Udział chitozanu w indukcji odpowiedzi immunologicznej podczas

advertisement
Uniwersytet Warszawski
Wydział Biologii
Klaudia Brodaczewska
Nr albumu: 217 273
Udział chitozanu w indukcji odpowiedzi
immunologicznej podczas zarażenia myszy
nicieniami
Rozprawa doktorska
w zakresie nauk biologicznych
dyscyplinie biologia
Praca wykonana pod kierunkiem
Prof. dr hab. Maria Doligalska
Zakład Parazytologii, Wydział Biologii
Warszawa, lipiec 2015
Chciałabym złożyć serdeczne podziękowania wszystkim,
którzy wspierali mnie w czasie powstawania tej pracy:
Prof. dr hab. Marii Doligalskiej- za cierpliwość
i zaufanie
Dr Katarzynie Donskow-Łysoniewskiej- za WSZYSTKO
Współpracownikom z Zakładu, w szczególności
Małej Kasi, Kindze, Maćkowi i pani Danusi- za pomoc
techniczną, merytoryczną i duchową
Pracownikom i doktorantom innych ZakładówImmunologii, Fizjologii Zwierząt, Cytologiiza gotowość do pomocy i otwartość
Studentom Zakładu-szczególnie Natalii W. i Sylwii S.za udział w doświadczeniach i wnoszenie różnorodności
do codziennej pracy
Moim znajomym i przyjaciołom,
Asi K., Dorocie i Krzyśkowi S., Patrycji i Szymonowi H.,
Asi i Piotrkowi O.- za wiarę we mnie
A przede wszystkim mojej Rodzinie- za to, że mnie
nie ocenia, tylko znosi i wspiera,
niezależnie od okoliczności
I moim Rodzicom, bez których moja praca naukowa
i spełnianie marzeń nie byłoby możliwe
Oświadczenie kierującego pracą
Oświadczam, że niniejsza praca została przygotowana pod moim kierunkiem i stwierdzam, że
spełnia ona warunki do przedstawienia jej w postępowaniu o nadanie stopnia doktora nauk
biologicznych w zakresie biologii.
Data
Podpis kierującego pracą
Oświadczenie autora pracy
Świadom odpowiedzialności prawnej oświadczam, że niniejsza rozprawa doktorska
została napisana przeze mnie samodzielnie i nie zawiera treści uzyskanych w sposób
niezgodny z obowiązującymi przepisami.
Oświadczam również, że przedstawiona praca nie była wcześniej przedmiotem procedur
związanych z uzyskaniem stopnia doktora w innej jednostce.
Oświadczam ponadto, że niniejsza wersja pracy jest identyczna z załączoną wersją
elektroniczną.
Data
Podpis autora pracy
Słowa kluczowe
Nicienie pasożytnicze, odpowiedź immunologiczna, chitozan, odpowiedź Th2- zależna, stan
zapalny, immunosupresja, przeciwciała, cytokiny, komórki prezentujące antygen
Tytuł pracy w języku angielskim
The role of chitosan in the induction of immune response in mice infected with nematodes
Spis treści:
Oświadczenie kierującego pracą ................................................................................................ 3
Oświadczenie autora pracy ........................................................................................................ 3
1. Streszczenie........................................................................................................................... 8
2. Wykaz skrótów ................................................................................................................... 10
3. Wstęp................................................................................................................................... 13
3.1
Nicienie pasożytnicze ................................................................................................. 14
3.2
Odpowiedź przeciwpasożytnicza ............................................................................... 15
3.2.1 Indukcja odpowiedzi immunologicznej typu 2 .......................................................... 16
3.2.2 Mechanizmy efektorowe odpowiedzi Th2 ................................................................. 17
3.2.3 Immunosupresja w czasie zarażeń nicieniami............................................................ 20
3.3
Rola chityny i chitozanu w indukcji odpowiedzi immunologicznej .......................... 23
3.3.1 Odpowiedź immunologiczna na chitynę .................................................................... 24
3.4
Właściwości i zastosowania chitozanu....................................................................... 25
5. Materiały i metody ............................................................................................................. 31
5.1
Myszy, pasożyty i linie komórkowe........................................................................... 31
5.2
Odczynniki ................................................................................................................. 31
5.3
Schemat doświadczeń in vivo ..................................................................................... 33
5.4
Analiza NMR ............................................................................................................. 34
5.5
Ocena pobudzenia immunologicznego ...................................................................... 34
5.6
Izolacja komórek ........................................................................................................ 35
5.7
Izolacja nicieni ........................................................................................................... 36
5.7.1 Heligmosomoides polygyrus....................................................................................... 36
5.7.2 Trichinella spiralis ..................................................................................................... 37
5.7.3 Otrzymywanie roztworów antygenów nicieni ........................................................... 37
5.8
Analiza cytometryczna ............................................................................................... 37
5.9
Hodowle komórkowe ................................................................................................. 42
5.10 Testy kolorymetryczne ............................................................................................... 43
5.11 Analiza białek metodą Western blot .......................................................................... 45
5.12 Badania histochemiczne ............................................................................................. 46
5.13 Analiza statystyczna ................................................................................................... 47
6. Wyniki ................................................................................................................................. 48
6.1
Właściwości immunostymulacyjne chitozanu in vitro........................................... 48
6.1.1 Wprowadzenie ............................................................................................................ 48
6.1.2 Wyniki ........................................................................................................................ 50
6.1.2.1
Cytotoksyczność ................................................................................................. 50
6.1.2.2
Apoptoza............................................................................................................. 51
6.1.2.3
Fenotyp komórek ................................................................................................ 53
6.1.2.4
Produkcja cytokin ............................................................................................... 55
6.1.3 Dyskusja ..................................................................................................................... 57
6.2
Właściwości immunostymulacyjne chitozanu in vivo............................................ 60
6.2.1 Wprowadzenie ............................................................................................................ 60
6.2.2 Wyniki ........................................................................................................................ 60
6.2.2.1
Wpływ chitozanu na stan fizjologiczny myszy .................................................. 60
6.2.2.2
Charakterystyka widm NMR chitozanu z jamy otrzewnej ................................. 64
6.2.2.3
Wpływ chitozanu na komórki jamy otrzewnej ................................................... 66
6.2.2.4
Wpływ chitozanu na komórki krwi obwodowej ................................................ 73
6.2.2.5
Wpływ chitozanu na poziom cytokin ................................................................. 74
6.2.3 Dyskusja ..................................................................................................................... 77
6.3
Wpływ chitozanu na odpowiedź przeciwpasożytniczą.......................................... 82
6.3.1 Wprowadzenie ............................................................................................................ 82
6.3.2 Wyniki ........................................................................................................................ 86
6.3.2.1
Heligmosomoides polygyrus ............................................................................... 86
6.3.2.1.1
Reakcja lokalna w jamie otrzewnej ................................................................ 87
6.3.2.1.2
Reakcja obwodowa w krwi ............................................................................. 92
6.3.2.2
Trichinella spiralis ............................................................................................. 94
6.3.2.2.1
Reakcja lokalna w jamie otrzewnej ................................................................ 95
6.3.2.2.2
Reakcja obwodowa w krwi ............................................................................. 99
6.3.3 Dyskusja ................................................................................................................... 102
6.4
Wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą ............................................................... 106
6.4.1 Wprowadzenie .......................................................................................................... 106
6.4.2 Wyniki ...................................................................................................................... 107
6.4.2.1
Wpływ chitozanu na odpowiedź limfocytów w MLN ..................................... 107
6.4.2.2
Wpływ chitozanu na proliferację limfocytów T CD4+ w MLN ...................... 108
6.4.2.3
Odpowiedź limfocytów w płynie otrzewnowym.............................................. 110
6.4.2.4
Wpływ chitozanu na produkcję przeciwciał ..................................................... 112
6.4.2.4.1
Poziom specyficznych przeciwciał IgG1 i IgE ............................................. 113
6.4.2.4.2
Poziom i specyficzność przeciwciał IgA oznaczany metodą ELISA ........... 114
6.4.2.4.3
Specyficzność przeciwciał IgA oznaczana metodą Western blot ................. 116
6.4.3 Dyskusja ................................................................................................................... 118
7. Podsumowanie i wnioski ................................................................................................. 126
7.1
Immunostymulacyjne właściwości chitozanu .......................................................... 126
7.2
Wpływ na odpowiedź przeciwpasożytniczą............................................................. 126
7.3
Różnice między gatunkami pasożyta w odpowiedzi na chitozan ............................ 127
7.4
Wnioski końcowe ..................................................................................................... 127
8. Spis literatury ................................................................................................................... 131
1. Streszczenie
Odpowiedź obronna przeciwko nicieniom pasożytniczym zależna jest zwykle od
mechanizmów regulowanych przez limfocyty Th2. Wzbudzenie tej populacji następuje w
wyniku aktywacji komórek odpowiedzi wrodzonej, jednak wiele pasożytów moduluje reakcje
układu odpornościowego wywołując immunosupresję, aby utrzymać się w żywicielu.
Prowadzi to do chronicznego zarażenia i znacznie utrudnia kontrolę inwazji, zarówno u ludzi,
jak i zwierząt hodowlanych. Poza podawaniem leków przeciwpasożytniczych, strategią
zwalczania/ kontrolowania nicieni pasożytniczych może być wzmacnianie naturalnych
mechanizmów obronnych żywiciela. Istnieje wiele związków, które mogą polaryzować
odpowiedź immunologiczną w kierunku Th2 zależnej i jednym z nich jest chitozan. Jest to
naturalny polimer, deacetylowana pochodna chityny, która występuje m. in. w strukturach
nicieni. Uważa się, że związek ten może być rozpoznawany przez układ odpornościowy
żywiciela i aktywować go, wpływając na równowagę odpowiedzi immunologicznej. Celem
pracy było określenie w jaki sposób chitozan, polimer N-acetyloglukozaminy i glukozaminy,
wpływa na odpowiedź immunologiczną oraz czy może on zwiększać skuteczność odpowiedzi
przeciwpasożytniczej. W badaniach in vitro i in vivo oceniano jak chitozan aktywuje komórki
odpowiedzi immunologicznej oraz czy wpływa na przebieg zarażenia nicieniami:
Heligmosomoides polygyrus i Trichinella spiralis. Stwierdzono, że chitozan, w zależności od
masy cząsteczkowej, wykazuje odmienne właściwości aktywowania in vitro komórek
odpowiedzi wrodzonej. Podany in vivo dootrzewnowo, chitozan o dużej masie cząsteczkowej
wywołał początkowo silny stan zapalny charakteryzujący się napływem neutrofilów i
niedojrzałych monocytów oraz produkcją cytokin prozapalnych, jak i regulatorowych. Po
zaprzestaniu podawania chitozanu obserwowano pojawianie się mechanizmów związanych z
gojeniem tkanek; alternatywną aktywację makrofagów oraz wydzielanie TGF-β i IL-10.
Zarażenie H. polygyrus myszy, którym podawano chitozan, skutkowało zahamowaniem
objawów stanu zapalnego, bez znacznego wpływu na przebieg zarażenia. Z kolei u myszy,
którym podawano chitozan, w czasie inwazji T. spiralis występował wyższy poziom
zarażenia, a odpowiedź na polimer zdominowała odpowiedź przeciwpasożytniczą i obniżyła
efektywność mechanizmów obronnych. Stan zapalny wywołany przez chitozan wpływał
także na odpowiedź nabytą; zahamował proliferację limfocytów T CD4+, ale wzbudził
produkcję przeciwciał IgA krzyżowo rozpoznających antygeny nicieni oraz sam polimer.
Uzyskane wyniki wskazują, że chitozan nie jest specyficznym adiuwantem odpowiedzi Th2
zależnej; przetwarzany przez komórki może wywoływać stan zapalny, który ma długotrwały
wpływ na mechanizmy odpornościowe żywiciela.
8
1. Streszczenie
Abstract
Protective immune response against parasitic nematodes is usually mediated by Th2
dependant mechanisms. Induction of those is initiated by activated cells of innate immunity,
however many parasites modify immune response leading to immunosuppression and
maintain within the host. This leads to chronicity and hampers control of infections both in
humans and livestock. Apart from drug therapy, amplification of natural immunity may be a
strategy to limit parasitic infections. Among compounds that polarise immune response
towards Th2 mechanisms, chitosan may be listed. It is a naturally occurring polymer derived
from chitin, that is present also in nematode structures. It is suggested that it can be
recognised by the immune system and activate immune response causing its polarisation. Aim
of this thesis was to establish how chitosan, polymer of N-acetyloglucosamine and
glucosamine, influences immune system and antiparasitic responses. In in vitro and in vivo
models it was evaluated how chitosan activates immune cells and affects the course of
infection with nematodes: Heligmosomoides polygyrus or Trichinella spiralis. It was
observed that chitosan activates innate immunity and this effect depends on molecular weight
of the polymer. After intraperitoneal injections, high molecular weight chitosan induced
inflammation characterized by influx of neutrophils and immature monocytes and production
of proinflammatory and regulatory cytokines. After the treatment was terminated, tissue
healing processes were observed; alternative activation of macrophages and secretion of
TGF-β and IL-10. Infection of mice that obtained chitosan with H. polygyrus alleviated
inflammation but the invasion was unchanged. However when chitosan treated mice were
infected with T. spiralis, increased level of infection was observed as response to the polymer
dominated and decreased protection. Chitosan induced inflammation altered also adaptive
responses; proliferation of CD4+ T lymphocytes was reduces but secretion of IgA occurred
that were cross-reactive to nematode antigens and polymer itself.
Obtained results suggest that chitosan is not a specific adjuvant of Th2 responses; processed
by cells it induces inflammation that alters host immunity in long-term perspective.
9
2. Wykaz skrótów
AAMf- Alternatively Activated Macrophages; makrofagi aktywowane alternatywnie; M2
ADCC- Antibody Dependant Cell-mediated Cytotoxicity; cytotoksyczność zależna od
przeciwciał
AdOH- kwas adypinowy
Ag- antygen
AMCase- Acidic Mammalian Chitinase; kwaśna chitynaza ssacza
AP- Alkaline Phosphatase; alkaliczna fosfataza
APC- Antigen Presenting Cell; komórki prezentujące antygen lub allophycocyanin;
allofikocyjanina
ATR- Attenuated Total Reflectance; wielokrotne odbicie osłabione
BCIP- 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate; 5-bromo, 4-chloro, 3-indolylofosforan
BMDMf- Bone Marrow Derived Macrophages; makrofagi otrzymywane ze szpiku
BSA- Bovine Serum Albumin ; albumina surowicy bydlęcej
CAMf- Classically Activated Macrophages; makrofagi aktywowane klasycznie; M1
CD- Cluster of Differentiation; antygen różnicowania komórkowego; oznaczane kolejno
numerami
CFSE- CarboxyFluorescein Succinimidyl Ester; ester karboksyfluoresceiny
ChaFF- Chitinase and Fizz Family members
Cht- chitozan
CLP- Chitinase-like Proteins; białka podobne do chitynaz
COS- Chitosan Oligosaccharides; oligosacharydy chitozanu
DAB- 3, 3'-diaminobenzidine; 3,3-diaminobenzydyna
DAPI- 4',6-diamidino-2-phenylindole; 4',6-diamidyno-2-fenyloindol
DC- Dendritic Cell; komórka dendrytyczna
DC-SIGN- Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin;
CD209
DD- Deacetylation Degree; stopień deacetylacji
DMSO- dimethyl sulfoxide; dimetylosulfotlenek
dpz- dzień po zarażeniu
ELISA- enzyme-linked immunosorbent assay
EPG- Eggs per Gram; liczba jaj na gram kału
EPO- Eosinophil Peroxidase; peroksydaza eozynofilowa
ES- Excretory-Secretory; wydalniczo-wydzielnicze; dotyczy antygenów pasożytniczych
FACS- Fluorescence-activated cell sorting
FIBCD1- fibrinogen C domain-containing protein 1
FITC- Fluorescein isothiocyanate; izotiocyjanian fluoresceiny
FTIR- Fourier Transform Infrared Spectroscopy
G- Gate; bramka; podział komórek na populacje w analizie FACS
Gen- Generation; pokolenie- dotyczy komórek potomnych, oznaczane kolejno numerami
GH18- Glycoside Hydrolase Family 18
GM-CSF- Granulocyte-Macrophage Colony-stimulating Factor; czynnik stymulujący
tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów
HMW- High Molecular Weight; duża masa cząsteczkowa; dotyczy chitozanu
10
2. Wykaz skrótów
Hp- Heligmosomoides polygyrus
HRP- Horseradish Peroxidase; peroksydaza chrzanowa
IBD- Inflammatory Bowel Disease; nieswoiste zapalenie jelit
Ig- Immunoglobulin; immunoglobulina; także przeciwciało
IL- Interleukin; interleukina
iNOS- Inducible Nitric Oxide Syntethase; indukowana syntaza tlenku azotu
K- grupa kontrolna; myszy niezarażone lub nietraktowane
kDa- kilo Daltony
LMW- Low Molecular Weight; mała masa cząsteczkowa; dotyczy chitozanu
LPS- Lipopolysaccharide; lipopolisacharyd
M- masa
MBP- Major Basic Protein; główne białko zasadowe
M-CSF- Macrophage Colony-stimulating Factor; czynnik stymulujący tworzenie kolonii
makrofagów
MCP-1- Monocyte Chemoattractant Protein-1
Mf- makrofag
MHC- Major Histocompatibility Complex; główny układ zgodności tkankowej
MLN- Mesenteric Lymph Nodes; krezkowe węzły limfatyczne
MPO- Myeloperoxidase; mieloperoksydaza
MR- Mannose Receptor; receptor dla mannozy, fukozy i N-acetyloglukozaminy, CD206
MTS3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2Htetrazolium
Mw- Molecular weight; masa cząsteczkowa
N- liczebność grupy; liczba powtórzeń
NBL- New-borne Larvae; larwy nowonarodzone; dotyczy T. spiralis
NMR- Nuclear Magnetic Resonance; spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego
NO- Nitric Oxide; tlenek azotu
OD- Optical Density; gęstość optyczna, absorbancja
p- p- value; p-wartość; prawdopodobieństwo popełnienia błędu pierwszego rodzaju; dotyczy
analizy statystycznej
PAMP- Pathogen Associated Molecular Patterns; wzorce molekularne związane z
patogenami
PBS- Phosphate-Buffered Saline; roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami
PE- Phycoerythrin; fikoerytryna
PercP- Peridinin chlorophyll
PI- Proliferation Index; indeks proliferacji; dotyczy analizy CFSE
PRR- Pattern Recognition Receptors; receptory rozpoznające wzorce
r- współczynnik korelacji Pearsona
ROS- Reactive Oxygen Species; reaktywne formy tlenu
rpm- revolutions per minute; obroty na minutę
RPMI- Roswell Park Memorial Institute medium
SD- Standard Deviation; odchylenie standardowe
TBS- Tris-Buffered Saline; roztwór soli fizjologicznej buforowany tris
Tc- cytotoxic T cell; limfocyt T cytotoksyczny
11
2. Wykaz skrótów
TCR- T Cell Receptor; receptor limfocytów T
TGF-β- Transforming Growth Factor beta; transformujący czynnik wzrostu
Th- T helper cell; limfocyt T pomocniczy; oznaczane kolejno numerami
TLR- Toll-like Receptor; receptor Toll-like; oznaczane kolejno numerami
TNF-α- Tumour Necrosis Factor alpha; czynnik martwicy nowotworu
Treg- T regulatory cell; limfocyt T regulatorowy
Ts- Trichinella spiralis
TSLP- Thymic Stromal Lymphopoietin
vs- versus; przeciw, dotyczy analizy statystycznej, porównanie 2 grup badanych
WGA- Wheat Germ Agglutinin; lektyna rozpoznająca N-acetyloglukozaminę
12
3. Wstęp
Zarażenia helmintami stanowią poważny problem zarówno w medycynie, jak i weterynarii
(Torgerson, 2013). Inwazje u ludzi, występujące głównie w krajach rozwijających się, choć są
rzadko śmiertelne, przyczyniają się do obniżenia aktywności układu odpornościowego np.
zmniejszając skuteczność szczepień (Borkow & Bentwich, 2008). Wysoka prewalencja
zarażeń stanowi problem także w krajach uprzemysłowionych; obniża produktywność
zwierząt hodowlanych powodując poważne straty ekonomiczne (Charlier et al., 2014).
Dodatkowo, choroby pasożytnicze przenoszone ze zwierząt na ludzi stanowią ryzyko
skażenia żywności i obniżenia jej wartości konsumpcyjnej (Alvin & Angeli, 2001). Zasięg
szkód ekonomicznych wywoływanych przez wybrane helminty przedstawia Tabela 1.
Problemy wynikające z zarażeń pasożytniczych stanowią poważne wyzwanie dla nauki:
konieczne jest opracowanie skutecznych metod zapobiegania, leczenia oraz kontrolowania
chorób pasożytniczych (Waller, 2003).
Tabela 1. Przykłady strat ekonomicznych związanych z zarażeniem helmintami.
Pasożyt
Żywiciel
Epidemiologia
Skutek
Szacowane
zarażenia
straty/koszty
Anemia,
N. americanus/
A. duodenale
Człowiek
500 mln osób niedożywienie,
na świecie
zaburzenie
rozwoju
30-70%
T.
circumcincta/
Trichostrongylus
Owca
stad
zarażonych w
południowej
Zmniejszona
produkcja
wełny
Australii
0,0007% prób
pozytywnych
T. spiralis
Świnia
w
badanych
rzeźniach
UE
w
402-952 USD/ osobę
chorą rocznie (Lee et
al., 2011)
Roczne
zyski
pomniejszone
153 mln
o
AUD
(Sackett et al., 2006)
25-400 mln EUR w
Konieczność
UE rocznie (EFSA,
badania mięsa
2006,
Murrell
&
Pozio, 2011)
13
3. Wstęp
3.1 Nicienie pasożytnicze
Nicienie pasożytnicze to wielokomórkowe bezkręgowce charakteryzujące się różnorodnością
budowy, strategii życiowych i patogenności względem żywicieli. Większość z nich ma
skomplikowane cykle rozwojowe, w czasie których może następować zmiana żywiciela,
lokalizacji w organizmie i stadium pasożyta. Cechy te sprawiają, że zarażenia nicieniami
stanowią wyjątkowe wyzwanie dla układu odpornościowego żywiciela.
W odróżnieniu od patogenów takich jak bakterie, wirusy czy pierwotniaki, nicienie zwykle
nie namnażają się w swoim żywicielu (z nielicznymi wyjątkami; np. Strongyloides; Grove &
Northern, 1989), dlatego wykształciły różnorodne strategie zapewniające im sukces
rozprzestrzeniania się (Rys. 1). Wiele gatunków, np. nicienie żołądkowo-jelitowe, bytuje w
przewodzie pokarmowym żywiciela, a formy dyspersyjne osiągają inwazyjność w środowisku
zewnętrznym, gdzie oczekują na kolejnego żywiciela (Necator, Ascaris). Różne gatunki filarii
w cyklu życiowym wymagają udziału wektora, który przenosi larwy nowego pokolenia do
kolejnych żywicieli. Nieliczne gatunki, np. z rodzaju Trichinella, cały cykl życiowy odbywają
w jednym osobniku żywicielskim (Despommier, 2005).
Nicienie mogą zasiedlać różne narządy żywiciela i kolejne stadia rozwojowe mogą
występować w różnych tkankach. Wiele gatunków pasożytuje w jelicie cienkim, gdzie
osiedlają się po przejściu przez inne narządy, jak skóra, układy krwionośny czy oddechowy
(Toxocara). Zmiana zasiedlanej tkanki zwykle wiąże się ze zmianą stadium i/lub antygenów
powierzchniowych, co obniża skuteczność reakcji komórek układu odpornościowego.
Charakterystyczne jest także aktywne modulowanie odpowiedzi immunologicznej żywiciela,
dlatego wiele zarażeń nicieniami ma przebieg chroniczny (Patel et al., 2009).
W warunkach naturalnych często występują ko-infekcje różnymi gatunkami patogenów,
dlatego w środowisku trudno jest ustalić swoistość reakcji na poszczególne rodzaje/gatunki
pasożytów. Z tego względu interakcje pasożyt-żywiciel najlepiej badać w warunkach
laboratoryjnych podczas inwazji eksperymentalnych. Opracowano wiele modelowych
układów przy użyciu zwierząt laboratoryjnych zarażanych nicieniami, co umożliwia
charakteryzowanie zjawisk zachodzących w czasie inwazji (Patel et al., 2009 i Rozdział 6.3).
14
3. Wstęp
Legenda:
Rys. 1 Biologia i związki filogenetyczne pasożytniczych nicieni; zróżnicowanie żywicieli,
cykli życiowych i znaczenie dla człowieka. Za: Gilabert & Wasmuth, 2013, zmienione.
3.2 Odpowiedź przeciwpasożytnicza
Pomimo różnorodności biologii, nicienie pasożytnicze wywołują zwykle zbliżone reakcje
odpornościowe u żywicieli (ssaków). Określa się je mianem odpowiedzi Th2-zależnej lub
typu 2 (Grencis, 1997), która charakteryzuje się między innymi: eozynofilią i mastocytozą,
alternatywną aktywacją makrofagów, dojrzewaniem limfocytów B i produkcją przeciwciał,
głównie klas IgE i IgG1, oraz aktywacją limfocytów Th2 produkujących IL-4, IL-5 i IL-13
(Maizels et al., 2004). Obserwuje się także zmiany fizjologiczne w tkankach zasiedlanych
przez pasożyty, np. zwiększenie wydzielania śluzu w układzie pokarmowym czy
oddechowym (Soga et al., 2013). Co ciekawe, podobna odpowiedź pojawia się w czasie
reakcji alergicznej (Annunziato et al., 2014). Rozwinięcie odpowiedzi typu Th2 w czasie
zarażenia może odpowiadać za: 1) hamowanie rozwoju kolejnych stadiów w pierwszym i po
15
3. Wstęp
ponownym zarażeniu (Voehringer et al., 2006), 2) usuwanie form dorosłych z jelita
(Finkelman et al., 2004), 3) ograniczanie stanu zapalnego, gdy pasożyt nie może być usunięty,
co zapewnia przeżywanie żywiciela (Herbert et al., 2004), ale także 4) reakcje patologiczne w
tkankach (fibroza) zasiedlanych przez pasożyta (Wynn et al., 2004). Zatem odpowiedź Th2
może zarówno warunkować obronność, jak i poprzedzać objawy chorobowe i komplikacje
związane z parazytozami.
3.2.1 Indukcja odpowiedzi immunologicznej typu 2
Rozwój odpowiedzi typu Th2, podobnie jak w przypadku stanu zapalnego Th1-zależnego, jest
determinowany już na poziomie komórek odpowiedzi wrodzonej. Są to głównie komórki
dendrytyczne (Dendritic Cells; DC) i makrofagi rozpoznające charakterystyczne struktury
patogenów (Pathogen Associated Molecular Patterns; PAMP) poprzez receptory PRR
(Pattern Recognition Receptors, receptory rozpoznające wzorce). W zależności od rodzaju
patogenu, wzbudzane i podtrzymywane są takie mechanizmy odpowiedzi immunologicznej,
które będą najskuteczniej zwalczać dany czynnik chorobotwórczy (Netea et al., 2005).
Wiadomo, że odpowiedź immunologiczna może ulegać polaryzacji, np. w kierunku Th1, Th2,
Th17, Treg i in., ale mechanizm tego zjawiska nie jest jeszcze dokładnie znany. Przypuszcza
się, że to struktura PAMP indukuje w komórkach wymaganą ścieżkę aktywacji.
Powinowactwo ligandów do receptorów PRR uruchamia różne ścieżki sygnałowe w komórce
i w konsekwencji inne mechanizmy efektorowe. O ile PAMP i PRR wzbudzające odpowiedź
Th1-zależną są dość dobrze opisane (Kay et al., 2013), mechanizmy uruchamiające pozostałe
typy odpowiedzi nie są jasne. W przypadku odpowiedzi Th2-zależnej, zaproponowanej już w
latach 80-tych XX wieku (Mosmann et al., 1986), funkcjonują obecnie 2 dominujące
hipotezy: 1) rozwija się ona przy braku lub niepełnej indukcji stanu zapalnego typu Th1 lub 2)
istnieją odrębne receptory i ścieżki sygnałowe odpowiedzialne za rozpoznawanie PAMP
patogenów indukujących odpowiedź Th2. Oba wyjaśnienia wydają się możliwe. Stwierdzono,
że aktywacja komórek dendrytycznych jest kluczowa dla rozwinięcia odpowiedzi Th2 in vivo
(Phythian-Adams et al., 2010), a ich fenotyp wskazuje wtedy na niedojrzałość. Pod wpływem
czynników wzbudzających odpowiedź Th1 (np. LPS, Lipopolysaccharide) następuje wzrost
ekspresji cząsteczek związanych z prezentacją antygenu limfocytom T (MHC klasy II- 1.
sygnał oraz CD40, CD80 i CD86- 2. sygnał) oraz produkcja IL-12 (3. sygnał), co świadczy o
dojrzałości tych komórek (Vieira et al., 2000). Zaobserwowano natomiast, że indukcja
mechanizmów typu 2 zachodzi, gdy DC nie ulegają pełnej aktywacji; nie następuje lub jest
16
3. Wstęp
niewystarczająca prezentacja antygenu i nie pojawia się IL-12, co indukuje dojrzewanie
limfocytów Th2 (Jankovic et al., 2004). Jednak obserwuje się wzbudzenie specyficznej
odpowiedzi Th2-zależnej także w obecności stymulantów typu Th1 (Cervi et al., 2004), co
sugeruje istnienie oddzielnych ścieżek aktywacji dla różnych rodzajów odpowiedzi.
Wykazano, że DC stymulowane antygenami pasożytów rozpoznawanymi przez receptory
takie jak: MR (Mannose Receptor; receptor dla mannozy, fukozy i N-acetyloglukozaminy,
CD206), dektyna 1 i 2, DC-SIGN czy TLR 4, indukują dojrzewanie limfocytów Th2. Te PRR
rozpoznają reszty cukrowe, które licznie występują w antygenach nicieni i sugeruje się, że
takie cząsteczki mogą być swoistymi adiuwantami odpowiedzi typu 2 (Hussaarts et al., 2014).
Cechą charakterystyczną inwazji helmintów, która ma duży wpływ na indukcję odpowiedzi
Th2, jest migracja pasożytów przez tkanki żywiciela w czasie zarażenia. Jako organizmy
wielokomórkowe, helminty przedzierają się przez tkanki i narządy powodując uszkodzenia
mechaniczne
indukujące
wydzielanie
różnych
czynników
alarmujących
układ
odpornościowy. Szczególnie dobrze poznana jest w tym aspekcie rola nabłonka jelita;
komórki epitelialne zwykle jako pierwsze mają kontakt z nicieniami żołądkowo-jelitowymi,
gdy te wnikają w nabłonek układu pokarmowego. Przerwanie ciągłości tkanki, a także
rozpoznawanie czynników pochodzenia pasożytniczego, indukuje wydzielanie przez komórki
nabłonkowe alarmin- TSLP (Thymic Stromal Lymphopoietin), IL-33 i IL-25- cytokin, które
sygnalizują uszkodzenie komórek. Cytokiny te przyciągają komórki odpowiedzi Th2,
związane także z gojeniem (Gause et al., 2013). Czynniki te prowadzą do rozwoju
odpowiedzi Th2 poprzez hamowanie wydzielania IL-12 przez komórki dendrytyczne (Zaph et
al., 2007), indukcję degranulacji komórek tucznych (Allakhverdi et al., 2007), a także przez
bezpośredni wpływ na limfocyty T powodując ich polaryzację (Owyang et al., 2006). Poprzez
te mechanizmy, inwazja pasożytnicza może być rozpoznana przez żywiciela i następuje
indukcja reakcji Th2.
3.2.2 Mechanizmy efektorowe odpowiedzi Th2
Aktywacja komórek odpowiedzi wrodzonej przez antygeny pasożytów oraz czynniki
wydzielane po uszkodzeniu tkanki, poprzedza aktywację komórek odpowiedzi nabytej,
specyficznej wobec antygenów pasożyta. Pobudzone w narządach komórki APC (Antigen
Presenting Cells; komórki prezentujące antygen) migrują do węzłów limfatycznych i poprzez
interakcje z naiwnymi limfocytami Th (helper; pomocniczymi, CD4+) indukują ich
dojrzewanie. Komórki Th specyficzne wobec prezentowanych antygenów są aktywowane i
17
3. Wstęp
wykazują fenotyp Th2, o czym świadczy produkcja cytokin: IL-4, IL-5, IL-9 i IL-13 (Paul,
2010). Komórki te są kluczowe w odpowiedzi obronnej przeciwko nicieniom; deplecja
limfocytów CD4+ w czasie zarażenia uniemożliwia rozwinięcie odpowiedzi obronnej
(Koyama et al., 1995). Jednak odpowiedź przeciwpasożytnicza nie jest jednoskładnikowa i
wymaga uruchomienia różnych mechanizmów efektorowych, które unieszkodliwią pasożyta.
Reakcje te kontrolowane są właśnie przez limfocyty Th2; wydzielane cytokiny aktywują
kolejne
populacje
komórek:
komórki
tuczne,
eozynofile,
makrofagi
aktywowane
alternatywnie (Alternatively Activated Macrophages; AAMf lub M2) i limfocyty B oraz
wywołują zmiany fizjologiczne w tkankach (Anthony et al., 2007), które to mechanizmy
wspólnie przyczyniają się do usunięcia inwazji.
W czasie zarażeń zwykle obserwuje się eozynofilię w krwi i narządach. Eozynofile,
aktywowane przez IL-5, GM-CSF i eotaksynę, migrują do miejsca, gdzie przebywa pasożyt i
wydzielają czynniki prozapalne oraz cytokiny (Klion & Nutman, 2004). W czasie
degranulacji uwalniane są białka, takie jak: rybonukleazy, peroksydaza eozynofilowa
(eosinophil peroxidase; EPO) i główne białko zasadowe (major basic protein; MBP) oraz
reaktywne formy tlenu, które uszkadzają powierzchnię pasożyta (Kita, 2011). Czynniki te są
szczególnie ważne w przypadku nicieni migrujących, jak Toxocara czy filarie, gdyż znacząco
przyczyniają się do zabijania larw tych pasożytów (Meeusen & Balic, 2000). Eozynofile
pełnią także ważną funkcję regulatorową; są źródłem cytokin, jak IL-4 i IL-13, i wzmacniają
odpowiedź Th2 zależną (Spencer, 2014). Jako komórki obecne w narządach (tissue-dwelling
cells) jako pierwsze mogą reagować na docierające pasożyty i sygnały z uszkodzonych
tkanek. Choć eozynofilom przypisuje się także rolę w powstawaniu zmian patologicznych i
nadmiernego uszkodzenia tkanek, zarówno w czasie zarażeń pasożytami jak i reakcji
alergicznej, podkreśla się znaczenie tej populacji komórek w procesie przebudowy oraz
gojenia tkanek (Lee & Lee, 2005). Te same mechanizmy, które mogą uszkadzać patogeny,
biorą udział w przekształcaniu tkanek żywiciela, jak degradacja białek macierzy
zewnątrzkomórkowej czy uwalnianych przez komórki nekrotyczne. Dzięki właściwościom
efektorowym i regulacyjnym, eozynofile biorą zatem udział wielokierunkowo w odpowiedzi
typu 2- wpływając bezpośrednio na pasożyta, ale także na tkanki żywiciela.
Kolejną populacją komórek pojawiającą się w czasie zarażenia nicieniami są makrofagi, które
pod wpływem czynników pochodzenia pasożytniczego i/lub środowiska Th2 (IL-4/IL-13)
ulegają aktywacji alternatywnej. U myszy, charakteryzuje się ona obniżoną aktywnością
indukowanej syntazy tlenku azotu (iNOS) na rzecz arginazy-1 (Sica & Mantovani, 2012).
18
3. Wstęp
Enzymy te konkurują o substrat, L-argininę; iNOS katalizuje reakcję, w której powstaje
tlenek azotu (nitric oxide; NO), jeden z mediatorów stanu zapalnego. Natomiast arginaza-1,
poprzez wytwarzanie L-ornitryny włączona jest w szlak syntezy poliamin, czynników
przeciwzapalnych, oraz kolagenu, niezbędnego do gojenia tkanek. Ponadto, AAMf w
odróżnieniu od makrofagów aktywowanych na drodze klasycznej (CAMf, Classically
Activated Macrophages, M1) nie wydzielają prozapalnych IL-1 i IL-12, lecz cytokiny
regulatorowe- IL-10 i TGF-β. Komórki te wydzielają także białka z rodziny ChaFF (Chitinase
and Fizz Family members), takie jak kwaśna chitynaza ssacza (acidic mammalian chitinase;
AMCase) Ym1, Fizz1 czy Fizz2 (Nair et al., 2005). Czynniki te mogą wiązać niektóre
cząsteczki pasożytów, indukować migrację innych leukocytów oraz wspomagać procesy
gojenia tkanki. AAMf różnią się od CAMf także ekspresją markerów powierzchniowych;
obserwuje się na nich zwiększoną ekspresję takich PRR jak: MR i dektyna 1 (receptor dla βglukanu) oraz receptory-zmiatacze (scavenger receptors; Gordon & Martinez, 2010).
Dokładna rola obronna AAMf w czasie inwazji nie jest poznana, wykazano jednak, że
usunięcie tej populacji zaburza pierwotną i wtórną odpowiedź przeciwko nicieniom jelitowym
(Anthony et al., 2006, Zhao et al., 2008). Prawdopodobnie wpływają one na procesy
fizjologiczne jelita wspomagając usuwanie pasożytów, ale także mogą bezpośrednio
uszkadzać pasożyty i wpływać na ich płodność (Bonne-Année et al., 2013). Zwraca się
również uwagę na ich rolę regulacyjną; hamując stan zapalny typu Th1 mogą pozytywnie
wpływać na rozwój i utrzymanie mechanizmów obronnych typu 2 (Herbert et al., 2004).
W czasie inwazji nicieni, szczególnie jelitowych, ważną funkcję w reakcji obronnej pełnią
komórki tuczne, u myszy zwykle warunkujące wyrzucanie pasożytów z jelita (Shintoku et al.,
2013). Ulegają one degranulacji, zależnej i niezależnej od IgE, uwalniając histaminę, proteazy
i cytokiny. Komórki tuczne mogą bezpośrednio uszkadzać powierzchnię pasożyta, ale
równocześnie pełnią funkcje regulatorowe; są źródłem cytokin chemotaktycznych dla
limfocytów T, komórek dendrytycznych i innych (Hepworth et al., 2012). Produkty komórek
tucznych wpływają także na nabłonek jelita; zwiększa się jego przepuszczalność, co razem ze
wzmożoną produkcją śluzu i napięciem mięśni ułatwia migrację komórek układu
odpornościowego, a także utrudnia utrzymanie się nicieni w jelicie (Onah & Nawa, 2000).
Kolejny mechanizm efektorowy w czasie odpowiedzi typu 2 wynika z aktywacji limfocytów
B. Pod wpływem IL-4 oraz oddziaływań z limfocytami Th2 następuje przełączanie klas
przeciwciał i produkowane są IgE oraz IgG1- zarówno specyficzne wobec antygenów nicieni,
jak i poliklonalne (Harris & Gause, 2011). IgE bierze udział w aktywacji komórek tucznych i
19
3. Wstęp
bazofilów, natomiast IgG1 aktywuje komórki takie jak makrofagi czy neutrofile. Uważa się,
że przeciwciała klasy IgG chronią przed kolejnym zarażeniem niektórymi gatunkami nicieni,
a w pierwotnej inwazji obniżają płodność pasożytów (McCoy et al., 2008). Ponadto,
odporność przeciwko helmintom może być biernie przenoszona poprzez transfer surowicy lub
samych IgG (Harris & Gause, 2011). Cytotoksyczność zależna od przeciwciał (Antibody
Dependant Cell-mediated Cytotoxicity; ADCC) z udziałem immunoglobulin i różnych
komórek posiadających receptor dla fragmentu Fc przeciwciał różnych klas, umożliwia
specyficzny atak na pasożyta; uwalniane czynniki toksyczne uszkadzają pasożyty lub
zatrzymują ich migrację obniżając negatywny wpływ na żywiciela. Przeciwciała neutralizują
także produkty pasożytów osłabiając ich wpływ na żywiciela (Moreau & Chauvin, 2010).
Ze względu na rozmiary, nicienie pasożytnicze nie są fagocytowane przez komórki żerne.
Wymienione wyżej mechanizmy obronne typu 2 polegają zatem na uwalnianiu cząsteczek
efektorowych, które uszkadzają powierzchnię nicieni lub blokują funkcje ich układu
pokarmowego (Knox et al., 2003) oraz na zmianie warunków fizjologicznych tkanki na mniej
sprzyjające pasożytowi. Równocześnie, uruchamiane mechanizmy zmniejszają skutki
uszkodzeń tkanek powodowanych przez przemieszczające się nicienie. Dlatego u myszy,
szczepy charakteryzujące się efektywniejszą indukcją mechanizmów Th2 zależnych, np.
BALB/c, są zwykle bardziej odporne na zarażenia nicieniami niż zwierzęta z tendencją do
odpowiedzi Th1, np. C57Bl6, AKR (Behnke et al., 2009). Jednak gatunki nicieni
pasożytniczych różnią się wrażliwością na wymienione reakcje obronne żywiciela; nie każda
reakcja mechanizmu typu 2 warunkuje obronność w czasie różnych inwazji. Różne
mechanizmy są skuteczne w zwalczaniu poszczególnych gatunków pasożytów, zatem
dynamika i równowaga reakcji są kluczowe dla kontrolowania zarażenia (Patel et al., 2009).
3.2.3 Immunosupresja w czasie zarażeń nicieniami
Ko-ewolucja układu pasożyt-żywiciel doprowadziła do wykształcenia przez helminty
mechanizmów regulujących i hamujących reakcje układu odpornościowego. Sprzyja to
przeżywaniu zarówno pasożyta, jak i żywiciela, przez ograniczanie stanu zapalnego
(MacDonald et al., 2002). Immunosupresja pojawiająca się w czasie zarażeń nicieniami
stanowi dodatkowe utrudnienie w zwalczaniu inwazji. Obserwuje się hamowanie reakcji
specyficznych wobec pasożyta, ale także obwodowych na inne antygeny, dlatego
immunosupresja może być także korzystna dla żywiciela, jak w przypadku helmintoterapii,
gdy obserwuje się łagodzenie objawów chorób zapalnych podczas zarażenia (Elliott &
20
3. Wstęp
Weinstock, 2009). Nicienie pasożytnicze indukują naturalne mechanizmy regulatorowe na
każdym poziomie odpowiedzi immunologicznej: wrodzonej i nabytej, komórkowej i
humoralnej (Maizels et al., 2004).
Jedną ze strategii unikania reakcji obronnej żywiciela jest ograniczanie rozpoznania pasożyta
przez układ odpornościowy oraz hamowanie mechanizmów efektorowych. Obserwuje się
hamowanie aktywacji limfocytów T; pasożytnicze inhibitory proteaz zaburzają przetwarzanie
peptydów w procesie prezentacji antygenów (Manoury et al., 2001). Pasożyty wydzielają
także wiele enzymów hamujących mechanizmy efektorowe żywiciela; u filarii opisano wiele
genów, których produkty bezpośrednio ochraniają te nicienie przed reaktywnymi formami
tlenu czy elastazami wydzielanymi przez neutrofile (Maizels et al., 2001).
Poza unikaniem reakcji obronnych, nicienie pasożytnicze wykształciły mechanizmy
umożliwiające im aktywne modulowanie odpowiedzi immunologicznej żywiciela. Wykazano,
że w czasie zarażenia indukowane są naturalne mechanizmy regulatorowe, które dla żywiciela
stanowią zabezpieczenie przed zbyt intensywnym stanem zapalnym lub reakcjami
autoimmunizacyjnymi; np. limfocyty T regulatorowe (Treg) odpowiadają za tolerancję na
auto-antygeny oraz za ograniczanie nadmiernych reakcji na cząsteczki obce (Wing &
Sakaguchi, 2010). Wykazano, że helminty stymulują różnicowanie Treg, które poprzez
wydzielanie cytokin supresorowych (IL-10 i TGF-β) oraz bezpośrednie oddziaływania z
komórkami, ograniczają funkcje efektorowe (Maizels et al., 2004). Obniżają proliferację i
aktywność limfocytów Th2, szczególnie specyficznych wobec antygenów nicieni; hamowana
jest produkcja cytokin IL-4 i IL-5. Po zahamowaniu aktywności limfocytów Treg zwykle
następuje przywrócenie reakcji obronnej i zwalczenie zarażenia (Taylor et al., 2005). Ponadto,
produkty pasożytnicze bezpośrednio wpływają na limfocyty T- mogą powodować ich
areaktywność (Telford et al., 1998) i zmieniać ich zdolność do proliferacji czy apoptozy
(Doligalska et al., 2012), co wpływa na równowagę odpowiedzi Th1/Th2/Treg.
Innym źródłem cytokin regulatorowych jest populacja makrofagów aktywowanych
alternatywnie. Chociaż, jak opisano wcześniej, komórki te pełnią funkcje obronne w czasie
odpowiedzi typu 2, uważa się, że mogą także hamować reakcje odpornościowe. Komórki te
produkują TGF-β i prostaglandyny oraz hamują proliferację limfocytów T (Rückerl & Allen,
2014), jak również przyspieszają gojenie tkanek.
Czynniki, które odpowiadają za wzbudzenie immunosupresji w czasie zarażeń helmintami,
nie są jeszcze dokładnie opisane. Wiadomo jednak, że niektóre pasożyty produkują homologi
cytokin ssaków, którymi mogą regulować odpowiedź żywiciela; np. u filarii obecne są
21
3. Wstęp
homologi TGF-β (Gomez-Escobar et al., 2000), cytokiny przeciwzapalnej, która może
hamować odpowiedź obronną. Natomiast S. mansoni wydziela prostaglandyny, które nie
dopuszczają do pełnej aktywacji komórek dendrytycznych (Angeli et al., 2001).
Choć immunosupresja indukowana przez helminty powoduje ograniczenie odpowiedzi
obronnej, to wydaje się być ona pewnego rodzaju kompromisem osiągniętym pomiędzy
żywicielem a pasożytem. Blokowanie mechanizmów regulatorowych może okazać się dla
żywiciela szkodliwe; u myszy zarażonych S. mansoni doprowadza to do groźnego stanu
zapalnego (Herbert et al., 2004). Z tego powodu kontrola zarażenia wymaga równowagi
między odpowiedzią obronną typu 2, mechanizmami gojenia a immunosupresją. Taki stan
zapewnia żywicielowi przeżywanie zarażenia, które często przebiega bezobjawowo, a
równocześnie ogranicza nadmierną jego eksploatację przez pasożyta. Mechanizmy
odpowiedzi immunologicznej, obronnej i regulatorowej, pojawiające się w czasie zarażenia
nicieniami pasożytniczymi podsumowano na Rys. 2.
Efekt dla
pasożyta
Aktywacja mechanizmów
regulatorowych/
Indukcja immunosupresji/
Hamowanie
mechanizmów
Hamowanie rozpoznania
obronnych
Odpowiedź
regulatorowa
Eozynofil
Makrofag
Limfocyt B
TGF-β i IL-10
Wydzielanie
cytokin
Komórka
dendrytyczna
Limfocyt T
Antygeny ES
i somatyczne
Pasożyt
Treg i Th2
TGF-β i IL-10
Th1 i Th17
IL-12
Makrofag
Komórki nabłonkowe
Cytokiny alarmujące
(IL-33, IL-25, TSLP)
Efekt dla
żywiciela
Rozpoznanie
patogenu
Oddziaływania
receptorowe
Aktywacja mechanizmów
obronnych
M2
M1
Obronna
odpowiedź Th2
Rys. 2. Mechanizmy odpowiedzi immunologicznej indukowane w czasie zarażenia
nicieniami. Rysunek własny.
22
3. Wstęp
3.3 Rola chityny i chitozanu w indukcji odpowiedzi immunologicznej
Chityna to drugi po celulozie najliczniej występujący w przyrodzie naturalny polimer.
Zbudowany jest z podjednostek β-1,4-N-actetyloglukozaminy połączonych wiązaniami
glikozydowymi i charakteryzuje się dużą wytrzymałością (Rys. 3a). Wchodzi w skład
szkieletu zewnętrznego stawonogów, a także wzmacnia strukturę kutykuli nicieni oraz ściany
komórkowej grzybów (Merzendorfer, 2013). Często formuje kompleksy z białkami oraz
innymi cząsteczkami, będąc elementem bardziej złożonych struktur (Free, 2013). U nicieni
wykazano obecność tego polimeru w osłonkach jajowych, gardzieli (Wharton, 1983), a w
czasie linienia obserwuje się wzmożoną aktywność szlaku metabolicznego chityny. W
genomie różnych gatunków nicieni, np. wolno żyjącego C. elegans (Veronico et al., 2001) i
pasożytniczych, np. Ascaris suum, Brugia malayi (Foster et al., 2005), identyfikuje się wiele
genów
kodujących
syntazę
chityny-
enzym
katalizujący
polimeryzację
reszt
β-1,4-N-actetyloglukozaminy i powstawanie łańcuchów polimeru. Jej aktywność wykazano
na różnych etapach ontogenezy. W czasie wykluwania się z jaj oraz linienia larw obserwuje
się dodatkowo aktywność chitynaz, enzymów rozkładających chitynę (Tachu et al., 2008).
U zwierząt kręgowych, a także roślin, chityna nie jest syntetyzowana, jednak stwierdzono u
nich homologi/analogi chitynaz, z których część zachowała aktywność chitynolityczną
(Adrangi & Faramarzi, 2013). U myszy chitynazy oraz białka podobne do chitynaz (chitinaselike proteins; CLP) należące do rodziny GH18 (glycosyl hydrolases; hydrolazy glikozylowe)
są białkami wydzielniczymi i występują m. in. w układzie oddechowym, pokarmowym i
rozrodczym oraz odpornościowym. Należą do nich: aktywne enzymatycznie chitotriosydaza i
kwaśna chitynaza ssacza oraz chi-lektyny; wiążące chitynę, lecz bez aktywności
enzymatycznej: Ym1 (Chil3), Ym2, BRP-39 i owiduktyna (Bussink et al., 2007). Uważa się,
że białka te pełnią głównie funkcje odpornościowe; biorą udział w rozkładaniu i wiązaniu
chityny, co można uznać za strategię obronną żywiciela przed patogenami zawierającymi ten
polimer (Nair et al., 2005).
Receptory, które mogą rozpoznawać chitynę występują na różnych komórkach ssaków.
Najwięcej z nich obserwuje się na komórkach układu odpornościowego i są to: MR, TLR2 i
dektyny (Brinchmann et al., 2011), ale występują także np. na komórkach nabłonka układu
oddechowego czy pokarmowego, jak np. fibrinogen C domain-containing protein 1 (FIBCD1;
Schlosser et al., 2009) czy secreted C-type lectin RegIIIγ (Cash et al., 2006). Wykazano także,
że chityna może bezpośrednio aktywować układ dopełniacza (Roy et al., 2013b).
23
3. Wstęp
a
b
Rys. 3 Wzór strukturalny podjednostek a) chityny i b) chitozanu. Czerwonymi ramkami
oznaczono różnice wynikające z acetylacji grupy aminowej.
3.3.1 Odpowiedź immunologiczna na chitynę
Chityna obecna w patogenach oraz ich metabolitach, może być rozpoznawana przez układ
odpornościowy żywiciela, a co za tym idzie, indukować odpowiedź immunologiczną
(Brodaczewska et al., 2015). Ze względu na szerokie rozpowszechnienie polimeru w naturze,
ekspozycja układu odpornościowego na chitynę jest wysoka. Uważa się, że chityna jest
rozpoznawana przede wszystkim przez komórki w narządach bezpośrednio kontaktujących
się ze środowiskiem zewnętrznym, jak jelito lub płuca, gdzie polimer może aktywować
zarówno odpowiedź wrodzoną, jak i nabytą (Lee et al., 2008). Zaobserwowano, że chityna
aktywuje komórki charakterystyczne dla alergii i odpowiedzi typu 2, jak: eozynofile (O’Dea
et al., 2014), makrofagi (Satoh et al., 2010) i limfocyty Th2 produkujące IL-4/IL-13 (Reese et
al., 2007). Pod wpływem chityny następuje też wzmożona produkcja cytokiny regulatorowej
IL-10 (Wagener et al., 2014), a także nieznacznie zwiększa się produkcja przeciwciał (Tokura
et al., 1999). Jak wykazano wcześniej, wymienione mechanizmy są charakterystyczne dla
zarażeń nicieniami, ale także grzybami oraz pasożytniczymi stawonogami, które są uważane
za patogeny wzbudzające odpowiedź typu 2 (Liu et al., 2004, Kreindler et al., 2010, Walton et
al., 2010, Chen et al., 2012), a posiadają w swojej strukturze chitynę, co może sugerować
udział polimeru w naturalnej polaryzacji immunologicznej. Co więcej, u roślin chityna
stanowi PAMP i warunkuje odporność na infekcje grzybicze, owadami i nicieniami
pasożytniczymi (Malinovsky et al., 2014).
Makrofagi mogą w dużym stopniu odpowiadać za rozpoznawanie patogenów zawierających
chitynę (Reese et al., 2007). W wielu badaniach stwierdzono, że ekspozycja na chitynę
skutkuje aktywacją alternatywną makrofagów. Obserwowano wzrost ekspresji arginazy-1,
markerów Ym1, Fizz1 i MR (Satoh et al., 2010), produkcję IL-10 (Wagener et al., 2014) oraz
leukotrienu B4, który jest chemoatraktantem dla eozynofilów (Reese et al., 2007). Obserwacje
24
3. Wstęp
te potwierdzono zarówno in vitro (Wagener et al., 2014), jak i w warunkach in vivo w płucach
(Reese et al., 2007) oraz w jamie otrzewnej (Satoh et al., 2010). Aktywacja alternatywna
makrofagów może prowadzić do gromadzenia się eozynofilów i wydzielania IL-4/IL-13
tworząc środowisko typowe dla odpowiedzi Th2 (Satoh et al., 2010).
W wyniku rozkładu chityny, przez enzymy wydzielane przez pasożyty jak i żywiciela,
uwalniane
są
jej
mniejsze
fragmenty;
oligosacharydy
oraz
pojedyncze
reszty
N-acetyloglukozaminy, a także, w mniejszym stopniu, inne jej pochodne, jak chitozan
(Rys. 3b). Jest to polimer, który powstaje przez deacetylację chityny; uznaje się, że terminem
chitozan można nazywać polimer o stopniu deacetylacji powyżej 60% (Bueter et al., 2011).
Różnice
w
strukturze
chitozanu
względem
chityny
zadecydowały
o
większym
zainteresowaniu tym polimerem- jest on rozpuszczalny w słabych kwasach, a także łatwiej
poddaje się modyfikacjom chemicznym. Dzięki temu to chitozan, a nie chityna, jest szeroko
badany jako biomateriał.
3.4 Właściwości i zastosowania chitozanu
Chitozan jest otrzymywany przez chemiczną (stężony NaOH) lub enzymatyczną (deacetylazy
chityny) deacetylację chityny, pozyskiwanej na skalę przemysłową zwykle ze szkieletów
morskich skorupiaków. Ma on formę proszku, który jest rozpuszczalny przy pH~6. Preparaty
polisacharydu dostępne na rynku mogą posiadać różną masę cząsteczkową (molecular
weight; Mw) oraz stopień deacetylacji (deacetylation degree; DD), które w dużym stopniu
decydują o jego właściwościach, zarówno fizycznych, chemicznych, jak i biologicznych.
Polimer ten ma wysoki wskaźnik pęcznienia oraz pojemność sorpcyjną i właściwości
chelatujące. Może być łatwo mieszany z innymi substancjami oraz modyfikowany chemicznie
i może być wytwarzany w postaci żeli, włókien, błon polimerowych czy nano- i mikrocząsteczek. Cechy te sprawiają, że znalazł on zastosowanie jako: substancja chelatująca i
filtrująca przy oczyszczaniu wody, dodatek do kosmetyków i żywności, materiał
wzmacniający papier lub tkaniny czy nawóz dla roślin. Jako polimer stanowi także
potencjalny materiał do wytwarzania złoży chromatograficznych, nici chirurgicznych czy
różnego rodzaju błon (Dutta, 2004).
Jako substancja bio-kompatybilna, chitozan wykorzystywany jest także w przemyśle
biomedycznym; testuje się go jako element rusztowań dla komórek i tkanek (scaffolds) oraz
opatrunków (Dutta, 2004). Chitozan wykazuje bardzo ciekawe właściwości biologiczne; ze
względu na obecność wolnych grup aminowych ma ładunek dodatni i może się łączyć z
25
3. Wstęp
powierzchniami naładowanymi ujemnie, jakimi są np. powierzchnia nabłonka jelitowego czy
oddechowego (Garg et al., 2010). Mikro- lub nano-cząsteczki chitozanu mogą także chronić
transportowane substancje, dlatego polimer ten testuje się jako nośnik leków, antygenów czy
transfekcyjnego DNA; szczególnie podawanych drogą pokarmową (Islam et al., 2012).
Wykazano, że preparaty chitozanu osłabiają połączenia międzykomórkowe w nabłonku,
zwiększając wchłanialność podawanych związków (Hsu et al., 2012). Cechy te mogą być
wykorzystywane w szczepionkach śluzówkowych- przedłużona ekspozycja antygenu
szczepionkowego oraz ułatwiony kontakt z komórkami M mogą przyczyniać się do większej
skuteczności szczepienia (Yoo et al., 2010).
Polimer ten wykazuje też bezpośrednie działanie na komórki układu odpornościowego; w
różnych modelach in vitro i in vivo wykazano immunostymulacyjne właściwości chitozanu.
Struktura chitozanu jest podobna do części cukrowej LPS ścian bakteryjnych; może być
zatem rozpoznawany przez te same receptory (TLR4) i podobnie aktywować komórki
(Otterlei et al., 1994). Sugeruje się także, że chitozan, podobnie jak chityna, może być
rozpoznawany przez MR (Mori et al., 2005). Receptory te obecne są m. in. na komórkach
dendrytycznych oraz makrofagach, na których chitozan indukuje ekspresję markerów
związanych z prezentacją antygenu oraz produkcję cytokin, co może prowadzić też do
aktywacji limfocytów (Villiers et al., 2009, Jia et al., 2014). Sugerowano, że chitozan
działając poprzez komórki APC może wzbudzać zarówno odpowiedź Th1, jak i Th2, i może
to zależeć od jego masy cząsteczkowej. Oligosacharydy oraz polimer o małej masie
(ok. 5 kDa) in vitro i in vivo indukuje stan zapalny (Mei et al., 2013, Zhang et al., 2014),
natomiast chitozan o większej masie aktywuje mechanizmy typu 2. Po podawaniu chitozanu
drogą pokarmową obserwuje się wzrost produkcji IL-10 i TGF-β, a także IL-4 i IL-6
(Porporatto et al., 2005, Canali et al., 2010). Immunostymulacyjne właściwości chitozanu są
wykorzystywane do wzmacniania odpowiedzi przeciwko komórkom nowotworowym czy w
czasie zakażeń bakteryjnych i wirusowych (Mann et al., 2014, Azuma et al., 2015.).
Natomiast indukcja odpowiedzi Th2 zależnej może być wykorzystana do wzmacniania
odpowiedzi humoralnej (Zaharoff et al., 2007), leczenia ran (Barreto et al., 2014) lub
łagodzenia chorób zapalnych. Chitozan podawany drogą pokarmową łagodzi objawy stanu
zapalnego jelit (Xiao et al., 2014), co może mieć zastosowanie w leczeniu IBD (Inflammatory
Bowel Disease; nieswoiste zapalenia jelit). Uważa się, że chitozan może wywoływać podobne
reakcje immunologiczne jak chityna, m. in. aktywację alternatywną makrofagów, która jest
jednym z mechanizmów odpowiedzi Th2 zależnej (Fong et al., 2015).
26
3. Wstęp
Połączenie właściwości immunostymulacyjnych chitozanu, mukoadhezyjności i funkcji
nośnika leków sprawia, że polimer ten spełnia kryteria adiuwantu, szczególnie dla
szczepionek przeciwko chorobom wymagającym odpowiedzi typu 2 oraz dostarczanych przez
nabłonki, jak np. zarażenia nicieniami jelitowymi.
27
4. Założenia i cele pracy
Zwalczanie zarażeń nicieniami opiera się obecnie przede wszystkim na podawaniu leków.
Jednak występujące re-inwazje, związane z dużym skażeniem środowiska pasożytami,
znacznie zwiększają koszty oraz ograniczają skuteczność terapii. Część żywicieli
eksponowanych na powtórne zarażenie pasożytem jest odporna, co sugeruje że szczepienia
mogą ograniczyć szerzenie się parazytoz (Maizels et al., 1999). Dotychczas niewiele jest
dostępnych na rynku szczepionek przeciwko helmintom; jest to zaledwie kilka preparatów
chroniących zwierzęta hodowlane przed niektórymi tasiemcami i 2 gatunkami nicieni
jelitowych (Bergquist & Lustigman, 2010, Harris & Gause, 2011). Choć wiele szczepionek
znajduje się w fazie badań klinicznych, trudno jest uzyskać preparat o zadowalającej
skuteczności (Hewitson & Maizels, 2014). Spowodowane jest to m. in. immunosupresją
wywoływaną przez pasożyty, ale także koniecznością wzbudzenia silnej odpowiedzi Th2
zależnej na podawane antygeny szczepionkowe. Wywołanie takiej odpowiedzi jest możliwe
po zastosowaniu odpowiedniego adiuwantu- substancji niespecyficznie wzmacniającej
odpowiedź immunologiczną (Pashine et al., 2005). Obecnie, dopuszczone do użytku u ludzi
są tylko 3 adiuwanty: sole glinu oraz emulsje MF59 i AS03 (Fierens & Kool, 2012).
Poszukuje się nowych związków, które przy niewielkich skutkach ubocznych, umożliwią
polaryzację
odpowiedzi
immunologicznej
i
skuteczne
rozwinięcie
odpowiednich
mechanizmów obronnych przeciwko patogenom. Dobranie adiuwantu aktywującego
mechanizmy Th2 zależne, wydaje się być kluczowe dla opracowania wydajnych szczepionek
przeciwko helmintom, ponieważ same antygeny są zwykle mało immunogenne.
Podobieństwa w odpowiedzi immunologicznej wywoływanej przez nicienie pasożytnicze
oraz chitynę/chitozan (podsumowane w Tabeli 2) sugerują udział tego polimeru w indukcji i
kształtowaniu reakcji przeciwpasożytniczych. Ponadto, właściwości biologiczne oraz zalety
związane z jego przetwarzaniem, sprawiają że chitozan może mieć zastosowanie jako nośnik
leków/antygenów lub substancja wzmacniająca odpowiedź immunologiczną nie tylko w
czasie zarażeń nicieniami pasożytniczymi, ale także innymi patogenami wywołującymi
odpowiedź typu 2.
W badaniach wstępnych stwierdziłam, że podawanie chitozanu wpływa na funkcje
makrofagów otrzewnowych wskazując na ich alternatywną aktywację (Brodaczewska &
Doligalska, 2012). Zmniejszenie produkcji NO przy wzroście aktywności arginazy 1 i
ekspresji receptora dla IL-4 pod wpływem chitozanu sugeruje, że polimer ten może działać
28
4. Założenia i cele pracy
jako stymulator odpowiedzi typu 2, a przez to może przyczyniać się do wzmacniania
odpowiedzi obronnej przeciwko helmintom.
Tabela 2. Podobieństwa w odpowiedzi immunologicznej wywoływanej przez nicienie
pasożytnicze oraz chitynę i chitozan.
Mechanizm odpowiedzi
Nicienie
pasożytnicze
Chityna
Chitozan
AAMf
++
+
+
Eozynofilia
+
++
+
Produkcja IL-4/IL-13
+++
++
+
Produkcja IL-10
+
+
+
Odpowiedź humoralna
++
+
++
W oparciu o wyniki własnych badań wstępnych oraz dane literaturowe, sformułowałam
hipotezę niniejszej rozprawy zakładającą, że:
chitozan zmieniając aktywność komórek odpowiedzi immunologicznej
wpływa na poziom odpowiedzi przeciwpasożytniczej w czasie zarażenia
myszy nicieniami Heligmosomoides polygyrus i Trichinella spiralis.
Właściwości biologiczne chitozanu sugerują, że może on wzbudzać mechanizmy
immunologiczne przydatne do wzmocnienia odpowiedzi przeciwpasożytniczej. Potwierdzenie
działania tego polimeru jako adiuwantu odpowiedzi Th2 zależnej w czasie inwazji nicieniami
jelitowymi, może stanowić podstawę do badań nad szczepionkami lub nośnikami związków
przeciwpasożytniczych z wykorzystaniem chitozanu. Dlatego w swoich badaniach podjęłam
próbę określenia, jak chitozan wpływa na odpowiedź immunologiczną na różnych jej
poziomach.
29
4. Założenia i cele pracy
Przeprowadzone badania, prezentowane w niniejszej pracy miały na celu:
1. Charakterystykę wpływu chitozanu na układ odpornościowy u myszy.
2. Określenie wpływu polimeru na odpowiedź przeciwpasożytniczą w czasie
zarażenia H. polygyrus i T. spiralis na poziomie mechanizmów wrodzonych oraz
nabytych.
Przeprowadzone doświadczenia są próbą określenia udziału polimeru N-acetyloglukozaminy i
glukozaminy w indukcji odpowiedzi przeciwko nicieniom oraz przydatności tego
biomateriału w zwalczaniu/kontrolowaniu inwazji.
30
5. Materiały i metody
5.1 Myszy, pasożyty i linie komórkowe
Doświadczenia prowadzono na samcach myszy szczepu C57Bl6, które są wrażliwe na
zarażenie nicieniami, a inwazja jest chroniczna.
Zwierzęta w wieku 6 tygodni lub starsze pochodziły ze Zwierzętarni Instytutu Medycyny
Eksperymentalnej i Klinicznej Polskiej Akademii Nauk w Warszawie lub Centrum Medycyny
Doświadczalnej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku. Myszy utrzymywano w
Zwierzętarni Wydziału Biologii UW w warunkach standardowych przy fotoperiodzie 12/12
godzin, ze swobodnym dostępem do wody i karmy. Po aklimatyzacji trwającej 1 tydzień,
rozpoczynano doświadczenia.
Myszy usypiano mieszaniną powietrza i 70% dwutlenku węgla (CO2).
Doświadczenia wykonywano zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Lokalną Komisję
Etyczną ds. Doświadczeń na Zwierzętach nr 1 w Warszawie (uchwała nr 216/2011).
Doświadczenia przeprowadzano na myszach zarażonych nicieniami pasożytniczymi:
Heligmosomoides polygyrus lub Trichinella spiralis. Oba gatunki pasożytów utrzymywane są
w Zakładzie Parazytologii w ciągłym pasażu na samicach myszy szczepów, odpowiednio
C57Bl6 i BALB/c. Myszy zarażano za pomocą sondy doprzełykowej podając 200 larw
stadium L3 H. polygyrus lub 400 larw mięśniowych (L1) T. spiralis w 250 μl wody.
Linię komórkową JAWS II (ATCC, nr kat. CRL-1190) otrzymano od Zakładu Immunologii
Wydziału Biologii. Są to unieśmiertelnione niedojrzałe komórki dendrytyczne uzyskane ze
szpiku kostnego myszy C56Bl/6 z knockout białka p53. Podziały tych komórek zachodzą w
obecności czynnika wzrostu GM-CSF (MacKay & Moore, 1997). Komórki te są
wykorzystywane m. in. w badaniach nad nowotworami (Xu et al., 2007) czy szczepionkami
(Otsu et al., 2006).
5.2 Odczynniki
Wykorzystano 3 rodzaje chitozanu: oligosacharydy (COS- Chitosan OligoSaccharides; 2-6
reszt N-acetyloglukozaminy, Amicogen, nr kat. ChitoOligo-100) oraz polimer o małej (Low
Molecular Weight; LMW; Mw= 50-190 kDa, DD >75%, Sigma, nr kat. 448869) i dużej (High
31
5. Materiały i metody
Molecular Weight; HMW; Mw= 190-375 kDa, DD >75%, Sigma, nr kat. 419419) masie
cząsteczkowej. Przygotowywano roztwory wyjściowe polimerów o stężeniu 1% w 0,75%
kwasie adypinowym (StanLab) lub w wodzie dejonizowanej (dla COS), które autoklawowano
i przechowywano w lodówce (przez maksymalnie 2 miesiące) do czasu wykorzystania w
doświadczeniach. Zawartość endotoksyn w roztworach wyjściowych wynosiła <0,2 EU/ml w
teście LAL (Thermo).
Tabela 3. Lista i skład stosowanych buforów
Skład
PBS
Pełna
nazwa;
wykorzystanie
Sól
fizjologiczna
buforowana
fosforanami
Roztwór NaCl
Sól fizjologiczna
NaCl (POCh) 0,9% w wodzie destylowanej
RPMI
Pożywka do izolacji RPMI-1640,
L-glutamina
2
komórek
płynu penicylina/streptawidyna
100
otrzewnowego
Wszystkie odczynniki Invitrogen
RPMI pełna
Pożywka do hodowli RPMI-1640,
L-glutamina
2
mM,
penicylina/streptawidyna 100 U/ml, inaktywowana
komórek
płodowa surowica bydlęca (FCS; Invitrogen) 10%
Nazwa
skrócona
NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM,
KH2PO4 1,8 mM, pH=7,2 w wodzie dejonizowanej
Wszystkie odczynniki POCh
mM,
U/ml
RPMI JAWS Pożywka do hodowli RPMI-1640,
L-glutamina
2
mM,
penicylina/streptawidyna
100
U/ml,
nieII
komórek JAWS II
inaktywowana płodowa surowica bydlęca (FCS)
20%, pirogronian sodu (Invitrogen) 1 mM, GM-CSF
(Peprotech) 5 ng/ml
RPMI
nicieni
do Pożywka do hodowli RPMI-1640 Glutamax, penicylina/streptawidyna 100
nicieni
U/ml. Wszystkie odczynniki Invitrogen
Roztwór
trawiący
Roztwór
do Pepsyna bydlęca (Sigma) 0,5%, HCl (Chempur) 1%
trawienia mięśni
w wodzie destylowanej
PBS/BSA
Bufor do oznaczeń NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM,
KH2PO4 1,8 mM, pH=7,2, albumina bydlęca (BSA;
cytometrycznych
Sigma) 0,1% w wodzie dejonizowanej
PBS Tween
Bufor do płukania NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM,
KH2PO4 1,8 mM, pH=7,2, Tween 20 (Serva) 0,05%
membrany
w wodzie dejonizowanej
Odczynnik
Griessa
Pomiar tlenku azotu
Sulfamilamid 1%, naftylendiamina 0,1%, kwas
ortofosforowy 2% w wodzie destylowanej
Wszystkie odczynniki Chempur
Żel 5%
Żel zagęszczający
Tris-HCl (Serva) 0,125 M, akrylamid/ bis-akrylamid
(37:1,Sigma) 5%, SDS (dodecylosiarczan sodu,
Sigma) 0,0125%, APC (nadsiarczan amonu, Serva)
0,006%,
TEMED
(tetrametyloetylenodiamina,
Serva) 0,2% w wodzie dejonizowanej
32
5. Materiały i metody
Żel 12%
Żel rozdzielający
Tris-HCl (Serva) 0,375 M, akrylamid/ bis-akrylamid
(37:1,Sigma) 12%, SDS (dodecylosiarczan sodu,
Sigma) 0,0125%, APC (nadsiarczan amonu, Serva)
0,006%,
TEMED
(tetrametyloetylenodiamina,
Serva) 0,2% w wodzie dejonizowanej
Bufor
do Rozdział
elektroforetyczny
elektoforezy
białek
Glicyna (Serva) 200 mM, Tris (Serva) 25 mM, SDS
(dodecylosiarczan sodu, Sigma) 10% w wodzie
dejonizowanej
Bufor
transferu
do Transfer białek na Glicyna (Serva) 40 mM, Tris (Serva) 50 mM,
membranę
Metanol (Chempur) 20% w wodzie dejonizowanej
nitrocelulozową
TBS
Sól
fizjologiczna Tris (Serva) 20 mM, NaCl (POCh) 0,9%, pH=7,4, w
buforowana Tris
wodzie dejonizowanej
TBS Tween
Bufor do płukania Tris (Serva) 20 mM, NaCl (POCh) 0,9%, pH=7,4,
membrany
Tween 20 (Serva) 0,01% w wodzie dejonizowanej
Bufor
Laemmli
Bufor
do
przygotowania prób
do
rozdziału
elektroforetycznego
DAB/H2O2
Substrat
peroksydazy
Western blot
Tris-HCl (Serva) 0,125 M, glicerol (Chempur) 25%,
SDS (dodecylosiarczan sodu, Sigma) 5%, βmerkaptaetanol (Serva) 15%, błękit bromofenolowy
(POCh) 0,01% w wodzie dejonizowanej
dla DAB (3,3-diaminobenzydyna, Sigma) 2,5%, H2O2
w (Chempur) 0,01% w wodzie dejonizowanej
5.3 Schemat doświadczeń in vivo
Chitozan HMW, 500 μg w 0,35% kwasie adypinowym, podawano myszom w objętości
200 μl codziennie dootrzewnowo przez 10 dni. Następnie, w różnych dniach doświadczenia
(wg Rys. 4) wykonywano sekcje w celu określenia wzbudzonych po podaniu chitozanu
reakcji układu odpornościowego. Myszy, którym podawano sam kwas adypinowy (200 μl,
0,35%) oraz myszy, którym nie wstrzykiwano roztworów do jamy otrzewnej stanowiły
2 grupy kontrolne, oznaczane odpowiednio: AdOH i K.
Sekcja 1
Cht1
0
10
Sekcja 2
Cht2
25
Sekcja 3
Cht3
35
dni
Podawanie chitozanu
Rys. 4. Schemat doświadczeń, w których określano przebieg odpowiedzi immunologicznej po
podaniu chitozanu.
33
5. Materiały i metody
W celu określenia wpływu chitozanu na odpowiedź przeciwpasożytniczą, w 5 dniu
podawania polimeru zwierzęta zarażano Heligmosomoides polygyrus (wg Rys. 5a) lub
Trichinella spiralis (wg Rys. 5b) i w zależności od gatunku nicienia wykonywano sekcje w
różnych dniach po zarażeniu (dpz).
a
Zarażenie
Sekcja 1
Sekcja 2
L4
0
5
11
dorosłe
27
dni
Podawanie chitozanu
b
0
Zarażenie
5
Sekcja 1
dorosłe
10
Sekcja 2
L1
35
dni
Podawanie chitozanu
Rys. 5. Schemat doświadczeń, w których określano wpływ chitozanu na przebieg zarażenia
myszy a) Heligmosomoides polygyrus lub b) Trichinella spiralis. Na niebiesko oznaczono
stadia rozwojowe nicieni obecne w żywicielu w badanym dniu zarażenia.
5.4 Analiza NMR
Analizę chitozanu metodą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (Nuclear
Magnetic Resonance; NMR) wykonywano we współpracy z dr Katarzyną Lewandowską z
Katedry Chemii Biomateriałów i Kosmetyków Wydziału Chemii Uniwersytetu Mikołaja
Kopernika w Toruniu. Wylewano krople roztworu na płytkę z CaBr2 i suszono układ
wytwarzając cienkie filmy. Następnie wykonywano pomiar widm w podczerwieni w zakresie
od 4000- 600 cm-1 w spektrofotometrze FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy)
Genesis II (Mattson, USA) wyposażonym w układ ATR (Attenuated Total Reflectance;
wielokrotne odbicie osłabione; MIRacleTM PIKE Technologies).
5.5 Ocena pobudzenia immunologicznego
W czasie trwania doświadczenia oceniano kondycję myszy na podstawie ich zachowania i
wyglądu. Co 2 lub 3 dzień myszy z wszystkich grup doświadczalnych ważono, a następnie
34
5. Materiały i metody
dla każdego zwierzęcia określano % zmiany masy ciała względem dnia 0 doświadczenia. W
dniach sekcji izolowano: serce, lewą nerkę, śledzionę, płuca oraz wątrobę i ważono narządy.
Następnie określano ich relatywną masę względem serca, według wzoru: Mrel=
Mnarządu
.
Mserca
Co 2 lub 3 dzień wykonywano rozmaz z kropli krwi pobranej z ogona każdej myszy.
Następnie wysuszone rozmazy utrwalano w 90% metanolu przez 5 min i barwiono metodą
DiffQuik (Merck)- komercyjnym zestawem do zmodyfikowanego barwienia Giemsa.
Rozmazy zanurzano 5-krotnie w kominkach zawierających barwniki I i II, a następnie
szkiełka płukano w bieżącej wodzie. Preparaty obserwowano w mikroskopie świetlnym przy
powiększeniu x100. Dla każdego preparatu liczono min. 200 komórek, a następnie obliczano
odsetek różnych populacji.
5.6 Izolacja komórek
Żywotność oraz gęstość komórek w zawiesinach określano w barwieniu błękitem trypanu w
automatycznym liczniku komórek Countess (Invitrogen). Do doświadczeń wykorzystywano
próby, w których żywotność komórek wynosiła >90%.
Krew obwodową pobierano z serca igłą do strzykawki przepłukanej roztworem heparyny (50
U/ml). Następnie próby wirowano przy 250 g w 4°C przez 10 min. Oddzielone osocze
zbierano i przechowywano w -20°C, a osad komórek inkubowano przez 10 min w
temperaturze pokojowej w 5 ml buforu lizującego, aby usunąć erytrocyty. Otrzymane
leukocyty płukano trzykrotnie w zimnym PBS/BSA i wykorzystywano do oznaczeń
cytometrycznych.
Komórki
otrzewnowe
otrzymywano
po
płukaniu
jamy
otrzewnej;
wstrzykiwano
dootrzewnowo 5 ml pożywki RPMI o temperaturze 37°C, a następnie masowano brzuch
myszy przez 1 min. Płyn otrzewnowy (o objętości ok. 4 ml) pobierano szklaną pipetą,
oddzielnie od każdej myszy, do probówek trzymanych na lodzie. Próby wirowano 200 g przez
7 min w 4°C, otrzymany supernatant zbierano i przechowywano w -20°C, a osad komórek
płukano trzykrotnie w PBS/BSA (do oznaczeń cytometrycznych) lub sterylnej pożywce
RPMI (do hodowli in vitro). Dodatkowo z zawiesiny komórek wykonywano rozmaz, który
barwiono metodą DiffQuik.
35
5. Materiały i metody
Krezkowe węzły limfatyczne (Mesenteric Lymph Nodes; MLN) izolowano oddzielnie od
każdej myszy i umieszczano w PBS w temperaturze 4°C. Następnie narządy przecierano
przez sterylne sitko (100 μm, BD Sciences) w pełnej pożywce RPMI. Otrzymane zawiesiny
komórek wirowano 220 g przez 7 min w 4°C i płukano trzykrotnie w PBS/BSA (do oznaczeń
cytometrycznych) lub sterylnej pełnej pożywce RPMI (do hodowli in vitro).
5.7 Izolacja nicieni
5.7.1
Heligmosomoides polygyrus
Liczbę jaj w kale określano metodą flotacji; próbki kału pobierano oddzielnie od każdej
myszy, ważono i umieszczano w szklanej probówce zawierającej 1 ml wody destylowanej.
Kał rozcierano bagietką, a następnie zalewano nasyconym roztworem NaCl do menisku
wypukłego. Na probówkę nakładano szkiełko nakrywkowe na 30 min, a następnie liczono
jaja przyklejone do szkiełka. Liczbę jaj przeliczano na 1 g kału (Eggs per Gram; EPG).
Larwy inwazyjne L3 otrzymywano z koprokultur; kał myszy C56Bl6 zbierano między 4-12
tygodniem po zarażeniu i mieszano z wodą. Otrzymaną zawiesinę nakładano na wilgotną
bibułę w szalce Petriego i inkubowano w 21°C. Po 7 dniach hodowli brzeg bibuły
opłukiwano, a zebrane larwy L3 przemywano wielokrotnie wodą i przechowywano w 4°C do
czasu zarażenia.
W 6 dpz izolowano jelito cienkie myszy, które umieszczano w szalce Petriego, końce jelita
wiązano nitką, aby uniemożliwić wydostawanie się treści. Szalkę z jelitem zalewano pożywką
RPMI do nicieni i inkubowano w 37°C przez minimum 3 h; w tym czasie larwy stadium L4
opuszczały ścianę jelita i wydostawały się do pożywki. Larwy zbierano, liczono i mrożono w
PBS w -20°C.
W celu wyizolowania form dorosłych nicienia metodą Baermanna od myszy w 22 dpz
pobierano jelito cienkie. Rozcinano je wzdłuż, a następnie odcinano 1 cm fragmenty, które
umieszczano na sitku w krystalizatorze i zalewano roztworem NaCl. Po 2 h inkubacji w 37°C
nicienie, które opadały na dno krystalizatora zbierano, liczono i mrożono w PBS w -20°C lub
36
5. Materiały i metody
hodowano in vitro w pożywce RPMI do nicieni, 20 samic/ dołek. Po 48 h liczono jaja i
przeliczano ich ilość na 1 samicę.
5.7.2
Trichinella spiralis
W celu wyizolowania form dorosłych nicienia metodą Baermanna od myszy w 5 dpz
izolowano jelito cienkie. Rozcinano je wzdłuż, a następnie odcinano 1 cm fragmenty, które
umieszczano na sitku w krystalizatorze i zalewano roztworem NaCl. Po 4 h inkubacji w 37°C
nicienie, które opadały na dno krystalizatora zbierano, liczono i mrożono w PBS w -20°C.
Część samic (po 10 od każdej myszy) umieszczano oddzielnie w dołkach płytki. Po
trzykrotnym wypłukaniu nicieni sterylną pożywką RPMI do nicieni, zalewano je 200 μl
pożywki i hodowano 48 h w 37°C, 5% CO2. Następnie dołki obserwowano w mikroskopie
odwróconym i liczono nowonarodzone larwy L1 (New-borne Larvae; NBL).
Larwy mięśniowe L1 izolowano od myszy w 30 dpz; po usunięciu narządów i skóry, mięśnie
rozdrabniano za pomocą blendera i próby inkubowano mieszając w roztworze trawiącym
przez 30 min w 37°C. Próby dekantowano wielokrotnie roztworem NaCl. Larwy L1 liczono
w binokularze, określając całkowitą liczbę nicieni na 1 mysz.
5.7.3
Otrzymywanie roztworów antygenów nicieni
Frakcję rozpuszczalnych w wodzie białek nicieni otrzymywano poprzez sonikację; zawiesiny
nicieni rozmrażano i rozdrabniano ultradźwiękami, na lodzie w urządzeniu VibraCell przez 6
min w trybie 20 s ON: 20 s OFF. Próby wirowano 1000 g przez 15 min w 4°C i poziom
białka mierzono w supernatancie we fluorymetrze Qubit (Invitrogen). Następnie próby
porcjowano, przechowywano w -80°C i używano do dalszych doświadczeń. Antygeny
przeznaczone do hodowli in vitro sterylizowano przepuszczając przez filtr strzykawkowy o
wielkości porów 0,22 μm (Millipore).
5.8 Analiza cytometryczna
Badania wykonywano na cytometrze przepływowym FACSCalibur (BD Sciences)
znajdującym się na wyposażeniu Zakładu Immunologii Wydziału Biologii UW. Cytometr
37
5. Materiały i metody
wyposażony jest w lasery 488 nm i 635 nm, umożliwiające wykonywanie oznaczeń
4-kolorowych.
Przygotowywano mieszaniny przeciwciał sprzężonych z fluorochromami (Tabela 4), zgodnie
z zaleceniami producentów, umożliwiające znakowania 4-kolorowe: FITC/PE/PercP/APC
obserwowane odpowiednio w kanałach FL-1/FL-2/FL-3/FL-4 cytometru. Dla każdego
rodzaju komórek, pochodzących z różnych tkanek, wykonywano barwienia pojedyncze
umożliwiające wykonanie ustawień cytometru.
Pół miliona komórek zawieszano w 50 μl PBS/BSA i dodawano 50 μl odpowiedniej
mieszaniny przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie. Próby inkubowano 30 min w 4°C w
ciemności, odpłukiwano niezwiązane przeciwciała dodając 500 μl PBS i wirując próby 200 g
przez 7 min w 4°C. Komórki utrwalano w 500 μl 1% formaliny przez minimum 24 h w 4°C w
ciemności. Analizę cytometryczną wykonywano w przeciągu tygodnia; próby wirowano i
zawieszano w 250 μl PBS i oznaczano w cytometrze. W przypadku komórek jamy otrzewnej
blokowano receptor dla fragmentu Fc przeciwciał, aby zahamować wiązania niespecyficzne;
przed znakowaniem inkubowano komórki przez 15 min z 0,15 μg przeciwciał antyCD16/CD32 (eBioscience).
Tabela 4. Markery wykrywane przez przeciwciała w oznaczeniach cytometrycznych.
Marker
CD11b
MR
Dectin1
CD14
CD4
CD19
F4/80
MHC II
CD80
CD40
CD86
Gr-1
Identyfikowana populacja komórek/
funkcja
Komórki mieloidalne; monocyty,
eozynofile, neutrofile
CD206, receptor mannozowy
Lektyna, PRR
Ko-receptor dla LPS
Limfocyty Th
Limfocyty B
Makrofagi
Prezentacja antygenu; makrofagi,
komórki dendrytyczne, limfocyty B
Prezentacja antygenu; makrofagi,
komórki dendrytyczne, limfocyty B
Prezentacja antygenu; makrofagi,
komórki dendrytyczne, limfocyty B
Prezentacja antygenu; makrofagi,
komórki dendrytyczne, limfocyty B
Monocyty i neutrofile
Fluorochrom
Producent
PercP lub APC
eBioscience
FITC
PercP
APC
PercP
FITC, PE lub PercP
PE
FITC
BioLegend
eBioscience
eBioscience
BD Pharmigen
eBioscience
eBioscience
eBioscience
PE
eBioscience
PercP
eBioscience
APC
eBioscience
APC
eBioscience
38
5. Materiały i metody
IL-4R
IgM
IgD
CD23
Receptor dla IL-4; AAMf
Limfocyty B
Limfocyty B
Receptor o słabym powinowactwie dla
IgE; monocyty i limfocyty B
PE
APC
FITC
PE
BD Pharmigen
eBioscience
eBioscience
AbSerotec
Analizę wykonywano w cytometrze za pomocą oprogramowania CELLQuest (BD Sciences).
Przy użyciu znakowań pojedynczych dla każdego rodzaju zawiesiny komórek określano
wartości napięć na detektorach oraz procent kompensacji. Dla każdej próby wciągano min.
30 tysięcy komórek, które następnie analizowano w programie FCS Express 4Flow (DeNovo
Software). Komórki identyfikowano na podstawie morfologii na wykresie SSC/FSC (Side
Scatter Chanel/Forward Scatter Chanel) obrazującym odpowiednio ziarnistość/wielkość
komórek (Rys. 6a). Analiza taka umożliwia wstępne rozróżnienie eozynofilów (E),
monocytów/makrofagów (M), limfocytów (L) i neutrofilów (N). Rys. 6b przedstawia
przykładowe wyniki otrzymywane dla komórek płynu otrzewnowego. Następnie, komórki z
bramki G1 (Rys. 6a) analizowano pod względem fluorescencji, na wykresach typu „dot plot”
(Rys. 6d) umożliwiających określenie odsetka komórek pozytywnych lub negatywnych dla
danego fluorochromu, lub histogramach (Rys. 6c) umożliwiających dodatkowo określenie
intensywności fluorescencji (Mean Fluorescence Intensity; MFI). W danym doświadczeniu,
dla jednego rodzaju narządu, dla wszystkich powtórzeń używano takich samych ustawień
bramek.
1024
c
SSC-H
768
29
Count
a
G1
512
22
5.07
15
52.14%
372.06
33.22%
7
0
256
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
F4/80
0
0
256
512
768
1024
FSC-H
39
5. Materiały i metody
b
1024
d
4
10
5.05%
43.99%
32.63%
18.33%
768
F4/80
SSC-H
3
10
E
512
M
N
256
2
10
1
10
L
0
0
256
512
0
768
FSC-H
1024
10
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
CD11b
Rys. 6. Przykładowe wykresy z analizy cytometrycznej komórek płynu otrzewnowego: a)
zasięg bramki G1, b) wstępne rozróżnienie subpopulacji leukocytów na podstawie morfologii,
c) histogram z określonymi odsetkiem (czarna czcionka) oraz średnią intensywnością
fluorescencji (czerwona czcionka) danej populacji i d) wykres typu „dot plot” przedstawiający
odsetki populacji o różnej intensywności fluorescencji dla 2 markerów/fluorochromów.
Poziom apoptozy oznaczano przy użyciu zestawu Annexin V Apoptosis Kit (BD Pharmigen).
Ćwierć miliona komórek zawieszano w 50 μl 1X Binding Buffer, do których dodawano po
1 μl Annexin V-FITC i 7-AAD (7-Aminoactinomycin D). Próby inkubowano przez 15 min w
ciemności w temperaturze pokojowej, a następnie barwienie zatrzymywano dodając 300 μl
1X Binding Buffer. Próby analizowano w cytometrze w przeciągu godziny. Wykonywano
także znakowania pojedyncze.
Proliferację komórek metodą cytometryczną mierzono z użyciem barwnika fluorecencyjnego
CFSE (ester karboksyfluoresceiny), który umożliwia śledzenie podziałów komórkowych.
Dziesięć milionów komórek MLN otrzymanych jak w pkt 5.6 zawieszano w 2 ml pełnej
pożywki RPMI i dodawano barwnika CFSE rozpuszczonego w DMSO do końcowego
stężenia 1 μM. Próby inkubowano przez 20 min w 37°C w ciemności. Następnie barwienie
zatrzymywano dodając 10 ml pełnej pożywki RPMI w temperaturze 4°C i komórki
trzykrotnie płukano, w celu usunięcia niezwiązanego barwnika. Wybarwione komórki
hodowano wg pkt 5.9, a po zakończonej hodowli zebrane komórki analizowano w cytometrze
przepływowym, po uprzednim wyznakowaniu ich mieszaniną przeciwciał anty-CD4 wg pkt
5.8. Rys. 7 przedstawia zasadę działania testu CFSE oraz przykładowy histogram
40
5. Materiały i metody
otrzymywany w analizie cytometrycznej. Populacje komórek po kolejnych podziałach
(kolejne generacje; Gen 1-5) określano na podstawie dwukrotnego spadku intensywności
fluorescencji CSFE w stosunku do poziomu fluorescencji poprzedniej populacji. Zakres
populacji komórek matczynych (Gen 0) określano na podstawie intensywności fluorescencji
CSFE komórek w 0 dniu hodowli (zielone pole na wykresie Rys. 7b). Indeks proliferacji
(Proliferation Index; PI) liczono według wzoru:
k potomne
k matczyne
, (Lk- liczba komórek), gdzie:
Lk matczyne=Lk Gen0+
Lk Gen1
2
+
Lk Gen2
4
+
Lk Gen3
Lk Gen4
8
Lk Gen5
32
, a Lk potomne=Lk analizowane-Lk Gen0.
dzielące się komórki
a
Komórka
matczyna
Komórki potomne
b
100
Count
75
50
25
54 3 21
0
10
0
10
1
10
0
2
Gen
10
3
10
Liczba
komórek
CFSE
Intensywność
fluorescencji
Intensywność fluorescencji
Liczba podziałów
Rys. 7 Zasada działania testu proliferacji z użyciem barwnika CFSE: a) schemat rozdziału
barwnika między komórki potomne i związany z nim spadek intensywności fluorescencji oraz
b) przykładowy histogram przedstawiający analizę cytometryczną komórek po 4 dniach
hodowli z oznaczonym podziałem na generacje komórek (na zielono oznaczono komórki z 0
dnia hodowli).
41
4
5. Materiały i metody
5.9 Hodowle komórkowe
Komórki linii JAWS II pasażowano co 7 dni; zakładano hodowle 100 tysięcy komórek w
butelkach T25 w 5 ml pożywki RPMI JAWS II. Komórki odklejano od powierzchni
hodowlanej za pomocą skrobaka; wirowano je, zawieszano w świeżej pożywce i przenoszono
do nowej butelki. Do doświadczeń, komórki hodowano na płytkach 24- lub 96- dołkowych;
nakładano odpowiednio 100 tysięcy komórek w 0,5 ml lub 10 tysięcy komórek w 80 μl na
dołek i hodowano 24 h w pożywce RPMI JAWS II. Następnie dodawano odpowiednio 0,5 ml
lub 20 μl czynnika stymulującego: LPS (końcowe stężenie 0,5 μg/ml) lub chitozanu i
hodowano komórki przez kolejne 48 h. Po zakończonej hodowli zbierano i zamrażano płyn
hodowlany (w celu oznaczenia poziomu cytokin), a komórki zeskrobywano, zawieszano w
PBS/BSA i wykorzystywano do oznaczeń cytometrycznych. Hodowle prowadzone na
płytkach 96-dołkowych wykorzystywano w teście MTS (pkt 5.10).
Makrofagi otrzymywano z komórek szpiku kostnego myszy C57Bl6 (Bone Marrow Derived
Macrophages; BMDMf). Od myszy kontrolnej (niezarażonej) izolowano kość udową,
przepłukiwano jej kanał PBS za pomocą igły i strzykawki, a otrzymaną zawiesinę wirowano
200 g przez 7 min w 4°C. Komórki płukano 3-krotnie sterylną pełną pożywką RPMI w
temperaturze 4°C, a następnie zakładano hodowle; na szalki Petriego o średnicy 60 mm
nakładano 5 ml zawiesiny komórek o gęstości 5x104/ml i dodawano czynnik wzrostu M-CSF
do końcowego stężenia 10 ng/ml. Hodowlę prowadzono przez 6-7 dni bez zmiany pożywki;
po tym czasie 95% komórek adherujących stanowią makrofagi (identyfikowane na
cytometrze jako F4/80+). Tak otrzymane makrofagi zeskrobywano z powierzchni szalki i
nakładano na płytki do hodowli w pożywce RPMI pełnej (bez dodatku M-CSF); 200
tysięcy/500 μl na płytkę 24-dołkową lub 20 tysięcy/80 μl na płytkę 96-dołkową. Po 24 h
hodowli do dołków dodawano 0,5 ml lub 20 μl czynnika stymulującego: LPS (końcowe
stężenie 0,5 μg/ml) lub chitozanu i hodowano komórki przez kolejne 48 h. Po zakończonej
hodowli zbierano i zamrażano płyn hodowlany (w celu oznaczenia poziomu cytokin), a
komórki zeskrobywano, zawieszano w PBS/BSA i wykorzystywano do oznaczeń
cytometrycznych. Hodowle prowadzone na płytkach 96-dołkowych wykorzystywano w teście
MTS (pkt 5.10).
Komórki płynu otrzewnowego otrzymane wg pkt 5.6 doprowadzano w pożywce RPMI do
gęstości 2,5x106 komórek/ml i nakładano 200 μl zawiesiny na dołki płytki 96-dołkowej.
42
5. Materiały i metody
Komórki inkubowano przez 2 h w 37°C; po tym czasie odpłukiwano pożywką RPMI w
temperaturze w 37°C komórki nieprzylegające, a do przylegających makrofagów dodawano
200 μl pożywki RPMI zawierającej czynniki stymulujące: bakteryjny LPS, o końcowym
stężeniu 0,5 μg/ml, HMW chitozan, 5 μg/ml lub antygen nicieni, 5 μg/ml. Hodowle
prowadzono przez 48 h, a następnie płytki wirowano; zbierano płyn hodowlany, a w
komórkach mierzono aktywność arginazy (pkt 5.10).
Dołki
96-dołkowej
płytki
hodowlanej
opłaszczano
czynnikami
stymulującymi:
przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28 (0,5 μg/ml), chitozanem HMW (5 μg/ml) lub
antygenem nicieni (5 μg/ml) w 50 μl sterylnego PBS, przez noc w 4°C. Komórki MLN
otrzymane wg pkt 5.6 wybarwione CFSE wg pkt 5.8 zawieszano w pełnej pożywce RPMI i
nakładano na dołki płytki hodowlanej w objętości 200 μl, 0,5 x106 komórek na dołek.
Hodowle prowadzono przez 96 h w 37°C, 5% CO2. Po zakończonej hodowli płytki wirowano
i komórki zawieszano w buforze PBS/BSA i wykorzystywano do oznaczeń cytometrycznych.
5.10 Testy kolorymetryczne
Poziom katabolizmu L-argininy określano mierząc aktywność enzymów, dla których
aminokwas ten jest substratem: syntazy tlenku azotu (iNOS; EC 1.14.13.39) oraz arginazy 1
(EC 3.5.3.1). Mierzono poziom specyficznych produktów reakcji enzymatycznych,
odpowiednio tlenku azotu (NO) i mocznika.
Tlenek azotu mierzono metodą kolorymetryczną w reakcji Griessa oznaczającej stężenie
jonów azotanowych (NO2-), które są stabilną pochodną NO. W kwaśnym środowisku NO2reagują z kwasem sulfanilowym, tworząc kwas diazobenzenosulfonowy, który następnie
sprzęgany z α-naftyloaminą daje purpurowy barwnik azowy absorbujący światło o
λ= 540 nm. Reakcja ta jest specyficzna dla jonów azotanowych. Czterdzieści μl badanej
próby, płynu hodowlanego, mieszano z odczynnikiem Griessa w proporcji 1:1 w dołku płytki
96-dołkowej i inkubowano w temperaturze pokojowej, w ciemności przez 10 min. Następnie
mierzono gęstość optyczną produktu reakcji w czytniku spektrofotometrycznym (μQuant,
BIO-TEK Instruments INC) przy λ= 540 nm. Ilość NO2-, a pośrednio NO, świadczy o
aktywności iNOS w komórkach.
43
5. Materiały i metody
Poziom mocznika mierzono metodą kolorymetryczną w komórkach z hodowli in vitro; osad
komórek lizowano za pomocą 0,1% Triton X w PBS przez 30 min w 4°C. Następnie do lizatu
dodawano MnCl2 w końcowym stężeniu 7,5 mM i aktywowano enzym przez 15 min w 56°C.
Następnie przeprowadzano reakcję enzymatyczną przez 1 h w 37°C po dodaniu substratuL-argininy o stężeniu 250 mM. Reakcję zatrzymywano dodając mieszaniny kwasów: H2SO4,
H3PO4 i H2O (1:3:1), a ilość produktu reakcji, mocznika, oznaczano inkubując próby w 96°C
przez 1 h w obecności α-izonitrozopropiofenonu rozpuszczonego w 99% etanolu w
końcowym stężeniu 1%. Po wystudzeniu, 100 μl mieszaniny przenoszono na 96-dołkową
płytkę titracyjną i mierzono gęstość optyczną barwnego produktu reakcji w czytniku
spektrofotometrycznym (μQuant, BIO-TEK Instruments INC) przy λ= 550 nm. Ilość
mocznika świadczy o poziomie aktywności arginazy-1 obecnej w lizacie komórek.
Proliferację komórek określano testem MTS (redukcja soli tetrazolowej do formazanu), który
mierzy ilość żywych komórek w hodowli. Komórki hodowano na płytkach 96-dołkowych jak
w pkt 5.9 w całkowitej objętości 100 μl (10 lub 20 tys. komórek/dołek) przez 48 h. Cztery
godziny przed końcem hodowli dodawano 20 μl odczynnika CellTiter (Promega)
zawierającego rozpuszczalną sól MTS, która w żywych komórkach jest przekształcana przez
oksydoreduktazy do brązowego produktu. Po zakończeniu hodowli mierzono gęstość
optyczną mieszaniny w czytniku spektrofotometrycznym (μQuant, BIO-TEK Instruments
INC) przy λ=490 nm.
Poziom cytokin mierzono w teście immunoenzymatycznym ELISA (Enzyme-Linked
ImmunoSorbent Assay) przy wykorzystaniu komercyjnych testów wykrywających mysie
IL-1β, IL-4, IL-10, IL-12p70, MCP-1, TGF-β (eBioscience) i IL-5, IL-6 (BD Sciences) oraz
MPO (MyeloPeroxidase; R&D) zgodnie z procedurą zalecaną przez producentów. Płytki
96-dołkowe Maxisorp opłaszczano przeciwciałami Capture w 50 μl Coating Buffer w czasie
całonocnej inkubacji w 4°C. Następnie odpłukiwano niezwiązane przeciwciała 250 μl PBS
Tween i blokowano dołki 150 μl 1X Assay Diluent (bufor zawierający 10% FCS) przez
godzinę w temperaturze pokojowej. Po odpłukaniu płytki, nakładano badane próby: surowicę
(rozcieńczoną 5X w Assay Diluent), płyn otrzewnowy lub płyn hodowlany w objętości 50 μl.
W przypadku pomiaru TGF-β, do prób dodawano najpierw 10 μl 0,5 M HCl w celu
otrzymania aktywnej formy cytokiny, a po 10 min inkubacji reakcję zatrzymywano 10 μl
0,5 M NaOH. Badane próby inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Po
44
5. Materiały i metody
3-krotnym płukaniu dołków nakładano 50 μl biotynowanych przeciwciał Detection i
inkubowano przez 1 h. Po 3-krotnym płukaniu płytki, nakładano na 30 min 50 μl kompleksu
streptawidyna-HRP (HorseRadish Peroxidase; peroksydaza chrzanowa). Następnie dołki
płukano 5-krotnie PBS Tween i nakładano 100 μl substratu dla peroksydazy, TMB i
inkubowano przez 20 min. Po zatrzymaniu reakcji 50 μl 2 N H2SO4, dokonywano pomiaru
gęstości optycznej w czytniku spektrofotometrycznym (μQuant, BIO-TEK Instruments INC)
przy λ=450 nm. Stężenie obliczano na podstawie krzywej wzorcowej wykonanej dla
standardów każdej z cytokin.
Poziom i specyficzność przeciwciał mierzono metodą ELISA; płytki 96-dołkowe Polysorp
opłaszczano różnymi roztworami antygenów nicieni lub chitozanem w stężeniu 5 μg/ml w
50 μl Coating Buffer (z zestawów ELISA eBioscience) w czasie całonocnej inkubacji w 4°C.
Następnie odpłukiwano niezwiązane białka 250 μl PBS Tween i blokowano dołki 150 μl 5%
odtłuszczonego mleka przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po płukaniu płytki,
nakładano badane próby: surowicę (rozcieńczoną 5X lub 200X w 1% odtłuszczonym mleku)
lub płyn otrzewnowy w objętości 50 μl. Badane próby inkubowano w temperaturze
pokojowej przez 2 godziny. Po 3-krotnym płukaniu, do dołków nakładano na 1 h 50 μl
przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z HRP rozpoznających mysie IgA, IgE lub IgG1
(1: 5 000; Novus Biologicals lub Sigma). Następnie dołki płukano 5-krotnie i nakładano
100 μl substratu dla peroksydazy, TMB, i inkubowano przez 20 min. Po zatrzymaniu reakcji
50
μl
2
N
H2SO4,
dokonywano
pomiaru
gęstości
optycznej
w
czytniku
spektrofotometrycznym (μQuant, BIO-TEK Instruments INC) przy λ=450 nm. Kontrole
stanowiły dołki nieopłaszczone żadnym antygenem, ale blokowane 5% odtłuszczonym
mlekiem, dzięki którym odejmowano tło (wiązanie niespecyficzne) dla każdej próby.
5.11 Analiza białek metodą Western blot
Dokonywano rozdziału białek nicieni metodą SDS-PAGE. Zastosowano poliakrylamidowe
żele nieciągłe (5% zagęszczający, 12% rozdzielający) z 10 studzienkami i nakładano
10 μg/dołek mieszaniny białek nicieni w buforze Laemmli lub 5 μl wzorca masy
cząsteczkowej Prestained Protein Ladder (Thermo). Żele w pojemniku zalewano buforem do
elektroforezy i prowadzono rozdział przez 45-50 min przy stałym napięciu 200 V. Następnie
białka przenoszono na membranę nitrocelulozową w aparacie do transferu półsuchego
(BioRad) w buforze do transferu, przez 1,5 h przy 15 V.
45
5. Materiały i metody
W celu wykrycia białek immunogennych, membranę blokowano w 5% odtłuszczonym mleku
w PBS przez 2 h w temperaturze pokojowej, a następnie nakładano nierozcieńczony płyn
otrzewnowy myszy i inkubowano w 4°C przez noc. Następnie membrany płukano w
PBS Tween i nakładano przeciwciało anty-IgA sprzężone z HRP (Novus Biologicals)
zawieszone w 1% odtłuszczonym mleku. Po 2 h inkubacji membrany płukano, a następnie
wywoływano
białka
rozpoznane
przez
mysie
IgA
dodając
roztwór
DAB/H2O2
(3,3-diaminobenzydyna, Sigma), substrat dla HRP, do momentu pojawienia się brązowych
prążków. Nadmiar substratu odpłukiwano wodą, membrany suszono i wykonywano zdjęcia w
aparacie GelDoc (BioRad). Przeprowadzano analizę w programie QuantityOne (BioRad)
określając masę cząsteczkową wykrytych prążków w odniesieniu do wzorca masy.
W celu wykrycia w białkach reszt cukrowych membranę blokowano 1% BSA w TBS przez
2 h w temperaturze pokojowej, a następnie membranę zalewano biotynowaną lektyną WGA
(Wheat Germ Agglutinin; 1:1000, rozpoznająca N-acetyloglukozaminę, Biotinylated Lectin
Kit I, Vector) w 0,1% BSA w TBS i inkubowano w 4°C przez noc. Następnie membrany
płukano intensywnie w TBS Tween i nakładano kompleks streptawidyna-AP (Alkaline
Phosphatase; alkaliczna fosfataza, 1:10 000) zawieszony w 0,1% BSA w TBS. Po 2 h
inkubacji membrany płukano, a następnie wizualizowano białka dodając wodny roztwór
BCIP (5-bromo, 4-chloro, 3-indolylofosforan, Sigma), substrat dla AP, aż były widoczne
fioletowe prążki. Nadmiar substratu odpłukiwano wodą, membrany suszono i wykonywano
zdjęcia w aparacie GelDoc (BioRad). Wykonywano analizę w programie QuantityOne
(BioRad) określając masę cząsteczkową wykrytych prążków w odniesieniu do wzorca masy.
5.12 Badania histochemiczne
Narządy izolowano, natychmiast zatapiano w preparacie Neg-50 (Richard-Allan Scientific) i
mrożono w ciekłym azocie. Próby przechowywano w -80°C, a następnie cięto w
kriomikrotomie w temperaturze -20°C na skrawki o grubości 10 μm, które utrwalano w 90%
metanolu przez 5 min. Następnie wykonywano standardowe barwienia hematoksyliną Cole`a
i kwaśną eozyną Y. Preparaty obserwowano w mikroskopie świetlnym. Wykonywano także
barwienia immunofluorescencyjne: utrwalone preparaty inkubowano w Assay Diluent (z
zestawu ELISA eBioscience) przez 1 h w 4°C, aby uniemożliwić wiązania niespecyficzne.
Następnie nakładano przeciwciała w buforze Assay Diluent: anty-CD68-Alexa488 (Genetex i
Biotium) i biotynowane anty-CD11b (eBioscience). Po 2 h inkubacji w 4°C preparaty
46
5. Materiały i metody
płukano wielokrotnie w PBS Tween i nakładano kompleks streptawidyna-eFluor570
(eBioscience) na 30 min, 4°C. Po dokładnym odpłukaniu, na szkiełka nakładano DAPI
mounting medium (Vector), zakrywano preparat szkiełkiem nakrywkowym i obserwowano w
mikroskopie fluorescencyjnym (Nikon) przy użyciu kamery i oprogramowania Lucia.
5.13 Analiza statystyczna
Grupy zwierząt doświadczalnych liczyły 3-5 osobników, a wyniki analizowano indywidualnie
dla każdej myszy. Doświadczenia in vitro przeprowadzano w 3 powtórzeniach technicznych.
Każde z prezentowanych doświadczeń przeprowadzano minimum dwukrotnie, ale
przedstawiono wyniki dla jednego z nich. Wyniki prezentowane są jako średnie ± odchylenie
standardowe (Standard Deviation; SD). Analizę statystyczną wykonywano w programie
Microsoft Excel przy użyciu Analysis ToolPack. Wykonywano test ANOVA dla określenia
wpływu czasu i grupy na badane parametry. Istotność statystyczną jednej pary zmiennych
pomiędzy grupami stwierdzano w teście parametrycznym T-Studenta. Różnice wyników przy
p<0,05 uznawano za istotne statystycznie i oznaczano je * na wykresach.
47
6. Wyniki
6.1 Właściwości immunostymulacyjne chitozanu in vitro
6.1.1
Wprowadzenie
Podczas odpowiedzi immunologicznej zachodzi rozpoznanie patogenu atakującego żywiciela,
co następnie decyduje o mechanizmach, jakie są uruchamiane. Komórkami, które w
najwyższym stopniu wpływają na przebieg odpowiedzi, są komórki prezentujące antygen, do
których zalicza się między innymi komórki dendrytyczne oraz makrofagi (Xu, 2013). Jako
komórki niedojrzałe, ale o silnych właściwościach fagocytujących, stale przebywają w kwi i
tkankach, a po kontakcie z antygenem/patogenem dojrzewają i migrują do narządów
limfatycznych (Geissmann et al., 2010), gdzie dostarczają 3 sygnały niezbędne do aktywacji
limfocytów T i B. Są to: antygen w kontekście MHC II, sygnał ko-stymulacyjny oraz
cytokiny. Dzięki temu zarówno makrofagi jak i komórki dendrytyczne łączą odpowiedź
wrodzoną i nabytą. Receptory PRR umożliwiają tym komórkom rozpoznawanie patogenów,
w wyniku czego ulegają one aktywacji i dojrzewając zapoczątkowują reakcje odpornościowe
(Stuart et al., 2013). Komórki dendrytyczne produkują cytokiny, takie jak IL-1, IL-6, IL-7,
IL-12, IL-15 i IL-18, a makrofagi dodatkowo pełnią funkcje efektorowe i regulatorowe
wydzielając m. in. tlenek azotu (Nitric Oxide; NO) i reaktywne formy tlenu (Reactive Oxygen
Species; ROS). Komórki te różnią się skutecznością prezentacji antygenów naiwnym
limfocytom T; makrofagi wykazują w tym mniejszą wydajność, ale silniej wpływają na
funkcje aktywowanych limfocytów T i B (Hashimoto et al., 2011). Pomimo tych różnic, obie
populacje komórek w znacznym stopniu biorą udział w inicjacji i regulacji odpowiedzi
immunologicznej. Rodzaj aktywacji komórek APC, o którym świadczą poziom ekspresji i
rodzaj markerów powierzchniowych oraz wydzielane cytokiny, decyduje o tym, jak będą
aktywowane następne populacje komórek. Dokładny mechanizm polaryzacji odpowiedzi
immunologicznej nie jest dobrze poznany, wiadomo jednak, że to komórki odpowiedzi
wrodzonej warunkują rozwinięcie się odpowiedzi Th1, Th2, Th17 lub Treg (Phythian-Adams
et al., 2010). Wzbudzenie odpowiedzi limfocytów typu Th2 następuje z udziałem komórek
APC o niższej ekspresji MHC II oraz cząsteczek ko-stymulacyjnych oraz słabszym
wydzielaniu IL-12 niż w przypadku aktywacji prowadzącej do odpowiedzi typu 1
(MacDonald & Maizels, 2008). Próbuje się ustalić jakie cząsteczki pochodzenia
pasożytniczego przyczyniają się do nabywania takiego fenotypu przez komórki APC;
sugeruje się, że będą to związki typu PAMP. Są to najbardziej charakterystyczne struktury
patogenów, konserwowane ewolucyjnie, które są rozpoznawane przez komórki odpowiedzi
48
6.1 Wyniki; właściwości chitozanu in vitro
wrodzonej. Większość PAMP stanowią cząsteczki strukturalne, które nie ulegają znaczącym
zmianom i są podobne u różnych gatunków danej grupy patogenów. Rozpoznawanie tych
wzorców przez komórki odpowiedzi wrodzonej decyduje o szybkości reakcji przy
zachowaniu specyficzności; możliwe jest rozpoznanie elementów obcych bez naruszania
zdrowych tkanek (Venugopal et al., 2009). Wiadomo, że mieszaniny antygenów różnych
pasożytów, poprzez komórki prezentujące antygen, indukują mechanizmy odpowiedzi Th2,
ale tylko nieliczne poszczególne PAMP charakterystyczne dla helmintów są poznane. Zalicza
się do nich m. in.: lizofosfatydyloserynę (van der Kleij et al., 2002), lakto-N-fukopentozę
(Thomas et al., 2003), ES-62 (fosforylocholina, Goodridge et al., 2005) czy Lewis x (van Die
et al., 2003). Są to związki o bardzo różnej budowie chemicznej; lipidy i cukry, które jak
wykazano są ligandami dla takich PRR jak TLR2, TLR4 czy DC-SIGN.
Cukry oraz związki modyfikowane resztami cukrowymi, licznie występujące w antygenach
somatycznych i wydzielniczych helmintów, są niewątpliwie ciekawym obiektem badań nad
polaryzacją odpowiedzi komórek APC; wiele receptorów PRR rozpoznaje glikany. Także
chitozan, jako pochodna chityny i polisacharyd, spełnia kryteria PAMP charakterystycznego
dla patogenów wzbudzających odpowiedź Th2-zależną. Wykazano, że N-acetyloglukozamina i glukozamina, monomery chitozanu, mogą być rozpoznawane przez receptor
mannozowy (MR, CD206, East & Isacke, 2002), CD14 (ko-receptor TLR4, Muzzarelli, 1997)
lub CR3 (receptor dla komplementu, Thornton et al., 1996). Są one także związkami
budującymi ściany komórkowe chorobotwórczych grzybów, które podobnie jak helminty,
wywołują odpowiedź typu Th2 (Lenardon et al., 2010).
Można zatem założyć, że chitozan rozpoznany przez komórki APC będzie induktorem
mechanizmów związanych z odpowiedzią Th2. Zbadano czy chitozan aktywuje in vitro
komórki odpowiedzi wrodzonej: makrofagi oraz komórki dendrytyczne. Aktywność komórek
dendrytycznych badano na linii komórkowej JAWS II pochodzącej z myszy C57Bl6.
Natomiast w celu określenia zmian funkcji makrofagów, indukowano dojrzewanie tych
komórek in vitro ze szpiku myszy C57Bl6 za pomocą czynnika M-CSF, otrzymując Bone
Marrow Derived Macrophages- BMDMf (Wang et al., 2013). Do badań in vitro
wykorzystano 3 rodzaje chitozanu: oligosacharydy (2-6 reszt cukrowych; COS), polimer o
małej (Mw= 50-190 kDa; LMW) oraz dużej (Mw= 190-375 kDa; HMW) masie
cząsteczkowej, aby ocenić jak i który rodzaj chitozanu wpływa na aktywację komórek
prezentujących antygen.
49
6.1 Wyniki; właściwości chitozanu in vitro
6.1.2
Wyniki
6.1.2.1 Cytotoksyczność
Test redukcji soli formazanu, MTS, jest standardową metodą określania biokompatybilności
różnych produktów używanych w medycynie (Sharifi et al., 2012). Pozwala stwierdzić czy
badana substancja wpływa na przeżywalność komórek w hodowli in vitro, a zatem czy jest
dla nich toksyczna. Komórki żywe są zdolne do enzymatycznej redukcji soli MTS, co
powoduje zmianę koloru odczynnika. Zmiana wartości OD (Optical Density, gęstość
optyczna) barwnika świadczy zatem o zmianie liczby żywych komórek w hodowli pod
wpływem badanego czynnika. Wzrost lub brak zmiany wartości OD względem komórek
kontrolnych świadczy o braku cytotoksyczności danego związku, a obniżenie OD wiąże się ze
spadkiem żywotności komórek. Użyto komórek dendrytycznych i makrofagów, aby wstępnie
ocenić wpływ chitozanu na przeżywalność komórek, a także wyznaczyć stężenie polimeru,
które będzie używane w dalszych doświadczeniach.
Chitozan nie wykazywał toksycznego wpływu na niedojrzałe komórki dendrytyczne linii
JAWS II (Wykres 1.1a). Niezależnie od masy polimeru i jego stężenia nie obserwowano
obniżonej żywotności komórek w hodowli. Chitozan HMW, przy małych stężeniach (0,1252,5 μg/ml), wykazywał nawet nieznaczny pozytywny wpływ na te komórki; OD hodowli
wzrosło, co wskazywało na proliferację komórek, jednak różnice te nie były istotne
statystycznie. Także kwas adypinowy, rozpuszczalnik chitozanu, nie miał wpływu na stan
hodowli.
Makrofagi otrzymane z komórek szpiku (BMDMf) były bardziej wrażliwe na działanie
chitozanu; wpływ polimeru zależny był od jego masy cząsteczkowej oraz użytego stężenia
(Wykres 1.1b). Chitozan HMW i LMW przy dużych stężeniach (>10 μg/ml) okazał się
toksyczny dla tych komórek. Natomiast COS nie był toksyczny dla makrofagów; przy
stężeniach >10 μg/ml nawet stymulował proliferację komórek. Rozpuszczalnik chitozanu,
kwas adypinowy, nie miał wpływu na żywotność komórek w hodowli.
50
6.1 Wyniki; właściwości chitozanu in vitro
GM-CSF
a
HMW
LMW
COS
AdOH
1,2
1
OD
0,8
0,6
0,4
0,2
0
GM-CSF
0
M-CSF
b
0,125
1,25
HMW
2,5
5
LMW
10
20
COS
40 stężenie
μg/ml
AdOH
1,2
1
OD
0,8
*
*
0,6
0,4
*
0,2
*
*
0
M-CSF
0
0,125
1,25
2,5
5
10
20
*
*
*
stężenie
40 μg/ml
Wykres 1.1 Wpływ stężenia i masy cząsteczkowej chitozanu na żywotność a) komórek linii
JAWS II lub b) makrofagów BMDMf. * oznaczono p<0,05 względem stężenia „0”, n=3.
Ponieważ stężenie chitozanu 5 μg/ml jest pierwszym w szeregu rozcieńczeń, które nie
wywoływało zmian w komórkach, wybrano je do kolejnych doświadczeń in vitro dla obu
populacji komórek i wszystkich rodzajów chitozanu.
6.1.2.2 Apoptoza
Poziom apoptozy w hodowli oznaczano w cytometrze przepływowym po wyznakowaniu
komórek aneksyną oraz 7-AAD (Wlodkowic et al., 2012). Metoda ta pozwala odróżnić
wczesną i późną fazę apoptozy od nekrozy komórek. Komórki wyznakowane aneksyną
51
6.1 Wyniki; właściwości chitozanu in vitro
(Annexin V), połączoną z fosfatydyloseryną przemieszczoną na stronę zewnętrzną błony
komórkowej, znajdują się we wczesnej fazie apopozy, natomiast komórki wiążące aneksynę
oraz 7-AAD (7-Aminoactinomycin D), barwnik łączący się z DNA- w późnej apoptozie.
Komórki pojedynczo pozytywne dla 7-AAD uznawano za nekrotyczne, a negatywne dla obu
odczynników za żywe.
Pomimo nie stwierdzonego toksycznego wpływu chitozanu na komórki JAWS II w teście
MTS, analiza cytometryczna wykazała, że polimer HMW i LMW w stężeniu 5 μg/ml
zmniejszył odsetek komórek żywych w hodowli o 20% (Wykres 1.2a). Wzrósł jednocześnie
odsetek komórek nekrotycznych oraz we wczesnej fazie apoptozy. Natomiast COS, podobnie
jak to obserwowano w teście MTS, nie wpływał na żywotność komórek. Rozpuszczalnik
chitozanu, kwas adypinowy, nie miał wpływu na żywotność komórek w hodowli.
Żywotność makrofagów ze szpiku kostnego także była mniejsza, szczególnie po hodowli z
chitozanem LMW (Wykres 1.2b). Obniżony o 50% odsetek komórek żywych w tej hodowli
związany był ze wzrostem liczby komórek nekrotycznych oraz w późnej fazie apoptozy.
Jednak apoptozę nieznacznie wzbudzał także LPS, zastosowany jako kontrola pozytywna.
COS oraz chitozan HMW nie wpływały znacząco na żywotność komórek, nieznacznie
zwiększały jedynie odsetek komórek nekrotycznych. Rozpuszczalnik chitozanu, kwas
adypinowy, nie miał wpływu na żywotność komórek w hodowli.
a
RPMI
%
120
HMW
LMW
COS
LPS
AdOH
100
80
* *
60
40
* *
20
* *
0
Żywe
Wczesna apoptoza Późna apoptoza
Nekroza
52
6.1 Wyniki; właściwości chitozanu in vitro
b
%
100
RPMI
HMW
LMW
COS
LPS
AdOH
80
60
*
*
40
*
20
*
*
* *
0
Żywe
Wczesna
apoptoza
Późna apoptoza
Nekroza
Wykres 1.2 Wpływ chitozanu o różnej masie cząsteczkowej na odsetek a) komórek linii
JAWS II lub b) makrofagów BMDMf w różnej fazie apoptozy po 48 h hodowli. * oznaczono
p<0,05 względem komórek niestymulowanych (RPMI), n=3.
Chitozan HMW i LMW w stężeniu 5 μg/ml wykazywał nieznaczne właściwości
cytotoksyczne wobec komórek linii JAWS II. Natomiast dla makrofagów ze szpiku tylko
polimer LMW był toksyczny.
6.1.2.3 Fenotyp komórek
Poziom aktywacji komórek w hodowli określano na podstawie zmian w ekspresji markerów
komórkowych. Metodą cytometrii przepływowej określono odsetek komórek pozytywnych
dla receptorów związanych z prezentacją antygenu (MHC II, CD80, CD40 i CD86), których
ekspresja zwiększa się u dojrzewających i aktywowanych komórek dendrytycznych i
makrofagów. Wzrost odsetka komórek pozytywnych uznawano za wzrost ekspresji danego
markera powierzchniowego w populacji.
Dodanie do hodowli każdego rodzaju chitozanu skutkowało wzrostem odsetka komórek
JAWS II z ekspresją MHC II na powierzchni (Wykres 1.3a). Taki sam wpływ wykazywał
LPS, który zastosowano jako kontrolę pozytywną. Chitozan HMW oraz LPS wykazywały
podobną siłę oddziaływania, zwiększając o połowę odsetek komórek MHC II+. Natomiast
chitozan LMW oraz COS działały silniej; zwiększyły dwukrotnie odsetek komórek
53
6.1 Wyniki; właściwości chitozanu in vitro
pozytywnych dla MHC II. Wzrosła także ekspresja CD86, jednak jego poziom nie zależał od
masy chitozanu- wszystkie badane czynniki wzbudziły ekspresję CD86 na podobnym
poziomie. Natomiast pozostałe cząsteczki ko-stymulacyjne (CD80 i CD40) wykazywały
zróżnicowaną reakcję na chitozan HMW, LMW i COS. Chitozan HMW spowodował
nieznaczny wzrost ekspresji CD80, podobnie jak LPS, natomiast chitozan LMW oraz COS
obniżyły odsetek komórek CD80+. W przypadku markera CD40 obserwowane zmiany były
inne; chitozan HMW obniżył odsetek komórek pozytywnych dla CD40, a chitozan LMW i
COS go zwiększył. Rozpuszczalnik chitozanu, kwas adypinowy, nie miał wpływu na
ekspresję markerów komórkowych.
Ekspresja MHC II na makrofagach ze szpiku uległa zwiększeniu tylko pod wpływem
chitozanu HMW i LMW; COS nie aktywował komórek (Wykres 1.3b). Odsetek komórek
MHC II pozytywnych był podobny po LPS jak po chitozanie HMW i LMW. Jednak poziom
ekspresji cząsteczek ko-stymulujących nie zwiększył się pod wpływem chitozanu, choć
komórki reagowały na LPS. Ekspresja CD80 i CD40 nie uległa zmianie, a odsetek komórek
pozytywnych dla CD86 został dodatkowo obniżony przez wszystkie rodzaje chitozanu. Choć
LPS zwiększał ekspresję wszystkich badanych markerów, chitozan LMW i HMW zwiększył
tylko poziom MHC II. Rozpuszczalnik chitozanu, kwas adypinowy, nie miał wpływu
ekspresję markerów komórkowych.
a
%
120
RPMI
HMW
LMW
*
100
COS
LPS
AdOH
* * * *
*
* *
* *
80
60
40
*
* *
*
20
*
0
MHC II
CD80
CD40
CD86
54
6.1 Wyniki; właściwości chitozanu in vitro
b
RPMI
%
120
HMW
LMW
COS
*
LPS
AdOH
*
100
80
*
60
* *
40
* * *
*
20
0
MHC II
CD80
CD40
CD86
Wykres 1.3 Wpływ chitozanu o różnej masie cząsteczkowej na odsetek a) komórek linii
JAWS II lub b) makrofagów BMDMf pozytywnych dla markerów powierzchniowych
związanych
z
prezentacją
antygenu.
*
oznaczono
p<0,05
względem
komórek
niestymulowanych, n=3.
6.1.2.4 Produkcja cytokin
W płynach hodowlanych zmierzono metodą ELISA poziom cytokin prozapalnych i
regulatorowych oraz chemokiny MCP-1, które mogą świadczyć o zróżnicowanym
pobudzeniu komórek.
Komórki dendrytyczne JAWS II w odpowiedzi na LPS zwiększają produkcję MCP-1, IL-1β,
IL-6 oraz IL-12 (Wykres 1.4a). Chitozan także nieznacznie aktywował komórki, a efekt ten
zależał od masy polimeru. COS obniżył tylko produkcję IL-10, a rozpuszczalnik polimeru,
kwas adypinowy nie wpłynął na poziom cytokin. Pozostałe rodzaje chitozanu, LMW i HMW,
istotnie zwiększyły produkcję chemokiny MCP-1. Natomiast ich wpływ na cytokiny był
odmienny; LMW silnie zwiększył wydzielanie IL-12 jednocześnie obniżając nieznacznie
poziom IL-6. Natomiast chitozan HMW nieistotnie zwiększał produkcję IL-6 i IL-10, ale nie
wpływał na wydzielanie IL-12.
Makrofagi, w odpowiedzi na LPS, ulegają aktywacji i zwiększa się sekrecja wszystkich
badanych cytokin; zarówno prozapalnych jak i regulatorowych (Wykres 1.4b). Na poziomie
55
6.1 Wyniki; właściwości chitozanu in vitro
cytokin reakcja tych komórek na chitozan była zróżnicowana, a największy wpływ
wykazywał chitozan HMW. Chitozan HMW zwiększył wydzielanie prozapalnych IL-1β i
regulatorowej IL-10 oraz nieznacznie IL-6, ale równocześnie obniżył o połowę poziom
chemokiny MCP-1. Chitozan LMW zwiększył tylko poziom IL-12. COS spowodował
natomiast obniżenie wydzielania chemokiny MCP-1 i IL-10. Rozpuszczalnik chitozanu, kwas
adypinowy, miał niewielki wpływ na produkcję cytokin; tylko MCP-1 uległa obniżeniu.
RPMI
a
HMW
LMW
COS
LPS
AdOH
6000
*
5000
*
4000
pg/ml
**
*
3000
*
2000
**
1000
*
0
MCP-1
b
RPMI
IL-1β
HMW
IL-6
LMW
COS
IL-10
LPS
IL-12
AdOH
180
*
150
*
pg/ml
120
*
90
60
*
*
*
30
*
*
*
*
*
*
0
MCP-1
IL-1β
IL-6
IL-10
IL-12
Wykres 1.4 Wpływ chitozanu o różnej masie cząsteczkowej na produkcję cytokin przez
a) komórki linii JAWS II lub b) makrofagi BMDMf. * oznaczono p<0,05 względem komórek
niestymulowanych, n=3.
56
6.1 Wyniki; właściwości chitozanu in vitro
Podsumowując, zarówno komórki JAWS II jak i makrofagi w odpowiedzi na chitozan
zmieniały poziom ekspresji receptorów powierzchniowych oraz produkcji cytokin, a efekt ten
zależał od masy chitozanu. Polimer LMW silniej zwiększał ekspresję MHC II oraz wzbudzał
produkcję IL-12. Natomiast HMW słabiej aktywował MHC II oraz nie wpływał na
wydzielanie IL-12, natomiast nieznacznie wzbudzał produkcję IL-10 i IL-6. COS nie
aktywował istotnie komórek.
6.1.3
Dyskusja
Makrofagi i komórki dendrytyczne, jako komórki prezentujące antygen, odgrywają ważną
rolę w aktywacji, a następnie różnicowaniu limfocytów T pomocniczych w komórki typu
Th1, Th2, Th17 lub Treg. W celu określenia roli chitozanu w polaryzacji odpowiedzi poprzez
aktywację komórek APC, makrofagi i komórki dendrytyczne hodowano in vitro w obecności
chitozanu o różnej masie cząsteczkowej, a następnie określano ich aktywność.
Chitozan testowany w różnych zastosowaniach wykazywał niską toksyczność (Molinaro et
al., 2002, Vandevord et al., 2002, Lim et al., 2007). Podobnie było w prezentowanym
doświadczeniu; używając standardowego testu określającego cytotoksyczność (redukcja soli
MTS), wszystkie rodzaje chitozanu, w stężeniu do 5 μg/ml, były mało toksyczne dla
badanych komórek. Jednak dokładniejsza analiza wykazała wpływ polimeru na aktywność
komórek, a efekt ten zależał od masy chitozanu. Polimer HMW i LMW wpływał na
żywotność komórek wywołując ich apoptozę, a także nekrozę. Jedynie COS nie był
cytotoksyczny; przy żadnym stężeniu nie powodował śmierci komórek.
Równocześnie ze zmianą żywotności, następował wzrost ekspresji markerów związanych z
prezentacją antygenu oraz produkcji cytokin, co świadczy o dojrzewaniu i aktywacji
komórek. Efekt ten był zależny nie tylko od masy chitozanu, ale także rodzaju użytych
komórek. Różnice w reaktywności na chitozan komórek dendrytycznych i makrofagów miały
głównie charakter ilościowy, a nie jakościowy i wynikają zapewne nie tylko z różnych
właściwości tych populacji, a także z ich różnego pochodzenia. Makrofagi otrzymywano
in vitro ze szpiku myszy i stanowiły hodowlę pierwotną. Natomiast komórki dendrytyczne
JAWS II to linia komórkowa, o większej przeżywalności, jako komórki unieśmiertelnione, co
obserwowano w teście MTS; nawet duże stężenia polimeru nie były toksyczne dla tych
komórek. Wykazano jednak, że linia JAWS II pomimo braku p53 ma podobne właściwości
jak pierwotne komórki dendrytyczne, dlatego może być używana w badaniach modelowych
dla tej populacji komórek (Jiang et al., 2008). Zarówno hodowle pierwotne jak i linie
57
6.1 Wyniki; właściwości chitozanu in vitro
komórkowe posiadają zalety, jak i wady (Stacey, 2001), jednak stanowią bardzo ważne
narzędzie w biologii, ponieważ umożliwiają badanie mechanizmów komórkowych w
kontrolowanych warunkach. Choć badania in vitro nie oddają w pełni skomplikowanych
zjawisk zachodzących w całym organizmie, stanowią dogodny model do określania funkcji
różnych komórek i tkanek (Pan et al., 2008). Pomimo różnego pochodzenia makrofagów i
komórek dendrytycznych w prezentowanym doświadczeniu, charakter zmian pod wpływem
chitozanu był podobny. Zarówno komórki dendrytyczne jak i makrofagi różnie reagowały na
chitozan LMW i HMW, co obserwowano głównie w odmiennym profilu produkcji cytokin;
chitozan LMW indukował produkcję IL-12, natomiast HMW wpływał na IL-10 i IL-6.
Wielkość cząsteczek pobieranych przez komórki ma wpływ na rodzaj indukowanej
odpowiedzi immunologicznej zarówno in vitro jak i in vivo (Mant et al., 2012).
Obserwowano, że cząsteczki małe (<50-100 nm) aktywują reakcje zapalne typu 1, natomiast
większe cząsteczki (> 200 nm) indukują mechanizmy odpowiedzi typu 2. Związane jest to z
inną bio-dystrybucją w organizmie substancji o różnej wielkości (Manolova et al., 2008), ale
także różnym sposobem ich pobierania przez komórki (Mant et al., 2012). Może to być
jednym z mechanizmów rozpoznawania rodzaju patogenów; cząsteczki <50-100 nm
indukujące odpowiedź zależną od IFN-α odpowiadają wielkością niektórym wirusom, wobec
których skuteczna jest odpowiedź komórkowa Th1 zależna (Xiang et al., 2006). Choć w
prezentowanym doświadczeniu nie mierzono wielkości cząsteczek badanego chitozanu, masa
polimeru również różnicowała aktywowane mechanizmy. Chitozan HMW (190-375 kDa)
in vitro wykazał częściowo cechy adiuwantu odpowiedzi typu Th2 lub regulatorowej; słabiej
indukował ekspresję MHC klasy II na komórkach APC i produkcję cytokiny prozapalnej IL12 równocześnie wywołując sekrecję IL-10. Natomiast chitozan LMW (50-190 kDa) silnie
wzbudzał ekspresję markerów związanych z prezentacją antygenu i produkcję prozapalnej
IL-12 (cytokiny Th1 zależnej), sugerując typowe dojrzewanie komórek APC. Komórki linii
JAWS II okazały się nieco bardziej wrażliwe na aktywację przez chitozan niż makrofagi,
ponieważ wykazywały zmianę poziomu także cząsteczek ko-stymulacyjnych pod wpływem
polimeru.
Podsumowując, chitozan LMW aktywował zarówno komórki dendrytyczne jak i makrofagi,
co obserwowano jako wzrost ekspresji MHC II i produkcji IL-12. Taki fenotyp komórek APC
oznacza ich dojrzałość po aktywacji prozapalnej. Natomiast w przypadku chitozanu HMW
efekt był odmienny; wzrost poziomu MHC II był zdecydowanie słabszy, a równocześnie
komórki wydzielały IL-10 i IL-6 świadczące o potencjalnej aktywacji odpowiedzi Th2 lub
58
6.1 Wyniki; właściwości chitozanu in vitro
regulatorowej. Dlatego do dalszych doświadczeń wykorzystano chitozan HMW (polimer o
dużej masie cząsteczkowej), aby sprawdzić czy po podaniu in vivo (dootrzewnowo)
zaindukuje mechanizmy odpowiedzi typu 2 i poprzez to wpłynie na skuteczność odpowiedzi
obronnej w czasie zarażenia nicieniami pasożytniczymi.
59
6.2 Właściwości immunostymulacyjne chitozanu in vivo
6.2.1
Wprowadzenie
Immunostymulacyjne właściwości chitozanu badano in vivo, w modelu mysim; samcom
szczepu C57Bl6 podawano dootrzewnowo polimer HMW (o dużej masie cząsteczkowej;
Mw= 190-375 kDa,), który zaktywował komórki in vitro, co przedstawiono w Rozdziale 6.1.
Jama otrzewnej to przestrzeń otoczona błoną, w której znajdują się narządy oraz płyn
surowiczy. Do jamy otrzewnej napływają różne populacje komórek układu odpornościowego,
z których u myszy największy odsetek stanowią limfocyty B (40-50%) i makrofagi (30-40%)
(Ghosn et al., 2010, Ray & Dittel, 2010, Misharin et al., 2012). W odpowiedzi na patogeny
pojawiające się w jamie otrzewnej lub w znajdujących się w niej narządach, obecne tam
komórki ulegają aktywacji; wydzielane są mediatory stanu zapalnego, np. NO,
prostaglandyny oraz chemokiny i cytokiny. Do jamy otrzewnej napływają komórki z krwi,
głównie neutrofile i monocyty, ale także rozwija się odpowiedź nabyta; aktywowane komórki
migrują do lokalnych węzłów limfatycznych, gdzie prezentują antygeny naiwnym limfocytom
indukując ich klonalną proliferację (Martín-Fontecha et al., 2009). Z tego powodu jama
otrzewnej to dogodne miejsce do badania różnorodnych reakcji układu odpornościowego na
podawane związki.
Celem badań była ocena wskaźników odpowiedzi wrodzonej u myszy; lokalnie (w jamie
otrzewnej) oraz obwodowo (w krwi) po długotrwałym dootrzewnowym podawaniu chitozanu
(przez 10 dni). Chitozan ulega biodegradacji, dlatego taki schemat podawania polimeru
zapewniał przedłużone oddziaływanie niezmienionego polimeru.
6.2.2
Wyniki
6.2.2.1 Wpływ chitozanu na stan fizjologiczny myszy
Oceniono wpływ chitozanu na stan fizjologiczny zwierząt; co 2/3 dni myszy ważono oraz
pobierano krew z ogona w celu oznaczenia odsetka różnych populacji komórek w rozmazach.
Wykres 2.1 przedstawia bezwzględną (a) oraz procentową (b) zmianę masy ciała w czasie
doświadczenia. Podanie chitozanu spowodowało istotny spadek masy ciała zwierząt tylko w
2, o 5%, i 4 dniu doświadczenia; około 8 dnia masa zwierząt powróciła do wartości
wyjściowej i przyrastała w sposób porównywalny do grupy kontrolnej. U myszy, którym
podawano chitozan, nie obserwowano zmian w zachowaniu; zwierzęta nie były osowiałe,
60
6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo
sierść i odchody były niezmienione i żadne ze zwierząt nie padło. Podawanie chitozanu nie
spowodowało choroby i jest potencjalnie bezpieczne.
K
a
Cht
Masa ciała (g)
30
*
*
*
*
*
2
4
6
8
11
15
18
ANOVA Cht F=7,007, P<0,01
22
*
*
*
20
10
0
0
b
K
25
29
dni
Cht
% zmiany masy ciała
10
*
5
*
0
-5
-10
0
2
4
6
8
11
15
18
22
25
29dni
Wykres 2.1 Zmiana masy ciała myszy pod wpływem chitozanu; a) bezwzględne wartości w
gramach, b) procent zmiany względem 0 dnia doświadczenia. * oznaczono p<0,05 Cht vs K
dla danego punktu czasowego doświadczenia, n=4.
Analiza składu komórek w rozmazach krwi z ogona (Wykres 2.2) wykazała, że chitozan
spowodował w 6 dniu doświadczenia 3-krotny wzrost odsetka neutrofilów, który utrzymywał
się do 20 dnia, 10 dni po zakończeniu podawania chitozanu. W tym samym czasie nastąpił
spadek odsetka limfocytów, z 70% do około 50%, który powrócił do poziomu wyjściowego
po 12 dniach od zakończenia podawania polimeru i przez następne dni nieznacznie wzrastał.
Wprawdzie odsetki pozostałych populacji komórek nie zmieniały się istotnie w czasie
podawania chitozanu, obserwowano jednak nieznacznie obniżony odsetek monocytów od 5
dnia po zakończeniu podawania chitozanu, który utrzymał się do końca doświadczenia.
Odsetek eozynofilów w krwi nie zmienił się pod wpływem chitozanu.
61
6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo
Neutrofile
Monocyty
Limfocyty
Eozynofile
100
Odsetek komórek
*
80
*
*
*
*
*
60
40
*
*
*
*
20
*
*
*
*
0
0
2
4
6
8
11
15
18
22
25
29 dni
Wykres 2.2 Zmiany odsetka różnych populacji komórek w krwi myszy, którym podawano
chitozan. * oznaczono p<0,05 względem wartości wyjściowej (dzień 0), n=4.
Zmiana masy narządów znajdujących się w jamie otrzewnej jest jednym ze wskaźników
intensywności stanu zapalnego otrzewnej (peritonitis, Jansen et al., 1997). Określano masy
śledziony i wątroby, a także płuc i nerek, ponieważ ich uszkodzenie jest częstym powikłaniem
peritonitis (Tsujimoto et al., 2002). Wykres 2.3 przedstawia relatywne masy tych narządów
określone względem masy serca. Podanie chitozanu spowodowało tylko wzrost relatywnej
masy śledziony na początku doświadczenia (o ok. 60%), tuż po zakończeniu podawania
polimeru, co świadczy o pobudzeniu tego narządu. Masa pozostałych narządów nie uległa
zmianie; wątroba ani płuca nie były zmienione.
62
6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo
K
Cht1
Cht3
AdOH
1,2
*
1
0,8
0,6
*
0,4
0,2
0
Śledziona
Wątroba
Nerka
Płuca
Wykres 2.3 Zmiana relatywnej- względem serca, masy narządów w czasie podawania
chitozanu. * oznaczono p<0,05 względem grupy kontrolnej (K), n=4.
Po 3 tygodniach od podawania chitozanu obserwowano uformowane białe struktury wewnątrz
jamy otrzewnej (Fot. 2.1a i b). Były one przytwierdzone do narządów wewnętrznych;
śledziony, jelit i wątroby, a także do błony otrzewnej. U niektórych myszy (szczególnie gdy
doświadczenia prowadzono na szczepie BALB/c) obserwowano liczne zrosty jelita cienkiego
(wyniki nieprzedstawione). Barwienie hematoksyliną i eozyną 10 μm skrawków tych struktur,
wyizolowanych razem z fragmentem wątroby, wykazały, że są to grudki odłożonego
chitozanu otoczone grubą warstwą gęstej tkanki łącznej tworzącej ziarniniak (Fot. 2.1c).
Wśród regularnie ułożonych komórek identyfikowano fibroblasty; wrzecionowate komórki o
okrągłym jądrze, oraz makrofagi epitelioidalne; ciasno ułożone komórki o wydłużonym
jądrze, a także komórki olbrzymie; kuliste skupiska jąder komórkowych (Shadman et al.,
2009, Ramakrishnan, 2012). Na dolnej części preparatu widać grubą warstwę kolagenu, a
wewnątrz ziarniniaka nieregularne masy chitozanu, wybarwione intensywnie różowo, z
uwięzionymi komórkami. W barwieniu fluorescencyjnym (Fot. 2.1d) w miejscu połączenia
ziarniniaka z wątrobą wykazano obecność największej liczby komórek CD11b+CD68+, które
mogą być komórkami Kupffera (makrofagi wątroby). Obserwowano je w niewielkiej ilości
także na całym obwodzie ziarniniaka, ale dominowały tam komórki CD11b+CD68- oraz
komórki podwójnie negatywne.
63
6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo
a
c
W
Cht
W
Cht
b
W
d
W
Cht
Fot. 2.1 Zmiany w jamie otrzewnej pod wpływem chitozanu, a) trzy tygodnie po podaniu
polimeru, b) tuż po zakończeniu nastrzykiwania oraz barwione c) hematoksyliną i eozyną lub
d) fluorescencyjnie (niebieski- DAPI, czerwony- CD11b, zielony- CD68, żółty- podwójnie
pozytywny) 10 μm skrawki ziarniniaka wyizolowanego od myszy po 3 tygodniach od podania
chitozanu. W- wątroba, Cht- ziarniniak z chitozanem. Powiększenie x10.
6.2.2.2 Charakterystyka widm NMR chitozanu z jamy otrzewnej
Płyn otrzewnowy wyizolowany po ostatnim wstrzyknięciu chitozanu, poddano analizie NMR
(Nuclear Magnetic Resonance; spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego) w celu
potwierdzenia obecności polimeru. Wykres 2.4a przedstawia widma NMR w transformacji
Fourier’a materiałów wyjściowych: pożywki RPMI (różowa linia), rozpuszczalnika; kwasu
64
6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo
adypinowego (AdOH, czerwona linia) oraz chitozanu, który był podawany myszom (HMW
chitosan, niebieska linia). Używany chitozan zawierał wszystkie charakterystyczne dla tego
polimeru pasma: 3400 – 3100 cm-1 (pasmo drgań rozciągających grup OH), 3365 cm-1 (pasmo
amidowe), 3292 cm-1 (pasmo rozciągające N-H), 2878 cm-1 (pasmo rozciągające C-H, obecne
także w kwasie adypinowym), 1640 cm-1 (pasmo amidowe I), 1563 cm-1 (pasmo amidowe II),
1550 cm-1 (pasmo asymetryczne NH3+), 1155 cm-1 (pasmo rozciągające O-C-O), 1100-1020
cm-1 (C-O rozciągające grup: C-OH, C-O-C pierścień, CH2OH). Wykres 2.4b przedstawia
przykładowe widmo płynu otrzewnowego (z pożywką RPMI) izolowanego w 10 dniu
doświadczenia. Widoczne są w nim charakterystyczne pasma chitozanu, co oznacza, że jest
on tam obecny. Pasmo przy 1700cm-1 w tej próbie nie występuje jako samodzielny pik, tak
jak to było w materiale wyjściowym chitozanu (wskazane strzałkami). Jest ono zawarte w
szerokim zakresie 1690-1550cm-1, co świadczy o zmianie charakteru oddziaływań. Pojawiło
się także nowe pasmo 1742cm-1, co może świadczyć o powstaniu wolnych grup
karboksylanowych nie zaangażowanych w wiązania wodorowe czy oddziaływania jonowe z
3500
3000
2500
916.25
917.03
2000
1500
928.98
881.72
843.98
773.94
1068.65
1044.19
1025.52
1119.49
1193.69
1278.26
690.44
733.99
1189.58
1273.64
1356.63
1314.33
1461.10
1428.02
1406.51
1537.95
1914.30
2343.53
HMW chitosan
4000
1461.95
1432.01
1408.43
1693.04
2498.43
2665.53
2614.05
2951.43
2874.05
2932.62
2873.15
AdOH
3128.67
3064.09
3034.38
RPMI medium
3211.27
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e
807.85
766.37
1304.78
1595.37
1488.12
1437.31
1714.86
1698.26
1684.09
2949.59
2899.71
3218.06
3416.40
3316.02
a
1217.16
1180.20
1111.53
1071.65
1036.51
1003.89
chitozanem.
1000
Wavenumbers
65
6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo
b
representative peritoneal fluid sample
1651.86
2951.65
2888.27
2852.22
766.39
833.41
928.37
903.85
1007.93
1042.71
1182.97
1127.03
1745.45
0.04
1457.72
1557.68
1541.40
2982.01
3394.52
3366.47
A
0.08
b
s
o
r
b
a
0.06
n
c
e
3296.48
3245.01
3184.26
3131.33
2920.02
0.10
0.02
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
Wavenumbers
Wykres 2.4 Przykładowe widma FTIR chitozanu a) przed oraz b) po podaniu myszom.
Różowa linia to widmo RPMI, pożywki, którą płukano jamę otrzewnej, czerwona liniawidmo kwasu adypinowego (AdOH), rozpuszczalnika chitozanu.
6.2.2.3 Wpływ chitozanu na komórki jamy otrzewnej
Sekcje wykonano w 4 punktach czasowych doświadczenia: 0 (K; kontrola, bez chitozanu), 10
(Cht1; ostatni dzień podawania chitozanu), 25 (Cht2; 2 tygodnie po zakończeniu podawania
chitozanu) oraz 35 (Cht3; 3 tygodnie po zakończeniu podawania chitozanu) dniu
doświadczenia. Zaobserwowano bardzo silny napływ komórek do jamy otrzewnej pod
wpływem chitozanu (Wykres 2.5); komórek było ponad siedmiokrotnie więcej niż u myszy
kontrolnych. Z czasem, liczba komórek obecnych w płynie otrzewnowym zmniejszała się aż
w 35 dniu doświadczenia powróciła do poziomu kontrolnego. Kwas adypinowy nie wpłynął
na liczbę komórek izolowanych z jamy otrzewnej.
66
6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo
K
Cht1
Cht 2
Cht3
AdOH
15
komórki x106
*
10
*
5
0
Wykres 2.5 Zmiana liczby komórek w jamie otrzewnej pod wpływem chitozanu. * oznaczono
p<0,05 względem grupy kontrolnej (K), n=4.
Skład komórkowy płynu otrzewnowego analizowano po wybarwieniu rozmazów oraz metodą
cytometrii przepływowej na podstawie ekspresji markerów F4/80 i CD11b oraz morfologii
komórek (Wykres 2.6c). Komórki F4/80hiCD11bhi (bramka G1) identyfikowano jako dojrzałe
makrofagi tkankowe. W populacji F4/80loCD11b+ (bramka G2) rozróżniano eozynofile na
podstawie ziarnistości (SSChi, bramka G3), a pozostałe komórki (bramka G4) uznawano za
monocyty napływowe (80% komórek z G4 było Ly6C+; wyniki nieprzedstawione). Pozostałe
komórki CD11b+ (bramka G5) identyfikowano jako neutrofile (95% wykazywało ekspresję
markera Gr1; wyniki nieprzedstawione). Wykazano, że pod wpływem chitozanu do jamy
otrzewnej napływają głównie neutrofile, które identyfikowano na rozmazach (Wykres 2.6a).
Także analiza cytometryczna potwierdziła znaczny udział tej populacji w odpowiedzi na
chitozan- stanowiły one ok. 40% komórek otrzewnowych, podczas gdy u myszy kontrolnychtylko
5-10%.
Dodatkowo
wykazano
obniżenie
odsetka
tkankowych
makrofagów
otrzewnowych przy równoczesnym wzroście odsetka napływowych monocytów (Wykres
2.6b); rozróżnienie tych populacji możliwe było tylko za pomocą cytometrii przepływowej.
67
6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo
a
K
%
80
Cht1
Cht3
AdOH
60
*
*
40
20
*
0
Monocyty
b
Neutrofile
K
%
50
Cht1
Eozynofile
Cht2
Cht3
Limfocyty
AdOH
*
40
*
30
* *
20
*
10
* *
*
0
Makrofagi
Eozynofile
Monocyty
Neutrofile
Cht1
K
CD11b
FSC
SSC
F4/80
SSC
F4/80
c
CD11b
FSC
Wykres 2.6 Zmiany odsetka różnych populacji komórek w płynie otrzewnowym pod
wpływem chitozanu; a) identyfikowanych na rozmazach barwionych metodą DiffQuik,
b) analizowanych metodą cytometrii przepływowej, c) przykładowe wykresy przedstawiające
sposób analizy komórek. * oznaczono p<0,05 względem grupy kontrolnej (K), n=4.
68
6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo
Ze względu na silny wzrost liczby komórek w jamie otrzewnej po podaniu chitozanu,
analizowano także całkowitą liczbę komórek poszczególnych populacji (Wykres 2.7).
Potwierdzono, że na początku doświadczenia w jamie otrzewnej gromadzą się neutrofile i
monocyty, jednak zaobserwowano także dodatkowo napływ eozynofilów tuż po zakończeniu
podawania chitozanu. Natomiast populacja tkankowych makrofagów nie zmieniła się;
polimer nie spowodował ich deplecji. Ilość komórek powróciła do stanu kontrolnego pod
koniec doświadczenia.
K
Cht1
Cht2
Cht3
AdOH
5
*
komórki x 106
4
3
*
2
*
*
1
*
0
Makrofagi
Eozynofile
Monocyty
Neutrofile
Wykres 2.7 Zmiany liczby komórek poszczególnych populacji identyfikowanych metodą
cytometrii przepływowej w płynie otrzewnowym. * oznaczono p<0,05 względem grupy
kontrolnej (K), n=4.
Następnie analizowano fenotyp monocytów/makrofagów CD11bhi (Wykres 2.8c); metodą
cytometrii przepływowej określano odsetek komórek posiadających markery powierzchniowe
związane z dojrzałością oraz aktywacją monocytów (Wykres 2.8a i b). Na początku
doświadczenia, 10 dnia podawania chitozanu, wykazano spadek ekspresji wszystkich
markerów na monocytach otrzewnowych; chitozan obniżył odsetek komórek pozytywnych
dla MHC II, CD80 i CD86, cząsteczek związanych z prezentacją antygenu oraz MR,
dektyny-1, CD23 i IL-4R, wskazujących na alternatywną aktywację, a także CD14,
ko-receptora dla LPS. Taki poziom aktywacji monocytów utrzymywał się do 25 dnia
doświadczenia, 15 dni po podaniu chitozanu. W 35 dniu doświadczenia, czyli 25 dni po
zakończeniu podawania polimeru, poziom ekspresji większości markerów powrócił do stanu
kontrolnego, jednak ekspresja MHC II nadal była niższa niż przed podaniem chitozanu,
69
6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo
natomiast poziom ekspresji receptorów CD86, MR oraz dektyny-1 i, nieznacznie, IL-4R
(p<0,1), markerów charakteryzujących alternatywnie aktywowane makrofagi, wzrósł, choć
CD14 powróciło do poziomu kontrolnego.
a
K
%
100
Cht1
Cht2
Cht3
AdOH
*
80
*
*
60
*
*
*
*
40
*
20
0
MHC II
b
%
100
K
CD80
Cht1
Cht2
CD86
Cht3
AdOH
**
80
*
*
60
*
*
40
* *
20
*
*
0
CD14
MR
Dektyna 1
IL-4R
CD23
70
6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo
c
K
FL1
SSC
Count
Cht1
CD11b
FSC
CD14
Wykres 2.8 Zmiana odsetka monocytów pozytywnych dla markerów powierzchniowych
a) związanych z prezentacją antygenu, b) związanych z rodzajem aktywacji pod wpływem
chitozanu. c) przykładowe wykresy analizy komórek. * oznaczono p<0,05 względem grupy
kontrolnej (K), n=4.
Komórki przylegające płynu otrzewnowego hodowano in vitro w celu określenia poziomu
metabolizmu L-argininy; zmierzono ilość NO-2 (Wykres 2.9a) oraz mocznika (Wykres 2.9b),
które świadczą o aktywności indukowanej syntazy tlenku azotu (iNOS) oraz arginazy 1. Jako
kontrolę pozytywną podano bakteryjny LPS, który zwiększa w komórkach aktywność obu
enzymów. W 10 dniu doświadczenia chitozan nie wpłynął na aktywność niestymulowanych
komórek, jednak obniżył poziom aktywności arginazy 1 po stymulacji LPS; komórki
wykazywały wtedy zmianę aktywności enzymów; z arginazy 1 na iNOS. Natomiast w 35
dniu
doświadczenia
zaobserwowano
zwiększoną
aktywność
arginazy 1;
zarówno
spontaniczną, jak i po aktywacji LPS (Wykres 2.9b). Obserwowano wówczas również wyższy
poziom NO po stymulacji LPS (Wykres 2.9a). Rozpuszczalnik chitozanu, kwas adypinowy
AdOH także wpłynął na badane wskaźniki komórek przylegających; zmniejszył aktywność
iNOS po stymulacji LPS, ale równocześnie zwiększył aktywność arginazy 1.
Zmieniła się również produkcja cytokin in vitro. Komórki izolowane od myszy, którym
podawano chitozan, najpierw wykazywały obniżoną spontaniczną produkcję zarówno IL-6 i
IL-10, ale pod wpływem stymulacji LPS dominowała produkcja cytokiny prozapalnej
(Wykres 2.9c i d). Z czasem, produkcja IL-6 przez komórki izolowane od myszy po
71
6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo
3 tygodniach od podania chitozanu, w 35 dniu doświadczenia, powróciła do stanu
kontrolnego, ale komórki te produkowały mniej IL-10 w odpowiedzi na LPS.
Kwas adypinowy nie wpłynął znacząco na aktywność komórek; obserwowano nieznacznie
słabszą reakcję na LPS, ale tylko na poziomie aktywności iNOS i arginazy 1.
a
0,4
K
Cht1
Cht3
b
AdOH
Cht1
Cht3
OD
OD
0,4
*
0,3
*
0,2
0,2
*
0,1
*
*
0,1
0
0
RPMI
c
3000
K
Cht1
LPS
Cht3
AdOH
RPMI
d
3000
*
2500
Cht1
Cht3
AdOH
*
pg/ml
2000
1500
1000
500
K
LPS
2500
2000
pg/ml
AdOH
*
*
0,3
K
0,5
1500
*
1000
500
*
0
0
RPMI
LPS
*
RPMI
LPS
Wykres 2.9 Wpływ chitozanu na poziom aktywności a) iNOS mierzonego stężeniem NO-2
oraz b) arginazy 1 mierzonego stężeniem mocznika oraz produkcję cytokin c) prozapalnej IL6 i d) regulatorowej IL-10 w hodowli komórek przylegających płynu otrzewnowego. *
oznaczono p<0,05 względem grupy kontrolnej (K), n=3.
Podsumowując, chitozan istotnie wpłynął na aktywność komórek jamy otrzewnej;
początkowo spowodował napływ neutrofilów i niedojrzałych monocytów, które wydzielały
jednak NO i IL-6 w odpowiedzi na stymulację in vitro, natomiast wykazywały obniżoną
72
6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo
produkcję IL-10 i aktywność arginazy 1. Z czasem, liczba komórek w jamie otrzewnej
powróciła do poziomu kontrolnego, jednak fenotyp monocytów wskazywał na ich aktywację
na drodze alternatywnej, choć komórki te były zdolne do produkcji mediatorów stanu
zapalnego w odpowiedzi na stymulację LPS in vitro.
6.2.2.4 Wpływ chitozanu na komórki krwi obwodowej
Określano wpływ chitozanu na odsetek różnych populacji komórek w krwi pobranej z serca.
Tuż po zakończeniu podawania polimeru obserwowano zmniejszenie o 1/3 odsetka
limfocytów przy wzroście udziału pozostałych populacji (Wykres 2.10). Najsilniejsze zmiany
dotyczyły monocytów (wzrost z 4 do 13%) i neutrofilów (z 5 do 18%).
%
100
K
Cht1
Cht2
Cht3
AdOH
80
*
60
40
20
*
*
*
0
Monocyty
Neutrofile
Eozynofile
Limfocyty
Wykres 2.10 Zmiany odsetka różnych populacji komórek w krwi pod wpływem chitozanu
analizowanych metodą cytometrii przepływowej. * oznaczono p<0,05 względem grupy
kontrolnej (K), n=4.
Oznaczono także wpływ chitozanu na poziom ekspresji CD14 na monocytach i neutrofilach
(Wykres 2.11), markera który pojawia się na komórkach reagujących na czynniki patogenów,
głównie LPS, a którego poziom zwiększa się na komórkach prozapalnych. Podawanie
chitozanu spowodowało krótkotrwały wzrost ekspresji CD14 tylko na neutrofilach krwi;
komórek CD14-pozytywnych było 2 razy więcej. Na koniec doświadczenia ekspresja CD14
powróciła do poziomu kontrolnego, co wskazuje na tymczasowe wzbudzenie komórek
prozapalnych przez chitozan.
73
6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo
% CD14+
K
Cht1
Cht2
Cht3
AdOH
20
*
*
15
10
5
0
Monocyty
Neutrofile
Wykres 2.11 Zmiana odsetka monocytów i neutrofilów CD14+ w krwi pod wpływem
chitozanu, analizowanych metodą cytometrii przepływowej. * oznaczono p<0,05 względem
grupy kontrolnej (K), n=4.
6.2.2.5 Wpływ chitozanu na poziom cytokin
Poziom cytokin w płynie otrzewnowym oraz w krwi mierzono metodą ELISA. Podanie
kwasu adypinowego nie wpłynęło na poziom cytokin, dlatego wyniki dla tej grupy nie są
prezentowane.
Chitozan istotnie zwiększył produkcję cytokin prozapalnych w płynie otrzewnowym, poza
IL-1β, tylko tuż po zakończeniu iniekcji. Produkcja cytokin powróciła do poziomu
kontrolnego w ciągu 2 tygodni (Wykres 2.12a). Także poziom cytokin przeciwzapalnych,
TGF-β i IL-10 uległ zmianie (Wykres 2.12b). Na początku doświadczenia chitozan wywołał
aż 60-krotny wzrost produkcji TGF-β oraz w nieco mniejszym stopniu podniósł poziom
IL-10. Zmiany te utrzymywały się i do końca doświadczenia nie powróciły do poziomu
kontrolnego. Podanie chitozanu spowodowało także 10-krotny wzrost produkcji chemokiny
MCP-1, czynnika chemotaktycznego dla monocytów i makrofagów (Wykres 2.12c). Wysoka
produkcja tego białka nie utrzymała się jednak po zakończeniu podawania polimeru. Podobną
dynamikę wykazywała produkcja mieloperoksydazy (Myeloperoxidase; MPO), wydzielanej
głównie przez neutrofile (Wykres 2.12d). Na koniec doświadczenia, w 35 dniu,
zaobserwowano także zwiększone wydzielanie IL-4.
74
6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo
a
TNF-α
IL-1β
IL-6
IL-12
400
*
350
300
pg/ml
250
200
150
*
100
*
*
50
0
0
10
TGF-β
b
500
25
IL-10
35
dni
IL-4
*
pg/ml
400
*
300
*
200
100
*
*
*
25
35
0
0
c
K Cht1
160
Cht2
10
Cht3
AdOH
d 100
*
80
Cht1
Cht3
*
80
pg/ml
pg/ml
120
K
dni
60
40
40
20
0
0
Wykres 2.12 Wpływ chitozanu na produkcję a) cytokin prozapalnych, b) cytokin
regulatorowych i Th2, c) chemokiny MCP-1 oraz d) mieloperoksydazy w płynie
otrzewnowym. * oznaczono p<0,05 względem grupy kontrolnej (K), n=5.
75
6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo
Podawanie chitozanu istotnie wpłynęło na poziom cytokin także na poziomie obwodowym
(Wykres 2.13a i b); w krwi obserwowano wzrost poziomu niektórych cytokin prozapalnych
(IL-6 i IL-1β), a także regulatorowych (TGF-β i IL-10). Obserwowano silniejszą indukcję
IL-10 (wzrost 5-krotny) niż TGF-β (wzrost 2-krotny). Już 2 tygodnie po zakończeniu iniekcji
poziom tych cytokin powrócił po stanu kontrolnego, jednak na koniec doświadczenia
zaobserwowano wzrost IL-4.
IL-1β
a
1200
IL-6
IL-12
*
1000
pg/ml
800
600
*
400
200
0
0
10
IL-4
b
25
IL-10
35
TGF-β
4000
*
pg/ml
3000
2000
*
1000
*
0
0
10
25
35
dni
Wykres 2.13 Wpływ chitozanu na produkcję a) cytokin prozapalnych, b) cytokin
regulatorowych i Th2 w krwi. * oznaczono p<0,05 względem grupy kontrolnej (K), n=4.
76
6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo
Podsumowyjąc, początkowo chitozan spowodował wzrost produkcji zarówno cytokin
prozapalnych jak i regulatorowych, zarówno w jamie otrzewnej jak i w krwi. Z czasem
stężenie cytokin powróciło do poziomu kontrolnego, jednak w jamie otrzewnej nadal
obserwowano silniejszą produkcję TGF-β i IL-10.
6.2.3
Dyskusja
W jamie otrzewnej myszy obecne są różne komórki odpornościowe, zdolne do
rozpoznawania
i
neutralizowania
patogenów
oraz
ich
metabolitów.
Odpowiedź
immunologiczna rozwija się szybko i łączy różne mechanizmy; wrodzone i nabyte. Celem
badań było stwierdzenie czy pod wpływem chitozanu zmienia się poziom aktywacji komórek
odpowiedzi wrodzonej w jamie otrzewnej myszy.
Badania wykazały immunostymulacyjne właściwości chitozanu; podany dootrzewnowo
wywołał silną odpowiedź immunologiczną. Była ona obserwowana zarówno lokalnie,
w jamie otrzewnej, jak i obwodowo, w krwi. Podczas podawania chitozanu nastąpiło
wzbudzenie ostrego stanu zapalnego, który z czasem, po ok. 3 tygodniach, uległ
zahamowaniu.
Chitozan spowodował silny napływ komórek do jamy otrzewnej, prawdopodobnie
w odpowiedzi na wzrost produkcji MCP-1. Jest to chemokina wydzielana przez różne
komórki; monocyty, fibroblasty, komórki śródbłonka, mięśniowe i nabłonkowe. Działa jako
czynnik chemotaktyczny głównie dla monocytów, ale także dla neutrofilów i limfocytów T
pamięci (Deshmane et al., 2009). Indukcja produkcji MCP-1 przez chitozan spowodowała
napływ głównie neutrofilów oraz monocytów, a także eozynofilów. Reakcja taka nastąpiła już
w 24 h po podaniu chitozanu (wyniki nieprzedstawione). Neutrofile jako jedne z pierwszych
komórek pojawiają się w miejscu wniknięcia czynnika obcego. W różnych doświadczalnych
modelach zapalenia otrzewnej, np. wywoływanego tioglikolatem, LPS lub zymosanem,
obserwuje się napływ tej populacji komórek do jamy otrzewnej oraz otaczających narządów
już w 4 h po podaniu czynnika prozapalnego (Tsujimoto et al., 2002). Neutrofile migrowały
do jamy otrzewnej jeszcze do 2 tygodni po zaprzestaniu nastrzyknięć chitozanu. Komórki te
wykazywały silne właściwości prozapalne; aktywność MPO była wysoka. Reakcja
obwodowa, w krwi, na podanie chitozanu pojawiła się później; wzrost odsetka neutrofilów
obserwowano dopiero około 5-6 dnia doświadczenia i była to prawdopodobnie odpowiedź
organizmu na wzmożoną migrację tej populacji do tkanek. Jednak wysoki poziom neutrofilów
w krwi utrzymywał się krócej niż w jamie otrzewnej; przed upływem 2 tygodni powrócił do
77
6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo
poziomu kontrolnego. Jednak spadek masy ciała zwierząt, obserwowany już w 2 dniu
doświadczenia, sugeruje silny stan zapalny głównie na początku podawania chitozanu
(Granger et al., 2013).
Komórkami migrującymi do jamy otrzewnej pod wpływem chitozanu były także monocyty.
Tradycyjnie, jama otrzewnej jest źródłem dojrzałych makrofagów tkankowych (Resident
Macrophages; Wang et al., 2013), które po stymulacji LPS produkują mediatory stanu
zapalnego i cytokiny prozapalne. Podanie chitozanu spowodowało napływ monocytów o
niskiej ekspresji F4/80, co wskazuje na ich niedojrzały fenotyp (Hettinger et al., 2013).
Komórki te wykazywały również niski poziom markerów związanych z prezentacją antygenu
(MHC II i cząsteczek ko-stymulacyjnych) i alternatywną aktywacją (MR, dektyna 1, CD23).
Pomimo niskiej ekspresji CD14, komórki te pozostały reaktywne; w hodowli in vitro po
podaniu LPS produkowały znaczną ilość NO i IL-6 przy równocześnie obniżonej aktywności
arginazy 1 i produkcji IL-10. Sugeruje to, że chitozan spowodował napływ niedojrzałych
monocytów pro-zapalnych do jamy otrzewnej, ale sam nie wywołał ich aktywacji ani
dojrzewania. Nie zaburzył jednak zdolności komórek do reagowania na czynniki prozapalne.
Gdy chitozan nie był już podawany, liczba komórek oraz poziom MCP-1 zaczęły powracać
do poziomu kontrolnego. Skład komórkowy płynu otrzewnowego po 3 tygodniach powrócił
do stanu fizjologicznego; główne populacje stanowiły limfocyty oraz makrofagi tkankowe.
Jednak fenotyp monocytów/makrofagów obecnych w jamie otrzewnej został zmieniony pod
wpływem chitozanu; obniżony poziom MHC II, przy wzroście CD86, MR, dektyny 1 oraz,
nieznacznie, receptora dla IL-4, sugeruje aktywację tych komórek na drodze alternatywnej
(Gordon, 2002). Aktywacja supresorowa tych komórek była jednak niepełna; choć in vitro
aktywność arginazy 1 była wysoka, monocyty nie produkowały zwiększonej ilości IL-10.
Równocześnie ekspresja CD14 powróciła do poziomu fizjologicznego i wzrosła produkcja
NO po stymulacji LPS tych komórek. Wykazano, że makrofagi charakteryzują się dużą
plastycznością fenotypową; AAMf pomimo odmiennych funkcji są zdolne ponownie do
klasycznej aktywacji w odpowiednim środowisku, np. w odpowiedzi na PAMP lub cytokiny
(Stout & Suttles, 2004, Guiducci et al., 2005). Zmieniony przez chitozan fenotyp mógł zatem
być modyfikowany przez inne czynniki, jak np. LPS w hodowli, aby zapewnić optymalną
odpowiedź na czynniki stymulujące.
Chitozan wzbudził produkcję różnych cytokin; początkowo obserwowano równoczesny
wzrost wydzielania cytokin prozapalnych (TNF-α, IL-6 i IL-12), jak i regulatorowych (TGF-β
i IL-10) w jamie otrzewnej. TNF-α jest cytokiną produkowaną m. in. przez monocyty i
78
6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo
neutrofile w odpowiedzi na patogeny i jest bardzo silnym czynnikiem pro-zapalnym; może
indukować apoptozę różnych komórek. IL-12 to cytokina charakterystyczna dla odpowiedzi
typu Th1 i jest wydzielana głównie przez makrofagi aktywowane klasycznie oraz komórki
dendrytyczne. Wykazano, że TNF-α i IL-6 produkowane przez otrzewnowe komórki tuczne
powodują napływ neutrofilów oraz wzrost ich aktywności prozapalnej w różnych modelach
stanów zapalnych, w tym peritonitis (Doener et al., 2013). Te cytokiny świadczą o ostrym
stanie zapalnym oraz pośredniczą w rekrutacji leukocytów. Ich wysoki poziom,
zaindukowany przez chitozan, mógł spowodować zatem napływ neutrofilów i monocytów
w reakcji na czynnik prozapalny jakim okazał się polimer. Podobne skutki obserwowano
w przypadku innych polisacharydów pochodzenia naturalnego; wykazano że niektóre roślinne
polimery stymulują in vitro i in vivo produkcję IL-6, IL-12 i TNF-α, co przyczyniało się
m. in. do hamowania wzrostu guzów i zwiększenia przeżywalności zwierząt z nowotworami
(Bao et al., 2013, Huang et al., 2014). Wyniki przedstawione wcześniej, w Rozdziale 6.1,
wskazywały, że chitozan o dużej masie cząsteczkowej może indukować in vitro mechanizmy
związane z odpowiedzią Th2/Treg. Jednak po podaniu polimeru in vivo obserwowano raczej
mieszaną reakcję; chitozan HMW wzbudził w jamie otrzewnej produkcję IL-6 i IL-10,
podobnie jak in vitro, ale równocześnie wzrósł poziom IL-12, jak w przypadku LMW in vitro.
Może to być związane z degradacją polimeru i zmianami w jego strukturze, co stwierdzono w
analizie NMR. Pojawiające się nowe pasma w widmie chitozanu sugerują zmiany w
oddziaływaniach cząsteczkowych tego związku, co mogło mieć konsekwencje w jego
właściwościach biologicznych. Polimer podawany był przez 10 dni, aby zapewnić kontakt
leukocytów z chitozanem HMW, jednak aktywność komórek mogła powodować pojawianie
się mniejszych jego fragmentów o silnych właściwościach prozapalnych (jak chitozan LMW,
co wykazano w badaniach in vitro).
Z czasem produkcja cytokin prozapalnych w jamie otrzewnej wywołana przez chitozan
zaczęła się obniżać; w 3 tygodniu doświadczenia wszystkie powróciły do poziomu
kontrolnego. Jednak wpływ chitozanu na wydzielanie cytokin regulatorowych był bardziej
długotrwały; poziom IL-10 i TGF-β wzrósł znacząco na początku doświadczenia i do końca
doświadczenia był podwyższony. TGF-β to czynnik wzrostu, który wykazuje działanie
supresyjne na komórki układu odpornościowego (Yi et al., 2013). Hamuje stan zapalny
warunkując równocześnie pojawianie się procesów gojenia tkanek
(Kim et al., 2006).
Wykazano również, że TGF-β zwiększa produkcję macierzy zewnątrzkomórkowej przez
komórki mezenchymalne, co w przeprowadzonym doświadczeniu mogło powodować
formowanie się ziarniniaka (Lin et al., 1998). Ponadto wykazano, że chroniczne wydzielanie
79
6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo
TGF-β powoduje silne włóknienie tkanek, obserwowane w różnych modelach peritonitis,
także u ludzi. Powoduje to zmiany w obrębie jamy otrzewnej; zaburza dyfuzję oraz migrację
komórek (Yung et al., 2012). Dlatego, zwiększona produkcja TGF-β wywołana przez
chitozan mogła mieć dwojaki efekt: działać jako czynnik regulatorowy ograniczający stan
zapalny, ale równocześnie wywoływać bliznowacenie tkanek ograniczając ich funkcje.
Lokalne podawanie chitozanu wywołało efekt obwodowy; na początku doświadczenia w krwi
obserwowano wzrost poziomu cytokin prozapalnych i regulatorowych. Jednak na poziomie
ogólnoustrojowym długotrwały wpływ polimeru był słabiej zaznaczony; spowodował tylko
wzrost IL-4, bez podwyższonego poziomu TGF-β i IL-10 jak to było widoczne w jamie
otrzewnej. Dynamika komórek w krwi była podobna jak w miejscu podawania chitozanu;
silna migracja monocytów, neutrofilów i eozynofilów do jamy otrzewnej spowodowała
wzrost odsetka tych populacji w krwi. Dodatkowo podawanie chitozanu zwiększyło odsetek
neutrofilów CD14+, co potwierdza ich udział w indukcji stanu zapalnego.
Odpowiedź immunologiczna wywoływana przez chitozan bardzo przypomina reakcje, jakie
obserwuje się po podaniu zymosanu. Jest to glukan otrzymywany z grzybów, który podany
dootrzewnowo wywołuje stan zapalny charakteryzujący się silnym napływem neutrofilów i
monocytów (Volman et al., 2005), podobnie jak to obserwowano po podaniu chitozanu.
Jednak model stanu zapalnego z wykorzystaniem zymosanu wiąże się z wysoką
śmiertelnością zwierząt (30-40%), podczas gdy podanie chitozanu nie wpłynęło znacząco na
kondycję myszy, pomimo wysokiej dawki i długiego czasu podawania, i żadne ze zwierząt
nie padło w czasie prowadzenia doświadczeń.
Podsumowując, wykazano, że chitozan o dużej masie cząsteczkowej wywołuje in vivo stan
zapalny jamy otrzewnej charakteryzujący się intensywnym napływem neutrofilów i
monocytów oraz równoczesną wysoką produkcją cytokin prozapalnych, jak i regulatorowych.
Prozapalny wpływ chitozanu był obserwowany także obwodowo. Pomimo, że indukowany
przez chitozan stan zapalny nie był wysoce patogenny, wywołał długotrwałe zmiany w
miejscu podania. Przy utrzymującym się wzroście TGF-β i IL-10 wytworzony został
ziarniniak otaczający polimer, a monocyty zasiedlające jamę otrzewną wykazywały
zmieniony fenotyp, sugerując ich alternatywną aktywację.
Efekt in vivo był inny niż ten obserwowany w badaniach in vitro (Rozdział 6.1). Inaczej niż
zakładano, chitozan o dużej masie nie indukował mechanizmów typu 2. Może to być efektem
degradacji polimeru; pojawiające się krótsze łańcuchy chitozanu powodowały reakcję zapalną
typu 1, tak jak sugerowały badania in vitro chitozanu LMW. Chociaż polimer nie wykazywał
80
6.2 Wyniki; właściwości chitozanu in vivo
własności adiuwantu odpowiedzi Th2 zależnej, ze względu na silną aktywację komórek
odpowiedzi
wrodzonej,
zbadano
wpływ
tego
polimeru
na
przebieg
odpowiedzi
przeciwpasożytniczej.
81
6.3 Wpływ chitozanu na odpowiedź przeciwpasożytniczą
6.3.1
Wprowadzenie
Badano czy stan zapalny wywołany przez chitozan zmienia skuteczność odpowiedzi
przeciwpasożytniczej. W tym celu wykonano doświadczenia z wykorzystaniem dwóch
gatunków nicieni pasożytniczych: wyłącznie jelitowego Heligmosomoides polygyrus oraz
jelitowego z migrującą larwą Trichinella spiralis. Pasożyty te różnią się biologią; cyklem
życiowym i miejscem zasiedlania w żywicielu, jednak oba gatunki indukują odpowiedź
obronną typu Th2 oraz modyfikują reakcje immunologiczne żywiciela.
Heligmosomoides polygyrus (dawniej Nematospiroides dubius, Baylis, 1926) należący do
rodziny Trichostrongylidae, to nicień pasożytujący w jelicie myszy i myszowatych. Jego cykl
życiowy (Rys. 3.1) odbywa się w jednym żywicielu, do którego rozwijająca się w środowisku
zewnętrznym larwa inwazyjna L3 dostaje się drogą pokarmową. Larwy wnikają do błony
śluzowej i osiedlają się w mięśniach jelita cienkiego. W ciągu około 8 dni po zarażeniu (dpz)
larwy przechodzą 2 linienia osiągając stadium przeddorosłe (L5), które powraca do światła
jelita i migruje do dwunastnicy (Liu, 1965). Tam nicienie osiągają dojrzałość i po kopulacji
samice składają jaja, które razem z kałem myszy usuwane są do środowiska zewnętrznego, w
którym rozwijają się stadia wolno żyjące (Fahmy, 1956). Ze względu na lokalizację pasożyta
w żywicielu rozróżnia się 2 fazy zarażenia H. polygyrus: histotropową (tkankową), kiedy
larwy L4 znajdują się w mięśniach jelita (ok. 6 dpz) oraz jelitową; która może stać się
chroniczna, kiedy formy dorosłe znajdują się w świetle jelita.
Zarażenie myszy laboratoryjnej nicieniem H. polygyrus stanowi model do badania zarażeń
ludzi tęgoryjcami (Necator americanus i Ancylostoma duodenale) oraz nicieniami
żołądkowo-jelitowymi u przeżuwaczy (Haemonchus contortus i Teladorsagia circumcincta),
a także mechanizmów immunoregulacji wywoływanej przez pasożyty jelitowe (Reynolds et
al., 2012).
H. polygyrus wykazuje wysoki stopień dostosowania do żywiciela i hamuje wiele
mechanizmów odpowiedzi immunologicznej, zapobiegając usuwaniu go z jelita. Odporność
na zarażenie jest warunkowana genetycznie i różni się u różnych szczepów myszy
laboratoryjnej; u szczepów odpornych obserwuje się adaptację mniejszej liczby nicieni oraz
ich niższą płodność (Zhong & Dobson, 1996).
Wnikanie larw do błony śluzowej jelita wzbudza odpowiedź immunologiczną; migrujące do
lamina propria i mięśniówki jelita leukocyty mogą zapobiegać zasiedlaniu jelita przez larwy
82
6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie
lub wstrzymywać ich rozwój. Nicienie, które osiągają postać dorosłą, powracają do światła
jelita i silnie hamują stan zapalny- nie tylko w jelicie, ale także w całym organizmie
(Reynolds et al., 2012).
11 dpz do 7 miesięcy
Formy
dorosłe
6 dpz
2 linienia
L4
ŻYWICIEL
L3
(inwazyjna)
jajo
ŚRODOWISKO
ZEWNĘTRZNE
L2
L1
Rys. 3.1 Schemat cyklu życiowego Heligmosomoides polygyrus. Zdjęcia własne.
Zarażenie H. polygyrus wzbudza odpowiedź już na poziomie mechanizmów wrodzonych;
następuje aktywacja komórek dendrytycznych, komórek tucznych i makrofagów, a także,
choć w mniejszym stopniu, eozynofilów i neutrofilów (Reynolds et al., 2012). Wszystkie te
komórki mają właściwości regulacyjne; wpływają na reakcje fizjologiczne jelita oraz
pośredniczą w aktywacji komórek odpowiedzi nabytej, ale pełnią także wiele funkcji
efektorowych. W czasie zarażenia H. polygyrus obserwuje się aktywację makrofagów na
drodze alternatywnej; produkowana przez nie arginaza 1 może bezpośrednio przyczyniać się
do zabijania nicieni i obecność AAMf wydaje się być kluczowa dla odpowiedzi obronnej
(Anthony et al., 2006). Antygeny H. polygyrus zmieniają również poziom aktywacji komórek
dendrytycznych, które zarówno in vivo jak i in vitro, stymulują dojrzewanie limfocytów Th2
oraz aktywację Treg (MacDonald & Maizels, 2008).
83
6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie
Trichinella spiralis (Owen, 1835) jest nicieniem pasożytniczym o szerokim kręgu
żywicielskim. Jest to pasożyt wewnątrzkomórkowy, wszystkie stadia rozwojowe występują w
tym samym żywicielu; od formy inwazyjnej do wykształcenia kolejnego stadium zdolnego do
zarażania, nie występują stadia wolno żyjące, a formą inwazyjną jest larwa L1 w cyściekomórce piastunce (Rys. 3.2). Kiedy mięśnie zawierające larwy L1 dostaną się do żołądka
kolejnego żywiciela, otoczka cysty zostaje strawiona, a larwy przedostają się do jelita
cienkiego, gdzie linieją i już po ok. 36-48 h dojrzewają do formy dorosłej (Shanta &
Meerovitch, 1967). Dorosłe nicienie zasiedlają błonę śluzową jelita przewiercając się przez
komórki nabłonka, a po kopulacji (ok. 4-5 dpz) samice rodzą larwy, opuszczające osłonki
jajowe wewnątrz macicy, do przestrzeni limfatycznych. Nowo narodzone larwy (New-born
Larvae; NBL) stadium L1 migrują przez organizm żywiciela docierając do mięśni
poprzecznie prążkowanych; tam wnikają do włókien mięśniowych i indukują proces
tworzenia komórki-piastunki (nurse-cell; Despommier et al., 1991). Ok. 21-30 dpz larwy L1
uzyskują inwazyjność i są zdolne zarażać kolejnych żywicieli.
Zarażenie T. spiralis wywołuje chorobę zwaną trichinellozą, która objawia się już 1-2 dni po
zarażeniu dysfunkcją układu pokarmowego. Objawy uogólnione, jak ból mięśni, gorączka,
opuchlizna i zmęczenie, obserwuje się 2, czasami aż do 8 tygodni po zarażeniu. Przebieg
choroby i nasilenie objawów zależy od ilości połkniętych nicieni, a larwy w mięśniach mogą
utrzymywać
się
przez
całe
życie
żywiciela.
Bardzo
często
choroba
pozostaje
niezdiagnozowana ze względu na niespecyficzne objawy (Knopp et al., 2012). W warunkach
laboratoryjnych, przebieg trichinellozy można badać u myszy lub szczurów zarażanych
eksperymentalnie larwami mięśniowymi .
Faza jelitowa zarażenia, w czasie której larwy inwazyjne dojrzewają i jako formy dorosłe
produkują nowe pokolenie larw, jest zwykle krótka; u większości szczepów myszy nicienie są
usuwane z jelita w ciągu paru tygodni (Wakelin & Donachie, 1983). Wyrzucanie pasożytów
następuje w wyniku jelitowej mastocytozy oraz eozynofilii i związanej z nimi zwiększonej
kurczliwości jelit (Bruschi & Chiumiento, 2012). W fazie mięśniowej, larwy wnikając do
włókien mięśniowych, wywołują stan zapalny w mięśniach oraz eozynofilię w krwi (Bruschi
et al., 2008). Zarówno w fazie jelitowej, jak i mięśniowej, decydujące dla reakcji obronnej
żywiciela jest zaangażowanie limfocytów CD4+ i ich dojrzewanie w kierunku Th2, jednak to
komórki odpowiedzi wrodzonej decydują o ich aktywacji (Netea et al., 2005).
Podobnie jak w przypadku H. polygyrus, wykazano, że antygeny T. spiralis mają zdolność
modulowania aktywności komórek dendrytycznych; indukują ich niepełne dojrzewanie, czego
84
6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie
konsekwencją jest aktywacja typu Th2 naiwnych limfocytów CD4+. Taką właściwość, choć o
różnym nasileniu, wykazują antygeny wszystkich stadiów T. spiralis (larwy mięśniowe,
formy dorosłe i nowonarodzone larwy, Ilic et al., 2012). Podobny wpływ T. spiralis wykazuje
na makrofagi; antygeny nicienia hamują aktywność prozapalną tych komórek (Bai et al.,
2012). Jednak in vivo pasożyt odmiennie aktywuje makrofagi; w fazie jelitowej obserwuje się
hamowanie aktywności tych komórek, a na początku mięśniowej następuje wzrost ich
aktywacji; komórki produkują NO i inne mediatory stanu zapalnego sprzyjające adaptacji
larwy (Kołodziej-Sobocińska et al., 2006).
Larwy mięśniowe stają się inwazyjne po ok. 3 tygodniach i mogą
zarazić kolejnego żywiciela
Inwazyjne larwy
mięśniowe L1
21 dpz do kilku lat
Larwy L1 osiedlają się
w mięśniach żywiciela
(komórka piastunka)
Larwy dostają się do
jelita cienkiego, gdzie
dojrzewają do form
dorosłych
2 dpz
Formy dorosłe
5- 21 dpz
Samice rodzą
larwy L1
5- 15 dpz
Nowonarodzone
larwy (NBL) dostają
się do krążenia i
migrują po żywicielu
Rys. 3.2 Schemat cyklu życiowego Trichinella spiralis. Zdjęcia własne.
Zwiększenie aktywności komórek odpowiedzi wrodzonej, głównie DC i makrofagów,
pośredniczących w odpowiedzi Th2, może być sposobem na wzmocnienie naturalnej
odporności w zarażeniu zarówno H. polygyrus jak i T. spiralis. Ze względu na
immunostymulacyjne właściwości chitozanu stwierdzone w Rozdziale 6.1 i 6.2, możliwe że
85
6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie
polimer ten poprzez aktywację DC i makrofagów wpłynie na skuteczność odpowiedzi
przeciwpasożytniczej.
Myszy, którym podawano chitozan, w 5 dniu doświadczenia zarażano jednym z nicieni.
Obserwacje przeprowadzano w 2 punktach czasowych odpowiadających obecności w
żywicielu różnych stadiów pasożyta, a także różnemu czasowi jaki upłynął od podania
chitozanu. Określono wpływ polimeru na poziom zarażenia oraz przebieg odpowiedzi
przeciwpasożytniczej
na
poziomie
mechanizmów
wrodzonych.
Podawanie
kwasu
adypinowego nie wpływało na badane wskaźniki, dlatego wyniki dla tych grup nie zostały
przedstawione.
6.3.2
Wyniki
6.3.2.1 Heligmosomoides polygyrus
Chitozan nie wpłynął na poziom zarażenia H. polygyrus; we wszystkich badanych grupach
izolowano taką samą liczbę nicieni z jelita cienkiego, zarówno form L4, jak i dorosłych
(Wykres 3.1a). Stwierdzono jednak nieznaczne różnice w płodności samic; in vitro nicienie
uzyskane od myszy, którym podawano chitozan, produkowały nieznacznie mniej jaj (Wykres
3.1c, p=0,07). Także in vivo między 11 a 21 dpz w próbach koproskopowych produkcja
jaj/g kału (Eggs per Gram; EPG) zmieniała się w czasie. Produkcja jaj H. polygyrus wykazuje
zmiany skokowe; co 4-6 dni następuje wzrost liczby jaj w kale (Wykres 3.1b grupa Hp oraz
Doligalska et al., 2006). Chitozan zmienił ten wzór; szczyt produkcji obserwowano w 15 dpz,
a ponowny wzrost nastąpił 2 dni później niż u myszy kontrolnych.
Hp
Hp/Cht
Hp
a 180
400
liczba jaj/samicę
liczba nicieni
150
120
90
60
30
Hp/Cht
500
c
**
300
200
100
0
6 dpz
22 dpz
0
86
6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie
b
Hp
Hp/Cht
100000
*
*
EPG
80000
60000
**
40000
20000
0
11
13
15
17
19
21 dpz
Wykres 3.1 Wpływ chitozanu na wskaźniki parazytologiczne w zarażeniu H. polygyrus:
a) liczbę nicieni różnych stadiów oraz płodność samic b) in vivo w czasie doświadczenia oraz
c) in vitro po 48 h hodowli. * oznaczono p<0,05, ** oznaczono p<0,1 Hp/Cht vs Hp dla
danego punktu czasowego doświadczenia, n=4.
Właściwości immunostymulacyjne chitozanu, wykazane w Rozdziale 6.2; związane z
napływem komórek i produkcją cytokin w jamie otrzewnej, nie wpłynęły na liczbę
H. polygyrus w jelicie. Zbadano czy podawanie chitozanu modulowało odpowiedź wrodzoną
indukowaną przez pasożyta.
6.3.2.1.1
Reakcja lokalna w jamie otrzewnej
W czasie zarażenia H. polygyrus nie obserwuje się silnych zmian w obrębie jamy otrzewnej;
w 6 dpz populacja makrofagów otrzewnowych nieznacznie maleje, a w fazie chronicznej
obserwuje się lekki napływ monocytów (Wykres 3.2). Pod wpływem chitozanu następuje
silny napływ monocytów i neutrofilów oraz nieznacznie zwiększa się liczebność eozynofilów
(Tabela 3.1). Zarażenie H. polygyrus osłabiło napływ komórek indukowany przez polimer; do
jamy otrzewnej napłynęło ponad 2 razy mniej monocytów i neutrofilów u myszy w 6 dpz niż
po samym podaniu chitozanu. Jednocześnie istotnie liczniejsza była populacja makrofagów
otrzewnowych, o 40%, choć ani samo zarażenie ani podawanie chitozanu nie wpływały na
liczbę tych komórek. W fazie chronicznej, 2 tygodnie po ostatnim podaniu chitozanu,
populacja makrofagów otrzewnowych była mniej liczna niż w kontrolnym zarażeniu;
zahamowany był napływ komórek (Wykres 3.2), ale ich liczba była podobna jak u myszy
87
6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie
niezarażonych (K i Cht2). Także populacja monocytów indukowanych przez chitozan
utrzymywała się na 3-krotnie niższym poziomie po zarażeniu. Zarażenie przyspieszyło także
spadek liczby neutrofilów; 2 tygodnie po podaniu polimeru utrzymywała się podwyższona
liczba tych komórek, natomiast przy równoczesnym zarażeniu powróciła już do stanu
kontrolnego.
6 dpz
6 dpz/Cht
22 dpz
22 dpz/Cht
Liczba komórek x 106
4
*
3
2
*
1
*
*
*
*
0
Mf otrzewnowe
Monocyty
Eozynofile
Neutrofile
Wykres 3.2 Wpływ chitozanu na liczbę komórek w jamie otrzewnej myszy zarażonych
H. polygyrus. Czerwoną kreską poziomą oznaczono poziom fizjologiczny, u myszy
kontrolnych (K) * oznaczono p<0,05 względem grupy z danego dpz bez chitozanu, n=4.
Tabela 3.1 Liczba komórek (x 106) ± SD w jamie otrzewnej myszy, którym podawano
chitozan. * oznaczono p<0,05 między grupami (zarażone vs niezarażone).
6 dpz/ Cht
Cht1
22 dpz/ Cht
Cht2
Mf otrzewnowe
*1,05 ± 0,11
0,6 ± 0,07
0,76 ± 0,07
0,83 ± 0,15
Monocyty
*0,82 ± 0,17
1,71 ± 0,05
*0,07 ± 0,03
0,22 ± 0,04
Eozynofile
0,18 ± 0,01
0,24 ± 0,04
*0,01 ± 0,01
0,02 ± 0,01
Neutrofile
*2,40 ± 0,26
4,16 ± 0,59
0,01 ± 0,01
0,02 ± 0,00
Monocyty jamy otrzewnej pod wpływem chitozanu miały także zmieniony fenotyp
(Wykres 3.3). W fazie jelitowej zarażenia monocyty ulegają aktywacji, o czym świadczy
zwiększona ekspresja MHC II (do prawie 100% komórek) i CD86, co zostało zahamowane
przez chitozan (Wykres 3.3a). Jednak obserwowano nieznaczną stymulację komórek przez
88
6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie
pasożyta; monocyty izolowane od myszy zarażonych, którym podawano chitozan, miały
wyższy poziom MHC II (p<0,1), CD80 i CD86, niż u myszy, którym podawano tylko polimer
(Tabela 3.2). W fazie jelitowej poziom markerów związanych z prezentacją antygenów jest
podobny jak w fazie histotropowej. W tym czasie chitozan, 2 tygodnie po podaniu, utrzymuje
obniżoną ekspresję tych cząsteczek, ale zarażenie przywróciło aktywację komórek
(Wykres 3.3a i Tabela 3.2).
Także ekspresja pozostałych markerów aktywacji monocytów w czasie zarażenia była inna
niż u myszy, którym podawano sam polimer (Tabela 3.2). Początkowo podanie chitozanu, jak
i zarażenie H. polygyrus powodują obniżenie odsetka komórek CD14+ i efekt ten został
pogłębiony przy równoczesnym zarażeniu i podaniu chitozanu osiągając jedynie 74%
(Wykres 3.3a). W fazie jelitowej zarażenia następuje dalszy spadek ekspresji CD14, ale
podanie chitozanu odwróciło ten efekt; komórek CD14+ było o 8% więcej niż w kontrolnym
zarażeniu. W fazie histotropowej zarażenia zwiększa się nieznacznie poziom ekspresji
niektórych markerów związanych z alternatywną aktywacją makrofagów- dektyny 1 i CD23
(p<0,1, Wykres 3.3b). Podanie chitozanu spowodowało w tym czasie 6-krotny wzrost
poziomu IL-4R oraz spadek tylko dektyny 1, choć u myszy niezarażonych polimer bardzo
silnie obniża ekspresję wszystkich tych markerów. W fazie jelitowej zarażenia, odsetek
komórek pozytywnych dla markerów alternatywnie aktywowanych makrofagów jest podobny
jak u myszy niezarażonych (o 1/3 więcej jest tylko komórek CD23+), a podanie chitozanu,
silniej niż u myszy niezarażonych, dodatkowo zwiększył poziom dektyny 1.
a
6 dpz
%
6 dpz/Cht
22 dpz
22 dpz/Cht
100
*
*
80
*
60
40
20
0
MHC II
CD80
CD86
89
6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie
b
6 dpz
%
100,0
6 dpz/Cht
22 dpz
22 dpz/Cht
*
*
*
80,0
*
60,0
40,0
*
20,0
0,0
CD14
IL-4R
MR
Dektyna 1
CD23
Wykres 3.3 Wpływ chitozanu na fenotyp otrzewnowych monocytów/makrofagów myszy
zarażonych H. polygyrus; a) odsetek komórek pozytywnych dla markerów związanych z
prezentacją antygenu, b) odsetek komórek pozytywnych dla markerów związanych z
rodzajem aktywacji. Czerwoną kreską poziomą oznaczono poziom fizjologiczny. * oznaczono
p<0,05 względem grupy z danego dpz bez chitozanu.
Tabela 3.2 Odsetek ± SD monocytów pozytywnych dla wybranych markerów
powierzchniowych w jamie otrzewnej myszy, którym podawano chitozan. * oznaczono
p<0,05 między grupami (zarażone vs niezarażone).
6 dpz/ Cht
Cht1
22 dpz/ Cht
Cht2
MHC II
*80,1 ± 4,9
62,5 ± 5,9
*95,1 ± 3,4
57,5 ± 7,7
CD80
*62,3 ± 8,7
47,7 ± 5,8
86,1 ± 5,1
81,8 ± 0,4
CD86
*55,3 ± 7,2
33,0 ± 4,2
*85,9 ± 3,8
44,6 ± 1,8
CD14
*74,1 ± 3,8
93,1 ± 0,7
88,9 ± 1,9
89,7 ± 0,7
IL-4R
*18,7 ± 6,6
0,7 ± 0,2
5,1 ± 2,1
5,7 ± 0,2
MR
*41,9 ± 5,8
19,4 ± 3,3
59,4 ± 4,9
50,2 ± 0,8
Dektyna 1
45,3 ± 7,1
39,6 ± 5,7
*80,4 ± 5,9
54,7 ± 0,6
CD23
*20,9 ± 1,9
9,3 ± 1,2
*27,5 ± 1,0
21,1 ± 1,5
Obserwowano także wpływ chitozanu na lokalną produkcję cytokin w czasie zarażenia
(Wykres 3.4). W fazie histotropowej, H. polygyrus indukuje wzrost produkcji IL-6, co zostało
wzmocnione przez chitozan i to 2-krotnie silniej niż u myszy niezarażonych (Tabela 3.3). W
czasie podawania chitozanu następuje wzrost poziomu także chemokiny MCP-1, prozapalnej
90
6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie
IL-12 oraz regulatorowego TGF-β, które były hamowane w czasie zarażenia. Chitozan
zablokował natomiast produkcję IL-4 w czasie zarażenia utrzymując ją na poziomie
kontrolnym, ale zwiększył poziom IL-10 i to 2-krotnie silniej niż u myszy niezarażonych,
choć sam H. polygyrus nie wpływa istotnie na produkcję tego czynnika na początku inwazji.
W fazie jelitowej zarażenia obserwuje się w jamie otrzewnej wzrost produkcji IL-4 i IL-10, a
chitozan zatrzymał produkcję IL-4, choć sam polimer o 20% stymulował wydzielanie tej
cytokiny. Dwa tygodnie po podaniu chitozanu utrzymuje się także podwyższony poziom
TGF-β i IL-12, ale zarażenie obniżyło produkcję tych czynników.
6 dpz
6 dpz/Cht
22 dpz
22 dpz/Cht
1600
*
pg/ml
1200
*
800
400
*
*
*
*
*
*
0
MCP-1
IL-1
IL-12
IL-4
TGF-β
IL-10
IL-6
Wykres 3.4 Wpływ chitozanu na poziom cytokin w płynie otrzewnowym myszy zarażonych
H. polygyrus. Czerwoną kreską poziomą oznaczono poziom fizjologiczny. * oznaczono
p<0,05 względem grupy z danego dpz bez chitozanu, n=4.
Tabela 3.3 Stężenie (pg/ml) ± SD cytokin w jamie otrzewnej myszy, którym podawano
chitozan. * oznaczono p<0,05 między grupami (zarażone vs niezarażone).
6 dpz/ Cht
Cht1
22 dpz/ Cht
Cht2
MCP-1
*212,2 ± 21,4
426,1 ± 25,3
41,6 ± 7,5
40,6 ± 6,9
IL-1
43,6 ± 9,8
35,2 ± 11,8
23,4 ± 3,8
26,8 ± 7,2
IL-12
*47,8 ± 9,9
162,6 ± 29,5
*60,6 ± 13,9
87,8 ± 5,2
IL-4
129,6 ± 7,1
109,0 ± 12,1
*81,3 ± 8,6
103,8 ± 12,8
TGF-β
106,9 ± 9,0
1004,8 ± 49,1
*167,4 ± 15,4
511,5 ± 34,1
IL-10
*833,6 ± 32,9
364,2 ± 26,1
230,1 ± 64,5
222,6 ± 42,9
IL-6
*1240,8 ± 70,7
649,3 ± 61,1
39,1 ± 10,0
45,8 ± 8,5
91
6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie
6.3.2.1.2
Reakcja obwodowa w krwi
Podanie chitozanu spowodowało nieznaczne zmiany odpowiedzi na poziomie obwodowym,
w krwi myszy zarażonych. Odsetek komórek różnych populacji u myszy, którym podawano
chitozan w 6 i 22 dpz był taki jak u myszy niezarażonych po takim samym czasie od podania
polimeru (Tabela 3.4). Odpowiedź na polimer nie została zmodyfikowana przez zarażenie;
wzrósł odsetek eozynofilów i trzykrotnie zwiększył się odsetek monocytów i neutrofilów,
przy równoczesnym zmniejszeniu odsetka limfocytów w krwi (Wykres 3.5). W 22 dpz i
2 tygodnie po podaniu chitozanu odsetek komórek powrócił do stanu fizjologicznego.
6 dpz
%
6 dpz/Cht
22 dpz
22 dpz/Cht
100
80
*
60
40
20
*
*
*
0
Monocyty
Eozynofile
Neutrofile
Limfocyty
Wykres 3.5 Wpływ chitozanu na odsetek komórek różnych populacji w krwi myszy
zarażonych H. polygyrus. Czerwoną kreską poziomą oznaczono poziom fizjologiczny.
* oznaczono p<0,05 względem grupy z danego dpz bez chitozanu, n=4.
Tabela 3.4 Odsetek ± SD komórek różnych populacji w krwi myszy, którym podawano
chitozan. * oznaczono p<0,05 między grupami (zarażone vs niezarażone).
6 dpz/ Cht
Cht1
22 dpz/ Cht
Cht2
Monocyty
11,9 ± 2,2
13,3 ± 4,2
4,8 ± 2,4
4,5 ± 2,5
Eozynofile
1,3 ± 0,4
1,6 ± 0,6
0,8 ± 0,2
0,9 ± 0,1
Neutrofile
19,5 ± 1,0
17,5 ± 3,0
1,9 ± 0,7
1,9 ± 0,4
Limfocyty
59,7 ± 4,3
50,3 ± 8,8
90,5 ± 4,1
84,4 ± 11,7
92
6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie
W fazie histotropowej zarażenia następuje ponad 3-krotny wzrost poziomu TGF-β, który
został zahamowany po podaniu chitozanu, chociaż sam polimer także indukuje syntezę tej
cytokiny (Wykres 3.6 i Tabela 3.5). Obserwowano także 2-krotnie niższy niż w kontroli
(grupa Cht1) poziom IL-10 po chitozanie w czasie zarażenia. Równocześnie znacznie wzrósł
poziom IL-6, 5-ciokrotnie bardziej niż u myszy niezarażonych, chociaż zarażenie nie wpływa
na tę cytokinę. Produkcja pozostałych cytokin we wszystkich grupach była na poziomie
fizjologicznym. W fazie jelitowej zarażenia 2-krotnie zwiększa się wydzielanie IL-10, a
podanie chitozanu utrzymało produkcję tej cytokiny na poziomie fizjologicznym. Zamiast
tego, zaobserwowano wzrost produkcji TGF-β podobnie jak u myszy niezarażonych po
długotrwałym podawaniu chitozanu.
6 dpz
6 dpz/Cht
22 dpz
22 dpz/Cht
2000
*
1600
pg/ml
1200
*
*
800
400
*
*
*
0
IL-1
IL-12
IL-4
TGF-β
IL-10
IL-6
Wykres 3.6 Wpływ chitozanu na poziom cytokin w krwi myszy zarażonych H. polygyrus.
Czerwoną kreską poziomą oznaczono poziom fizjologiczny. * oznaczono p<0,05 względem
grupy z danego dpz bez chitozanu, n=4.
Tabela 3.5 Stężenie (pg/ml) ± SD cytokin w krwi myszy, którym podawano chitozan.
* oznaczono p<0,05 między grupami (zarażone vs niezarażone).
6 dpz/ Cht
Cht1
22 dpz/ Cht
Cht2
IL-1
52,1 ± 19,4
71,4 ± 21,8
*49,6 ± 7,1
83,3 ± 12,5
IL-12
293,5 ± 72,6
200,8 ± 29,7
147,5 ± 75,3
131,1 ± 42,9
IL-4
44,8 ± 6,7
52,9 ± 9,9
105,5 ± 76,6
100,9 ± 51,4
TGF-β
*218,5 ± 2,6
488,7 ± 19,5
588,3 ± 118,9
628,3 ± 74,6
93
6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie
IL-10
*890,0 ± 13,3
1729,5 ± 51,2
547,3 ± 52,2
553,6 ± 81,5
IL-6
*1626,7 ± 185,4
472,2 ± 36,9
227,6 ± 40,5
272,9 ± 56,8
U myszy zarażonych H. polygyrus, którym podawano chitozan obserwowano wpływ
polimeru
na
odpowiedz
przeciwpasożytniczą,
jednak
inwazja
pasożytnicza
także
modyfikowała przebieg stanu zapalnego indukowanego przez chitozan. Napływ komórek do
jamy otrzewnej w odpowiedzi na chitozan był słabszy u myszy zarażonych. Fenotyp
monocytów otrzewnowych pod wpływem chitozanu wskazywał na ich niski stopień
dojrzałości, jednak zarażenie nieznacznie powodowało ich aktywację. Zarażenie obniżyło
także lokalną produkcję IL-12 i TGF-β w odpowiedzi chitozan, ale zwiększyło poziom IL-6 i
IL-10. Pomimo zmian w odpowiedzi immunologicznej wywołanej przez chitozan, podanie
polimeru nie wpłynęło na poziom zarażenia.
6.3.2.2 Trichinella spiralis
Podanie chitozanu istotnie wpłynęło na poziom zarażenia T. spiralis; od myszy, którym
podawano chitozan, izolowano więcej nicieni obu stadiów (Wykres 3.7a). W fazie jelitowej
izolowano o 40% więcej form dorosłych od myszy, którym podawano chitozan. Płodność
samic in vitro nie została zmieniona (Wykres 3.7b), jednak w fazie mięśniowej obserwowano
dwa razy więcej larw L1 w mięśniach żywiciela (Wykres 3.7a).
Ts
a
Ts
Ts/Cht
b
Ts/Cht
50
150
dorosłe/ L1 x 102
120
*
90
60
30
0
liczba NBL/samicę
*
40
30
20
10
0
5 dpz
30 dpz
Wykres 3.7 Wpływ chitozanu na a) liczbę nicieni T. spiralis różnych stadiów oraz b)
płodność samic in vitro po 24 h hodowli. * oznaczono p<0,05 względem grupy kontrolnej dla
danego dpz, n=4.
94
6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie
Podawanie dootrzewnowo chitozanu, jak wykazano w Rozdziale 6.2, wywołuje silny napływ
komórek oraz produkcję cytokin w jamie otrzewnej. W przypadku T. spiralis takie warunki
immunologiczne okazały się korzystne dla pasożyta i sprzyjały jego przeżywaniu. Zbadano
jak chitozan wpłynął na odpowiedź immunologiczną wzbudzaną przez pasożyta.
6.3.2.2.1
Reakcja lokalna w jamie otrzewnej
Chitozan spowodował napływ komórek do jamy otrzewnej w fazie jelitowej zarażenia.
Obserwowano intensywną migrację neutrofilów, monocytów i eozynofilów, a populacja
makrofagów otrzewnowych znacznie się zmniejszyła (Wykres 3.8). Jednak dynamika
komórek była podobna jak u myszy niezarażonych, w czasie podawania chitozanu;
odpowiedź na polimer zdominowała tę indukowaną przez nicienia (Tabela 3.6). Zarażenie
dodatkowo obniżyło 5-krotnie liczbę makrofagów otrzewnowych, czego nie obserwowano w
czasie kontrolnego zarażenia ani po podaniu chitozanu. Po dłuższym czasie podawania
obserwowano silniejszy wpływ chitozanu na odpowiedź przeciwpasożytniczą; podobny jak u
myszy niezarażonych. W fazie mięśniowej inwazji T. spiralis następuje napływ komórek do
jamy otrzewnej; eozynofilów oraz monocytów, a także znacząco (10-krotnie) zwiększa się
populacja otrzewnowych makrofagów. Podanie chitozanu istotnie zahamowało migrację
komórek i ich liczba pozostała na poziomie kontrolnym; polimer hamował reakcje wzbudzane
przez larwy L1.
5 dpz
5dpz /Cht
30 dpz
30dpz /Cht
7
*
Liczba komórek x106
6
5
4
3
*
2
1
*
*
0
Mf otrzewnowe
*
*
*
Eozynofile
Monocyty
Neutrofile
Wykres 3.8 Wpływ chitozanu na liczbę komórek w jamie otrzewnej myszy zarażonych
T. spiralis. Czerwoną kreską poziomą oznaczono poziom fizjologiczny. * oznaczono p<0,05
względem grupy z danego dpz bez chitozanu, n=5.
95
6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie
Tabela 3.6 Liczba komórek (x 106) ± SD w jamie otrzewnej myszy, którym podawano
chitozan. * oznaczono p<0,05 między grupami (zarażone vs niezarażone).
5 dpz/ Cht
Cht1
30 dpz/ Cht
Cht3
Mf otrzewnowe
*0,13 ± 0,06
0,46 ± 0,04
0,93 ± 0,49
0,83 ± 0,15
Monocyty
1,59 ± 0,54
1,47 ± 0,42
0,20 ± 0,11
0,22 ± 0,09
Eozynofile
0,35 ± 0,24
0,21± 0,06
0,06 ± 0,04
0,02 ± 0,00
Neutrofile
4,12 ± 1,76
3,66 ± 1,34
0,23 ± 0,20
0,22 ± 0,04
Monocyty obecne w jamie otrzewnej miały także zmieniony przez chitozan fenotyp
(Wykres 3.9). W fazie jelitowej zarażenia następuje wzrost odsetka komórek pozytywnych
dla MHC II oraz ponad 2-krotny spadek CD86 (Wykres 3.9a). Podanie chitozanu w tym
czasie powoduje spadek ekspresji markerów związanych z prezentacją antygenu; w czasie
zarażenia zahamowało wzrost poziomu MHC II, silniej obniżyło CD86, a dodatkowo
wpłynęło na 2-krotne obniżenie CD80 i to silniej niż u myszy niezarażonych (Cht1;
Tabela 3.7). W fazie mięśniowej pasożyt utrzymuje wysoką ekspresję MHC II, a chitozan,
inaczej niż w grupie kontrolnej, nie zaburzył tego procesu. Poziom CD80 był taki sam we
wszystkich 3 grupach, a CD86, które jest obniżane w czasie zarażenia, pod wpływem
chitozanu nie zwiększyło poziomu ekspresji, choć miało to miejsce w grupie kontrolnej
(Cht3).
Także poziom markerów związanych z rodzajem aktywacji monocytów został zmieniony
przez chitozan (Wykres 3.9b). Chitozan w fazie jelitowej zarażenia obniżył odsetek
monocytów CD14+, podobnie jak po samym podaniu polimeru (Tabela 3.7). Nicienie
wywołują wzrost ekspresji niektórych markerów związanych z alternatywną aktywacją
monocytów: dektyny 1 i IL-4R. Chitozan, który powoduje napływ niedojrzałych monocytów,
spowodował obniżenie odsetka komórek pozytywnych dla MR, dektyny 1 i CD23, ale nie
IL-4R; wpływ zarażenia na poziom tego markera był silniejszy i odsetek komórek IL-4R+ był
taki jak w kontrolnym zarażeniu. W fazie mięśniowej następuje nieznaczna redukcja odsetka
komórek CD14+; efekt ten został dodatkowo pogłębiony przez chitozan, choć przy
podawaniu polimeru u myszy niezarażonych, ekspresja tego markera powróciła do poziomu
kontrolnego. Indukcja IL-4R pojawiająca się w fazie mięśniowej została dodatkowo
wzmocniona przez chitozan (o ok. 25%), natomiast poziom dektyny 1 i CD23 był podobny w
obu grupach myszy zarażonych, a także porównywalny z myszami niezarażonymi, którym
podawano chitozan. Jednak odsetek komórek MR+, który jest obniżony w czasie zarażenia
wzrósł 2-krotnie po chitozanie, tak jak u myszy kontrolnych.
96
6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie
5 dpz
a
5dpz /Cht
30 dpz
30dpz /Cht
120
100
*
80
60
*
*
40
*
20
0
MHC II
b
CD80
5 dpz
120
5dpz /Cht
CD86
30 dpz
30dpz /Cht
*
100
*
*
*
80
60
*
40
*
*
20
0
CD14
IL-4R
MR
Dektyna 1
CD23
Wykres 3.9 Wpływ chitozanu na fenotyp otrzewnowych monocytów/makrofagów myszy
zarażonych T. spiralis; a) odsetek komórek pozytywnych dla markerów związanych z
prezentacją antygenu, b) odsetek komórek pozytywnych dla markerów związanych z
rodzajem aktywacji. Czerwoną kreską poziomą oznaczono poziom fizjologiczny. * oznaczono
p<0,05 względem grupy z danego dpz bez chitozanu, n=5.
Tabela 3.7 Odsetek ± SD monocytów pozytywnych dla wybranych markerów
powierzchniowych w jamie otrzewnej myszy, którym podawano chitozan. * oznaczono
p<0,05 między grupami (zarażone vs niezarażone).
5 dpz/ Cht
Cht1
30 dpz/ Cht
Cht3
MHC II
55,4 ± 13,0
66,0 ± 6,2
86,3 ± 5,6
86,2 ± 2,9
CD80
*39,2 ± 2,8
47,7 ± 3,8
94,9 ± 2,7
96,9 ± 0,6
97
6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie
CD86
14,3 ± 1,3
15,9 ± 2,1
36,0 ± 3,2
36,7 ± 1,3
CD14
94,2 ± 0,7
93,1 ± 0,7
*74,0 ± 5,8
88,3 ± 2,2
IL-4R
*13,4 ± 3,8
2,6 ± 1,0
*67,2 ± 4,8
13,7 ± 1,4
MR
*32,5 ± 6,1
21,2 ± 2,7
66,5 ± 6,8
57,5 ± 8,7
Dektyna 1
21,5 ± 7,0
15,4 ± 6,3
*34,2 ± 1,0
57,1 ± 2,1
CD23
6,6 ± 3,3
5,6 ± 0,8
*27,1 ± 4,7
23,0 ± 1,8
Podawanie chitozanu istotnie wpłynęło na produkcję cytokin w jamie otrzewnej myszy
zarażonych (Wykres 3.10). W fazie jelitowej obserwuje się tylko wzrost TGF-β, natomiast
podanie chitozanu spowodowało silny wzrost produkcji cytokin prozapalnych (oprócz IL-1β).
Kinetyka zmian była taka jak u myszy niezarażonych, którym podawano chitozan, jednak w
niektórych przypadkach osiągane stężenie cytokin było inne u myszy zarażonych
(Tabela 3.8). T. spiralis wzmocnił 2-krotnie produkcję MCP-1 zaindukowaną przez chitozan,
choć samo zarażenie nie wpływa na poziom tej chemokiny. Ponadto pasożyt zahamował
nieco wydzielanie IL-1, IL-12 i IL-6 stymulowanych przez chitozan, mimo że w czasie
kontrolnego zarażenia nie obserwuje się spadku produkcji tych cytokin. Poziom cytokin
regulatorowych, pomimo indukcji syntezy TGF-β przez pasożyta, nie uległ zmianie
względem myszy niezarażonych po podaniu chitozanu. W fazie mięśniowej następuje
zwiększenie produkcji MCP-1 i IL-6, a chitozan dodatkowo zwiększył poziom tych cytokin,
pomimo że u myszy niezarażonych (grupa Cht3) ich produkcja wróciła już w tym czasie do
poziomu kontrolnego. Indukcja IL-10 następuje w tym czasie zarówno pod wpływem
zarażenia, jak i chitozanu, i efekt ten nałożył się; produkcja IL-10 miała w grupie zarażonej
po chitozanie najwyższy poziom, 6-krotnie wyższy od fizjologicznego. Inaczej było w
przypadku IL-4; pomimo że chitozan zwiększał jej produkcję, w czasie zarażenia jej poziom
się nie zmienił.
98
6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie
5 dpz
5 dpz /Cht
30 dpz
30 dpz /Cht
500
*
pg/ml
400
300
*
*
*
200
*
*
100
*
*
0
MCP-1
IL-1β
IL-12
IL-4
TGF-β
IL-10
IL-6
Wykres 3.10 Wpływ chitozanu na poziom cytokin w płynie otrzewnowym myszy zarażonych
T. spiralis. Czerwoną kreską poziomą oznaczono poziom fizjologiczny. * oznaczono p<0,05
względem grupy z danego dpz bez chitozanu, n=5.
Tabela 3.8 Stężenie (pg/ml) ± SD cytokin w jamie otrzewnej myszy, którym podawano
chitozan. * oznaczono p<0,05 między grupami (zarażone vs niezarażone).
5 dpz/ Cht
Cht1
30 dpz/ Cht
Cht3
MCP1
*199,9 ± 25,3
93,8 ± 16,0
*146,2 ± 22,7
9,9 ± 3,6
IL-1β
*17,9 ± 0,6
23,9 ± 1,0
*27,0 ± 4,6
42,0 ± 4,7
IL-12
*209,3 ± 11,8
312,2 ± 29,5
181,5 ± 13,7
232,7 ± 33,7
IL-4
24,6 ± 7,3
23,6 ± 6,8
*28,6 ± 4,6
60,6 ± 5,0
TGF-β
359,7 ± 24,4
376,2 ± 29,1
14,0 ± 1,9
15,1 ± 1,4
IL-10
327,5 ± 31,0
282,8 ± 26,1
*70,8 ± 25,7
36,9 ± 6,7
IL-6
27,6 ± 5,2
39,3 ± 12,6
*99,4 ± 21,2
6,1 ± 0,8
6.3.2.2.2
Reakcja obwodowa w krwi
Chitozan wpłynął na odsetek komórek różnych populacji w krwi tylko w czasie fazy jelitowej
zarażenia (Wykres 3.11). Zwiększył się 2-krotnie odsetek monocytów i neutrofilów oraz
nieznacznie eozynofilów, ale zmiany te były na takim samym poziomie jak u myszy
niezarażonych (Tabela 3.9), choć samo zarażenie indukuje wzrost odsetka monocytów, a
zmniejsza liczbę eozynofilów w krwi. W fazie mięśniowej odsetek komórek we krwi był taki
99
6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie
sam w obu grupach myszy zarażonych; inwazja spowodowała wzrost odsetka eozynofilów i
chitozan nie zaburzył tego procesu.
5 dpz
%
100
5 dpz/Cht
30 dpz
30 dpz/Cht
80
*
60
40
20
*
*
*
0
Monocyty
Neutrofile
Eozynofile
Limfocyty
Wykres 3.11 Wpływ chitozanu na odsetek komórek różnych populacji w krwi myszy
zarażonych T. spiralis. Czerwoną kreską poziomą oznaczono poziom fizjologiczny.
* oznaczono p<0,05 względem grupy z danego dpz bez chitozanu, n=5.
Tabela 3.9 Odsetek ± SD komórek różnych populacji w krwi myszy, którym podawano
chitozan. * oznaczono p<0,05 między grupami (zarażone vs niezarażone).
5 dpz/ Cht
Cht1
30 dpz/ Cht
Cht3
Monocyty
13,5 ± 3,1
13,3 ± 3,0
10,5 ± 3,2
6,1 ± 1,7
Neutrofile
13,5 ± 3,2
17,5 ± 0,7
13,7 ± 1,3
14,1 ± 3,7
Eozynofile
1,3 ± 0,3
1,6 ± 0,3
*11,6 ± 2,9
4,4 ± 2,8
Limfocyty
49,9 ± 11,7
50,3 ± 8,2
60,7 ± 5,3
72,3 ± 7,0
Wpływ chitozanu na poziom cytokin w krwi myszy zarażonych obserwowany był tylko w
przypadku cytokin regulatorowych (Wykres 3.12). W fazie jelitowej polimer zwiększył aż
100-krotnie wydzielanie IL-10; silniej niż to miało miejsce u myszy niezarażonych
(Tabela 3.10), choć nie obserwuje się indukcji tej cytokiny przez samego pasożyta.
Równocześnie nie obserwowano zwiększonej produkcji TGF-β pod wpływem chitozanu;
zarażenie zahamowało ten proces. Efekt ten nie był obserwowany w fazie mięśniowej; w
czasie zarażenia następuje wtedy zmniejszenie wydzielania TGF-β, a chitozan zaindukował
produkcję tej cytokiny, choć słabiej niż u myszy niezarażonych.
100
6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie
5 dpz
5 dpz/Cht
30 dpz
30 dpz/Cht
9000
*
7500
*
pg/ml
6000
4500
3000
1500
0
IL-1
IL-6
IL-12
IL-4
IL-10
TGF-β
Wykres 3.12 Wpływ chitozanu na poziom cytokin w krwi myszy zarażonych T. spiralis.
Czerwoną kreską poziomą oznaczono poziom fizjologiczny. * oznaczono p<0,05 względem
grupy z danego dpz bez chitozanu, n=5.
Tabela 3.10 Stężenie (pg/ml) ± SD cytokin w krwi myszy, którym podawano chitozan.
* oznaczono p<0,05 między grupami (zarażone vs niezarażone).
5 dpz/ Cht
Cht1
30 dpz/ Cht
Cht3
IL-1
183,5 ± 20,5
202,3 ± 11,8
266,0 ± 28,1
251,0 ± 26,2
IL-6
1524,2 ± 262,6
1248,1 ± 25,3
553,1 ± 11,1
606,4 ± 55,4
IL-12
165,2 ± 62,8
196,2 ± 74,8
434,9 ± 22,9
404,1 ± 25,2
IL-4
35,2 ± 4,0
28,3 ± 5,3
55,8 ± 6,9
68,0 ± 15,9
IL-10
*6189,4± 551,9
3085,9 ± 152,0
514,9 ± 18,7
453,2 ± 39,5
TGF-β
*917,1 ± 113,8
5130,2 ± 391,3
*5952,2 ± 297,0
8163,4 ± 447,6
W czasie zarażenia T. spiralis obserwowano podobny wpływ chitozanu jak u myszy
niezarażonych. Do jamy otrzewnej w fazie jelitowej po podaniu chitozanu napływały
niedojrzałe monocyty, neutrofile i eozynofile oraz występowało wysokie stężenie cytokin
prozapalnych i regulatorowych. W fazie mięśniowej 3 tygodnie po podaniu chitozanu
obserwowano zahamowanie napływu komórek, jednak obecne w jamie otrzewnej komórki
reagowały na antygeny pasożytnicze; następowała produkcja cytokin (MCP-1, IL-6 i IL-10)
oraz ekspresja markerów powierzchniowych (MHC II, CD80 i IL-4R).
101
6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie
6.3.3
Dyskusja
Badano, jak chitozan wpływa na skuteczność odpowiedzi przeciwpasożytniczej wobec dwóch
gatunków nicieni: T. spiralis oraz H. polygyrus. Stan zapalny wywołany przez chitozan
(scharakteryzowany w Rozdziale 6.2) miał różny wpływ na poziom zarażenia; nie zmienił
liczby nicieni H. polygyrus, ale był korzystny dla T. spiralis. Większa liczba dorosłych form
T. spiralis dojrzewała w jelicie myszy, którym podawano chitozan. Mimo, że płodność samic
nie została zmieniona, to większa liczba nicieni dostarczała więcej larw L1, które migrowały
przez narządy. Efekt ten był widoczny 3 tygodnie później; ponad dwukrotnie więcej larw L1
izolowano z mięśni myszy, które otrzymały chitozan podczas fazy jelitowej zarażenia. Wzrost
liczby komórek w jamie otrzewnej pod wpływem chitozanu wskazuje, że dzięki jego
właściwościom chemotaktycznym komórki obronne gromadziły się raczej w miejscu podania
polimeru, a nie docierały do jelita czy nie podążały za migrującymi larwami. Mogło to
obniżyć poziom stanu zapalnego wokół larw, który zazwyczaj cechuje eozynofilia i napływ
komórek tucznych (Helmby & Grencis, 2002). W przypadku H. polygyrus, choć poziom
zarażenia nie został zmieniony pod wpływem polimeru, pojawiający się stan zapalny nie był
obojętny dla nicieni i zmienił ich płodność. Zaburzona była produkcja jaj in vivo, a także
in vitro, gdy nicienie nie znajdowały się już w żywicielu, w środowisku stanu zapalnego.
Komórki napływające do jamy otrzewnej pod wpływem chitozanu, choć reagowały na
stymulację in vitro, nie zapewniły ochrony przed T. spiralis. Możliwe, że chitozan był
silniejszym bodźcem dla komórek niż pasożyty, przez co usuwanie polimeru było
pierwszoplanowe dla migrujących komórek. Z tego powodu odpowiedź przeciwpasożytnicza
została zakłócona, być może przez zaburzenie równowagi immunologicznej. Usuwanie
dorosłych nicieni podczas fazy jelitowej zarażenia T. spiralis, zależy głównie od działania
komórek tucznych i limfocytów T CD4+, które są aktywowane przez cytokiny Th2-zależne;
IL-4 i IL-13 (Helmby & Grencis, 2002). Wykazano, że odpowiedź Th1 i Th2 hamują się
wzajemnie, tj. IL-12 zapobiega odpowiedzi Th2, która pośredniczy w usuwaniu pasożyta
(Finkelman et al., 1994), dlatego indukowana przez chitozan IL-12 mogła obniżyć obronną
odpowiedź Th2. Choć podczas zarażenia produkcja IL-12 była niższa niż w czasie podawania
polimeru u myszy niezarażonych, jej poziom był wyższy niż w stanie fizjologicznym
sugerując dominację odpowiedzi typu 1. Mogło to sprzyjać osiedlaniu się większej liczby
nicieni i doprowadzić do wydłużenia fazy jelitowej, co później przyczyniło się do wzrostu
liczby larw L1 w mięśniach. Dodatkowo, chitozan zaburzył pojawiający się w fazie
mięśniowej napływ komórek (makrofagów) do jamy otrzewnej. Prawdopodobnie było to
związane z chronicznym wysokim poziomem TGF-β, który mógł powodować bliznowacenie
102
6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie
tkanek (w tym błony otrzewnej, Lin et al., 1998, Yung et al., 2012), co ograniczyło później
migrację komórek w 30 dpz. Efekt ten był raczej lokalny, gdyż wzrost odsetka eozynofilów w
krwi nie został zmieniony przez chitozan. Wykazano, że makrofagi oraz monocyty i
produkowany przez nie NO odgrywają bardzo ważną rolę w czasie ustalania się poziomu
zarażenia w fazie mięśniowej; ich napływ koreluje ze zmniejszeniem liczby larw
mięśniowych między 20 a 60 dpz (Kołodziej-Sobocińska et al., 2006). Dlatego zahamowanie
napływu tych komórek oraz ich aktywności pro-zapalnej, o czym świadczy obecność
markerów alternatywnej aktywacji, i to pomimo wysokiej produkcji MCP-1, mogło się
dodatkowo przyczynić do wyższego poziomu zarażenia T. spiralis po podaniu chitozanu.
Odmiennie, w przypadku zarażenia H. polygyrus podawanie chitozanu w czasie zarażenia nie
wywołało tak silnego stanu zapalnego typu Th1. Dlatego nie została zakłócona odpowiedź
przeciwpasożytnicza i poziom zarażenia, zarówno w 6 jak i 22 dpz pozostały bez zmian. Co
ciekawe, niektóre badania wskazują, że zarażenia pasożytnicze mogą wpływać na zapalenie
otrzewnej, łagodząc objawy i zwiększając przeżywalność żywiciela (Sutherland et al., 2011).
W przeprowadzonym badaniu, także obserwowano hamujący wpływ nicieni na stan zapalny.
Zarażenie H. polygyrus istotnie zmniejszyło napływ monocytów i neutrofilów do jamy
otrzewnej wywoływany przez chitozan, pomimo bardzo wysokiego stężenia IL-6; cytokiny
rekrutującej neutrofile (Fielding et al., 2008). W fazie histotropowej nastąpiło także obniżenie
produkcji cytokin prozapalnych (MCP-1 i IL-12) i zwiększenie produkcji regulatorowej
IL-10, choć równocześnie spadek zaindukowanego przez chitozan TGF-β. Podobny wpływ
larw L4 obserwowany jest w czasie hamowania objawów nieswoistego zapalenia jelit (colitis)
czy eksperymentalnego zapalenia mózgu i rdzenia u myszy (EAE). W tkankach, w których
występuje stan zapalny, w czasie zarażenia już w 6 dpz wzrasta produkcja IL-6 i IL-10, co
koreluje z zahamowaniem objawów choroby (Donskow-Łysoniewska et al., 2012, 2013). Po
zakończeniu podawania chitozanu skład komórkowy powraca do poziomu fizjologicznego
dopiero po 3 tygodniach, a zarażenie H. polygyrus przyspieszyło ten proces; już w 2 tygodnie
od zakończenia podawania polimeru, u myszy zarażonych nie obserwowano napływu
komórek do jamy otrzewnej. Jednak ze względu na obniżoną podczas zarażenia liczbę
komórek w czasie podawania chitozanu, nie wiadomo czy efekt w 22 dpz wynika z
immunosupresyjnego działania form dorosłych pasożyta. Możliwe, że obniżony w 6 dpz stan
zapalny został szybciej zakończony i obserwowano raczej immunosupresyjny wpływ larw L4
niż stadiów dorosłych. W cytowanych wcześniej badaniach (Donskow-Łysoniewska et al.,
2012, 2013), obserwowano także wpływ stanu zapalnego na nicienie; w przypadku colitis
więcej pasożytów adaptowało się w żywicielu, a w czasie EAE mniej. Stan zapalny w
103
6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie
układzie pokarmowym (w jelicie grubym przy colitis) był korzystny dla nicienia; w
przypadku chitozanu podobny efekt obserwowano w czasie zarażenia T. spiralis. Larw L1,
które mogą migrować także przez jamę otrzewnej lub osiedlać się w okolicznych mięśniach
(np. w przeponie), było więcej po podaniu chitozanu, ale także więcej form dorosłych
zasiedliło jelito. Równocześnie jednak, w przypadku T. spiralis nie obserwowano
łagodzącego wpływu zarażenia na toczący się stan zapalny; napływ komórek do jamy
otrzewnej pod wpływem chitozanu był taki sam u myszy niezarażonych jak i w 5 dpz. Na
poziomie produkcji cytokin, zarażenie T. spiralis ograniczyło nieco produkcję IL-12
indukowaną przez chitozan, ale dodatkowo zwiększyło sekrecję chemokiny MCP-1. Wydaje
się, że większy potencjał w łagodzeniu peritonitis może mieć faza mięśniowa zarażenia, która
jak wykazano chroni myszy przed colitis (Ashour et al., 2013). W 30 dpz, choć pierwotny
stan zapalny wywołany przez polimer jest już złagodzony, obserwowano wzrost poziomu
IL-6 i IL-10 po chitozanie, co sugeruje że zapalenie otrzewnej zaindukowane w czasie już
rozwiniętej fazy mięśniowej mogło by być hamowane przez zarażenie.
W czasie zarażenia H. polygyrus obserwowano hamujący wpływ nicienia także na poziomie
ekspresji markerów powierzchniowych. Larwy L4 silnie wzbudziły ekspresję receptora dla
IL-4 na komórkach jamy otrzewnej oraz osłabiły hamujący wpływ chitozanu na poziom
markerów związanych z alternatywną aktywacją makrofagów. Natomiast w fazie jelitowej
fenotyp tych komórek jest bardzo podobny w czasie zarażenia jak i po długotrwałym
podawaniu polimeru i wykazuje cechy alternatywnej aktywacji. Choć wskazuje się, że AAMf
pełnią funkcje obronne w czasie zarażenia H. polygyrus (Anthony et al., 2006) ich indukcja
przez chitozan nie wpłynęła na poziom zarażenia.
Podawanie chitozanu indukuje napływ monocytów o niedojrzałym fenotypie, ale zarażenie
nicieniami wpływa na ekspresję markerów powierzchniowych i efekt ten jest zależny od
gatunku pasożyta. Zarówno H. polygyrus i T. spiralis zwiększają na tych komórkach
ekspresję MHC II, ale tylko H. polygyrus zdołał przełamać wpływ polimeru i zwiększyć
odsetek komórek pozytywnych, także tych o ekspresji cząsteczek ko-stymulacyjnych (CD80 i
CD86). Efekt stymulacji antygenami pasożyta był widoczny zarówno w 6 jak i 22 dpz. W
czasie zarażenia T. spiralis dopiero w fazie mięśniowej obserwowano stymulacyjny wpływ
pasożyta; zwiększył się odsetek komórek z ekspresją MHC II, a poziom CD86 był taki jak u
myszy zarażonych, a nie jak po podaniu polimeru. Ekspresja MHC II i prezentacja antygenu
jest kluczowa dla aktywacji limfocytów T i rozwoju odpowiedzi typu 2. W czasie fazy
jelitowej zarażenia T. spiralis zwiększa się ekspresja MHC klasy II w jelicie, między innymi
na makrofagach (F4/80+). Obecność komórek prezentujących antygen jest konieczna dla
104
6.3 Wyniki; wpływ chitozanu na zarażenie
reakcji obronnej w jelicie; myszy pozbawione komórek MHC II+ mają wydłużoną fazę
jelitową zarażenia, co jest związane z zaburzeniem kurczliwości jelit i brakiem ekspulsji
(Vallance et al., 1999). Zmiany w poziomie ekspresji MHC II wywołane przez chitozan w
jamie otrzewnej mogły mieć wpływ na zaburzenie reakcji komórek APC w jelicie, co
wpłynęło na obniżenie skuteczności odpowiedzi obronnej.
Także obniżenie poziomu ekspresji pozostałych markerów powierzchniowych przez chitozan
wystąpiło w czasie zarażenia T. spiralis. Wyjątkiem był receptor dla IL-4; w fazie jelitowej
następuje wzrost ekspresji tego markera i nie zostało to zahamowane przez polimer. Po
długotrwałym podawaniu chitozanu na monocytach wzrasta ekspresja markerów związanych
z alternatywną aktywacją i podobny fenotyp komórki te wykazywały w czasie zarażenia. W
fazie mięśniowej następuje silny wzrost ekspresji IL-4R i, podobnie jak w fazie jelitowej,
efekt ten został wzmocniony przez chitozan. Przy jednoczesnym spadku odsetka komórek
CD14+ wyniki te wskazują, że zarażenie T. spiralis w fazie mięśniowej wzmocniło
alternatywną aktywację monocytów wywołaną pierwotnie przez chitozan. Zwiększenie przez
chitozan produkcji IL-10 w płynie otrzewnowym i TGF-β w surowicy oraz aktywacja AAMf
mogły mieć korzystny wpływ na żywiciela; mogą świadczyć o uruchomieniu mechanizmów
gojenia tkanek, uszkadzanych przez wysoką liczbę migrujących i mięśniowych larw L1.
Wykazano, że migrujące larwy T. spiralis przy niedoborze IL-10 powodują silne patologie w
tkankach (Bliss et al., 2003), dlatego chitozan i indukowana pod jego wpływem produkcja
cytokin regulatorowych mogły sprzyjać hamowaniu patologii u żywiciela.
Podsumowując, stan zapalny wywołany podaniem chitozanu nie wzmocnił obronnych
mechanizmów typu Th2 w czasie zarażenia myszy nicieniami. Przeciwnie, w przypadku
T. spiralis aktywacja przez chitozan komórek w jamie otrzewnej znacznie zwiększyła poziom
zarażenia. Nie obserwowano adiuwantowych właściwości chitozanu przeciwko nicieniom
wywołującym odpowiedź Th2. Zaobserwowano jednak wpływ zarażenia nicieniami na
przebieg stanu zapalnego indukowanego przez chitozan. Wykazano, że zarażenie
H. polygyrus także w czasie peritonitis łagodzi przebieg stanu zapalnego już w fazie
histotropowej, podobnie jak to wykazywano dla innych chorób zapalnych. W przypadku
T. spiralis formy dorosłe nie hamowały objawów stanu zapalnego, jednak u tego pasożyta
silniejsze właściwości supresyjne obserwuje się w fazie mięśniowej.
Aktywacja przez chitozan komórek odpowiedzi wrodzonej była zmieniana pod wpływem
dodatkowego bodźca antygenowego jakim było zarażenie nicieniem. Dlatego dalej zbadano,
jak podanie chitozanu wpłynęło na elementy odpowiedzi nabytej, w tym specyficznej wobec
antygenów nicieni.
105
6.4 Wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą
6.4.1
Wprowadzenie
Aktywacja komórek odpowiedzi wrodzonej poprzedza wzbudzenie odpowiedzi nabytej, która
w przypadku zarażeń nicieniami jelitowymi charakteryzuje się polaryzacją Th2 zależną.
Aktywowane limfocyty T migrują ze śluzówki jelita do lokalnych węzłów limfatycznych już
w 2-4 dpz, gdzie produkują IL-4 i IL-13. Cytokiny te aktywują komórki efektorowe,
posiadające na swojej powierzchni receptor IL-4Rα, przyczyniając się do usuwania nicieni z
jelita. Egzogenne podawanie IL-4 i IL-13, nawet u myszy nieposiadających limfocytów T ani
B, jest wystarczające do obniżenia poziomu zarażenia, co świadczy o regulatorowej roli IL-4
i/lub IL-13 (Finkelman et al., 2004). Aktywują one m. in. limfocyty B powodując zwiększenie
na nich poziomu ekspresji MHC II oraz wydzielanie przeciwciał klasy IgE (Shimoda et al.,
1996). Pod wpływem IL-4 i IL-13 następuje też aktywacja eozynofilów i komórek tucznych
oraz zwiększa się aktywność komórek nabłonkowych i mięśniowych jelita (Liu et al., 2004).
Nie wszystkie te mechanizmy efektorowe są równocześnie niezbędne do usuwania T. spiralis
i H. polygyrus, jednak IL-4 i/lub IL-13 są konieczne dla reakcji obronnej (Patel et al., 2009).
W czasie zarażenia różnymi gatunkami nicieni obserwuje się także wzrost produkcji IgG1 i
IgE w surowicy oraz IgA w śluzówce jelita; zarówno przeciwciał specyficznych, jak i
całkowitych. Mechanizmy immunologiczne zależne od przeciwciał obniżają m. in. płodność
pasożytów, przyczyniając się do zmniejszania ilości form dyspersyjnych. Mają one jednak
zwykle ograniczony wpływ na osiedlanie się pasożytów przy pierwotnym zarażeniu (Harris &
Gause, 2011). Produkcja przeciwciał wiąże się z aktywacją limfocytów B, które odpowiadają
także za podtrzymywanie środowiska Th2; produkują cytokiny, które regulują odpowiedź
limfocytów T i innych komórek. Ponadto wykazano, że prezentacja antygenu przez komórki
B często skutkuje polaryzacją odpowiedzi limfocytów w kierunku Th2 (Lindell et al., 2008).
Indukcja mechanizmów Th2 jest skomplikowanym, wielopoziomowym procesem, zależnym
od wielu populacji komórek oraz antygenów patogenu. Jej podtrzymanie, szczególnie na
poziomie odpowiedzi nabytej, może w istotny sposób wpływać na obniżanie kondycji
pasożyta,
skracanie
fazy
chronicznej,
a
także
zwiększać
skuteczność
pamięci
immunologicznej (Holland et al., 2000).
Ze względu na lokalną aktywację komórek odpowiedzi wrodzonej po podaniu chitozanu
określono wpływ polimeru na przebieg odpowiedzi nabytej przeciwko pasożytom,
specyficznej wobec antygenów pasożytniczych, a także samego polimeru.
106
6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą
6.4.2
Wyniki
6.4.2.1 Wpływ chitozanu na odpowiedź limfocytów w MLN
Podanie chitozanu wpłynęło na odsetek limfocytów różnych populacji w MLN (Mesenteric
Lymph Nodes; krezkowe węzły limfatyczne), ale efekt ten był różny w czasie zarażenia
H. polygyrus i T. spiralis (Wykres 4.1).
W przypadku H. polygyrus wpływ chitozanu obserwowano tylko w fazie histrotropowej
zarażenia (Wykres 4.1a); wzrasta wtedy o 10% odsetek limfocytów CD4, a chitozan zmienił
tę kinetykę; obniżył odsetek limfocytów Th (CD4+), ograniczył też udział Tc
(cytotoksycznych, CD8+) oraz nieznacznie zwiększył odsetek limfocytów B (CD19+,
p=0,15). W fazie jelitowej zarażenia H. polygyrus odsetek limfocytów nie zmienił się pod
wpływem chitozanu.
W czasie inwazji T. spiralis wpływ chitozanu był także obserwowany tylko na początku
doświadczenia, jednak efekt ten był inny niż w przypadku H. polygyrus. Zarażenie T. spiralis
powoduje wzrost o 10% odsetka komórek CD8+, a chitozan znacznie wzmocnił to zjawisko i
komórki CD8 stanowiły połowę limfocytów w MLN (Wykres 4.1b). Ponadto chitozan
zwiększył też o 10% udział limfocytów Th. W fazie mięśniowej odsetek limfocytów po
chitozanie był taki, jak w kontrolnym zarażeniu.
6 dpz
%
a
6 dpz/Cht
22 dpz
22 dpz/Cht
40
30
*
*
20
10
0
CD4
CD8
CD19
107
6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą
b
5 dpz
%
60
5 dpz/Cht
30 dpz
30 dpz/Cht
*
50
*
40
30
20
10
0
CD4
CD8
CD19
Wykres 4.1 Wpływ chitozanu na odsetek różnych populacji limfocytów w MLN myszy
zarażonych a) H. polygyrus lub b) T. spiralis. Czerwoną kreską poziomą oznaczono poziom
fizjologiczny. * oznaczono p<0,05 wzg. danego dpz bez podawania chitozanu, n=5.
6.4.2.2 Wpływ chitozanu na proliferację limfocytów T CD4+ w MLN
Test CFSE umożliwia śledzenie podziałów komórkowych; barwnik fluorescencyjny CFSE
(ester karboksyfluoresceiny) łączy się z białkami cytosolu, a wraz z każdym podziałem
komórki słabnie intensywność jego świecenia. Obserwując „rozcieńczanie” CFSE w
komórkach potomnych można określać odsetek komórek ulegających podziałom, a także
liczbę podziałów, które przeszła każda komórka. Dodatkowo, znakując na komórkach
markery powierzchniowe, można określić proliferację różnych populacji komórek w
mieszanej hodowli. Komórki otrzymane z krezkowych węzłów limfatycznych myszy
zarażonych hodowano w obecności antygenów pasożytniczych lub chitozanu. Kontrole
stanowiły komórki niestymulowane, ulegające proliferacji spontanicznej, oraz hodowane w
obecności przeciwciał anty-CD3 i anty-CD28, które indukują silną proliferację komórek
poprzez aktywację TCR. Następnie oceniano poziom proliferacji limfocytów CD4+.
Podanie chitozanu istotnie wpłynęło na proliferację in vitro komórek CD4+ (Wykres 4.2). W
czasie zarażenia H. polygrus chitozan początkowo obniżył ilość podziałów komórek
niestymulowanych i w odpowiedzi na antygen form dorosłych (AgHp) oraz polimer in vitro
(HMW), jednak nie wpłynął istotnie na zdolność komórek do reakcji na stymulację TCR
(Wykres 4.2a). W fazie jelitowej zarażenia chitozan wpłynął tylko na proliferację komórek
stymulowanych anty-TCR, zwiększając o prawie 20% ich zdolność do podziału.
108
6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą
W czasie zarażenia T. spiralis efekt polimeru był obserwowany tylko w fazie jelitowej;
chitozan znacząco zmniejszył ilość podziałów komórek (Wykres 4.1b). Polimer obniżył
spontaniczną proliferację limfocytów oraz tę w odpowiedzi na antygen pasożytniczy (larwy
mięśniowe L1; AgL1) i polimer in vitro (HMW), a także znacznie osłabił ich reakcję na
stymulację TCR; indeks stymulowanej proliferacji był o ¼ niższy niż w czasie kontrolnego
zarażenia. W fazie mięśniowej obserwuje się zahamowanie zdolności proliferacyjnych
komórek CD4+; limfocyty nie proliferowały nawet po stymulacji TCR, a chitozan nie
wpłynął na ten proces.
a
DI
3
6 dpz
6 dpz/Cht
22 dpz/Cht
#
*
2,5
2
1,5
22 dpz
#
*
#
#
*
*
1
0,5
0
RPMI
b
5 dpz
DI
3,5
5 dpz/Cht
AgHp
30 dpz
HMW
30 dpz/Cht
#
3
2,5
2
a-TCR
*
#
* # #
*
1,5
#
*
1
0,5
0
RPMI
a-TCR
AgL1
HMW
Wykres 4.2 Wpływ chitozanu na proliferację limfocytów CD4+ myszy zarażonych
a) H. polygyrus lub b) T. spiralis. * oznaczono p<0,05 wzg. danego dpz bez podawania
chitozanu, # oznaczono p<0,05 wzg. komórek niestymulowanych (RPMI) w danej grupie,
n=8.
109
6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą
6.4.2.3 Odpowiedź limfocytów w płynie otrzewnowym
Chitozan istotnie wpłynął na skład limfocytów w jamie otrzewnej myszy zarażonych
nicieniami (Wykres 4.3).
W fazie histotropowej zarażenia H. polygyrus nie następuje istotny napływ limfocytów do
jamy otrzewnej, ale podanie chitozanu spowodowało silną migrację komórek CD4 i CD8,
jednocześnie zmniejszając o połowę populację komórek CD19 (Wykres 4.3a). W fazie
chronicznej, następuje migracja limfocytów CD19 i CD4 do jamy otrzewnej i zjawisko to
zostało przez chitozan zatrzymane.
W inwazji T. spiralis obserwowano podobny wpływ polimeru (Wykres 4.3b). W fazie
jelitowej zarażenia T. spiralis obserwuje się napływ limfocytów B. Podanie chitozanu
zmieniło tę dynamikę; polimer zahamował migrację komórek B, ale zwiększył 4-krotnie
udział limfocytów CD4 i CD8. W fazie mięśniowej zarażenia następuje napływ wszystkich
populacji limfocytów, co zostało zahamowane przez chitozan.
6 dpz
a
6 dpz/Cht
22 dpz
22 dpz/Cht
2
*
komórki x106
1,6
1,2
0,8
0,4
*
*
*
*
0
CD19
CD4
CD8
110
6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą
5 dpz
b
5 dpz/Cht
30 dpz
30 dpz/Cht
6
komórki x106
5
4
3
2
1
*
*
*
*
*
*
0
CD19
CD4
CD8
Wykres 4.3 Wpływ chitozanu na napływ limfocytów do jamy otrzewnej myszy zarażonych
a) H. polygyrus lub b) T. spiralis. Czerwoną kreską oznaczono poziom fizjologiczny komórek
(u myszy niezarażonych). * oznaczono p<0,05 wzg. danego dpz bez podawania chitozanu,
n=4.
Chitozan zaburzył także równowagę między limfocytami B1 i B2 w jamie otrzewnej, w której
w warunkach fizjologicznych te pierwsze stanowią ponad 60% limfocytów CD19
(Wykres 4.4a i b).
W fazie jelitowej zarażenia T. spiralis i histotropowej oraz jelitowej H. polygyrus nie
obserwuje się zmian w odsetku i liczbie komórek B1 (IgD+IgM+) i B2 (IgD+). Podanie
chitozanu powodowało na początku doświadczeń zmniejszenie liczebności obu populacji oraz
odwrócenie ich proporcji; większość, 65-80% komórek B stanowiła populacja B2. Z czasem
odsetek komórek zaczął powracać do stanu kontrolnego, ale nie osiągnął go nawet 2 tygodnie
po podaniu. Choć odbudowała się populacja komórek B2, liczebność limfocytów B1 nie
osiągnęła stanu fizjologicznego, mimo że po zarażeniu zwiększała się liczba tych komórek.
W fazie mięśniowej zarażenia T. spiralis następuje wyrównanie udziału komórek B1 i B2 i
taki sam odsetek tych komórek obserwowano po 2-3 tygodniach od podania chitozanu, także
u myszy zarażonych H. polygyrus. Jednak podawanie chitozanu silnie zaburzyło zwiększanie
liczebności komórek obu populacji, szczególnie u myszy w fazie mięśniowej zarażenia
T. spiralis.
111
6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą
a
6 dpz
6 dpz/Cht
22 dpz
22 dpz/Cht
0,4
(71)
komórki x106
0,3
(70)
0,2
*
(52**)
*
0,1
(29) (48**)
(30)
*
(86*)
(14*)
0
B1
5 dpz
b
B2
5 dpz/Cht
2
30 dpz
30 dpz/Cht
(45)
(55)
komórki x106
1,6
1,2
*
*
(60)
0,8
(65)
0,4
(40)
*
(35*)
(35)
(65*)
0
B1
B2
Wykres 4.4 Wpływ chitozanu na liczbę i odsetek limfocytów B1 i B2 w płynie otrzewnowym
myszy zarażonych a) H. polygyrus lub b) T. spiralis. W nawiasach podano odsetek populacji.
Czerwoną kreską oznaczono poziom fizjologiczny komórek (u myszy niezarażonych).
* oznaczono p<0,05, ** oznaczono p<0,1 wzg. danego dpz bez podawania chitozanu, n=4.
6.4.2.4 Wpływ chitozanu na produkcję przeciwciał
Określano wpływ chitozanu na wydzielanie przeciwciał 3 klas: IgG1 i IgE w krwi oraz IgA w
płynie otrzewnowym. Metodą ELISA mierzono poziom immunoglobulin specyficznych
wobec antygenów nicieni. Dodatkowo, określano masę cząsteczkową rozpoznawanych
epitopów antygenów metodą Western blot.
112
6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą
6.4.2.4.1
Poziom specyficznych przeciwciał IgG1 i IgE
Podanie chitozanu nie wpłynęło istotnie na poziom specyficznych IgG1 i IgE w krwi myszy
zarażonych (Wykres 4.5a i b). Zarówno w czasie zarażenia T. spiralis jak i H. polygyrus
poziom przeciwciał tych dwóch klas nie zmienił się pod wpływem podawania chitozanu, ani
na początku doświadczenia ani po 2-3 tygodniach od podawania polimeru.
a
OD
1,6
6 dpz
6 dpz/Cht
22 dpz
22 dpz/Cht
1,2
0,8
0,4
0
IgG1
b
OD
2,5
5 dpz
IgE
5 dpz/Cht
30 dpz
30 dpz/Cht
2
1,5
1
0,5
0
IgG1
IgE
Wykres 4.5 Wpływ chitozanu na poziom IgG1 (rozcieńczenie 400x) i IgE (rozcieńczenie 20x)
specyficznych wobec antygenów nicieni a) form dorosłych w czasie zarażenia H. polygyrus
lub b) L1 w czasie zarażenia T. spiralis w krwi, n=4.
113
6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą
6.4.2.4.2
Poziom i specyficzność przeciwciał IgA oznaczany metodą ELISA
Podanie chitozanu zwiększyło poziom otrzewnowej IgA u myszy zarażonych T. spiralis i
H. polygyrus we wszystkich badanych dniach po zarażeniu (Wykres 4.6a i b). Efekt ten był
silniejszy w chronicznej fazie zarażeń; 2-3 tygodni po podaniu chitozanu, gdy poziom
przeciwciał był 2-krotnie wyższy po chitozanie.
Obserwowano wyższy poziom przeciwciał rozpoznających antygeny obu gatunków nicieni, a
także zmienił się współczynnik korelacji poziomu przeciwciał z liczbą nicieni. W przypadku
zarażenia H. polygyrus wpływ chitozanu obserwowano tylko w fazie chronicznej zarażenia;
polimer wywołał bardzo silną negatywną korelację (r22dpz= 0,11, r22dpz/Cht= -0,98). W fazie
jelitowej zarażenia T. spiralis chitozan zwiększył korelację między produkcją przeciwciał i
poziomem zarażenia (współczynnik korelacji Pearsona r5dpz= 0,16, r5dzp/Cht= 0,65). Jeszcze
silniejszy efekt był obserwowany w fazie mięśniowej; w kontrolnym zarażeniu występuje
słaba negatywna korelacja ilości przeciwciał i liczby larw L1 (r30dpz= -0,65), a podanie
chitozanu odwróciło tę zależność (r30dpz/Cht= 0,77).
Istotność statystyczna (p<0,05) dla korelacji Pearsona przy df=3 występuje, gdy r>0,87 lub
r<-0,87.
a
OD
6 dpz
6 dpz/Cht
0,5
22 dpz
22 dpz/Cht
*
0,4
0,3
0,2
*
0,1
0
114
6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą
b
OD
1
5 dpz
5 dpz/Cht
30 dpz
30 dpz/Cht
*
*
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Wykres 4.6 Wpływ chitozanu na poziom otrzewnowej IgA specyficznej wobec antygenów
nicieni a) form dorosłych w czasie zarażenia H. polygyrus lub b) L1 w czasie zarażenia T.
spiralis. * oznaczono p<0,05 wzg. danego dpz bez podawania chitozanu, n=4.
Zaobserwowano, że chitozan indukuje produkcję IgA rozpoznającej sam polimer. U myszy
niezarażonych, którym podawano chitozan stwierdzono produkcję IgA rozpoznającej
zarówno antygeny nicieni i chitozan już na początku doświadczenia i efekt ten utrzymywał się
do jego końca (Wykres 4.7). Rozpuszczalnik chitozanu, kwas adypinowy, nie wpłynął istotnie
na poziom IgA.
K
OD
2,5
Cht1
Cht3
AdOH
*
2
*
1,5
1
*
*
*
*
0,5
0
Hp
Ts
HMW
Wykres 4.7 Wpływ chitozanu na poziom otrzewnowej IgA specyficznej wobec nicieni
H. polygyrus (Hp) i T. spiralis (Ts) oraz polimeru (HMW) u myszy niezarażonych.
* oznaczono p<0,05 wzg. K, n=4.
115
6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą
6.4.2.4.3
Specyficzność przeciwciał IgA oznaczana metodą Western blot
Specyficzność otrzewnowych IgA indukowanych przez chitozan oceniano metodą Western
blot; określano jakie antygeny form dorosłych H. polygyrus oraz larw mięśniowych L1
T. spiralis są rozpoznawane przez otrzewnowe IgA myszy z różnych grup badanych
(Zdjęcie 4.1 i Tabela 4.1).
a)
kDa
M
Hp
b)
Ts
Hp
c)
Ts
Hp
d)
Ts
Hp
Ts
100
70
50
40
35
25
15
Zdjęcie 4.1 Białka antygenu somatycznego form dorosłych H. polygyrus (Hp) i larw L1
T. spiralis (Ts) rozpoznawane przez IgA pochodzące od myszy a) niezarażonych, 3 tygodnie
po podawaniu chitozanu (Cht3), b) zarażonych H. polygyrus w 22 dpz lub c) zarażonych
T. spiralis w 30 dpz, analizowane metodą Western blot oraz d) reszty acetylo-glukozaminy w
antygenach nicieni rozpoznawane przez lektynę WGA. M- marker wielkości białek wyrażonej
w kDa.
Wykazano, że IgA od myszy niezarażonych, którym podawano 3 tygodnie wcześniej chitozan
(grupa Cht3), rozpoznaje epitopy antygenów nicieni; więcej prążków obserwowano w
116
6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą
antygenie T. spiralis niż H. polygyrus (Zdjęcie 4.1a). Antygen H. polygyrus jest słabiej
rozpoznawany przez IgA; w czasie zarażenia powstaje niewiele specyficznych przeciwciał tej
klasy (8 prążków), w odróżnieniu od antygenu larw mięśniowych T. spiralis (21 prążków).
Jednak w przypadku obu gatunków stwierdzono wiele białek glikolizowanych (reszty acetyloglukozaminy; H. polygyrus 16 prążków, T. spiralis 18 prążków).
W antygenie dorosłych H. polygyrus IgA indukowane przez chitozan rozpoznawały tylko
jedno białko, o masie 65 kDa, wykrywane także przez IgA zwierząt zarażonych, które było
krzyżowo rozpoznane przez IgA myszy zarażonych T. spiralis oraz lektynę WGA, co
świadczy o obecność reszt acetylo-glukozaminy w tym białku (Tabela 4.1). W antygenie
T. spiralis IgA indukowane przez polimer rozpoznawały więcej białek (15 prążków), w tym
białko o masie ok. 65 kDa, podobne jak w antygenie H. polygyrus, widoczne także w
naturalnym zarażeniu, posiadające reszty acetylo-glukozaminy. Pozostałe IgA indukowane
przez chitozan rozpoznawały w antygenie T. spiralis szereg białek o masie 30-40 kDa, z
których większość rozpoznawana była w naturalnym zarażeniu oraz przez lektynę WGA.
Tabela 4.1 Masy cząsteczkowe (kDa) białek antygenów H. polygyrus i T. spiralis
rozpoznawanych przez IgA z płynu otrzewnowego od myszy z różnych grup (Ts- T. spiralis
30 dpz, hp- H. polygyrus 22 dpz, Cht- 3 tygodnie po podaniu chitozanu) oraz lektynę WGA.
PO
Ag
Ts
Hp
Cht
T. spiralis
WGA
Hp
Ts
Cht
H. polygyrus
192,0
154,9
WGA
196,9
174,0
149,1
126,7
126,3
124,6
121,8
109,9
93,0
95,1
85,5
66,7
64,7
94,1
65,7
57,1
82,6
66,3
70,6
65,9
59,0
56,5
52,0
49,9
82,7
83,7
73,2
64,9
65,1
63,5
57,7
54,1
52,2
117
6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą
48,2
47,1
44,1
43,5
42,4
40,2
37,1
33,8
30,4
44,0
41,6
40,1
37,1
33,6
40,4
39,7
38,4
35,6
33,6
30,6
40,3
38,3
36,0
39,1
34,9
29,1
27,4
24,4
23,0
21,5
20,0
17,8
16,2
6.4.3
28,6
26,8
24,6
21,8
20,1
17,9
15,0
28,9
23,5
24,5
21,2
18,8
17,2
15,3
15,3
Dyskusja
Określono wpływ chitozanu na mechanizmy odpowiedzi nabytej, tj. proliferację limfocytów
T oraz odpowiedź limfocytów B i produkcję przeciwciał.
Chitozan nie wpływał na poziom zarażenia H. polygyrus, jednak zaburzył naturalną
odpowiedź limfocytów na zarażenie. W fazie histotropowej inwazji obserwuje się
zwiększenie odsetka komórek CD4+ w MLN; podanie chitozanu zablokowało to zjawisko.
Mogło to być związane z obniżoną zdolnością tych komórek do proliferacji; zarówno
spontanicznej jak i po aktywacji TCR. Jednak zmniejszony odsetek komórek CD8 oraz
niewielki wzrost odsetka limfocytów B sugeruje napływ do lokalnych węzłów limfatycznych
innych, nie identyfikowanych komórek z pobudzonych tkanek, tj. jamy otrzewnej.
Pojawiające się w niej pod wpływem chitozanu monocyty i/lub inne komórki (Rozdział 6.3)
mogą po aktywacji migrować do MLN, gdzie będą funkcjonować jako APC i aktywować
specyficzne limfocyty T. Te z kolei opuszczą węzeł i będą migrować do tkanek, w których
występuje stan zapalny i wysokie stężenie chemokin/cytokin (Stein & Nombela-Arrieta,
2005). Było to obserwowane w prezentowanym doświadczeniu; do jamy otrzewnej napłynęły
limfocyty CD4+ i CD8+. Równocześnie po podaniu chitozanu u myszy zarażonych
118
6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą
H. polygyrus obserwowano wysokie stężenie IL-6 w jamie otrzewnej. Wykazano, że cytokina
ta nie tylko hamuje apoptozę limfocytów T, sprzyja ich proliferacji (Ayroldi et al., 1998), ale
także polaryzuje je w kierunku Th2 (Rincón et al., 1997). Napływowe limfocyty mogły w
tych warunkach dłużej przeżywać i/lub proliferować. U myszy zarażonych H. polygyrus pod
wpływem chitozanu obserwowano najsilniejszy wśród badanych grup napływ limfocytów
CD8+ do jamy otrzewnej, przy równocześnie mniejszym udziale procentowym pozostałych
komórek (neutrofilów i monocytów, Rozdział 6.3, ale też CD4+). U pacjentów, u których
przeprowadza się dializy otrzewnowe stwierdza się w jamie otrzewnej liczne limfocyty Tc,
które charakteryzują się aktywacją typu 2; produkują IL-4, IL-5, IL-6 i IL-10. Wzmacniają
one produkcję przeciwciał przez limfocyty B oraz mają obniżone właściwości cytotoksyczne
(Wang et al., 2003). Podobny fenotyp mogły mieć limfocyty CD8 indukowane przez
chitozan. Możliwe, że zarażenie H. polygyrus w czasie podawania chitozanu łagodzi stan
zapalny wcześniej wywołany przez polimer poprzez przełączanie odpowiedzi z Th1 zależnej
na Th2/Treg także z udziałem komórek Tc. Wykazano także, że H. polygyrus indukuje
komórki CD8+, które odpowiadają za hamowanie objawów colitis (Metwali et al., 2006),
więc również te komórki mogły brać udział w immunomodulacji podczas peritonitis.
W czasie zarażenia T. spiralis środowisko cytokinowe w jamie otrzewnej po podaniu
chitozanu było inne; występowało wysokie stężenie IL-12, IL-6 i TGF-β. Wykazano, że IL-6
w połączeniu z TGF-β jest czynnikiem stymulującym dojrzewanie limfocytów Th17 (Korn et
al., 2009). Ta subpopulacja limfocytów obserwowana jest w czasie różnych chorób
autoimmunizacyjnych, ale uważa się że odpowiada za usuwanie patogenów (głównie bakterii
i grzybów) w nabłonkach. Komórkami efektorowymi związanymi z odpowiedzią Th17 są
między innymi neutrofile oraz limfocyty B produkujące IgM i IgA. Komórki te pojawiały się
licznie po podaniu chitozanu myszom kontrolnym oraz w czasie zarażenia T. spiralis.
Natomiast w przypadku H. polygyrus obserwowano słabszy napływ tych komórek, co było
prawdopodobnie związane z niskim poziomem TGF-β; IL-6 towarzyszyła produkcja IL-10.
W czasie peritonitis obserwuje się hamowanie proliferacji limfocytów T oraz zwiększony
udział komórek B w węzłach limfatycznych i krwi (Gore, 2014). Podanie chitozanu wywołało
podobny efekt, zarówno u myszy zarażonych H. polygyrus i T. spiralis. W przypadku
H. polygyrus pomimo supresji odpowiedzi limfocytów CD4+ w MLN na stymulację, nie
zaobserwowano wpływu chitozanu na poziom zarażenia. Jednak fazie histotropowej zarażenia
obserwuje się hamowanie proliferacji komórek w MLN (Donskow-Schmelter et al., 2007)
pod wpływem pasożyta, dlatego niewykluczone, że zaburzenie tego mechanizmu przez
119
6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą
chitozan nie miało wpływu na adaptację pasożyta. Inaczej było w czasie zarażenia T. spiralis;
w fazie jelitowej limfocyty w MLN intensywnie proliferują i areaktywność tych komórek
wywołana przez chitozan istotnie wpłynęła na obronność żywiciela. Wykazano, że u
szczepów myszy odpornych na zarażenie T. spiralis limfocyty MLN silniej proliferują (Zhu et
al., 1990). Zahamowanie odpowiedzi proliferacyjnej komórek mogło zatem wpłynąć na
poziom odpowiedzi Th2 i przez to obniżyć jej skuteczność. Jednak proliferację limfocytów
CD4+ oznaczano w zawiesinie komórek MLN, w których znajdują się różne populacje;
limfocyty T i B, ale także takie komórki jak makrofagi, DC i inne, które mogą zarówno
wzbudzać jak i hamować aktywność limfocytów. Dlatego na podstawie otrzymanych
wyników nie można stwierdzić z jakich mechanizmów wynikał hamujący wpływ chitozanu
na proliferację limfocytów.
Po dłuższym czasie od podania chitozanu (2-3 tygodni), zarówno u myszy zarażonych
H. polygyrus jak i T. spiralis, nie obserwowano znacznego wpływu polimeru na odpowiedź
limfocytów w MLN. Zarówno odsetek, jak i proliferacja komórek CD4+ były takie, jak w
kontrolnym zarażeniu, co sugeruje, że wpływ chitozanu na limfocyty był krótkotrwały.
Jednak, podobnie jak to obserwowano w Rozdziale 6.3, w 2 i 3 tygodniu po podaniu polimeru
napływ komórek do jamy otrzewnej (makrofagów, monocytów i eozynofilów) był zaburzony.
W czasie zarażenia H. polygyrus i T. spiralis obserwuje się napływ do jamy otrzewnej
limfocytów B i Th, a wcześniejsze podanie chitozanu uniemożliwiło ten proces, co mogło być
związane z zaburzoną funkcją komórek mezotelialnych otrzewnej, jak to się obserwuje w
czasie peritonitis (Yung et al., 2012).
Chitozan wpłynął także na odpowiedź limfocytów B. W czasie inwazji obu pasożytów pod
wpływem polimeru zmniejszyła się liczba komórek CD19 w jamie otrzewnej. Mogło być to
związane z migracją lub apoptozą komórek populacji B1, której odsetek znacznie się
zmniejszył. Limfocyty B1 i B2 różnią się fenotypem, pochodzeniem oraz pełnionymi
funkcjami. Komórki subpopulacji B2 powstają w szpiku kostnym i migrują między krwią a
obwodowymi narządami limfatycznymi, gdzie uczestniczą w odpowiedzi humoralnej zależnej
od limfocytów T. Zachodzi u nich przełączanie klas przeciwciał, charakteryzują się ich dużą
zmiennością oraz rozwijają się w komórki pamięci. Z kolei limfocyty B1 uważa się za
element odpowiedzi wrodzonej; powstają w czasie życia płodowego i lokalizują się płynach
surowiczych, gdzie ich populacja jest odnawiana głównie przez lokalną proliferację
(Hayakawa et al., 1986). Produkują przeciwciała klasy IgM o ograniczonej, choć wielorakiej
specyficzności i małym powinowactwie, nazywane „naturalnymi”. Część z nich jest
120
6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą
autospecyficzna, ale rozpoznają także wzorce molekularne patogenów, szczególnie te o
powtarzającej się strukturze, jak DNA czy LPS (Tangye, 2013). Limfocyty B1 umożliwiają
szybką reakcję na patogen; już 1 dzień po aktywacji produkują przeciwciała (Itakura et al.,
2005), podczas gdy rozwinięcie odpowiedzi nabytej limfocytów B2 wymaga tygodni (Martin
& Kearney, 2001). Limfocyty B1 po aktywacji intensywniej migrują poza jamę otrzewnej niż
B2 (Moon et al., 2012) między innymi w odpowiedzi na stymulację przez TLR (Ha et al.,
2006). Podanie chitozanu także spowodowało intensywną migrację komórek B1 z jamy
otrzewnej, a efekt ten był silniejszy w czasie zarażenia H. polygyrus, u których zmniejszyła
się także populacja B2. Ponadto u tych myszy populacja B1 nie odbudowała się nawet po
2 tygodniach od podania polimeru mimo, że pasożyt nieznacznie zwiększa wtedy liczbę tych
komórek. W czasie zarażenia T. spiralis ubytek komórek B1 był mniejszy, ale po
3 tygodniach również dominowała populacja B2. W tym czasie, w fazie mięśniowej
obserwuje się w jamie otrzewnej wzrost liczby limfocytów B obu populacji. Indukcję
limfocytów B obserwuje się także w czasie zarażeń innymi helmintami; liczba komórek B1 w
jamie otrzewnej zwiększa się w odpowiedzi na antygeny cukrowe Schistosoma mansoni
(Velupillai et al., 1997) czy zarażenie filarią (Ramalingam et al., 2003). Podawanie chitozanu
w
perspektywie
długoterminowej
zaburzyło
zatem
napływ
komórek
B2
oraz
proliferację/apoptozę limfocytów B1 w odpowiedzi na stymulację antygenową (zarażenie).
Migracja aktywowanych przez chitozan limfocytów poza jamę otrzewnej, szczególnie
komórek B1, może się wiązać z silną produkcją IL-10 w narządach obwodowych (Maseda et
al., 2013), co mogło także wpływać na obniżenie proliferacji limfocytów CD4+ obserwowane
w MLN. Zaburzenie odpowiedzi limfocytów w jamie otrzewnej było długotrwałe, jednak nie
wiązało się ze zmianą odsetka komórek B w lokalnych węzłach limfatycznych 2 i 3 tygodnie
po podaniu chitozanu, również w odpowiedzi na zarażenie. Dlatego wydaje się, że
długotrwały wpływ chitozanu na odpowiedź komórek w jamie otrzewnej związany był raczej
z zaburzoną homeostazą i migracją komórek w tym miejscu. Wszystkie populacje komórek
indukowanych w fazie chronicznej zarażeń (makrofagi, monocyty, eozynofile, limfocyty Th,
Tc i B) po zaprzestaniu iniekcji chitozanu słabiej migrowały do jamy otrzewnej.
Podanie chitozanu i wywołana przez to zmiana odpowiedzi limfocytów B miały wpływ na
produkcję przeciwciał, ale tylko lokalnej IgA, jednak już od początku doświadczenia (w 5 i 6
dpz, ok. 10 dni po pierwszym podaniu polimeru). Zwiększone miano przeciwciał tej klasy
wiązało się z indukcją Ig krzyżowo rozpoznających zarówno antygeny nicieni, jak i sam
polimer, również u myszy niezarażonych. Przeciwciała klasy IgA są głównym komponentem
odpowiedzi humoralnej w śluzówkach, a w jelicie plazmocyty wydzielające IgA pochodzą
121
6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą
zarówno z jamy otrzewnowej (komórki B1) jak z prekursorów ze szpiku (komórki B2)
zasiedlających kępki Peyer’a (Kroese et al., 1989). Wykazano, że IgA jest też ważnym
czynnikiem umożliwiającym rozwój tolerancji wobec bakterii komensalnych zasiedlających
jelito i pojawia się niezależnie od limfocytów T, ale dopiero w odpowiedzi na stymulację
antygenem. Dlatego uważa się, że IgA, nawet produkowane przez limfocyty B1, nie
reprezentują „naturalnych” przeciwciał (Macpherson et al., 2000). Limfocyty B2 IgA+
aktywowane w kępkach Peyer’a migrują do krezkowych węzłów limfatycznych, gdzie
przekształcają się w plazmocyty, które następnie migrują do lamina propria jelita cienkiego
(Fagarasan & Honjo, 2003), a produkcję IgA indukuje IL-6 (Beagley et al., 1989). Natomiast
komórki B1 aktywowane m. in. poprzez TLR mogą opuszczać jamę otrzewnej i bezpośrednio
zasiedlać śluzówkę jelita lub migrować do śledziony (Ha et al., 2006), a przełączanie klas
przeciwciał z IgM na IgA zachodzi pod wpływem IL-5 produkowanej przez limfocyty Th
(Bao et al., 1998) oraz TGF-β (Roy et al., 2013). Ilość komórek B1 IgA+ w jamie otrzewnej
myszy różni się między szczepami i jest mała u myszy C57Bl6 (<1%), których użyto w
doświadczeniach (Beagley et al., 1995). W prezentowanych doświadczeniach nie jest jednak
możliwe wykazanie, która populacja limfocytów B była źródłem IgA indukowanej przez
chitozan.
Jednak
indukcja
IL-6
przy
niewykrywalnym
poziomie
IL-5
(wyniki
nieprzedstawione; w każdej z grup badanych poziom IL-5 był poniżej progu detekcji
stosowanego testu ELISA) w jamie otrzewnej, może sugerować ważniejszą rolę komórek B2
w sekrecji IgA.
Podanie chitozanu już po 10 dniach wzbudziło produkcję IgA zarówno u myszy kontrolnych
jak i zarażonych nicieniami, a efekt ten utrzymywał się przez cały czas doświadczenia.
Przeciwciała te rozpoznawały białka pasożytów, z których wiele ma w swojej strukturze
reszty acetylo-glukozaminy, ale także sam polimer. IgA o krzyżowej specyficzności była
wykrywana zarówno w płynie otrzewnowym, jak i homogenacie śluzówki jelita cienkiego
(wyniki nieprzedstawione).
W czasie zarażenia H. polygyrus obserwuje się wzrost produkcji całkowitej IgG1 i IgA, z
której część jest specyficzna wobec nicieni i w dużym stopniu warunkuje obronność w fazie
jelitowej
zarażenia.
Wykazano,
że
surowicza
IgG1
zapewnia
bierną
odpowiedź
przeciwpasożytniczą (Ben-Smith et al., 1999), ale znacznie mniej wiadomo o roli IgA w
reakcji na zarażenie H. polygyrus. Zaobserwowano, że więcej komórek produkujących IgA w
kępkach Peyer’a i MLN występuje u myszy odpornych na zarażenie, natomiast u szczepów
wrażliwych wzrasta produkcja tej Ig w surowicy (Monroy & Enriquez, 1992). IgA
122
6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą
specyficzne wobec nicienia rozpoznaje niewiele antygenów, wśród których znajdują się
białka Venom Allergen Like (VAL) zawierające reszty cukrowe. Białka te okazały się
skutecznym antygenem szczepionkowym, obniżającym poziom zarażenia (Hewitson et al.,
2011). Wśród antygenów o podobnej masie cząsteczkowej (ok. 65 kDa) znajduje się także
Glycan B (HM-65); epitop nie będący białkiem, ale zawierający fosfatydylo-serynę, który
wykrywany jest wewnątrz nicienia (Hewitson et al., 2011). Podanie chitozanu myszom
niezarażonym powodowało pojawianie się IgA rozpoznającej w antygenie H. polygyrus
epitop o podobnej masie (65 kDa), a poziom całkowitej specyficznej IgA u myszy zarażonych
wzrósł, więc możliwe jest, że w czasie zarażenia nicieniem po podaniu chitozanu pojawiły się
dodatkowe przeciwciała rozpoznające struktury pasożyta. Choć zwiększenie ilości IgA
specyficznej wobec nicienia nie skutkowało obniżeniem poziomu zarażenia, obserwowano
zmiany w produkcji jaj. Może to wskazywać, że mechanizmy zależne od IgA uszkadzające
ciało pasożyta, mogły być nieznacznie wzmocnione pod wpływem chitozanu. Co ciekawe
podobny epitop (65 kDa) został krzyżowo rozpoznany przez IgA myszy zarażonych
T. spiralis co wskazuje, że białko to może być strukturą konserwowaną ewolucyjnie. Ponadto,
po podaniu chitozanu, zarówno u myszy kontrolnych jak i zarażonych, obserwowano
obecność IgA rozpoznającej sam polimer, co może wskazywać, że epitop o masie 65 kDa
może
mieć
podobną
do
chitozanu,
powtarzającą
się
strukturę
lub
reszty
N-acetylo-glukozaminy.
W antygenie larw mięśniowych T. spiralis IgA zaindukowana przez chitozan rozpoznawała
więcej epitopów, jednak dominowały wśród nich białka o małej masie cząsteczkowej (15-40
kDa), z których większość miała reszty N-acetylo-glukozaminy. Widoczny był także
glikozylowany prążek o masie 65 kDa, podobnie jak w antygenie H. polygyrus. Podobne
epitopy były rozpoznawane przez surowiczą IgG w antygenie somatycznym oraz wydalniczowydzielniczym larw mięśniowych L1, jednak nie wszystkie zostały zidentyfikowane (Cui et
al., 2013). Wykazano jednak, że białka o masie ok. 40 kDa należą do rodziny
deoksyrybonukleazy II, natomiast wśród białek o masie ok. 62-70 kDa zidentyfikowano
proteazy serynowe. W antygenie somatycznym mogą się znajdować białka wydalniczowydzielnicze, wśród których IgA indukowane przez chitozan mogły rozpoznawać białka
21 kDa ES i 45 kDa antigen (Robinson et al., 2005, 2007). Wykazano, że przeciwciała
przeciwko proteazie serynowej T. spiralis obniżają liczbę nicieni wszystkich stadiów w czasie
zarażenia następującego po podaniu rekombinowanego białka (Wang et al., 2013). Wśród
białek larw mięśniowych T. spiralis licznie występują antygeny TSL-1 (Trichinella spiralis
larvae 1), które są bardzo immunogenne i charakteryzują się obecnością nietypowej reszty
123
6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą
cukrowej; tywelozy. Ponadto w antygenie somatycznym larw L1 25% glikozylacji białek
związanych jest z resztami N-acetylo-glukozaminy (Wisnewski et al., 1993). Wykazano, że
przeciwciała specyficzne wobec antygenów T. spiralis, w tym klasy IgA (Inaba et al., 2003),
znacząco obniżają inwazyjność nicieni, nawet bez obecności leukocytów (McVay et al.,
1998). Obserwowano także, że wcześniejsze zarażenie myszy przywrą Clonorchis sinensis,
której antygeny są krzyżowo rozpoznawane razem z antygenami T. spiralis (Chu et al., 2014),
zwiększa skuteczność odpowiedzi wobec T. spiralis (Chen et al., 2013). Jednak produkcja
przeciwciał IgA, która pojawiła się po podaniu chitozanu, miała odwrotny skutek w czasie
zarażenia T. spiralis; więcej larw dojrzewało do form dorosłych. Być może IgA wzbudzane
przez chitozan, mimo że rozpoznają epitopy nicienia, charakteryzują się słabszym
powinowactwem, co jest typowe dla przeciwciał przeciwko cukrom (Heimburg-Molinaro &
Rittenhouse-Olson, 2009). Słabsze oddziaływanie przeciwciał ze strukturami pasożyta lub ich
nieznacznie zmieniona specyficzność mogły mieć wpływ na mechanizmy komórkowe zależne
od przeciwciał, co mogło skutkować obniżoną odpornością żywiciela na zarażenie. Wskazuje
się także, że przeciwciała przeciw cukrom mogą wiązać się raczej z ucieczką immunologiczną
pasożyta; u szympansów zarażonych Schistosoma mansoni pojawiają się przeciwciała
skierowane przeciwko epitopom węglowodanowym w czasie, gdy zarażenie staje się
chroniczne (Eberl et al., 2001). Autorzy sugerują, że antygeny cukrowe pasożyta stanowią
„zasłonę dymną”; indukowane przeciwciała przeciwko tym epitopom, odwracają uwagę
mechanizmów obronnych żywiciela od ważniejszych struktur tej przywry. Podobny efekt
mógł wywołać chitozan; zwiększona produkcja przeciwciał nie przyczyniała się do
obronności, ponieważ rozpoznawane struktury nie były kluczowe dla przeżycia pasożyta.
Równocześnie zaburzenie odpowiedzi limfocytów B skutkowało także zakłóconą produkcją
przeciwciał, które normalnie zapewniają skuteczną odpowiedź przeciwpasożytniczą. Ponadto
wykazano udział komórek B produkujących IgA w indukcji odpowiedzi limfocytów Treg
(Kim & Kim, 2014), co mogło dodatkowo sprzyjać odpowiedzi regulatorowej, a nie obronnej
po podaniu chitozanu.
Podsumowując, wpływ chitozanu na odpowiedź przeciwpasożytniczą był bardziej
długotrwały na poziomie mechanizmów nabytych, szczególnie humoralnych. Początkowo
obserwowano zmiany w reakcji limfocytów T; komórki te opuszczały lokalne węzły
limfatyczne lub pozostawały areaktywne. Równocześnie następował intensywny napływ
komórek CD4+ i CD8+ do miejsca podania polimeru, co mogło zaburzyć rozwój odpowiedzi
Th2 w jelicie, gdzie znajdowały się pasożyty. Odwrotną dynamikę obserwowano w
przypadku limfocytów B; komórki te opuszczały jamę otrzewnej (szczególnie populacja B1) i
124
6.4 Wyniki; wpływ chitozanu na odpowiedź nabytą
częściowo mogły lokalizować się w MLN. Pomimo zmniejszenia puli tych komórek, w jamie
otrzewnej następowała intensywna produkcja przeciwciał klasy IgA rozpoznających
krzyżowo antygeny nicieni i sam polimer. Produkcja tej immunoglobuliny wzrastała z
czasem, ale nie obserwowano wpływu chitozanu na produkcję pozostałych badanych klas
przeciwciał. Odpowiedź przeciwpasożytnicza limfocytów w fazie chronicznej zarażeń była
zmieniona tylko lokalnie, w jamie otrzewnej, prawdopodobnie ze względu na zaburzone przez
długi stan zapalny funkcje nabłonka i migrację komórek.
125
7. Podsumowanie i wnioski
W niniejszej pracy zaprezentowano wyniki dotyczące immunostymulacyjnych właściwości
chitozanu oraz udziału tego polimeru w indukcji odpowiedzi przeciwpasożytniczej.
Wykazano, że polimer ten wpływa na aktywność komórek odpowiedzi immunologicznej, w
tym tych włączonych w reakcje przecipasożytnicze. Otrzymane wyniki nie potwierdzają
jednak przyjętych na początku założeń, że chitozan wzmocni odpowiedź typu Th2 i przyczyni
się do zwiększonej odporności na zarażenie nicieniami.
7.1 Immunostymulacyjne właściwości chitozanu
W badaniach in vitro stwierdzono różnice w rodzaju aktywacji komórek APC w zależności od
masy cząsteczkowej chitozanu. Polimer zmieniał ekspresję markerów powierzchniowych na
tych komórkach, a charakter tych zmian sugerował różny rodzaj aktywacji, mogący
promować odpowiedź Th1 lub Th2 zależną, odpowiednio przez chitozan o małej lub dużej
masie cząsteczkowej. Jednak in vivo efekt był odmienny; chitozan o dużej masie, wybrany
jako stymulator odpowiedzi typu 2, wywołał po podaniu dootrzewnowym silny lokalny stan
zapalny charakteryzujący się napływem neutrofilów i monocytów oraz produkcją cytokin
prozapalnych Th1 zależnych. Równocześnie jednak podanie chitozanu zwiększyło poziom
TGF-β i IL-10, co skutkowało bliznowaceniem tkanek i tworzeniem ziarniniaków,
prawdopodobnie przez aktywację mechanizmów związanych z gojeniem, co następnie
zaburzało napływ komórek niezbędnych do zwalczania zarażenia.
7.2 Wpływ na odpowiedź przeciwpasożytniczą
Myszy, u których za pomocą chitozanu wywołano stan zapalny jamy otrzewnej, zarażano
jednym z 2 gatunków nicieni pasożytniczych, H. polygyrus lub T. spiralis, aby określić
wpływ
mechanizmów
zaindukowanych
przez
polimer
na
przebieg
odpowiedzi
przeciwpasożytniczej. Indukcja odpowiedzi immunologicznej przez chitozan nie zwiększyła
reakcji obronnych żywiciela; poziom zarażenia H. polygyrus się nie zmienił, a
T. spiralis się zwiększył. Mechanizmy wzbudzone przez chitozan nie sprzyjały zatem
zwalczaniu pasożytów. Napływające komórki, pomimo nieznacznej aktywacji pod wpływem
antygenów nicieni, nie spełniały funkcji obronnych, prawdopodobnie przez dominację
odpowiedzi Th1, która nie jest skuteczna w zwalczaniu badanych pasożytów. Pomimo
wzbudzenia stanu zapalnego odpowiedź limfocytów CD4 została zahamowana; komórki nie
126
7. Podsumowanie i wnioski
proliferowały w lokalnych węzłach limfatycznych, co znacznie zaburzyło rozwój specyficznej
odpowiedzi Th2. Chitozan miał natomiast inny wpływ na limfocyty B; komórki te ulegały
aktywacji i produkowały IgA, krzyżowo rozpoznające struktury pasożytów i sam polimer.
7.3 Różnice między gatunkami pasożyta w odpowiedzi na chitozan
Podanie chitozanu inaczej wpływało na przebieg zarażenia dwoma badanymi nicieniami; w
przypadku H. polygyrus nie obserwowano zmian w poziomie zarażenia, natomiast więcej
nicieni T. spiralis zasiedlało żywiciela po podaniu polimeru. Różnice te są związane z nieco
inną dynamiką odpowiedzi przeciwpasożytniczej wywoływanej przez te nicienie. Może to
być też związane z różnicami w budowie tych pasożytów, ponieważ IgA indukowane przez
chitozan rozpoznawało więcej epitopów T. spiralis, przez co mogły silniej wzbudzać
mechanizmy tolerancji.
Ponadto w przypadku zarażenia H. polygyrus obserwowano łagodzący wpływ nicienia na
przebieg stanu zapalnego zaindukowanego przez chitozan. U myszy zarażonych mniej
neutrofilów i monocytów napływało do jamy otrzewnej, co wiązało się także z obniżoną
produkcją cytokin prozapalnych. Efekt ten nie był obserwowany w czasie zarażenia
T. spiralis; w czasie zarażenia stan zapalny wywoływany przez chitozan nie zmieniał się.
Możliwe, że ten gatunek nicienia mógłby wykazywać łagodzący wpływ na objawy peritonitis
w fazie mięśniowej. Interesującym byłoby podanie chitozanu ok. 30 dpz T. spiralis i określić
wtedy przebieg stanu zapalnego otrzewnej.
7.4 Wnioski końcowe
Chitozan zmieniając aktywność komórek odpowiedzi immunologicznej wpłynął odmiennie
na poziom odpowiedzi przeciwpasożytniczej w czasie zarażenia myszy nicieniami
Heligmosomoides polygyrus i Trichinella spiralis, jednak nie zwiększał skuteczności
odpowiedzi
przeciwpasożytniczej.
Przeprowadzone
doświadczenia
nie
potwierdzają
początkowych założeń wynikających z danych literaturowych, że chitozan jest induktorem
odpowiedzi Th2 zależnej. Stan zapalny wywołany po podaniu dootrzewnowym polimeru
wykazywał cechy odpowiedzi Th1 oraz aktywację mechanizmów supresorowych, które miały
zapewne chronić żywiciela przez reakcjami patologicznymi. Po zarażeniu, taki stan nie
wpływał lub uniemożliwiał skuteczne zwalczanie inwazji, ponieważ układ odpornościowy
uczestniczył w neutralizacji polimeru. Takie wyniki sugerują ostrożność w używaniu
127
7. Podsumowanie i wnioski
chitozanu jako składnika leków czy szczepionek; podany w nieodpowiedniej formie może
stać się dla organizmu czynnikiem szkodliwym, zaburzając funkcjonowanie układu
odpornościowego.
Ciekawym wynikiem otrzymanym w niniejszej pracy jest stwierdzenie indukcji przez
chitozan IgA krzyżowo specyficznych wobec antygenów H. polygyrus, T. spiralis i samego
polimeru. Interesującym byłoby zidentyfikowanie jakie struktury pasożyta są przez te
przeciwciała rozpoznawane oraz czy mają one funkcje supresorowe.
Przedstawione wyniki pokazują jak skomplikowane relacje łączą różne mechanizmy
odpowiedzi immunologicznej. Podanie chitozanu wpłynęło na odpowiedź wrodzoną i nabytą
oraz lokalną i obwodową zarówno u zwierząt zdrowych, jak i zarażonych nicieniami.
Określenie mechanizmu działania tego polimeru na odpowiedź immunologiczną wymaga
dalszych badań, aby określić wzajemne relacje między różnymi wzbudzanymi populacjami
komórek oraz bezpośredni wpływ chitozanu na komórki odpornościowe.
Wyniki uzyskane w prezentowanej pracy pozwalają stwierdzić, że:

chitozan o różnej masie cząsteczkowej wykazuje odmienne właściwości aktywowania
in vitro komórek odpowiedzi wrodzonej

chitozan o dużej masie cząsteczkowej podawany dootrzewnowo wywołuje
początkowo silny stan zapalny charakteryzujący się napływem neutrofilów i
niedojrzałych monocytów oraz produkcją cytokin prozapalnych jak i regulatorowych

po zaprzestaniu podawania chitozanu obserwuje się wzbudzenie mechanizmów
związanych z gojeniem tkanek; alternatywną aktywację makrofagów oraz
wydzielanie TGF-β i IL-10

zarażenie H. polygyrus myszy, którym podawano chitozan skutkuje złagodzeniem
objawów stanu zapalnego

u myszy, którym podawano chitozan, w czasie inwazji T. spiralis obserwuje się
wyższy poziom zarażenia, a odpowiedź na polimer dominuje odpowiedź
przeciwpasożytniczą

stan zapalny wywołany przez chitozan hamuje proliferację limfocytów T CD4+, ale
także wzbudza produkcję przeciwciał IgA krzyżowo rozpoznających antygeny nicieni
oraz sam polimer
128
7. Podsumowanie i wnioski
Wyniki, stanowiące podstawę przedstawionej pracy prezentowano na konferencjach:
XVI Seminarium Robocze pt. „Nowe aspekty w chemii i zastosowaniu chityny i jej
pochodnych”, Zakopane, 22-24.09.10
Plakat: Klaudia Brodaczewska, Katarzyna Donskow, Kinga Jóźwicka, Maria Doligalska „In
vitro action of chitosan on immune cells of mice infected with parasitic helminth
Heligmosomoides bakeri.”
XVII Seminarium Robocze pt. „Nowe aspekty w chemii i zastosowaniu chityny i jej
pochodnych”, Warszawa, 21-23.09.11.
Prezentacja ustna: Klaudia Brodaczewska, Maria Doligalska „Effect of chitosan on activity
of myeloid cells during Heligmosomoides bakeri infection in mice”
XI European Multicolloquium of Parasitology, Cluj Napoca, Romania, 25-28.07.12.
Plakat: Klaudia Brodaczewska, Katarzyna Donskow-Lysoniewska and Maria Doligalska
“Screening for immunostimulant activity of chitosan during Trichinella spiralis infection in
mice”
XVIII Seminarium Robocze pt. „Nowe aspekty w chemii i zastosowaniu chityny i jej
pochodnych”, Bochnia, 19-21.09.12.
Prezentacja ustna: Klaudia Brodaczewska, Maria Doligalska, „Zróżnicowany efekt
chitozanu o małej i dużej masie cząsteczkowej u myszy zarażonych H. polygyrus.
16th International Congress of Mucosal Immunology, 17-20 lipca 2013, Vancouver, Kanada
Plakat: Klaudia Brodaczewska, Natalia Wolaniuk, Katarzyna Donskow-Lysoniewska, Maria
Doligalska “Chitosan alters activity of innate immune cells in mice infected with Trichinella
spiralis”
15th International Congress of Immunology, 22-27 sierpnia 2013, Mediolan, Włochy
Brodaczewska K., Wolaniuk N., Donskow-Łysoniewska K., Doligalska M. (2013) “Chitosan
administration stimulates lymphocyte proliferation during muscle phase of infection with
Trichinella spiralis infection in mice”
EPNOE 2013: "Polysaccharides and polysaccharide-derived products, from basic science to
applications", 21-24 Października 2013, Nicea, Francja
Prezentacja ustna: Klaudia Brodaczewska, Katarzyna Donskow-Lysoniewska,
Maria Doligalska „The in vivo isolation of chitosan by cells in the peritoneal cavity”
Plakat: Klaudia Brodaczewska, Natalia Wolaniuk, Katarzyna Donskow-Lysoniewska,
Maria Doligalska “Chitosan injections attract cells of innate immunity in mice”
XIX Seminarium Robocze pt „Nowe aspekty w chemii i zastosowaniu chityny i jej
pochodnych”, 18-20 września 2013 r Żywiec
Prezentacja ustna: Klaudia Brodaczewska, Sylwia Szkudlarek, Maria Doligalska „Dendritic
cell activation depends on chitosan size”
XX Seminarium Robocze pt „Nowe aspekty w chemii i zastosowaniu chityny i jej
pochodnych”, 24-24 września 2014 r Łódź
Prezentacja ustna: Klaudia Brodaczewska, Katarzyna Donskow-Łysoniewska and Maria
Doligalska “Cross-reactivity of IgA induced by chitosan in nematode infection”
oraz w publikacjach:
Brodaczewska K., Doligalska M. (2012) ”In vivo stimulation of peritoneal cells by chitosan
administered in drinking water to mice”. Progress on Chemistry and Application of Chitin and
Its Derivatives, Vol. XVII, p.107-112.
129
7. Podsumowanie i wnioski
Brodaczewska K., Doligalska M. (2013). “Differential effects of low and high molecular
weight chitosan administered intraperitoneally to mice infected with Heligmosomoides
polygyrus.” Progress on Chemistry and Application of Chitin and Its Derivatives, Vol. XVIII,
p 77-84.
Brodaczewska, K., Donskow-Łysoniewska, K., & Doligalska, M. (2015). „Chitin, a key
factor in immune regulation: lesson from infection with fungi and chitin bearing parasites.”
Acta Parasitologica, 60(2), 337-344.
130
8. Spis literatury
1.
Adrangi, S., and Faramarzi, M.A. (2013). From bacteria to human: A journey into the
world of chitinases. Biotechnol. Adv. 31, 1786–1785.
2.
Allakhverdi, Z., Smith, D.E., Comeau, M.R., and Delespesse, G. (2007). Cutting edge:
The ST2 ligand IL-33 potently activates and drives maturation of human mast cells. J.
Immunol. 179, 2051–2054.
3.
Alvin, A.G., and Angeli, V.F. (2001). Trichinella diagnostics and control: Mandatory
and best practices for ensuring food safety. Vet. Parasitol. Role Parasitederived
Prostaglandin D2 Inhib. Epidermal Langerhans Cell Migr. Dur. Schistosomiasis Infect.
J. Exp. Med. 11351148 193, 3–4.
4.
Angeli, V., Faveeuw, C., Roye, O., Fontaine, J., Teissier, E., Capron, a, Wolowczuk, I.,
Capron, M., and Trottein, F. (2001). Role of the parasite-derived prostaglandin D2 in
the inhibition of epidermal Langerhans cell migration during schistosomiasis infection.
J. Exp. Med. 193, 1135–1147.
5.
Annunziato, R.A., Parbhakar, M., Helcer, J., Kapoor, K., Henkel, K., and Arnon, R.
(2014). Strategies for measuring quality of life among pediatric solid-organ transplant
recipients. Prog. Transplant. 24, 247–256.
6.
Anthony, R.M., Urban, J.F., Alem, F., Hamed, H. a, Rozo, C.T., Boucher, J.-L., Van
Rooijen, N., and Gause, W.C. (2006). Memory T(H)2 cells induce alternatively
activated macrophages to mediate protection against nematode parasites. Nat. Med. 12,
955–960.
7.
Anthony, R.M., Rutitzky, L.I., Urban, J.F., Stadecker, M.J., and Gause, W.C. (2007).
Protective immune mechanisms in helminth infection. Nat. Rev. Immunol. 7, 975–987.
8.
Ashour, D.S., Othman, a a, Shareef, M.M., Gaballah, H.H., and Mayah, W.W. (2013).
Interactions between Trichinella spiralis infection and induced colitis in mice. J.
Helminthol. 88, 1–9.
9.
Ayroldi, E., Zollo, O., Cannarile, L., D’ Adamio, F., Grohmann, U., Delfino, D. V, and
Riccardi, C. (1998). Interleukin-6 (IL-6) prevents activation-induced cell death: IL-2independent inhibition of Fas/fasL expression and cell death. Blood 92, 4212–4219.
10.
Azuma, K., Osaki, T., Minami, S., and Okamoto, Y. (2015). Anticancer and antiinflammatory properties of chitin and chitosan oligosaccharides. J. Funct. Biomater. 6,
33–49.
11.
Bai, X., Wu, X., Wang, X., Guan, Z., Gao, F., Yu, J., Yu, L., Tang, B., Liu, X., Song,
Y., et al. (2012). Regulation of cytokine expression in murine macrophages stimulated
by excretory/secretory products from Trichinella spiralis in vitro. Mol. Cell. Biochem.
360, 79–88.
12.
Bao, S., Beagley, K.W., Murray, a. M., Caristo, V., Matthaei, K.I., Young, I.G., and
Husband, a. J. (1998). Intestinal IgA plasma cells of the B1 lineage are IL-5 dependent.
Immunology 94, 181–188.
13.
Bao, X., Yuan, H., Wang, C., Liu, J., and Lan, M. (2013). Antitumor and
immunomodulatory activities of a polysaccharide from Artemisia argyi. Carbohydr.
Polym. 98, 1236–1243.
14.
Barreto, R.S., Quintans, J.S., Barreto, A.S., Albuquerque-Júnior, R.L., Galvão, J.G.,
Gonsalves, J.K., Nunes, R.S., Camargo, E.A., Lucca-Júnior, W., Soares, R.C., et
131
8. Spis literatury
al.(2014). Improvement of wound tissue repair by chitosan films containing (-)-borneol,
a bicyclic monoterpene alcohol, in rats. Int. Wound J.
15.
Beagley, K.W., Eldridge, J.H., Lee, F., Kiyono, H., Everson, M.P., Koopman, W.J.,
Hirano, T., Kishimoto, T., and McGhee, J.R. (1989). Interleukins and IgA synthesis.
Human and murine interleukin 6 induce high rate IgA secretion in IgA-committed B
cells. J. Exp. Med. 169, 2133–2148.
16.
Beagley, K.W., Murray, a M., McGhee, J.R., and Eldridge, J.H. (1995). Peritoneal
cavity CD5 B cells: cytokine induced IgA secretion and homing to intestinal lamina
propria in SCID mice. Immunol. Cell Biol. 73, 425–432.
17.
Behnke, J.M., Menge, D.M., and Noyes, H. (2009). Heligmosomoides bakeri: a model
for exploring the biology and genetics of resistance to chronic gastrointestinal nematode
infections. Parasitology 136, 1565–1580.
18.
Ben-Smith, a., Wahid, F.N., Lammas, D. a., and Behnke, J.M. (1999). The relationship
between circulating and intestinal Heligmosomoides polygyrus-specific IgG1 and IgA
and resistance to primary infection. Parasite Immunol. 21, 383–395.
19.
Bergquist, R., and Lustigman, S. (2010). Control of Important Helminthic Infections.
VaccineDevelopment as Part of the Solution. Adv. Parasitol. 73, 297–326.
20.
Bliss, S.K., Alcaraz, A., and Appleton, J. a (2003). IL-10 prevents liver necrosis during
murine infection with Trichinella spiralis. J. Immunol. 171, 3142–3147.
21.
Bonne-Année, S., Kerepesi, L. a., Hess, J. a., O’Connell, A.E., Lok, J.B., Nolan, T.J.,
and Abraham, D. (2013). Human and mouse macrophages collaborate with neutrophils
to kill larval strongyloides stercoralis. Infect. Immun. 81, 3346–3355.
22.
Borkow, G., and Bentwich, Z. (2008). Chronic parasite infections cause immune
changes that could affect successful vaccination. Trends Parasitol. 24, 243–245.
23.
Brinchmann, B.C., Bayat, M., Brøgger, T., Muttuvelu, D.V., Tjønneland, A., and
Sigsgaard, T. (2011). A possible role of chitin in the pathogenesis of asthma and
allergy. Ann. Agric. Environ. Med. 18, 7–12.
24.
Brodaczewska, K., and Doligalska, M. (2012). In vivo stimulation of peritoneal cells by
chitosan administered in drinking water to mice. Prog. Chem. Appl. Chitin Its Deriv. 17,
107–112.
25.
Brodaczewska, K., Donskow-Łysoniewska, K., and Doligalska, M. (2015). Chitin, a
key factor in immune regulation: lesson from infection with fungi and chitin bearing
parasites. Acta Parasitol. 60, 337–344.
26.
Bruschi, F., and Chiumiento, L. (2012). Immunomodulation in Trichinellosis: Does
Trichinella Really Escape the Host Immune System? Endocrine, Metab. Immune
Disord. - Drug Targets 12, 4–15.
27.
Bruschi, F., Korenaga, M., and Watanabe, N. (2008). Eosinophils and Trichinella
infection: toxic for the parasite and the host? Trends Parasitol. 24, 462–467.
28.
Bueter, C.L., Lee, C.K., Rathinam, V. a K., Healy, G.J., Taron, C.H., Specht, C. a., and
Levitz, S.M. (2011). Chitosan but not chitin activates the inflammasome by a
mechanism dependent upon phagocytosis. J. Biol. Chem. 286, 35447–35455.
29.
Bussink, A.P., Speijer, D., Aerts, J.M.F.G., and Boot, R.G. (2007). Evolution of
mammalian chitinase(-like) members of family 18 glycosyl hydrolases. Genetics 177,
959–970.
132
8. Spis literatury
30.
Canali, M.M., Porporatto, C., Aoki, M.P., Bianco, I.D., and Correa, S.G. (2010). Signals
elicited at the intestinal epithelium upon chitosan feeding contribute to
immunomodulatory activity and biocompatibility of the polysaccharide. Vaccine 28,
5718–5724.
31.
Cash, H.L., Whitham, C. V, Behrendt, C.L., and Hooper, L. V (2006). Symbiotic
bacteria direct expression of an intestinal bactericidal lectin. Science 313, 1126–1130.
32.
Cervi, L., MacDonald, A.S., Kane, C., Dzierszinski, F., and Pearce, E.J. (2004). Cutting
edge: dendritic cells copulsed with microbial and helminth antigens undergo modified
maturation, segregate the antigens to distinct intracellular compartments, and
concurrently induce microbe-specific Th1 and helminth-specific Th2 responses. J.
Immunol. 172, 2016–2020.
33.
Charlier, J., van der Voort, M., Kenyon, F., Skuce, P., and Vercruysse, J. (2014).
Chasing helminths and their economic impact on farmed ruminants. Trends Parasitol.
30, 361–367.
34.
Chen, F., Liu, Z., Wu, W., Rozo, C., Bowdridge, S., Millman, A., Van Rooijen, N.,
Urban, J.F., Wynn, T. a, and Gause, W.C. (2012). An essential role for TH2-type
responses in limiting acute tissue damage during experimental helminth infection. Nat.
Med. 18, 260–266.
35.
Chen, Y., Huang, B., Huang, S., Yu, X., Li, Y.Y., Song, W., and Lu, F. (2013).
Coinfection with Clonorchis sinensis modulates murine host response against
Trichinella spiralis infection. Parasitol. Res. 112, 3167–3179.
36.
Chu, K.-B., Kim, S.-S., Lee, S.-H., Lee, H.-S., Joo, K.-H., Lee, J.-H., Lee, Y.-S., Zheng,
S., and Quan, F.-S. (2014) Enhanced protection against Clonorchis sinensis induced by
co-infection with Trichinella spiralis in rats. Parasite Immunol. 36, 522–530.
37.
Cui, J., Liu, R.D., Wang, L., Zhang, X., Jiang, P., Liu, M.Y., and Wang, Z.Q. (2013).
Proteomic analysis of surface proteins of Trichinella spiralis muscle larvae by twodimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Parasit. Vectors 6, 355.
38.
Darwin Murrell, K., and Pozio, E. (2011). Worldwide occurrence and impact of human
trichinellosis, 1986-2009.
39.
Deshmane, S.L., Kremlev, S., Amini, S., and Sawaya, B.E. (2009). Monocyte
chemoattractant protein-1 (MCP-1): an overview. J. Interferon Cytokine Res. 29, 313–
326.
40.
Despommier, D.G. V (2005). The Nematodes. W D G Apple Trees Prod.
41.
Despommier, D., Symmans, W.F., and Dell, R. (1991). Changes in nurse cell nuclei
during synchronous infection with Trichinella spiralis. J. Parasitol. 77, 290–295.
42.
Van Die, I., van Vliet, S.J., Nyame, A.K., Cummings, R.D., Bank, C.M.C., Appelmelk,
B., Geijtenbeek, T.B.H., and van Kooyk, Y. (2003). The dendritic cell-specific C-type
lectin DC-SIGN is a receptor for Schistosoma mansoni egg antigens and recognizes the
glycan antigen Lewis x. Glycobiology 13, 471–478.
43.
Doener, F., Michel, A., Reuter, S., Friedrich, P., Böhm, L., Relle, M., Codarri, L.,
Tenzer, S., Klein, M., Bopp, T., et al. (2013). Mast cell-derived mediators promote
murine neutrophil effector functions. Int. Immunol. 25, 553–561.
44.
Doligalska, M., Rzepecka, J., Drela, N., Donskow, K., and Gerwel-Wronka, M. (2006).
The role of TGF-beta in mice infected with Heligmosomoides polygyrus. Parasite
Immunol. 28, 387–395.
133
8. Spis literatury
45.
Doligalska, M., Brodaczewska, K., and Donskow- Lysoniewska, K. (2012). The
antiapoptotic activity of Heligmosomoides polygyrus antigen fractions. Parasite
Immunol. 34, 589–603.
46.
Donskow-Łysoniewska, K., Krawczak, K., and Doligalska, M. (2012).
Heligmosomoides polygyrus: EAE remission is correlated with different systemic
cytokine profiles provoked by L4 and adult nematodes. Exp. Parasitol. 132, 243–248.
47.
Donskow-Łysoniewska, K., Bien, J., Brodaczewska, K., Krawczak, K., and Doligalska,
M. (2013). Colitis Promotes Adaptation of an Intestinal Nematode: A Heligmosomoides
Polygyrus Mouse Model System. PLoS One 8.
48.
Donskow-Schmelter, K., Doligalska, M., Rzepecka, J., and Jedlina-Panasiuk, L. (2007).
Heligmosomoides polygyrus: Decreased apoptosis in fast responder FVB mice during
infection. Exp. Parasitol. 117, 149–156.
49.
Dutta, P.K. (2004). Chitin and chitosan: Chemistry, properties and applications. J. Sci.
Ind. Res. (India). 63, 20–31.
50.
East, L., and Isacke, C.M. (2002). The mannose receptor family. Biochim. Biophys.
Acta 1572, 364–386.
51.
Eberl, M., Langermans, J. a, Vervenne, R. a, Nyame, a K., Cummings, R.D., Thomas, a
W., Coulson, P.S., and Wilson, R. a (2001). Antibodies to glycans dominate the host
response to schistosome larvae and eggs: is their role protective or subversive? J. Infect.
Dis. 183, 1238–1247.
52.
Elliott, D.E., and Weinstock, J. V. (2009). Helminthic therapy: Using worms to treat
immune-mediated disease. Adv. Exp. Med. Biol. 666, 157–166.
53.
European Food Safety Authority (EFSA) (2006). The Community Summary Report on
Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents, Antimicrobial Resistance and
Foodborne Outbreaks in the European Union in 2005. EFSA J. 94, 288.
54.
Fagarasan, S., and Honjo, T. (2003). Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line
body defences. Nat. Rev. Immunol. 3, 63–72.
55.
Fahmy, M. a M. (1956). An investigation on the life cycle of Nematospiroides dubius
(nematoda: heligmosomidae) with special reference to the free-living stages. Zeitschrift
F??r Parasitenkd. 17, 394–399.
56.
Fielding, C. a, McLoughlin, R.M., McLeod, L., Colmont, C.S., Najdovska, M., Grail,
D., Ernst, M., Jones, S. a, Topley, N., and Jenkins, B.J. (2008). IL-6 regulates neutrophil
trafficking during acute inflammation via STAT3. J. Immunol. 181, 2189–2195.
57.
Fierens, K., and Kool, M. (2012). The Mechanism of Adjuvanticity of AluminiumContaining Formulas. Curr. Pharm. Des. 18, 2305–2313.
58.
Finkelman, F.D., Madden, K.B., Cheever, a W., Katona, I.M., Morris, S.C., Gately,
M.K., Hubbard, B.R., Gause, W.C., and Urban, J.F. (1994). Effects of interleukin 12 on
immune responses and host protection in mice infected with intestinal nematode
parasites. J. Exp. Med. 179, 1563–1572.
59.
Finkelman, F.D., Shea-Donohue, T., Morris, S.C., Gildea, L., Strait, R., Madden, K.B.,
Schopf, L., and Urban, J.F. (2004). Interleukin-4- and interleukin-13-mediated host
protection against intestinal nematode parasites. Immunol. Rev. 201, 139–155.
60.
Fong, D., Ariganello, M.B., Girard-Lauzière, J., and Hoemann, C.D. (2015)
Biodegradable chitosan microparticles induce delayed STAT-1 activation and lead to
134
8. Spis literatury
distinct cytokine responses in differentially polarized human macrophages in vitro. Acta
Biomater. 12, 183–194.
61.
Foster, J.M., Zhang, Y., Kumar, S., and Carlow, C.K.S. (2005). Parasitic nematodes
have two distinct chitin synthases. Mol. Biochem. Parasitol. 142, 126–132.
62.
Free, S.J. (2013). Chapter Two - Fungal Cell Wall Organization and Biosynthesis. Adv.
Genet. 81, 33–82.
63.
Garg, N.K., Mangal, S., Khambete, H., Sharma, P.K., and Tyagi, R.K. (2010). Mucosal
delivery of vaccines: role of mucoadhesive/biodegradable polymers. Recent Pat. Drug
Deliv. Formul. 4, 114–128.
64.
Gause, W.C., Wynn, T. a, and Allen, J.E. (2013). Type 2 immunity and wound healing:
evolutionary refinement of adaptive immunity by helminths. Nat. Rev. Immunol. 13,
607–614.
65.
Geissmann, F., Manz, M.G., Jung, S., Sieweke, M.H., Merad, M., and Ley, K. (2010).
Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science 327, 656–661.
66.
Ghosn, E.E.B., Cassado, A. a, Govoni, G.R., Fukuhara, T., Yang, Y., Monack, D.M.,
Bortoluci, K.R., Almeida, S.R., Herzenberg, L. a, and Herzenberg, L. a (2010). Two
physically, functionally, and developmentally distinct peritoneal macrophage subsets.
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 2568–2573.
67.
Gilabert, A., and Wasmuth, J.D. (2013). Unravelling parasitic nematode natural history
using population genetics. Trends Parasitol. 29, 438–448.
68.
Gomez-Escobar, N., Gregory, W.F., and Maizels, R.M. (2000). Identification of tgh-2, a
filarial nematode homolog of Caenorhabditis elegans daf-7 and human transforming
growth factor ??, expressed in microfilarial and adult stages of Brugia malayi. Infect.
Immun. 68, 6402–6410.
69.
Goodridge, H.S., Marshall, F. a, Else, K.J., Houston, K.M., Egan, C., Al-Riyami, L.,
Liew, F.-Y., Harnett, W., and Harnett, M.M. (2005). Immunomodulation via novel use
of TLR4 by the filarial nematode phosphorylcholine-containing secreted product, ES62. J. Immunol. 174, 284–293.
70.
Gordon, S. (2002). Pattern recognition receptors: Doubling up for the innate immune
response. Cell 111, 927–930.
71.
Gordon, S., and Martinez, F.O. (2010). Alternative activation of macrophages:
Mechanism and functions. Immunity 32, 593–604.
72.
Gore, D.P. (2014). L. . In vitro hyporesponsiveness of CD4+ and CD8+ T cells in septic
patients with faecal peritonitis. 1851 192 SRC -.
73.
Granger, J.I., Ratti, P.L., Datta, S.C., Raymond, R.M., and Opp, M.R. (2013). Sepsisinduced morbidity in mice: Effects on body temperature, body weight, cage activity,
social behavior and cytokines in brain. Psychoneuroendocrinology 38, 1047–1057.
74.
Grencis, R.K. (1997). Th2-mediated host protective immunity to intestinal nematode
infections. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 352, 1377–1384.
75.
Grove, D.I., and Northern, C. (1989). Dissociation of the protective immune response in
the mouse to Strongyloides ratti. J. Helminthol. 63, 307–314.
76.
Guiducci, C., Vicari, a P., Sangaletti, S., Trinchieri, G., and Colombo, M.P. (2005).
Redirecting in vivo elicited tumor infiltrating macrophages and dendritic cells towards
tumor rejection. Cancer Res 65, 3437–3446.
135
8. Spis literatury
77.
Ha, S., Tsuji, M., Suzuki, K., Meek, B., Yasuda, N., Kaisho, T., and Fagarasan, S.
(2006). Regulation of B1 cell migration by signals through Toll-like receptors. J. Exp.
Med. 203, 2541–2550.
78.
Harris, N., and Gause, W.C. (2011). To B or not to B: B cells and the Th2-type immune
response to helminths. Trends Immunol. 32, 80–88.
79.
Hashimoto, D., Miller, J., and Merad, M. (2011). Dendritic Cell and Macrophage
Heterogeneity In Vivo. Immunity 35, 323–335.
80.
Hayakawa, K., Hardy, R.R., Stall, a. M., Herzenberg, L. a., and Herzenberg, L. a.
(1986). Immunoglobulin-bearing B cells reconstitute and maintain the murine Ly-1 B
cell lineage. Eur. J. Immunol. 16, 1313–1316.
81.
Heimburg-Molinaro, J., and Rittenhouse-Olson, K. (2009). Glycomics. Methods 534,
341–357.
82.
Helmby, H., and Grencis, R.K. (2002). IL-18 regulates intestinal mastocytosis and Th2
cytokine production independently of IFN-gamma during Trichinella spiralis infection.
J. Immunol. 169, 2553–2560.
83.
Hepworth, M.R., Maurer, M., and Hartmann, S. (2012). Regulation of type 2 immunity
to helminths by mast cells. Gut Microbes 3, 476–481.
84.
Herbert, D.R., Hölscher, C., Mohrs, M., Arendse, B., Schwegmann, A., Radwanska, M.,
Leeto, M., Kirsch, R., Hall, P., Mossmann, H., et al. (2004). Alternative macrophage
activation is essential for survival during schistosomiasis and downmodulates T helper 1
responses and immunopathology. Immunity 20, 623–635.
85.
Hettinger, J., Richards, D.M., Hansson, J., Barra, M.M., Joschko, A.-C., Krijgsveld, J.,
and Feuerer, M. (2013). Origin of monocytes and macrophages in a committed
progenitor. Nat. Immunol. 14, 821–830.
86.
Hewitson, J.P., and Maizels, R.M. (2014). Vaccination against helminth parasite
infections. Expert Rev. Vaccines 13, 473–487.
87.
Hewitson, J.P., Filbey, K.J., Grainger, J.R., Dowle, A.A., Pearson, M., Murray, J.,
Harcus, Y., and Maizels, R.M. (2011). Heligmosomoides polygyrus elicits a dominant
nonprotective antibody response directed against restricted glycan and peptide epitopes.
J. Immunol. 187, 4764–4777.
88.
Holland, M.J., Harcus, Y.M., Riches, P.L., and Maizels, R.M. (2000). Proteins secreted
by the parasitic nematode Nippostrongylus brasiliensis act as adjuvants for Th2
responses. Eur. J. Immunol. 30, 1977–1987.
89.
Hsu, L.W., Lee, P.L., Chen, C.T., Mi, F.L., Juang, J.H., Hwang, S.M., Ho, Y.C., and
Sung, H.W. (2012). Elucidating the signaling mechanism of an epithelial tight-junction
opening induced by chitosan. Biomaterials 33, 6254–6263.
90.
Huang, D., Nie, S., Jiang, L., and Xie, M. (2014). A novel polysaccharide from the
seeds of Plantago asiatica L. Induces dendritic cells maturation through toll-like
receptor 4. Int. Immunopharmacol. 18, 236–243.
91.
Hussaarts, L., Yazdanbakhsh, M., and Guigas, B. (2014). Priming Dendritic Cells for
Th2 Polarization: Lessons Learned from Helminths and Implications for Metabolic
Disorders. Front. Immunol. 5, 499.
92.
Ilic, N., Gruden-Movsesijan, A., and Sofronic-Milosavljevic, L. (2012). Trichinella
spiralis: shaping the immune response. Immunol. Res. 52, 111–119.
136
8. Spis literatury
93.
Inaba, T., Sato, H., and Kamiya, H. (2003). Monoclonal IgA antibody-mediated
expulsion of Trichinella from the intestine of mice. Parasitology 126, 591–598.
94.
Islam, M.A., Firdous, J., Choi, Y.J., Yun, C.H., and Cho, C.S. (2012). Design and
application of chitosan microspheres as oral and nasal vaccine carriers: An updated
review. Int. J. Nanomedicine 7, 6077–6093.
95.
Itakura, A., Szczepanik, M., Campos, R.A., Paliwal, V., Majewska, M., Matsuda, H.,
Takatsu, K., and Askenase, P.W. (2005). An hour after immunization peritoneal B-1
cells are activated to migrate to lymphoid organs where within 1 day they produce IgM
antibodies that initiate elicitation of contact sensitivity. J. Immunol. 175, 7170–7178.
96.
Jankovic, D., Kullberg, M.C., Caspar, P., and Sher, A. (2004). Parasite-induced Th2
polarization is associated with down-regulated dendritic cell responsiveness to Th1
stimuli and a transient delay in T lymphocyte cycling. J. Immunol. 173, 2419–2427.
97.
Jansen, M.J., Hendriks, T., Verhofstad, A.A., Lange, W., Geeraedts, L.M., and Goris,
R.J. (1997). Gradual development of organ damage in the murine zymosan-induced
multiple organ dysfunction syndrome. Shock 8, 261–267.
98.
Jia, L., Gao, X., Wang, Y., Yao, N., and Zhang, X. (2014). Structural, phenotypic and
functional maturation of bone marrow dendritic cells (BMDCs) induced by Chitosan
(CTS). Biologicals 42, 334–338.
99.
Jiang, X., Shen, C., Rey-Ladino, J., Yu, H., and Brunham, R.C. (2008). Characterization
of Murine Dendritic Cell Line JAWS II and Primary Bone Marrow-Derived Dendritic
Cells in Chlamydia muridarum Antigen Presentation and Induction of Protective
Immunity. Infect. Immun. 76, 2392–2401.
100. Kay, E., Scotland, R.S., and Whiteford, J.R. (2013). Toll-like receptors: Role in
inflammation and therapeutic potential. Biofactors 40, 284–294.
101. Kim, M.S., and Kim, T.S. (2014). IgA+ plasma cells in murine intestinal lamina propria
as a positive regulator of Treg differentiation. J. Leukoc. Biol. 95, 461–469.
102. Kim, J.-S., Kim, J.-G., Moon, M.-Y., Jeon, C.-Y., Won, H.-Y., Kim, H.-J., Jeon, Y.-J.,
Seo, J.-Y., Kim, J.-I., Kim, J., et al. (2006). Transforming growth factor-beta1 regulates
macrophage migration via RhoA. Blood 108, 1821–1829.
103. Kita, H. (2011). Eosinophils: Multifaceted biological properties and roles in health and
disease. Immunol. Rev. 242, 161–177.
104. Van der Kleij, D., Latz, E., Brouwers, J.F.H.M., Kruize, Y.C.M., Schmitz, M., KurtJones, E.A., Espevik, T., de Jong, E.C., Kapsenberg, M.L., Golenbock, D.T., et al.
(2002). A novel host-parasite lipid cross-talk. Schistosomal lyso-phosphatidylserine
activates toll-like receptor 2 and affects immune polarization. J. Biol. Chem. 277,
48122–48129.
105. Klion, A.D., and Nutman, T.B. (2004). The role of eosinophils in host defense against
helminth parasites. J. Allergy Clin. Immunol. 113, 30–37.
106. Knopp, S., Steinmann, P., Keiser, J., and Utzinger, J. (2012). Nematode infections: soiltransmitted helminths and trichinella. Infect. Dis. Clin. North Am. 26, 341–358.
107. Knox, D.P., Redmond, D.L., Newlands, G.F., Skuce, P.J., Pettit, D., and Smith, W.D.
(2003). The nature and prospects for gut membrane proteins as vaccine candidates for
Haemonchus contortus and other ruminant trichostrongyloids. Int. J. Parasitol. 33,
1129–1137.
137
8. Spis literatury
108. Kołodziej-Sobocińska, M., Dvoroznakova, E., and Dziemian, E. (2006). Trichinella
spiralis: macrophage activity and antibody response in chronic murine infection. Exp.
Parasitol. 112, 52–62.
109. Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., and Kuchroo, V.K. (2009). IL-17 and Th17 Cells.
Annu. Rev. Immunol. 27, 485–517.
110. Koyama, K., Tamauchi, H., and Ito, Y. (1995). The role of CD4+ and CD8+ T cells in
protective immunity to the murine nematode parasite Trichuris muris. Parasite
Immunol. 17, 161–165.
111. Kreindler, J.L., Steele, C., Nguyen, N., Chan, Y.R., Pilewski, J.M., Alcorn, J.F., Vyas,
Y.M., Aujla, S.J., Finelli, P., Blanchard, M., et al. (2010). Vitamin D3 attenuates Th2
responses to Aspergillus fumigatus mounted by CD4+ T cells from cystic fibrosis
patients with allergic bronchopulmonary aspergillosis. J. Clin. Invest. 120, 3242–3254.
112. Kroese, F.G., Butcher, E.C., Stall, A.M., Lalor, P.A., Adams, S., and Herzenberg, L.A.
(1989). Many of the IgA producing plasma cells in murine gut are derived from selfreplenishing precursors in the peritoneal cavity. Int. Immunol. 1, 75–84.
113. Lee, J.J., and Lee, N. a. (2005). Eosinophil degranulation: An evolutionary vestige or a
universally destructive effector function? Clin. Exp. Allergy 35, 986–994.
114. Lee, B.Y., Bacon, K.M., Bailey, R., Wiringa, A.E., and Smith, K.J. (2011). The
potential economic value of a hookworm vaccine. Vaccine 29, 1201–1210.
115. Lee, C.G., Da Silva, C. a., Lee, J.Y., Hartl, D., and Elias, J. a. (2008). Chitin regulation
of immune responses: an old molecule with new roles. Curr. Opin. Immunol. 20, 684–
689.
116. Lenardon, M.D., Munro, C.A., and Gow, N.A.R. (2010). Chitin synthesis and fungal
pathogenesis. Curr. Opin. Microbiol. 13, 416–423.
117. Lim, C.K., Halim, a S., Lau, H.Y., Ujang, Z., and Hazri, A. (2007). In vitro
cytotoxicology model of oligo-chitosan and n, o-carboxymethyl chitosan using primary
normal human epidermal keratinocyte cultures. J. Appl. Biomater. Biomech. 5, 82–87.
118. Lin, C.Y., Chen, W.P., Yang, L.Y., Chen, A., and Huang, T.P. (1998). Persistent
transforming growth factor-beta 1 expression may predict peritoneal fibrosis in CAPD
patients with frequent peritonitis occurrence. Am. J. Nephrol. 18, 513–519.
119. Lindell, D.M., Berlin, A.A., Schaller, M.A., and Lukacs, N.W. (2008). B cell antigen
presentation promotes Th2 responses and immunopathology during chronic allergic
lung disease. PLoS One 3, e3129.
120. Liu, S.K. (1965). Pathology of Nematospiroides dubius. I. Primary infections in C3H
and Webster mice. Exp. Parasitol. 17, 123–135.
121. Liu, Q., Arseculeratne, C., Liu, Z., Whitmire, J., Grusby, M.J., Finkelman, F.D.,
Darling, T.N., Cheever, A.W., Swearengen, J., Urban, J.F., et al. (2004a). Simultaneous
deficiency in CD28 and STAT6 results in chronic ectoparasite-induced inflammatory
skin disease. Infect. Immun. 72, 3706–3715.
122. Liu, Z., Liu, Q., Pesce, J., Anthony, R.M., Lamb, E., Whitmire, J., Hamed, H.,
Morimoto, M., Urban, J.F., and Gause, W.C. (2004b). Requirements for the
development of IL-4-producing T cells during intestinal nematode infections: what it
takes to make a Th2 cell in vivo. Immunol. Rev. 201, 57–74.
138
8. Spis literatury
123. MacDonald, A.S., and Maizels, R.M. (2008). Alarming dendritic cells for Th2
induction. J. Exp. Med. 205, 13–17.
124. MacDonald, A.S., Araujo, M.I., and Pearce, E.J. (2002). Immunology of parasitic
helminth infections. Infect. Immun. 70, 427–433.
125. MacKay, V.L., and Moore, E.E. (1997). Immortalized dendritic cells. US Pat.
5,648,219.
126. Macpherson, A.J., Gatto, D., Sainsbury, E., Harriman, G.R., Hengartner, H., and
Zinkernagel, R.M. (2000). A primitive T cell-independent mechanism of intestinal
mucosal IgA responses to commensal bacteria. Science 288, 2222–2226.
127. Maizels, R.M., Holland, M.J., Falcone, F.H., Zang, X.X., and Yazdanbakhsh, M.
(1999). Vaccination against helminth parasites - The ultimate challenge for
vaccinologists? Immunol. Rev. 171, 125–147.
128. Maizels, R.M., Blaxter, M.L., and Scott, A.L. (2001). Immunological genomics of
Brugia malayi: Filarial genes implicated in immune evasion and protective immunity.
Parasite Immunol. 23, 327–344.
129. Maizels, R.M., Balic, A., Gomez-Escobar, N., Nair, M., Taylor, M.D., and Allen, J.E.
(2004). Helminth parasites - Masters of regulation. Immunol. Rev. 201, 89–116.
130. Malinovsky, F.G., Fangel, J.U., and Willats, W.G.T. (2014). The role of the cell wall in
plant immunity. Front. Plant Sci. 5, 178.
131. Mann, A.J., Noulin, N., Catchpole, A., Stittelaar, K.J., De Waal, L., Veldhuis Kroeze,
E.J.B., Hinchcliffe, M., Smith, A., Montomoli, E., Piccirella, S., et al. (2014). Intranasal
H5N1 vaccines, adjuvanted with chitosan derivatives, protect ferrets against highly
pathogenic influenza intranasal and intratracheal challenge. PLoS One 9, e93761.
132. Manolova, V., Flace, A., Bauer, M., Schwarz, K., Saudan, P., and Bachmann, M.F.
(2008). Nanoparticles target distinct dendritic cell populations according to their size.
Eur. J. Immunol. 38, 1404–1413.
133. Manoury, B., Gregory, W.F., Maizels, R.M., and Watts, C. (2001). Bm-CPI-2, a
cystatin homolog secreted by the filarial parasite Brugia malayi, inhibits class II MHCrestricted antigen processing. Curr. Biol. 11, 447–451.
134. Mant, A., Chinnery, F., Elliott, T., and Williams, A.P. (2012). The pathway of crosspresentation is influenced by the particle size of phagocytosed antigen. Immunology
136, 163–175.
135. Martin, F., and Kearney, J.F. (2001). B1 cells: similarities and differences with other B
cell subsets. Curr. Opin. Immunol. 13, 195–201.
136. Martín-Fontecha, A., Lanzavecchia, A., and Sallusto, F. (2009). Dendritic cell migration
to peripheral lymph nodes. Handb. Exp. Pharmacol. 31–49.
137. Maseda, D., Candando, K.M., Smith, S.H., Kalampokis, I., Weaver, C.T., Plevy, S.E.,
Poe, J.C., and Tedder, T.F. (2013). Peritoneal cavity regulatory B cells (B10 cells)
modulate IFN-γ+CD4+ T cell numbers during colitis development in mice. J. Immunol.
191, 2780–2795.
138. McCoy, K.D., Stoel, M., Stettler, R., Merky, P., Fink, K., Senn, B.M., Schaer, C.,
Massacand, J., Odermatt, B., Oettgen, H.C., et al. (2008). Polyclonal and Specific
Antibodies Mediate Protective Immunity against Enteric Helminth Infection. Cell Host
Microbe 4, 362–373.
139
8. Spis literatury
139. McVay, C.S., Tsung, A., and Appleton, J. (1998). Participation of parasite surface
glycoproteins in antibody-mediated protection of epithelial cells against Trichinella
spiralis. Infect. Immun. 66, 1941–1945.
140. Meeusen, E.N.T., and Balic, a. (2000). Do eosinophils have a role in the killing of
helminth parasites? Parasitol. Today 16, 95–101.
141. Mei, Y., Chen, H., Zhang, J., Zhang, X., and Liang, Y. (2013). Protective effect of
chitooligosaccharides against cyclophosphamide-induced immunosuppression in mice.
Int. J. Biol. Macromol. 62, 330–335.
142. Merzendorfer, H. (2013). Chitin synthesis inhibitors: Old molecules and new
developments. Insect Sci. 20, 121–138.
143. Metwali, A., Setiawan, T., Blum, A.M., Urban, J., Elliott, D.E., Hang, L., and
Weinstock, J. V (2006). Induction of CD8+ regulatory T cells in the intestine by
Heligmosomoides polygyrus infection. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 291,
G253–G259.
144. Misharin, A. V, Saber, R., and Perlman, H. (2012). Eosinophil contamination of
thioglycollate-elicited peritoneal macrophage cultures skews the functional readouts of
in vitro assays. J. Leukoc. Biol. 92, 325–331.
145. Molinaro, G., Leroux, J.-C., Damas, J., and Adam, A. (2002). Biocompatibility of
thermosensitive chitosan-based hydrogels: an in vivo experimental approach to
injectable biomaterials. Biomaterials 23, 2717–2722.
146. Monroy, F.G., and Enriquez, F.J. (1992). Heligmosomoides polygyrus: a model for
chronic gastrointestinal helminthiasis. Parasitol. Today 8, 49–54.
147. Moon, H., Lee, J.-G., Shin, S.H., and Kim, T.J. (2012). LPS-induced migration of
peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory
sensitivity to CXCL12. J. Korean Med. Sci. 27, 27–35.
148. Moreau, E., and Chauvin, A. (2010). Immunity against helminths: Interactions with the
host and the intercurrent infections. J. Biomed. Biotechnol. 2010.
149. Mori, T., Murakami, M., Okumura, M., Kadosawa, T., Uede, T., and Fujinaga, T.
(2005). Mechanism of macrophage activation by chitin derivatives. J. Vet. Med. Sci. 67,
51–56.
150. Mosmann, T.R., Cherwinski, H., Bond, M.W., Giedlin, M. a, and Coffman, R.L. (1986).
Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of
lymphokine activities and secreted proteins. J. Immunol. 136, 2348–2357.
151. Muzzarelli, R.A. (1997). Human enzymatic activities related to the therapeutic
administration of chitin derivatives. Cell. Mol. Life Sci. 53, 131–140.
152. Nair, M.G., Gallagher, I.J., Taylor, M.D., Loke, P., Coulson, P.S., Wilson, R. a.,
Maizels, R.M., and Allen, J.E. (2005). Chitinase and Fizz family members are a
generalized feature of nematode infection with selective upregulation of Ym1 and Fizz1
by antigen-presenting cells. Infect. Immun. 73, 385–394.
153. Netea, M.G., Van Der Meer, J.W.M., Sutmuller, R.P., Adema, G.J., and Kullberg, B.J.
(2005). From the Th1/Th2 paradigm towards a toll-like receptor/T-helper bias.
Antimicrob. Agents Chemother. 49, 3991–3996.
154. O’Dea, E.M., Amarsaikhan, N., Li, H., Downey, J., Steele, E., Van Dyken, S.J.,
Locksley, R.M., and Templeton, S.P. (2014). Eosinophils are recruited in response to
140
8. Spis literatury
chitin exposure and enhance Th2-mediated immune pathology in aspergillus Fumigatus
infection. Infect. Immun. 82, 3199–3205.
155. Onah, D.N., and Nawa, Y. (2000). Mucosal immunity against parasitic gastrointestinal
nematodes. Korean J. Parasitol. 38, 209–236.
156. Otsu, S., Gotoh, K., Yamashiro, T., Yamagata, J., Shin, K., Fujioka, T., and Nishizono,
A. (2006). Transfer of antigen-pulsed dendritic cells induces specific T-cell proliferation
and a therapeutic effect against long-term Helicobacter pylori infection in mice. Infect.
Immun. 74, 984–993.
157. Otterlei, M., Vårum, K.M., Ryan, L., and Espevik, T. (1994). Characterization of
binding and TNF-α-inducing ability of chitosans on monocytes: The involvement of
CD14. Vaccine 12, 825–832.
158. Owyang, A.M., Zaph, C., Wilson, E.H., Guild, K.J., McClanahan, T., Miller, H.R.P.,
Cua, D.J., Goldschmidt, M., Hunter, C. a, Kastelein, R. a, et al. (2006). Interleukin 25
regulates type 2 cytokine-dependent immunity and limits chronic inflammation in the
gastrointestinal tract. J. Exp. Med. 203, 843–849.
159. Pan, C., Kumar, C., Bohl, S., Klingmueller, U., and Mann, M. (2008). Comparative
Proteomic Phenotyping of Cell Lines and Primary Cells to Assess Preservation of Cell
Type-specific Functions. Mol. Cell. Proteomics 8, 443–450.
160. Pashine, A., Valiante, N.M., and Ulmer, J.B. (2005). Targeting the innate immune
response with improved vaccine adjuvants. Nat. Med. 11, S63–S68.
161. Patel, N., Kreider, T., Urban, J.F., and Gause, W.C. (2009). Characterisation of effector
mechanisms at the host:parasite interface during the immune response to tissuedwelling intestinal nematode parasites. Int. J. Parasitol. 39, 13–21.
162. Paul, W.E. (2010). What determines Th2 differentiation, in vitro and in vivo? Immunol.
Cell Biol. 88, 236–239.
163. Phythian-Adams, A.T., Cook, P.C., Lundie, R.J., Jones, L.H., Smith, K. a, Barr, T. a,
Hochweller, K., Anderton, S.M., Hämmerling, G.J., Maizels, R.M., et al. (2010).
CD11c depletion severely disrupts Th2 induction and development in vivo. J. Exp.
Med. 207, 2089–2096.
164. Porporatto, C., Bianco, I.D., and Correa, S.G. (2005). Local and systemic activity of the
polysaccharide chitosan at lymphoid tissues after oral administration. J. Leukoc. Biol.
78, 62–69.
165. Ramakrishnan, L. (2012). Revisiting the role of the granuloma in tuberculosis. Nat.
Rev. Immunol. 12, 352–366.
166. Ramalingam, T., Rajan, B., Lee, J., and Rajan, T. V. (2003). Kinetics of cellular
responses to intraperitoneal Brugia pahangi infections in normal and immunodeficient
mice. Infect. Immun. 71, 4361–4367.
167. Ray, A., and Dittel, B.N. (2010). Isolation of mouse peritoneal cavity cells. J. Vis. Exp.
447, 92–96.
168. Reese, T. a, Liang, H.-E., Tager, A.M., Luster, A.D., Van Rooijen, N., Voehringer, D.,
and Locksley, R.M. (2007). Chitin induces accumulation in tissue of innate immune
cells associated with allergy. Nature 447, 92–96.
169. Reynolds, L. a., Filbey, K.J., and Maizels, R.M. (2012). Immunity to the model
intestinal helminth parasite Heligmosomoides polygyrus.
141
8. Spis literatury
170. Rincón, M., Anguita, J., Nakamura, T., Fikrig, E., and Flavell, R.A. (1997). Interleukin
(IL)-6 directs the differentiation of IL-4-producing CD4+ T cells. J. Exp. Med. 185,
461–469.
171. Robinson, M.W., Gare, D.C., and Connolly, B. (2005). Profiling excretory/secretory
proteins of Trichinella spiralis muscle larvae by two-dimensional gel electrophoresis
and mass spectrometry. Vet. Parasitol. 132, 37–41.
172. Robinson, M.W., Greig, R., Beattie, K. a., Lamont, D.J., and Connolly, B. (2007).
Comparative analysis of the excretory-secretory proteome of the muscle larva of
Trichinella pseudospiralis and Trichinella spiralis. Int. J. Parasitol. 37, 139–148.
173. Roy, B., Brennecke, A.M., Agarwal, S., Krey, M., Düber, S., and Weiss, S. (2013a). An
intrinsic propensity of murine peritoneal B1b cells to switch to IgA in presence of TGFβ and retinoic acid. PLoS One 8, e82121.
174. Roy, R.M., Paes, H.C., Nanjappa, S.G., Sorkness, R., Gasper, D., Sterkel, A., Wüthrich,
M., and Klein, B.S. (2013b). Complement component 3C3 and C3a receptor are
required in chitin-dependent allergic sensitization to Aspergillus fumigatus but
dispensable in chitin-induced innate allergic inflammation. MBio 4.
175. Rückerl, D., and Allen, J.E. (2014). Macrophage proliferation, provenance, and
plasticity in macroparasite infection. Immunol. Rev. 262, 113–133.
176. Sackett, D., Holmes, P., Abbott, K., Jephcott, S., and Barber, M. (2006). Assessing the
economic cost of endemic disease on the profitability of Australian beef cattle and
sheep producers. AHW 87 119.
177. Satoh, T., Takeuchi, O., Vandenbon, A., Yasuda, K., Tanaka, Y., Kumagai, Y., Miyake,
T., Matsushita, K., Okazaki, T., Saitoh, T., et al. (2010). The Jmjd3-Irf4 axis regulates
M2 macrophage polarization and host responses against helminth infection. Nat.
Immunol. 11, 936–944.
178. Schlosser, A., Thomsen, T., Moeller, J.B., Nielsen, O., Tornøe, I., Mollenhauer, J.,
Moestrup, S.K., and Holmskov, U. (2009). Characterization of FIBCD1 as an acetyl
group-binding receptor that binds chitin. J. Immunol. 183, 3800–3809.
179. Shadman, N., Ebrahimi, S.F., Jafari, S., and Eslami, M. (2009). Peripheral giant cell
granuloma: a review of 123 cases. Dent. Res. J. (Isfahan). 6, 47–50.
180. Shanta, C.S., and Meerovitch, E. (1967). The life cycle of trichinella spiralis. I. The
intestinal phase of development. Can. J. Zool. 45, Suppl:1255–1260.
181. Sharifi, S., Behzadi, S., Laurent, S., Forrest, M.L., Stroeve, P., and Mahmoudi, M.
(2012). Toxicity of nanomaterials. Chem. Soc. Rev. 41, 2323–2343.
182. Shimoda, K., van Deursen, J., Sangster, M.Y., Sarawar, S.R., Carson, R.T., Tripp, R. a,
Chu, C., Quelle, F.W., Nosaka, T., Vignali, D. a, et al. (1996). Lack of IL-4-induced
Th2 response and IgE class switching in mice with disrupted Stat6 gene. Nature 380,
630–633.
183. Shintoku, Y., Kadosaka, T., Kimura, E., Takagi, H., Kondo, S., and Itoh, M. (2013).
Intestinal mast cells and eosinophils in relation to Strongyloides ratti adult expulsion
from the small and large intestines of rats. Parasitology 140, 626–631.
184. Sica, A., and Mantovani, A. (2012). JCI - Macrophage plasticity and polarization: in
vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787–795.
142
8. Spis literatury
185. Soga, K., Yamada, M., and Naito, Y. (2013). Mucin-Related Molecular Responses of
Bronchial Epithelial Cells in Rats Infected with the Nematode Nippostrongylus
brasiliensis. ISRN Parasitol.
186. Spencer, L.A. (2014). Eosinophil secretion of granule-derived cytokines. Front.
Immunol. 5.
187. Stacey, G. (2001). Primary Cell Cultures and Immortal Cell Lines. eLS.
188. Stein, J. V., and Nombela-Arrieta, C. (2005). Chemokine control of lymphocyte
trafficking: A general overview. Immunology 116, 1–12.
189. Stout, R.D., and Suttles, J. (2004). Functional plasticity of macrophages: reversible
adaptation to changing microenvironments. J. Leukoc. Biol. 76, 509–513.
190. Stuart, L.M., Paquette, N., and Boyer, L. (2013). Effector-triggered versus patterntriggered immunity: how animals sense pathogens. Nat. Rev. Immunol. 13, 199–206.
191. Sutherland, R.E., Xu, X., Kim, S.S., Seeley, E.J., Caughey, G.H., and Wolters, P.J.
(2011). Parasitic infection improves survival from septic peritonitis by enhancing mast
cell responses to bacteria in mice. PLoS One 6, e27564.
192. Tachu, B., Pillai, S., Lucius, R., and Pogonka, T. (2008). Essential role of chitinase in
the development of the filarial nematode Acanthocheilonema viteae. Infect. Immun. 76,
221–228.
193. Tangye, S.G. (2013). To B1 or not to B1: That really is still the question! Blood 121,
5109–5110.
194. Taylor, M.D., LeGoff, L., Harris, A., Malone, E., Allen, J.E., and Maizels, R.M. (2005).
Removal of regulatory T cell activity reverses hyporesponsiveness and leads to filarial
parasite clearance in vivo. J. Immunol. 174, 4924–4933.
195. Telford, G., Wheeler, D.J., Appleby, P., Bowen, J.G., and Pritchard, D.I. (1998).
Heligmosomoides polygyrus immunomodulatory factor (IMF), targets T-lymphocytes.
Parasite Immunol. 20, 601–611.
196. Thomas, P.G., Carter, M.R., Atochina, O., Da’Dara, A. a, Piskorska, D., McGuire, E.,
and Harn, D. a (2003). Maturation of dendritic cell 2 phenotype by a helminth glycan
uses a Toll-like receptor 4-dependent mechanism. J. Immunol. 171, 5837–5841.
197. Thornton, B.P., Vĕtvicka, V., Pitman, M., Goldman, R.C., and Ross, G.D. (1996).
Analysis of the sugar specificity and molecular location of the beta-glucan-binding
lectin site of complement receptor type 3 (CD11b/CD18). J. Immunol. 156, 1235–1246.
198. Tokura, S., Tamura, H., and Azuma, I. (1999). Immunological aspects of chitin and
chitin derivatives administered to animals. EXS 87, 279–292.
199. Torgerson, P.R. (2013). One world health: Socioeconomic burden and parasitic disease
control priorities. Vet. Parasitol. 195, 223–232.
200. Tsujimoto, H., Ono, S., Mochizuki, H., Aosasa, S., Majima, T., Ueno, C., and
Matsumoto, A. (2002). Role of macrophage inflammatory protein 2 in acute lung injury
in murine peritonitis. J. Surg. Res. 103, 61–67.
201. Vallance, B. a, Galeazzi, F., Collins, S.M., and Snider, D.P. (1999). CD4 T Cells and
Major Histocompatibility Complex Class II Expression Influence Worm Expulsion and
Increased Intestinal Muscle Contraction during Trichinella spiralis Infection CD4 T
Cells and Major Histocompatibility Complex Class II Expression Influence . Infect.
Immun. 67, 6090–6097.
143
8. Spis literatury
202. Vandevord, P.J., Matthew, H.W.T., Desilva, S.P., Mayton, L., Wu, B., and Wooley,
P.H. (2002). Evaluation of the biocompatibility of a chitosan scaffold in mice. J.
Biomed. Mater. Res. 59, 585–590.
203. Velupillai, P., Secor, W.E., Horauf, a M., and Harn, D. a (1997). B-1 cell (CD5+B220+)
outgrowth in murine schistosomiasis is genetically restricted and is largely due to
activation by polylactosamine sugars. J. Immunol. 158, 338–344.
204. Venugopal, P.G., Nutman, T.B., and Semnani, R.T. (2009). Activation and regulation of
Toll-Like Receptors (TLRs) by helminth parasites. Immunol. Res. 43, 252–263.
205. Veronico Gray, LJ, Jones, JT, Bazzicalupo, P, Arbucci, S, Cortese, MR, Di Vito, M, De
Giorgi, C, P. (2001). Nematode chitin synthases: gene structure, expression and
function in Caenorhabditis elegans and the plant parasitic nematode Meloidogyne
artiella. Mol Genet Genom 266, 28–34.
206. Vieira, P.L., de Jong, E.C., Wierenga, E. a, Kapsenberg, M.L., and Kaliński, P. (2000).
Development of Th1-inducing capacity in myeloid dendritic cells requires
environmental instruction. J. Immunol. 164, 4507–4512.
207. Villiers, C., Chevallet, M., Diemer, H., Couderc, R., Freitas, H., Van Dorsselaer, A.,
Marche, P.N., and Rabilloud, T. (2009). From secretome analysis to immunology:
chitosan induces major alterations in the activation of dendritic cells via a TLR4dependent mechanism. Mol. Cell. Proteomics 8, 1252–1264.
208. Voehringer, D., Reese, T. a, Huang, X., Shinkai, K., and Locksley, R.M. (2006). Type 2
immunity is controlled by IL-4/IL-13 expression in hematopoietic non-eosinophil cells
of the innate immune system. J. Exp. Med. 203, 1435–1446.
209. Volman, T.J.H., Hendriks, T., and Goris, R.J. a (2005). Zymosan-Induced Generalized
Inflammation: Experimental Studies Into Mechanisms Leading To Multiple Organ
Dysfunction Syndrome. Shock 23, 291–297.
210. Wagener, J., Malireddi, R.K.S., Lenardon, M.D., Köberle, M., Vautier, S., MacCallum,
D.M., Biedermann, T., Schaller, M., Netea, M.G., Kanneganti, T.D., et al. (2014).
Fungal Chitin Dampens Inflammation through IL-10 Induction Mediated by NOD2 and
TLR9 Activation. PLoS Pathog. 10, e1004050.
211. Wakelin, D., and Donachie, A.M. (1983). Genetic control of immunity to Trichinella
spiralis: influence of H-2-linked genes on immunity to the intestinal phase of infection.
Immunology 48, 343–350.
212. Waller, P.J. (2003). Global perspectives on nematode parasite control in ruminant
livestock: the need to adopt alternatives to chemotherapy, with emphasis on biological
control. Anim. Health Res. Rev. 4, 35–43.
213. Walton, S.F., Pizzutto, S., Slender, A., Viberg, L., Holt, D., Hales, B.J., Kemp, D.J.,
Currie, B.J., Rolland, J.M., and O’Hehir, R. (2010). Increased allergic immune response
to Sarcoptes scabiei antigens in crusted versus ordinary scabies. Clin. Vaccine
Immunol. 17, 1428–1438.
214. Wang, B., Wang, Z.Q., Jin, J., Ren, H.J., Liu, L.N., and Cui, J. (2013a). Cloning,
expression and characterization of a Trichinella spiralis serine protease gene encoding a
35.5 kDa protein. Exp. Parasitol. 134, 148–154.
215. Wang, C., Yu, X., Cao, Q., Wang, Y., Zheng, G., Tan, T.K., Zhao, H., Zhao, Y., Wang,
Y., and Harris, D.C. (2013b). Characterization of murine macrophages from bone
marrow, spleen and peritoneum. BMC Immunol. 14, 6.
144
8. Spis literatury
216. Wang, H.H., Lin, C.Y., and Huang, T.P. (2003). Patterns of CD4/CD8 T-cell ratio in
dialysis effluents predict the long-term outcome of peritonitis in patients undergoing
peritoneal dialysis. Nephrol. Dial. Transplant. 18, 1181–1189.
217. Wharton, D. a (1983). The production and functional morphology of helminth eggshells. Parasitology 86 (Pt 4), 85–97.
218. Wing, K., and Sakaguchi, S. (2010). Regulatory T cells exert checks and balances on
self tolerance and autoimmunity. Nat. Immunol. 11, 7–13.
219. Wisnewski, N., McNeil, M., Grieve, R.B., and Wassom, D.L. (1993). Characterization
of novel fucosyl- and tyvelosyl-containing glycoconjugates from Trichinella spiralis
muscle stage larvae. Mol. Biochem. Parasitol. 61, 25–36.
220. Wlodkowic, D., Skommer, J., and Darzynkiewicz, Z. (2012). Cytometry of apoptosis.
Historical perspective and new advances. Exp. Oncol. 34, 255–262.
221. Wynn, T.A., Thompson, R.W., Cheever, A.W., and Mentink-Kane, M.M. (2004).
Immunopathogenesis of schistosomiasis. Immunol. Rev. 201, 156–167.
222. Xiang, S.D., Scholzen, A., Minigo, G., David, C., Apostolopoulos, V., Mottram, P.L.,
and Plebanski, M. (2006). Pathogen recognition and development of particulate
vaccines: Does size matter? Methods 40, 1–9.
223. Xiao, D., Wang, Y., Liu, G., He, J., Qiu, W., Hu, X., Feng, Z., Ran, M., Nyachoti, C.M.,
Kim, S.W., et al. (2014). Effects of Chitosan on Intestinal Inflammation in Weaned Pigs
Challenged by Enterotoxigenic Escherichia coli. PLoS One 9, e104192.
224. Xu, W., and Banchereau, J. (2014). The Antigen Presenting Cells Instruct Plasma Cell
Differentiation. Front. Immunol. 4, 504.
225. Xu, Y., Darcy, P.K., and Kershaw, M.H. (2007). Tumor-specific dendritic cells
generated by genetic redirection of Toll-like receptor signaling against the tumorassociated antigen, erbB2. Cancer Gene Ther. 14, 773–780.
226. Yi, X., Zeng, C., Liu, H., Chen, X., Zhang, P., Yun, B.S., Jin, G., and Zhou, A. (2013).
Lack of RNase L attenuates macrophage functions. PLoS One 8, e81269.
227. Yoo, M.K., Kang, S.K., Choi, J.H., Park, I.K., Na, H.S., Lee, H.C., Kim, E.B., Lee,
N.K., Nah, J.W., Choi, Y.J., et al. (2010). Targeted delivery of chitosan nanoparticles to
Peyer’s patch using M cell-homing peptide selected by phage display technique.
Biomaterials 31, 7738–7747.
228. Yung, D., Kapral, M.K., Asllani, E., Fang, J., and Lee, D.S. (2012). Reinitiation of
Anticoagulation After Warfarin-Associated Intracranial Hemorrhage and Mortality
Risk: The Best Practice for Reinitiating Anticoagulation Therapy After Intracranial
Bleeding (BRAIN) Study. Can. J. Cardiol. 28, 33–39.
229. Zaharoff, D. a., Rogers, C.J., Hance, K.W., Schlom, J., and Greiner, J.W. (2007).
Chitosan solution enhances both humoral and cell-mediated immune responses to
subcutaneous vaccination. Vaccine 25, 2085–2094.
230. Zaph, C., Troy, A.E., Taylor, B.C., Berman-Booty, L.D., Guild, K.J., Du, Y., Yost, E. a,
Gruber, A.D., May, M.J., Greten, F.R., et al. (2007). Epithelial-cell-intrinsic IKK-beta
expression regulates intestinal immune homeostasis. Nature 446, 552–556.
231. Zhang, P., Liu, W., Peng, Y., Han, B., and Yang, Y. (2014). Toll like receptor 4 (TLR4)
mediates the stimulating activities of chitosan oligosaccharide on macrophages. Int.
Immunopharmacol. 23, 254–261.
145
8. Spis literatury
232. Zhao, A., Urban, J.F., Anthony, R.M., Sun, R., Stiltz, J., van Rooijen, N., Wynn, T. a.,
Gause, W.C., and Shea-Donohue, T. (2008). Th2 Cytokine-Induced Alterations in
Intestinal Smooth Muscle Function Depend on Alternatively Activated Macrophages.
Gastroenterology 135, 217–225.
233. Zhong, S., and Dobson, C. (1996). Heligmosomoides polygyrus: resistance in inbred,
outbred, and selected mice. Exp. Parasitol. 82, 122–131.
234. Zhu, D.Z., Lu, X.F., and Bell, R.G. (1990). Antigen-specific lymphocyte proliferative
responses in inbred mice after Trichinella spiralis infection. J. Parasitol. 76, 85–92.
146
Download