (2004). Helminth parasites - Masters of regulation. Immunol. Rev. 201, 89–116. 130. Malinovsky, F.G., Fangel, J.U., and Willats, W.G.T. (2014). The role of the cell wall in plant immunity. Front. Plant Sci. 5, 178. 131. Mann, A.J., Noulin, N., Catchpole, A., Stittelaar, K.J., De Waal, L., Veldhuis Kroeze, E.J.B., Hinchcliffe, M., Smith, A., Montomoli, E., Piccirella, S., et al. (2014). Intranasal H5N1 vaccines, adjuvanted with chitosan derivatives, protect ferrets against highly pathogenic influenza intranasal and intratracheal challenge. PLoS One 9, e93761. 132. Manolova, V., Flace, A., Bauer, M., Schwarz, K., Saudan, P., and Bachmann, M.F. (2008). Nanoparticles target distinct dendritic cell populations according to their size. Eur. J. Immunol. 38, 1404–1413. 133. Manoury, B., Gregory, W.F., Maizels, R.M., and Watts, C. (2001). Bm-CPI-2, a cystatin homolog secreted by the filarial parasite Brugia malayi, inhibits class II MHCrestricted antigen processing. Curr. Biol. 11, 447–451. 134. Mant, A., Chinnery, F., Elliott, T., and Williams, A.P. (2012). The pathway of crosspresentation is influenced by the particle size of phagocytosed antigen. Immunology 136, 163–175. 135. Martin, F., and Kearney, J.F. (2001). B1 cells: similarities and differences with other B cell subsets. Curr. Opin. Immunol. 13, 195–201. 136. Martín-Fontecha, A., Lanzavecchia, A., and Sallusto, F. (2009). Dendritic cell migration to peripheral lymph nodes. Handb. Exp. Pharmacol. 31–49. 137. Maseda, D., Candando, K.M., Smith, S.H., Kalampokis, I., Weaver, C.T., Plevy, S.E., Poe, J.C., and Tedder, T.F. (2013). Peritoneal cavity regulatory B cells (B10 cells) modulate IFN-γ+CD4+ T cell numbers during colitis development in mice. J. Immunol. 191, 2780–2795. 138. McCoy, K.D., Stoel, M., Stettler, R., Merky, P., Fink, K., Senn, B.M., Schaer, C., Massacand, J., Odermatt, B., Oettgen, H.C., et al. (2008). Polyclonal and Specific Antibodies Mediate Protective Immunity against Enteric Helminth Infection. Cell Host Microbe 4, 362–373. 139 8. Spis literatury 139. McVay, C.S., Tsung, A., and Appleton, J. (1998). Participation of parasite surface glycoproteins in antibody-mediated protection of epithelial cells against Trichinella spiralis. Infect. Immun. 66, 1941–1945. 140. Meeusen, E.N.T., and Balic, a. (2000). Do eosinophils have a role in the killing of helminth parasites? Parasitol. Today 16, 95–101. 141. Mei, Y., Chen, H., Zhang, J., Zhang, X., and Liang, Y. (2013). Protective effect of chitooligosaccharides against cyclophosphamide-induced immunosuppression in mice. Int. J. Biol. Macromol. 62, 330–335. 142. Merzendorfer, H. (2013). Chitin synthesis inhibitors: Old molecules and new developments. Insect Sci. 20, 121–138. 143. Metwali, A., Setiawan, T., Blum, A.M., Urban, J., Elliott, D.E., Hang, L., and Weinstock, J. V (2006). Induction of CD8+ regulatory T cells in the intestine by Heligmosomoides polygyrus infection. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 291, G253–G259. 144. Misharin, A. V, Saber, R., and Perlman, H. (2012). Eosinophil contamination of thioglycollate-elicited peritoneal macrophage cultures skews the functional readouts of in vitro assays. J. Leukoc. Biol. 92, 325–331. 145. Molinaro, G., Leroux, J.-C., Damas, J., and Adam, A. (2002). Biocompatibility of thermosensitive chitosan-based hydrogels: an in vivo experimental approach to injectable biomaterials. Biomaterials 23, 2717–2722. 146. Monroy, F.G., and Enriquez, F.J. (1992). Heligmosomoides polygyrus: a model for chronic gastrointestinal helminthiasis. Parasitol. Today 8, 49–54. 147. Moon, H., Lee, J.-G., Shin, S.H., and Kim, T.J. (2012). LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12. J. Korean Med. Sci. 27, 27–35. 148. Moreau, E., and Chauvin, A. (2010). Immunity against helminths: Interactions with the host and the intercurrent infections. J. Biomed. Biotechnol. 2010. 149. Mori, T., Murakami, M., Okumura, M., Kadosawa, T., Uede, T., and Fujinaga, T. (2005). Mechanism of macrophage activation by chitin derivatives. J. Vet. Med. Sci. 67, 51–56. 150. Mosmann, T.R., Cherwinski, H., Bond, M.W., Giedlin, M. a, and Coffman, R.L. (1986). Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J. Immunol. 136, 2348–2357. 151. Muzzarelli, R.A. (1997). Human enzymatic activities related to the therapeutic administration of chitin derivatives. Cell. Mol. Life Sci. 53, 131–140. 152. Nair, M.G., Gallagher, I.J., Taylor, M.D., Loke, P., Coulson, P.S., Wilson, R. a., Maizels, R.M., and Allen, J.E. (2005). Chitinase and Fizz family members are a generalized feature of nematode infection with selective upregulation of Ym1 and Fizz1 by antigen-presenting cells. Infect. Immun. 73, 385–394. 153. Netea, M.G., Van Der Meer, J.W.M., Sutmuller, R.P., Adema, G.J., and Kullberg, B.J. (2005). From the Th1/Th2 paradigm towards a toll-like receptor/T-helper bias. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 3991–3996. 154. O’Dea, E.M., Amarsaikhan, N., Li, H., Downey, J., Steele, E., Van Dyken, S.J., Locksley, R.M., and Templeton, S.P. (2014). Eosinophils are recruited in response to 140 8. Spis literatury chitin exposure and enhance Th2-mediated immune pathology in aspergillus Fumigatus infection. Infect. Immun. 82, 3199–3205. 155. Onah, D.N., and Nawa, Y. (2000). Mucosal immunity against parasitic gastrointestinal nematodes. Korean J. Parasitol. 38, 209–236. 156. Otsu, S., Gotoh, K., Yamashiro, T., Yamagata, J., Shin, K., Fujioka, T., and Nishizono, A. (2006). Transfer of antigen-pulsed dendritic cells induces specific T-cell proliferation and a therapeutic effect against long-term Helicobacter pylori infection in mice. Infect. Immun. 74, 984–993. 157. Otterlei, M., Vårum, K.M., Ryan, L., and Espevik, T. (1994). Characterization of binding and TNF-α-inducing ability of chitosans on monocytes: The involvement of CD14. Vaccine 12, 825–832. 158. Owyang, A.M., Zaph, C., Wilson, E.H., Guild, K.J., McClanahan, T., Miller, H.R.P., Cua, D.J., Goldschmidt, M., Hunter, C. a, Kastelein, R. a, et al. (2006). Interleukin 25 regulates type 2 cytokine-dependent immunity and limits chronic inflammation in the gastrointestinal tract. J. Exp. Med. 203, 843–849. 159. Pan, C., Kumar, C., Bohl, S., Klingmueller, U., and Mann, M. (2008). Comparative Proteomic Phenotyping of Cell Lines and Primary Cells to Assess Preservation of Cell Type-specific Functions. Mol. Cell. Proteomics 8, 443–450. 160. Pashine, A., Valiante, N.M., and Ulmer, J.B. (2005). Targeting the innate immune response with improved vaccine adjuvants. Nat. Med. 11, S63–S68. 161. Patel, N., Kreider, T., Urban, J.F., and Gause, W.C. (2009). Characterisation of effector mechanisms at the host:parasite interface during the immune response to tissuedwelling intestinal nematode parasites. Int. J. Parasitol. 39, 13–21. 162. Paul, W.E. (2010). What determines Th2 differentiation, in vitro and in vivo? Immunol. Cell Biol. 88, 236–239. 163. Phythian-Adams, A.T., Cook, P.C., Lundie, R.J., Jones, L.H., Smith, K. a, Barr, T. a, Hochweller, K., Anderton, S.M., Hämmerling, G.J., Maizels, R.M., et al. (2010). CD11c depletion severely disrupts Th2 induction and development in vivo. J. Exp. Med. 207, 2089–2096. 164. Porporatto, C., Bianco, I.D., and Correa, S.G. (2005). Local and systemic activity of the polysaccharide chitosan at lymphoid tissues after oral administration. J. Leukoc. Biol. 78, 62–69. 165. Ramakrishnan, L. (2012). Revisiting the role of the granuloma in tuberculosis. Nat. Rev. Immunol. 12, 352–366. 166. Ramalingam, T., Rajan, B., Lee, J., and Rajan, T. V. (2003). Kinetics of cellular responses to intraperitoneal Brugia pahangi infections in normal and immunodeficient mice. Infect. Immun. 71, 4361–4367. 167. Ray, A., and Dittel, B.N. (2010). Isolation of mouse peritoneal cavity cells. J. Vis. Exp. 447, 92–96. 168. Reese, T. a, Liang, H.-E., Tager, A.M., Luster, A.D., Van Rooijen, N., Voehringer, D., and Locksley, R.M. (2007). Chitin induces accumulation in tissue of innate immune cells associated with allergy. Nature 447, 92–96. 169. Reynolds, L. a., Filbey, K.J., and Maizels, R.M. (2012). Immunity to the model intestinal helminth parasite Heligmosomoides polygyrus. 141 8. Spis literatury 170. Rincón, M., Anguita, J., Nakamura, T., Fikrig, E., and Flavell, R.A. (1997). Interleukin (IL)-6 directs the differentiation of IL-4-producing CD4+ T cells. J. Exp. Med. 185, 461–469. 171. Robinson, M.W., Gare, D.C., and Connolly, B. (2005). Profiling excretory/secretory proteins of Trichinella spiralis muscle larvae by two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Vet. Parasitol. 132, 37–41. 172. Robinson, M.W., Greig, R., Beattie, K. a., Lamont, D.J., and Connolly, B. (2007). Comparative analysis of the excretory-secretory proteome of the muscle larva of Trichinella pseudospiralis and Trichinella spiralis. Int. J. Parasitol. 37, 139–148. 173. Roy, B., Brennecke, A.M., Agarwal, S., Krey, M., Düber, S., and Weiss, S. (2013a). An intrinsic propensity of murine peritoneal B1b cells to switch to IgA in presence of TGFβ and retinoic acid. PLoS One 8, e82121. 174. Roy, R.M., Paes, H.C., Nanjappa, S.G., Sorkness, R., Gasper, D., Sterkel, A., Wüthrich, M., and Klein, B.S. (2013b). Complement component 3C3 and C3a receptor are required in chitin-dependent allergic sensitization to Aspergillus fumigatus but dispensable in chitin-induced innate allergic inflammation. MBio 4. 175. Rückerl, D., and Allen, J.E. (2014). Macrophage proliferation, provenance, and plasticity in macroparasite infection. Immunol. Rev. 262, 113–133. 176. Sackett, D., Holmes, P., Abbott, K., Jephcott, S., and Barber, M. (2006). Assessing the economic cost of endemic disease on the profitability of Australian beef cattle and sheep producers. AHW 87 119. 177. Satoh, T., Takeuchi, O., Vandenbon, A., Yasuda, K., Tanaka, Y., Kumagai, Y., Miyake, T., Matsushita, K., Okazaki, T., Saitoh, T., et al. (2010). The Jmjd3-Irf4 axis regulates M2 macrophage polarization and host responses against helminth infection. Nat. Immunol. 11, 936–944. 178. Schlosser, A., Thomsen, T., Moeller, J.B., Nielsen, O., Tornøe, I., Mollenhauer, J., Moestrup, S.K., and Holmskov, U. (2009). Characterization of FIBCD1 as an acetyl group-binding receptor that binds chitin. J. Immunol. 183, 3800–3809. 179. Shadman, N., Ebrahimi, S.F., Jafari, S., and Eslami, M. (2009). Peripheral giant cell granuloma: a review of 123 cases. Dent. Res. J. (Isfahan). 6, 47–50. 180. Shanta, C.S., and Meerovitch, E. (1967). The life cycle of trichinella spiralis. I. The intestinal phase of development. Can. J. Zool. 45, Suppl:1255–1260. 181. Sharifi, S., Behzadi, S., Laurent, S., Forrest, M.L., Stroeve, P., and Mahmoudi, M. (2012). Toxicity of nanomaterials. Chem. Soc. Rev. 41, 2323–2343. 182. Shimoda, K., van Deursen, J., Sangster, M.Y., Sarawar, S.R., Carson, R.T., Tripp, R. a, Chu, C., Quelle, F.W., Nosaka, T., Vignali, D. a, et al. (1996). Lack of IL-4-induced Th2 response and IgE class switching in mice with disrupted Stat6 gene. Nature 380, 630–633. 183. Shintoku, Y., Kadosaka, T., Kimura, E., Takagi, H., Kondo, S., and Itoh, M. (2013). Intestinal mast cells and eosinophils in relation to Strongyloides ratti adult expulsion from the small and large intestines of rats. Parasitology 140, 626–631. 184. Sica, A., and Mantovani, A. (2012). JCI - Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787–795. 142 8. Spis literatury 185. Soga, K., Yamada, M., and Naito, Y. (2013). Mucin-Related Molecular Responses of Bronchial Epithelial Cells in Rats Infected with the Nematode Nippostrongylus brasiliensis. ISRN Parasitol. 186. Spencer, L.A. (2014). Eosinophil secretion of granule-derived cytokines. Front. Immunol. 5. 187. Stacey, G. (2001). Primary Cell Cultures and Immortal Cell Lines. eLS. 188. Stein, J. V., and Nombela-Arrieta, C. (2005). Chemokine control of lymphocyte trafficking: A general overview. Immunology 116, 1–12. 189. Stout, R.D., and Suttles, J. (2004). Functional plasticity of macrophages: reversible adaptation to changing microenvironments. J. Leukoc. Biol. 76, 509–513. 190. Stuart, L.M., Paquette, N., and Boyer, L. (2013). Effector-triggered versus patterntriggered immunity: how animals sense pathogens. Nat. Rev. Immunol. 13, 199–206. 191. Sutherland, R.E., Xu, X., Kim, S.S., Seeley, E.J., Caughey, G.H., and Wolters, P.J. (2011). Parasitic infection improves survival from septic peritonitis by enhancing mast cell responses to bacteria in mice. PLoS One 6, e27564. 192. Tachu, B., Pillai, S., Lucius, R., and Pogonka, T. (2008). Essential role of chitinase in the development of the filarial nematode Acanthocheilonema viteae. Infect. Immun. 76, 221–228. 193. Tangye, S.G. (2013). To B1 or not to B1: That really is still the question! Blood 121, 5109–5110. 194. Taylor, M.D., LeGoff, L., Harris, A., Malone, E., Allen, J.E., and Maizels, R.M. (2005). Removal of regulatory T cell activity reverses hyporesponsiveness and leads to filarial parasite clearance in vivo. J. Immunol. 174, 4924–4933. 195. Telford, G., Wheeler, D.J., Appleby, P., Bowen, J.G., and Pritchard, D.I. (1998). Heligmosomoides polygyrus immunomodulatory factor (IMF), targets T-lymphocytes. Parasite Immunol. 20, 601–611. 196. Thomas, P.G., Carter, M.R., Atochina, O., Da’Dara, A. a, Piskorska, D., McGuire, E., and Harn, D. a (2003). Maturation of dendritic cell 2 phenotype by a helminth glycan uses a Toll-like receptor 4-dependent mechanism. J. Immunol. 171, 5837–5841. 197. Thornton, B.P., Vĕtvicka, V., Pitman, M., Goldman, R.C., and Ross, G.D. (1996). Analysis of the sugar specificity and molecular location of the beta-glucan-binding lectin site of complement receptor type 3 (CD11b/CD18). J. Immunol. 156, 1235–1246. 198. Tokura, S., Tamura, H., and Azuma, I. (1999). Immunological aspects of chitin and chitin derivatives administered to animals. EXS 87, 279–292. 199. Torgerson, P.R. (2013). One world health: Socioeconomic burden and parasitic disease control priorities. Vet. Parasitol. 195, 223–232. 200. Tsujimoto, H., Ono, S., Mochizuki, H., Aosasa, S., Majima, T., Ueno, C., and Matsumoto, A. (2002). Role of macrophage inflammatory protein 2 in acute lung injury in murine peritonitis. J. Surg. Res. 103, 61–67. 201. Vallance, B. a, Galeazzi, F., Collins, S.M., and Snider, D.P. (1999). CD4 T Cells and Major Histocompatibility Complex Class II Expression Influence Worm Expulsion and Increased Intestinal Muscle Contraction during Trichinella spiralis Infection CD4 T Cells and Major Histocompatibility Complex Class II Expression Influence . Infect. Immun. 67, 6090–6097. 143 8. Spis literatury 202. Vandevord, P.J., Matthew, H.W.T., Desilva, S.P., Mayton, L., Wu, B., and Wooley, P.H. (2002). Evaluation of the biocompatibility of a chitosan scaffold in mice. J. Biomed. Mater. Res. 59, 585–590. 203. Velupillai, P., Secor, W.E., Horauf, a M., and Harn, D. a (1997). B-1 cell (CD5+B220+) outgrowth in murine schistosomiasis is genetically restricted and is largely due to activation by polylactosamine sugars. J. Immunol. 158, 338–344. 204. Venugopal, P.G., Nutman, T.B., and Semnani, R.T. (2009). Activation and regulation of Toll-Like Receptors (TLRs) by helminth parasites. Immunol. Res. 43, 252–263. 205. Veronico Gray, LJ, Jones, JT, Bazzicalupo, P, Arbucci, S, Cortese, MR, Di Vito, M, De Giorgi, C, P. (2001). Nematode chitin synthases: gene structure, expression and function in Caenorhabditis elegans and the plant parasitic nematode Meloidogyne artiella. Mol Genet Genom 266, 28–34. 206. Vieira, P.L., de Jong, E.C., Wierenga, E. a, Kapsenberg, M.L., and Kaliński, P. (2000). Development of Th1-inducing capacity in myeloid dendritic cells requires environmental instruction. J. Immunol. 164, 4507–4512. 207. Villiers, C., Chevallet, M., Diemer, H., Couderc, R., Freitas, H., Van Dorsselaer, A., Marche, P.N., and Rabilloud, T. (2009). From secretome analysis to immunology: chitosan induces major alterations in the activation of dendritic cells via a TLR4dependent mechanism. Mol. Cell. Proteomics 8, 1252–1264. 208. Voehringer, D., Reese, T. a, Huang, X., Shinkai, K., and Locksley, R.M. (2006). Type 2 immunity is controlled by IL-4/IL-13 expression in hematopoietic non-eosinophil cells of the innate immune system. J. Exp. Med. 203, 1435–1446. 209. Volman, T.J.H., Hendriks, T., and Goris, R.J. a (2005). Zymosan-Induced Generalized Inflammation: Experimental Studies Into Mechanisms Leading To Multiple Organ Dysfunction Syndrome. Shock 23, 291–297. 210. Wagener, J., Malireddi, R.K.S., Lenardon, M.D., Köberle, M., Vautier, S., MacCallum, D.M., Biedermann, T., Schaller, M., Netea, M.G., Kanneganti, T.D., et al. (2014). Fungal Chitin Dampens Inflammation through IL-10 Induction Mediated by NOD2 and TLR9 Activation. PLoS Pathog. 10, e1004050. 211. Wakelin, D., and Donachie, A.M. (1983). Genetic control of immunity to Trichinella spiralis: influence of H-2-linked genes on immunity to the intestinal phase of infection. Immunology 48, 343–350. 212. Waller, P.J. (2003). Global perspectives on nematode parasite control in ruminant livestock: the need to adopt alternatives to chemotherapy, with emphasis on biological control. Anim. Health Res. Rev. 4, 35–43. 213. Walton, S.F., Pizzutto, S., Slender, A., Viberg, L., Holt, D., Hales, B.J., Kemp, D.J., Currie, B.J., Rolland, J.M., and O’Hehir, R. (2010). Increased allergic immune response to Sarcoptes scabiei antigens in crusted versus ordinary scabies. Clin. Vaccine Immunol. 17, 1428–1438. 214. Wang, B., Wang, Z.Q., Jin, J., Ren, H.J., Liu, L.N., and Cui, J. (2013a). Cloning, expression and characterization of a Trichinella spiralis serine protease gene encoding a 35.5 kDa protein. Exp. Parasitol. 134, 148–154. 215. Wang, C., Yu, X., Cao, Q., Wang, Y., Zheng, G., Tan, T.K., Zhao, H., Zhao, Y., Wang, Y., and Harris, D.C. (2013b). Characterization of murine macrophages from bone marrow, spleen and peritoneum. BMC Immunol. 14, 6. 144 8. Spis literatury 216. Wang, H.H., Lin, C.Y., and Huang, T.P. (2003). Patterns of CD4/CD8 T-cell ratio in dialysis effluents predict the long-term outcome of peritonitis in patients undergoing peritoneal dialysis. Nephrol. Dial. Transplant. 18, 1181–1189. 217. Wharton, D. a (1983). The production and functional morphology of helminth eggshells. Parasitology 86 (Pt 4), 85–97. 218. Wing, K., and Sakaguchi, S. (2010). Regulatory T cells exert checks and balances on self tolerance and autoimmunity. Nat. Immunol. 11, 7–13. 219. Wisnewski, N., McNeil, M., Grieve, R.B., and Wassom, D.L. (1993). Characterization of novel fucosyl- and tyvelosyl-containing glycoconjugates from Trichinella spiralis muscle stage larvae. Mol. Biochem. Parasitol. 61, 25–36. 220. Wlodkowic, D., Skommer, J., and Darzynkiewicz, Z. (2012). Cytometry of apoptosis. Historical perspective and new advances. Exp. Oncol. 34, 255–262. 221. Wynn, T.A., Thompson, R.W., Cheever, A.W., and Mentink-Kane, M.M. (2004). Immunopathogenesis of schistosomiasis. Immunol. Rev. 201, 156–167. 222. Xiang, S.D., Scholzen, A., Minigo, G., David, C., Apostolopoulos, V., Mottram, P.L., and Plebanski, M. (2006). Pathogen recognition and development of particulate vaccines: Does size matter? Methods 40, 1–9. 223. Xiao, D., Wang, Y., Liu, G., He, J., Qiu, W., Hu, X., Feng, Z., Ran, M., Nyachoti, C.M., Kim, S.W., et al. (2014). Effects of Chitosan on Intestinal Inflammation in Weaned Pigs Challenged by Enterotoxigenic Escherichia coli. PLoS One 9, e104192. 224. Xu, W., and Banchereau, J. (2014). The Antigen Presenting Cells Instruct Plasma Cell Differentiation. Front. Immunol. 4, 504. 225. Xu, Y., Darcy, P.K., and Kershaw, M.H. (2007). Tumor-specific dendritic cells generated by genetic redirection of Toll-like receptor signaling against the tumorassociated antigen, erbB2. Cancer Gene Ther. 14, 773–780. 226. Yi, X., Zeng, C., Liu, H., Chen, X., Zhang, P., Yun, B.S., Jin, G., and Zhou, A. (2013). Lack of RNase L attenuates macrophage functions. PLoS One 8, e81269. 227. Yoo, M.K., Kang, S.K., Choi, J.H., Park, I.K., Na, H.S., Lee, H.C., Kim, E.B., Lee, N.K., Nah, J.W., Choi, Y.J., et al. (2010). Targeted delivery of chitosan nanoparticles to Peyer’s patch using M cell-homing peptide selected by phage display technique. Biomaterials 31, 7738–7747. 228. Yung, D., Kapral, M.K., Asllani, E., Fang, J., and Lee, D.S. (2012). Reinitiation of Anticoagulation After Warfarin-Associated Intracranial Hemorrhage and Mortality Risk: The Best Practice for Reinitiating Anticoagulation Therapy After Intracranial Bleeding (BRAIN) Study. Can. J. Cardiol. 28, 33–39. 229. Zaharoff, D. a., Rogers, C.J., Hance, K.W., Schlom, J., and Greiner, J.W. (2007). Chitosan solution enhances both humoral and cell-mediated immune responses to subcutaneous vaccination. Vaccine 25, 2085–2094. 230. Zaph, C., Troy, A.E., Taylor, B.C., Berman-Booty, L.D., Guild, K.J., Du, Y., Yost, E. a, Gruber, A.D., May, M.J., Greten, F.R., et al. (2007). Epithelial-cell-intrinsic IKK-beta expression regulates intestinal immune homeostasis. Nature 446, 552–556. 231. Zhang, P., Liu, W., Peng, Y., Han, B., and Yang, Y. (2014). Toll like receptor 4 (TLR4) mediates the stimulating activities of chitosan oligosaccharide on macrophages. Int. Immunopharmacol. 23, 254–261. 145 8. Spis literatury 232. Zhao, A., Urban, J.F., Anthony, R.M., Sun, R., Stiltz, J., van Rooijen, N., Wynn, T. a., Gause, W.C., and Shea-Donohue, T. (2008). Th2 Cytokine-Induced Alterations in Intestinal Smooth Muscle Function Depend on Alternatively Activated Macrophages. Gastroenterology 135, 217–225. 233. Zhong, S., and Dobson, C. (1996). Heligmosomoides polygyrus: resistance in inbred, outbred, and selected mice. Exp. Parasitol. 82, 122–131. 234. Zhu, D.Z., Lu, X.F., and Bell, R.G. (1990). Antigen-specific lymphocyte proliferative responses in inbred mice after Trichinella spiralis infection. J. Parasitol. 76, 85–92. 146
