tom 43 numer 1 rok 2004

POST. MIKROBIOL.,
2004, 43, 1, 3–6
http://www.pm.microbiology.pl
Prof. dr hab. Krystyna Kote³ko
(1920–2003)
Prof. dr hab. Krystyna K o t e ³ k o urodzi³a
w Grodzisku Mazowieckim w 1920 r. Ukoñczy³a Gimnazjum im. Marii Konopnickiej, uzyskuj¹c w 1938 r. œwiadectwo dojrza³oœci. W tym
samym roku rozpoczê³a studia na Uniwersytecie
Warszawskim na Wydziale Matematyczno-Przyrodniczym. Studia te przerwa³ wybuch II Wojny
Œwiatowej. Podczas wojny pracowa³a jako laborantka w Miejskim Zak³adzie Higieny w Warszawie, gdzie pod kierunkiem prof. Aleksandra
£awrynowicza w praktyce laboratoryjnej poznawa³a mikrobiologiê. Bra³a udzia³ w ruchu oporu,
najpierw w Szarych Szeregach, a nastêpnie
w Sanitariacie Warszawskiego Kedywu, podczas
Powstania Warszawskiego – na Woli. Po upadku
powstania prowadzi³a laboratorium szpitalne.
W kwietniu 1945 r. przyjecha³a do £odzi, rozpoczynaj¹c drugi rok studiów na
powstaj¹cym Uniwersytecie £ódzkim. Tytu³ magistra filozofii w zakresie mikrobiologii uzyska³a w 1947 r. Po studiach podjê³a pracê w Pañstwowym Zak³adzie Higieny w £odzi, gdzie kierowa³a Pracowni¹ Zaka¿eñ Jelitowych. Stopieñ
naukowy doktora filozofii uzyska³a w 1951 r. na podstawie rozprawy pt. „Klasyfikacja serologiczna paciorkowców hemolizuj¹cych wyhodowanych z przypadków
p³onicy”. W 1952 r. rozpoczê³a pracê w Uniwersytecie £ódzkim w ówczesnym
Zak³adzie Bakteriologii (póŸniejszym Instytucie Mikrobiologii), kierowanym przez
prof. dr hab. Bernarda Z a b ³ o c k i e g o. Stopieñ naukowy doktora habilitowanego
uzyska³a w U£ w 1961 r. na podstawie rozprawy pt. „Chemiczne podstawy swoistoœci serologicznej antygenów O rodzaju Salmonella”. W 1969 r. nadano Jej tytu³
profesora nadzwyczajnego, a w 1976 r. – profesora zwyczajnego.
W pierwszych latach swojej pracy w Zak³adzie Bakteriologii U£ uczestniczy³a
w badaniach naukowych paciorkowców, gronkowców i pa³eczek czerwonki prowadzonych pod kierunkiem prof. B. Z a b ³ o c k i e g o. PóŸniej skoncentrowa³a
swoj¹ uwagê na budowie i funkcji wybranych antygenów powierzchniowych bakterii. Podjê³a te¿ badania bakteryjnych form L Proteus.
3
Najwiêkszym osi¹gniêciem naukowym Zmar³ej by³o stworzenie szko³y naukowej immunochemii antygenów bakterii. Wykorzystuj¹c swoje doœwiadczenia ze
sta¿y naukowych w Instytucie Pasteura w Pary¿u i Instytucie Immunobiologii
Maxa Plancka we Freiburgu (RFN) zapocz¹tkowa³a badania struktury chemicznej
i swoistoœci serologicznej lipopolisacharydu (LPS) i jego biologicznego znaczenia
jako endotoksyny u bakterii z rodzaju Proteus. Tym badaniom poœwiêci³a prawie
ca³e ¿ycie naukowe, przyczyniaj¹c siê do poznania podstaw molekularnych klasyfikacji serologicznej tych drobnoustrojów. Osi¹gniêcia Profesor Krystyny K o t e ³ k o
w tym zakresie mia³y tak¿e szersze znaczenie, bowiem wraz ze wspó³pracownikami
wykaza³a po raz pierwszy obecnoœæ kwasów uronowych i aminokwasów w LPS
Proteus, a tak¿e innych sk³adników dotychczas nie wykrywanych w tym antygenie
powierzchniowym bakterii. Zapocz¹tkowa³a te¿ badania struktury chemicznej i identyfikacji epitopów (determinant antygenowych) nadaj¹cych swoistoœæ serologiczn¹
antygenom O pa³eczek Proteus. Cennym osi¹gniêciem zespo³u, którym kierowa³a
by³o te¿ otrzymanie mutantów szorstkich (R); analiza LPS tych form pozwoli³a
bowiem poznaæ dwie pozosta³e, obok antygenu O, czêœci LPS – region rdzeniowy
i lipid A – tzw. centrum biologiczne endotoksyny. W zakresie badañ immunochemicznych i serologicznych wspó³pracowa³a z wymienionymi wy¿ej oœrodkami
zagranicznymi oraz z Instytutem Badawczym Borstel w Niemczech, Instytutem
Higieny Roberta Kocha w Wernigerode (Niemcy) i Instytutem Chemii Organicznej
Rosyjskiej Akademii Nauk w Moskwie. Znalaz³a uznanie w Polsce i za granic¹,
czego dowodem by³o wielokrotne powierzanie Jej prowadzenia sesji naukowych na
konferencjach krajowych i zagranicznych.
W 1961 prof. K. K o t e ³ k o zorganizowa³a od podstaw Zak³ad Mikrobiologii
Ogólnej, którym kierowa³a bez przerwy do przejœcia na emeryturê w roku 1991.
Z czasem rozszerzy³a jego profil badawczy o badania czynników chorobotwórczoœci bakterii z rodzaju Proteus. W latach 1977–1984 i 1988–1991 by³a dyrektorem
Instytutu Mikrobiologii. Bogaty i ró¿norodny dorobek naukowy Zmar³ej obejmuje
autorstwo lub wspó³autorstwo dwóch monografii na temat pa³eczek Proteus, 65 prac
doœwiadczalnych, 10 artyku³ów przegl¹dowych oraz kilkudziesiêciu komunikatów na zjazdach, konferencjach i sympozjach naukowych. By³a te¿ wspó³autork¹
trzech cenionych ksi¹¿ek – skryptu „Æwiczenia z mikrobiologii” oraz podrêczników
„Mikrobiologia dla farmaceutów” i „Biologia bakterii”.
Profesor Krystyna K o t e ³ k o wypromowa³a 8 doktorów, opiekowa³a siê 6 habilitantami, czworo Jej uczniów uzyska³o tytu³ profesora. Recenzowa³a 45 prac
doktorskich, 27 rozpraw habilitacyjnych i 23 wnioski o nadanie tytu³u profesora.
Jako wieloletni cz³onek Centralnej Komisji ds. Kadr Naukowych opracowa³a kilkadziesi¹t superrecenzji habilitacji i wniosków profesorskich.
Prof. dr hab. Krystyna K o t e ³ k o by³a bardzo dobrym organizatorem badañ
naukowych. Jej wielk¹ zas³ug¹ dla rozwoju mikrobiologii w Polsce by³o przygotowanie i kierowanie dwoma ogólnopolskimi programami badawczymi MR II.17
i CPBP 04.02, w których uczestniczy³y placówki naukowe z wiêkszoœci uczelni
wy¿szych i instytutów badawczych w kraju. Te, trwaj¹ce przez dziesiêæ lat, wspólne
prace zintegrowa³y œrodowisko mikrobiologów, pozwoli³y zintensyfikowaæ badania,
4
skoncentrowaæ uwagê zespo³ów na tematach istotnych dla spo³eczeñstwa – zagro¿eniu zaka¿eniami warunkowo-chorobotwórczymi patogenami, diagnostyce mikrobiologicznej, praktycznym wykorzystaniu drobnoustrojów w przemyœle i ich znaczeniu
w œrodowisku naturalnym. Miar¹ uznania zas³ug dla œrodowiska mikrobiologicznego w Polsce by³o powo³anie Jej do zespo³ów redakcyjnych czo³owych polskich czasopism mikrobiologicznych oraz kilku rad naukowych instytutów badawczych m.in.
Instytutu Immunologii i Terapii Doœwiadczalnej PAN we Wroc³awiu i Centrum
Mikrobiologii i Wirusologii PAN w £odzi. By³a te¿ cz³onkiem Komitetu Mikrobiologii PAN i Przewodnicz¹c¹ Komisji Immunochemii przy Komitecie Immunologii
PAN. Wybrano J¹ na cz³onka honorowego Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów.
Zosta³a te¿ wybrana do International Endotoxin Society. Uniwersytet £ódzki w dowód uznania osi¹gniêæ, dorobku oraz pozycji w nauce uroczyœcie odnowi³ w 2001 r.
prof. K. K o t e ³ k o dyplom doktorski, w 50. rocznicê jego otrzymania.
Prof. dr hab. Krystyna K o t e ³ k o by³a wzorem profesora uniwersyteckiego,
wspaniale ³¹cz¹c pracê badawcz¹ z dydaktyk¹. By³a wspania³ym pedagogiem,
erudyt¹, znakomicie potrafi¹cym zainteresowaæ s³uchaczy nawet najtrudniejszymi
tematami. Wyk³ada³a lekko, barwnie, piêkn¹ polszczyzn¹, w prowadzeniu wyk³adów znajduj¹c wielk¹ satysfakcjê oraz mo¿liwoœæ przekazywania nie tylko swojej
wiedzy i pasji, ale tak¿e w³asnych przemyœleñ i doœwiadczeñ osobistych Przywi¹zywa³a wielk¹ wagê do formy i stylu wyg³aszanego wyk³adu, a tak¿e pisanego artyku³u naukowego. By³a niedoœcignionym wzorem w tym wzglêdzie dla studentów
i m³odych pracowników naukowych. Wykszta³ci³a ponad stu magistrów mikrobiologii. Jako wybitnemu pedagogowi powierzono Jej w latach 1969–1972 funkcjê
Prorektora U£ ds. Dydaktyki, a w latach 1969–1977 przewodnictwo Ministerialnego
Zespo³u Dydaktyczno-Wychowawczego Biologii, w którym wspólnie z biologami
z innych uczelni opracowa³a, wprowadzony póŸniej w ¿ycie jednolity program
kszta³cenia biologów na wy¿szych uczelniach w Polsce.
Profesor Krystyna K o t e ³ k o by³a humanistk¹. Zna³a bardzo dobrze historiê,
zna³a i ceni³a literaturê, kocha³a sztukê zw³aszcza muzykê powa¿n¹, zna³a bardzo
dobrze jêzyki obce, czytaj¹c w oryginale literaturê francusk¹ i niemieck¹. Bardzo
dba³a o piêkno i bogactwo naszego jêzyka ojczystego, równie¿ naukowego w mikrobiologii, utrwalaj¹c na wyk³adach, w rozprawach i artyku³ach naukowych terminologiê polsk¹, proponuj¹c nowe terminy i ich znaczenie. Patriotyzm, przywi¹zanie do wolnoœci i niezale¿noœci, zasady tolerancji i poszanowania pogl¹dów osób
drugich – to wartoœci, którymi siê kierowa³a w swoim ¿yciu, zyskuj¹c uznanie,
szacunek oraz powa¿anie. By³a osob¹ bez reszty zaanga¿owan¹ w pracê naukow¹
i kszta³cenie studentów, charakteryzowa³a J¹ wielka pracowitoœæ, równie¿ po
przejœciu na emeryturê, dopiero w ostatnich latach z³y stan zdrowia nie pozwoli³
Jej ju¿ przychodziæ do Instytutu, wykazywa³a jednak dalej szczere zainteresowanie
problemami mikrobiologii.
Profesor Krystyna K o t e ³ k o by³a odznaczon¹ m.in. Z³otym Krzy¿em Zas³ugi,
Krzy¿ami – Kawalerskim i Komandorskim Orderu Odrodzenia Polski oraz Medalem
Komisji Edukacji Narodowej, a tak¿e wyró¿nion¹ wielokrotnie nagrodami Rektora
U£, Ministra i Sekretarza Naukowego PAN oraz w 1984 r Nagrod¹ Miasta £odzi.
5
Prof. dr hab. Krystyna K o t e ³ k o zmar³a 14 listopada 2003 r., zosta³a pochowana 20 listopada 2003 r. w Alei Zas³u¿onych na Cmentarzu Na Do³ach w £odzi.
Po¿egnaliœmy J¹ z ¿alem i smutkiem, pe³ni uznania dla Jej postawy ¿yciowej,
pracowitoœci, roztropnoœci oraz osi¹gniêæ i doœwiadczenia, wdziêczni za wszystko
co zrobi³a dla œrodowiska mikrobiologów w Polsce.
Pozostanie w naszej wdziêcznej pamiêci na zawsze.
Antoni Ró¿alski, Zygmunt Sidorczyk
6
POST. MIKROBIOL.,
2004, 43, 1, 7–38
http://www.pm.microbiology.pl
MECHANIZMY REGULACJI
CZYNNIKÓW WIRULENCJI
YERSINIA ENTEROCOLITICA
Katarzyna Brzostek
1. Wprowadzenie. 2. Molekularne pod³o¿e procesów adaptacyjnych. 2.1. Zmiany topologii DNA.
2.1.1. Kontrola superskrêcenia DNA. 2.1.2. Wp³yw topologii DNA na ekspresjê genów Y. enterocolitica. 2.2. Regulony czynników sigma (F). 2.3. Dwusk³adnikowe systemy regulacji. 3. Regulacja
syntezy czynników wirulencji Y. enterocolitica w odpowiedzi na bodŸce œrodowiskowe. 3.1. W³aœciwoœci wolno ¿yj¹cych Y. enterocolitica przed infekcj¹ organizmu gospodarza. Wczesny etap
infekcji zwi¹zany z przemieszczaniem siê patogenu ze œrodowiska zewnêtrznego do organizmu gospodarza. 3.1.1. Lipopolisacharyd (LPS). 3.1.2. Enterotoksyna Yst. 3.1.3. Transport ¿elaza z udzia³em sideroforów. 3.1.4. Maltoza i regulon maltozowy. 3.2. Ekspresja genów i czynników wirulencji podczas kolonizacji i inwazji tkanki nab³onkowej jelita. 3.2.1. Inwazyna Inv. 3.2.2. Adhezyna
Ail. 3.2.3. Adhezyna YadA. 3.2.4. Antygen Myf. 3.2.5. Udzia³ adhezyn w rozwoju infekcji.
3.3. Aktywnoœæ wirulonu Yop-wzrost zewn¹trzkomórkowy Y. enterocolitica oraz rozsianie zaka¿nia
do tkanek i narz¹dów. 3.3.1. Wirulon Yop. 3.3.2. Efektorowe bia³ka Yop. 3.3.3. Mechanizm
sekrecji i translokacji bia³ek Yop. 3.3.4. Sygna³y pochodz¹ce z organizmu gospodarza aktywuj¹ce
mechanizm sekrecji III typu-wapniowy paradoks. 3.3.5. Kontrola aktywnoœci wirulonu Yop. 4. Podsumowanie.
Regulation of virulence factors in Yersinia enterocolitica
Abstract: This review describes how environmental stimuli can modulate the expression of virulence
factors in Y. enterocolitica. The molecular mechanisms involved in regulation of virulence gene
expression are crucial and depend (among others) on changes in DNA topology and the activity of
transcriptional factors such as regulatory proteins of the AraC family, response regulators of the
two-component regulatory systems and sigma factors. These systems affect the survival of Y. enterocolitica in extra- and intracellular stress conditions. Growth temperature, osmolarity, pH, calcium and
iron ions influence the expression of Y. enterocolitica virulence factors. Some characteristics of such
virulence factors as LPS, enterotoxin Yst, adhesions Inv, Ail, YadA, Myf and their mechanism
of regulation are described. Special focus is on the Yop virulon and the type III secretion system.
Some new information regarding the regulation of Yops is presented.
1. Introduction. 2. The molecular mechanisms of adaptative responses. 2.1. Changes in topology of
DNA. 2.1.1. DNA supercoiling. 2.1.2. Topology DNA influences expression of Y. enterocolitica
genes. 2.2. Regulons of sigma factors. 2.3. Two-component regulatory systems. 3. Regulation of
virulence factors of Y. enterocolitica in response to environmental signals. 3.1. The ability of freeliving cells of Y. enterocolitica before invasion of the host. The early stages of infection connected
with the movement of the pathogen into the host organism. 3.1.1. Lipopolysaccharide (LPS).
3.1.2. Enterotoxin Yst. 3.1.3. Iron acquisition by siderophore-dependent transport. 3.1.4. Maltose and
the maltose regulon. 3.2. Virulence factors involved in the colonization and invasion of epithelial
tissue. 3.2.1. Invasin Inv. 3.2.2. Adhesin Ail. 3.2.3. YadA protein. 3.2.4. Myf antigen. 3.3. Activity
of the Yop virulon-extracellular growth of Y. enterocolitica and spread to deeper issues.
3.3.1. Virulon Yop. 3.3.2. Yop protein effectors. 3.3.3. Mechanism of the secretion and translocation
7
of Yop proteins. 3.3.4. Signals coming from the host activating type III secretion system. The calcium
paradox. 3.3.5. Control of the activity of the Yop virulon. 4. Summary.
1. Wprowadzenie
Z³o¿ona natura oddzia³ywañ pomiêdzy bakteriami patogennymi a œrodowiskiem
jest przedmiotem wielokierunkowych badañ. Analiza tych relacji s³u¿y poznaniu
mechanizmów bakteryjnej patogenezy, a tak¿e budowaniu teorii na temat rozprzestrzeniania siê bakterii patogennych w œwiecie (w œrodowisku). Proces adaptacji,
zwi¹zany zarówno z wolno¿yj¹cym jak i paso¿ytniczym trybem ¿ycia bakterii,
a tak¿e z zewn¹trzkomórkowym jak i wewn¹trzkomórkowym statusem patogenu,
polega na uruchamianiu z³o¿onych mechanizmów regulacyjnych. Kontroluj¹ one
podstawowe procesy metaboliczne oraz ekspresjê czynników wirulencji. Badania
regulacji ekspresji czynników zjadliwoœci pod wp³ywem bodŸców œrodowiskowych
u patogennych gatunków z rodzaju Yersinia przynios³y szereg istotnych danych
pozwalaj¹cych na pe³niejsze wyjaœnienie molekularnych podstaw bakteryjnej
patogenezy. Yersinia enterocolitica jest drobnoustrojem szeroko rozpowszechnionym w przyrodzie. Bakterie te dziêki doskonale funkcjonuj¹cym mechanizmom
adaptacyjnym s¹ zdolne do zasiedlania ró¿norodnych œrodowisk, w³¹czaj¹c w to
nisze ekologiczne zwi¹zane z organizmem gospodarza. Y. enterocolitica jest te¿
ludzkim enteropatogenem, etiologicznym czynnikiem jersiniozy, która mo¿e przybieraæ ró¿ne postaci kliniczne (jelitowe, pseudowyrostkowe, posocznicowe, rumieniowe oraz stawowe) [15].
Relacje typu: patogen-organizm gospodarza okreœlane s¹ czêsto jako dynamiczne pole bitewne, gdzie okreœlone strategie patogenu, zapewniaj¹ce prze¿ycie i namno¿enie, spotykaj¹ siê z licznymi i najczêœciej skutecznymi mechanizmami obronnymi uk³adu immunologicznego. W przypadku enteropatogennej Y. enterocolitica
powodzenie infekcji zale¿y od aktywnoœci wielu czynników wirulencji, kodowanych na plazmidzie pYV oraz chromosomie, które uczestnicz¹ w kolejnych
etapach patobiologii tego mikroorganizmu [28]. Uruchomienie z³o¿onych mechanizmów wirulencji pozwala na prze³amywanie bariery tkankowej, unikanie
ataku ze strony uk³adu immunologicznego, a tak¿e umo¿liwia wzrost w warunkach
ograniczenia w zwi¹zki od¿ywcze oraz w ogólnie niesprzyjaj¹cym œrodowisku
organizmu gospodarza.
W przebiegu infekcji wywo³anej Y. enterocolitica ró¿ne parametry fizykochemiczne œrodowiska s¹ bodŸcem do ekspresji okreœlonych czynników wirulencji.
Istotnymi w regulacji zjadliwoœci Y. enterocolitica s¹ temperatura, stê¿enie jonów
wapnia, ¿elaza, pH i osmolarnoœæ œrodowiska. Ekspresja genów wirulencji podlega
skomplikowanym mechanizmom regulacji, dziêki którym komórka doskonale adaptuje siê do okreœlonych warunków oraz czasami zwyciê¿a w walce z systemami
obronnymi gospodarza. Niniejsza praca przedstawia obecny stan wiedzy na temat
ekspresji czynników wirulencji u Y. enterocolitica w odpowiedzi na sygna³y p³yn¹ce
ze œrodowiska, a tak¿e wyniki badañ autorki nad mechanizmami tej regulacji.
8
2. Molekularne pod³o¿e procesów adaptacyjnych
2.1. Zmiany topologii DNA
2.1.1. Kontrola superskrêcenia
Kolista cz¹steczka DNA bakteryjnego jest zwiniêta przestrzennie i tworzy formê
superhelikaln¹1 [40]. Poziom superskrêcenia DNA ustalony jest w wyniku dzia³ania
mechanizmu homeostatycznego, w którym funkcjonuj¹ przede wszystkim dwie
topoizomery DNA, dzia³aj¹ce antagonistycznie [40]. Gyraza DNA zmniejsza liczbê
opleceñ (Lk) wprowadzaj¹c negatywne superskrêty, natomiast topoizomera I DNA
zwiêksza liczbê opleceñ, relaksuj¹c negatywne superskrêty. W rzeczywistoœci ten
homeostatyczny model ulega ró¿nym komplikacjom.
Ró¿ne czynniki (w tym œrodowiskowe) mog¹ bezpoœrednio lub poœrednio zmieniaæ stopieñ superskrêcenia DNA [37, 66]. Zmiany te s¹ korygowane poprzez
aktywnoœæ i preferencje substratow¹ topoizomeraz. W wyniku ich dzia³ania ustalony jest nowy poziom superskrêcenia, charakterystyczny dla danych warunków
wzrostu. Czynniki zmieniaj¹ce poziom superskrêcenia DNA mo¿na podzieliæ na:
– czynniki zmieniaj¹ce strukturê DNA (temperatura, transkrypcja, barwniki
interkaluj¹ce itp.). Pod wp³ywem temperatury zmniejsza siê wartoœæ Tw (liczba skrêtów), helisa siê rozkrêca. W œlad za tym nastêpuje relaksacja DNA,
co jest pierwsz¹ reakcj¹ komórki na zmienione warunki. Wówczas najczêœciej
uaktywniaj¹ siê korekcyjne w³aœciwoœci gyrazy, wzrasta jej aktywnoœæ oraz
synteza nowych cz¹steczek enzymu, co prowadzi do obni¿enia wartoœci Lk
(liczba opleceñ). Ostatecznie zmniejsza siê skrêcenie helisy przy wzroœcie
superskrêcenia DNA [95].
– czynniki zmieniaj¹ce energetykê komórki (szok osmotyczny, solny, beztlenowy). Szok osmotyczny powoduje wzrost indeksu ATP/ADP w komórce, co prowadzi do zwiêkszenia aktywnoœci gyrazy i wzrostu superskrêcenie DNA [51].
– czynniki zmieniaj¹ce aktywnoœæ topoizomeraz (dzia³anie inhibitorów lub mutacje w genach koduj¹cych enzymy). Inhibitory gyrazy powoduj¹ relaksacjê
DNA. Jeœli dawki inhibitora (np. nowobiocyny) s¹ ma³e to po chwilowym
hamowaniu aktywnoœci enzymu, zwiêksza siê ekspresja genów gyrA i gyrB
koduj¹cych odpowiednio podjednostki " i $ gyrazy. Wzrost syntezy enzymu
prowadzi do wzrostu superskrêcenia DNA [35].
Bardzo wysoki poziom superskrêcenia DNA sprzyja powstawaniu lokalnych, nietypowych struktur DNA, których tworzenie prowadzi do czêœciowej relaksacji DNA
bez zmiany liczby opleceñ (Lk). Wœród nich s¹ m.in.:
– Z-DNA-DNA o helisie lewoskrêtnej (mo¿e powstawaæ w obrêbie obszarów
bogatych w pary GC);
1
Superskrêcenie jest w³aœciwoœci¹ topologiczn¹ DNA, któr¹ opisuj¹ trzy wielkoœci. S¹ to: Tw,
liczba skrêtów (twist), która wskazuje ile razy tworz¹cy ko³o DNA zosta³ skrêcony; Wr (writhe),
liczba zwojów (superskrêtów), która mówi ile razy cz¹steczka DNA przeplata siê ze sob¹, DNA
bakteryjne jest superskrêcone ujemnie; Lk (linking number), liczba opleceñ opisuj¹ca ile razy dwie
nici helisy oplataj¹ siê wzajemnie. Miêdzy tymi wielkoœciami zachodzi zale¿noœæ: Lk = Tw+Wr
9
– formy krzy¿owe (cruciforms), które sk³adaj¹ siê z dwóch struktur „szpilki
do w³osów”. Tworz¹ siê dziêki sekwencjom palindromowym (odwrotnym
powtórzeniom z podwójn¹ osi¹ symetrii).
Dodatkowym czynnikiem sprzyjaj¹cym tworzeniu siê struktur jest wysokie stê¿enie soli (wystêpuj¹ce w komórce po zadzia³aniu szoku osmotycznego) [5, 95].
W regulacji superskrêcenia DNA wa¿n¹ rolê odgrywaj¹ tak¿e bia³ka histonopodobne, które mog¹ wi¹zaæ siê z DNA specyficznie co do sekwencji (np. HU, IHF)
lub charakterystycznej struktury (H-NS) [35, 37]. Bia³ka takie jak IHF czy H-NS
lokalnie zmieniaj¹ topologiê DNA poprzez uginanie b¹dŸ zapêtlanie helisy. Natomiast bia³ko HU nawija na siebie podwójn¹ helisê, przyczyniaj¹c siê w ten sposób
do wprowadzania i stabilizacji superskrêtów [40]. Bia³ka histonopodobne uczestnicz¹ w wielu procesach zachodz¹cych w komórkach takich jak transkrypcja, replikacja, rekombinacja, transpozycja. Bia³ko H-NS w wielu przypadkach jest negatywnym regulatorem transkrypcji, a jego oddzia³ywania z DNA zale¿y od warunków
œrodowiska. Niektóre z bia³ek histonopodobnych podlegaj¹ regulacji równie¿
poprzez czynniki œrodowiska takie jak temperatura (H-NS) czy faza wzrostu (FIS,
H-NS, IHF) [39]. Histonopodobnym bia³kiem u Y. enterocolitica jest YmoA. YmoA
jest bia³kiem o masie cz¹steczkowej 8,1 kDa. Badaj¹c w³aœciwoœci mutantów ymoA
Y. enterocolitica wykazano ich podobieñstwo do virF mutantów Shigella flexneri
pozbawionych bia³ka H-NS. YmoA nie jest jednak¿e odpowiednikiem H-NS E. coli
czy S. flexneri. Nie stwierdzono tak¿e homologii w sekwencji aminokwasowej
pomiêdzy YmoA, a bia³kami HU i IHF. Homologiem bia³ka YmoA okaza³ siê regulator syntezy hemolizyny u Escherichia coli [35]. Gen hha koduj¹cy ten regulator
z powodzeniem komplementuje mutacjê w genie ymoA Y. enterocolitica. Oba te bia³ka stanowi¹ wiêc now¹ klasê bia³ek histonopodobnych reguluj¹cych ekspresjê genów.
2.1.2. Wp³yw topologii DNA na ekspresjê genów Y. enterocolitica
Wyniki licznych badañ dowodz¹, ¿e topologia DNA odgrywa wa¿n¹ rolê w kontroli przede wszystkim inicjacji transkrypcji. Negatywne superskrêcenie sprzyja tworzeniu kompleksu otwartego w obrêbie promotora. Od superskrêcenia DNA zale¿¹
m.in. dostêp i mo¿liwoœæ wi¹zania siê polimerazy RNA z promotorem oraz po³o¿enie regionów regulatorowych wzglêdem siebie i promotora. Regulacji mog¹ podlegaæ tak¿e etapy elongacji i terminacji [35]. Istnieje tak¿e teoria, wg której zmiany
wartoœci Tw (skrêcenie helisy) w równym o ile nie w wiêkszym stopniu co zmiany
Wr (superskrêcenie DNA) wp³ywaj¹ na ekspresjê wielu genów. Stopieñ skrêcenia
helisy wp³ywa przede wszystkim na wzajemne po³o¿enie miejsc –10 i –35 promotora, co decyduje o powodzeniu przy³¹czenia polimerazy RNA.
O stopniu i jakoœci zmian Tw i Wr decyduj¹ m.in. czynniki œrodowiskowe. Hipotezê mówi¹c¹ o tym, ¿e zmiany topologii DNA indukowane zmianami warunków
œrodowiskowych s¹ istotnym elementem globalnej kontroli transkrypcji i mog¹
byæ kluczowym regulatorem ekspresji genów zjadliwoœci poparto ju¿ licznymi dowodami. Udzia³ topologii w regulacji ekspresji genów zjadliwoœci wykazano w przypadku Y. enterocolitica, S. flexneri, Salmonella enterica sv. Typhimurium, E. coli
czy Staphylococcus aureus [35, 36].
10
Temperatura wywiera plejotropowy efekt na ekspresjê genów u Y. enterocolitica
i prowadzi do wielu fenotypowych zmian. Ró¿nice temperaturowe wi¹¿¹ siê najczêœciej ze zmian¹ œrodowiska ¿ycia patogenu. Dotyczy to etapów przejœcia z 20–25°C
tj. temperatury œrodowiska zewnêtrznego do 37°C (ciep³ota cia³a ludzkiego). Zmiany fenotypowe Y. enterocolitica dotycz¹ morfologii i ruchliwoœci komórki, syntezy
bia³ek b³ony zewnêtrznej, cz¹steczki lipopolisacharydu (LPS), produkcji ureazy,
a tak¿e czynników wirulencji, kodowanych na chromosomie oraz na plazmidzie
pYV (Yersinia virulence) [15]. Wszystkie trzy patogenne dla cz³owieka gatunki
Yersinia tj. Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis oraz Y. pestis posiadaj¹ homologiczny plazmid zjadliwoœci (zwany odpowiednio pYV, pIB1, pCD1) [27]. Na
plazmidzie pYV Y. enterocolitica zlokalizowane s¹ geny yop koduj¹ce bia³ka sekrecyjne, które s¹ g³ównymi czynnikami wirulencji tego patogenu (szczegó³owy opis,
pkt. 3.3 pracy). Ekspresja genów yop zachodzi w temperaturze 37°C, w œrodowisku
pozbawionym jonów Ca+2. Poszukuj¹c mechanizmów regulacji temperaturowej
R o h d e i wsp. [83] analizowali zmiany w stopniu superskrêcenia DNA plazmidu
reporterowego pACYC184 izolowanego z komórek Y. enterocolitica poddanych
zmianom temperatury o 12°C (25°C i 37°C). Stopieñ superskrêcenia kolistej cz¹steczki DNA okreœlono, analizuj¹c szybkoœæ migracji superhelikalnego DNA w trakcie
elektroforezy w ¿elu agarozowym z chlorochin¹. Wyniki ich badañ sugeruj¹, ¿e
zmiany topologii DNA, indukowane temperatur¹ mog¹ odgrywaæ wa¿n¹ rolê w regulacji syntezy zarówno flagelliny jak i bia³ek Yop. Zmiany w ekspresji genów yop
obserwowano równie¿ pod wp³ywem ró¿nych dawek nowobiocyny (inhibitor gyrazy)
[23, 83]. Wykazano, ¿e niskie dawki inhibitora (5–20 :g/ml), które mog¹ aktywowaæ gyrazê, indukuj¹ syntezê bia³ek Yop w 25°C. Jednak¿e synteza bia³ek Yop
stymulowana nisk¹ dawk¹ nowobiocyny zachodzi³a na ni¿szym poziomie ni¿
w przypadku indukcji termicznej co sugerowa³o, ¿e zmiany superskrêcenia DNA nie
s¹ wystarczaj¹cym czynnikiem dla uzyskania pe³nej ekspresji genów yop. Sugestiê,
¿e aktywnoœæ gyrazy jest niezbêdna do indukcji syntezy bia³ek Yop potwierdza fakt,
¿e du¿a dawka nowobiocyny, która wydajnie hamuje aktywnoœæ gyrazy (co powoduje relaksacjê DNA) hamuje równie¿ ekspresjê bia³ek Yop w temperaturze 37°C.
Wyniki prac R o h d e i wsp. [83] uzupe³ni³y koncepcjê z³o¿onej regulacji ekspresji bia³ek Yop, w której istotn¹ rolê odgrywaj¹ dwa bia³ka, VirF oraz YmoA.
Bia³ko VirF jest kluczowym aktywatorem transkrypcji plazmidowych genów yop,
ysc oraz yadA [61]. VirF (30,9 kDa) nale¿y do rodziny bia³ek regulatorowych AraC,
które domen¹ bia³kow¹ typu helisa-skrêt-helisa wi¹¿¹ siê ze specyficznymi sekwencjami nukleotydowymi DNA [29, 43]. Rodzina AraC obejmuje regulatory szlaków
katabolicznych u E. coli oraz Pseudomonas putida jak równie¿ bia³ka regulatorowe
zaanga¿owane w kontrolê genów wirulencji u Shigella spp., enterotoksycznej
E. coli i P. aeruginosa. Regulator VirF wi¹¿e siê specyficznie do 40 p.z. regionu
bogatego w zasady AT w obrêbie promotora yop bezpoœrednio przed miejscem
wi¹zania polimerazy RNA [96]. Transkrypcja genu virF podlega termoregulacji
i jest uruchamiana w 37°C. C o r n e l i s i wsp. [30] wykazali, ¿e w regulacji
tej bierze udzia³ kodowane chromosomalnie histonopodobne bia³ko YmoA oraz,
¿e inaktywacja ymoA prowadzi do ekspresji virF w temperaturze niepermisywnej.
11
Rys. 1. Termoregulacja ekspresji genów virF i yop u Y. enterocolitica
Histonopodobne bia³ko YmoA jest negatywnym regulatorem genów yop i virF w temperaturze 25°C. Zmiany
w topologii DNA zachodz¹ce przy wzroœcie temperatury do 37°C prowadz¹ do od³¹czenia YmoA i uruchomienia
transkrypcji tych genów. Bia³ko VirF jest induktorem transkrypcji yop w 37°C.
Zaobserwowali równie¿, ¿e poziom ekspresji virF w tych warunkach jest ni¿szy od
obserwowanego w 37°C. Tak wiêc YmoA i temperatura dzia³aj¹ niezale¿nie, ale
kooperatywnie na promotor virF Y. enterocolitica. YmoA jest represorem transkrypcji zarówno genu virF jak i yop w niskiej temperaturze. W œwietle otrzymanych
wyników stworzono hipotezê, w myœl której temperatura za poœrednictwem VirF
powoduje zmiany w stopniu superskrêcenia DNA reguluj¹c tym samym ekspresjê
genów yop. Ponadto zmiany w topologii DNA Y. enterocolitica obserwowane wraz
ze wzrostem temperatury powoduj¹ oddysocjowanie represora YmoA od promotorów genów yop i virF. Nastêpowa³aby wówczas synteza bia³ka VirF, aktywatora
genów yop, a co za tym idzie – synteza bia³ek Yop (Rys. 1).
Zgromadzono tak¿e wiele danych sugeruj¹cych, ¿e szok osmotyczny, indukuj¹c
zmiany w topologii DNA, mo¿e byæ istotnym czynnikiem reguluj¹cym aktywnoœæ
wielu genów [35, 49, 95]. Stres hyperosmotyczny wywiera na komórkê bardzo niekorzystny wp³yw. Bakterie aby utrzymaæ aktywnoœæ biologiczn¹ wytworzy³y odpowiednie mechanizmy regulacyjne. Jedn¹ z pierwszych odpowiedzi na szok osmotyczny jest pobieranie ze œrodowiska i akumulacja w komórkach jonów potasu. Pozwala to
na odbudowanie i utrzymanie odpowiedniego turgoru. Wysokie stê¿enie jonów potasu
jest niekorzystne dla aktywnoœci niektórych enzymów tote¿ wkrótce wymieniane s¹
one na tzw. osmoprotektanty. Substancje takie jak prolina, betaina glicynowa czy cholina mog¹ byæ syntetyzowane lub pobierane ze œrodowiska. Szok osmotyczny ma
wp³yw na ekspresjê wielu genów, promotory tych genów mog¹ ulegaæ aktywacji b¹dŸ
represji. Aktywowane s¹ przede wszystkim geny, koduj¹ce bia³ka uczestnicz¹ce
w osmoprotekcji np. bia³ka systemów transportu potasu (operon kdp u E. coli) czy
betainy glicynowej (operon proU) [65]. Za wzrost superskrêcenia DNA po szoku
12
osmotycznym najprawdopodobniej odpowiada wzrost wartoœci indeksu ATP/ADP, co
powoduje wiêksz¹ aktywnoœæ gyrazy [51]. Gyraza zmniejsza iloœæ opleceñ (Lk),
a powsta³e w cz¹steczce DNA naprê¿enia czêœciowo likwidowane s¹ przez zwiêkszenie superskrêcenia DNA. Teoretycznie powinno siê tak¿e zmniejszyæ skrêcenie helisy.
Jednak nale¿y pamiêtaæ, ¿e podczas szoku osmotycznego zwiêksza siê stê¿enie jonów
potasu w komórce, co mo¿e powodowaæ wzrost skrêcenia helisy. W cz¹steczce DNA
powstaj¹ dodatkowe naprê¿enia, które s¹ redukowane przez tworzenie w okreœlonych
miejscach nietypowych struktur DNA, m.in. Z-DNA i form krzy¿owych [66].
Wyniki badañ u Y. enterocolitica sugeruj¹, ¿e wysoka osmolarnoœæ œrodowiska
wp³ywa na wzrost superskrêcenia DNA [23, 83]. Obserwowane zmiany topologii
DNA mog¹ równie¿ odgrywaæ wa¿n¹ rolê w zahamowaniu ekspresji genów yop
i genów biosyntezy flagelliny w warunkach wysokiej osmolarnoœci.
2.2. Regulony czynników sigma (F)
Bakterie w œrodowisku czêsto spotykaj¹ siê z ró¿norodnymi warunkami stresowymi. Nale¿¹ do nich: nag³e podwy¿szenie temperatury (stres cieplny), pojawienie
siê reaktywnych form tlenu (stres tlenowy), zmiany w osmolarnoœci (stres osmotyczny), czy te¿ nag³e zakwaszenie œrodowiska (stres kwasowy). Bakteriom patogennym warunki stresowe „stwarza” organizm gospodarza. Stres prowadzi
do charakterystycznej odpowiedzi adaptacyjnej. Komórka dysponuje wieloma mechanizmami odpowiedzi, eliminuj¹c czynnik stresowy lub reperuj¹c uszkodzenia.
OdpowiedŸ stresowa jest kontrolowana w g³ównej mierze przez czynniki transkrypcyjne sigma (F)2. Regulacja inicjacji transkrypcji z udzia³em czynników sigma pe³ni
kluczow¹ rolê w ekspresji genów w warunkach stresowych [48, 72].
Kontrola regulonu stresu (szoku) cieplnego jest zwi¹zana z czynnikiem F32
(RpoH), który pozwala na wydajn¹ transkrypcjê genów bia³ek szoku cieplnego (HSP,
heat shock proteins), które s¹ tak¿e bia³kami stresu. Bia³ka te indukowane s¹ równie¿ przez wiele innych czynników stresowych (etanol, promieniowanie UV, wysoka
osmoralnoœæ, produkty utlenienia). Do bia³ek HSP nale¿¹ proteazy (Lon), a tak¿e
bia³ka opiekuñcze DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL, GroES. Bia³ka opiekuñcze zapewniaj¹ uzyskanie prawid³owej konformacji nowo syntetyzowanych na rybosomie
³añcuchów polipeptydowych. Umo¿liwiaj¹ tak¿e renaturacjê bia³ek, które uleg³y
odkszta³ceniu w wyniku szoku cieplnego. Bia³ka stresu stabilizuj¹ nowo syntetyzowane bia³ka, chroni¹c je przed niepoprawnym z³o¿eniem lub te¿ przed niespecyficznymi oddzia³ywaniami z innymi bia³kami. Indukcja bia³ek stresu cieplnego u E. coli
jest kontrolowana tak¿e przez czynnik FE, niezbêdny do transkrypcji genu htrA,
2 W komórce prokariotycznej funkcjonuje jedna transkryptaza tj. polimeraza RNA zale¿na od
DNA, która sk³ada siê z dwóch funkcjonalnych czêœci: rdzenia (czêœæ podstawowa) i czynnika
sigma (F). Podjednostka F jest t¹ czêœci¹ polimerazy, która ma zdolnoœæ specyficznego wi¹zania siê
z DNA. U E. coli podstawow¹ podjednostk¹ F bior¹c¹ udzia³ w transkrypcji wiêkszoœci genów jest
F70. Oprócz czynnika F70 u E. coli opisano tak¿e alternatywne czynniki bior¹ce udzia³ w ekspresji
genów: aktywnych w fazie stacjonarnej – F38 (zwany te¿ RpoS, FS), szoku termicznego – F32 F24
(FE), regulacji azotowej – F52, syntezy rzêsek, chemotaksji – F28.
13
którego produkt bakteria wykorzystuje do degradacji niepoprawnie z³o¿onych bia³ek obecnych w przestrzeni peryplazmatycznej.
Molekularne mechanizmy adaptacji Y. enterocolitica do stresowego œrodowiska
makrofagów s¹ tematem intensywnych badañ zespo³u Ya m a m o t o [97]. Zespó³
ten sformu³owa³ hipotezê popart¹ ju¿ danymi doœwiadczalnymi, postuluj¹c¹ ¿e zdolnoœæ do adaptacji fakultatywnych wewn¹trzkomórkowych patogenów, w tym Y. enterocolitica, do œrodowiska panuj¹cego wewn¹trz fagosomu makrofaga, zale¿y od aktywnoœci bia³ek stresowych. Badania in vitro wykaza³y, ¿e w warunkach stresów:
cieplnego i tlenowego, a tak¿e zwi¹zanego z procesem fagocytozy przez komórkê
makrofaga (linia makrofagopodobna J774-1) Y. enterocolitica syntezuje bia³ka HSP
homologicznie do Gro EL, Gro ES i DnaK E. coli. W odpowiedzi na stres wewn¹trzkomórkowy zwi¹zany z fagocytoz¹ aktywnoœæ proteolityczna bia³ek stresowych
wymagana by³aby szczególnie do degradacji Ÿle zwiniêtych i bakteriobójczych
cz¹steczek peptydów, które akumuluj¹ siê wewn¹trz makrofaga w wyniku dzia³ania
antybakteryjnych mechanizmów zale¿nych i niezale¿nych od tlenu. Prace grupy
Ya m a m o t o dowodz¹, ¿e komórkom Y. enterocolitica udaje siê prze¿yæ wewn¹trz
fagolizosomu makrofaga m.in. dziêki aktywnoœci proteolitycznej bia³ka GsrA (global stress requirement). Sekwencja aminokwasowa bia³ka GsrA jest homologiczna
do sekwencji aminokwasowej proteazy HtrA E. coli. Mutacja insercyjna w genie
gsrA prowadzi do zahamowania podzia³ów bakterii wewn¹trz makrofagów, a tak¿e
wiêkszej wra¿liwoœci na tlenowy i osmotyczny stres. Wydaje siê wiêc, ¿e regulon FE Y. enterocolitica jest uruchamiany w stresogennym œrodowisku makrofagów.
Kluczow¹ rolê w uruchamianiu transkrypcji genów koduj¹cych bia³ka pozwalaj¹ce przetrwaæ stres pe³ni czynnik FS (bia³ko RpoS) [48]. Synteza RpoS u E. coli
jest regulowana transkrypcyjnie i potranslacyjnie w sposób, którego mechanizm nie
jest w pe³ni zdefiniowany, ale bardzo aktywny w stacjonarnej fazie wzrostu hodowli.
Przez lata uwa¿ano, ¿e RpoS reguluje jedynie zdarzenia w fazie stacjonarnego
wzrostu. Obecnie wiadomo, ¿e jest on g³ównym regulatorem odpowiedzi na ró¿ne
warunki stresowe zarówno w fazie wzrostu stacjonarnego jak i wyk³adniczego. Do
regulonu RpoS nale¿¹ m.in. geny koduj¹ce bia³ka szoku kwasowego (bia³ka
ASP, acid-shock proteins). Od ich syntezy zale¿y adaptacja i prze¿ycie patogenu
w niskim pH (odpowiedŸ ATR, acid tolerance response). Wyra¿anie siê genów asp
kontroluje RpoS wraz z bia³kiem Fur (Ferric iron uptake regulation).
OdpowiedŸ stresowa u Y. enterocolitica uruchamiana przez wiele ró¿nych czynników stresowych (wysoka temperatura, osmolarnoœæ, niskie pH), kontrolowana jest
tak¿e przez g³ówny regulator tej odpowiedzi tj. czynnik transkrypcyjny FS (RpoS)
[7]. Sekwencja aminokwasowa tego bia³ka jest homologiczna w 90% do RpoS E. coli.
Ekspresja czynników wirulencji Y. enterocolitica takich jak inwazyna Inv, adhezyna Ail, antygen Myf czy enterotoksyna Yst zale¿y od wielu czynników œrodowiska (patrz c.d. pracy), a tak¿e uruchamiana jest podczas wejœcia hodowli w stacjonarn¹ fazê wzrostu. Wyniki badañ z mutantami Y. enterocolitica w genie rpoS
prowadzonych w pracowni C o r n e l i s a [55] wskazuj¹ na udzia³ czynnika
RopS w ekspresji enterotoksyny Yst w stacjonarnej fazie wzrostu oraz niezale¿n¹
od RpoS, ekspresjê Inv, Ail oraz Myf. W œwietle otrzymanych wyników wydaje siê,
14
¿e RopS nie jest jedynym czynnikiem uczestnicz¹cym w ekspresji genów zwi¹zanych z patogennoœci¹ w stacjonarnej fazie wzrostu.
2.3. Dwusk³adnikowe systemy regulacji u Y. enterocolitica
Wiêkszoœæ z omówionych dotychczas zmian w ekspresji genów wynika z ró¿nic
w aktywnoœci transkrypcyjnej DNA. Zanim jednak dojdzie do odpowiedzi na poziomie transkrypcji komórka bakteryjna musi odebraæ odpowiedni bodziec ze œrodowiska. Mechanizmy molekularnej odpowiedzi komórki bakteryjnej na sygna³y
p³yn¹ce ze œrodowiska zewnêtrznego s¹ z³o¿one i zale¿¹ m.in. od dwusk³adnikowych systemów regulacji3 [9, 16, 90]. Bia³ka systemów dwusk³adnikowych (sensor
i regulator) ró¿nych gatunków bakterii cechuj¹ wspólne motywy sekwencyjne,
szczególnie wœród reszt aminokwasowych zlokalizowanych w pobli¿u lub dooko³a
miejsca aktywnego, a w przypadku regulatorów wykazuj¹ tak¿e wysoki stopieñ
strukturalnej homologii. Wiêkszoœæ sensorów to bia³ka transb³onowe posiadaj¹ce
wa¿ne dla ich funkcjonowania domeny peryplazmatyczn¹ i cytoplazmatyczn¹.
Wszystkie te bia³ka maj¹ konserwowan¹ ~200 aa domenê C-terminaln¹. Bia³ka
z grupy regulatorów posiadaj¹ konserwowan¹ sekwencjê ~120 aa na N-koñcu.
Dwusk³adnikowy system regulacji OmpR/EnvZ bierze udzia³ w odpowiedzi bakteryjnej na zmiany osmolarnoœci œrodowiska zewnêtrznego [1, 2]. Zosta³ on najlepiej poznany u E. coli, ale wystêpuje równie¿ u Y. enterocolitica a tak¿e u takich
patogenów jak np.: S. enterica, S. flexneri [10, 34]. Geny ompR i envZ u E. coli
wchodz¹ w sk³ad operonu ompB. Koduj¹ one odpowiednio regulatorowe bia³ko
OmpR oraz sensoryczne bia³ko EnvZ, które zaanga¿owane s¹ w osmoregulacjê bia³ek OmpF i OmpC. Bia³ka te tworz¹ pory w b³onie zewnêtrznej pozwalaj¹ce na
biern¹ i niespecyficzn¹ dyfuzjê drobnocz¹steczkowych substancji hydrofilowych.
Funkcj¹ bia³ka OmpR jest zarówno pozytywna jak i negatywna regulacja transkrypcji obu tych bia³ek [62].
Badania kilku ostatnich lat wykaza³y, ¿e systemy dwusk³adnikowe, w tym OmpR/
EnvZ bior¹ udzia³ w regulacji zjadliwoœci bakterii patogennych. Dowiedziono, ¿e
system dwusk³adnikowy OmpR/EnvZ odgrywa wa¿n¹ rolê w kontroli wirulencji
takich enteropatogenów jak Shigella i Salmonella. Locus ompB (zawieraj¹cy geny
ompR i envZ) zidentyfikowano tak¿e u Y. enterocolitica serotyp O:8 [38]. Ponadto
w Zak³adzie Mikrobiologii Stosowanej UW zidentyfikowano i zsekwencjonowano
gen ompR Y. enterocolitica O:9 oraz wykazano, ¿e mutacja w genie ompR powoduje obni¿enie zdolnoœci bakterii do prze¿ycia i namna¿ania siê w linii makrofagopodobnej J774A.1 [22].
3 W systemie dwusk³adnikowym przekazywanie sygna³u zachodzi dziêki parze bia³ek, które komunikuj¹ siê ze sob¹ na drodze konserwowanego mechanizmu jakim jest fosforylacja. Bia³ko odbieraj¹ce bodziec jest kinaz¹ histydynow¹ i okreœlone jest mianem sensora. Natomiast bia³ko, które
z nim wspó³pracuje nazywane jest regulatorem. Kinaza autofosforyluje resztê histydynow¹ przy
udziale ATP. Nastêpnie grupa fosforanowa jest przenoszona na asparaginê regulatora. Ufosforylowany regulator aktywuje ekspresjê odpowiednich genów.
15
Ve s c o v i i wsp. [94] wykazali, ¿e jony Mg+2 mog¹ byæ sygna³em kontroluj¹cym aktywnoœæ dwusk³adnikowego systemu PhoP/PhoQ. PhoP/PhoQ system bierze
udzia³ w kontroli wielu cech wirulencji u S. enterica sv. Typhimurium. Obecnoœæ
milimolarnych iloœci jonów Mg+2 w pod³o¿u wzrostowym hamuje ekspresjê genów
wirulencji podlegaj¹cych regulacji PhoP i prowadzi do atenuacji szczepu. PhoP jest
transkrypcyjnym regulatorem, a kinaza PhoQ jest bia³kiem sensorowym bior¹cym
udzia³ w adaptacji bakterii do œrodowiska wewn¹trzkomórkowego i w prze¿ywalnoœci wewn¹trz makrofagów. Bia³ko PhoP bierze udzia³ w regulacji syntezy oko³o
40 polipeptydów, hamuj¹c lub indukuj¹c ekspresjê wielu genów [45]. System PhoP/
PhoQ obecny jest tak¿e w patogennych szczepach Yersinia. Zidentyfikowano, sklonowano oraz zsekwencjonowano ortolog PhoP z genomu Y. pestis, Y. pseudotuberculosis
i Y. enterocolitica [74]. Wstêpne prace wykaza³y, ¿e mutant PhoP Y. pestis jest niezdolny do wzrostu na pod³o¿u pozbawionym jonów Mg+2, a tak¿e, ¿e bia³ko PhoP
ma znaczenie w wewn¹trzkomórkowej prze¿ywalnoœci patogenu. Jednak¿e, z uwagi
na w wiêkszoœci zewn¹trzkomórkow¹ lokalizacjê pa³eczek Yersinia podczas cyklu
¿yciowego efekt mutacji w phoP by³ mniejszy w porównaniu do wyników uzyskanych dla S. enterica sv. Typhimurium. Ciekawe s¹ równie¿ wyniki wskazuj¹ce na
bardzo du¿¹ liczbê bia³ek regulowanych przez system PhoP/PhoQ w 28°C, a hamowanych w 37°C, co œwiadczy o udziale tego systemu w cyklu ¿yciowym Yersinia.
Warto w tym momencie podkreœliæ, ¿e aktywacja (fosforylacja) czy te¿ defosforylacja regulatora jednego systemu dwusk³adnikowego mo¿e zachodziæ pod wp³ywem
oddzia³ywania z zupe³nie innym systemem. Zak³ada to koncepcja zwana „cross-talk”,
udokumentowana na razie in vitro [52]. Istnieje tak¿e system kontroli aktywnoœci
dwusk³adnikowych systemów wy¿szego rzêdu tworz¹cy w ten sposób sieæ (network
system). Oddzia³ywania fosfataz pomiêdzy dwusk³adnikowymi systemami transdukcji sygna³u odkryto u Bacillus subtilis, lecz jest bardzo prawdopodobne, ¿e ten
system mo¿e funkcjonowaæ równie¿ w wielu innych organizmach.
„Networking” jest tylko czêœci¹ odpowiedzi komórkowej na bodŸce œrodowiskowe w z³o¿onym procesie przekazywania sygna³ów. OdpowiedŸ komórkowa wynika
z aktywacji du¿ej liczby genów znajduj¹cych siê pod kontrol¹ kilku ró¿nych regulatorów transkrypcyjnych. Oprócz wspomnianej regulacji nale¿y pamiêtaæ o innych mechanizmach reguluj¹cych ekspresj¹ genów. Represja kataboliczna i inne mechanizmy
globalne reguluj¹ aktywnoœci¹ genów równie¿ poprzez transdukcjê sygna³u. Czynniki F grupuj¹ geny w oddzielnie regulowane jednostki. Warunki stresowe ró¿nego rodzaju (szok cieplny, kwasowy czy tlenowy) indukuj¹ geny pewnych regulonów, hamuj¹c inne. Liczba kombinacji i mo¿liwoœci dzia³ania regulatorów jest ogromna [76].
3. Regulacja syntezy czynników wirulencji Y. enterocolitica w odpowiedzi
na bodŸce œrodowiskowe
Parametry fizykochemiczne œrodowiska s¹ bodŸcem do ekspresji okreœlonych
cech oraz czynników zjadliwoœci Y. enterocolitica (Tabela I). Istotne w tej regulacji s¹ temperatura, stê¿enie jonów wapnia i ¿elaza, pH, osmolarnoœæ œrodowiska,
16
Ta b e l a I
BodŸce œrodowiskowe uczestnicz¹ce w indukcji ekspresji genów wirulencji Y. enterocolitica
Bodziec œrodowiskowy
brak jonów Fe+3
Gen lub operon
(zespó³ genów)
Biosynteza makromoleku³
fyuA/irp1-irp5, irp9
receptor FyuA, yersiniobaktyna
foxA
fcuA
hemR
receptory: FoxA, FcuA, HemR
temperatura < 30°C
rfb
yst
inv
³añcuch O-specyficzny LPS
enterotoksyna Yst
inwazyna Inv
temperatura 37°C
yadA
ail
adhezyna YadA
adhezyna Ail
+ brak Ca+2 lub kontakt z komórk¹
eukariotyczn¹, aminokwasy, albumina
yop
ysc
bia³ka Yop
Ysc A-M
+ niskie pH, Na+1
inv
myfA
inwazyna Inv
antygen Myf
+ lekko zasadowe pH,
wysoka osmolarnoϾ
yst
enterotoksyna Yst
Ÿród³o wêgla oraz obecnoœæ okreœlonych substancji od¿ywczych. Y. enterocolitica
poza organizmem gospodarza bytuje w wilgotnym naturalnym œrodowisku. Oprócz
typowych procesów metabolicznych, cechuj¹cych wszystkie wolno ¿yj¹ce enterobacterie Y. enterocolitica posiada kilka w³aœciwoœci charakterystycznych tylko dla
umiarkowanej temperatury tego œrodowiska i s³abo lub wcale nie wyra¿anych
w temperaturze 37°C. W niskiej temperaturze Y. enterocolitica syntetyzuje lipopolisacharyd (LPS) w formie S (smooth), inwazynê Inv oraz ciep³ostabiln¹ enterotoksynê
Yst. Jednym z efektów adaptacji do ¿ycia w ró¿nych warunkach temperaturowych
s¹ zmiany w ruchliwoœci komórki. W 25°C i ni¿szej komórki przybieraj¹ formê
ma³ych, ruchliwych, urzêsionych perytrychalnie pa³eczek, które po przeniesieniu
do 37°C staj¹ siê nieruchliwe [28]. Niektóre z tych cech maj¹ istotne znaczenie dla
bytowania w œrodowisku naturalnym, inne u³atwiaj¹ patogenowi pokonanie pierwszych barier na drodze do infekcji organizmu gospodarza.
Do wnêtrza organizmu gospodarza pa³eczki Y. enterocolitica dostaj¹ siê z zaka¿onym po¿ywieniem i przechodz¹ przez kolejne odcinki uk³adu pokarmowego.
Miejscem inwazji jest tkanka nab³onkowa jelita krêtego. Po przedostaniu siê przez
warstwê nab³onka, komórki Y. enterocolitica docieraj¹ do zorganizowanych struktur
(grudek) limfatycznych zwanych kêpkami Peyera. W grudkach limfatycznych komórki patogenu napotykaj¹ m.in. makrofagi, które razem z neutrofilami (leukocyty
polimorfonuklearne, PMN) docieraj¹cymi na miejsce inwazji, stanowi¹ pierwsz¹
liniê obrony w nieswoistej odpowiedzi immunologicznej organizmu gospodarza.
Miejscem docelowym, gdzie Y. enterocolitica namna¿a siê, wywo³uj¹c zmiany zapalne i owrzodzenia s¹ wêz³y limfatyczne jamy brzusznej. Najczêœciej zaka¿enia
17
prowadz¹ jednak tylko do lokalnych zmian z tendencj¹ do samoograniczenia. Ten
bardzo uproszczony obraz infekcji pozwala wyró¿niæ trzy fazy: pierwsza zwi¹zana
jest z przebywaniem patogenu w œwietle jelita, druga obejmuje etap inwazji tkanki
nab³onkowej, trzecia faza po³¹czona jest ze wzrostem zewn¹trzkomórkowym
Y. enterocolitica w g³êbiej po³o¿onych tkankach (wêz³y limfatyczne krezkowe) oraz
narz¹dach, w tym w¹troby i œledziony. W odpowiedzi na zmieniaj¹ce siê warunki
œrodowiska, zwi¹zane tak¿e z wewn¹trz czy zewn¹trzkomórkowym statusem patogenu, uruchamiana jest ekspresja ró¿nych czynników wirulencji.
Czynniki zjadliwoœci Y. enterocolitica kodowane s¹ przez geny zlokalizowane
na chromosomie oraz plazmidzie pYV [27]. Bia³ka kodowane chromosomalnie:
Yst, Inv oraz adhezyna Ail przede wszystkim bior¹ udzia³ w pierwszych fazach
infekcji. Umo¿liwiaj¹ kolonizacjê i inwazjê tkanki nab³onkowej jelita. Plazmid pYV
koduje adhezynê YadA, a tak¿e g³ówne czynniki wirulencji tj. bia³ka Yop, których
ekspresja uruchamiana jest w temperaturze 37°C w nieobecnoœci jonów Ca2+ (patrz
pkt. 2 i 3.3.1). Podstawow¹ funkcj¹ bia³ek Yop jest hamowanie reakcji obronnej
organizmu gospodarza, co umo¿liwia wzrost i namna¿anie siê komórek Yersinia
zewn¹trzkomórkowo w uk³adzie siateczkowo-œródb³onkowym.
W dalszej czêœci pracy przedstawiono wyniki badañ, które wskazuj¹ na udzia³
czynników œrodowiskowych w regulacji determinantów patogenezy Y. enterocolitica. Wydaje siê tak¿e, ¿e ró¿nice w aktywnoœci czynników wirulencji s¹ przejawem
adaptacji do ró¿nych etapów w cyklu ¿yciowym tego patogenu.
Podczas infekcji organizmu gospodarza czynniki wirulencji syntetyzowane przez
bakterie patogenne uczestnicz¹ w wywo³ywaniu ró¿nych objawów chorobowych
i prowadz¹ do wielu zmian patologicznych. Czêsto czynniki wirulencji decyduj¹
tak¿e o tym jak dobrze mikroorganizm namna¿a siê w organizmie gospodarza. Z tej
perspektywy definicja czynników wirulencji mo¿e byæ rozszerzona i obejmowaæ
produkty genów, które niekoniecznie uczestnicz¹ w wywo³ywaniu objawów klinicznych, ale nale¿¹ do grupy produktów, które umo¿liwiaj¹ korzystanie z substratów
metabolicznych limitowanych przez œrodowisko gospodarza. W tym kontekœcie
omawiane te¿ bêd¹ systemy transportu ¿elaza.
3.1. W³aœciwoœci wolno ¿yj¹cych Y. enterocolitica przed infekcj¹ organizmu
gospodarza. Wczesny etap infekcji zwi¹zany z przemieszczaniem siê patogenu
ze œrodowiska zewnêtrznego do organizmu gospodarza
3.1.1. Lipopolisacharyd (LPS)
LPS wolno ¿yj¹cych komórek Y. enterocolitica, a wiêc tak¿e tych, które dostaj¹
siê do œwiat³a jelita jest typu g³adkiego (S), natomiast w 37°C nastêpuje jego tranzycja w kierunku g³adko-szorstkiego (S-R). G³adki LPS Y. enterocolitica charakteryzuje siê znacznym zró¿nicowaniem sk³adu chemicznego czêœci wielocukrowej
(³añcuchy O-swoiste, antygen O) [87, 100]. LPS izolowany z komórek hodowanych w 37°C zawiera odpowiednio mniej frakcji rdzenia i O-swoistej czêœci
wielocukrowej. Zmiany w czêœci wielocukrowej LPS Y. enterocolitica serotyp O:3
18
polegaj¹ miêdzy innymi na zmniejszeniu zawartoœci podjednostek cukrowych tj.
6-dezoksy-L-altriozy. Geny odpowiedzialne za biosyntezê 3 strukturalnych sk³adników LPS tj. lipidu A, rdzenia oraz antygenu O s¹ zlokalizowane na chromosomie. Szczegó³ow¹ analizê genetyczn¹ tego regionu przeprowadzi³ S k u r n i k
i T o i v a n e n [87], klonuj¹c loci rfa i rfb, których produkty uczestnicz¹ odpowiednio w syntezie rdzenia LPS, oraz ³añcucha O-swoistego. Wyniki sekwencjonowania
locus rfb wskazuj¹ na obecnoœæ 8 ramek odczytu, funkcjê 5 z nich ustalono na
podstawie homologii do odpowiednich sekwencji nukleotydowych S. enterica sv.
Typhimurium. Stwierdzono, ¿e locus rfb sk³ada siê z 2 operonów, transkrypcja
jednego z nich podlega represji w 37°C. W efekcie w 37°C syntetyzowany jest
antygen O znacznie krótszy ni¿ w 25°C. Autorzy rozwa¿aj¹ dwa modele wyjaœniaj¹ce to zjawisko. W pierwszym, hipotetyczny regulator transkrypcji genów locus
rfb by³by aktywny tylko w niskiej temperaturze i nieaktywny w 37°C, w drugim
modelu zak³adano obecnoœæ represora aktywnego w 37°C. W rzeczywistoœci sytuacja jest prawdopodobnie du¿o bardziej skomplikowana. Wstêpne badania nad mutantami regulatorowymi wskazuj¹, ¿e regulacja syntezy LPS jest czêœci¹ z³o¿onego
systemu, w którym kilkanaœcie genów rozrzuconych na chromosomie podlega
tym samym mechanizmom regulacyjnym. Kandydatami do wspólnego systemu s¹
czynniki wirulencji takie jak inwazyna czy enterotoksyna. Bardzo prawdopodobna
wydaje siê hipoteza, wed³ug której zahamowanie syntezy ³añcuchów O-swoistych
w 37°C jest skorelowane ze zmianami powierzchniowymi komórki i zwiêkszon¹
syntez¹ adhezyny Ail w tej temperaturze. Zarówno LPS jak i adhezyna Ail chroni¹ bowiem komórkê Y. enterocolitica przed dostêpem soli ¿ó³ci oraz sk³adników dope³niacza. LPS pe³ni³by wiêc swoj¹ funkcjê ochronn¹ na pocz¹tku infekcji,
a adhezyna Ail na dalszych jej etapach.
3.1.2. Enterotoksyna Yst
Objawom jersiniozy wywo³anych obecnoœci¹ Y. enterocolitica w œwietle jelita
towarzyszy biegunka. Czynnikiem odpowiedzialnym za uszkodzenia b³ony œluzowej jest termostabilna enterotoksyna Yst uwalniana z komórek patogenu do
œrodowiska zewnêtrznego [69]. Jednak¿e enterotoksyna in vitro jest syntetyzowana
i uwalniana do pod³o¿a hodowlanego w temperaturze poni¿ej 30°C w kilka godzin
po wejœciu bakterii w stacjonarn¹ fazê wzrostu. Zahamowanie syntezy Yst w 37°C
wydawa³o siê wiêc sprzeczne z rol¹ jak¹ przypisywano jej w organizmie gospodarza. Dopiero badania M i k u l s k i s i wsp. [69] wykaza³y, ¿e synteza Yst w temperaturze 37°C in vitro mo¿e zachodziæ w pH lekko zasadowym, w œrodowisku
o wysokiej osmolarnoœci. Warunki takie panuj¹ w koñcowym odcinku jelita krêtego
i prawdopodobnie kombinacja tych trzech czynników œrodowiska umo¿liwia kontynuacjê syntezy enterotoksyny Yst in vivo.
Synteza Yst w hodowlach Y. enterocolitica na chemicznie zdefiniowanych
pod³o¿ach wzrasta tak¿e w obecnoœci glukonianu potasu jako Ÿród³a wêgla. Jony
Ca+2, Mn+2 czy Mg+2 nie maj¹ wp³ywu na zwiêkszenie produkcji enterotoksyny,
natomiast wykazano hamuj¹cy wp³yw jonów ¿elaza Fe+2 na syntezê Yst w stê¿eniu
powy¿ej 10 :M [3].
19
Udzia³ enterotoksyny w wywo³ywaniu biegunki u ludzi by³ przez lata kontrowersyjny nie tylko ze wzglêdu na brak syntezy Yst w 37°C, ale tak¿e ze wzglêdu na
niespójne wyniki badañ na zwierzêtach doœwiadczalnych. Wykazano bowiem, ¿e
szczepy Y. enterocolitica O:3 nie syntetyzuj¹ce Yst wywo³ywa³y biegunkê u myszy.
W¹tpliwoœci te zosta³y ostatecznie rozwiane z chwil¹ wykrycia tzw. cichych kopii
genu yst uruchamianych w szczepach z mutacj¹ w bia³ku YmoA. Ponadto wykazano,
¿e Y. enterocolitica produkuje oprócz termostabilnej enterotoksyny Yst I, tak¿e
toksynê Yst II. Dwa nowe warianty toksyny Yst I, znane jako Yst-b i Yst-c opisano
ostatnio u Y. enterocolitica [80].
Gen yst jest zlokalizowany na chromosomie Y. enterocolitica oraz podlega regulacji przez dwa bia³ka kontroluj¹ce superskrêcenie DNA. Negatywnym regulatorem
ekspresji yst jest histonopodobne bia³ko YmoA (patrz pkt. 2 pracy). Aktywatorem
transkrypcji yst jest bia³ko Yrp [69]. Do pe³nej ekspresji w 30°C i stacjonarnej fazie
wzrostu wymaga funkcjonalnego produktu genu rpoS [55].
Toksyna Yst jest syntetyzowana jako ³añcuch polipeptydowy, w którym 30 aminokwasów domeny C-terminalnej peptydu odpowiada dojrza³ej cz¹steczce toksyny
uwalnianej z komórki Y. enterocolitica do œrodowiska zewnêtrznego. N-terminalna
domena polipeptydu zawiera 18-aminokwasow¹ sekwencjê sygnaln¹ odcinan¹
w procesie transportu przez b³onê cytoplazmatyczn¹. Czêœæ œrodkowa tego peptydu
jest usuwana przez bakteryjne proteazy w chwili przejœcia przez b³onê zewnêtrzn¹
[93]. Pod wzglêdem w³aœciwoœci fizykochemicznych, antygenowych oraz mechanizmu dzia³ania Yst jest podobna do toksyny STI produkowanej przez enterotoksyczne szczepy E. coli (ETEC). Obie toksyny aktywuj¹ cyklazê guanylow¹
w kosmkach jelitowych, co prowadzi do wzrostu stê¿enia cGMP i w konsekwencji
do utraty przez enterocyty zdolnoœci absorpcji p³ynów [53]. Uszkodzeniom komórek towarzyszy uwalnianie substancji od¿ywczych, potrzebnych w utrzymaniu
du¿ej populacji bakterii.
3.1.3. Transport ¿elaza z udzia³em sideroforów
¯elazo jest niezbêdne dla wzrostu bakterii, wchodzi bowiem w sk³ad wielu wa¿nych bakteryjnych uk³adów enzymatycznych, a tak¿e jest kofaktorem w ró¿nych
reakcjach biochemicznych. Ponadto nale¿y do wielu czynników œrodowiskowych
reguluj¹cych ekspresjê genów koduj¹cych czynniki wirulencji, w tym toksyny [73].
Stê¿enie wolnych jonów ¿elaza (Fe+3) w œrodowisku naturalnym, a tak¿e w organizmach zwierzêcych jest bardzo niskie. W œrodowisku naturalnym ¿elazo wystêpuje
w postaci nierozpuszczalnego polimeru wodorotlenku ¿elaza. Natomiast w organizmach zwierzêcych zwi¹zane jest w ¿elazoproteidach hemowych np. (hemoglobina,
mioglobina) i niehemowych (ferrytyna, transferyna, laktoferyna). Umiejêtnoœæ
pozyskiwania jonów ¿elaza, które znajduj¹ siê w œrodowisku w formie zwi¹zanej,
nieprzyswajalnej dla bakterii nale¿y do bardzo wa¿nych w³aœciwoœci metabolicznych komórek Y. enterocolitica. W warunkach niedoboru ¿elaza w œrodowisku
Y. enterocolitica reaguje depresjê systemów pobierania tego pierwiastka tzw. systemów wysokiego powinowactwa do ¿elaza [88]. Uruchamianie i funkcjonowanie tych
20
mechanizmów (umo¿liwiaj¹cych asymilacjê ¿elaza) wzmacnia tak¿e w³aœciwoœci
chorobotwórcze Y. enterocolitica. Transport ¿elaza z udzia³em sideroforów jest
jednym z g³ównych mechanizmów zapewniaj¹cych wzrost Y. enterocolitica i w nastêpstwie kolonizacjê tkanek gospodarza. W sk³ad tego systemu wchodz¹: siderofor
i system jego aktywnego transportu w kompleksie z ¿elazem (Fe-siderofor) 4.
Siderofor, zwany yersiniobaktyn¹ opisano u Y. enterocolitica O:8 pod koniec
lat 80-tych. Wkrótce te¿ okaza³o siê, ¿e istnieje œcis³y zwi¹zek miêdzy zjadliwoœci¹
bakterii, a zdolnoœci¹ do produkcji tego chelatora [47, 79]. Tylko szczepy bêd¹ce
silnymi patogenami, letalne dla myszy (nale¿¹ce do biogrupy IB, np. serotypy
O:8, O:4) syntetyzuj¹ yersiniobaktynê. W cz¹steczce yersiniobaktyny znajduj¹
siê aromatyczne i niearomatyczne grupy chelatuj¹ce jony ¿elaza. Intensywne badania nad lokalizacj¹ w genomie Y. enterocolitica O:8 genów odpowiedzialnych
za obserwowan¹ zjadliwoœæ, zaowocowa³y identyfikacj¹ w chromosomie wyspy
patogennoœci HPI (High Pathogenicity Island) skupiaj¹cej geny biosyntezy i pobierania do komórki Fe-sideroforu [79]. HPI Y. enterocolitica ma wielkoœæ 43,4 kb
i sk³ada siê z dwóch czêœci: œciœle konserwowanego rdzenia oraz bogatej w pary
AT czêœci zmiennej. Funkcjonalna czêœæ wyspy zawiera 12 genów, szeœæ z nich
(irp1-irp5 oraz irp9) koduje bia³ka bior¹ce udzia³ w biosyntezie yersiniobaktyny.
Dwa wysokocz¹steczkowe bia³ka, HMWP1 (260 kDa) i HMWP2 (190 kDa) kodowane odpowiednio przez geny irp1 i irp2 maj¹ aktywnoœæ syntetaz. Gen fyuA
koduje receptor dla yersiniobaktyny. Bia³ko FuyA (65 kDa) pe³ni podwójn¹ rolê,
jest receptorem dla Fe-sideroforu oraz dla pestycyny (bakteriocyny Y. pestis). Pozosta³e geny koduj¹: bia³koYbt bêd¹ce regulatorem transkrypcji regulonu yersiniobaktyny, bia³ka Irp6 i Irp7, które uczestnicz¹ w transporcie Fe-siderofor przez b³onê
cytoplazmatyczn¹ oraz bia³ko Irp8 bior¹ce udzia³ w transdukcji sygna³u. Synteza
sideroforów i bia³ek aparatu aktywnego transportu jest regulowana na poziomie
transkrypcji stê¿eniem jonów Fe+2 w komórce oraz jego dostêpnoœci¹ w œrodowisku
(Fe+3). System transportu z udzia³em yersiniobaktyny funkcjonuje w temperaturze 25°C i 37°C. Rolê represora spe³nia bia³ko Fur [88]. Fur w kompleksie z jonami ¿elaza (Fe+2) wi¹¿e siê do promotorów genów odpowiedzialnych za transport
¿elaza hamuj¹c ich ekspresjê. Po³¹czenie C-terminalnej domeny bia³ka Fur z jonem
¿elaza zmienia strukturê jego N-terminalnej czêœci, co prowadzi do wzrostu powinowactwa Fur do DNA.
Poszukiwania zwi¹zków o aktywnoœci sideroforowej zaowocowa³y identyfikacj¹
w niektórych szczepach Y. enterocolitica (szczepy œrodowiskowe i izolaty kliniczne)
4
Siderofory s¹ to niskocz¹steczkowe chelatory (~1 kDa) charakteryzuj¹ce siê wysokim powinowactwem do jonów ¿elaza (Fe+3) [73]. Siderofory zidentyfikowane w rodzinie Enterobacteriaceae
nale¿¹ do dwóch typów chemicznych. S¹ to siderofory o budowie katecholowej (enterobaktyna)
i hydroksamowej (aerobaktyna). Syntetyzowane przez komórkê bakteryjn¹ siderofory uwalniane s¹ do
œrodowiska, gdzie po po³¹czeniu z ¿elazem wychwytywane s¹ przez receptory znajduj¹ce siê w b³onie
zewnêtrznej komórki. Kompleks Fe-siderofor transportowany jest do wnêtrza komórki przy udziale
bia³ka TonB i systemu permeaz b³ony cytoplazmatycznej. Losy kompleksu Fe-siderofor wewn¹trz
komórki s¹ s³abo poznane. ¯elazo z tego po³¹czenia mo¿e byæ uwalniane na dwa sposoby: w wyniku
dzia³ania swoistych esteraz albo na skutek redukcji jonu ¿elazowego (Fe+3) do ¿elazawego (Fe+2).
21
sideroforów o naturze hydrofilowej [18, 24]. Y. enterocolitica mo¿e korzystaæ tak¿e
z sideroforów egzogennych syntetyzowanych przez drobnoustroje znajduj¹ce siê
w tej samej niszy ekologicznej. Warunkiem korzystania z obcych chelatorów
jest obecnoœæ zarówno receptora jak i systemu transportu dla sideroforów. W b³onie
zewnêtrznej Y. enterocolitica zidentyfikowano tak¿e receptory dla ferrichromu
(bia³ko FcuA, 78 kDa) oraz ferroksaminy (FoxA, 75 kDa). Korzystanie z heminy
jako Ÿród³a ¿elaza uzupe³nia szeroki wachlarz mo¿liwoœci Y. enterocolitica. Niedobór ¿elaza powoduje depresjê systemu transportu heminy kodowanego przez geny
hem PR i hem STUV [88, 91].
Funkcjonowanie u Y. enterocolitica wymienionych systemów zwiêksza szanse
na prze¿ycie w mieszanej populacji bakteryjnej jelita. Aktywnoœæ tych systemów
jest wa¿na dla komórki patogenu równie¿ w sytuacji nag³ego obni¿enia stê¿enia
jonów ¿elaza w p³ynach tkankowych, które towarzyszy zaka¿eniom bakteryjnym.
3.1.4. Maltoza i regulon maltozowy
Istotn¹ rolê w ekspresji determinantów patogenezy Y. enterocolitica pe³ni¹ równie¿ inne sygna³y p³yn¹ce ze œrodowiska zewnêtrznego. Wyniki prac B r z o s t e k
i wsp. [21] wskazuj¹ na przypuszczaln¹ rolê maltozy i elementów regulonu maltozowego w ekspresji i sekrecji bia³ek Yop. Doniesienia te nabieraj¹ szczególnego
znaczenia zwa¿ywszy na fakt, ¿e maltoza wystêpuj¹c powszechnie w jelicie ludzkim jako produkt dzia³ania hydrolaz tj. amylazy trzustkowej i amylazy jelitowej,
stanowi jednoczeœnie potencjalne i ³atwo dostêpne Ÿród³o wêgla dla Y. enterocolitica w trakcie kolonizacji jelita.
Geny odpowiedzialne za transport i metabolizm maltozy zosta³y stosunkowo dobrze poznane u bakterii jelitowej z rodziny Enterobacteriaceae – E. coli [14]. Badania nad regulonem maltozowym prowadzone u innych chorobotwórczych enterobakterii wykaza³y jego udzia³ w zjadliwoœci tych enteropatogenów. Interesuj¹ce
wyniki otrzymano badaj¹c wp³yw genów regulonu maltozowego na wirulencjê
Vibrio cholerae [63]. Stwierdzono, ¿e maltoza hamuje sekrecjê toksyny cholery CT
(cholera toxin) i redukuje produkcjê mannozo-wra¿liwej hemaglutyniny MSHA
(mannose-sensitive hemagglutinin) oraz proteazy SHA (soluble hemagglutinin-protease), natomiast u³atwia sekrecjê bia³ek buduj¹cych pilus TCP (toxin-coregulated
pilus). Obserwowany efekt jest wynikiem aktywnoœci regulonu maltozowego i wskazuje na kluczow¹ rolê systemu transportu maltozy w biogenezie i translokacji
czynników wirulencji przez b³onê zewnêtrzn¹. Regulon maltozowy zidentyfikowano tak¿e u Y. enterocolitica. Okreœlono funkcjê dwóch bia³ek bior¹cych udzia³
w transporcie maltozy. Jedno z nich, bia³ko LamB, jest maltoporyn¹ b³ony zewnêtrznej uczestnicz¹c¹ w transporcie maltozy i maltodekstryn do peryplazmy komórek
Y. enterocolitica [20], drugie to MBP, bia³ko wi¹¿¹ce maltozê w przestrzeni peryplazmatycznej komórki [19]. Wyniki ostatnich badañ wskazuj¹ na korelacjê miêdzy
funkcjonowaniem systemu maltozowego, a ekspresj¹ czynników wirulencji Y. enterocolitica. Otrzymano mutanty transpozonowe miniTn5 Y. enterocolitica o fenotypie
Mal–, defektywne w transporcie maltozy, które charakteryzowa³y siê obni¿on¹ produkcj¹ czynników wirulencji tj. bia³ek Yop [21].
22
3.2. Ekspresja genów i czynników wirulencji podczas kolonizacji
i inwazji tkanki nab³onkowej jelita
Pierwszym etapem w procesie patogenezy jest adhezja komórek Y. enterocolitica
do tkanki nab³onkowej jelita. Interakcja adhezyn Inv i Ail Y. enterocolitica z komórkami nab³onkowymi jelita poprzedza inwazjê, która umo¿liwia bakteriom rozprzestrzenianie siê w g³¹b tkanek i rozsianie zaka¿enia. Wyniki wielokierunkowych badañ pozwoli³y ustaliæ, ¿e w procesie tym g³ówn¹ rolê odgrywa inwazyna Inv [98].
3.2.1. Inwazyna (Inv)
Inv jest bia³kiem b³ony zewnêtrznej o masie cz¹steczkowej 92 kDa. Biologiczn¹
funkcjê tego bia³ka ustalono w oparciu o wyniki doœwiadczeñ nad ekspresj¹ Inv
w szczepach E. coli. Wprowadzenie genu inv nadawa³o komórkom E. coli cechê
inwazyjnoœci. Inwazyna bierze udzia³ zarówno w adhezji jak i inwazji tkanki
nab³onkowej. Miejscem jej bezpoœredniego oddzia³ywania s¹ przede wszystkim
komórki M wystêpuj¹ce w nab³onku FAE (follicle-associated epithelium) pokrywaj¹cym struktury limfatyczne b³ony œluzowej jelita tj. kêpki Peyera [59]. Silna i specyficzna adherencja Y. enterocolitica do komórek M polega na wi¹zaniu siê inwazyny
Inv do specyficznych receptorów, $1 integryn, wystêpuj¹cych na powierzchni
komórek [58]. Domena wi¹¿¹ca cz¹steczkê $1 integryny jest zlokalizowana w 192 aa
C-koñcowym fragmencie cz¹steczki bia³ka sk³adaj¹cego siê z 986 aminokwasów.
Ostatnie badania wykaza³y, i¿ pewne domeny wewn¹trz inwazyny uczestnicz¹
w autoasocjacji cz¹steczki. Inwazyna w postaci homomultimeru indukuje efektywne
przy³¹czenie do $1 integryn, co dostarcza sygna³u do internalizacji komórki. Inwazja
za poœrednictwem bia³ka Inv obejmuje tak¿e rearan¿acjê szkieletu aktynowego
komórki gospodarza, prowadz¹c do zamkniêcia komórki w pêcherzyku endosomu,
jest to tzw. mechanizm zamka b³yskawicznego (zipper mechanism). Procesowi temu
towarzyszy akumulacja aktyny, filaminy, taliny i $1 integryn dooko³a bakterii [99].
Inwazyna obecna jest ju¿ na powierzchni wolno¿yj¹cych komórek Y. enterocolitica, które dostaj¹ siê do œwiat³a jelita co potwierdza jej wa¿n¹ rolê w pierwszych
etapach infekcji. Badania in vitro potwierdzi³y, ¿e transkrypcja genu inv zachodzi
maksymalnie w temperaturze 23°C, ale wykazano tak¿e, ¿e hamowana jest w 37°C.
Dziêki konstrukcji chromosomalnej fuzji translacyjnej inv::phoA uda³o siê wykazaæ, ¿e jony sodu, a tak¿e obni¿enie pH do 5,5 uruchamia produkcjê bia³ka w 37°C
[98]. Dodatkowe informacje o regulacji ekspresji genu inv pochodz¹ z pracowni
M i l l e r, gdzie udowodniono, ¿e ekspresja inv u Y. enterocolitica zale¿y od fazy
wzrostu hodowli i jest maksymalna w momencie wchodzenia w fazê wzrostu stacjonarnego [75]. Opisane mechanizmy regulacji mog¹ byæ dowodem na to, ¿e in vivo
transkrypcja inwazyny mo¿e tak¿e wyst¹piæ w 37°C w zgo³a odmiennych warunkach, w dalszym etapie infekcji jelita oraz w innych g³êbiej le¿¹cych tkankach.
Wyniki najnowszych badañ sugeruj¹, ¿e ekspresja genu inv jest du¿o bardziej
z³o¿ona i pozostaje w odwrotnej relacji do syntezy rzêski. To znaczy czynniki œrodowiskowe i bia³ka regulatorowe wzmacniaj¹ce ekspresjê inv obni¿aj¹ równoczeœnie syntezê flagelliny [8]. Gen inv zlokalizowany jest bowiem w grupie genów
23
koduj¹cych bia³ka rzêski. Sens tego typu regulacji wydaje siê oczywisty, gdy¿ komórka nie mog³aby siê aktywnie poruszaæ bêd¹c zwi¹zana z powierzchni¹.
3.2.2. Adhezyna Ail
Adhezyna Ail (17 kDa) jest drugim bia³kiem b³ony zewnêtrznej Y. enterocolitica
bior¹cym udzia³ w adhezji i inwazji in vivo, a tak¿e wielu linii komórkowych in
vitro [70]. Bia³ko Ail cechuj¹ jednak du¿o s³absze w³aœciwoœci adhezyjne,
ni¿ inwazynê Inv. Adhezyna Ail przede wszystkim chroni komórkê przed dzia³aniem bia³ek dope³niacza. Gen ail zosta³ zsekwencjonowany w pracowni M i l l e r
[71]. Otwarta ramka odczytu koduje 178 aa polipeptyd, którego 23 aa fragment na
N-koñcu stanowi sekwencjê sygnaln¹. Bia³ko Ail wykazuje homologiê do bia³ka
OmpX E. coli oraz PagC S. enterica sv. Typhimurium [67]. Transkrypcja genu ail w
stacjonarnej fazie wzrostu hodowli zachodzi w 37°C (odwrotnie ni¿ inv), natomiast
w temperaturze 30°C nie identyfikuje siê odpowiedniego mRNA. W logarytmicznej
fazie wzrostu transkrypcja ail w 37°C jest tylko nieznacznie wy¿sza od poziomu
transkrypcji w 30°C. Pomimo ma³ych ró¿nic w ekspresji genu ail, komórki Y. enterocolitica rosn¹ce w 37°C s¹ nie tylko oporne na dzia³anie surowicy, ale tak¿e
charakteryzuj¹ siê wiêksz¹ inwazyjnoœci¹ ni¿ te rosn¹ce w 30°C [70]. Zdaniem
M i l l e r i wsp. [70] obserwowane w³aœciwoœci mog¹ wynikaæ ze zmian w strukturach powierzchniowych komórek Y. enterocolitic. Utrata ³añcuchów O-swoistych
w cz¹steczce LPS w 37°C mo¿e prowadziæ do wiêkszej ekspozycji bia³ka Ail na
powierzchni komórki, a wiêc zahamowanie ekspresji rfb (synteza LPS w formie S)
w 37°C mo¿e byæ w tych warunkach kompensowane aktywacj¹ genu ail.
3.2.3. Adhezyna YadA
W procesie adhezji Y. enterocolitica do komórek eukariotycznych uczestniczy
tak¿e, kodowana na plazmidzie pYV, adhezyna YadA [27]. W oparciu o nowe badania
mikroskopowe z zastosowaniem kriotechniki, a tak¿e analizê funkcjonaln¹ regionów
aa cz¹steczki YadA H o i c z y k i wsp. [50] sugeruj¹, i¿ bia³ko YadA zorganizowane
jest na powierzchni komórki bakteryjnej w strukturê o kszta³cie „lizaka” (lolipop).
Sk³ada siê na ni¹ N-koñcowa czêœæ bia³ka, tworz¹ca owaln¹ g³owê i spiralnie skrêcony trzonek oraz C-koñcowy fragment zakotwiczony w b³onie zewnêtrznej. G³owa
„lizaka” uczestniczy w procesie autoaglutynacji komórek Y. enterocolitica, w adhezji
do œluzu jelitowego oraz bia³ek (kolagen, fibronektyna) macierzy zewn¹trzkomórkowej (ECM), co wiêcej wykazano tak¿e hamowanie aktywnoœci przeciwinwazyjnej
interferonu ( [41]. Ponadto YadA, dziêki wi¹zaniu czynnika H, utrudnia opsonizacjê
komórek Y. enterocolitica przez bia³ka dope³niacza [81]. Badaj¹c biologiczn¹ funkcjê
YadA udowodniono, ¿e bia³ko to umo¿liwia prze¿ycie i namna¿anie siê Y. enterocolitica w kêpkach Peyera, a tak¿e rozsianie infekcji z kêpków Peyera do innych czêœci
organizmu [82]. Geny koduj¹ce YadA zsekwencjonowano w ró¿nych serogrupach
Y. enterocolitica i wykazano wysok¹ homologiê sekwencji aminokwasowych, które
tworz¹ polipeptydy o masie cz¹steczkowej od 41 do 44 kDa. YadA izolowane z preparatu os³on komórkowych bakterii tworzy agregaty oporne na temperaturê i na ¿elu
SDS-PAGE lokuje siê w pozycji odpowiadaj¹cej wzglêdnej masie cz¹steczkowej od
24
160 do 240 kDa. Œwiadczy to o oligomerycznej strukturze bia³ka (3–4 monomery).
Jednak¿e w formach oligomerycznych bia³ka nie zidentyfikowano ani reszt cysteinowych ani mostków dwusiarczkowych. W cz¹steczce YadA wyraŸnie wyodrêbniæ
mo¿na regiony hydrofilowe i hydrofobowe. Hydrofobowy C-koniec poprzedzony
jest dwoma regionami hydrofilowymi oddzielonymi poprzez inny region hydrofobowy. W celu wykazania funkcji poszczególnych fragmentów cz¹steczki YadA
skonstruowano mutanty w ró¿nych regionach polipeptydu. Uszkodzenie C-koñca
prowadzi do obni¿enia ekspresji YadA na powierzchni komórki i hamuje oligomeryzacjê bia³ka. W wyniku delecji 29–81 aminokwasów YadA traci zdolnoœæ adhezji
do neutrofilów. Natomiast zast¹pienie reszty histydynowej w pozycji 157 i 158 przez
resztê tyrozynow¹ skutkuje utrat¹ zdolnoœci adhezji do ECM czy komórek HeLa.
Du¿o wiêkszy efekt na funkcjonowanie bia³ka ma delecja hydrofobowego fragmentu
od 83 do 104 aminokwasów, co poci¹ga za sob¹ utratê zdolnoœci wi¹zania kolagenu
i autoaglutynacji komórek [81, 82].
Ekspresja genu yadA jest indukowana podobnie jak geny wirulonu Yop, w temperaturze 37°C, w wyniku aktywnoœci regulatora VirF i podlega represji poprzez
bia³ko YmoA (pkt. 2 pracy).
3.2.4. Antygen Myf
W latach 80-tych D i a z i wsp. [33] zidentyfikowali i opisali antygen C-Ag,
mukoidaln¹ substancjê pokrywaj¹c¹ kolonie enteropatogennych szczepów Y. enterocolitica. Antygen zwany obecnie Myf (mucoid Yersinia factor) jest bia³kowym polimerem sk³adaj¹cym siê z podjednostek o wzglêdnej masie cz¹steczkowej 21 kDa
(analiza SDS-PAGE) [56]. Zdjêcia z mikroskopu elektronowego dowodz¹, ¿e Myf
tworzy na powierzchni komórki strukturê fibrylarn¹, która mo¿e lokalnie wystawaæ
z powierzchni komórki nawet o 2 :m. Pomimo strukturalnych podobieñstw MyfA
ze strukturami fibrylarnymi E. coli (CS3, CS6) czy Klebsiella pneumoniae (fimbrie
3 typu) ich sekwencje nukleotydowe s¹ ró¿ne. W biogenezie fimbrii Myf bierze
udzia³ 5 genów zlokalizowanych na chromosomie Y. enterocolitica [54]. Gen myfA
koduje g³ówn¹ podjednostkê fimbrii, tj. 159 aminokwasowe bia³ko, które po odciêciu sekwencji sygnalnej powinno posiadaæ masê cz¹steczkow¹ 14,25 kDa. Tak du¿e
rozbie¿noœci w m. cz. (21 kDa – analiza SDS-PAGE i 14,25 kDa) wynikaj¹ przypuszczalnie z procesu glikozylacji jakiej podlega polipeptyd w komórce. Locus myf
obejmuje oprócz myfA tak¿e geny myfB, myfC, myfE i myfF. Gen myfB koduje peryplazmatyczne bia³ko opiekuñcze, gen myfC bia³ko b³ony zewnêtrznej. Oba bia³ka
uczestnicz¹ w organizacji struktury fimbrii. Transkrypcja myfA zale¿y od aktywnoœci produktów genów myfE i myfF. Oba geny koduj¹ bia³ka b³ony cytoplazmatycznej. N-koñcowa domena MyfF ma charakter hydrofobowy i jest zwi¹zana
z b³on¹ cytoplazmatyczn¹. C-koñcowa domena bia³ka znajduje siê w peryplazmie.
Regulator MyfF nie posiada motywu helisa-skrêt-helisa typowego dla aktywatorów
rodziny AraC uczestnicz¹cego w ekspresji fimbrii E. coli czy S. enterica sv. Typhimurium. Natomiast jego organizacja w b³onie odpowiada charakterystyce bia³ka ToxS,
reguluj¹cego ekspresjê pilusów Tcp V. cholerae. Zlokalizowany w cytoplazmie N-koniec bia³ka MyfE wykazuje podobieñstwo do domeny wi¹¿¹cej DNA, regulatorów
25
transkrypcji systemów dwusk³adnikowych. Wydaje siê wiêc, ¿e oba bia³ka mog¹
razem odbieraæ i przekazywaæ sygna³ ze œrodowiska do wnêtrza komórki. Bia³ko
MyfA syntetyzowane jest tylko w temperaturze 37°C w pod³o¿u o pH 6. Badania
Iriarte i wsp. [56] wykaza³y, ¿e MyfA jest homologiem antygenu pH6 (PsA) Y. pestis,
syntetyzowanego równie¿ w œrodowisku o pH 6, chocia¿ prawdopodobnie antygeny
te odgrywaj¹ ró¿n¹ rolê w patogenezie tych dwóch gatunków. Podobnie jak enterotoksyna Yst, antygen Myf pojawia siê tylko w patogennych, zarówno „amerykañskich” jak i „europejskich” seroptypach Y. enterocolitica. Obecnoœæ antygenu Myf
tylko w szczepach zjadliwych œwiadczy o jego roli w patogenezie jersiniozy. Mo¿liwe, ¿e Myf uczestniczy w kolonizacji jelita, a tak¿e w sekrecji enterotoksyny Yst
poprzez umo¿liwienie œcis³ego kontaktu komórki bakteryjnej z komórkami nab³onka jelitowego [33]. Bardzo prawdopodobny jest tak¿e udzia³ MyfA w ochronie przed
fagocytoz¹, zw³aszcza na wczesnych etapach infekcji, gdy nie aktywowane makrofagi s¹ miejscem mamna¿ania siê Y. enterocolitica. Kwaœne œrodowisko fagolizosomu w 37°C indukowa³oby syntezê antygenu Myf. Bia³ko MyfA wraz z innymi
produktami genów aktywowanymi w takich warunkach u³atwia³oby prze¿ycie równie¿ wewn¹trz neutrofilów nap³ywaj¹cymi do miejsca infekcji.
3.2.5. Udzia³ adhezyn w rozwoju infekcji
Szczególn¹ rolê w kolonizacji b³ony œluzowej jelita i rozwoju infekcji pa³eczkami Y. enterocolitica odgrywaj¹ adhezyny. Wejœciu Y. enterocolitica do organizmu
gospodarza towarzyszy ekspresja kilku adhezyn kodowanych przez geny zlokalizowane na chromosomie bakteryjnym (ail, myf, inv) jak i na plazmidzie pYV (yadA).
BodŸcem do syntezy tych bia³ek s¹ ró¿nice w fizykochemicznych parametrach
œrodowiska. Najwa¿niejsz¹ rolê odgrywa temperatura, dodatkowymi czynnikami s¹:
osmolarnoœæ, jony sodu oraz pH. W oparciu o zebrane dane literaturowe poni¿ej
przedstawiono scenariusz, w którym przypisano adhezynom okreœlone role w przebiegu zaka¿enia pa³eczkami Y. enterocolitica. Zaproponowany scenariusz jest oczywiœcie du¿ym uproszczeniem, ale wyjaœnia pewn¹ strategiê patogenu, polegaj¹c¹ na
selektywnej aktywacji bia³ek powierzchniowych komórki.
Barierê w postaci tkanki nab³onkowej jelita Y. enterocolitica pokonuje przy udziale
inwazyny Inv. Inv ulega ekspresji w œwietle jelita krêtego w 37°C w pH6, w obecnoœci jonów sodu i wysokiej osmolarnoœci tj. w warunkach charakterystycznych
dla tego odcinka jelita. Transcytoza przez komórki M umo¿liwia dotarcie do kêpek
Peyera. W tym miejscu dochodzi do pierwszego kontaktu patogenu z makrofagami.
Na tym wczesnym etapie infekcji makrofagi nie s¹ aktywowane i prawdopodobnie
s¹ miejscem gdzie patogen mo¿e prze¿yæ i namno¿yæ siê. Jest to prawdopodobnie
jedyny moment kiedy Y. enterocolitica jest zdolna do wzrostu wewn¹trzkomórkowego. Razem z makrofagami mo¿e te¿ przemieszczaæ siê w g³¹b organizmu. Œrodowisko fagolizosomu makrofaga cechuje niskie pH i niska osmoralnoœæ. Kwaœne pH
i 37°C indukuj¹ ekspresjê bia³ka Myf. Pasa¿ przez to œrodowisko nadaje komórce
bakteryjnej w³aœciwoœci umo¿liwiaj¹ce w nastêpnej kolejnoœci prze¿ycie w kontakcie z neutrofilami. Prze¿ywalnoœæ wewn¹trz neutrofilów zale¿y czêœciowo od
bia³ka YadA, które chroni komórkê bakteryjn¹ przed fagocytoz¹. Nastêpne etapy
26
infekcji wi¹¿¹ siê z zewn¹trzkomórkowym wzrostem Y. enterocolitica. Adhezyny
Ail i YadA chroni¹ przed bakteriobójczym dzia³aniem surowicy. Wzrost zewn¹trzkomórkowy mo¿liwy jest dziêki aktywnoœci wirulonu Yop. Warunkiem jego funkcjonowania jest œcis³y kontakt komórki patogenu z komórk¹ eukariotyczn¹. Wa¿n¹
rolê w ustaleniu tego kontaktu mog¹ pe³niæ adhezyny YadA i Inv.
3.3. Aktywnoœæ wirulonu Yop-wzrost zewn¹trzkomórkowy Y. enterocolitica
oraz rozsianie zaka¿enia do tkanek i narz¹dów
3.3.1. Wirulon Yop
Hamowanie fagocytozy, ³agodzenie odczynu zapalnego oraz pobudzenie uk³adu
immunologicznego organizmu gospodarza do efektywnego dzia³ania wi¹¿e siê z aktywnoœci¹ wirulonu Yop kodowanego na plazmidzie pYV. Wirulon Yop jest archetypem systemu sekrecji III typu, który zidentyfikowano te¿ u innych patogenów
zwierzêcych i roœlinnych [31]. W wyniku jego dzia³ania patogenne szczepy Y. enterocolitica mog¹ prze³amaæ barierê obronn¹ gospodarza, skolonizowaæ tkankê limfatyczn¹ lub mno¿¹c siê we krwi doprowadziæ do infekcji systemowej. Zdumiewaj¹cy
potencja³ patogenny Y. enterocolitica jest wynikiem aktywnoœci czterech podstawowych elementów wirulonu tj. efektorowych bia³ek Yop (YopE, H, M, O, P, T),
bia³ek opiekuñczych Syc, aparatu sekrecyjnego Ysc, a tak¿e tzw. translokatorów
(bia³ka YopB, D, LcrV) dziêki którym, efektorowe bia³ka Yop podlegaj¹ sekrecji
i translokacji [26]. Bia³ka efektorowe s¹ syntetyzowane bez sekwencji sygnalnej,
a sygna³ sekrecyjny (minimum 15 aa) prawdopodobnie znajduje siê w N-koñcowej
domenie bia³ka. Istnieje równie¿ hipoteza sformu³owana przez A n d e r s o n
i S c h n e e w i n d [4] wed³ug której sekrecja regulowana jest na poziomie translacji,
a sygna³ sekrecyjny mo¿e znajdowaæ siê na 5’ koñcu mRNA. Sekrecja bia³ek Yop
wymaga obecnoœci ma³ych cytoplazmatycznych bia³ek opiekuñczych zwanych bia³kami Syc. Bia³ka Syc wi¹¿¹ siê z odpowiednimi bia³kami Yop, co prawdopodobnie
zapobiega ich asocjacji i degradacji. Mo¿liwe, ¿e bia³ka opiekuñcze Syc uczestnicz¹
tak¿e w kierowaniu syntetyzowanych bia³ek Yop w stronê aparatu sekrecyjnego Ysc,
zlokalizowanego w os³onach komórki bakteryjnej. Badania ostatnich lat pozwoli³y na
sformu³owanie dwóch innych hipotez. Wed³ug jednej z nich bia³ka opiekuñcze Syc
zapobiegaj¹ fa³dowaniu cz¹steczki Yop, co u³atwia³oby jej transport. Druga hipoteza
zak³ada, ¿e Syc dostarczaj¹ trójwymiarowy „pomocniczy” sygna³ przestrzenny [17].
W funkcjonowaniu wirulonu Yop uczestnicz¹ tak¿e bia³ka regulatorowe: VirF
[29, 96], YscM1 i YscM2 (LcrQ u Y. pseudotuberculosis) [78, 89]. Warunkiem
koniecznym do aktywacji wirulonu Yop i uwalniania efektorowych bia³ek Yop do
cytozolu komórki eukariotycznej in vivo jest œcis³y kontakt komórki bakteryjnej
z eukariotyczn¹.
Szczegó³owy opis mechanizmu sekrecji III typu Y. enterocolitica zaanga¿owanego
w sekrecjê i translokacjê efektorowych bia³ek Yop znajd¹ czytelnicy w ostatniej pracy
przegl¹dowej przygotowanej miêdzy innymi przez autorkê obecnego artyku³u [44].
Zawarte w tej pracy informacje dotycz¹ce bia³ek Yop koncentruj¹ siê na najnowszych
wynikach dotycz¹cych wp³ywu œrodowiska na regulacjê ich ekspresji i sekrecji.
27
3.3.2. Efektorowe bia³ka Yop
Wewn¹trz komórki eukariotycznej efektorowe bia³ka Yop pe³ni¹ dwojak¹ funkcjê. Zaburzaj¹ mechanizmy przekazywania sygna³u co prowadzi do dezorganizacji
cytoszkieletu komórki gospodarza (YopH, YopE, YopT, YopO) oraz hamuj¹ odpowiedŸ zapaln¹ i immunologiczn¹ (YopP, YopM oraz YopH). Hamowanie rearan¿acji
cytoszkieletu blokuje proces fagocytozy przez makrofagi jak i neutrofile.
Bia³ka Yop hamuj¹ce fagocytozê (YopH, YopE, YopT, YopO)
Bia³ko YopH (51 kDa) jest bia³kiem efektorowym o aktywnoœci fosfatazy tyrozynowej [46]. Domena katalityczna YopH znajduje siê w C-koñcowym regionie bia³ka i jest homologiczna do eukariotycznych fosfataz, PTP-az (protein-tyrosine phosphatase). Po wnikniêciu do komórki eukariotycznej bia³ko YopH defosforyluje
kinazy bia³kowe blokuj¹c tym samym przekazywanie sygna³ów komórkowych
umo¿liwiaj¹cych kontrolê wielu procesów komórkowych. Fosfataza YopH odgrywa
kluczow¹ rolê w blokowaniu zdolnoœci fagocytarnych makrofagów obni¿aj¹c tym
samym system obronny gospodarza. YopH oddzia³uje bowiem na receptorowe kinazy tyrozynowe (klasa integryn posiadaj¹cych domenê katalityczn¹), co prowadzi
do wyciszenia sygna³u powstaj¹cego w wyniku ³¹czenia siê cz¹steczek kompleksu
adhezyjnego do zewn¹trzkomórkowych czêœci receptorowych kinaz. Wewn¹trz
komórki, YopH deaktywuje bia³ka reguluj¹ce ³¹czenie filamenów aktynowych do
integryn oraz polimeryzacjê aktyny. Wyniki prac P e r s s o n i wsp. [77] dowodz¹,
¿e bia³ko YopH oddzia³ywuje z ufosforylowanymi bia³kami FAK (focal adhesin kinase) oraz p130CAS. Prace in vitro z lini¹ makrofagow¹ J774 udowodni³y, ¿e YopH
defosforyluje tak¿e bia³ka FYB (Fyn-binding protein) oraz SKAP-HOM, co prowadzi do rozpadu kompleksu adhezyjnego hamuj¹c tym samym proces pabierania bakterii przez makrofaga [11].
Trzy pozosta³e bia³ka efektorowe tj. YopE, YopT i YopO hamuj¹ proces fagocytozy przez interakcje z GTP-azami Rho (RhoA, Rac-1, Cdc42), które kontroluj¹
rearan¿acjê cytoszkieletu aktynowego komórki.
Bia³ko YopE (22,9 kDa) dezorganizuje mikrofilamenty aktynowe w komórce gospodarza [84]. W wyniku tego dzia³ania dochodzi do komórkowego amorfizmu
i oderwania siê komórek od macierzy zewn¹trzkomórkowej (efekt cytotoksyczny).
Natomiast bia³ko YopE wprowadzone do makrofagów gospodarza hamuje proces
fagocytozy. Mechanizm dzia³ania YopE prawdopodobnie polega na hamowaniu
aktywnoœci GTPaz Rho, które kontroluj¹ proces polimeryzacji aktyny [6].
Bia³ko YopT (35,5 kDa) jest cytotoksyn¹ opisan¹ i scharakteryzowan¹ stosunkowo
niedawno [57]. Efekt cytotoksyczny YopT jest tak samo silny jak bia³ka YopE. Aktywnoœæ proteolityczna YopT na terenie komórki ¿ernej prowadzi do dezorganizacji
mikrofilamentów aktynowych i zahamowania procesu fagocytozy. YopT funkcjonuje
jako proteaza cysteinowa i przeprowadza proteolityczne ciêcie domeny C-koñcowej
bia³ek RhoA, Rac i Cdc42. W rezultacie dzia³ania YopT, bia³ka Rho odcinane s¹ od
sekwencji kotwicz¹cych je na wewnêtrznej stronie b³ony plazmatycznej.
Bia³ko YopO-81,7 kDa (YpkA u Y. pseudotubeculosis) jest autofosforyluj¹c¹
kinaz¹ serynowo-treoninow¹. Model dzia³ania tej kinazy pozostaje jednak nieznany.
28
Nie uda³o siê tak¿e zdefiniowaæ substratu dla tego enzymu. Ostatnie badania sugeruj¹, ¿e bia³ko YpkA w wyniku kontaktu z filamentami aktynowymi ulega autofosforylacji. YpkA jest bia³kiem o sekwencji i strukturze przypominaj¹cej kinazy wi¹¿¹ce GTP-azê RhoA. Przy³¹czenie YopO do aktyny jak i do bia³ek RhoA czy Rac-1
mo¿e byæ istotne w procesie hamowania fagocytozy [60].
Bia³ka Yop blokuj¹ce odpowiedŸ zapaln¹ i immunologiczn¹
Efektorowe bia³ko YopP (32,5 kDa) Y. enterocolitica (YopJ u Y. pestis) hamuje
uwalnianie interleukiny-8 przez komórki epitelialne i endotelialne. Aktywnoœæ bia³ka
YopP polega tak¿e na blokowaniu uwalniania przez makrofagi czynnika martwicy
nowotworu " (TNF"), który jest pierwsz¹ cytokin¹ pojawiaj¹c¹ siê w odpowiedzi
na infekcjê bakteryjn¹ [13]. TNF-" wykazuje wielokierunkowe dzia³anie biologiczne
oraz zapocz¹tkowuje tzw. kaskadê cytokinow¹. Przypuszczalnie bezpoœrednim
celem dzia³ania bia³ka YopP s¹ kinazy MKKs i IKK$ funkcjonuj¹ce na szlaku prowadz¹cym do aktywacji czynników transkrypcyjnych NF-kB i CREB. Blokowanie
uwalniania TNF-" jest wynikiem zahamowania translokacji NF-kB do j¹dra komórki.
Badania ostatnich kilku lat dostarczy³y danych na temat udzia³u YopP w apoptozie
makrofagów [32]. Nie znany jest jednak mechanizm prowadz¹cy do œmierci komórki.
Mo¿liwe, ¿e wynika on z braku aktywnoœci czynnika transkrypcyjnego NF-kB,
który chroni komórki przed apoptoz¹. Ostatnie doniesienia charakteryzuj¹ YopP jako
proteazê cysteinow¹ tzw. SUMO proteazê uczestnicz¹c¹ w potranslacyjnej modyfikacji [25]. Jednak¿e te przypuszczenia s¹ niezgodne z wczeœniejszymi wnioskami
o hamowaniu przez YopP foforylacji MKKs i szlaku IKK$.
Bia³ko YopM (56,9–51,6 kDa) izolowane z ró¿nych gatunków Yersinia wykazuje znaczne ró¿nice masy cz¹steczkowej. Funkcja bia³ka YopM nie zosta³a dotychczas ustalona, chocia¿ wykazano jego udzia³ w procesie infekcji myszy. Wykazano
ponadto, ¿e YopM migruje do j¹dra komórki docelowej oraz, ¿e uczestniczy w regulacji transkrypcji [12]. Intensywne prace nad bia³kiem YopM ju¿ wkrótce mog¹
zaowocowaæ nowymi koncepcjami na temat jego roli w procesie patogenezy.
3.3.3. Mechanizm sekrecji i translokacji bia³ek Yop
W temperaturze 37°C dochodzi do indukcji syntezy oko³o 28 bia³ek aparatu
sekrecyjnego Ysc. Bia³ka te kodowane s¹ przez geny zlokalizowane na plazmidzie
pYV, w czterech s¹siaduj¹cych ze sob¹ loci zwanych virA (yopN, tyeA, sycN, yscX,
Y, V (lcrD), lcrR), virB (yscN, O, P, Q, R, S, T, U), virG i virC (yscA, B, C, D, E, F, G,
H, I, J, K, L, M) [27, 68]. Kilkanaœcie bia³ek tworzy w os³onach komórki bakteryjnej
organelle (molekularne strzykawki). W oparciu o dane z mikroskopu elektronowego
ustalono, ¿e organellum sk³ada siê z cia³a podstawowego (bia³ka YscC, YscD, YscR,
YscU, LcrD) ³¹cz¹cego warstwê peptydoglikanu z dwiema bakteryjnymi b³onami
(wewnêtrzn¹ i zewnêtrzn¹) oraz wystaj¹cej na zewn¹trz komórki struktury o kszta³cie
ig³y [26]. Wewn¹trz ca³ego organellum funkcjonuje kana³ sekrecyjny. Kana³ pozostaje
jednak zamkniêty do momentu wyst¹pienia bezpoœredniego kontaktu z komórk¹
eukariotyczn¹ (in vitro, otwarcie nastêpuje z chwil¹ usuniêcia jonów wapnia).
W tym czasie bia³ka Yop gromadzone s¹ na terenie cytoplazmy. Wed³ug jednej
29
z hipotez trzy bia³ka: YopN, TyeA oraz LcrG dzia³aj¹ jako zawór kontroluj¹cy
sekrecjê bia³ek Yop [86]. Rolê sensora wra¿liwego na stê¿enie jonów wapnia przypisuje siê bia³ku YopN, które jednoczeœnie pe³ni³oby funkcjê „korka”. Kontakt
z komórk¹ eukariotyczn¹, który decyduje o otwarciu kana³u sekrecyjnego, polega
prawdopodobnie na oddzia³ywaniu bia³ka LcrG z receptorami na powierzchni
komórki gospodarza. Mo¿liwe, ¿e w oddzia³ywaniach tych uczestnicz¹ tak¿e adhezyny bakteryjne. W przypadku fagocytozy prawdopodobnie tylko obecnoœæ receptorów
na komórce ¿ernej jest wystarczaj¹ca do bezpoœredniego kontaktu. Po kontakcie
z receptorem, zawór ulega otwarciu co umo¿liwia sekrecjê i translokacjê bia³ek. Translokacja efektorowych bia³ek Yop do cytozolu komórek eukariotycznych przebiega
przy udziale translokatorów tj. bia³ek YopB, YopD, LcrV [85]. YopD jest g³ównym
elementem aparatu translokacji. Ponadto, w œwietle ostatnich badañ mo¿e pe³niæ tak¿e
rolê negatywnego regulatora ekspresji i translokacji bia³ek Yop [42]. Translokatory
tworz¹ w b³onie komórki eukariotycznej niedu¿y kana³ (œrednica 16–23 Å). Przypuszcza siê, ¿e bia³ka te musz¹ byæ syntetyzowane jako pierwsze tj. przed bia³kami efektorowymi. Jednak¿e ustalenie tej kolejnoœci jest spraw¹ otwart¹. Podobnie jak pytanie
co dzieje siê z bia³kow¹ ig³¹? Czy jest instalowana przed kontaktem z komórk¹ eukariotyczn¹. A jeœli tak, to co dzieje siê w momencie œcis³ego kontaktu miêdzy komórkami, czy ig³a kurczy siê lub ³amie albo przebija b³onê komórki docelowej? Istnieje
hipoteza, ¿e bia³ka YopB, YopD i LcrV destabilizuj¹ b³onê komórki gospodarza umo¿liwiaj¹c zanurzenie ig³y i zakotwiczenie siê komórki bakteryjnej.
3.3.4. Sygna³y pochodz¹ce z organizmu gospodarza aktywuj¹ce mechanizm
sekrecji III typu – wapniowy paradoks
Ju¿ w latach 50-tych zaobserwowano, ¿e patogenne dla ludzi gatunki Yersinia in
vitro wymagaj¹ do wzrostu w temperaturze 37°C jonów Ca+2. Zjawisko to znane
jest w literaturze pod nazw¹ „zale¿noœæ wapniowa” („Ca+2 dependency”) [92]. PóŸniejsze badania wykaza³y, ¿e usuniêcie jonów wapnia z równoczesnym podwy¿szeniem temperatury hodowli z 25°C do 37°C hamuje wzrost i uruchamia sekrecjê
bia³ek Yop do pod³o¿a. Tymczasem prace nad cyklem ¿yciowym Y. enterocolitica
dowiod³y, ¿e jest to patogen namna¿aj¹cy siê w organizmie gospodarza zewn¹trzkomórkowo, gdzie stê¿enie jonów wapnia jest wysokie i wynosi oko³o 2,5 mM.
Warunki (in vivo) wyklucza³yby wiêc sekrecjê bia³ek Yop. Intensywne prace badawcze dotycz¹ce tego paradoksu wapniowego zaowocowa³y jego rozwi¹zaniem.
Udowodniono, ¿e efektorowe bia³ka Yop podlegaj¹ sekrecji i translokacji wprost do
cytozolu komórki eukariotycznej [27]. Bezpoœredni kontakt komórki bakteryjnej
z komórk¹ eukariotyczn¹ jest sygna³em do otwarcia kana³u sekrecyjnego, a tak¿e do
uruchamiania transkrypcji genów yop. Warunek ten konieczny jest do uruchomienia
mechanizmu sekrecji III typu u patogenów zwierzêcych z rodzaju Shigella oraz
P. aeruginosa [42]. W jaki sposób bezpoœredni kontakt prowadzi do otwarcia kana³u
sekrecyjnego nie wiadomo. Rozwa¿any jest udzia³ ligandów na powierzchni komórki bakteryjnej w oddzia³ywaniach ze specyficznymi receptorami na powierzchni
komórki gospodarza. Te oddzia³ywania mog³yby u Yersinia aktywowaæ sekrecjê
i uruchamiaæ blokowany przez bia³ka YopN, TyeA, LcrG mechanizm translokacji.
30
Jaka jest rola sygna³ów pochodz¹cych ze œrodowiska w aktywacji mechanizmu
sekrecji III typu? Prace L e e i wsp. [64] prowadzone in vitro z lini¹ komórkow¹
HeLa dostarczy³y dowodów na istnienie trzech takich sygna³ów. Stanowi¹ je,
w œrodowisku zewn¹trzkomórkowym, aminokwasy (glutaminian, glutamina, asparaginian, asparagina) oraz bia³ka (np. albumina) obecne w surowicy dodanej do pod³o¿a hodowlanego. Wed³ug hipotezy autorów trzeci sygna³, wapniowy, generuje
komórka eukariotyczna, a Yersinia „mierzy³yby” stê¿enie jonów wapnia w b³onie
cytoplazmatycznej komórki. Molekularna natura sygna³u wapniowego jest nieznana.
W przedstawionym modelu (Rys. 2), podwy¿szona temperatura oraz zwiêkszone
stê¿enie aminokwasów w œrodowisku indukuj¹ u Y. enterocolitica instalacjê aparatu
sekrecji (molekularn¹ strzykawkê). Albumina i inne bia³ka surowicy aktywuj¹ komórkê patogenu do sekrecji bia³ek translokatorowych YopB, YopD i YopR. Natomiast
kontakt patogenu z komórk¹ eukariotyczn¹ dostarcza sygna³u wapniowego i prowadzi
do odblokowania mechanizmu sekrecji bia³ek efektorowych. Dane z mikroskopu
elektronowego wskazuj¹ na insercjê ig³y aparatu sekrecyjnego w b³onê plazmatyczn¹
komórek eukariotycznych. Taka insercja s³u¿y³aby nie tylko jako droga transportu
efektorowych bia³ek Yop przez b³onê, ale tak¿e pomiarom stê¿enia jonów Ca +2.
Niskie stê¿enie Ca+2 by³oby sygna³em do transportu bia³ek. Oczywiœcie w odpowiedzi na zmiany temperatury z niskiej do 37°C uruchamiana jest kaskada reakcji regulatorowych z udzia³em bia³ka VirF, regulatora transkrypcji genów wirulonu Yop.
Przedstawiony model stopniowego, sukcesywnego budowania i uruchamiania systemu sekrecji zak³ada tak¿e udzia³ bia³ek regulatorowych. Nale¿¹ do nich bia³ka
YopD, LcrH, YscM1/YscM2 (LcrQ), które chroni³yby system sekrecji przed aktywacj¹ w œrodowisku pozbawionym glutaminianu. Ostatnie badania sugeruj¹ tak¿e,
¿e bia³ka te u Y. pseudotuberculosis i Y. pestis bior¹ udzia³ w potranskrypcyjnej
regulacji ekspresji genów yop. Albumina aktywuje III system sekrecji, ale byæ mo¿e
istniej¹ te¿ inne niezidentyfikowane czynniki hamuj¹ce transport YopB, D, R. Natomiast bia³ka YopN, TyeA, SycN, YscB i LcrG blokowa³yby etap wstrzykniêcia efektorowych bia³ek Yop, dopóki komórka nie dosta³aby sygna³u wapniowego.
Jaka jest rola sygna³ów pochodz¹cych z surowicy podczas infekcji organizmu gospodarza (ssaka)? Mo¿liwe, ¿e in vivo glutaminian i albumina surowicy dostarczaj¹
sygna³ów, które prowadz¹ do aktywacji III typu sekrecji. Natomiast podczas infekcji
hodowli tkankowych komórki Yersinia otrzymuj¹ sygna³ pochodz¹cy z surowicy obecnej w pod³o¿u hodowlanym. Eksperymentalna weryfikacja tych przypuszczeñ jest
utrudniona przez fakt, ¿e oba tj. zainfekowany organizm gospodarza oraz komórki
hodowli tkankowej uwalniaj¹ glutaminian, glutaminê i bia³ka do zewn¹trzkomórkowego pod³o¿a (surowicy) [64]. Dlatego proste pominiêcie tych zwi¹zków nie jest mo¿liwe. Warto te¿ dodaæ, ¿e wiele innych bia³ek poza albumin¹ mo¿e aktywowaæ sekrecjê YopB, D, R w obecnoœci jonów wapnia. Mo¿liwe wiêc, ¿e Yersinia rozpoznaj¹
cechê wspóln¹ dla bia³ek surowicy i odpowiadaj¹ na ni¹ aktywuj¹c III system.
3.3.5. Kontrola aktywnoœci wirulonu Yop
Dwa ró¿ne mechanizmy kontroluj¹ aktywnoœæ wirulonu Yop u Yersinia. Pierwszy funkcjonuje na poziomie transkrypcji i umo¿liwia ekspresjê wszystkich genów
31
Rys. 2. Sygna³y pochodz¹ce z organizmu gospodarza uruchamiaj¹ III typ sekrecji wg L e e i wsp.,
zmodyfikowany [64]
Schemat przedstawia model zdarzeñ, które zachodz¹ podczas infekcji Yersinia. Wejœciu komórki Yersinia do organizmu gospodarza towarzysz¹ zmiany w temperaturze i zewn¹trzkomórkowym stê¿eniu glutaminianu, co indukuje
ekspresjê genów yop oraz sekrecjê III typu. Albumina surowicy uruchamia sekrecjê YopBDR do zewnêtrznego
pod³o¿a. Kontakt z komórkami eukariotycznymi zatrzymuje sekrecjê i przekszta³ca mechanizm III typu w molekularn¹ strzykawkê. Cytozol komórki eukariotycznej generuje sygna³ wapniowy, który aktywuje wstrzykiwanie
efektorowych bia³ek Yop. Cz¹steczki represora reguluj¹ aktywnoœæ mechanizmu III typu. YopD, LcrH i YscM
prawdopodobnie reguluj¹ translacjê bia³ek podlegaj¹cych sekrecji, podczas gdy YopN, TyeA, SycN i YscB
funkcjonuj¹ jako zawór dla omawianego mechanizmu.
32
wirulencji kodowanych na plazmidzie pYV. Transkrypcja genów yop, yadA, a tak¿e
ca³ego operonu virC w temperaturze 37°C zale¿y od aktywnoœci kluczowego regulatora VirF (regulacja pozytywna). Du¿o mniejsze znaczenie ma VirF na transkrypcjê operonów virA i virB. Gen virF jest transkrybowany w 37°C i jego ekspresja
jest modulowana przez histonopodobne bia³ko YmoA. Istot¹ tej regulacji s¹ zmiany
w architekturze DNA (patrz pkt. 2.1.2).
Drugi mechanizm dotyczy procesu sekrecji bia³ek Yop i aktywny jest równie¿
w 37°C, a ponadto uruchamiany in vivo w odpowiedzi na sygna³ wapniowy pochodz¹cy z komórki eukariotycznej. Sekrecja bia³ek Yop in vitro zachodzi przy braku
jonów wapnia w œrodowisku. BodŸce ze œrodowiska w postaci zmian w stê¿eniu aminokwasów oraz bia³ek surowicy mog¹ kontrolowaæ proces sekrecji i translokacji [42].
Bezpoœredni kontakt patogenu z komórk¹ eukariotyczn¹ jest sygna³em nie tylko
do otwarcia kana³u sekrecyjnego, ale tak¿e do uruchomienia transkrypcji genów
yop. Potwierdzi³y to badania poziomu ekspresji fuzji operonowej yopE-luxAB jak
równie¿ analiza Northern [78]. Wed³ug hipotezy P e t t e r s o n a i wsp. [78] aktywacja transkrypcji genów yop u Y. pseudotuberculosis zwi¹zana jest z usuniêciem
z komórki patogenu negatywnego regulatora LcrQ. W sekrecji LcrQ uczestniczy
prawdopodobnie bia³ko opiekuñcze SycH. Wa¿nym elementem tej regulacji jest
tak¿e bia³ko YopD. Rolê negatywnego regulatora transkrypcji u Y. enterocolitica
pe³ni³yby bia³ka YscM1 i YscM2, które gromadzone w cytoplazmie Y. enterocolitica
uruchamia³yby mechanizm hamowania zwrotnego, „feedback inhibition”, co zapobiega³oby niekorzystnej dla komórki akumulacji bia³ek Yop [25].
Mimo znacznego postêpu wiedzy w dziedzinie kontroli syntezy i uwalniania bia³ek Yop do cytozolu komórki eukariotycznej wiele w¹tpliwoœci i pytañ czeka na
rozwi¹zanie i odpowiedzi.
4. Podsumowanie
W pracy przedstawiono wyniki badañ na ekspresjê tych cech i czynników wirulencji, które funkcjonuj¹ na kolejnych etapach cyklu ¿yciowego Y. enterocolitica,
a które uruchamiane s¹ w odpowiedzi na zmieniaj¹ce siê czynniki œrodowiskowe.
Wiedza o mechanizmach tej regulacji pozwala poznaæ mo¿liwoœci adaptacyjne
Y. enterocolitica, mechanizmy wirulencji i zrozumieæ jak¹ rolê w sterowaniu „arsena³em broni” pe³ni œrodowisko.
Badania mo¿liwoœci adaptacyjnych w rodzaju Yersinia nabieraj¹ szczególnego
znaczenia w œwietle ostatnich badañ wzbogaconych o analizê genomowego DNA
trzech patogennych gatunków tj. Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis oraz
Y. pestis. Wyniki tych badañ dowodz¹ bowiem, i¿ ewolucja w rodzaju Yersinia jest
konsekwencj¹ zdobywania nowych nisz ekologicznych, czemu towarzyszy zarówno transfer horyzontalny genów zjadliwoœci, jak równie¿ mechanizmy prowadz¹ce
do wyciszenia genów. Brak u Y. pestis genu yst, a tak¿e obecnoœæ nieczynnych genów dla Inv i YadA jest tego najlepszym przyk³adem.
33
Piœmiennictwo
1. Aiba H., Mizuno T.: Phosphorylation of bacterial activator protein, OmpR, by a protein kinase,
EnvZ, stimulates the transcription of the ompF and ompC genes in Escherichia coli. FEBS Lett.
261, 19–22 (1990)
2. Aiba H., Mizuno T., Mizushima S.: Transfer phosphoryl group between two regulatory proteins
involved in osmoregulatory expression of the ompF and ompC genes Escherichia coli. J. Biol.
Chem. 264, 8563–8567 (1989)
3. Amirmozafari N., Robertson D.C.: Nutritional requirements for synthesis of heat-stable enterotoxin by Yersinia enterocolitica. App. Env. Microbiol. 59, 2214–3320 (1993)
4. Anderson D.M., Schneewind O.: Yersinia enterocolitica type III secretion: an mRNA signal that
couples translation and secretion of YopQ. Mol. Microbiol. 31, 1139–148 (1996)
5. Anderson P., Bauer W.: Supercoiling in closed circular DNA: dependence upon ion type and
concentration. Biochem. 17, 594–596 (1978)
6. Andor A.: YopE of Yersinia, a GAP for Rho GTPases, selectively modulates Rac-dependent
action structures in endothelial cells. Cell Microbiol. 3, 301–310 (2001)
7. Badger J.L. Miller V.L.: Role of RpoS in survival of Yersinia enterocolitica to a variety of environmental stresses. J. Bacteriol. 177, 5370–5373 (1995)
8. Badger J.L., Miller V.L.: Expression of invasion and motility are coordinately regulated in Yersinia enterocolitica. J. Bacteriol. 180, 793–800 (1998)
9. Barret J.F., Hoch J.A.: Two-component signal transduction as a target for microbial anti-infective
therapy. Antimicrob. Agents Chemother. 42, 1529–1536 (1998)
10. Bernardini M.J., Fontaine A., Sansonetti P.J.: The two-component regulatory system OmoR-EnvZ
controls the virulence of Shigella flexneri. J. Bacteriol. 172, 6274–6281 (1990)
11. Black D.S., Marie-Cardine A., Schraven B., Bliska J.B.: The Yersinia tyrosine phosphatase YopH
targets a novel adhesion-regulated signaling complex in macrophages. Cell Microbiol. 2,
401–414 (2000)
12. Boland A., Sory M.-P., Iriarte M., Kerbourch C., Wattiau P., Cornelis G.R.: Status of YopM and
YopN in the Yersinia Yop virulon: YopM of Y. enterocolitica is internalized inside the cytosol of
PU5-1.8 macrophages by the YopB, D, N delivery apparatus. EMBO J. 15, 5191–5201 (1996)
13. Boland A., Cornelis G.R.: Role of YopP in suppression of tumor necrosis factor alpha release by
macrophages during Yersinia infection. Infect. Immun. 66, 1878–1884 (1998)
14. Boos W., Shuman H.: Maltose/maltodextrin system of Escherichia coli: transport, metabolism
and regulation. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 204–229 (1998)
15. Bottone E.J.: Yersinia enterocolitica: the charisma continues. Clinical Microbiol. Rev. 10,
257–276 (1997)
16. Bourret R.B., Borkovich K.A., Simon M.I.: Signal transduction pathways involving protein phosphorylation in prokaryotes. Ann. Rev. Biochem. 60, 401–441 (1991)
17. Britalan S.C., Philips R.M., Ghosh P.: Three-dimensional secretion signals in chaperone-effectors
complexes of bacterial pathogens. Mol. Cell. 9, 971–980 (2002)
18. Brzostek K., Górka A., Rechnio M.: Physiological properties and production of siderophores
detected in Yersinia enterocolitica strain 4–32. Microbios, 101, 169–180 (2000)
19. Brzostek K., Heleszko H., Hrebenda J.: Maltoporins and maltose-binding proteins of Yersinia
enterocolitica. J. Gen. Microbiol. 139, 195–201 (1993)
20. Brzostek K., Heleszko H., Hrebenda J.: Production of Escherichia coli LamB protein in Yersinia
enterocolitica. FEMS Microbiol. Lett. 127, 17–21 (1995)
21. Brzostek K., Raczkowska A.: The level of Yop proteins secreted by Yersinia enterocolitica is
changed in maltose mutants. FEMS Microbiol. Lett. 204, 95–100 (2001)
22. Brzostek K., Raczkowska A., Zasada A.: The osmotic regulator OmpR is involved in the response
of Yersinia enterocolitica O:9 to environmental stresses and survival within macrophages. FEMS
Microbiol. Lett. 228, 265–271 (2003)
34
23. Brzostek K., Stencel I., Hrebenda J.: Osmoregulation-dependent expression of Yersinia enterocolitica virulence factors. Acta Microbiol. Polon. 48, 31–37 (1999)
24. Chambers C.E., Sokol P.A.: Comparison of siderophore production and utilization and environmental isolates of Yersinia enterocolitica. J. Clin. Microbiol. 32, 32–39 (1994)
25. Corneli G.R.: Yersinia type III secretion: send in the effectors. J. Cell Biol. 158, 401–408 (2002)
26. Cornelis G.R.: The Yersinia Ysc-Yop “type III” weaponry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 742–754
(2002)
27. Cornelis G.R., Boland A., Boyd A.P., Geuijen C., Iriarte M., Neyt C., Sory M.-P., Stainier I.: The
virulence plasmid of Yersinia, an antihost genome. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 1315–1352 (1998)
28. Cornelis G.R., Laroche Y., Balligant G., Sory M.-P., Wauters G.: Yersinia enterocolitica, a primary
model for bacterial invasiveness. Rev. Inf. Dis. 9, 64–87 (1987)
29. Cornelis G.R., Sluiters C., Lambert de Rouvroit C.L., Michiels T.: Homology between virF, the
transcriptional activator of the Yersinia virulence regulon, and AraC, the Escherichia coli arabinose operon regulator. J. Bacteriol. 171, 254–262 (1989)
30. Cornelis G.R., Sluiters C., Delor I., Geib D., Kaniga K., Lambert de Rouvroit C.L., Sory M.P.,
Vanooteghem J.C., Michiels T.: ymoA, a Yersinia enterocolitica chromosomal gene modulating
the expression of virulence function. Mol. Microbiol. 5, 1023–1034 (1991)
31. Cornelis G.R., Van Gijsegem F.: Assembly and function of type III secretory systems. Annu. Rev.
Microbiol. 54, 735–774 (2000)
32. Denecker G., Declercq W., Geuijen C.A., Boland A., Benabdillah R., van Gurp M., Sory M.P.,
Vandenabeele P., Cornelis G.R.: Yersinia enterocolitica YopP-induced apoptosis of macrophages
involves the apoptotic signaling cascade upstream of bid. J. Biol. Chem. 276, 19706–19714 (2001)
33. Diaz R., Urra E., Toyos J., Moriyon I: Characterization of a Yersinia enterocolitica antigen common to enterocolitis-associated serotypes. J. Clin. Microbiol. 22, 1035–1039 (1985)
34. Dorman C.J., Chatfield S., Higgins C.F., Hayward C., Dougan G.: Characterization of porin and
ompR mutants of a virulent strain of Salmonella typhimurium: ompR mutants are attenuated in
vivo. Infect. Immun. 57. 2136–2140 (1989)
35. Dorman Ch.J., Ni Bhriain N.: DNA topology and bacterial virulence gene regulation. Trends.
Microbiol. 1, 92–99 (1993)
36. Dorman Ch.J.: DNA supercoiling and environmental regulation of gene expression in pathogenic
bacteria. Infect. Immun. 59, 745–749 (1991)
37. Dorman Ch.J.: DNA topology and the global control of bacterial gene expression: implication for
the regulation of virulence gene expression. Microbiol. 141, 1271–1280 (1995)
38. Dorrel N., Li S.-R., Everest P.H., Dougan G., Wren B.W.: Construction and characterization of a
Yersinia enterocolitica O:8 ompR mutant. FEMS Microbiol. Lett. 165, 145–151 (1998)
39. Drlica K., Rouviere-Yaniv J.: Histonlike proteins of bacteria. Microbiol. Rev. 51, 301–319 (1987)
40. Drlica K.: Control of bacteria DNA supercoiling. Mol. Microbiol. 6, 425–433 (1993)
41. El Tahir Y., Skurnik M.: YadA, the multifaceted Yersinia adhesin. Int. J. Med. Microbiol. 291,
209–218 (2001)
42. Francis M.S., Wolf-Watz H., Fosberg A.: Regulation of type III secretion systems. Curr. Opin.
Microbiol. 5, 166–172 (2002)
43. Gallegos M.T., Scheif R., Bairoch A., Hofmann K., Ramos J.L.: AraC/XylS family of transcriptional regulators. Microbiol. Mol. Rev. 61, 393–410 (1997)
44. Górka A., Brzostek K., Hrebenda J.: Bia³ka Yop rodzaju Yersinia – mechanizm sekrecji i translokacji. Post. Microbiol. 38, 141–162 (1999)
45. Groisman E.A.: The pleiotropic two-component regulatory system PhoP-PhoQ. J. Bacteriol. 183,
1835–1842 (2001)
46. Guan K., Dixon J.E.: Protein tyrosine phosphate activity of essential virulence determinant in
Yersinia. Science, 249, 553–556 (1990)
47. Haag H., Hankce K., Drechsel H., Stojiljkovic I., Jung G., Zähner H.: Purification of yersiniabactin: a siderophore and possible virulence factor of Yersinia enterocolitica. J. Gen. Microbiol.
139, 2159–2165(1993)
35
48. Hengge-Aronis R.: Recent insights into the general stress response regulatory network in Escherichia coli. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 4, 341–346 (2002)
49. Higgins Ch.F., Dorman Ch.J., Stirling D.A., Waddell L., Booth I.R., May G., Bremer E.: A physiological role for DNA supercoiling in the osmotic regulation of gene expression in Salmonella
typhimurium and Escherichia coli. Cell, 52, 569–584 (1988)
50. Hoiczyk E., Roggenkamp A., Reichenbecher M., Lupas A., Heesemann J.: Structure and sequence
analysis of Yersinia YadA and Moraxella UspAs reveal a novel class of adhesin. EMBO J. 15,
59989–5999 (2000)
51. Hsieh L.S., Rouviere-Yaniv J., Drlica K.: Bacterial DNA supercoiling and [ATP/ADP] ratio: changes associated with salt shock. J. Bacteriol. 173, 3914–3917 (1991)
52. Igo M.M., Ninfa A.J., Silhavy T.J.: A bacterial environmental sensor that functions as a protein
kinase and stimulates transcriptional activation. Genes Dev. 3, 598–605 (1989)
53. Inoue T., Okamoto K., Moriyama T., Takahashi T., Shimizu K., Miyama A.: Effect of Yersinia
enterocolitica ST on cycling guanosine 3’,5’-monophosphate levels in mouse intestines and cultured cells. Microbiol. Immunol. 27, 159–166 (1983)
54. Iriarte M., Cornelis G.R.: MyfF, an element of the network regulating the synthesis of fibrillae in
Yersinia enterocolitica. J. Bacteriol. 177, 7338–744 (1995)
55. Iriarte M., Stainier I., Cornelis C.R.: The rpoS gene from Yersinia enterocolitica and its influence
on expression of virulence factors. Infect. Immun. 63, 1840–1847 (1995)
56. Iriarte M., Vanooteghem J.C., Delor I., Diaz R., Knutton S., Cornelis G.R.: The Myf fibrillae of
Yersinia enterocolitica. Mol. Microbiol. 9, 507–520 (1993)
57. Iriarte M., Cornelis G.R.: YopT, a new Yersinia Yop effector protein, affects the cytoskeleton
of host cells. Mol. Microbiol. 29, 915–929 (1998)
58. Isberg R.R., Leong J.M.: Multiple $1 chain integrins are receptors for invasin, a protein that
promotes bacterial penetration into mamalian cells. Cell, 60, 861–871 (1990)
59. Jepson M.A., Clark M.A.: M cells and their role in infection. Trends Microbiol. 6, 359–365 (1998)
60. Juris S.J. Rudolph A.E., Huddler D., Orth K., Dixon J.E.: A distinctive role for the Yersinia protein kinase: actin binding, kinase activation, and cytoskeleton disruption. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 97, 9431–9436 (2000)
61. Lambert de Rouvroit C., Sluters C., Cornelis G.R.: Role of the transcriptional activator, VirF, and
temperature in the expression of the pYV plasmid genes of Yersinia enterocolitica. Mol. Microbiol. 6, 395–409 (1992)
62. Lan C., Igo M.M.: Differential expression of the OmpF and OmpC porin proteins in Escherichia
coli K-12 depends upon the level of active OmpR. J. Bacteriol. 180, 171–174 (1998)
63. Lang H., Jonson G., Holmgren J., Palva E.T.: The maltose regulon of Vibrio cholerae affects
production and secretion of virulence factors. Infect. Immun. 62, 4781–4788 (1994)
64. Lee V.T., Mazmanian S.K., Schneewind O.: A program of Yersinia enterocolitica type III reaction
is activated by specific signal. J. Bacteriol. 183, 4970–4978 (2001)
65. Lucht J.M., Bremer E.: Adaptation of Escherichia coli to high osmolarity environments: Osmoregulation of the high-affinity glycine betaine transport system ProU. FEMS Microbiol. Rev. 14,
3–20 (1994)
66. McClellan J.A., Bublikova P., Palecek E., Lilley D.M.J.: Superhelical torsion in cellular
DNA responds directly to environmental and genetic factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87,
8373–8377 (1990)
67. Mecsas J., Welch R., Ericson J.W., Cross C.A.: Identification and characterization of an outer
membrane protein, OmpX, in Escherichia coli that is homologous to family of outer membrane
proteins including Ail of Yersinia enterocolitica. J. Bacteriol. 177, 799–804 (1995)
68. Michiels T., Vanooteghem J.C., Lambert de Rouvroit C.L., China B., Gustin A., Boudry P.,
Cornelis G.R.: Analysis of virC, an operon involved in the secretion of Yop proteins by Yersinia
enterocolitica. J. Bacteriol. 173, 4994–5009 (1991)
69. Mikulskis A.V., Delor I., Thi V.H., Cornelis G.R.: Regulation of the Yersinia enterocolitica Yst
gene. Influence of growth phase, temperature, osmolarity, pH and bacterial host factors. Mol.
Microbiol. 14, 905–915 (1994)
36
70. Miller V.L., Farmer III J.J. Hill W.E., Falkow S.: The ail locus is found uniquely in Yersinia
enterocolitica serotypes commonly associated with disease. Infect Immun. 57, 121–131 (1989)
71. Miller V.L., Bliska J.B., Falkow S.: Nucleotide sequence of the Yersinia enterocolitica ail gene an
characterization of the Ail protein product. J. Bacteriol. 172, 1062–1069 (1990)
72. Morimoto A., Tissieres A., Georgopoulos C.: The stress response, function of the proteins, and
perspectives (w:) Stress proteins in biology and medicine, red. A. Morimoto, A. Tissieres,
C. Georgopoulos, CSH Lab. Press, Cold Spring Harbor, New York 2000, s. 1–36
73. Neilands J.B.: Microbial iron compounds. Ann. Rev. Biechem. 50, 715–731 (1981)
74. Oyston P.C.F., Dorrell N., Williams K., Li S.-R., Green M., Titball R.W., Wren B.W.: The response
regulator PhoP is important for survival under conditions of macrophage-induced stress and virulence in Yersinia pestis. Infect Immun. 68, 3419–3425 (2000)
75. Pepe J.C., Badger J.L., Miller V.L.: Growth phase and low pH affect the termal regulation of the
Yersinia enterocolitica inv gene. Mol. Microbiol. 11, 123–135 (19940
76. Perego M., Hoch J.A.: Protein aspartate phosphatases control the output of two-component signal
transduction systems. Trends. Genet. 12, 97–101 (1996)
77. Persson C., Carballeira N., Wolf-Watz H., Fällman M.: The PTPase YopH inhibits uptake of
Yersinia, tyrosine phosphorylation of p130CAS and FAK, and the associated accumulation of these
proteins in peripherial focal adhesions. EMBO J. 16, 2307–2318
78. Petterson J., Nordfelth R., Dubinina E., Bergman T., Gustafsson M., Magnusson K.E., Wolf-Watz H.: Modulation of virulence factor expression by pathogen target cell contact. Science,
273, 1231–1233 (1996)
79. Rakin A., Schubert S., Pelludat C., Brem D., Heesemann J.: The High-Pathogenicity Island
of Yersiniae (w:) Pathogenicity Islands and other mobile virulence elements, red. J.B. Kaper,
J. Hacker, American Society for Microciol., Washington, DC, 1999
80. Robbins-Browne R.M., Takeda T., Fasand A., Borund A., Dohi S., Kasuga H., Fong G., Prado V.,
Guerrant R.L., Morris J.G., Jr.: Assessment of enterotoxin production by Yersinia enterocolitica
and identification of a novel heat-stable enterotoxin produced by a noninvasive Y. enterocolitica
strain isolated from clinical material. Infect. Immun. 61, 764–767 (1993)
81. Roggenkamp A., Ruckdeschel K., Leitritz L., Schmitt R., Heesemann J.: Deletion of amino acids
29 to 81 in adhesion protein YadA of Yersinia enterocolitica serotype O:8 results in selective
abrogation of adherence to neutrophils. Infect. Immun. 64, 2506–2514 (1996)
82. Roggenkamp A., Ruckdeschel K., Leitritz L., Schmitt R., Heesemann J.: Substitution of the two
histidine residues in YadA protein of Yersinia enterocolitica abrogates collagen binding, cell
adherence and mouse virulence. Mol. Microbiol. 16, 1207–1219 (1995)
83. Rohde J.R. Fox J.M., Minnich S.A.: Thermoregulation in Yersinia enterocolitica is coincident
with changes in DNA supercoiling. Mol. Microbiol. 12, 187–199 (1994)
84. Rosqvist R., Frosberg A., Wolf-Watz H.: Intracellular targeting of the Yersinia YopE cytotoxin in
mammalian cells induces actin microfilament disruption. Infect. Immun. 59, 4562–4569 (1991)
85. Sarker M.R., Neyt C., Stainier I., Cornelis G.R.: The Yersinia Yop virulon: LcrV is required for
extrusion of the translocators YopB and YopD. J. Bacteriol. 180, 1207–1214 (1998)
86. Sarker M.R., Sory M.-P., Boyd A.P., Iriarte M., Cornelis G.R.: LcrG is required for efficient translocation of Yersinia Yop effector proteins into eukaryotic cell. Infect. Immun. 66, 2976–2979
(1998)
87. Skurnik M., Toivanen P.: Yersinia enterocolitica lipopolisaccharide: genetics and virulence.
Trends Microbiol. 1, 148–152 (1993)
88. Staggs T.M., Perry R.D.: Fur regulation in Yersinia species. Mol. Microbiol. 6, 2507–2516 (1992)
89. Stainier I., Iriarte M., Cornelis G.R.: YscM1 and YscM2, two Yersinia enterocolitica proteins
causing down regulation of yop transcription. Mol. Microbiol. 26, 833–843 (1997)
90. Stock J.B., Ninfa A.J., Stock A.M.: Protein phosphorylation and regulation of adaptive responses
in bacteria. Microbiol. Rev. 53, 450–490 (1998)
91. Stojiljkovic I., Hantke K.: Transport of hemin across the cytoplasmic membrane through a heminspecific periplasmic binding-protein-dependent transport system in Yersinia enterocolitica. Mol.
Microbiol. 13, 719–732 (1994)
37
92. Straley S.C., Plano G.V., Skrzypek E., Haddix P.L., Fields K.A.: Regulation by Ca2+ in Yersinia
low-Ca2+ response. Mol. Microbiol. 8, 1005–1010, (1993)
93. Takao T., Yominaga N., Shimonishi Y., Hara S., Inoue T., Miyama A.: Primary structure of the
heat stable enterotoxin produced by Yersinia enterocolitica. Biochem. Biophys. Res. Commun.
125, 845–851 (1984)
94. Vescovi E.G., Soncini F.C., Groisman A.: Mg+2 as an environmental signal: Environmental regulation of Salmonella virulence. Cell, 84, 165–174 (1996)
95. Wang J.Y., Syvanen M.: DNA twist as a transcriptional sensor for environmental changes. Mol.
Microbiol. 6, 1981–1988 (1992)
96. Wattiau P., Cornelis G.R.: Identification of DNA sequences recognized by VirF, the transcriptional activator of Yersinia yop regulon. J. Bacteriol. 176, 3878–3884 (1994)
97. Yamamoto T., Hanawa T., Ogata S., Kamiya S.: The Yersinia enterocolitica GsrA stress protein,
involved in intracellular survival, is induced by macrophage phagocytosis. Infect. Immun. 65,
2190–2196 (1997)
98. Young V., Miller V.L., Falkow S., Schoolnik G.K.: Sequence, localization and function of the
invasion protein of Yersinia enterocolitica. Mol. Microbiol. 4, 1119–1128 (1990)
99. Young V.B., Fakow S., Schoolnik G.K.: The invasin protein of Yersinia enterocolitica: Internalization o invasin-bearing bacteria by eucaryotic cells is associated with reorganization of the
cytosceleton. J. Cell Biol. 116, 197–202 (1992)
100. Zhang L., Radziejewska-Lebrecht J., Krajewska-Pietrasik D., Toivanen P., Skurnik M.: Molecular and chemical characterization of the lipopolysaccharide O-antigen and its role in the virulence of Yersinia enterocolitica serotype O:8. Mol. Microbiol. 23, 63–76 (1997)
Katarzyna Brzostek
Instytut Mikrobiologii, Uniwersytet Warszawski
ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa
e-mail: [email protected]
38
POST. MIKROBIOL.,
2004, 43, 1, 39–57
http://www.pm.microbiology.pl
STRUKTURY ZEWNÊTRZNE
BAKTERII GRAM-UJEMNYCH
A BAKTERIOBÓJCZA AKTYWNOŒÆ
DOPE£NIACZA
Gabriela Mielnik, W³odzimierz Doroszkiewicz,
Agnieszka Korzeniowska-Kowal
1. Wstêp. 2. Budowa oraz funkcje œciany komórkowej bakterii Gram-ujemnych. 3. Bia³ka b³ony zewnêtrznej. 4. Budowa lipopolisacharydu. 5. W³aœciwoœci biologiczne lipopolisacharydu. 6. Budowa,
wystêpowanie oraz biologiczne w³aœciwoœci kwasu sjalowego. 7. Mechanizm dzia³ania oraz rola
dope³niacza w bakteriobójczym dzia³aniu surowicy. 8. Mechanizmy obronne chroni¹ce bakterie
Gram-ujemne przed litycznym dzia³aniem dope³niacza. 9. Podsumowanie
The outer membrane compnents of Gram-negative rods and bacterial activity of complement
Abstract: The bactericidal process of serum caused by the complement system is an important
defence mechanism protecting the host organism against infection caused by Gram-negative bacteria.
Sensitivity of bacteria to the bactericidal activity of complement depends on the structure and organisation of bacterial outer membrane. Attention has been paid to lipopolysaccharide (LPS) and outer
membrane protein (OMP), which are an outer membrane component as one of the factors determining
the resistance of bacteria to the bactericidal action of complement. Sialic acid not a common component in bacteria, has been found in O-specific region of LPS, of some serotypes. In bacteria sialic acid
may occur as a component of the capsular polysaccharide of envelope and plays an essential role in
protecting Gram-negative bacteria against bactericidal activity of serum.
1. Introduction. 2. Structure and function outer membrane. 3. Outer membrane protein. 4. Structure
of lipopolysaccharide. 5. Biological characteristic of lipopolysaccharide 6. Structure, localisation
and biological characteristic of sialic acid. 7. Mechanism of complement activation in bactericidal
activity of serum. 8. Mechanism protecting the Gram-negative rods against bactericidal activity of
complement. 9. Summary
1. Wstêp
Bakteriobójcze dzia³anie surowicy jest wa¿nym mechanizmem chroni¹cym organizm wy¿szy przed zaka¿eniami powodowanymi przez bakterie Gram-ujemne.
Istotn¹ rolê w mechanizmie bakteriobójczego dzia³ania surowicy odgrywaj¹ bia³ka
dope³niacza aktywowane na drodze klasycznej, alternatywnej b¹dŸ lektynowej
[16, 98]. Przyczyna opornoœci bakterii Gram-ujemnych na surowice ma charakter
wieloczynnikowy. Istnieje silna korelacja pomiêdzy opornoœci¹ na surowice a budow¹
struktur powierzchniowych bakterii tj. ³añcuchów O-swoistych lipopolisacharydu
(LPS) i bia³ek powierzchniowych [16, 72].
Kwasy sjalowe s¹ powszechnym sk³adnikiem tkanek organizmów wy¿szych,
jednoczeœnie s¹ tak¿e rzadkim, ale istotnym sk³adnikiem powierzchniowych struktur
bakteryjnych. Mikroorganizmy, u których stwierdzono obecnoœæ kwasu sjalowego
39
s¹ ludzkimi patogenami co wskazuje na to, ¿e kwas sjalowy zaanga¿owany jest
w ich wirulencjê. Biologiczna rola kwasu sjalowego jako sk³adnika lipopolisacharydów bakteryjnych, oraz jednoczeœnie udzia³ bia³ek OMP szczepów posiadaj¹cych
lipopolisacharydy z kwasem sjalowym w zjawisku opornoœci bakterii na surowicê
jest stosunkowo s³abo poznana.
2. Budowa oraz funkcje œciany komórkowej bakterii Gram-ujemnych
Zewnêtrzna os³ona bakterii Gram-ujemnych ze wzglêdu na sk³ad chemiczny,
budowê oraz organizacjê jest jedn¹ a najbardziej z³o¿onych struktur komórki prokariotycznej. Os³ony komórkowe bakterii Gram-ujemnych sk³adaj¹ siê z trzech g³ównych warstw: b³ony zewnêtrznej, przestrzeni peryplazmatycznej i b³ony cytoplazmatycznej (CM) [52]. B³ona cytoplazmatyczna zbudowana jest z fosfolipidów i bia³ek.
Rola biologiczna b³ony cytoplazmatycznej zwi¹zana jest wiêc z eksportem metabolitów, aktywnym transportem aminokwasów i cukrów, syntez¹ peptydoglikanu
oraz lipopolisacharydów a tak¿e z fosforylacj¹ oksydatywn¹ [68]. Pomiêdzy b³on¹
cytoplazmatyczn¹, a b³on¹ zewnêtrzn¹ znajduje siê przestrzeñ peryplazmatyczna.
W przestrzeni peryplazmatycznej zlokalizowany jest peptydoglikan.
Peptydoglikan z b³on¹ zewnêtrzn¹ ³¹czy siê poprzez bia³ka oraz lipoproteiny Brauna, których fragment wi¹¿e siê kowalencyjnie z peptydoglikanem, a reszta dwuglicerydowa cz¹steczki jest zakotwiczona w b³onie zewnêtrznej. Miejsca
kontaktu miêdzy b³on¹ cytoplazmatyczn¹, a b³on¹ zewnêtrzn¹ s¹ strefami adhezji
(z³¹cza Bayer’a) [8].
G³ównymi sk³adnikami b³ony zewnêtrznej s¹ bia³ka, fosfolipidy oraz lipopolisacharyd (LPS). B³ona zewnêtrzna posiada typow¹ dwuwarstwow¹ strukturê fosfolipidow¹ z t¹ ró¿nic¹, ¿e fosfolipidy znajduj¹ siê g³ównie w wewnêtrznej warstwie
b³ony a warstwê zewnêtrzn¹ tworzy LPS oraz bia³ka, niektóre wykazuj¹ aktywnoœæ
enzymatyczn¹. B³ona zewnêtrzna pe³ni nie tylko rolê mechaniczn¹ warunkuj¹c¹
kszta³t komórki ale ma równie¿ wa¿ne znaczenie fizjologiczne. Transmembranowe
bia³ka, zwane porynami pozwalaj¹ na wnikanie do wnêtrza komórki niskocz¹steczkowych substancji hydrofilowych. B³ona ochrania tak¿e komórkê przed dzia³aniem
takich substancji jak sole ¿ó³ciowe, niektóre antybiotyki (nowobiocyna, ryfamycyna), barwniki, czy wolne kwasy t³uszczowe [58].
Niektóre bakterie Gram-ujemne syntetyzuj¹ tak¿e otoczki polisacharydowe (CPS
– capsular polysaccharide), czyli zewn¹trzkomórkowe substancje mog¹ce luŸno lub
œciœle przylegaæ do komórki. Budowa chemiczna otoczek bakteryjnych jest bardzo
zró¿nicowana [15, 43, 54]. W œrodowisku naturalnym otoczka chroni komórkê bakteryjn¹ przed wysychaniem, a tak¿e modyfikuje wnikanie ró¿nych cz¹steczek do
wnêtrza komórki.
3. Bia³ka b³ony zewnêtrznej
B³ona zewnêtrzna bakterii Gram-ujemnych w porównaniu z b³on¹ cytoplazmatyczn¹ jest bardziej uboga w enzymy, jednak¿e stwierdza siê w niej wystêpowanie
40
bia³ek wykazuj¹cych aktywnoœæ enzymatyczn¹ [68]. Jednym z takich bia³ek jest
fosfolipaza A u E. coli. Stwierdzono tak¿e aktywnoœæ lizofosfolipazy, fosfatazy kwasu
lizofosfatydowego oraz hydrolazy UDP – glukozy. B³ona zewnêtrzna zawiera tak¿e
bia³ka wykazuj¹ce aktywnoœæ proteolityczn¹ [58].
Wœród bia³ek b³ony zewnêtrznej (OMP – outer membrane protein) wyró¿nia siê
poryny (POR – porin protein) tworz¹ce w b³onie kana³y dyfuzyjne, przez które przechodz¹ substancje hydrofilowe [66]. Do poryn nale¿¹ m.in. bia³ka: OmpC, OmpF,
PhoE. Ze wzglêdu na funkcjê, poryny mo¿na podzieliæ na poryny dyfuzji ogólnej
(niespecyficzne), dzia³aj¹ce jak filtry przepuszczaj¹ce cz¹stki o okreœlonej wielkoœci
oraz poryny specyficzne, uczestnicz¹ce w transporcie okreœlonych substancji przez
b³onê zewnêtrzn¹. Oprócz poryn ogólnej dyfuzji, b³ona zewnêtrzna bakterii jelitowych zawiera ró¿nego typu poryny swoiste. W komórkach E. coli wstêpuj¹
przynajmniej trzy poryny tego typu. S¹ to bia³ka: LamB, Tsx i PhoE [7, 9, 55].
W b³onie zewnêtrznej bakterii Gram-ujemnych wystêpuj¹ równie¿ bia³ka pe³ni¹ce rolê stabilizuj¹c¹ strukturê b³ony zewnêtrznej, a tak¿e pe³ni¹ce funkcje zwi¹zane
z adhezj¹ komórek do ró¿nych powierzchni lub ochron¹ komórki bakterii przed reakcjami immunologicznymi.
Takim bia³kiem jest bia³ko OmpA E. coli wystêpuj¹ce w b³onie zewnêtrznej
w liczbie oko³o 105 kopii. OmpA ³¹czy siê z peptydoglikanem spe³nia funkcjê receptora przy koniugacji bakterii, jest równie¿ receptorem dla fagów. Bia³ko to nie tworzy
kana³ów i nie wykazano jego uczestnictwa w procesach transportu. Nadprodukcja
OmpA powoduje zmniejszenie liczby kopii OmpF, OmpC i LamB, oraz lipoproteiny
Brauna w komórce, zaœ bardzo wysoka nadprodukcja jest dla komórki letalna. Do
kolejnej grupy bia³ek b³ony zewnêtrznej mo¿na zaliczyæ wspomnian¹ ju¿ wczeœniej
lipoproteinê Brauna. Lipoproteina ta wystêpuje w formie wolnej i zwi¹zanej [52].
4. Budowa lipopolisacharydu
Lipopolisacharyd (LPS, endotoksyna) jest integralnym sk³adnikiem œciany komórkowej bakterii Gram-ujemnych. Lipopolisacharydy bakteryjne maj¹ wspólny
plan architektoniczny i sk³adaj¹ siê z trzech ró¿ni¹cych siê budow¹ chemiczn¹
regionów: czêœci O-swoistej (tzw. antygen O), regionu rdzeniowego i lipidu A [79].
Endotoksyna zakotwiczona jest w b³onie zewnêtrznej czêœci¹ lipidow¹ (lipid A),
czêœæ polisacharydowa zwrócona jest na zewn¹trz komórki bakterii pe³ni¹c rolê
antygenu powierzchniowego (antygen O). Kompletny lipopolisacharyd syntetyzowany jest przez bakterie g³adkie tzw. formy S (S, smooth cells). Mutanty R (R, rough
cells) tzw. formy szorstkie wytwarzaj¹ LPS zwieraj¹cy lipid A i oligosacharyd rdzeniowy pozbawiony ³añcucha O-swoistego. Istniej¹ dwie g³ówne grupy mutantów R
(szorstkich): mutanty Ra – posiadaj¹ce defekt w biosyntezie ³añcucha O-swoistego
i produkuj¹ce kompletny rdzeñ po³¹czony z lipidem A, oraz mutanty Rb-Re – wykazuj¹ce defekt w biosyntezie rdzenia i syntetyzuj¹ce niekompletny rdzeñ. Bakterie
mog¹ równie¿ syntetyzowaæ LPS w formie pó³szorstkiej (SR), gdzie ³añcuch
O-swoisty zawiera tylko pojedyncz¹ jednostkê oligosacharydow¹ [77].
41
Czêœæ O-swoist¹ LPS-u buduj¹ powtarzaj¹ce siê jednostki oligosacharydowe,
z których ka¿da sk³ada siê z 1–8 monocukrów. Jednostki te s¹ charakterystyczne pod
wzglêdem swego sk³adu chemicznego i rodzaju wi¹zañ pomiêdzy resztami cukrowymi dla poszczególnych serotypów bakterii [44, 50, 76, 77]. Sk³adnikami ³añcucha
O-swoistego s¹ najczêœciej: pentozy, heksozy, i ich O-metylowe pochodne, a tak¿e
kwasy uronowe i aminocukry. U wielu gatunków bakterii w czêœci O-swoistej zidentyfikowano równie¿ sk³adniki niecukrowe takie jak: aminokwasy, fosforany, rybitol,
glicerol, kwas mlekowy i kwas pirogronowy. Sk³adnikiem czêœci O-swoistej mo¿e
byæ równie¿ kwas sjalowy, czyli pochodna kwasu neuraminowego [24, 80]. Rdzeñ
wielocukrowy zbudowany jest z dwóch czêœci: zewnêtrznej (tzw. heksozowej) i wewnêtrznej sk³adaj¹cej siê z podregionów: heptozowego i Kdo (kwas 2-keto-3-deoksyoktulozonowy) [77, 79]. Funkcja cz¹steczki Kdo zwi¹zana jest z transportem lipopolisacharydu z miejsca jego biosyntezy do b³ony zewnêtrznej. Nie wyizolowano równie¿
zdolnych do wzrostu form bakterii pozbawionych Kdo [79].
Endotoksycznie aktywny lipid A jest najbardziej konserwatywn¹ czêœci¹ lipopolisacharydu. We wszystkich lipopolisacharydach wykazuj¹cych aktywnoœæ endotoksyczn¹ lipid A posiada: hydrofilowy szkielet cukrowy, z którym kowalencyjnie
zwi¹zane s¹ cztery cz¹steczki kwasów t³uszczowych typu (R)-3-hydroksy, wœród
których przynajmniej dwie reszty s¹ acyloksyacylowe [30].
5. W³aœciwoœci biologiczne lipopolisacharydu
Aktywnoœæ biologiczna ka¿dej substancji zale¿y od jej budowy chemicznej i powinowactwa do bia³ek ustroju. Dotyczy to tak¿e toksyn bakteryjnych odgrywaj¹cych znacz¹c¹ rolê w patogenezie wielu chorób.
Lipopolisacharyd uwalnia siê z komórki bakteryjnej podczas jej lizy [29, 64, 85].
Z uwolnionym z komórki bakterii lipopolisacharydem czêsto wi¹¿¹ siê obecne
w surowicy bia³ka. Najwa¿niejszymi z tych bia³ek s¹: HDL (High Density Lipoprotein) oraz LBP (Lipopolysaccharide Binding Protein), które odgrywaj¹ kluczow¹
rolê w odpowiedzi na endotoksynê [100]. Kompleks LPS-LBP wi¹¿e siê z receptorami CD14 na powierzchni monocytów, makrofagów oraz granulocytów obojêtnoch³onnych [100]. Efektem tego po³¹czenia jest wytwarzanie przez monocyty,
makrofagi i granulocyty mediatorów odczynu zapalnego: anafilatoksyn C3a i C5a
powstaj¹cych wskutek aktywacji dope³niacza, które rozszerzaj¹ naczynia krwionoœne zwiêkszaj¹c ich przepuszczalnoœæ, wykazuj¹ równie¿ w³aœciwoœci chemotaktyczne, prostaglandyn, leukotrienów, oraz czynnika aktywuj¹cego p³ytki krwi (PAF),
cytokin: TNF (Tumor Necrosis Factor), IL-1, IL-6, IL-8, IL-10 [48]. Bia³kiem
o dzia³aniu bakteriobójczym jest równie¿ wytwarzane przez ludzkie neutrofile bia³ko
BPI (Bactericidal/Permeability-Increasing Protein). BPI wi¹¿e i neutralizuje LPS
form g³adkich i mutantów R. BPI hamuje tak¿e wydzielanie TNF" przez ludzkie
monocyty stymulowane przez LPS [81]. Na powierzchni komórek wystêpuj¹ tak¿e
glikoproteiny z rodziny integryn tj. CD11a/CD18 i CD11b/CD18 uczestnicz¹ce
w przekazywaniu sygna³u aktywacji komórek pod wp³ywem LPS [48].
42
Inny mechanizm aktywacji komórek przez LPS polega na oddzia³ywaniu endotoksyny na bia³ka cytoszkieletu. Wykazano, ¿e endotoksyny wi¹¿¹ siê z kompleksem $-tubulina-bia³ko MAP-2, aktywuj¹c fosforylacjê bia³ek cytoszkieletu [17].
Zagadnienie roli biologicznej LPS mo¿na rozpatrzyæ w odniesieniu do poszczególnych elementów strukturalnych endotoksyny.
Czêœæ O-swoista nadaje swoistoœæ serologiczn¹ formom g³adkim bakterii Gramujemnych. Rolê sk³adników determinuj¹cych swoistoœæ serologiczn¹ antygenów O
spe³niaj¹ terminalne reszty cukrowe, lub reszty cukrowe wstêpuj¹ce jako odga³êzienia boczne [80]. Czêœæ O-swoista LPS wykazuje zdolnoœæ aktywacji dope³niacza
na drodze alternatywnej, a efektywnoϾ tej aktywacji jest najprawdopodobniej
uwarunkowana struktur¹ powtarzaj¹cych siê jednostek antygenu O-swoistego. Czêœæ
O-swoista mo¿e pe³niæ rolê adhezyny, a tak¿e glikokaliksu [80]. Zarówno region
O-swoisty, jak równie¿ czêœæ zewnêtrzna rdzenia lipopolisacharydu jest receptorem
dla fagów [75, 80].
Czêœæ zewnêtrzna rdzenia lipopolisacharydu wi¹¿e tak¿e receptory powierzchniowe na limfocytach T, aktywuje dope³niacz, a tak¿e nadaje swoistoœæ serologiczn¹ LPS mutantom R i LOS (lipid A podstawiony oligosacharydem rdzeniowym)
[81]. Funkcj¹ biologiczn¹ czêœci zewnêtrznej regionu rdzeniowego jest równie¿
reagowanie z bia³kami surowicy nie bêd¹cymi immunoglobulinami.
Lipid A aktywuje makrofagi, monocyty i komórki œródb³onka do wytwarzania
i uwalniania mediatorów: prostaglandyn, leukotrienów, TNF oraz interleukin. Wysokie stê¿enie tych substancji w organizmie cz³owieka i zwierz¹t prowadzi do podniesienia temperatury cia³a, obni¿enia ciœnienia krwi, aktywacji dope³niacza [78, 80].
6. Budowa, wystêpowanie oraz biologiczne w³aœciwoœci kwasu sjalowego
Nazwa „kwas sjalowy” obejmuje wszystkie pochodne kwasu neuraminowego,
czyli kwasu 5-amino-3,5 dideoksy-D-glicero-D-galakto-nonulozonowego. Kwas
neuraminowy na reszcie aminowej mo¿e byæ podstawiony grup¹ acetylow¹ lub
glikolylow¹, zaœ reszty hydroksylowe podstawione mog¹ byæ przez grupy acetylowe, L-mleczanowe, metylowe lub siarczanowe [82]. Kwas sjalowy wystêpuje
powszechnie w organizmach zwierz¹t wy¿szych, rzadziej u bakterii. Owady produkuj¹ g³ównie asjaloproteidy, ale u Drosophila melanogaster obecnoœæ kwasu
sjalowego stwierdza siê we wszystkich etapach rozwojowych [53]. Nie stwierdzono
wystêpowania kwasu sjalowego u roœlin [21]. W organizmach zwierz¹t wy¿szych
i cz³owieka kwas sjalowy wystêpuje najczêœciej na zewnêtrznych powierzchniach
komórek i tkanek.
Wyeksponowana pozycja kwasu sjalowego, ich ³adunek ujemny oraz wystêpowanie w postaci ró¿nych strukturalnych pochodnych kreuj¹ specyficzn¹ rolê tego
zwi¹zku w organizmach. Kwas sjalowy reguluje przepuszczalnoœæ b³on biologicznych, bierze udzia³ w oddzia³ywaniach miêdzykomórkowych i przekazywaniu
neurochemicznie produkowanych sygna³ów, chroni tak¿e bia³ka przed zbyt szybk¹
degradacj¹ proteolityczn¹ poprzez interakcjê ujemnie na³adowanych cz¹steczek
43
z dodatnio na³adowanymi resztami aminokwasów. Dodatkowo kwas sjalowy mo¿e
byæ sk³adnikiem epitopów lecz g³ównie maskuje miejsca antygenowe [82].
Kwasy sjalowe s¹ tak¿e sk³adnikami substancji grupowej krwi MN obecnej na
glikoforynie A. Glikoforyna A nale¿y do grupy transb³onowych glikoprotein, wystêpuj¹cych w b³onie erytrocytów cz³owieka. Obecnoœæ kwasu sjalowego nadaje
powierzchni erytrocytów ³adunek ujemny. £añcuchy oligosacharydowe zwi¹zane
z glikoforyn¹ A wytwarzaj¹ na powierzchni erytrocytów hydrofilny, anionowy
p³aszcz, który umo¿liwia im wêdrówkê w uk³adzie krwionoœnym bez przywierania
do innych komórek i œcian naczyñ [21, 87]. Ponadto kwasy sjalowe s¹ sk³adnikiem
sjaloforyny, bia³ka bogatego w reszty kwasu sjalowego wystêpuj¹cego na limfocytach T, monocytach, neutrofilach, p³ytkach krwi i niektórych limfocytach B [87].
Wiele œwie¿o syntezowanych glikoprotein np. immunoglobuliny czy hormony peptydowe zawieraj¹ jednostki wêglowodanowe z koñcowymi resztami kwasu sjalowego, który wyznacza czas usuwania tych bia³ek z krwiobiegu. Mechanizm ich dzia³ania polega na tym, ¿e w odpowiednim czasie zwi¹zki te s¹ usuwane przez sjalilazy
wystêpuj¹ce na powierzchni naczyñ krwionoœnych, a wystaj¹ce reszty galaktozy
skróconych w ten sposób glikoprotein s¹ rozpoznawane przez receptory asjaloglikoproteinowe wystêpuj¹ce w b³onie komórek w¹troby. Kompleks asjaloglikoproteiny
i jej receptora jest wprowadzany do wnêtrza komórek w¹troby w procesie endocytozy.
Jednostki oligosacharydowe wyznaczaj¹, wiêc up³yw czasu, kiedy oznakowane nimi
bia³ka powinny zostaæ usuniête z obiegu. Szybkoœæ usuwania kwasu sjalowego jest
kontrolowana przez sam¹ strukturê bia³ka. W ten sposób zale¿nie od potrzeb fizjologicznych bia³ka mog¹ byæ przeznaczone do prze¿ywania okreœlonego okresu
czasu w organizmie [87]. Kwasy sjalowe odgrywaj¹ tak¿e istotn¹ rolê w tworzeniu
immunobariery pomiêdzy matk¹ a p³odem, gdy¿ na powierzchni syncytiotrofoblastu
obecne s¹ wysoko sjalilowane glikokoniugaty, co chroni przed tworzeniem przez
organizm matki przeciwcia³ przeciwko komórkom p³odu [84].
Zwi¹zane z uk³adem grupowym krwi Lewis antygeny Lea i Lex z przy³¹czon¹
reszt¹ kwasu sjalowego nosz¹ nazwy: sjalo-Lea i sjalo-Lex i stanowi¹ one przyk³ady
struktur cukrowych, których wystêpowanie zwi¹zane jest z transformacj¹ nowotworow¹ [95]. Kwas sjalowy nie jest powszechnym sk³adnikiem struktur powierzchniowych bakterii. Obecnoœæ kwasu sjalowego w polisacharydzie otoczkowym bakterii
wykaza³ w 1958 roku B a r r y [6]. W 1977 J a n n i wsp. wyró¿nili trzy serotypy
E. coli zawieraj¹ce kwas sjalowy w LPS, by³y to: O24, O56, O104 [38]. W roku
1978 wykazano, ¿e kwas sjalowy jest integraln¹ czêœci¹ ³añcucha O-swoistego lipopolisacharydu Salmonella Toucra O48 [46].
Niezbitym potwierdzeniem wystêpowania kwasu sjalowego w LPS by³o ustalenie struktury monomeru O-swoistego i jego po³¹czenia z regionem rdzeniowym dla
szczepu Hafnia alvei. Wystêpowanie kwasu sjalowego w lipopolisacharydach potwierdzono ostatecznie w 1991 roku [25]. Poza lipopolisacharydami bakterii Gramujemnych, kwas sjalowy znaleziono równie¿ w polisacharydach otoczkowych
zarówno bakterii Gram-ujemnych jak i Gram-dodatnich. Wystêpowanie kwasu polisjalowego stwierdzono u E. coli K1 oraz Neisseria meningitidis grupy B, u których
wystêpuje otoczkowy homopolimer kwasu sjalowego [10, 61]. Obecnoœæ kwasu sja44
lowego wykazano tak¿e w otoczkach E. coli K92 [19], N. meningitidis grupy C [10],
Pasteurella haemolytica A2 [1] oraz Streptococcus grupy B [86].
Z obecnoœci¹ kwasu sjalowego w strukturach powierzchniowych wi¹¿e siê zjawisko mimikry cz¹steczkowej bakteryjnych antygenów polisacharydowych. Zjawisko
mimikry cz¹steczkowej polega na wystêpowaniu homologii strukturalnej, serologicznej lub biologicznej pomiêdzy mikroorganizmem a gospodarzem. Produkowanie przez
patogenny drobnoustrój antygenów bardzo podobnych do wystêpuj¹cych u gospodarza jest bardzo korzystne dla mikroorganizmu, gdy¿ chroni go przed rozpoznaniem
przez uk³ad immunologiczny gospodarza i dziêki temu umo¿liwia mu prze¿ycie [21].
Pojawiaj¹ca siê tolerancja immunologiczna na obecnoœæ obcych antygenów, lecz to¿samych z w³asnymi strukturami sprawia, ¿e bakteria nierozpoznawalna jako „obca”
przez system obronny mo¿e migrowaæ i namna¿aæ siê w organizmie, co prowadziæ
mo¿e do zaka¿eñ, wstrz¹su septycznego, a tak¿e chorób immunologicznych [78].
Zjawisko mimikry cz¹steczkowej opisano u E. coli K1 i N. meningitidis grupy B,
u których otoczkowy homopolimer kwasu sjalowego po³¹czony wi¹zaniem "(2→8)
jest identyczny z antygenem eksponowanym przez tkanki gospodarza [13, 41].
W przypadku szczepu Hemophilus ducreyi, mimikra cz¹steczkowa zwi¹zana jest
z podobieñstwem lipopolisacharydu H. ducreyi do paraglobozydów i glikosfingolipidów tkanek ludzkich, a tak¿e z obecnoœci¹ reszty kwasu sjalowego w LPS, co
przyczynia siê do wzrostu opornoœci tego gatunku na bakteriobójcze dzia³anie surowicy [85]. Dwusacharyd Neu5Ac"(2→3)$Gal obecny u bakterii Streptococcus
grupy B bêd¹cej przyczyn¹ zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków jest identyczny z dwusacharydem wystêpuj¹cym w substancjach grupowych
krwi M i N na glikoforynie A [86]. Campylobacter jejunii wywo³uje przewlek³e
schorzenia jelitowe. U wielu badanych serotypów C. jejunii stwierdzono wystêpowanie terminalnego kwasu sjalowego na krótkim ³añcuchu oligosacharydowym
rdzenia. Badania wskazuj¹, ¿e po³¹czenie kwasu sjalowego z rdzeniem jest podobne
do po³¹czenia wystêpuj¹cego w glikolipidach i glikoproteinach na powierzchni
komórek ssaków, co wskazywa³oby na istotny udzia³ LOS (lipooligosachryd)
w determinowaniu wirulencji tej bakterii [4]. Sjalylacja LOS C. jejunii determinuje
opornoœæ tego szczepu na bakteriobójcze dzia³anie surowicy [27]. Mimikrê cz¹steczkow¹ opart¹ na homologii serologicznej zaobserwowano miêdzy komórkami
C. braakii O37 a erytrocytami koñskimi i ludzkimi, co mo¿e wskazywaæ na zwi¹zek
z chorobotwórczoœci¹ tej bakterii [24].
7. Mechanizm dzia³ania oraz rola dope³niacza
w bakteriobójczym dzia³aniu surowicy
Jednym z elementów obrony organizmu wy¿szego przed infekcjami bakteryjnymi
jest bakteriobójcza aktywnoœæ surowicy. W mechanizmie bakteriobójczego dzia³ania
surowicy kluczow¹ rolê odgrywa dope³niacz, wywieraj¹cy dzia³anie lityczne wobec
bakterii Gram-ujemnych [33]. Uk³ad dope³niacza jest czêœci¹ wrodzonego systemu
odpornoœci i sk³ada siê z oko³o 25 bia³ek, aktywowanych kaskadowo, tzn. ka¿dy
45
enzym jest katalizatorem dla nastêpnego. Aktywacja bia³ek dope³niacza prowadzi
do enzymatycznego rozbijania ich cz¹steczek na podjednostki [4]. Najwa¿niejszym
sk³adnikiem uk³adu dope³niacza jest bia³ko C3. Aktywacja dope³niacza mo¿e odbywaæ siê drog¹ klasyczn¹, alternatywn¹ i lektynow¹. Wszystkie te drogi prowadz¹ do
utworzenia konwertazy, która trawi C3 do C3a i C3b. Jest to zasadniczy etap procesu
aktywacji. Droga klasyczna wi¹¿e siê z odpornoœci¹ nabyt¹, droga alternatywna odzwierciedla zaœ wrodzon¹ odpowiedŸ odpornoœciow¹ [78].
Proces aktywacji dope³niacza obejmuje: opsonizacjê, aktywacjê leukocytów, lizê
komórek docelowych.
W aktywacji dope³niacza drog¹ klasyczn¹ uczestnicz¹ przeciwcia³a, które wi¹¿¹
siê z antygenem. Powstaje kompleks z³o¿ony z antygenu i jednej cz¹steczki przeciwcia³a klasy IgM lub antygenu i dwóch cz¹steczek IgG (IgG1, IgG2 lub IgG3).
Struktura przestrzenna cz¹steczki przeciwcia³a po zwi¹zaniu siê z antygenem ulega
odkszta³ceniu, ods³aniaj¹c miejsca wi¹¿¹ce sk³adowe dope³niacza. Sk³adnik C1q
(lektyna zale¿na od Ca++) wi¹¿e siê z przeciwcia³em, co stanowi sygna³ do aktywacji podjednostek C1s i C1r. Aktywna podjednostka C1s (proteaza C1) dzia³a na sk³adowe C2 i C4, w wyniku czego uwolnione zostaj¹ komponenty C4a, C4b oraz C2a
i C2b. Podjednostki C4b i C2a tworz¹ enzym: konwertazê C3 (C4b2a). Konwertaza C3 jest kowalencyjnie po³¹czona z b³on¹ komórkow¹, dzia³anie tej konwertazy
na sk³adow¹ C3 prowadzi do uwolnienia podjednostek C3a i C3b. Fragment C3b
wchodzi w sk³ad kompleksu C4b2a3b o w³aœciwoœciach konwertazy C5. Aktywacja
dope³niacza drog¹ klasyczn¹ mo¿e zachodziæ równie¿ przy braku przeciwcia³,
w wyniku ³¹czenia siê C1 np. z lipidem A, wirusami RNA, limfocytami. Wa¿n¹ rolê
odgrywa tutaj bia³ko C1INA blokuj¹ce aktywacjê C1 na powierzchni komórek bakterii, które wytwarzaj¹ kompletny LPS. Nie obserwuje siê tego zjawiska u bakterii
wytwarzaj¹cych niekompletny LPS [33, 51, 78, 98].
Aktywacja drog¹ lektynow¹ aktywowana jest w sposób niezale¿ny od przeciwcia³, co wskazuje na to, ¿e jest pierwsz¹ lini¹ obrony gospodarza podczas infekcji
powodowanej przez mikroorganizmy. W reakcji bakteriobójczej, w której uruchomiona zostaje droga lektynowa wa¿n¹ rolê odgrywaj¹ LPS, LOS oraz otoczki.
Kluczow¹ rolê w aktywacji dope³niacza drog¹ lektynow¹ odgrywa bia³ko MBL
(Mannan Binding Lectin, zwane tak¿e MBP – mannose binding protein). Bia³ko
MBL syntezowane przez hepatocyty jest strukturalnie i funkcjonalnie podobne do
bia³ka C1q i nale¿y podobnie jak C1q do rodziny lektyn zale¿nych od wapnia [40].
MBL rozpoznaje i wi¹¿e siê z wêglowodanami obecnymi w strukturach powierzchniowych wielu drobnoustrojów tj.: D-mannoz¹, D-glukoz¹, galaktoz¹, N-acetyloglukozamin¹, maltoz¹, N-acetylogalaktozamin¹, N-acetylomannozamin¹, L-fukoz¹.
Wi¹zanie to rozpoczyna proces aktywacji bia³ek dope³niacza na drodze lektynowej.
MBL aktywuje dope³niacz poprzez enzymy MASP-1 i MASP-2 (proteazy serynowe). MBL surowicy wi¹¿e siê z grupami koñcowymi mannozy struktur powierzchniowych drobnoustrojów, uzyskuje tym sposobem zdolnoœæ do interakcji z proteaz¹
serynow¹ MASP-1 i MASP-2. Proteaza MASP-2 wykazuje homologiê do MASP-1.
Obie proteazy dzia³aj¹ podobnie jak proteazy C1r i C1s drogi klasycznej, trawi¹c
komponenty C2 i C4, z których podobnie jak w drodze klasycznej utworzona zostaje
46
konwertaza C3: C4b2a. Aktywnoœæ MASP1 i MASP2 jest regulowana przez alfa2makroglobulinê ("2M) oraz inhibitor C1 (C1INA). Inhibicyjne dzia³anie "2M oraz
C1INA polega na uniemo¿liwianiu tworzenia siê kompleksu MBL-MASP1 wskutek
kowalencyjnego wi¹zania siê inhibitora z MASP1 [57, 59, 92, 94].
Aktywacja dope³niacza drog¹ alternatywn¹ prawdopodobnie odgrywa znacz¹c¹
rolê we wczesnych stadiach zaka¿enia bakteryjnego, w ¿yciu p³odowym i u noworodków, kiedy poziom wytwarzanych swoistych przeciwcia³ jest niewielki. Nie
bior¹ udzia³u w tym procesie sk³adowe C1, C2, C4, a aktywacja dope³niacza t¹
drog¹ nie wymaga na ogó³ obecnoœci przeciwcia³. Przyjmuje siê, ¿e aktywacja
rozpoczyna siê od sk³adnika C3b, który powstaje w wyniku aktywacji dope³niacza
drog¹ klasyczn¹ lub w wyniku spontanicznej hydrolizy C3 na podjednostki C3b
i C3a. W obecnoœci jonów Mg++, C3b ³¹czy siê z czynnikiem B tworz¹c kompleks
C3bB, wra¿liwy na enzymatyczne dzia³anie czynnika D. Proteolityczne dzia³anie czynnika D na kompleks C3bB prowadzi do powstania podjednostek Ba i Bb.
Bia³ko Bb ³¹czy siê z C3b tworz¹c konwertazê C3. Kompleks ten jest stabilizowany przez properdynê (P). Na tym etapie obserwowana jest amplifikacja: im
wiêksze jest wytwarzanie C3b, tym wiêcej powstanie konwertazy z po³¹czenia czynnika B i D, a w efekcie zwiêkszeniu ulega rozk³ad C3. Konwertaza C3 analogicznie
jak w przypadku konwertazy drogi klasycznej i lektynowej rozszczepia C3 na C3a
i C3b [11, 33, 98].
Centraln¹ rolê w aktywacji dope³niacza i reakcjach odpornoœciowych odgrywa
bia³ko C3. Bia³ko to nale¿y do bia³ek posiadaj¹cych niezwyk³¹ potranslacyjn¹ mo¿liwoœæ modyfikacji struktury, co umo¿liwia mu wi¹zanie kowalencyjne z innymi
cz¹steczkami. Na poziomie sk³adowej C3 ³¹cz¹ siê ze sob¹ wszystkie drogi aktywacji
dope³niacza: klasyczna, lektynowa i alternatywna. W wyniku dzia³ania konwertaz C3
(bêd¹cymi funkcjonalnie identycznymi kompleksami, wi¹¿¹cymi siê kowalencyjnie
z powierzchni¹ komórki bakterii) dochodzi do proteolitycznego rozszczepienia bia³ka C3 na dwie podjednostki: C3a i C3b. Mniejsza podjednostka – C3a wykazuje
charakter anafilatoksyny, wiêksza – C3b wi¹¿e siê na b³onie docelowej komórki
bakteryjnej. Czêœæ moleku³ C3b bierze udzia³ w aktywacji drogi alternatywnej
i tworzeniu nowych cz¹steczek konwertazy C3bBbP. Komponenta C3b jest tak¿e
zaanga¿owana w procesie opsonizacji antygenu. Moleku³y C3b wchodz¹ w sk³ad
konwertaz C5, drogi klasycznej C4b2a3b oraz drogi alternatywnej C3bnBbP, które
s¹ odpowiedzialne za proteolizê bia³ka C5 na podjednostki C5a i C5b.
Konwerazy C5 rozszczepiaj¹ bia³ko C5 na podjednostki C5a i C5b. Podjednostka
C5a ma równie¿ charakter anafilatoksyny, fragment C5b umo¿liwia przy³¹czenie pozosta³ych bia³ek dope³niacza do miejsca docelowego na b³onie komórki bakteryjnej.
Powstawanie kompleksów C5b-7, C5b-8 i C5b-9 nie zachodzi na drodze enzymatycznej. Podjednostka C5b spontanicznie ³¹czy siê z C6 i C7, powstaje kompleks C5b-7.
Zwi¹zanie C7 oznacza przejœcie kompleksu z hydrofilowego w hydrofobowy, co nadaje mu zdolnoœæ wnikania do dwuwarstwy lipidowej, kompleks wiêc wbudowuje siê
trwale w b³onê docelow¹ bakterii wystaj¹c ponad jej powierzchniê. Kompleksy C5b-7
stanowi¹ miejsce akceptorowe dla bia³ka C8. Przy³¹czenie jednej cz¹steczki C8 do
ka¿dego agregatu C5b-7 powoduje powstanie ma³ego transmembranowego kana³u
47
o œrednicy 1 nm. Przy³¹czenie jednej cz¹steczki bia³ka C9 do kompleksu C5b-8
inicjuje polimeryzacjê i rozfa³dowanie innych podjednostek C9. Do kompleksu mo¿e
byæ w³¹czonych nawet 16-18 cz¹stek C9 powoduj¹c utworzenie na miejscu docelowym b³ony kompleksu atakuj¹cego b³onê – MAC maj¹cego kszta³t cylindra z³o¿onego z bia³ek C6, C7, C8 oraz C9 [89]. Destrukcyjne dzia³anie MAC zwi¹zane jest
z jego struktur¹ przestrzenn¹, nie zaœ z w³aœciwoœciami enzymatycznymi. Uwa¿a
siê, ¿e miejscem docelowym dla MAC w b³onie zewnêtrznej bakterii Gram-ujemnych jest lipid A. Dzia³anie MAC poprzez tworzenie kana³ów w b³onie docelowej
prowadzi do zaburzeñ metabolizmu w komórce bakteryjnej. Synteza DNA, RNA
i bia³ek ulega spowolnieniu lub zahamowaniu. Obserwuje siê tak¿e zaburzenia
w gospodarce jonami K+, Na+, Ca++. Nieodwracalne zmiany w metabolizmie bakterii prowadz¹ do ich œmierci [33].
Uk³ad dope³niacza stale aktywowany in vivo móg³by potencjalnie uszkadzaæ w³asne komórki, zapobiegaj¹ temu jednak¿e bia³ka b³onowe (komórkowe), do których
zaliczamy: czynnik DAF (decay accelerating factor; CD55) – inhibitor konwertaz C3, czynnik MCP (membrane cofactor protein; CD46) – inaktywacja C3b, czynnik CR1 (complement receptor type 1; CD35) – inhibitor C3b i C4b, czynnik HRF
(homologous restriction factor) – inhibitor C8 i C9, bia³ko CD59 – inhibitor MAC.
Aktywacja dope³niacza regulowana jest tak¿e przez bia³ka wystêpuj¹ce w surowicy:
C1INA – inaktywator C1, C4bp – bia³ko wi¹¿¹ce C4b, C3INA – inhibitor C3b/C4b,
czynnik H – bia³ko wi¹¿¹ce C3b, bia³ko S – inhibitor MAC [34, 47, 49, 69, 99].
Uk³ad dope³niacza stanowi wa¿ny element obrony organizmu przed infekcjami.
Poza aktywnoœci¹ lityczn¹ dope³niacz wraz z przeciwcia³ami IgM i IgG bierze tak¿e
udzia³ w opsonizacji, w wyniku której kompleksy antygen–przeciwcia³o zwi¹zane
z fragmentem C3b s¹ ³atwiej fagocytowane przez neutrofile i makrofagi. Sk³adowe:
C3a, C4a i C5a bêd¹c anafilatoksynami, powoduj¹ zwiêkszenie przepuszczalnoœci
naczyñ krwionoœnych w nastêpstwie degranulacji komórek tucznych i uwolnienia
histaminy [35, 39, 99]. Bakteriobójcze w³aœciwoœci surowicy s¹ uwarunkowane niezale¿n¹ aktywacj¹ dope³niacza na drodze klasycznej i alternatywnej. Dominuj¹c¹
rolê spe³nia uk³ad dope³niacza aktywowany drog¹ klasyczn¹. Taki mechanizm bakteriobójczoœci surowicy zaobserwowano w stosunku do niektórych szczepów E. coli
i Salmonella [2,44] Wyeliminowanie klasycznej drogi aktywacji powoduje, ¿e surowice wykazuj¹ ma³¹ aktywnoœæ bakteriobójcz¹. Istniej¹ jednak dane, z których wynika, ¿e obie drogi maj¹ jednakowe znaczenie w procesie bakteriobójczoœci surowicy
[83]. W przypadku szczepów H. influenzae czy Vibrio cholerae w reakcji bakteriobójczoœci surowicy udzia³ bierze dope³niacz aktywowany tylko drog¹ klasyczn¹ [5]. Obserwacje M o k r a c k i e j - L a t a j k a i wsp. [63] wskazuj¹, ¿e pewne
szczepy Shigella wymagaj¹ równoczesnej aktywacji obu dróg dope³niacza w procesie bakteriobójczoœci surowicy. Znaczenie bakteriobójczego dzia³ania dope³niacza
aktywowanego na drodze lektynowej wykazuj¹ szczepy zawieraj¹ce LPS bogaty
w mannozê, do której mog¹ przy³¹czaæ siê cz¹steczki MBL [40, 97, 99]. Szczepy
otoczkowe bêd¹ce czynnikiem etiologicznym zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych np. N. meningitidis czy N. mucosa maj¹ zmniejszon¹ zdolnoœæ wi¹zania siê
z MBL w porównaniu ze szczepami bezotoczkowymi [97].
48
Skutecznoœæ opisywanych dróg aktywacji dope³niacza przejawiaj¹ca siê w efekcie cytolitycznym jest zale¿na od budowy b³ony zewnêtrznej bakterii, obecnoœci
w surowicy przeciwcia³ i lizozymu [33].
8. Mechanizmy obronne chroni¹ce bakterie Gram-ujemne
przed litycznym dzia³aniem dope³niacza
Bakterie Gram-ujemne oporne na dzia³anie dope³niacza izolowane s¹ najczêœciej
z krwi, zaka¿eñ uk³adu moczowego oraz p³ynu mózgowo-rdzeniowego. Opornoœæ
bakterii Gram-ujemnych na bakteriobójcze dzia³anie surowicy uwarunkowana jest
przede wszystkim ochronn¹ rol¹ komórkowych struktur powierzchniowych tj.
lipopolisacharydów, bia³ek powierzchniowych oraz otoczek. Niew¹tpliwe znaczenie w tym procesie odgrywa proteolityczna degradacja immunoglobulin oraz bia³ek
dope³niacza [5, 34, 37].
Szczepy Serratia marcescens oraz Pseudomonas aeruginosa wykazuj¹ aktywnoœæ proteolityczn¹ wytwarzaj¹c enzymy zdolne trawiæ bia³ka uk³adu dope³niacza
[84]. Dzia³anie elastazy degraduj¹cej bia³ka dope³niacza wytwarzanej przez P. aeruginosa mo¿e byæ jedn¹ z przyczyn opornoœci pa³eczek ropy b³êkitnej na lityczne
dzia³anie dope³niacza.
Degradacji enzymatycznej podlegaæ mog¹ równie¿ immunoglobuliny klasy IgM
oraz IgG. Zdolnoœæ enzymatycznego rorszczapiania immunoglobulin posiadaj¹
szczepy Bacteroides gingivalis oraz B. intermedius [88].
Otoczki pe³ni¹ wa¿n¹ funkcjê u bakterii chorobotwórczych. Rola otoczek w procesie chorobotwórczym polega g³ównie na ochronie komórek bakteryjnych przed mechanizmami obronnymi zaka¿onego organizmu [23, 32]. Wœród szczepów N. meningitidis nale¿¹cych do typów A, B i C wystêpuje wiele szczepów opornych na
bakteriobójczy efekt dzia³ania dope³niacza [43]. Sk³adnikiem otoczki B jest kwas
sjalowy hamuj¹cy aktywacjê dope³niacza na drodze alternatywnej poprzez umo¿liwienie wi¹zania czynnika H do bia³ka C3b. Zdeponowanie kompleksu HC3b
na powierzchni bakterii w miejsce konwertazy C3bBbP i inaktywacja C3b przez
C3INA powoduje zablokowanie amplifikacji drogi alternatywnej [39, 45, 56].
P l u s c h k e i wsp. [71] wykazali, ¿e obecnoœæ otoczki K1 jest jednym z mechanizmów, dziêki którym pa³eczki E. coli unikaj¹ bakteriobójczego dzia³ania surowicy.
Polisacharyd otoczkowy K1 jest liniowym homopolimerem kwasu 2,8 N-acetyloneuraminowego. Jest on strukturalnie i antygenowo identyczny z polisacharydem
otoczkowym N. meningitidis B, którego podstawow¹, powtarzaj¹c¹ siê jednostk¹
strukturaln¹ jest cz¹steczka kwasu sjalowego. Jednak obecnoœæ otoczki K1 na powierzchni komórki nie zawsze jest wystarczaj¹ca, aby dany szczep wykazywa³ opornoœæ na surowicê, poniewa¿ wœród pa³eczek K1+ izolowano zarówno szczepy oporne,
jak i szczepy wra¿liwe na surowice [60, 96, 97].
Dzia³anie ochronne wobec komplementu mo¿e wywieraæ równie¿ antygen powierzchniowy K5 niektórych szczepów E. coli [15]. Nie wszystkie antygeny K maj¹
jednak dzia³anie ochronne. Nie zaobserwowano efektu ochronnego w przypadku
49
antygenu K27 E. coli, gdy¿ szczepy posiadaj¹ce ten antygen by³y wra¿liwe na
lityczne dzia³anie bia³ek dope³niacza [89].
L o o n e y i wsp. [54] wykazali, ¿e szczepy S. typhi posiadaj¹ce antygen powierzchniowy Vi (polimer kwasu 1,4,2-deoksy-2-N-acetylo-galakturonowego) s¹
bardziej oporne na dzia³anie dope³niacza ni¿ szczepy pozbawione tego antygenu.
Obecnie uwa¿a siê, ¿e najwa¿niejsz¹ rolê w ochronie bakterii Gram-ujemnych
przed dzia³aniem dope³niacza pe³ni¹ O-swoiste ³añcuchy boczne lipopolisacharydu
[93]. Badania prowadzone w wielu laboratoriach [7, 18, 26, 62] wskazuj¹, ¿e szczepy
chemotypu S wykazuj¹ czêsto niewielk¹ wra¿liwoœæ na surowicê. Mutanty z defektami w strukturze LPS (Ra-Rd) charakteryzuj¹ siê zwiêkszon¹ podatnoœci¹ na bakteriobójcze dzia³anie surowic [89]. Badania J a n k o w s k i e g o i D o r o s z k i e w i c z a
[36] dotycz¹ce wp³ywu ozonu na aktywnoœæ normalnej surowicy ludzkiej w stosunku do S. typhimurium chemotypu S i Ra potwierdzaj¹ ochronn¹ rolê kompletnych
³añcuchów LPS wobec litycznego dzia³ania komplementu. Opornoœæ wielu szczepów chemotypu S na bakteriobójcze dzia³anie surowic t³umaczy siê ³atwym usuwaniem z powierzchni ich komórek kompleksu MAC, zanim wejdzie on w trwa³e
hydrofobowe po³¹czenia z lipidem A, zapocz¹tkowuj¹c tym samym proces lizy.
W przypadku szczepów g³adkich C3b wi¹¿¹c siê na d³ugich ³añcuchach LPS determinuje lokalizacjê MAC na tych w³aœnie ³añcuchach w znacznym oddaleniu od
b³ony zewnêtrznej bakterii. W przypadku szczepów chemotypu Rb-Re MAC wchodzi w po³¹czenia z lipidem A, sprawiaj¹c, ¿e mutanty te szybko zabijane s¹ przez
ró¿ne rodzaje surowic [42, 90]. Jednak wiele g³adkich szczepów bakterii Gramujemnych pomimo posiadania kompletnych ³añcuchów O-swoistych jest wra¿liwych
na bakteriobójcze dzia³anie dope³niacza [89, 93]. N e l s o n i R o a n t r e e [67]
udowodnili, ¿e szczepy podatne na dzia³anie surowic nie wykazuj¹ w strukturach
O-swoistych LPS obecnoœci ramnozy, mannozy i abekwozy. Wyniki badañ w³asnych
[62] wykaza³y, ¿e szczepy pa³eczek Gram-ujemnych posiadaj¹ce lipopolisacharydy
zawieraj¹ce kwas sjalowy wykazuj¹ zró¿nicowan¹ podatnoœæ na bakteriobójcze
dzia³anie normalnej surowicy ludzkiej, bydlêcej i noworodkowej. Wyniki te wskazuj¹, ¿e obecnoœæ kwasu sjalowego w podjednostkach O-swoistych LPS-u nie jest
wystarczaj¹cym czynnikiem determinuj¹cym opornoœæ pa³eczek Gram-ujemnych na
surowicê. Interesuj¹cy mechanizm opornoœci na surowicê wytworzy³a N. gonorrhoeae,
u której podczas infekcji mo¿e dochodziæ do zmiany antygenowoœci struktur
powierzchniowych na skutek usjalowania laktoneotetraozydowej czêœci LPS
z udzia³em CMP-NeuAc (cytydynomonofosforan kwasu N-acetyloneuraminowego)
gospodarza. N. gonorrhoeae nie s¹ zdolne do wytwarzania CMP-NeuAc. Sjalylacja
powoduje zwiêkszenie wirulencji tych bakterii [3, 22]. Rola sjalylacji LPS w warunkowaniu opornoœci na surowicê N.meningitidis grup B i C jest przedmiotem dyskusji. Badania J a c k i wsp. [31] wykaza³y, ¿e obecnoœæ kwasu sjalowego w LOS
N. meningitidis B ogranicza przy³¹czenie MBL do b³ony zewnêtrznej komórki,
co sprawia, ¿e szczepy staj¹ siê niewra¿liwe na bakteriobójcze dzia³anie surowicy.
Dodatkow¹ barier¹ chroni¹c¹ bakterie Gram-ujemne przed dzia³aniem dope³niacza
s¹ bia³ka powierzchniowe, których synteza uwarunkowana jest genami zlokalizowanymi w genomie lub na plazmidach. Znaczenie bia³ek powierzchniowych
50
w ochronie bakterii przed litycznym dzia³aniem dope³niacza wykazano w przypadku wielu drobnoustrojów [14, 29, 68]. Szczepy N. gonorrhoae izolowane z zaka¿eñ
rozsianych oporne na dzia³anie normalnej surowicy ludzkiej zawiera³y bia³ko o masie cz¹steczkowej 36 500 daltonów zlokalizowane w b³onie zewnêtrznej. R a m
i wsp. [72, 73] dowodz¹, ¿e opornoœæ N. gonorrhoae na bakteriobójcze dzia³anie
surowicy zwi¹zana jest z obecnoœci¹ w ich b³onie zewnêtrznej poryn (Por 1A
i Por 1B). Bia³ko Por 1A wi¹¿e czynnik H surowicy, który efektywnie inaktywuje
bia³ko C3b do bia³ka nieaktywnego C3bi.
T a y l o r i P a r t o n [91] wykazali, ¿e mutanty E. coli oporne na dzia³anie surowic wytwarza³y wiêcej bia³ka o masie cz¹steczkowej 46 000 daltonów. Równie¿
bia³ko OmpA przyczynia siê do zwiêkszania opornoœci na surowicê szczepów E. coli,
lecz mechanizm tego zjawiska nie jest do koñca poznany. Ochronne dzia³anie bia³ek
powierzchniowych wykazano tak¿e w przypadku szczepów Campylobacter fetus
posiadaj¹cych w b³onie zewnêtrznej bia³ka o masach cz¹steczkowych 100 000 oraz
125 000 daltonów. Stwierdzono, ¿e obecnoœæ tych bia³ek warunkuje opornoœæ na
surowicê [14]. M u n n i wsp. [65] wykazali zwi¹zek pomiêdzy obecnoœci¹ w b³onie zewnêtrznej u Aeromonas salmonicida bia³ka powierzchniowego A o masie
cz¹steczkowej 49 000 daltonów a wystêpowaniem u tego szczepu opornoœci na bakteriobójcze dzia³anie surowicy.
Badania nad mechanizmem opornoœci bakterii Gram-ujemnych na dzia³anie
surowicy wskazuj¹ równie¿ na udzia³ plazmidów w tym procesie. Produktem genu
traT zlokalizowanego na plazmidzie R6-5 jest bia³ko TraT o masie cz¹steczkowej 23 709 daltonów. W b³onê zewnêtrzn¹ E. coli wbudowanych jest oko³o
20 000–30 000 kopii tego bia³ka. Mechanizm ochronnego dzia³ania bia³ka TraT
wobec bakteriobójczego dzia³ania surowicy polega na blokowaniu prawid³owego
wbudowywania siê MAC do miejsc docelowych. Gen traT odpowiedzialny za syntezê bia³ka zlokalizowano u E. coli, Salmonella i Yersinia [90, 91]. Interesuj¹cym
jest fakt, ¿e obecnoœæ pewnych plazmidów R mo¿e zwiêkszaæ podatnoœæ bakterii na
bakteriobójcze dzia³anie surowic. Plazmidy R577 oraz R785 zwiêkszaj¹ wra¿liwoœæ
E. coli K12 W1485 na dzia³anie normalnej surowicy noworodkowej i cz³owieka
doros³ego w porównaniu z komórkami E. coli, które nie maj¹ tych plazmidów [33].
W klinicznych szczepach E. coli wystêpuje czêsto plazmid V-ColV-K94 odpowiedzialny za syntezê kolicyny. B i n n s i wsp. [12] wykazali, ¿e zlokalizowany w tym
plazmidzie gen iss wp³ywa na wytworzenie stanu opornoœci bakterii na bakteriobójcze dzia³anie surowic. Szczepy Yersinia enterocolitica posiadaj¹ plazmidy Vir.
Plazmid Vir jest odpowiedzialny za syntezê bia³ka YadA o masie cz¹steczkowej
100–200 kDa, które jest zlokalizowane w b³onie zewnêtrznej chroni¹c komórkê
przed dzia³aniem dope³niacza [70]. Na plazmidzie Vir E.coli i Salmonella zlokalizowano gen rck koduj¹cy bia³ko b³ony zewnêtrznej Rck. Obecnoœæ tego bia³ka
wp³ywa na obni¿enie wra¿liwoœci komórek bakterii na dzia³anie lityczne surowic
[28]. Kolejnym rodzajem bakterii, których opornoœæ na surowicê zwi¹zana jest
z obecnoœci¹ specyficznego bia³ka w b³onie zewnêtrznej jest H. ducreyi.
Bia³kiem determinuj¹cym opornoœæ na lityczne dzia³anie surowic jest DsrA
(ducreyi serum resisatnce A) [20]. Innymi mechanizmami umo¿liwiaj¹cymi
51
zablokowanie bakteriobójczego dzia³ania MAC na drobnoustroje jest uwalnianie
z powierzchni komórek gospodarza bia³ek tj. CD46, CD55, CD59 reguluj¹cych
aktywnoœæ dope³niacza i w³¹czeniu ich w strukturê powierzchniow¹ patogenów.
Interesuj¹cych danych na temat tzw. nabytej opornoœci na lityczne dzia³anie komplementu dostarczaj¹ wyniki badañ R a u t e m a a i wsp. [74]. Autorzy wykazali, ¿e
b³ona zewnêtrzna E. coli mo¿e byæ akceptorem bia³ka CD59. Wbudowanie tego
bia³ka w b³onê zewnêtrzn¹ w obecnoœci jonów Ca++ prowadzi do nabycia przez
szczep E. coli opornoœci na bakteriobójcze dzia³anie dope³niacza. Inny z mechanizmów polega na wnikaniu drobnoustrojów do komórek posiadaj¹cych CD59, co
chroni je przed atakiem dope³niacza [99].
Opornoœæ bakterii Gram-ujemnych na dzia³anie dope³niacza zale¿y wiêc w du¿ym stopniu od budowy zewnêtrznych warstw komórki bakteryjnej. Jednak mechanizm opornoœci zwi¹zany z obecnoœci¹ otoczek, kompletnych ³añcuchów O-swoistych czy bia³ek powierzchniowych nie zosta³ dotychczas w pe³ni wyjaœniony.
9. Podsumowanie
Bakteriobójcze dzia³anie surowicy jest wa¿nym mechanizmem chroni¹cym organizm wy¿szy przed zaka¿eniami powodowanymi przez bakterie Gram-ujemne.
Istotn¹ rolê w mechanizmie bakteriobójczego dzia³ania surowicy odgrywaj¹ bia³ka
dope³niacza aktywowane na drodze klasycznej, alternatywnej b¹dŸ lektynowej.
Przyczyna opornoœci bakterii Gram-ujemnych na surowice ma charakter wieloczynnikowy. Istnieje silna korelacja pomiêdzy opornoœci¹ na surowice a budow¹
struktur powierzchniowych bakterii tj. ³añcuchów O-swoistych lipopolisacharydu
(LPS) i bia³ek powierzchniowych. Kwasy sjalowe s¹ powszechnym sk³adnikiem
tkanek organizmów wy¿szych, jednoczeœnie s¹ tak¿e rzadkim, ale istotnym sk³adnikiem struktur bakteryjnych. Jako, ¿e wiele mikroorganizmów posiadaj¹cych kwas
sjalowy jest ludzkimi patogenami sugeruje to na to, ¿e kwas sjalowy zaanga¿owany
jest w ich wirulencjê. Biologiczna rola kwasu sjalowego jako sk³adnika lipopolisacharydów bakteryjnych jest stosunkowo s³abo poznana. Bakterie Gram-ujemne
nale¿¹ce do jednego gatunku, rodzaju i serotypu s¹ w ró¿nym stopniu wra¿liwe na
bakteriobójcze dzia³anie surowicy pêpowinowej, bydlêcej oraz osób doros³ych.
Wœród bakterii Gram-ujemnych posiadaj¹cych lipopolisacharydy z kwasem sjalowym istniej¹ szczepy zarówno oporne jak i wra¿liwe na lityczne dzia³anie bia³ek
dope³niacza, co dowiodzi, ¿e obecnoœæ kwasu sjalowego w LPS nie determinuje
opornoœci bakterii na bakteriobójcze dzia³anie dope³niacza.
Piœmiennictwo
1. Adlam C., Knights J.M., Mugridge A., Wiliams J.M., Lindom J.C.: Production of colominic acid
by Pasteurella haemolytica serotype A2 organisms. FEMS Microbiol. Lett. 42, 23–25 (1987)
2. Alexander J.W., Alexander S.L., Curtis S.R.: Bactericidal activity of human serum against Escherichia coli x1776. Infect. Immun. 28, 837–840 (1980)
52
3. Apicella M.A., Mandrell R.E., Shero M., Wilson M.E., Griffiss J.M., Brooks G.F., Lammel C.,
Breen J.F., Rice P.A.: Modification by sialic acid of Neisseria gonorrhoeae lipopolysaccharide
epitope expression in human urethral exudates: an immunoelectron microscopic analysis. J. Inf.
Dis. 162, 506–512 (1990)
4. Aspinal G.O., Mc Donald A.G., Raju T.S., Pang H., Mills S.D., Kurjanczyk L.A., Penner J.L.:
Serological diversity and chemical structures of Campylobacter jejuni low-molecular-weight
lipopolysaccharides J. Bacteriol. 174, 1324–1332 (1999)
5. Barak M., Ulitzur S., Merzbach D.: Determination of serum bactericidal activity with the aid of
luminous bacteria. J. Clin. Microbiol. 18, 248–260 (1983)
6. Barry G.T.: Colominic acid, a polymer of N-acetylneuraminic acid. J. Exp. Med. 107, 507–521
(1958)
7. Bavoil P., Nikaido H.: Physical interaction between the phage receptor protein and the carrier
immobilized maltose-binding protein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 256, 11385–11388 (1981)
8. Bayer M.E.: Areas of adhesion between wall and membrane of Escherichia coli. J. Gen. Microbiol. 53, 395–404 (1968)
9. Benz R., Janko K., Lauger P.: Ionic selectivity of pores formed by the matrix protein (porin) of
Escherichia coli. Bioch. Bioph. Acta, 551, 238–247 (1979)
10. Bhattacharjee A.K., Jennings H.J., Kenny C.P., Martin A., Smith J.C.P.: Structural determination
of the sialic acid polysaccharide antigens of Neisseria meningitidis serogroups B and C with
carbon 13 nuclear magnetic resonance. J. Biol. Chem. 250, 1926–1932 (1975)
11. Biesma D.H., Hannema A., Velzen-Blad H., Mulder L., Zwiten R., Kluijt I., Roos D.: A family
with complement factor D deficiency. J. Clin. Invest. 108, 233–240 (2001)
12. Binns M.M., Davies D.L., Hardy K.G.: Cloned fragments of the plasmid Col V, I-K 94 specifying
virulence and serum resistance. Nature, 279, 778–781 (1979)
13. Blake M.S., Gotschlich E.C.: Functional and immunological properties of pathogenic neisserial
surface proteins. In. Inouye M. (Ed.) Bacterial Outer Membranes as Model Systems. John Wiley,
New York, s. 337–400, 1986
14. Blaser M.J., Smith P.E., Hopkins J.A., Heinzer I., Bryner J.H., Wang W-L.L.: Pathogenesis of
Campylobacter fetus Infections: serum resistance associated with hight-molecular-weight surface
proteins. J. Infect. Dis. 155, 696–706 (1987)
15. Cross A.S., Kim K.S., Wright D.C., Sadoff J.C., Gemski P.: Role of lipopolysaccharide and capsule in the serum resistance of bacteremic strains of Escherichia coli. J. Infect. Dis. 154, 497–499
(1986)
16. Devine D.A., Roberts A.P.: K1, K5 and O-antigen Escherichia coli in relation to serum killing via
the classical and alternative complement pathways. J. Med. Microbiol. 41, 139–144 (1994)
17. Ding A., Sanchez Z., Tancinco M., Nathan C.: Interactions of bacterial lipopolysaccharide with
microtubule proteins. J. Immunol. 148, 2853–2858 (1992)
18. Doroszkiewicz W., Lachowicz T.M.: Mechanism of antigenic variation in Shigella flexneri bacilli
in vivo. I. Selective lethal effect of normal sera on mixed population of Shigella flexneri 1b serotype and its antigenic 3b mutant. Arch. Immunol. Ther. Exp. 37, 195 (1989)
19. Egan W., Liu T.-Y., Dorrow D., Cohen J.S., Robbins J.D., Gotschlich E.C., Robbins J.B.: Structural studies on the sialic acid polysaccharide antigen of Escherichia coli strain Bos-12. Biochemistry, 16, 3687–3692 (1977)
20. Elkins Ch., Morrow K.J., Olsen B.: Serum resistance in Haemophilus ducreyi Requires outer
membrane protein DsrA. Infect. Immun. 68, 1608–1619 (2000)
21. Encyklopedia Biologiczna. OPRES. Kraków 1998, s. 13–15, 50–51
22. Estabrook M.M., Griffiss J.M., Jarvis G.A: Sialylation of Neisseria meningitidis lipopooligosaccharide inhibits serum bactericidal activity by masking lacto-N-neotetraose. Infect. Immun. 65,
4436–4444 (1997)
23. Franiczek R., Jankowski S.: Wspó³dzia³anie cefotaksymu i normalnej surowicy ludzkiej w procesie bakteriobójczym wobec pa³eczek Escherichia coli wytwarzaj¹cych powierzchniowy antygen K1. Med. Doœw. Microbiol. 45, 61–64 (1993)
53
24. Gamian A.: Lipopolisacharydy zawieraj¹ce kwas sjalowy. Post. Hig. Med. Doœw. 50, 459–472
(1996)
25. Gamian A., Romanowska E., D¹browski U., D¹browski J.: Structure of the O-specific sialic acid
containing polysaccharide chain and its linkage to the core region in lipopolysaccharide from
Hafnia alvei strain 2 elucidated by chemical methods gas-liquid chromatography/mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy. Biochemistry, 30, 5032–5038 (1991)
26. Go³¹b J., Stok³osa T.: Mechanizmy unikania odpowiedzi immunologicznej przez bakterie i wirusy.
Nowa Klinika (Immunologia), 6, 601–605 (1999)
27. Guerry P., Ewing Ch., Hickey T.E., Prendergast M.M., Moran A.P.: Sialylation of lipooligosaccharide cores affects immunogenicity and serum resistance of Campylobacter jejuni. Infect.
Immun. 68, 6656–6662 (2000)
28. Hefferman E.J., Reed S., Hackelt J., Fierer J., Roudier C., Guiney D.: Mechanism of resistance
to complement-mediated killing of bacteria encoded by the Salmonella typhimurium virulence
plasmid gene rck. J. Clin. Invest. 90, 953–964 (1992)
29. Hellman J., Loiselle P.M., Tehan M.M., Allaire J.E., Boyle L.A., Kurnick J.T., Andrews D.M.,
Kim K.S., Warren H.S.: Outer membrane protein A, peptidoglycan-associated lipoprotein
and murein lipoprotein are released by Escherichia coli bacteria into serum. Infect. Immun. 68,
2566–2572 (2000)
30. Holst O., Brade H.: Chemical structure of the core region of lipopolysaccharides. Molecular Biochemistry and Cellular Biology, Bacterial Endotoxic Lipopolysaccharides, vol. 1, CRC Press,
Boca Raton: FI. s. 135–170, 1992
31. Jack D.L., Dodds A.W., Anwar N., Ison C.A., Law A., Frosch M., Turner M.W., Klein N.J.: Activation of complement by mannose binding lectin on isogenic mutants of Neisseria meningitidis.
I. Immunol. 160, 13–1353 (1998)
32. Janas T., Merker R.I., Troy F.A.: Polysialic acid synthesis in neuroinvasive Escherichia coli K1:
the functional domain of the polysialyltransferase complex is localized on the citoplasimic surface
of the inner membrane. Glycoconj. J. 8, 153–154 (1991)
33. Jankowski S.: Aktywnoœæ bakteriobójcza dope³niacza oraz mechanizmy adaptacyjne chroni¹ce
bakterie Gram-ujemne przed jego dzia³aniem. Rozprawy habilitacyjne, AM Wroc³aw (1991)
34. Jankowski S.: Mechanizmy obronne chroni¹ce bakterie Gram-ujemne przed bakteriobójczym
dzia³aniem dope³niacza. Post. Mikrobiol. 34, 23–44 (1995)
35. Jankowski S.: W³aœciwoœci biologiczne komplementu. II Konf. Nauk. „Zaburzenia odpornoœci
wieku rozwojowego”. 24–25.04.1997. Wroc³aw. Materia³y Naukowe. s. 7–15
36. Jankowski S., Doroszkiewicz W.: Preliminary studies of the effect of ozone on the bactericidal
properties of complement. Compl. Inflamm. 7, 57–62 (1990)
37. Jankowski S., Grzybek-Hryncewicz K.: Znaczenie bakteriobójczego dzia³ania dope³niacza w odpornoœci na zaka¿enia bakteriami Gram-ujemnymi. Post. Med. Klin. Doœw. 4, 479–490 (1995)
38. Jann K., Jann B.: Bacterial polysaccharide antigens. (w:) Surface carbohydrates of the procaryotic
cell. Ed.: Sutherland I. W., Academic Press, London. s. 247–297, 1977
39. Jarvis G.A., Verdos N.A.: Sialic acid of group B Neisseria meningitidis regulates of alternative
complement pathway activation. Infect. Immun. 55, 174–177 (1987)
40. Jiang G.Z., Sugiyama T., Kato Y., Koide N., Yokochi T.: Binding of mannose-binding protein to
Kliebsiella relation to complement activation. Infect. Immunol. 63, 2537–2540 (1995)
41. Johnson J.R.: Virulence factors in Escherichia coli urinary tract infection. Clin. Microbiol. Rev. 4,
80–128 (1991)
42. Joiner K.A., Hammer C. H., Brown E.J., Cole R.J., Frank M.M.: Studies on the mechanism of
bacterial resistance to complement-mediated killing. I. Terminal complement components are
deposited from Salmonella minnesota S218 without causing bacterial death. J. Exp. Med. 155,
797–804 (1982)
43. Kahler C.M., Martin L.E., Shih G.C., Rahman M.M., Carlson R.W., Stephens D.S.: The (L2→8)
– linked polysialic acid capsule and lipopoligosaccharide structure both contribute to the ability
of serogroup B Neisseria meningitidis to resist the bactericidal activity of normal human serum.
Infect. Immun. 66, 5939–5947 (1998)
54
44. Katzenellenbogen E.: Badania strukturalne czêœci cukrowej lipopolisacharydów Hafnia alvei.
Post. Hig. Med. Doœw. 50, 431–445 (1996)
45. Kazatchkine M.D., Fearon D.T., Austen F.: Human alternative complement pathway: membraneassociated sialic acid regulates the competition between B and $1H for cell-bound C3b. J. Immunol. 122, 75–81 (1979)
46. Kêdzierska B.: N-Acetylneuraminic acid: a constituent of the lipopolysaccharide of Salmonella
toucra. Eur. J. Biochem. 91, 545–552 (1978)
47. Kirschfink M., Nurnberger W.: C1 inhibitor in anti-inflammatory therapy: from animal experiment to clinical application. Molec. Immunol. 36, 225–232 (1999)
48. Klink M., Kaca W.: Aktywacja neutrofilów przez endotoksyny bakteryjne. Post. Hig. Med. Doœw.
50, 333–350 (1996)
49. Kraus D., Medof M.E., Mold C.: Complementary recognition of alternative pathway activators
by decay-accelerating factor and factor H. Infect. Immun. 66, 339–405 (1998)
50. Kübler J. Miesza³a M., Katzenellenbogen E., Gamian A., Romanowska E.: Charakterystyka strukturalna i serologiczna polisacharydów O-swoistych Hafnia alvei PCM 1185 i 1199. Post. Hig.
Med. Doœw. 50, 515–517 (1996)
51. Laich A., Sim R.B.: Interaction of the complement proteins C2 and C4. Molec. Immunol. Abstr.
36, 277–280 (1999)
52. Lambert P.A.: Enterobacteriaceae: composition, structure and function of the cell envelope.
J. Appl. Bacteriol. (Suppl.) 21–34 (1988)
53. Lis H., Sharon N.: Protein glycosylation. Structural and functional aspects. Eur. J. Biochem. 218,
1–27 (1993)
54. Looney R.J., Steigbiegel R.T.: Role of the Vi antigen of Salmonella typhi in resistance to host
defence in vitro. J. Lab. Clin. Med. 108, 506–510 (1986)
55. Lugtenberg B.: Composition and function of the outer membrane of E. coli. TIBS. 10, 262–266
(1981)
56. Mackinonn F.G., Gulati S., Gorringe P.A., Ram S.: The molecular basis of serum resistance in
group B meningococci: inhibitor of membrane attack complex insertion by capsular polysaccharide. Molec. Immunol. Abstr. 36, 295–296 (1999)
57. Madsen H.O.: Genetics of mannose-binding lectin. Benzone Symposium: “Molecular Mechanisms
of Innate Immunity”, August 22–26. 25, Kopenhaga, Dania 1999
58. Markiewicz Z.: Struktura i funkcje os³on bakteryjnych. Wydawnictwo Naukowe PWN. Warszawa 1993
59. Matsushita M., Endo Y., Fuijta T.: MASP1 (MBL-associated serine protease 1). Immunobiol. 199,
340–347. (1998)
60. McCabe W.R., Kaijser B., Olling S., Uwaydah M., Hanson L. A.: Escherichia coli in bacteremia:
K and O-antigens and serum sensitivity of strains from adults and neonates. J. Infect. Dis. 138,
33–37 (1978)
61. McGuire E.J., Binkley S.: The structure and chemistry of colominic acid. Biochemistry, 3,
247–251 (1964)
62. Mielnik G., Gamian A., Doroszkiewicz W.: Bactericidal activity of normal cord serum (NCS)
against Gram-negative rods with sialic acid-containing lipopolysaccharides (LPS). FEMS Immnol.
Med. Microbiol. 31, 169–173 (2001)
63. Mokracka-Latajka G., Jankowski S., Grzybek-Hryncewicz K., Krzy¿anowska B.: The mechanism of bactericidal action of normal human serum against Salmonella rods. Acta Microbiol. Pol.
45, 169–180 (1996)
64. Morrison D.C., Danner R.L., Danavello C.A., Munford R.S., Natanson C., Pollack M., Spitzer J.J.,
Ulevitch R.J., Vogel S.N., Mc Sweegan E.: Bacterial endotoxins and pathogenesis of Gram-negative infections: current status and future direction. J. Endotx. Res. 1, 71–83 (1994)
65. Munn C.B., Ishiguro E.E., Kay W.W., Trust T.J.: Role of surface components in serum resistance
of virulent Aeromonas salmonicida. Infect. Immun. 36, 1069–1075 (1982)
66. Nakae T.: Isolation of protein complex that produces transmembrane channels. J. Biol. Chem.
251, 2176–2178 (1976)
55
67. Nelson B.W., Roantree R.J.: Analysis of lipopolysaccharides extracted from penicillin-resistant,
serum-sensitive Salmonella mutants. J. Gen. Microbiol. 48, 697–499 (1967)
68. Osborn M.J., Gander J.E., Parisi E., Carson J.: Mechanism of assembly of the outer membrane of
Salmonella typhimurium. J. Biol. Chem. 247, 3962–3972 (1972)
69. Pasch M.C., Bos J.D., Daha M.R., Asghar S.S.: Transforming growth factor-isoforms regulated
the surface expression of membrane cofactor protein (CD46) and CD59 on human keratinocytes.
Eur. J. Immunol. 29, 100–108 (1999)
70. Pilz D., Vocke T., Heesemann J., Brade V.: Mechanism of Yad A-mediated serum resistance of
Yersinia enterocolitica serotype O3. Infect. Immun. 60, 189–195 (1992)
71. Pluschke G., Achtman M.: Degree of antibody-independent activation of the classical complement pathway by K1 Escherichia coli differs with O-antigen type and correlates with virulence of
meningitis in newborns. Infect. Immun. 43, 684–686 (1984)
72. Ram S., Cullinane M., Blom A.M., Gulati S., McQuillen D.P., Monks B.G., O’Connel C.,
Boden R., Elkins Ch., Pangburn M.K., Dahlback B., Rice P.A.: Binding of C4b binding protein to
porin A molecular mechanism of serum resistance of Neisseria gonorrhoeae. J. Exp. Med. 196,
281–295 (2001)
73. Ram S., Mackinnon F.G., Gulati S., McQuillen D.P., Vogel U., Frosch M., Elkins C., Guttormsen
H.-K., Wetzer L.M., Oppermann M., Pangburnn M.K., Rice P.A.: The contrasting mechanisms of
serum resistance of Neisseria gonorrhoeae and group B Neisseria meningitidis. Molec. Immunol.
36, 915–928 (1999)
74. Rautemaa R., Jarvis G.A., Marnila P., Meris S.: Acquired resistance of Escherichia coli to complement lysis by binding of glycophosphoinositol-anchored protectin (CD59). Infect. Immun. 66,
1928–1933 (1998)
75. Reeves P.: Role of O-antigen variation in the immune response. Trends in Microbiology, 3,
381–386 (1995)
76. Rietschel E.T., Brade L.: Bacterial endotoxins: properties and structures of biologically active
domains. W: Surface structures of microorganisms and their interactions with the mammalian
host (red.) Schrinner E., Richmont M.H., Seibert G., Schwarz U. Proceeding of the 18th workshop Conference Hoechst, Schloß Ringberg 1987, s. 1–41
77. Rietschel E.T., Kivikae T., Feist W., Loppnow H., Zabel P., Brade L.,Ulmer A.J., Brade H.,
Seydel U., Zahringer U., Schlaak M., Flad M.D., Schade U.: Molecular aspects of the chemistry
and biology of endotoxins. Molecular aspects of inflammation. Springer-Verlag 1991, s. 207–220
78. Roitt I., Brostoff J., Male D.: Immunologia. Wydawnictwo Lekarskie PZWL. 2000
79. Ró¿alski A.: Lipopolisacharyd (endotoksyna) – struktura chemiczna, a funkcje biologiczne. Przegl¹d najnowszych wiadomoœci. Post. Hig. Med. Doœw. 45, 315–333 (1991)
80. Ró¿alski A.: Lipopolisacharydy (LPS) bakterii Gram-ujemnych – struktura chemiczna, aktywnoœæ biologiczna i znaczenie w chorobotwórczoœci. II. Budowa chemiczna a funkcje biologiczne
LPS. Post. Mikrobiol. 34, 317–337 (1995)
81. Ró¿alski A.: Lipopolisacharydy (LPS) bakterii Gram-ujemnych, struktura chemiczna, aktywnoœæ
biologiczna i znaczenie w chorobotwórczoœci. III. Lipopolisacharyd jako czynnik chorobotwórczoœci bakterii Gram-ujemnych. Post. Mikrobiol. 34, 339–363 (1995)
82. Schauer R.: Sialic acids as antigenic determinants of complex carbohydrates. W: The Molecular
Immunology of Complex Carbohydrates. red. Wu A.M., Adams L.G. Adv. Exp. Med. Biol. 228,
48–72 (1988)
83. Schiller N.L.: Characterization of the susceptibility of Pseudomonas aeruginosa to complementmediated killing: role of antibodies to the rough lipopolysaccharide on serum sensitive strains.
Infect. Immun. 56, 632–636 (1988)
84. Schultz D.R., Miller K.D.: Elastaze of Pseudomonas aeruginosa: inactivation of complement
components and complement-derived chemotactic and phagocytic factors. Infect. Immun. 10,
128–131 (1974)
85. Schweda E.K., Jonasson J.A., Jansson P.-E.: Structural studies of lipooligosaccharides from
Haemophilus ducreyi ITM 5535, ITM 3147 and a fresh clinical isolate, ACY1: evidence for intra-
56
86.
87.
88.
89.
90.
91.
92.
93.
94.
95.
96.
97.
98.
99.
100.
strain heterogeneity with the production of mutally exclusive sialylated or elongated glycoforms.
J. Bacteriol. 177, 5316–5321 (1995)
Spik G., Bayard B., Fournet B., Strecker G., Bouguelet S., Montreuil J.: Studies on glycoconjugates. LXIV. Complete structure of two carbohydrate units of human serotransferrin. FEBS Lett.
50, 296–299 (1975)
Stryer L.: Biochemia. Wyd. Nauk. PWN. Warszawa 1997, s. 508–511
Sundgvist G., Carlson J., Herrmann B., Tarnvik A.: Degradation of human immuglobulin G and
M and complement factor C3 and C5 by black-pigmenteal Bacteroides. J. Med. Microbiol. 19,
85–86 (1985)
Taylor P.W.: Resistance of bacterial to complement. (w) Virulence mechanism of Bacterial
Pathogens, 2nd ed., Ed. J.A. Roth et al. ASM Washington. D.C. s. 49–64, 1995
Taylor P.W., Kroll H.P.: Interaction of human complement proteins with serum-sensitive and
serum-resistant strains of Escherichia coli. Mol. Immunol. 21, 609–611 (1984)
Taylor P.W., Parton R.: A protein factor associated with serum resistance in Escherichia coli.
J. Med. Microbiol. 10, 225–229 (1977)
Terai I., Kobayashi K., Matsushita M., Fuijta T., Matsuno K.: L2-macroglobulin binds to and
inhibits mannose-binding protein-associated serine protease. Inf. Immunol. 7, 1579–1584 (1995)
Tomas J.M., Ciurana B., Benedi V.J., Juarez A.: Role of lipopolysaccharide and complement in
susceptibility of Escherichia coli and Salmonella typhimurium to non-immune serum. J. Gen.
Microbiol. 134, 1009–1016 (1988)
Turner M.W.: Mannose-binding lectin in health and disease. Benzone Symposium: No. 46
“Molecular Mechanisms of Innate Immunity” August 22–26. Copenhagen. Denmark 1999
Ugorski M., K³opocki A.G.: Udzia³ antygenów sjalo-Lea i sjalo-Lex w adhezji i progresywnym
wzroœcie nowotworowym. Post. Hig. Med. Doœw. 50, 209–231 (1996)
Van Dijk W. C., Verbrugh H. A., Peters R., Van de Tol M., Petersen P.K., Verhoef J.: Escherichia
coli K antigen in relation to serum-induced lysis and phagocytosis. J. Med. Microbiol. 12,
123–130 (1979)
Van Emmerik L.C., Kuijper E.J., Fijenc A.P., Dankert J., Thiel S.: Binding of mannan-binding
protein to various bacterial pathogens of meningitidis J. Exp. Immunol. 97, 411–416 (1994)
Wojnicz D., Jankowski S.: MBP-bialko wi¹¿¹ce mannozê i jego rola w odpornoœci przeciwzakaŸnej. Adv. Clin. Exp. Med. 9, 261–274 (2000)
Wojnicz D., Jankowski S.: Bia³ko CD59-charakterystyka i jego rola w ochronie komórek przed
dzia³aniem dope³niacza. Post. Mikrobiol. 69, 37–53 (2000)
Wright S.D., Ramos R.A., Tobias P.S., Ulevith R.J., Mathison J.C.: CD14, a receptor for complexes of lipopolysaccharides (LPS) and LPS binding protein. Science, 249, 1431–1433 (1990)
Praca zosta³a sfinansowana z funduszy komitetu badañ naukowych (projekt Nr 3 PO5A 098 22)
G. Mielnik, W. Doroszkiewicz
Zak³ad Mikrobiologii Instytutu Genetyki i Mikrobiologii Uniwersytetu Wroc³awskiego
ul. S. Przybyszewskiego 63/67, 51-148 Wroc³aw
tel. 71 375 62 27, 71 357 62 28, e-mail: [email protected]
A. Korzeniowska-Kowal
Instytut Immunologii i Terapii Doœwiadczalnej PAN Wroc³aw, ul. Weigla 12
53-114 Wroc³aw, tel. 71 337 11 72, e-mail: [email protected]
Wp³ynê³o w czerwcu 2003 r.
57
POST. MIKROBIOL.,
2004, 43, 1, 59–76
http://www.pm.microbiology.pl
INTEINY – BUDOWA,
FUNKCJE BIOLOGICZNE
I FILOGENEZA
Liliana Serweciñska, Pawe³ St¹czek,
Adam Jaworski
1. Wprowadzenie. 2. Nazewnictwo, rodzaje i rozpowszechnienie intein. 3. Ukierunkowane endonukleazy intein. 4. Obecnoœæ intein w bia³kach metabolizmu DNA. 5. Rozwa¿ania na temat funkcji
i pochodzenia intein. 6. Zastosowanie intein w biotechnologii
Inteins – organization, biological functions and phylogenesis
Abstract: Inteins are the intervening sequences of proteins that are excised from precursor by an autocatalytic mechanism. The regions flanking an intein are called exteins. Inteins in contrast to introns,
are transcribed and translated together with their host protein. Most of these elements consist of two
domains: one that catalyzes its own removal from the host protein and is involved in protein
self-splicing, and the other display a site-specific endonuclease activity. Posttranslational highly
specific self-cleavage of intein, and protein ligation reactions lead to the splicing of functional protein
in the cell. Inteins avoid disrupting their host gene function by splicing themselves out at the protein
level. Endonucleases of inteins are rare-cutting enzymes that confer genetic mobility to these elements
by catalyzing a specific double-strand break in a cognate recipient allele of the host gene lacking intein.
The end result of such homing process is the duplication of the intein. Inteins occur in all three kingdoms of life: archea, eubacteria, and eukaryote. This broad phylogenetic distribution suggest their
ancient evolutionary origin, and reflects their nature as a mobile genetic elements. Also, cases of horizontal inteins transfer have been discovered. Inteins exist in numerous host protein, many of these
proteins are involved in DNA replication, transcription, and repair mechanisms, although there is no
known limitation on the type of host protein. Inteins provide a source for innovate biotechnology tools,
particulary for protein purification, for labeling or protein modification, and for cytotoxins expression.
1. Introduction. 2. Nomenclature, types and dissemination of inteins. 3. Homing endonucleases.
4. Localization of inteins in DNA metabolism proteins. 5. Inteins function and origin. 6. Application
of intein systems
1. Wprowadzenie
Inteiny (internal proteins) s¹ wewnêtrznymi segmentami niektórych bia³ek drobnoustrojów, kodowanymi przez specyficzne sekwencje nukleotydowe le¿¹ce wewn¹trz
ró¿nych genów w tej samej ramce odczytu i podlegaj¹ce procesom transkrypcji
i translacji. W okresie posttranslacyjnym elementy te s¹ precyzyjnie wycinane
i usuwane z bia³ek gospodarzy na drodze z³o¿onego procesu autoproteolizy, nazywanej w literaturze przedmiotu samosk³adaniem bia³ek (self-splicing). Syntetyzowane
bia³ka nosz¹ce inteiny s¹ wiêc pierwotnie rozdzielone na dwie czêœci zewnêtrzne,
czêœci te okreœlane s¹ terminem ekstein (external proteins) [11, 19, 49]. W procesie
wycinania intein i sk³adania bia³ka komórkowego, zewnêtrzne eksteiny ³¹cz¹ siê
59
DNA
transkrypcja
RNA
translacja
iteina
N-eksteina
C-eksteina
autoproteoliza
N-eksteina
C-eksteina
z³o¿one bia³ko
N-
i C-
koñcowe fragmenty
domeny sk³adaj¹cej
wyciêta inteina
Rys. 1. Samosk³adanie siê bia³ka na drodze autoproteolizy
przez utworzenie wi¹zania peptydowego w wyniku czego powstaje dojrza³e i funkcjonalne bia³ko (Rys. 1). Zatem, w odró¿nieniu od intronów, których wycinanie odbywa siê na poziomie RNA, samowycinanie intein ma miejsce dopiero na poziomie
produktu bia³kowego. Zjawisko samosk³adania bia³ek zosta³o po raz pierwszy opisane przez K a n e’ a i wsp. w 1990 roku dla produktu dro¿d¿owego genu TFP1,
z którego w wyniku usuniêcia inteiny powstaje bia³ko cytoplazmatycznej V-ATPazy
[32]. Kilkanaœcie lat intensywnych badañ intein pozwoli³o na stosunkowo dobre
poznanie ich budowy i struktury przestrzennej oraz zrozumienie mechanizmu wycinania siê tych elementów z bia³ek gospodarzy. W proces sk³adania bia³ka zaanga¿owanych jest od 100 do 150 reszt w czêœci N-koñcowej inteiny i oko³o 50 reszt jej
koñca karboksylowego [52, 56, 69]. Pierwszym aminokwasem intein jest przewa¿nie cysteina, rzadziej seryna, ostatnim zaœ asparagina z poprzedzaj¹c¹ j¹ histydyn¹
(Rys. 2). Konserwatywny charakter regionów dystalnych intein wynika z roli, jak¹
aminokwasy te pe³ni¹ w czteroetapowej reakcji wycinania intein i ³¹czenia ekstein.
Na efektywnoœæ procesu sk³adania wp³ywa równie¿ sekwencja samego bia³ka gospodarza, zbadano ¿e pierwszym aminokwasem eksteiny jest cysteina, seryna lub
60
N1 N2
C
S
X
N3
D
F
N4
TCH
C2
D
F
C1
HD
C
S
T
C-exte
N-eksteina
C-eksteina
xteina
Endonukleaza
C
S
D
F
–
–
–
–
Cys
Ser
Asp
Phe
T – Thr
H – His
N – Asn
Rys. 2. Konserwatywne regiony intein
treonina. Tak¿e wewn¹trz intein znajduj¹ siê niewielkie regiony o charakterze konserwatywnym [12, 75]. W reakcji sk³adania proteiny nie bior¹ udzia³u jakiekolwiek
kofaktory lub enzymy pomocnicze, dlatego mo¿na uwa¿aæ inteiny za specyficzne
katalizatory procesu samosk³adania bia³ek [42, 69]. Wiadomo tak¿e, ¿e wiêkszoœæ
poznanych intein zawiera domeny o aktywnoœci specyficznych rzadko tn¹cych
endonukleaz, rozpoznaj¹cych w genomie docelowe sekwencje DNA o d³ugoœci od
14 do 40 par zasad. Uwa¿a siê, ¿e endonukleazy te, zwane „homing endonucleases”
mog¹ pochodziæ od innych wystêpuj¹cych w naturze tego typu enzymów, szczególnie od tych, znajdowanych w sekwencjach intronów klasy I i II [3, 31]. S¹ one
obecnie intensywnie badane, zarówno z racji poznawczych jak i mo¿liwoœci ich
zastosowania w biologii molekularnej i biotechnologii. Niestety, wci¹¿ ma³o wiadomo o genetyce i funkcji biologicznej intein, które, jak wynika z dotychczasowych
badañ, s¹ rozpowszechnione wœród organizmów prokariotycznych jak i prostych
jednokomórkowych organizmów eukariotycznych, w tym wœród archebakterii, bakterii w³aœciwych, glonów, grzybów i wirusów.
2. Nazewnictwo, rodzaje i rozpowszechnienie intein
Pocz¹tkowo nadawano inteinom ró¿ne nazwy; bia³kowe introny (protein introns),
sekwencje ³¹cznikowe (spacer sequences), wtrêty sekwencji bia³kowych (intervening protein sequences), protozymy (protozymes) , samolubne lub paso¿ytnicze elementy genetyczne (selfish or parasitic genetic elements), a obecnie przyjêty termin
„inteiny” zaproponowany zosta³ w 1994 roku przez P e r l e r’ a i wsp. [49].
Nazewnictwo intein oparto o nazwy rodzajowe i gatunkowe organizmów oraz
bia³ek, w których je wykryto. Je¿eli u okreœlonego gatunku, w danym bia³ku znajduje siê wiêcej ni¿ jedna inteina, nadaje siê im kolejne numery. Dla przyk³adu,
Tfu Pol-2 oznacza drug¹ z kolei inteinê wykryt¹ w polimerazie " DNA gatunku
Thermococcus fumicolans. Natomiast inteiny, które znajduj¹ siê w tych samych
61
miejscach homologicznych bia³ek ró¿nych organizmów przyjêto okreœlaæ pojêciem
alleli. Przyk³adami mog¹ byæ, wykryta jako trzecia z kolei inteina polimerazy
" DNA Thermococcus aggregans, Tag Pol-3 i wspomniana wy¿ej inteina Tfu Pol-2
T. fumicolans; zajmuj¹ one to samo miejsce w polimerazie DNA obydwu gatunków s¹ wiêc allelami [59].
Analiza sekwencji nukleotydowej i aminokwasowej kilku pierwszych poznanych
intein, pozwoli³a zidentyfikowaæ charakterystyczny, konserwatywny motyw, który sta³
siê podstaw¹ opracowania programu komputerowego dla poszukiwania nowych
intein w bazach danych genów i genomów ró¿nych organizmów [http://www.neb.
com./neb/inteins.html; http://bioinfo.weizmann.ac.il/~pietro/inteins, 56]. Do chwili
obecnej odkryto 160 intein w ponad 30 klasach bia³ek Prokaryota i Eukaryota. Spoœród nich, 84 to inteiny wykryte u 18 gatunków archebakterii, 52 zidentyfikowano
u 33 gatunków bakterii w³aœciwych, a zaledwie 19 u glonów i grzybów [51]. Interesuj¹cym odkryciem jest du¿a czêstoœæ wystêpowania intein w szczepach ró¿nych gatunków Mycobacterium, u których wykryto a¿ 26 intein, zlokalizowanych w czterech
bia³kach, a mianowicie w podjednostce gyrazy (GyrA), bia³ku RecA, helikazie DnaB
oraz bia³ku transportuj¹cym Pps1 [51]. Wielkoœæ cz¹steczek poznanych do tej pory
intein mieœci siê w granicach od 134 do 608 aminokwasów [40, 50] . Zró¿nicowana
jest tak¿e lokalizacja intein, bowiem s¹ one obecne w bia³kach pe³ni¹cych wielorakie
funkcje jak: enzymy metabolizmu podstawowego, polimerazy DNA i RNA, topoizomerazy, helikazy, proteazy, reduktazy oraz cytoplazmatyczne ATPazy. Z przedstawionych w Tabeli I danych mo¿na wyci¹gn¹æ wniosek, ¿e inteiny najczêœciej wystêpuj¹
w bia³kach uczestnicz¹cych w metabolizmie DNA (70% wszystkich znanych obecnie
intein), w tym szczególnie w enzymach odpowiedzialnych za replikacjê i transkrypcjê
oraz w bia³kach naprawy b³êdów i uszkodzeñ DNA [40, 50]. Udzia³ procentowy
intein w opisywanych wy¿ej bia³kach komórkowych jest tak¿e bardzo zró¿nicowany
i wynosi dla przyk³adu, oko³o 10% w bia³ku PRP8 Filobasidella neoformans, natomiast ³¹czna wielkoœæ trzech intein Methanococcus jannaschii zlokalizowanych
w czynniku replikacji C, czterokrotnie przekracza rozmiary samego bia³ka RFC,
gospodarza tych intein [50]. Wiêkszoœæ, bo oko³o 85% poznanych dotychczas intein
(du¿e inteiny) zbudowana jest z dwóch funkcjonalnie odmiennych domen, tj. jednej,
bior¹cej udzia³ w samosk³adaniu bia³ka gospodarza (self-splicing domain) oraz
drugiej, domeny endonukleazy. Druga grupa, nazwana miniinteinami pozbawiona
jest domeny endonukleazy, nie wp³ywa to jednak na efektywnoœæ procesu samosk³adania bia³ka [34, 62]. Analizy sekwencji aminokwasowej mutantów delecyjnych oraz struktury kryszta³ów du¿ych intein dowiod³y, ¿e za aktywnoœæ nukleolityczn¹ odpowiedzialna jest wewnêtrzna czêœæ intein, natomiast w proces wycinania
zaanga¿owane s¹ N-i C-terminalne regiony tych elementów [16, 18, 34, 53].
Nale¿y jednak zaznaczyæ, ¿e pomimo wykrycia w wiêkszoœci intein konserwatywnych sekwencji charakterystycznych dla endonukleaz, dotychczas uda³o siê
potwierdziæ doœwiadczalnie aktywnoœæ enzymatyczn¹ zaledwie dla dwunastu z nich,
w tym dla dziesiêciu intein pochodz¹cych z ró¿nych gatunków archebakterii, jednej
z Saccharomyces cerevisiae, oraz jednej wykrytej i scharakteryzowanej u Mycobacterium gastri [26, 35, 59, 60, 61].
62
Ta b e l a I
Bia³ka bêd¹ce gospodarzami znanych intein [baza danych:
http://www.neb.com./neb/inteins.html; paŸdziernik 2003]
Bia³ko gospodarz
Rekombinazy DNA (RecA)
Czynnik C replikacji DNA i jego homolog DnaX
Liczba
znanych intein
3
8
Helikazy DNA i ich homologi
10
Polimerazy DNA i ich podjednostki
18
Bia³ko reperacji DNA RadA
1
Topoizomerazy DNA
9
Polimerazy RNA i czynnik transkrypcji
3
Syntetazy nukleotydów
13
Podjednostka A ATPazy cytoplazmatycznej (VMA 1)
6
Bia³ko kontroli podzia³u komórkowego (CDC21)
5
Proteazy
4
Czynnik inicjacji translacji
4
Aminotransferaza glutamino-fruktozo-6-fosforanu
1
Syntaza fosfoenolopirogronianowa
1
Dehydrogenaza UDP-glukozy
Niezidentyfikowane otwarte ramki odczytu
1
13
Domeny intein o aktywnoœciach endonukleaz przyjêto nazywaæ endonukleazami PI (protein insert), dla odró¿nienia ich od znanych i szeroko stosowanych
w in¿ynierii genetycznej enzymów restrykcyjnych. Przyk³adowo, PI MgaI oznacza
aktywnoœæ endonukleazy w domenie inteiny zlokalizowanej w bia³ku transportuj¹cym Pps1 M. gastri, a PI SceI to aktywnoœæ endoukleolityczna domeny inteiny
obecnej w bia³ku cytoplazmatycznej ATPazy dro¿d¿y S. cerevisiae [61].
Innym, bardzo interesuj¹cym rodzajem s¹ inteiny podzielone (split inteins). Przyk³adem mo¿e byæ inteina Ssp DnaE zidentyfikowana w podjednostce " polimerazy III DNA (Dna E) cyjanobakterii Synechocystis ssp. oraz Nostoc punctiforme.
Podjednostka a tej polimerazy jest kodowana przez dwa oddzielne geny dnaE-n
i dnaE-c, które s¹ oddalone od siebie w chromosomalnym DNA o 745 kb. Pierwszy
z tych genów, N-terminalna eksteina, koduje syntezê aminowego koñca podjednostki " polimerazy oraz przylegaj¹cy do niego fragment inteiny, drugi zaœ, C-terminalna eksteina, koduje czêœæ karboksylow¹ wraz z drugim fragmentem inteiny.
Wykazano, ¿e proces precyzyjnego samowycinania tych dwóch czêœci inteiny
z syntetyzowanej cz¹steczki enzymu (trans-splicing of the split intein) prowadzi do
z³o¿enia w komórce funkcjonalnej podjednostki " polimerazy Dna E [21, 42, 72].
Szereg innych podzielonych intein zosta³o skonstruowanych w ró¿nych laboratoriach, w wyniku przeciêcia sekwencji koduj¹cych ich syntezê oraz sklonowania
63
otrzymanych fragmentów w oddalonych od siebie miejscach okreœlonego wektora
ekspresyjnego. Dowiedziono, ¿e tak skonstruowane inteiny podzielone s¹ zdolne do
samowycinania i sk³adania w komórce w funkcjonaln¹ cz¹steczkê bia³ka, aczkolwiek wydajnoœæ tego procesu jest znacznie ni¿sza ni¿ dla wy¿ej opisanej, podzielonej inteiny naturalnej cyjanobakterii [20, 40, 44, 64]. Dotychczas nie wiadomo, czy
zjawisko wystêpowania intein podzielonych i mechanizmu „trans-splicing” dotyczy
wy³¹cznie takich bia³ek jak omawiana wy¿ej podjednostka a polimerazy III DNA
cyjanobakterii, w której rezyduj¹ obie czêœci inteiny podzielonej, czy te¿ fragmenty
takich intein podzielonych mog¹ le¿eæ w ró¿nych bia³kach danej komórki, a ich
„trans-splicing” móg³by w takiej sytuacji prowadziæ do z³o¿enia w komórce bia³ka
fuzyjnego o zupe³nie nowej funkcji.
3. Ukierunkowane endonukleazy intein (homing endonucleases)
Pojêciem „intein homing”czyli ukierunkowanego przemieszczania siê inteiny,
okreœla siê zjawisko przenoszenia sekwencji koduj¹cej syntezê inteiny w homologiczne locus genu aktualnie pozbawionego tego elementu. Proces ten mo¿na zatem
zdefiniowaæ jako miejscowo-specyficzn¹ rekombinacjê zachodz¹c¹ z wysok¹
czêstoœci¹, która prowadzi do duplikacji w genomie sekwencji koduj¹cej inteinê.
Mechanizm transferu inteiny jest inicjowany przez domenê endonukleazy, która
rozpoznaje i przecina obie nici DNA w specyficznym miejscu sekwencji docelowej
w homologicznym locus. Powsta³e w ten sposób wolne koñce DNA musz¹ zostaæ
naprawione, bowiem stanowi¹ zagro¿enie dla integralnoœci genomu, a tym samym
dla ¿ycia komórki [3, 31].
Przedstawiony na Rys. 3 schemat obrazuje mechanizm przemieszczania siê inteiny i rekombinacyjnej naprawy tego typu uszkodzeñ dsDNA, polegaj¹cy na
konwersji genu, prowadz¹cej w efekcie do powielenia sekwencji inteiny w nowym
miejscu danego genu lub homologicznym locus tego genu. Omawiany proces ukierunkowanego przemieszczania siê inteiny nie jest odmian¹ znanego od dawna
u bakterii mechanizmu transpozycji ruchomych elementów genetycznych (transpozonów i sekwencji insercyjnych). W obu mechanizmach transfer inicjowany jest
co prawda aktywnoœci¹ bia³ek kodowanych przez same te elementy, to jest endonukleaz intein i transpozaz transpozonów, zasadnicza ró¿nica polega jednak na
tym, ¿e transpozazy rozpoznaj¹ specyficzne sekwencje zlokalizowane na koñcach
transpozonów zaœ endonukleazy intein rozpoznaj¹ i przecinaj¹ sekwencje docelowe
zlokalizowane w homologicznych loci okreœlonych genów [2, 11, 31]. Endonukleazy kodowane przez inteiny, pomimo, ¿e podobnie jak restryktazy typu I, II i III
rozpoznaj¹ i przecinaj¹ obie nici w docelowych sekwencjach DNA, to jednak ich
struktura przestrzenna, mechanizm rozpoznawania sekwencji docelowych i lokalizacja w genomie s¹ zupe³nie odmienne. I tak, endonukleazy intein rozpoznaj¹ stosunkowo d³ugie sekwencje docelowe, w granicach od 14 do 40 par zasad, podczas
gdy dla enzymów restrykcyjnych d³ugoœæ sekwencji docelowych na ogó³ mieœci siê
w granicach 4–12 par zasad [36]. Endonukleazy intein toleruj¹ mutacje punktowe
64
Matrycowy DNA (dawca)
N-eksteina
N-eksteina
inteina
iteina
C-eksteina
DNA
Homologiczne locus (biorca)
transkrypcja,
translacja
translacja
N-eksteina
naciêcie dsDNA
rekombinacyjna
naprawa dsDNA
C-eksteina
endonukleaza
inteina
autokatalityczne
sk³adanie siê
autokatalityczne
ekstein
sk³adanie siê
konwersja genu
ekstein
funkcjonalne bia³ko komórkowe
Rys. 3. Ukierunkowane przemieszczanie siê inteiny w nowe locus chromosomu („intein homing”)
w rozpoznawanych asymetrycznych sekwencjach docelowych, podczas gdy restryktazy s¹ bardzo wra¿liwe na wszelkie punktowe substytucje zasad w rozpoznawanych przez nie, krótkich sekwencjach palindromowych [57, 58]. Odmienne jest tak¿e
rozprzestrzenienie tych enzymów w przyrodzie. Endonukleazy PI jako integralne
domeny du¿ych intein, a tak¿e endonukleazy intronów grupy I i II wykryto zarówno
w komórkach archebakterii i eubakterii jak i w komórkach prostych organizmów
eukariotycznych, a wœród tych ostatnich tak¿e w mitochondriach i chloroplastach
[36]. Natomiast enzymy restrykcyjne s¹ kodowane przez niektóre wirusy eukariotyczne ale szczególnie szeroko s¹ rozpowszechnione wœród ró¿nych gatunków bakterii, w tym nale¿¹cych do królestwa Archea [3, 31]. Istotna ró¿nica pomiêdzy nimi
polega tak¿e na tym, ¿e ramki odczytu dla endonukleaz ukierunkowanych le¿¹
w sekwencji nukleotydowej tych elementów, natomiast enzymy restrykcyjne s¹
kodowane przez niezale¿ne geny, które prawie zawsze le¿¹ w s¹siedztwie genów
kodujacych syntezê odpowiednich metylotransferaz [71]. Omawiane endonukleazy
pe³ni¹ te¿ ró¿ne funkcje biologiczne. Uwa¿a siê, ¿e podstawow¹, aczkolwiek
nie jedyn¹ funkcj¹ restryktaz jest ochrona komórki przed wtargniêciem obcego
DNA, które jest szybko rozpoznawane i degradowane przez gêsto tn¹ce restryktazy,
65
podczas gdy w³asny genom jest chroniony wskutek komplementarnej metylacji
rozpoznawanych przez nie sekwencji docelowych. Natomiast funkcja biologiczna
„homing” endonukleaz sprowadza siê do inicjowania procesu transferu inteiny
w nowe miejsce. Enzymy te przecinaj¹ genom zwykle w jednym, œciœle okreœlonym
miejscu w homologicznym locus i st¹d rozpoznawane sekwencje docelowe dla tych
enzymów s¹ znacznie d³u¿sze, co zapewnia wysok¹ specyficznoœæ ich dzia³ania [31].
Endonukleazy intein oraz intronów grupy I i II znalaz³y zastosowanie w ró¿nych dziedzinach wspó³czesnej biologii molekularnej, w³aœnie z racji specyficznoœci
dzia³ania wobec d³ugich sekwencji docelowych [6]. By³y one z powodzeniem stosowane w mapowaniu i w badaniach organizacji genomów bakteryjnych. Dla przyk³adu, endonukleaza I-CeuI rozpoznaje i trawi wy³¹cznie DNA w obrêbie sekwencji
bakteryjnych koduj¹cych syntezê rRNA, co pozwala ustalaæ konfiguracjê i plastycznoœæ regionu rDNA w chromosomach wielu gatunków bakterii [38, 67]. Wprowadzenie do chromosomów bakterii lub dro¿d¿y unikatowych sekwencji docelowych
dla endonukleaz I-SceI oraz I-DmoI pozwala trawiæ genomy tych drobnoustrojów
na du¿e fragmenty, przydatne w mapowaniu i klonowaniu bardzo du¿ych regionów
DNA w odpowiednich wektorach. Wprowadzanie tych sekwencji do chromosomów
odbywa siê w oparciu o mechanizm transpozycji przygotowanych specjalnie w tym
celu kaset w minitranspozonach Tn10::I-SceI i Tn5::I-SceI dla bakterii oraz w retrotranspozonie Ty1::DmoI dla dro¿d¿y [4, 14, 41]. Du¿e fragmenty restrykcyjne,
otrzymane po trawieniu DNA tak in¿ynierowanych komórek, mo¿na z powodzeniem klonowaæ w dostêpnych obecnie wektorach plazmidowych lub kosmidowych, które zawieraj¹ unikatowe miejsca restrykcyjne dla endonukleaz I-SceI,
I-PolI, I-CeuI lub I-TliI [1, 24].
4. Obecnoœæ intein w bia³kach metabolizmu DNA
Nie wiadomo dlaczego bia³ka metabolizmu DNA tak czêsto s¹ gospodarzami
intein, ale w dyskusjach na ten temat rozwa¿a siê kilka teoretycznie mo¿liwych
przyczyn. Po pierwsze, proces ukierunkowanego przemieszczania siê tych elementów wymaga obecnoœci nie tylko inteinowej endonukleazy, ale te¿ bia³ek bior¹cych
udzia³ w replikacji i reperacji DNA. Zatem obecnoœæ du¿ych intein, z domen¹ endonukleazy w bia³kach metabolizmu DNA zapewnia³aby jednoczesn¹ obecnoœæ w komórce endonukleazy i bia³ek koniecznych w kolejnych etapach procesu przemieszczania siê intein. Po drugie, ryzyko transferu intein w przypadkowe miejsce
chromosomu by³oby zmniejszone, wskutek ograniczenia produkcji endonukleaz
inteinowych do okresu aktywnej replikacji i reperacji DNA, st¹d przypadkowe
naciêcie DNA mog³oby byæ szybko naprawione bez uszczerbku dla integralnoœci
chromosomu i ¿ywotnoœci komórki [10, 40]. Ta hipoteza wydaje siê o tyle prawdopodobna, ¿e jak ju¿ wspomniano, endonukleazy intein wykazuj¹ stosunkowo wysok¹ tolerancjê dla pojedynczych mutacji w rozpoznawanej przez siebie sekwencji.
Po trzecie, lokalizacja intein w konserwatywnych regionach bia³ek niezbêdnych
dla ¿ycia komórki zapobiega ich negatywnej selekcji [40]. Wreszcie obecnoœæ intein
66
w fagowych i wirusowych genach odpowiedzialnych za metabolizm DNA mo¿e
wskazywaæ, ¿e w³aœnie fagi i wirusy pos³u¿y³y za wektory do rozpowszechnienia
intein w podobnych genach u innych organizmów [17, 37, 48, 52, 53, 54]. Okreœlone regiony chromosomu koduj¹ce bia³ka uczestnicz¹ce w replikacji i naprawie
DNA, w których najczêœciej s¹ zlokalizowane inteiny, s¹ podobne u ró¿nych, nawet
bardzo odleg³ych filogenetycznie organizmów. W tej sytuacji horyzontalny, miêdzygatunkowy transfer intein i ich integracja w takie analogiczne, konserwatywne
regiony bia³ek metabolizmu DNA u ró¿nych organizmów, wydaj¹ siê mechanizmami
nie tylko teoretycznie mo¿liwymi, ale tak¿e potwierdzonymi analizami sekwencji
i „codon usage”, na przyk³ad dla intein bia³ek GyrA i Pps1 obecnych w kilku gatunkach Mycobacterium [25, 61]. Innym, czêsto cytowanym przyk³adem mo¿liwego
transferu inteiny pomiêdzy odleg³ymi filogenetycznie drobnoustrojami jest inteina
obecna w bia³ku DnaB fotosyntetyzuj¹cych cyjanobakterii Nostoc punctiforme oraz
termofilnych, heterotroficznych morskich bakterii Rhodothermus marinus. Okaza³o
siê, ¿e „codon usage” w sekwencji nukleotydowej koduj¹cej syntezê inteiny bia³ka
DnaB R. marinus, jest zupe³nie odmienny od „codon usage” dla innych genów tego
gatunku bakterii, ale identyczny jak dla genów N. punctiforme. Mo¿na wiêc s¹dziæ,
¿e inwazja inteiny DnaB do genomu R. marinus nast¹pi³a w póŸniejszym okresie na
drodze horyzontalnej transmisji [39]. Inteina Pfu TopA jest z kolei przyk³adem transferu tych elementów pomiêdzy bia³kami o zupe³nie odmiennych funkcjach biologicznych tzn. topoizomeraz¹ I z Pyrococcus furiosus i odwrotn¹ gyraz¹ Methanococcus jannaschii [9].
5. Rozwa¿ania na temat pochodzenia intein i ich funkcji
W piœmiennictwie trwa o¿ywiona dyskusja na temat filogenezy intein oraz ich funkcji biologicznych, zarówno w przesz³oœci ewolucyjnej, jak i w komórkach wspó³czeœnie ¿yj¹cych organizmów. Nale¿y zaznaczyæ, ¿e we wspomnianej dyskusji nie
brak sprzecznych pogl¹dów i opinii. Ponadto, wyniki nielicznych prac doœwiadczalnych na ten temat s¹ zupe³nie odmiennie interpretowane przez ró¿nych autorów,
w tym wybitnych specjalistów w dziedzinie biologii intein takich jak X-Q. L i u,
P. G o g a r t e n, czy S. P i e t r o k o v s k i [28, 40, 54].
W niniejszym rozdziale zostan¹ przedstawione niektóre tylko dane i opinie na
ten temat. Jeden z mo¿liwych, logicznych scenariuszy ewolucyjnego rozwoju intein
i ich funkcji biologicznych zosta³ zaproponowany przez L i u. Wspomniano wczeœniej, i¿ w sk³ad znanych intein wchodzi od 134 do 608 aminokwasów, a zasadnicze
ró¿nice w wielkoœci poszczególnych elementów s¹ zwi¹zane z obecnoœci¹ lub brakiem domeny endonukleazy [50]. Wydaje siê bardzo prawdopodobnym, ¿e ma³e,
naturalne inteiny pochodz¹ od du¿ych bifunkcyjnych intein, które w rozwoju ewolucyjnym utraci³y domenê endonukleazy, co nie wp³ywa z regu³y na proces autokatalitycznego wycinania siê inteiny z bia³ka gospodarza i sk³adania flankuj¹cych j¹
ekstein w funkcjonaln¹ cz¹steczkê. Zatem nie ma w istocie silnej presji selekcyjnej
dla utrzymania aktywnoœci endonukleaz w obrêbie intein. Zdaniem L i u raczej
67
ma³o prawdopodobnym jest to, ¿e ma³e inteiny s¹ filogenetycznie starszymi od du¿ych, i ¿e nigdy w przesz³oœci ewolucyjnej nie mia³y one w swoim sk³adzie domen
endonukleaz. Gdyby tak by³o, nale¿a³oby siê spodziewaæ, ¿e wszystkie obecnie wystêpuj¹ce mini-inteiny s¹ ze sob¹ filogenetycznie spokrewnione [16, 51]. Ponadto,
szerokie rozpowszechnienie intein œwiadczy³oby o tym, ¿e by³y one pierwotnie
mobilnymi elementami z domen¹ endonukleazy warunkuj¹c¹ ich przemieszczanie
siê. Analiza pokrewieñstwa przeprowadzona na podstawie sekwencji nukleotydowej intein wskazuje z jednej strony, i¿ s¹ one bardzo zró¿nicowane, z drugiej zaœ
ujawnia podobieñstwo intein allelicznych, co dodatkowo utwierdza w przekonaniu
o mo¿liwej, czêstej ich transmisji horyzontalnej. Nie wiadomo tak¿e, ile z obecnie
znanych intein, w których wykryto motywy sekwencji charakterystycznych dla ukierunkowanych endonukleaz, posiada w istocie aktywnoœæ enzymatyczn¹, a ile z nich
ju¿ tê aktywnoœæ utraci³o. Jak wspomniano wczeœniej, dotychczas uda³o siê potwierdziæ tê aktywnoœæ doœwiadczalnie dla zaledwie 12 intein, z których zdecydowan¹
wiêkszoœæ, bo a¿ 10, stanowi¹ inteiny bardzo starych filogenetycznie bakterii nale¿¹cych do królestwa Archea [39]. Nie brak w piœmiennictwie hipotez zak³adaj¹cych, ¿e inwazja ró¿nych endonukleaz do ukszta³towanych intein nast¹pi³a wiele
razy w okresie póŸniejszym. Przytaczanym argumentem, przemawiaj¹cym za takim
przebiegiem filogenetycznego rozwoju du¿ych intein jest obecnoœæ w nich endonukleaz, które nale¿¹ do ró¿nych klas i typów [15, 51, 54].
Zdaniem P i e t r o k o v s k i’ e g o sam fakt obecnoœci intein w trzech królestwach
organizmów ¿ywych, ujawnia ich charakter, jako elementów filogenetycznie bardzo
starych, które by³y obecne w komórkach wspólnego przodka archeonów, eubakterii
i organizmów eukariotycznych. S¹dzi on, ¿e inteiny w obecnie ¿yj¹cych organizmach
nie pe³ni¹ w istocie ¿adnej wa¿nej funkcji biologicznej i uwa¿a je za elementy samolubne lub paso¿ytnicze, które w dalekiej przesz³oœci ewolucyjnej mog³y mieæ znaczenie, bowiem ich wycinanie z domen ró¿nych bia³ek mog³o prowadziæ do sk³adania
w komórce, w procesie „ trans-splicing”, bia³ek o nowych w³aœciwoœciach biologicznych [40, 54]. Mo¿liwoœæ taka zosta³a potwierdzona doœwiadczalnie dla sztucznych,
rekombinowanych intein oraz opisana tak¿e dla inteiny wczeœniej dyskutowanego
bia³ka polimerazy DnaE cyjanobakteri, kiedy to precyzyjne wycinanie siê inteiny
podzielonej prowadzi do z³o¿enia dwóch ekstein, kodowanych przez dwie oddalone
od siebie sekwencje, w postaæ funkcjonalnego bia³ka niezbêdnego dla ¿ycia tych bakterii [29, 44, 64, 72]. Innym przytaczanym przyk³adem funkcji biologicznej s¹ inteiny
polimerazy DNA Pyrococcus kodakaraensis, zawieraj¹ce w swoim sk³adzie domeny
endonukleaz. Okaza³o siê, ¿e endonukleazy te obok zasadniczej funkcji zwi¹zanej
z procesem przemieszczania siê intein w nowe locus, mog¹ tak¿e pe³niæ rolê w rearan¿acji chromosomu [45, 46]. Prawdopodobnie takie rearan¿acje odpowiedzialne s¹
za podzia³ pierwotnie ci¹g³ej inteiny bia³ka DnaE cyjanobakterii na dwie czêœci. Oczywiœcie nikt nie kwestionuje biologicznej funkcji „homing” endonukleaz odpowiedzialnych za rozprzestrzenianie siê intein w homologiczne regiony genomu danego gospodarza, a prawdopodobnie tak¿e za ich horyzontalny transfer do innych gatunków.
Teoretycznie, proces ukierunkowanego przemieszczania siê intein mo¿e doprowadziæ
do szybkiego wysycenia w te elementy wszystkich homologicznych loci w genomie,
68
inteina z domen¹
endonukleazy
reinwazja
wolne miejsce
w chromosomie
transkrypcja
translacja
transfer
horyzontalny
homologiczne
locus
autokatalityczne
wycinanie siê
mini-inteiny
inteina z domen¹
endonukleazy
uwolniona
funkcjonalna
endonukleaza
utrata domeny
endonukleazy
mini-inteina
Rys. 4. Cykl inwazji i reinwazji w filogenetycznym rozwoju intein
a aktywnoœæ endonukleazy konieczna dla przebiegu tego procesu, by³aby czynnikiem
pozytywnej selekcji intein bifunkcyjnych. Z chwil¹ wysycenia wszystkich loci w inteiny, nie by³oby dalszej pozytywnej selekcji dla aktywnoœci nukleolitycznej, a zatem
domeny enzymów, w pierwszej kolejnoœci podlega³yby czêstym delecjom, w dalszej
zaœ by³yby wycinane z kolejnych miejsc genomu. Powtarzaj¹cy siê cykl inwazji
i reinwazji intein zaproponowany przez G o d d a r t’ a i wsp., przedstawiony zosta³
na Rys. 4, cykl ten obejmuje: a) horyzontalny transfer du¿ych intein do nowego
gospodarza, b) rozprzestrzenianie siê inteiny w wolne, homologiczne miejsca genomu nowego gospodarza, c) degradacjê du¿ej inteiny w kolejnych loci w nastêpstwie
utraty ramki odczytu endonukleazy i przekszta³cenie w monofunkcyjn¹ miniinteinê,
d) utratê ma³ego elementu w wyniku jego autokatalitycznego wycinania siê z kolejnych loci genomu, co na powrót stwarza³oby mo¿liwoœæ kolejnej inwazji tego samego lub innego elementu [27]. Naszym zdaniem, hipoteza ta jest dobrym podsumowaniem wszystkich znanych faktów doœwiadczalnych na temat rozprzestrzeniania
siê intein i nie jest sprzeczna ani z wy¿ej komentowanymi pogl¹dami innych autorów, ani z proponowanymi mechanizmami inwazji i reinwazji innych samolubnych
elementów genetycznych [27].
Warto przytoczyæ w tym miejscu wyniki uzyskane przez H a l l’ a i wsp. metod¹
krystalografii rentgenowskiej, które ujawni³y, ¿e struktura krystaliczna miniinteiny Mxe GyrA jest bardzo podobna do struktury jednej z domen bia³ka hedgehog
69
Drosophila, które to bia³ko uczestniczy w aran¿acji wzoru segmentacji zarodka
muchy. Domena Hh-C17 bia³ka hedgehog, katalizuj¹ca jego obróbkê poprzez ciêcie
cz¹steczki bia³ka na dwie jednostki, jest strukturalnie zbli¿ona do inteiny Mxe
GyrA, chocia¿ oba te bia³ka wykazuj¹ niski poziom podobieñstwa na poziomie
sekwencji aminokwasowej. Byæ mo¿e inteiny i bia³ko hedgehog w przesz³oœci ewolucyjnej mia³y wspólnego przodka, lub te¿ taka sama struktura powsta³a w ewolucji
dwa razy [28, 30].
6. Zastosowanie intein w biotechnologii
W zakoñczeniu tego artyku³u pragniemy zwróciæ uwagê czytelnika na propozycje
nowoczesnych, biotechnologicznych zastosowañ miniintein naturalnych oraz sztucznie konstruowanych w ekspresji i pozyskiwaniu rekombinowanych bia³ek, które jako
cz¹steczki fuzyjne z inteinami mog¹ byæ ³atwo oczyszczane metod¹ chromatografii
powinowactwa, a nastêpnie w wyniku indukowanego wycinania intein in vitro, bia³ka
te mog¹ byæ pozyskiwane z du¿¹ wydajnoœci¹ bez koniecznoœci u¿ycia proteaz. Pierwsz¹ intein¹ wykorzystan¹ w tym celu by³a inteina Sce VMA. Element ten, po uprzedniej modyfikacji, zosta³ umieszczony od strony czêœci aminowej pomiêdzy bia³kiem
oczyszczanym, i od strony czêœci karboksylowej, bia³kiem wi¹¿¹cym chitynê CBD
z Bacillus circulans. W kolejnym etapie, kompleks CBD-inteina-bia³ko oczyszczane,
zosta³ zatrzymany na kolumnie chitynowej, po czym, w wyniku indukowanego rozerwania wi¹zania peptydowego w czêœci N-terminalnej nastêpowa³o uwolnienie bia³ka
docelowego z kompleksu cz¹steczek fuzyjnych zwi¹zanych na kolumnie [7, 8]. Od
tego czasu opracowano wiele innych, analogicznych systemów fuzyjnych, w których
bia³ko docelowe by³o zwi¹zane z N- lub C-koñcem zmodyfikowanej inteiny, a rozerwanie wi¹zania peptydowego w obrêbie inteiny indukowane by³o czynnikami z grupy
tioli [43, 55]. W przypadku stosowania inteiny Ssp DnaB czynnikiem indukuj¹cym
ciecie wi¹zania, jest pH o wartoœci 8 lub wy¿sze co umo¿liwia oczyszczanie bia³ek
wra¿liwych na tiole. W warunkach laboratoryjnych mo¿liwa jest tak¿e indukcja reakcji wycinania intein podwy¿szon¹ temperatur¹. Dotyczy to elementów pochodz¹cych
z termofilnych gatunków archebakterii, takich jak inteina Psp PolI wystêpuj¹ca
w sekwencji termostabilnej polimerazy DNA gatunku Pyrococcus sp. [20, 65, 74].
Wiêkszoœæ intein stosowanych w celu pozyskiwania bia³ek t¹ metod¹ to ma³e
inteiny naturalne, jak np. Mxe GyrA z Mycobacterium xenopi [66], Pho RadA czy
Pho PolIII z Pyrococcus horikoshii [33]. Elementy specjalnie zmienione podlegaj¹
uprzednim modyfikacjom polegaj¹cym na podstawieniu aminokwasów w taki sposób,
aby przeciêcie w obrêbie inteiny katalizowane by³o w obydwu lub tylko w jednym
jej koñcu, zale¿nie od potrzeb eksperymentu [77]. Modyfikacje du¿ych intein to
przede wszystkim usuwanie domen endonukleaz, jak to mia³o miejsce w przypadku
Ssp DnaB [73], czy inteiny podzielonej Ssp DnaE [72]. Modyfikacje te maj¹ na celu
podwy¿szenie poziomu ekspresji bia³ka [42, 73]. Kolejnym udogodnieniem na drodze
oczyszczania i pozyskiwania bia³ek jest do³¹czanie elementu reporterowego do kompleksu fuzyjnego, co ogromnie u³atwia wstêpn¹ identyfikacjê rekombinowanych
70
Rys. 5. Schemat oczyszczania bia³ek metod¹ chromatografii powinowactwa z wykorzystaniem
intein: CBD (chitin-binding domain) – bia³ko wi¹¿¹ce chitynê, GFP (green fluorescent protein)
– bia³ko zielonej fluorescencji
71
bia³ek, któr¹ mo¿na przeprowadziæ przed liz¹ komórki i przed analiz¹ elektroforetyczn¹. Rolê bia³ka reporterowego doskonale spe³nia bia³ko GFP (green fluorescens
protein); jego fluorescencja mo¿e byæ ³atwo wykrywana w ¿ywych komórkach. Formowanie chromoforów GFP w komórce, uwarunkowane jest poprawnym z³o¿eniem
bia³ka fuzyjnego, a zatem GFP mo¿e s³u¿yæ jako wskaŸnik prawid³owoœci procesu
sk³adania, co z regu³y daje gwarancjê uzyskania aktywnej proteiny (Rys. 3). Zbadano,
¿e w wyniku przy³¹czania bia³ka docelowego do C-koñcowej czêœci GFP, ³atwo
mierzalna fluorescencja ¿ywych komórek pozostawa³a w korelacji liniowej z poziomem ekspresji tego bia³ka. Przy czym dobrze rozpuszczalne bia³ka fuzyjne wykazuj¹ wy¿sz¹ fluorescencjê ni¿ te, które s¹ s³abo rozpuszczalne lub nierozpuszczalne
[68]. Zastosowanie bia³ka reporterowego w tego typu systemach znacznie u³atwia
poszukiwanie wydajnych uk³adów szczep/wektor oraz ustalanie w³aœciwych warunków hodowli rekombinantów, czyli optymalizacjê czynników, od których zale¿y
wysoka ekspresja konkretnego bia³ka fuzyjnego. W efekcie, raz w³aœciwie dobrane
warunki eksperymentu, pozwalaj¹ na szybki „screening” rekombinantów i efektywne
oczyszczanie na pojedynczej kolumnie. Systemy takie, oprócz unikniêcia koniecznoœci stosowania enzymów proteolitycznych, umo¿liwiaj¹ te¿ przewidywanie
ostatecznej iloœci produktu, bezpoœrednio na podstawie poziomu fluorescencji
komórki, to znaczy przed jej liz¹ i przed etapem oczyszczania [77]. Wektory inteinowe znalaz³y zastosowanie w pozyskiwaniu bia³ek, których nadprodukcja jest toksyczna dla komórki, takich jak RNaza A czy endonukleaza HpaI. W tym przypadku
nieaktywne prekursory cytotoksycznego bia³ka, podzielone przez sekwencjê inteiny, podlegaj¹ ekspresji in vivo, natomiast ich ligacja, prowadz¹ca do uzyskania
funkcjonalnych cz¹steczek zachodzi in vitro [22, 23, 45, 63]. Zastosowanie wektorów inteinowych stwarza te¿ ogromne mo¿liwoœci w otrzymywaniu nowych jakoœciowo bia³ek, poprzez rekombinowanie funkcjonalnie ró¿nych domen; umo¿liwia
znakowanie polipeptydów znacznikami fluorescencyjnymi oraz modyfikacje w nastêpstwie do³¹czania ró¿nych grup reaktywnych [13]. Modyfikacje mog¹ dotyczyæ
zarówno koñcowych jak i centralnych czêœci peptydu i otwieraj¹ nowe perspektywy
w badaniu struktury i funkcji bia³ek. W ten sposób okreœlano wp³yw fosforylacji
reszt tyrozyny na konformacjê i aktywnoœæ kinazy tyrozynowej [5, 45]. Systemy
intein podzielonych, takich jak Ssp DnaE z powodzeniem wykorzystywane s¹ do
syntezy in vivo peptydów cyklicznych. Cyklizacja szkieletu peptydowego zwiêksza
stabilnoœæ protein i zapobiega degradacji przez egzopeptydazy. Otrzymana t¹ metod¹ forma cykliczna czynnika wi¹¿¹cego maltozê jest w pe³ni funkcjonalna in vivo,
natomiast in vitro charakteryzuje siê wiêksz¹ termostabilnoœci¹, w porównaniu do
naturalnej formy liniowej wystêpuj¹cej w komórkach [23].
Zmodyfikowane systemy inteinowe znajduj¹ te¿ zastosowanie w syntezie znakowanych izotopowo fragmentów, wchodz¹cych w sk³ad du¿ych bia³ek. Znakowanie bia³ek o du¿ych rozmiarach mo¿liwe jest, jak dot¹d, tylko z wykorzystaniem
wektorów inteinowych i umo¿liwia badania struktury i zmian konformacyjnych
w konkretnych domenach i regionach bia³ek, takich jak miejsca aktywne czy
sekwencje odpowiedzialne za wi¹zanie kofaktorów metod¹ magnetycznego rezonansu j¹drowego [47, 70, 76].
72
Piœmiennictwo
1. Asselbergs F.A., Rival S.: Creation of a novel, versatile multiple cloning site cut by four rarecutting homing endonucleases. Biotechniques, 20, 558–562 (1996)
2. Belfort M., Perlman P.S.: Mechanisms of intron mobility. J. Biol. Chem. 270, 30237–30240 (1995)
3. Belfort M., Roberts R.J.: Homing endonucleases: keeping the house in order. Nucleic Acids Res.
25, 3379–3388 (1997)
4. Bloch C.A., Rode C.K., Obreque V.H., Mahillon J.: Purification of Escherichia coli chromosomal
segments without cloning. Biochem. Biophys. Res. Commun. 223, 104–111 (1996)
5. Camarero J.A., Muir T.W.: Biosynthesis of a head-to-tail cyclized protein with improved biological activity. J. Am. Chem. Soc. 121, 5597–5598 (1999)
6. Chevalier B.S., Kortemme T., Chadsey M.S., Baker D., Monnat R.J., Stoddard B.L.: Design, activity, and structure of a highly specific artificial endonuclease. Mol. Cell, 10, 895–905 (2002)
7. Chong S., Mersha F.B., Comb D.G., Scott M.E., Landry D., Vence L.M., Perler F.B., Benner J.,
Kucera R.B., Hirvonen C.A., Pelletier J.J., Paulus H., Xu M.Q.: Single-column purification of
free recombinant proteins using a self-cleavable affinity tag derived from a protein splicing element. Gene, 192, 271–281 (1997)
8. Chong S., Xu M.Q.: Protein splicing of the Saccharomyces cerevisiae VMA intein without the
endonuclease motifs. J. Biol. Chem. 272, 15587–15590 (1997)
9. Chute I.C., Hu Z., Liu X.Q.: A topA intein in Pyrococcus furiosus and its relatedness to the r-gyr
intein of Methanococcus jannaschii. Gene, 210, 85–92 (1998)
10. Chute I.S.: Studies on the structure and evolution of inteins in the Porphyra purpurea DnaB and
Pyrococcus furiosus Top A proteins. MS thesis. Dalhousie Univ Can.
11. Cooper A.A., Stevens T.H.: Protein splicing: self-splicing of genetically mobile elements at the
protein level. Trends Biochem. 20, 351–356 (1995)
12. Cooper A.A., Chen Y.J., Lindorfer M.A., Stevens T.H.: Protein splicing of the yeast TFP1 intervening protein sequence: a model for self-excision. EMBO J. 12, 2575–2583 (1993)
13. Cotton G.J., Ayers B., Xu R., Muir T.W.: Insertion of a synthetic peptide into a recombinant
protein framework:a protein biosensor. J. Am. Chem. Soc. 121, 1100–1101 (1999)
14. Dalgaard J.Z., Banerjee M., Curcio M.J.: A novel Ty1-mediated fragmentation method for native
and artificial yeast chromosomes reveals that the mouse steel gene is a hotspot for Ty1 integration. Genetics, 143, 673–683 (1996)
15. Dalgaard J.Z., Klar A.J., Moser M.J., Holley W.R., Chatterjee A., Mian I.S.: Statistical modeling
and analysis of the LAGLIDADG family of site-specific endonucleases and identification of
an intein that encodes a site-specific endonuclease of the HNH family. Nucleic Acids Res. 25,
4626–4638 (1997)
16. Dalgaard J.Z., Moser M.J., Hughey R., Mian I.S.: Statistical modeling, phylogenetic analysis and
structure prediction of a protein splicing domain common to inteins and hedgehog proteins.
J. Comput. Biol. 4, 193–214 (1997)
17. Derbyshire V., Belfort M.: Lightning strikes twice: intron-intein coincidence. Proc. Natl. Acad.
Sci.USA, 95, 1356–1357 (1998)
18. Duan X., Gimble F.S., Quiocho F.A.: Crystal structure of PI-SceI, a homing endonuclease with
protein splicing activity. Cell, 89, 555–564 (1997)
19. Dujon B.: Group I introns as mobile genetic elements: facts and mechanistic speculations
– a review. Gene, 82, 91–114 (1989)
20. Evans Jr.,T.C., Benner J., Xu M.Q.: The in vitro ligation of bacterially expressed proteins using
an intein from Methanobacterium thermoautotrophicum. J. Biol. Chem. 274, 3923–3926 (1999)
21. Evans Jr.,T.C., Martin D., Kolly R., Panne D., Sun L., Ghosh I., Chen L., Benner J., Liu X.Q.,
Xu M.Q.: Protein trans-splicing and cyclization by a naturally split intein from the dnaE gene of
Synechocystis species PCC6803. J. Biol. Chem. 275, 9091–9094 (2000)
22. Evans Jr.,T.C., Benner J., Xu M.Q.: Semisynthesis of cytotoxic proteins using a modified protein
splicing element. Protein Sci. 7, 2256–2264 (1998)
73
23. Evans Jr.,T.C., Benner J., Xu M.Q.: The cyclization and polymerization of bacterially expressed
proteins using modified self-splicing inteins. J. Biol. Chem. 274, 18359–18363 (1999)
24. Favre D., Viret J.F.: Versatile cosmid vectors for facilitated analysis and subcloning of the insert.
Gene, 178, 43–49 (1996)
25. Fsihi H., Vincent V., Cole S.T.: Homing events in the gyrA gene of some mycobacteria. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 93, 3410–5 (1996)
26. Gimble F.S., Thorner J.: Homing of a DNA endonuclease gene by meiotic gene conversion in
Saccharomyces cerevisiae. Nature, 357, 301–306 (1992)
27. Goddard M.R., Burt A.: Recurrent invasion and extinction of a selfish gene. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 96, 13880–13885 (1999)
28. Gogarten J.P., Senejani A.G., Zhaxybayeva O., Olendzenski L., Hilario E.: Inteins: structure, function, and evolution. Annu. Rev. Microbiol. 56, 263–287 (2002)
29. Gorbalenya A.E.: Non-canonical inteins. Nucleic Acids Res. 26, 1741–1748 (1998)
30. Hall T.M., Porter J.A., Young K.E., Koonin E.V., Beachy P.A., Leahy D.J.: Crystal structure of
a Hedgehog autoprocessing domain: homology between Hedgehog and self-splicing proteins.
Cell, 91, 85–97 (1997)
31. Jurica M.S., Stoddard B.L.: Homing endonucleases: structure, function and evolution. Cell. Mol.
Life Sci. 55, 1304–1326 (1999)
32. Kane P.M., Yamashiro C.T., Wolczyk D.F., Neff N., Goebl M., Stevens T.H.: Protein splicing
converts the yeast TFP1 gene product to the 69-kD subunit of the vacuolar H(+)-adenosine triphosphatase. Science, 250, 651–657 (1990)
33. Kawarabayasi Y., Sawada M., Horikawa H., Haikawa Y., Hino Y., Yamamoto S., Sekine M., Baba
S., Kosugi H., Hosoyama A., Nagai Y., Sakai M., Ogura K., Otsuka R., Nakazawa H., Takamiya
M., Ohfuku Y., Funahashi T., Tanaka T., Kudoh Y., Yamazaki J., Kushida N., Oguchi A., Aoki K.,
Kikuchi H.: Complete sequence and gene organization of the genome of a hyper-thermophilic
archaebacterium, Pyrococcus horikoshii OT3. DNA Res. 5, 55–76 (1998)
34. Kawasaki M., Nogami S., Satow Y., Ohya Y., Anraku Y.: Identification of three core regions
essential for protein splicing of the yeast Vma1 protozyme. A random mutagenesis study of the
entire Vma1-derived endonuclease sequence. J. Biol. Chem. 272, 15668–15674 (1997)
35. Komori K., Fujita N., Ichiyanagi K., Shinagawa H., Morikawa K., Ishino Y.: PI-PfuI and
PI-PfuII, intein-coded homing endonucleases from Pyrococcus furiosus. I. Purification and identification of the homing-type endonuclease activities. Nucleic Acids Res. 27, 4167–4174 (1999)
36. Lambowitz A.M., Belfort M.: Introns as mobile genetic elements. Annu. Rev. Biochem. 62,
587–622, (1993)
37. Lazarevic V., Soldo B., Dusterhoft A., Hilbert H., Mauel C., Karamata D.: Introns and intein
coding sequence in the ribonucleotide reductase genes of Bacillus subtilis temperate bacteriophage
SPbeta. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1692–1697 (1998)
38. Liu S.L., Sanderson K.E.: Highly plastic chromosomal organization in Salmonella typhi. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 93, 10303–10308 (1996)
39. Liu X.Q., Hu Z.: A DnaB intein in Rhodothermus marinus: indication of recent intein homing
across remotely related organisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 7851–7856 (1997)
40. Liu X.Q.: Protein-splicing intein: Genetic mobility, origin, and evolution. Annu. Rev. Genet. 34,
61–76 (2000)
41. Mahillon J., Rode C.K., Leonard C., Bloch C.A.: New ultrarare restriction site-carrying transposons for bacterial genomics. Gene, 187, 273–279 (1997)
42. Martin D.D., Xu M.Q., Evans Jr.,T.C.: Characterization of a naturally occurring trans-splicing
intein from Synechocystis sp. PCC6803. Biochemistry. 40, 1393–1402 (2001)
43. Mathys S., Evans Jr., T.C., Chute I.C., Wu H., Chong S., Benner J., Liu X.Q., Xu M.Q.: Characterization of a self-splicing mini-intein and its conversion into autocatalytic N- and C-terminal
cleavage elements: facile production of protein building blocks for protein ligation. Gene, 231,
1–13 (1999)
74
44. Mills K.V., Lew B.M., Jiang S., Paulus H.: Protein splicing in trans by purified N- and C-terminal
fragments of the Mycobacterium tuberculosis RecA intein. Proc. Natl. Acad. Sci .USA, 95, 3543–
3548 (1998)
45. Muir T.W., Sondhi D., Cole P.A.: Expressed protein ligation: a general method for protein engineering. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 95, 6705–6710 (1998)
46. Nishioka M., Fujiwara S., Takagi M., Imanaka T.: Characterization of two intein homing endonucleases encoded in the DNA polymerase gene of Pyrococcus kodakaraensis strain KOD1. Nucleic Acids Res. 26, 4409–4412 (1998)
47. Paulus H.: Protein splicing and related forms of protein autoprocessing. Annu. Rev.Biochem. 69,
447–496 (2000)
48. Perler F.B., Davis E.O., Dean G.E., Gimble F.S., Jack W.E., Neff N., Noren C.J., Thorner J.,
Belfort M.: Protein splicing elements: inteins and exteins—a definition of terms and recommended nomenclature. Nucleic Acids Res. 22, 1125–1127 (1994)
49. Perler F.B., Olsen G.J., Adam E.: Compilation and analysis of intein sequences. Nucleic Acids
Res. 25, 1087–1093 (1997)
50. Perler F.B.: A natural example of protein trans-splicing. Trends Biochem. 24, 209–211 (1999)
51. Perler F.B.: InBase, the Intein Database. Nucleic Acids Res. 30, 383–384 (2002)
52. Pietrokovski S.: Conserved sequence features of inteins (protein introns) and their use in identifying new inteins and related proteins. Protein Sci. 3, 2340–2350 (1994)
53. Pietrokovski S.: Identification of a virus intein and a possible variation in the protein-splicing
reaction. Curr. Biol. 8, R634–5 (1998)
54. Pietrokovski S.: Intein spread and extinction in evolution. Trends Genet. 17, 465–472 (2001)
55. Pietrokovski S.: Modular organization of inteins and C-terminal autocatalytic domains. Protein
Sci. 7, 64–71 (1998)
56. Pietrokovski S.: Inteins = protein introns. http://bioinfo.-eizmann.ac.il/~pietro/inteins/ (29 PaŸdziernika 2003)
57. Pingoud A., Jeltsch A.: Recognition and cleavage of DNA by type-II restriction endonucleases.
Eur. J. Biochem. 246, 1–22 (1997)
58. Roberts R.J., Macelis D.: REBASE-restriction enzymes and methylases. Nucleic Acids Res. 25,
248–262 (1997)
59. Saves I., Eleaume H., Dietrich J., Masson J.M.: The thy pol-2 intein of Thermococcus hydrothermalis is an isoschizomer of PI-TliI and PI-TfuII endonucleases. Nucleic Acids Res. 28, 4391–
4396 (2000)
60. Saves I., Ozanne V., Dietrich J., Masson J.M.: Inteins of Thermococcus fumicolans DNA polymerase are endonucleases with distinct enzymatic behaviors. J. Biol. Chem. 275, 2335–2341 (2000)
61. Saves I., Westrelin F., Daffe M., Masson J.M.: Identification of the first eubacterial endonuclease
coded by an intein allele in the pps1 gene of mycobacteria. Nucleic Acids Res. 29, 4310–4318 (2001)
62. Senejani A.G., Hilario E., Gogarten J.P.: The intein of the Thermoplasma A-ATPase A subunit:
structure, evolution and expression in E. coli. BMC Biochem. 2, 13 (2001)
63. Severinov K., Muir T.W.: Expressed protein ligation, a novel method for studying protein-protein
interactions in transcription. J. Biol. Chem. 273, 16205–16209 (1998)
64. Southworth M.W., Adam E., Panne D., Byer R., Kautz R., Perler F.B.: Control of protein splicing
by intein fragment reassembly. EMBO J. 17, 918–926 (1998)
65. Southworth M.W., Amaya K., Evans Jr., T.C., Xu M.Q., Perler F.B.: Purification of proteins fused
to either the amino or carboxy terminus of the Mycobacterium xenopi gyrase A intein. Biotechniques, 27, 110–4, 116, 118–120 (1999)
66. Telenti A., Southworth M., Alcaide F., Daugelat S., Jacobs Jr.,W.R., Perler F.B.: The Mycobacterium xenopi GyrA protein splicing element: characterization of a minimal intein. J. Bacteriol.
179, 6378–6382 (1997)
67. Toda T., Itaya M.: I-CeuI recognition sites in the rrn operons of the Bacillus subtilis 168 chromosome: inherent landmarks for genome analysis. Microbiology, 141, 1937–1945 (1995)
75
68. Waldo G.S., Standish B.M., Berendzen J., Terwilliger T.C.: Rapid protein-folding assay using
green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 17, 691–695 (1999)
69. Wallace C.J.: The curious case of protein splicing: mechanistic insights suggested by protein
semisynthesis. Protein Sci. 2, 697–705, (1993)
70. Wider G., Wuthrich K.: NMR spectroscopy of large molecules and multimolecular assemblies in
solution. Curr .Opin. Struct. Biol. 9, 594–601 (1999)
71. Wilson G.G.: Cloned restriction-modification systems – a review. Gene, 74, 281–289 (1988)
72. Wu H., Hu Z., Liu X.Q.: Protein trans-splicing by a split intein encoded in a split DnaE gene of
Synechocystis sp. PCC6803. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 9226–9231 (1998)
73. Wu H., Xu M.Q., Liu X.Q.: Protein trans-splicing and functional mini-inteins of a cyanobacterial
dnaB intein. Biochim. Biophys. Acta, 1387, 422–432 (1998)
74. Xu M.Q., Paulus H., Chong S.: Fusions to self-splicing inteins for protein purification. Methods
Enzymol. 326, 376–418 (2000)
75. Xu M.Q., Perler F.B.: The mechanism of protein splicing and its modulation by mutation. EMBO
J. 15, 5146–5153 (1996)
76. Xu R., Ayers B., Cowburn D., Muir T.W.: Chemical ligation of folded recombinant proteins: segmental isotopic labeling of domains for NMR studies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 388–393,
(1999)
77. Zhang A., Gonzalez S.M., Cantor E.J., Chong S.: Construction of a mini-intein fusion system to
allow both direct monitoring of soluble protein expression and rapid purification of target proteins. Gene, 275, 241–252 (2001)
Zak³ad Genetyki Drobnoustrojów, Instytut Mikrobiologii i Immunologii U£
ul. Banacha 12/16, 90-237 £ódŸ, tel. 042/6354466, e-mail: [email protected]
Wp³ynê³o w listopadzie 2003 r.
76
POST. MIKROBIOL.,
2004, 43, 1, 77–79
http://www.pm.microbiology.pl
Uroczystoœæ poœwiêcona pamiêci
prof. dr hab. Bernarda Zab³ockiego
w pierwsz¹ rocznicê œmierci
W dniu 7 paŸdziernika 2003 roku odby³a siê na Uniwersytecie £ódzkim uroczystoœæ ods³oniêcia tablicy pami¹tkowej i nadania imienia Profesora Bernarda
Zab³ockiego Gmachowi Biologii U£. W programie spotkania zaplanowano równie¿
sesjê naukow¹ poœwiêcon¹ œp. Profesorowi. Uroczystoœæ pod patronatem Oddzia³ów £ódzkich, Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów, Polskiego Towarzystwa
Immunologii Doœwiadczalnej i Klinicznej, zorganizowa³a Katedra Immunologii
i Biologii lnfekcyjnej Instytutu Mikrobiologii i Immunologii U£. Komitetowi Organizacyjnemu przewodzi³a pani prof. dr hab. Teresa Goœcicka, która po otwarciu sesji
przez Dziekana Wydzia³u BiOŒ prof. dr hab. Antoniego Ró¿alskiego – w wyst¹pieniu zatytu³owanym „Profesor Bernard Zab³ocki, jego ¿ycie i twórczoœæ”– przedstawi³a sylwetkê naukow¹ zmar³ego Profesora. Wiêcej informacji o Profesorze czytelnicy Postêpów Mikrobiologii mog¹ znaleŸæ w dwu publikacjach prof. T. Goœcickiej:
Profesor Bernard Zab³ocki, 1.01.1907–14.03.2002. Post. Mikrobiol. 41, 3, 231–233
(w formie elektronicznej na stronie http:www.pm.microbiology.pl) oraz obszerniejszej biografii ³¹cznie z bibliografi¹ prac Profesora pt. Profesor Bernard Zab³ocki
zamieszczonej w Zeszycie 61, Sylwetki £ódzkich Uczonych, red. E. Karasiñski,
T. Goœcicka, Wydawnictwo £ódzkiego Towarzystwa Naukowego 2002.
Oddaj¹c ho³d Zmar³emu Profesorowi Redakcja Postêpów Mikrobiologii postanowi³a opublikowaæ nades³ane do odczytania w trakcie Sesji Wspomnienie doc.
dr hab. Gustawa Kerszmana o prof. B. Zab³ockim. Doc.dr hab. Kerszman by³
jednym z najbli¿szych wspó³pracowników zmar³ego Profesora. Drukujemy równie¿
dwa artyku³y pañ prof. Danuty Dzier¿anowskiej (przewodnicz¹cej ZG PTM, Centrum
Zdrowia Dziecka, Warszawa) oraz Wies³awy Rudnickiej (Instytut Mikrobiologii
i Immunologii U£). Oba artyku³y dedykowane Profesorowi B. Zab³ockiemu s¹ zmodyfikowan¹ form¹ referatów wyg³oszonych w trakcie Sesji Naukowej.
Jerzy Hrebenda
Redaktor Postêpów Mikrobiologii
77
Profesor Bernard Zab³ocki
1.01.1907 – 14.03.2002
Wspomnienie o Profesorze Bernardzie Zab³ockim
nades³ane przez
p. doc. dr hab. Gustawa Kerszmana
Nie mog¹c niestety przybyæ na uroczystoœæ poœwiêcon¹ Profesorowi Bernardowi
Zab³ockiemu pragnê jako uczeñ i dawny wspó³pracownik przynajmniej t¹ drog¹
oddaæ gor¹cy ho³d pamiêci mojego drogiego nauczyciela.
Profesor zas³uguje na serdeczn¹ i wdziêczn¹ pamiêæ nie tylko jako wybitny uczony, nauczyciel i organizator, lecz tak¿e jako dobry, ¿yczliwy i prostolinijny cz³owiek.
My, jego wspó³pracownicy, zawsze mogliœmy liczyæ na ¿yczliwoœæ i pomoc.
Profesor dba³ o nasz rozwój naukowy i o awanse oraz stwarza³ swoim pracownikom mo¿liwie najlepsze warunki oraz szanse rozwijania w³asnych zainteresowañ
– osobiœcie z wdziêcznoœci¹ wspominam fakt, ¿e mog³em zaj¹æ siê pod Jego kierunkiem bakteriofagami oraz genetyk¹ bakterii i wyspecjalizowaæ siê w tych dziedzinach, chocia¿ nie le¿a³y one w centrum zainteresowañ Kierownika Katedry.
Plon doktoratów i habilitacji przeprowadzonych pod kierunkiem Profesora dostarcza³ Mu wielkiej satysfakcji.
78
W stosunkach ze wspó³pracownikami i studentami Profesor by³ prosty i bezpoœredni. Tak jedni jak i drudzy nie tylko szanowali, lecz tak¿e bardzo lubili Profesora.
Niektóre roczniki urz¹dza³y po uzyskaniu dyplomów wieczory po¿egnalne. Pamiêtam jak na jednym z nich odœpiewano popularn¹ wtedy piosenkê: T¹ piosenk¹ Ciê
¿egnamy profesorze,
Ale jest nam smutno co tu kryæ.
Profesor Zab³ocki by³ wyraŸnie wzruszony. Smutno jest teraz uœwiadomiæ sobie,
¿e moje osobiste a póŸniej korespondencyjne, serdeczne kontakty z Profesorem
ju¿ nale¿¹ do przesz³oœci. Wieczna i ciep³a pamiêæ o Nauczycielu towarzyszyæ mi
bêdzie do koñca moich dni.
Pragn¹³bym wyraziæ w tym miejscu wielkie uznanie profesor Teresie Goœcickiej
oraz w³adzom wydzia³u i uczelni za piêkn¹ inicjatywê uczczenia zas³ug Profesora.
Pewien jestem, ¿e liczne grono by³ych studentów i wspó³pracowników zawsze
wspominaæ Go bêdzie serdecznie i z szacunkiem, mam nadziejê, ¿e Uniwersytet
£ódzki, który tak bardzo du¿o Profesorowi Zab³ockiemu zawdziêcza, pamiêtaæ
o Nim bêdzie jako o jednej ze swoich najbardziej zas³u¿onych postaci.
Gustaw Kerszman
l Lekooporne patogeny w zaka¿eniach szpitalnych – D. Dzier¿anowska
l Molekularne podstawy opornoœci na gruŸlicê – W. Rudnicka
79
POST. MIKROBIOL.,
2004, 43, 1, 81–105
http://www.pm.microbiology.pl
LEKOOPORNE DROBNOUSTROJE
W ZAKA¯ENIACH SZPITALNYCH
Danuta Dzier¿anowska, Alicja Pawiñska,
Wanda Kamiñska, Jan Patzer
Antimicrobial resistant pathogenes in nosocomial infections
Abstract: The article discusses the etiology of hospital infections focusing on spread of antimicrobial-resistant pathogens, and it describes the most important mechanisms of biochemical and genetic
resistance among hospital isolates.
Stosowanie przez ponad pó³ wieku antybiotyków i chemioterapeutyków w terapii zaka¿eñ bakteryjnych u pacjentów hospitalizowanych doprowadzi³o w warunkach szpitalnych do selekcji szczepów opornych. Najwiêcej problemów terapeutycznych, z którymi konfrontuje siê na codzieñ lekarz w szpitalu stwarzaj¹ zaka¿enia
wywo³ywane przez, metycylinooporne szczepy gronkowca z³ocistego i skórnego,
enterokoki oporne na wiele antybiotyków, w tym na antybiotyki glikopeptydowe
oraz wielooporne szczepy pa³eczek Gram-ujemnych zarówno ferementuj¹ce jak
i szczepy niefermentuj¹ce.
Gronkowce z³ociste s¹ odpowiedzialne za zaka¿enia szpitalne przede wszystkim
u chorych w oddzia³ach zabiegowych. Epidemiczny charakter tych drobnoustrojów
i zdolnoœæ do przetrwania poza organizmem ¿ywym przez wiele dni – na powierzchniach sprzêtów i aparatury medycznej sprawia, ze czêsto wywo³uj¹ one szpitalne
epidemie obejmuj¹ce kilka oddzia³ów. Pierwszy, wprowadzony na rynek antybiotyk, penicylina stosowany by³ w pocz¹tkowym okresie przede wszystkim w leczeniu ran zaka¿onych przez gronkowce. Szybko narastaj¹ca opornoœæ na penicylinê
zmobilizowa³a naukowców do stworzenia nowej, syntetycznej penicyliny, metycyliny, opornej na destrukcyjne dzia³anie penicylinazy gronkowcowej. I chocia¿ ju¿
po roku stosowania tego antybiotyku pojawi³y siê pierwsze doniesienia o wykryciu
szczepów opornych na metycylinê (MRSA), to do koñca lat 70-tych XX wieku
udzia³ MRSA w zaka¿eniach szpitalnych nie przekroczy³ kilku procent [54, 74].
Wprowadzenie w latach 80-tych do lecznictwa cefalosporyn by³o przyczyn¹ du¿ych
zmian w etiologii zaka¿eñ szpitalnych. Znacz¹co zmala³a rola pa³eczek Gramujemnych, podczas, gdy wzros³a liczba zaka¿eñ wywo³ywanych przez ziarenkowce.
Istotn¹ rolê w zaka¿eniach zaczê³y odgrywaæ enterokoki i gronkowce koagulazoujemne, które do tej pory uwa¿ano za drobnoustroje saprofityczne, sporadycznie
odpowiedzialne za zaka¿enia [101]. W bardzo szybkim tempie zaczê³a rosn¹æ liczba
S³owa kluczowe: MRSA, CNSMR, VISA, VRE, ES$L, metalo-$-laktamazy
Key words:
MRSA, CNSMR, VISA, VRE, ES$L, metallo-$-laktamases
81
zaka¿eñ szpitalnych wywo³ywanych przez MRSA. W 1994 roku czêstoœæ wystêpowania zaka¿eñ o tej etiologii w krajach europejskich by³a zró¿nicowana i wynosi³a
ponad 30% w Hiszpanii, Francji i we W³oszech i mniej ni¿ 1% w krajach skandynawskich [54]. Szczepy MRSA wykrywane w Holandii pochodzi³y najczêœciej od
obcokrajowców, a czêstoœæ zaka¿eñ o tej etiologii wynosi³a 2% [38]. Alarmuj¹co
wysoki udzia³ MRSA w zaka¿eniach notowany by³ w szpitalach w Hong Kongu
i w Japonii (40–60%) [54, 60]. Analiza danych amerykañskich, pochodz¹cych
z programu Narodowego Nadzoru nad Zaka¿eniami Szpitalnymi (NNIS) wykaza³a,
i¿ stale, z roku na rok roœnie liczba szpitalnych zaka¿eñ wywo³ywanych przez
MRSA [54]. W 1975 roku ich udzia³ w etiologii zaka¿eñ szpitalnych w USA wynosi³ 2,4%, w 1991 roku 29%, a w 1996 roku 35%. W wielu szpitalach sta³y siê
flor¹ endemiczn¹, szczególnie w oddzia³ach intensywnej terapii. Wykazano tak¿e,
¿e te same klony wystêpowa³y w ró¿nych szpitalach. Coraz czêœciej izolowane by³y
od pacjentów ambulatoryjnych oraz od rezydentów w pozaszpitalnych oœrodkach
opieki. Zaka¿enia wywo³ywane przez gronkowce oporne na metycylinê sta³y siê
powa¿nym problem epidemiologicznym i klinicznym, gdy¿ czêsto by³y to szczepy
oporne na wiêkszoœæ dostêpnych antybiotyków [74, 101].
Przez ponad 30 lat gronkowce pozostawa³y wra¿liwe na wankomycynê. Jednak
bardzo szerokie stosowanie tego antybiotyku doprowadzi³o do narastania opornoœci
na glikopeptydy [39, 87]. Jako pierwsze opornoœæ na glikopeptydy wyselekcjonowa³y gronkowce koagulazo-ujemne [9, 89]. Od koñca lat 80-tych wykrywane by³y
oporne Staphylococcus haemolyticus i S. epidermidis, przy czym znacznie czêœciej
wœród gronkowców koagulazo-ujemnych spotykana by³a opornoœæ na teikoplaninê
ni¿ na wankomycynê [9, 49]. W 1996 roku pojawi³a siê informacja o pierwszym,
udokumentowanym klinicznie zaka¿eniu wywo³anym przez Staphylococcus aureus
o obni¿onej wra¿liwoœci na wankomycynê, VISA [39]. W maju tego roku, w szpitalu uniwersyteckim w Tokio szczep VISA zosta³ wyizolowany z materia³u ropnego od 4-miesiêcznego niemowlêcia po zabiegu kardiochirurgicznym. Pojawienie
siê VISA poprzedzi³o zaka¿enie wywo³ane przez MRSA w miejscu operowanym
i 41-dniowa kuracja wankomycyn¹. Wkrótce po opublikowaniu przez H i r a m a t s u
analizy pierwszego przypadku zaka¿enie VISA i opracowaniu metody wykrywania
szczepów o obni¿onej wra¿liwoœci na wankomycynê zaczê³y nap³ywaæ z ró¿nych
krajów informacje o wykrywaniu kolejnych przypadków zaka¿eñ szczepami VISA
[38, 60, 87, 95], w tym tak¿e w Polsce [46]. Zespó³ naukowców pracuj¹cy pod
kierownictwem dr H i r a m a t s u wyjaœni³ istotê zjawiska narastania opornoœci na
glikopeptydy u S. aureus [39]. Wbrew wczeœniejszym obawom nie by³o to zwi¹zane
z przeniesieniem genu opornoœci od enterokoków, lecz znacznym zwiêkszeniem gruboœci œciany komórkowej. Szczepy VISA wytwarzaj¹ znacznie wiêksz¹ iloœæ prekursorów peptoglikanu przez co ich œciana komórkowa jest blisko 3-krotnie grubsza
ni¿ u gronkowców wra¿liwych na wankomycynê. Szczepy VISA klinicznie s¹ oporne
na wankomycynê, poniewa¿ antybiotyk ten Ÿle penetruje do tkanek i czêsto nie
osi¹ga stê¿enia terapeutycznego w ognisku zaka¿enia [101]. Dlatego niezwykle wa¿ne jest wykrywanie tych szczepów przy zastosowaniu metod zalecanych przez CDC
(Center for Diseases Control and Prevention) [17]. Nie jest mo¿liwe wykrycie szcze82
pów VISA przy zastosowaniu metod automatycznych (za wyj¹tkiem systemu Vitek,
wersji 7,01 bioMerieux) [81]. Zawodna bywa tak¿e metoda kr¹¿kowa. Zalecane
przez CDC jest wysiewanie zawiesiny (0,5 McF) badanego szczepu gronkowca na
pod³o¿e BHI zawieraj¹ce wankomycynê w stê¿eniu 6 mg/l. Je¿eli po 48-godzinnej
inkubacji w 35°C na pod³o¿u pojawi¹ siê kolonie gronkowców to nale¿y dok³adnie
oznaczyæ ich wra¿liwoœæ na wankomycynê okreœlaj¹c MIC metod¹ rozcieñczeñ
antybiotyku w pod³o¿u lub E-testów. W latach 90-tych XX wieku powa¿ne zaniepokojenie epidemiologów budzi³a gwa³townie rosn¹ca liczba zaka¿eñ wywo³ywanych
przez oporne na wankomycynê enterokoki. Istnia³o realne zagro¿enie, ¿e gen opornoœci, zlokalizowany na transpozonie zostanie przeniesiony do komórek gronkowców. Zjawisko to zaobserwowali N o b l e i wsp. w doœwiadczeniu, które przeprowadzili w 1992 roku [67]. Powodzeniem zakoñczy³a siê próba przeniesienia genu
opornoœci na wankomycynê od Enterococcus faecalisNCTC 12201 do S. aureus
(dziki szczep) i uzyskania hodowli wankomycyno-opornych gronkowców. Wydawa³o siê, i¿ wkrótce zjawisko to bêdzie spontanicznie zachodziæ w naturalnym œrodowisku (w organizmie cz³owieka). Niektórzy naukowcy podchodzili sceptycznie
do tych prognoz uwa¿aj¹c, i¿ odtworzenie w œrodowisku naturalnym warunków,
które wystêpowa³y w doœwiadczeniu jest trudne lub niemo¿liwe [21], bowiem gronkowce i enterokoki zasiedlaj¹ ró¿ne nisze ekologiczne i wywo³uj¹ zasadniczo ró¿ne
zaka¿enia. Najprawdopodobniej z tych powodów dopiero 10 lat po doœwiadczalnym
przeniesieniu genu opornoœci na wankomycynê do komórek gronkowców zjawisko
to przybra³o kliniczn¹ postaæ zaka¿enia. Doniesienie o pierwszym, ca³kowicie opornym na wankomycynê S. aureus pochodzi³o ze Stanów Zjednoczonych [18]. By³ to
gronkowiec wyizolowany z miejsca wk³ucia cewnika centralnego od pacjentki dializowanej, chorej na cukrzycê. Od zg³oszenia drugiego przypadku zaka¿enia VRSA
(równie¿ w USA) minê³o ju¿ blisko 2 lata i s¹ to, jak dot¹d jedyne wykryte na
œwiecie zaka¿enia o tej etiologii.
Charakterystyczn¹ cech¹ szczepów VISA i VRSA jest opornoœæ na metycylinê
– wszystkie te szczepy pochodz¹ od metycylino-opornych gronkowców z³ocistych
[18, 74, 88]. Zatem najwiêksze ryzyko wyselekcjonowania gronkowców opornych
na wankomycynê wystêpuje w szpitalach z wysokim odsetkiem zaka¿eñ MRSA.
Zagro¿enie pojawienia siê VRSA jest tak¿e zwi¹zane z obecnoœci¹ w œrodowisku
szpitala opornych na wankomycynê enterokoków. Zaskakuj¹ce wyniki przynios³o
doœwiadczenie przeprowadzone przez Holenderskich naukowców na grupie szczepów MRSA. Celem badañ by³o oznaczenie wra¿liwoœci gronkowców na linezolid
i porównanie z wra¿liwoœci¹ na inne antybiotyki. Okaza³o siê, ¿e spoœród 15 testowanych szczepów MRSA a¿ 12 by³o hetero-opornych na wankomycynê. Mniejszym zaskoczeniem by³ fakt, ¿e ¿aden z tych szczepów nie pochodzi³ od Holendra.
Trzy szczepy wyizolowane zosta³y od Turków, 3 od W³ochów, 2 od Francuzów,
2 od Greków, 1 u Niemca i jeden od mieszkañca Wybrze¿a Koœci S³oniowej. By³y
to pierwsze, opisane przypadki wykrycia opornych gronkowców z³ocistych od obywateli Turcji, gdy¿ wczeœniej nie by³o ¿adnego sygna³u o narastaniu opornoœci na
wankomycynê w ich macierzystym kraju. Wszystkie, wykryte do tej pory szczepy
S. aureus o obni¿onej wra¿liwoœci lub oporne na wankomycynê by³y wra¿liwe na
83
Ta b e l a I
Najczêstsze czynniki etiologiczne sepsy odcewnikowej [69]
Patogen
Lata 1986–1989 (%) Lata 1992–1999 (%)
Gronkowce koagulazo-ujemne
27
37
Staphylococcus aureus
16
13
Enterococcus sp.
8
13
19
14
Escherichia coli
6
2
Enterobacter sp.
5
4
Pseudomonas aeruginosa
4
4
Klebsiella pneumoniae
4
4
Candida sp.
8
8
Pa³eczki Gram-ujemne
linezolid i w wiêkszoœci przypadków na pochodne pristynamycyny (chinupristynê/
dalfopristynê) oraz wykazywa³y zró¿nicowan¹ wra¿liwoœæ na inne antybiotyki
aktywne wobec ziarenkowców [38, 74, 100, 101]. Wankomycyna nadal pozostaje
antybiotykiem z wyboru w leczeniu zaka¿eñ o etiologii MRSA. Wa¿ne jest jednak
œcis³e przestrzeganie zaleceñ dotycz¹cych dawkowania, monitorowanie poziomu
antybiotyku we krwi i nie przed³u¿anie terapii, je¿eli jest ona nieskuteczna (nie
obserwuje siê efektu terapeutycznego) lub zaka¿enie zosta³o wyeliminowane.
Drugim, stale aktualnym wskazaniem do podawania wankomycyny jest wyst¹pienie
sepsy u chorego z cewnikiem naczyniowym. Czynnikiem etiologicznym tego zaka¿enia s¹ najczêœciej gronkowce koagulazo-ujemne. W ostatnich 20 latach maleje
udzia³ gronkowców z³ocistych w etiologii bakteriemii i sepsy szpitalnej. Roœnie
natomiast udzia³ gronkowców koagulazo-ujemnych.
Wiele jest przyczyn rosn¹cej z roku na rok chorobotwórczoœci gronkowców
koagulazo-ujemnych [25, 47, 75]. Do najwa¿niejszych nale¿¹: coraz czêstsze stosowanie cewników naczyniowych w diagnostyce i w terapii, sztucznych zastawek
serca, stymulatorów, defibrylatorów, implantów naczyniowych, drena¿y OUN,
protez ortopedycznych, a tak¿e zwiêkszaj¹ca siê liczba chorych z ró¿nego stopnia
zaburzeniami w uk³adzie odpornoœciowym. Gronkowce skórne, które przedosta³y
siê (zosta³y przeniesione) na powierzchniê implantowanych materia³ów przylegaj¹
do nich, namna¿aj¹ siê i wydzielaj¹ zewn¹trzkomórkowy œluz, który przykrywa
kolonie drobnoustrojów. Pod powierzchni¹ œluzu gronkowce tworz¹ wielowarstwow¹
strukturê, okreœlan¹ mianem biofilmu. Gronkowce koagulazo-ujemne s¹ z natury
drobnoustrojami ma³o inwazyjnymi. Zdolnoœæ kolonizowania tworzyw sztucznych
i tworzenie biofilmu uwa¿ane s¹ za najistotniejsze cechy zwi¹zane z ich patogennoœci¹. Zagro¿eniem dla pacjentów jest wysoka opornoœæ gronkowców koagulazoujemnych na antybiotyki. Niemal wszystkie szczepy (70–80%) wykrywane w œrodowisku szpitalnym s¹ oporne na metycylinê [75]. Wobec rosn¹cej opornoœci
gronkowców na wankomycynê problemem mo¿e staæ siê leczenie sepsy o etiologii
84
8
1
2
3
4
5
6
7
8
Rys. 1. Typowanie genetyczne gronkowców koagulazo-ujemnych wyizolowanych
z sekwencyjbych posiewów krwi od pacjentów IPCZD w 2001 roku
CNS (coagulase negative Staphylococcus), tym bardziej, ¿e nadal przy wyhodowaniu
tych drobnoustrojów z krwi interpretacja wyników posiewu budzi wiele w¹tpliwoœci. Gronkowce koagulazo-ujemne stanowi¹ najczêstsze zanieczyszczenie materia³ów pobieranych do badañ mikrobiologicznych, szczególnie wówczas, kiedy istnieje
ryzyko kontaktu materia³u z flor¹ skórn¹. Badania genetyczne wykaza³y, ¿e nawet
wielokrotne wyhodowanie gronkowców koagulazo-ujemnych z kolejnych posiewów
krwi nie zawsze œwiadczy o wykryciu czynnika etiologicznego sepsy [73]. Rys. 1
przedstawia typowanie genetyczne gronkowców koagulazo-ujemnych wyizolowanych
od 8 pacjentów z kilku kolejnych posiewów krwi. Analiza genetyczna potwierdzi³a
etiologiê gronkowcow¹ jedynie u pacjentów 4 i 5, natomiast u pozosta³ych pacjentów
z kolejnych posiewów krwi wyhodowane zosta³y ró¿ne drobnoustroje.
Wœród drobnoustrojów izolowanych z krwi pacjentów hospitalizowanych trzeci¹
pozycjê co do czêstoœci zajmuj¹ ziarenkowce z rodzaju Enterococcus.
Drobnoustroje te przez d³ugi czas by³y pomijane jako ewentualne patogeny szpitalne z uwagi na ich niewielk¹ chorobotwórczoœæ. Najczêœciej by³y czynnikiem etiologicznym pozaszpitalnego, podostrego zapalenia wsierdzia u starszych mê¿czyzn,
zwi¹zanego z zapaleniem dróg moczowo-p³ciowych. Znaczenie enterokoków
zaczê³o wzrastaæ w latach 80-tych ubieg³ego wieku, tj. wraz z udoskonaleniem
inwazyjnych metod diagnostycznych oraz masowego stosowania cefalosporyn
w szpitalu. Drobnoustroje te uplasowa³y siê te¿ na jednej z pierwszych pozycji pod
wzglêdem czêstoœci izolacji z niektórych materia³ów klinicznych, od pacjentów
z oddzia³ów intensywnej terapii i chirurgii. W latach 1986–88 enterokoki by³y
czwartym pod wzglêdem czêstoœci izolacji patogenem na oddzia³ach intensywnej terapii w USA; a drugim, bior¹c pod uwagê ca³y szpital (National Infection
85
Surveillance USA). Dane NNIS z 1999 roku wskazuj¹ na enterokoki jako drugi
najczêstszy czynnik etiologiczny zaka¿eñ krwi na OIT [66]. Wg danych europejskich, by³y one pi¹tym patogenem na OIT [97], a w Polsce w latach 1996–97 powodowa³y 8% zaka¿eñ szpitalnych. Obecnie enterokoki s¹ drugim, co do czêstoœci
wystêpowania patogenem szpitalnym, po E. coli, w USA i w Niemczech. S¹ te¿
drugim, po E. coli, drobnoustrojem izolowanym z moczu, chocia¿ najczêœciej
powoduj¹ bakteriomocz bezobjawowy [85]. Czêœciej wystêpuj¹ u pacjentów
przewlekle cewnikowanych (15% przypadków zum), u starszych mê¿czyzn towarzysz¹ stanom zapalnym prostaty, oraz u pacjentów z wadami anatomiczno-czynnoœciowymi uk³adu moczowego, z bardzo zró¿nicowan¹ manifestacj¹ kliniczn¹, od bezobjawowej bakteriurii do ostrego odmiedniczkowego zapalenia nerek.
Enterokoki s¹ trzecim patogenem miejsc operowanych (surgery site) na oddzia³ach
zabiegowych [27, 97]. Najczêstszym Ÿród³em bakteriemii enterokokowej jest
cewnik ¿ylny lub centralny. Wyst¹pieniu bakteriemii enterokokowej sprzyja d³ugotrwa³e cewnikowanie dróg moczowych, choroba nowotworowa, oparzenia du¿ych
powierzchni cia³a, oraz ¿ywienie pozajelitowe [59]. Ten ostatni czynnik zwi¹zany
jest z jednej strony z obecnoœci¹ cewnika naczyniowego, a z drugiej, z upoœledzon¹
czynnoœci¹ jelit, przy której czêsto dochodzi do uszkodzenia nab³onka jelitowego
i translokacji flory jelitowej do krwi. Ka¿de uszkodzenie bariery œluzówki jelita
zwi¹zane jest z ryzykiem rozwoju bakteriemii; enterokoki czêsto towarzysz¹ pa³eczkom jelitowym. Uszkodzenie œluzówki jelita wystêpuje u pacjentów z nowotworami podczas radio- i chemioterapii; dodatkowym czynnikiem sprzyjaj¹cym
zaka¿eniom u tych pacjentów jest upoœledzenie odpornoœci. Inne grupy pacjentów
podwy¿szonego ryzyka wyst¹pienia bakteriemii enterokokowej to biorcy narz¹dów
i szpiku, diabetycy i inni chorzy przewlekle. Istotnym czynnikiem ryzyka, zw³aszcza zaka¿enia szczepem opornym na glikopeptydy, jest ponowna interwencja
chirurgiczna po przeszczepieniu w¹troby [24, 27]. Reoperacja wykonywana jest
u pacjentów poddawanych przewlek³ej antybiotykoterapii i immunosupresji. Enterokoki s¹ czêsto jedyn¹ tlenow¹ flor¹ jelitow¹ u tych pacjentów.
Czynnikiem ryzyka jest te¿ stosowanie antybiotyków: cefalosporyn III generacji,
aztreonamu, imipenemu, chinolonów, a nawet metronidazolu, który zwiêksza kolonizacjê enterokokow¹ jelita poprzez eradykacjê wielu gatunków flory beztlenowej
[24]. Czynnikami ryzyka, wymienianymi jako szczególnie sprzyjaj¹ce wyst¹pieniu
zaka¿enia szczepem wankomycyno-opornym, s¹: neutropenia, niewydolnoœæ nerek,
przed³u¿ona hospitalizacja, przeszczepy narz¹dów i szpiku oraz uprzednia antybiotykoterapia ze szczególnym uwzglêdnieniem terapii przeciwko beztlenowcom,
która powoduje nadmierny wzrost enterokoków w stosunku do innej flory jelitowej,
sprzyjaj¹cy selekcji szczepów opornych [52]. Predysponowani do zaka¿enia wankomycyno-opornym szczepem enterokoków s¹ pacjenci z enterocolitis o etiologii
C. difficile, leczeni doustnie wankomycyn¹. Czêste w przebiegu tego schorzenia uszkodzenie b³ony œluzowej jelita jest przyczyn¹ translokacji bakterii do krwiobiegu.
Wiele bakteriemii enterokokowych nie ma okreœlonego Ÿród³a. Jeœli pacjent nie
ma za³o¿onej linii naczyniowej, zaka¿enie wi¹zane jest z przewodem pokarmowym
(g³ównie pacjenci z neutropeni¹) lub drogami moczowo-p³ciowymi. Przebieg bak86
teriemii enterokokowej zwykle nie jest ciê¿ki, a jedynym objawem czêsto jest gor¹czka. Przewa¿nie nie wystêpuje wstrz¹s ani objawy wykrzepiania naczyniowego
[37]. Bakteriemia, której Ÿród³em s¹ bakterie jelitowe, ma zwykle charakter mieszany.
Zaobserwowano, ¿e odpowiedzialne za bakteriemie enterokoki wankomycyno-oporne w 80–90% przypadków wystêpuj¹ w monokulturze jako samodzielny czynnik
etiologiczny [37, 52]. Zjawiska tego nie nale¿y wi¹zaæ z wiêkszym potencja³em
chorobotwórczym szczepów wielo-opornych, lecz ze stanem klinicznym pacjentów,
u których antybiotykoterapia doprowadzi³a do wyselekcjonowania takich szczepów
i wyeliminowa³a inne bakterie jelitowe [30, 59, 64].
Najczêstsz¹ infekcj¹ enterokokow¹, znan¹ przed er¹ zaka¿eñ szpitalnych, jest
zapalenie wsierdzia. Enterokoki s¹ odpowiedzialne za 5–15% przypadków szpitalnego bakteryjnego endocarditis. Mo¿e siê ono rozwin¹æ po cewnikowaniu serca,
po zabiegach na otwartym sercu oraz po operacjach z zastosowaniem elementów
wszczepianych [62].
Kolejn¹ grup¹ zaka¿eñ szpitalnych z udzia³em enterokoków s¹ zaka¿enia w jamie brzusznej. S¹ to zawsze zaka¿enia mieszane, gdzie enterokoki towarzysz¹
pa³eczkom z rodziny Enterobacteriaceae lub beztlenowcom. Bakteriemia enterokokowa, bêd¹ca skutkiem takich zaka¿eñ, obarczona jest wysok¹ œmiertelnoœci¹. Mimo
braku czynników zjadliwoœci enterokoków, wykazano w badaniach eksperymentalnych synergizm dzia³ania patogennego enterokoków i bakterii beztlenowych,
oraz zwiêkszenie œmiertelnoœci, jeœli w zaka¿eniu bior¹ udzia³ enterokoki. Z drugiej
strony, niektórzy klinicyœci uwa¿aj¹, ¿e wiêkszoœæ ran chirurgicznych i zaka¿eñ
wewn¹trzbrzusznych, gdzie enterokoki s¹ kopatogenami, wystarczy w³aœciwie opracowaæ chirurgicznie i za³o¿yæ drena¿, pozostawiaj¹c bez leczenia skierowanego
przeciwko enterokokom [27].
Enterokokowe zaka¿enia skóry i tkanek miêkkich to równie¿ najczêœciej mieszane zaka¿enia ran chirurgicznych, stopy cukrzycowej oraz ran oparzeniowych.
Coraz czêœciej opisywane s¹ w literaturze enterokokowe zaka¿enia u noworodków, najczêœciej maj¹ce postaæ bakteriemii lub posocznicy z zajêciem opon mózgowo-rdzeniowych. Dotycz¹ przewa¿nie dzieci z nisk¹ mas¹ urodzeniow¹ i wczeœniaków poni¿ej 27 tygodnia ci¹¿y. Do najwiêkszych czynników ryzyka tych zaka¿eñ
nale¿¹ linie centralne oraz resekcja jelita.
Antybiotykami aktywnymi i najczêœciej stosowanymi w leczeniu zaka¿eñ enterokokowych s¹ penicyliny: ampicylina i amoksycylina, piperacylina, nastêpnie aminoglikozydy (zawsze stosowane razem z penicylinami), glikopeptydy, rifampicyna
i chinolony. Izolowane coraz czêœciej szczepy oporne na wysokie stê¿enia aminoglikozydów nie wykazuj¹ synergizmu z $-laktamami. Penicyliny mo¿na stosowaæ
same lub z inhibitorami, jeœli opornoœæ na $-laktamy jest zale¿na od wytwarzania
$-laktamaz. W Polsce i wielu krajach jest to problem marginalny. Mimo, ¿e chinolony maj¹ mniejsz¹ aktywnoœæ wobec enterokoków in vivo, ni¿ obserwowana in
vitro, wiele autorytetów zaleca terapiê zaka¿eñ szczepami opornymi na aminoglikozydy ampicylin¹ po³¹czon¹ z chinolonem.
Liczne szczepy enterokoków charakteryzuj¹ siê naturaln¹ opornoœci¹ na szereg
antybiotyków, tj. na $-laktamy (cefalosporyny i penicyliny oporne na penicylinazy),
87
na niskie stê¿enia aminoglikozydów, klindamycynê, fluorochinolony, trimetoprim
i sulfametoksazol. Enterokoki mog¹ nabyæ opornoœæ na wysokie stê¿enia $-laktamów (zale¿n¹ od bia³ek PBP lub $-laktamazy), na wysokie stê¿enia aminoglikozydów, glikopeptydy, tetracykliny, erytromycynê, fluorochinolony, ryfampicynê,
chloramfenicol i nitrofurantoinê.
W leczeniu ciê¿kich zaka¿eñ, jak endocarditis czy meningitis, niezbêdny jest
synergizm antybiotyku $-laktamowego lub glikopeptydowego, na które w stê¿eniach terapeutycznych enterokoki wykazuj¹ tolerancjê, z aminoglikozydem, antybiotykiem o dzia³aniu bakteriobójczym. W wiêkszoœci przypadków, aby uzyskaæ
efekt terapeutyczny, szczep nie mo¿e mieæ opornoœci wysokiego stopnia na ¿aden
ze stosowanych antybiotyków. Szczepy E. faecium s¹ przewa¿nie oporne na penicyliny, co jest zwi¹zane z obecnoœci¹ bia³ka b³onowego PBP5, które ma niskie powinowactwo do tej grupy antybiotyków. Podczas wykszta³cania opornoœci na wankomycynê nastêpuje jednoczeœnie shift genetyczny w stronê wysoko-cz¹steczkowych
bia³ek wi¹¿¹cych penicyliny (hmw-PBP) o wysokim powinowactwie do $-laktamów [3]. Zjawisko to t³umaczy synergizm podczas jednoczesnego stosowania wankomycyny i $-laktamów, obserwowany przy leczeniu zaka¿eñ szczepami wankomycyno-opornymi. Jednak nie w komórkach wszystkich szczepów proces ten
zachodzi; podczas leczenia selekcjonowane s¹ subpopulacje oporne na oba antybiotyki (ampicylinê i wankomycynê). Naturalna opornoœæ enterokoków na $-laktamy
zale¿y od iloœci wytwarzanego bia³ka PBP5. Liczne szczepy E. faecalis s¹ wra¿liwe
na ampicylinê przy wartoœci MIC= 1–8 mg/l, natomiast E. faecium, gatunek kilkakrotnie bardziej oporny na penicyliny ni¿ E. faecalis, charakteryzuje wartoœæ MIC
dla ampicyliny = 16–64 mg/l lub wy¿sza. Jest to stê¿enie niemo¿liwe do uzyskania
w organizmie cz³owieka [28].
Wra¿liwoœæ enterokoków na wankomycynê jest skutkiem zablokowania przez
cz¹steczkê antybiotyku jednego z wczesnych etapów syntezy œciany komórkowej
[5, 26, 53]. W normalnych warunkach syntezy peptydoglikanu, dwie cz¹steczki
D-alaniny s¹ ³¹czone przez enzym ligazê do formy dwupeptydu D-ala-D-ala,
który nastêpnie jest przy³¹czany do UDP-N-acetylomuramylotrójpeptydu, tworz¹c
UDP-N-acetylomuramylopiêciopeptyd. Zwi¹zek ten jest z kolei w³¹czany do rosn¹cego ³añcucha peptydoglikanu w procesie transglikozylacji, co umo¿liwia tworzenie
wi¹zañ krzy¿owych podczas transpeptydacji i zapewnia trwa³oœæ warstwy peptydoglikanu. Przy³¹czenie wankomycyny do jednostki prekursorowej, a dok³adnie do jej
koñca D-ala-D-ala UDP-N-acetylomuramylopiêciopeptydu blokuje etap do³¹czenia
jej do ³añcucha peptydoglikanu i powstawanie wi¹zañ krzy¿owych. Gdy szczep jest
oporny na glikopeptydy, cz¹steczka antybiotyku nie przy³¹cza siê do prekursora
i zachodz¹ dalsze etapy syntezy œciany. Opornoœæ zale¿na od zespo³u genów vanA
polega na syntezie zmienionego prekursora: zamiast dwupeptydu D-ala-D-ala powstaje dwupeptyd alaniny z mleczanem D-ala-D-lac. W zespole genów vanA gen
vanA koduje bia³ko VanA, które jest ligaz¹ o zmienionych preferencjach substratowych, wytwarzaj¹cym dwupeptyd D-ala-D-lac. Bia³ko VanH jest dehydrogenaz¹
D-hydroksykwasów, która wytwarza pulê D-mleczanu, potrzebnego do reakcji ligacji. Jest to enzym niezbêdny do nadania fenotypu opornoœci VanA, gdy¿ D-mlecza88
ny nie wystêpuj¹ naturalnie w cytoplazmie ani w œrodowisku bakterii. Bia³ko VanX
jest D,D-dwupeptydaz¹, pozbawion¹ aktywnoœci wobec dwupeptydu D-ala-D-lac.
Jednoczeœnie redukuje ona pulê powstaj¹cych w niewielkim stopniu naturalnych
dwupeptydów alaninowych, wytwarzanych przez funkcjonuj¹c¹ na pewnym poziomie naturaln¹ ligazê. Proces ten minimalizuje syntezê natywnego piêciopeptydu,
przez co zwiêksza poziom opornoœci. Ponadto w zespole genów vanA znajduj¹ siê
geny regulatorowe vanR i vanS, oraz geny koduj¹ce inne bia³ka funkcjonalne: VanY,
VanZ. Bia³ko VanS jest sensorem wykrywaj¹cym obecnoœæ wankomycyny, a raczej
pewnych wczesnych efektów dzia³ania antybiotyku na syntezê œciany. Sygnalizuje
ono bia³ku VanR, które jest regulatorem wykonawczym, decyduj¹cym o w³¹czeniu
syntezy bia³ek VanHAX, nadaj¹cych fenotyp opornoœci. Zmiana natywnego dwupeptydu alaninowego na dwupeptyd alaninowo-mleczanowy nie wp³ywa na jakoœæ
wi¹zañ krzy¿owych. Wynika to z syntezy wspomnianych powy¿ej wysoko-cz¹steczkowych bia³ek PBP, o wysokim powinowactwie do $-laktamów. Zespó³ genów nadaj¹cych fenotyp opornoœci VanA znajduje siê na transpozonie Tn 1546, który mo¿e
byæ przenoszony pomiêdzy szczepami; st¹d mo¿liwe jest zjawisko horyzontalnego
szerzenia siê opornoœci [6, 41]. Szczepy o tym fenotypie charakteryzuj¹ siê opornoœci¹ zarówno na wankomycynê, jak i teikoplaninê (MIC dla Va≥ 64, MIC dla
TEC ≥ 16). Opisano je pierwotnie u gatunków Enterococcus faecalis i E. faecium;
nastêpnie stwierdzono obecnoœæ genów vanA u szczepów E. gallinarum i E. casseliflavus. Powstanie tego fenotypu opornoœci jest indukowane przez aminoglikozydy,
tak¿e te stosowane jako dodatki do paszy, a tak¿e inne antybiotyki: bacytracynê,
polimyksynê B czy robenidynê, dodawan¹ do paszy przeciwko zaka¿eniom kokcidialnym. Zespó³ genów vanB, decyduj¹cych o powstaniu fenotypu VanB, pierwotnie wykryty u szczepów gatunków E. faecalis i E. faecium, równie¿ jest przenoszony na ruchomych elementach genetycznych: Tn 1547, Tn 5382. Kluczowym
enzymem jest ligaza o powinowactwie do dwupeptydu alaninowo-mleczanowego,
cechuj¹ca siê 76% homologi¹ z ligaz¹ VanA. Pozosta³e geny zespo³u oznaczono
analogicznie do genów zespo³u vanA: vanHB itd. Szczepy o tym fenotypie charakteryzuj¹ siê opornoœci¹ na wankomycynê (MIC 4 do ≥ 1000), przy zachowanej wra¿liwoœci na teikoplaninê (MIC ≥ 1). Oprócz ligazy, bia³kiem decyduj¹cym o poziomie opornoœci jest dwupeptydaza VanXB, która wytwarzaj¹c pulê D-mleczanow,
dostarcza substratów do reakcji ligacji. Szczepy nale¿¹ce do gatunków E. gallinarum, E. casseliflavus i E. flavescens o fenotypie VanC charakteryzuj¹ siê naturaln¹,
kodowana chromosomalnie, opornoœci¹ na wankomycynê (MIC=2–32), oraz wra¿liwoœci¹ na teikoplaninê (MIC ≥ 1). O opornoœci na niskim poziomie decyduje ligaza
VanC o powinowactwie do dwupeptydu D-ala-D-ser. Mniej istotne klinicznie fenotypy: VanD i VanE opisano u pojedynczych wyizolowanych szczepów [53].
Gdy szczep wankomycyno-oporny jest oporny na ampicylinê i ponadto na
wysokie stê¿enia aminoglikozydów, nie ma mo¿liwoœci terapii z uzyskaniem efektu
bakteriobójczego. W przypadku zaka¿eñ szczepem opornym na antybiotyki zalecane w konwencjonalnej terapii, nale¿y rozwa¿yæ zastosowanie innych preparatów:
z grupy tetracyklin, chloramfenikol, ryfampicynê, chinolony, lub, przy zaka¿eniu
uk³adu moczowego, nitrofurantoinê. Skuteczne s¹ nowe antybiotyki: oksazolidynony
89
– linezolid oraz preparat streptogramin, chinopristina z dalfopristin¹, aktywny tylko
wobec E. faecium [57]. Pojawi³y siê ju¿ szczepy oporne na streptograminy. Nosicielstwo ich u ludzi wzrasta pod wp³ywem presji selekcyjnej analogu wirginiamycyny,
dodawanej do paszy dla kurcz¹t.
Istniej¹ dwa typy opornoœci enterokoków na aminoglikozydy: opornoœæ œredniego stopnia, wynikaj¹ca z obni¿onej przepuszczalnoœci os³on komórkowych (MIC
dla streptomycyny =62–500 mg/l), oraz opornoœæ wysokiego stopnia, spowodowana mutacj¹ w miejscu dzia³ania antybiotyku na rybosomie lub wytwarzaniem enzymu modyfikuj¹cego cz¹steczkê antybiotyku (MIC dla streptomycyny ≥ 2000 mg/l).
Najpowszechniejszym enzymem modyfikuj¹cym u bakterii Gram-dodatnich jest
dwufunkcyjny enzym 2’’-fosfotransferaza-6’-acetylotransferaza. Wytwarzaj¹ce go
bakterie s¹ oporne na gentamycynê, która mo¿e s³u¿yæ jako marker opornoœci na
kolejne aminoglikozydy, jak: tobramycyna, netylmycyna, kanamycyna i amikacyna. Natomiast streptomycynê modyfikuje inny enzym, adenylotransferaza. Posiadaj¹ce go szczepy mog¹ pozostaæ wra¿liwe na gentamycynê.
W przypadku szczepów enterokoków wysoce opornych na aminoglikozydy
(HLAR) nie wystêpuje synergizm dzia³ania antybiotyków z tej grupy z penicylinami. U E. faecium wystêpuje kodowany chromosomalnie enzym AAC(6’)-1, nadaj¹cy opornoœæ na tobramycynê, netylmycynê, kanamycynê i amikacynê. Mimo,
¿e nie powoduje on wyst¹pienia fenotypu opornoœci wysokiego stopnia, jest odpowiedzialny za utratê synergizmu aminoglikozydów z antybiotykami – inhibitorami
œciany komórkowej.
Kolejn¹ grupê drobnoustrojów o znacz¹cej roli w zaka¿eniach szpitalnych stanowi¹ pa³eczki Gram-ujemne z rodziny Enterobacteriaceae tworz¹ce endogenn¹ florê
jelitow¹ cz³owieka, jak równie¿ drobnoustroje œrodowiskowe z rodzajów Pseudomonas i Acinetobacter. Warto pamiêtaæ, ¿e ich dominuj¹ca rola w zaka¿eniach szpitalnych przypada na lata 70-te ubieg³ego stulecia, kiedy to wprowadzona do terapii
metycylina spowodowa³a znamienny spadek zaka¿eñ gronkowcowych. Pojawienie
siê szczepów metycylinoopornych gronkowca, a tak¿e wprowadzenie nowych technik diagnostycznych i leczniczych (np. przeszczepy narz¹dów, szpiku, protezowanie zastawek, naczyñ i innych) doprowadzi³o do ponownego wzrostu zaka¿eñ ziarenkowcami Gram-dodatnimi w szpitalu. Pa³eczki Gram-ujemne ci¹gle s¹ istotnym
czynnikiem etiologicznym w zaka¿eniach p³uc u pacjentów na oddzia³ach intensywnej terapii, w zaka¿eniach wewn¹trzbrzusznych, a tak¿e w zaka¿eniach uk³adu
moczowego u pacjentów z oddzia³ów urologicznych. ród³em drobnoustrojów
Gram-ujemnych w zaka¿eniach szpitalnych jest flora endogenna przewodu pokarmowego pacjenta hospitalizowanego, wymieniona po kilku dniach pobytu w szpitalu na szczepy szpitalne oraz szczepy œrodowiskowe.
Szerokie i nie zawsze kontrolowane stosowanie antybiotyków u pacjentów hospitalizowanych doprowadzi³o do selekcji i zasiedlenia œrodowiska szpitalnego
szczepami bakterii Gram-ujemnych opornych na wiêkszoœæ, a czasem na wszystkie
dostêpne w terapii antybiotyki i chemioterapeutyki. Leczenie zaka¿eñ o etiologii
Gram-ujemne w warunkach szpitalnych jest powa¿nym problemem z uwagi na
wspomnian¹ lekoopornoœæ. Najwy¿sze odsetki szczepów opornych pa³eczek Gram90
ujemnych stwierdza siê w przypadku antybiotyków $-laktamowych i aminoglikozydów, chinolonów, TMP/SMX i nieco ni¿sze, jeœli chodzi o karbapenemy czy te¿
kolistynê. Ten ostatni antybiotyk stosowany jest tylko w przypadku szczepów
P. aeruginosa lub Acinetobacter baumanii opornych na wszystkie pozosta³e antybiotyki. Jednym z najczêstszych mechanizmów opornoœci pa³eczek Gram-ujemnych
na antybiotyki $-laktamowe jest zdolnoœæ syntezy enzymów hydrolizuj¹cych wi¹zanie amidowe C-N w cz¹steczce antybiotyku. Opornoœæ na antybiotyki $-laktamowe
rozwinê³a siê przed ich odkryciem, a pierwszy enzym zidentyfikowano u pa³eczek
E. coli przed wprowadzeniem do terapii penicyliny [1]. Uwa¿a siê, ¿e $-laktamazy
ewolucyjnie wywodz¹ siê z PBP (bia³ek wi¹¿¹cych penicyliny) zlokalizowanych
w b³onie protoplazmatycznej, pod wp³ywem selekcyjnej presji $-laktamów, wytwarzanych przez bakterie ziemne [31]. Wiele szczepów pa³eczek Gram-ujemne
naturalnie opornych na antybiotyki $-laktamowe wytwarza enzymy, których synteza determinowana jest genami zlokalizowanymi w chromosomie (ampC). Zdecydowanie wiêksza grupa $-laktamaz syntetyzowanych przez lekooporne szczepy
bakterii Gram-ujemnych kodowana jest przez geny po³o¿one na ruchomych elementach genetycznych jak plazmidy, transpozony i integrony (Rys. 2). Umieszczenie genów lekoopornoœci na ruchomych elementach genetycznych sprzyja szybkiemu szerzeniu siê tej cechy w obrêbie tego samego gatunku lub te¿ gatunków
genetycznie odleg³ych. Transfer genów opornoœci odbywa siê tak¿e wewn¹trz
komórki, np. z chromosomu na ruchomy element genetyczny lub z plazmidu niekoniugacyjnego na koniugacyjny. Lekooporne pa³eczki Gram-ujemne mog¹ szerzyæ
siê w szpitalu w sposób „nieklonalny” lub te¿ w sposób klonalny polegaj¹cy na ich
przenoszeniu z pacjenta na pacjenta najczêœciej przez personel medyczny w wyniku
zaniedbañ higienicznych [20, 36, 42]. Pierwszym plazmidowym enzymem by³a
$-laktamazy gatunkowo swoiste (naturalne)
(ewolucyjne, obecne w erze przedantybiotykowej)
– kodowane przez geny chromosomalne
ekspresja
konstytutywna
indukcyjna
$-laktamazy wtórne (odpowied¿ na antybiotyki stosowane w terapii)
– informacja: DNA – plazmid
transpozon
ekspresja konstytutywna
(wywodz¹ siê z enzymów naturalnych w wyniku duplikacji genu
i przeniesienia na ruchomy element genetyczny
Rys. 2. $-laktamazy jako najczêstszy mechanizm opornoœci bakterii na antybiotyki $-laktamowe
91
ampicylina/
amoksycylina
piperacylina
cefalosporyny I gen.
cefalosporyny II gen.
III / IV generacja
cefalosporyn
ES$L (+)
ampC (+)
TEM, SHV
E. coli, Klebsiella, Haemophilus
Lata 80-te
Lata 70-te ↑
Karbapenemy (1990)
P. aeruginosa – ImPR
D2 – deficyt
ES$L
metalo$-laktamazy
Acinetobacter baumannii РwieloopornoϾ (ES$L, M$L)
Rys. 3. Narastanie opornoœci wœród pa³eczek Gram-ujemnych w zale¿noœci od rodzaju antybiotyków
wprowadzanych do terapii (gen. – generacji)
penicylinaza TEM-1 odkryta w szczepie pa³eczki E. coli w latach 60-tych przez
K o n t a m i c h a l o u [61]. Stale powiêkszaj¹ca siê liczba nowo odkrytych $-laktamaz typu TEM manifestuje siê odpowiedni¹ cyfr¹ przy symbolu TEM. Klasyczny
enzym TEM-1 i jego odmiana izomeryczna ró¿ni¹ca siê wartoœci¹ punktu izoelektrycznego jest typow¹ penicylinaz¹, w której profilu substratowym znajduj¹ siê
g³ównie penicyliny oraz cefalosporyny I generacji, zaœ antybiotyki cefalosporynowe
wy¿szych generacji s¹ oporne na ich dzia³anie.
Kolejn¹ $-laktamaz¹ o identycznym profilu substratowym do enzymów wy¿ej
opisanych by³a odkryta w szczepach pa³eczek Klebsiella pneumoniae $-laktamaza
SHV-1. W ci¹gu kilku lat opisane enzymy rozprzestrzeni³y siê wœród wiêkszoœci pa³eczek Gram-ujemnych izolowanych na ca³ym œwiecie. S¹ to tzw. klasyczne $-laktamazy o szerokim spektrum substratowym [14]. Aktywnoœæ tych enzymów jest hamowana przez inhibitory takie jak kwas klawulanowy, sulbaktam i tazobaktam (Rys. 3).
Wprowadzenie do terapii nowych antybiotyków $-laktamowych o coraz szerszym spektrum przeciwbakteryjnym generuje syntezê nowych enzymów o coraz
szerszym spektrum substratowym (ES$L – extended spectrum $-lactamases). Pierwszym enzymem o rozszerzonym spektrum by³a $-laktamaza SHV-2 wykryta
w szczepach K. ozenae [44]. Cech¹ charakterystyczn¹ $-laktamaz o rozszerzonym
spektrum (ES$L) jest zdolnoϾ hydrolizy oksyiminocefalosporyn, tj. cefalosporyn
III/IV generacji ze szczególn¹ aktywnoœci¹ wobec ceftazydymu [35, 44, 45]. Obecnie znanych jest ponad 220 ró¿nych enzymów a liczba ich stale roœnie, bowiem
pojawiaj¹ siê ci¹gle nowe ich warianty. Warto pamiêtaæ, ¿e wiêkszoœæ ES$L
powsta³a z klasycznych $-laktamaz na skutek mutacji punktowych w genach koduj¹cych ich syntezê. Poziom ekspresji enzymu w komórce bakteryjnej decyduje
o poziomie jej opornoœci na antybiotyki $-laktamowe [56]. Pierwsze ES$L opisano
92
w pocz¹tku lat 80-tych w Niemczech, i póŸniej we Francji wœród szczepów pa³eczek Klebsiella pneumoniae [44, 76]. ES$L typu TEM lub SHV wystêpuj¹ g³ównie
u pa³eczek K. pneumoniae i E. coli, jednak spotyka siê je tak¿e u innych gatunków
pa³eczek z rodziny Enterobacteriaceae jak Proteus sp., Providencia sp., Salmonella
sp. oraz u pa³eczek niefermentuj¹cych z rodzajów Pseudomonas i Acinetobacter.
$-laktamazy o rozszerzonym profilu substratowym (ES$L) tworz¹ kilka rodzin
w zale¿noœci od pochodzenia. Wyró¿nia siê, zatem enzymy nale¿¹ce do rodziny
TEM, SHV, OXA, CTX-M wywodz¹ce siê prawdopodobnie od $-laktamazy chromosomalnej K. oxytoca oraz enzymy z rodziny PER [14]. Znanych jest oko³o
70 enzymów rodziny TEM i po 25 ró¿nych z rodzin SHV i CTX-M. Ró¿nice
pomiêdzy poszczególnymi enzymami dotycz¹ przede wszystkim aktywnoœci enzymatycznej i preferencji w stosunku do substratu $-laktamowego; st¹d te¿ bêd¹ to np.
ceftazydymazy (TEM-5, TEM-10, TEM-26) lub cefotaksymazy (SHV-2, TEM-3
lub CTX-M) [14]. W grupie ES$L wymieniane s¹ trzy enzymy oporne na inhibitory, które równie¿ oznaczone s¹ symbolem TEM i odpowiedni¹ cyfr¹, bowiem
one tak¿e wywodz¹ siê z enzymów prekursorowych TEM lub SHV. Warto pamiêtaæ, ¿e enzymy te s¹ oporne na inhibitory takie jak kwas klawulanowy lub sulbaktam, zachowa³y jednak wra¿liwoœæ na tazobaktam [11, 19]. Zosta³y wykryte we
Francji a póŸniej tak¿e w innych krajach Europy [19].
Kolejn¹ grup¹ $-laktamaz odgrywaj¹cych istotn¹ rolê w opornoœci na antybiotyki $-laktamowe niektórych gatunków szczepów klinicznych pa³eczek Gram-ujemnych, nale¿¹cych do gatunków Enterobacter, Serratia, Citrobacter, Morganella,
Providencia, s¹ enzymy chromosomalne AmpC, determinuj¹ce w fazie derepresji
opornoœæ na wiêkszoœæ antybiotyków $-laktamowych z wyj¹tkiem karbapenemów.
Ich cech¹ charakterystyczn¹ jest brak wra¿liwoœci na inhibitory $-laktamaz, takie
jak kwas klawulanowy, sulbaktam i tazobaktam [14, 56]. $-laktamazy chromosomalne nale¿¹ do grupy enzymów indukcyjnych, których synteza wyraŸnie wzrasta
w obecnoœci antybiotyku $-laktamowego [8]. Czêœæ z tych szczepów niezale¿nie od
obecnoœci antybiotyku w œrodowisku wytwarza du¿e iloœci $-laktamazy sprawiaj¹c,
¿e szczep jest oporny na wszystkie $-laktamy z wyj¹tkiem karbapenemów. Jest
to stan derepresji, polegaj¹cy na trwa³ym zablokowaniu aktywnoœci genu regulatorowego syntezy enzymu w wyniku pojedynczej mutacji [84]. Wytwarzanie enzymu
odbywa siê wówczas na wysokim i niekontrolowanym poziomie. Stosowanie antybiotyków szerokowachlarzowych, zw³aszcza cefalosporyn III generacji, prowadzi
do selekcji szczepów z derepresorowanym genem $-laktamazy, a szybkoœæ selekcji
zale¿y od liczby komórek bakteryjnych w ognisku zaka¿enia. Opornoœæ na antybiotyki $-laktamowe szczepów pa³eczek Enterobacter sp. zwi¹zana z syntez¹ ampC
w polskich szpitalach wysokospecjalistycznych jest bardzo wysoka, zw³aszcza na
oddzia³ach intensywnej terapii.
Na Rys. 4 przedstawiono schemat ilustruj¹cy narastanie opornoœci na antybiotyki $-laktamowe pa³eczek Gram-ujemnych w zale¿noœci od strategii leczenia.
Warto pamiêtaæ, ¿e zdolnoœæ syntezy $-laktamaz nie jest jedynym mechanizmem opornoœci pa³eczek Gram-ujemnych na antybiotyki $-laktamowe, jednak inne
mechanizmy jak np. zaburzenie transportu antybiotyku przez os³ony zewnêtrzne,
93
III generacja cefalosporyn
ES$L (+)
Klebsiella sp.
E. coli
AmpC
Enterobacter
Serratia
MRSA
Enterococcus
wankomycyna
depresja
imipenem/meropenem (wzrost zu¿ycia w terapii)
D2 – deficyt
1. P. aeruginosa
–
ImPR
VRE
VISA
VRSA
ES$L
metalo$-laktamazy
ES$L
2. Acinetobacter – wielooporny
metalo$-laktamazy
Rys. 4. Ewolucja narastania opornoœci na antybiotyki w zale¿noœci od strategii leczenia
modyfikacja miejsca docelowego dzia³ania lub czynne usuwanie leku z komórki
obserwowane s¹ rzadziej wœród izolatów klinicznych. St¹d te¿ opornoœæ na antybiotyki $-laktamowe wœród pa³eczek Gram-ujemnych prawie zawsze kojarzona jest
z wytwarzaniem enzymu. Od po³owy lat osiemdziesi¹tych, tj. od pierwszej izolacji
w Niemczech szczepów pa³eczek Klebsiella sp. wytwarzaj¹cych ES$L o wystêpowaniu takich szczepów donosz¹ publikacje pochodz¹ce ze wszystkich krajów na
œwiecie. W Polsce niepodwa¿alnym autorytetem w zakresie $-laktamaz bakterii
Gram-ujemnych jest G n i a d k o w s k i, a wszystkie informacje dotycz¹ce rodzaju
wytwarzanych $-laktamaz wœród izolatów w Polsce pochodz¹ z jego publikacji.
G n i a d k o w s k i opisa³ tak¿e nowe warianty ES$L tych enzymów w liczbie 14, z
których jedynie w Polsce wystêpuje 7 [35]. Zatem specyfika wytwarzanych enzymów przez kliniczne izolaty mo¿e wi¹zaæ siê z regionem geograficznym. Niektóre
z opisanych enzymów np. SHV-5 [10, 13, 56] wystêpuj¹ z jednakow¹ czêstoœci¹
w izolatach klinicznych we wszystkich krajach stosuj¹cych w terapii antybiotyki
$-laktamowe. Szczepy pa³eczek Gram-ujemnych wytwarzaj¹ce ES$L opisano równie¿ wœród klasycznych patogenów przewodu pokarmowego, tj. wœród pa³eczek
Salmonella enterica serotyp Typhimurium tak¿e w Polsce [33, 90]. Dominuj¹c¹
pozycjê wœród $-laktamaz typu ES$L wœród szczepów klinicznych izolowanych
w Polsce zajmuj¹ enzymy typu CTX-M3. Szczepy kliniczne, wytwarzaj¹ce ES$L,
czêsto w warunkach in vitro nie wykazuj¹ pe³nej opornoœci na antybiotyki znajduj¹ce siê w ich profilu substratowym, st¹d wiele laboratoriów nie identyfikuje ich
prawid³owo [91]. Zastosowanie antybiotyku $-laktamowego w terapii zaka¿enia
powodowanego przez szczep ES$L(+) i wra¿liwego in vitro na tê grupê leków zwi¹zane jest z niepowodzeniem terapii, st¹d te¿ umiejêtnoœæ wykrywania tych enzy94
mów mo¿e przyczyniæ siê do zmniejszenia liczby niepowodzeñ terapeutycznych,
a tak¿e u³atwiæ opracowanie w³aœciwej polityki antybiotykowej, zmniejszaj¹cej
ryzyko selekcji szczepów opornych. Warto pamiêtaæ, ¿e komórki jednego szczepu
mog¹ wytwarzaæ kilka wariantów ES$L lub te¿ mog¹ syntetyzowaæ enzym chromosomalny ampC oraz plazmidowy typu ES$L. Zdolnoœæ syntezy $-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym (ES$L) wœród izolatów klinicznych w Polsce
zawarta jest w przedziale od 20–60%. Te najwy¿sze wartoœci obserwowane s¹ wœród
izolatów pochodz¹cych ze szpitali wysokospecjalistycznych, hospitalizuj¹cych
pacjentów z ca³ego obszaru kraju [23, 43, 71].
Kolejn¹ grupê $-laktamaz o znacznie krótszej historii ni¿ ES$L, tworz¹ tzw. karbapenemazy, tj. enzymy hydrolizuj¹ce antybiotyki karbapenemowe, czyli imipenem
i meropenem. Warto pamiêtaæ, ¿e antybiotyki te s¹ zalecane jako leki pierwszego
rzutu w leczeniu zaka¿eñ wywo³anych przez pa³eczki z rodziny Enterobacteriaceae
wytwarzaj¹ce ES$L.
Na ca³ym œwiecie ze wzrastaj¹c¹ czêstoœci¹ izolowane s¹ szczepy oporne na karbapenemy zw³aszcza wœród pa³eczek niefermentuj¹cych z rodzaju Pseudomonas
i Acinetobacter. Wœród opornych na karbapenemy szczepów P. aeruginosa wyró¿niono izolaty o niskiej opornoœci (MIC = 8–32 mg/l) i o wysokiej opornoœci
(MIC> 32 mg/l). Mechanizm niskiej opornoœci mo¿e byæ zwi¹zany z mniejszym
pobieraniem antybiotyku w wyniku zmniejszonej ekspresji lub utraty genu oprD
bia³ka porynowego po³¹czonego z derepresj¹ genu dla chromosomalnej $-laktamazy
ampC. W wypadku meropenemu opornoœæ jest najczêœciej konsekwencj¹ wysokiej
ekspresji genu odpowiedzialnego za aktywne usuwanie antybiotyku. Wysoki poziom opornoœci na karbapenemy jest zwi¹zany z obecnoœci¹ karbapenemaz [55].
Karbapenemazy mo¿na zdefiniowaæ jako $-laktamazy, które hydrolizuj¹ przynajmniej czêœciowo imipenem lub/i meropenem oraz inne penicyliny lub cefalosporyny [50, 68]. Wed³ug klasyfikacji strukturalnej Amblera s¹ one zaliczane do
$-laktamaz klasy A (penicylinazy) i klasy D (oksacylinazy), które maj¹ w centrum
aktywnym serynê oraz klasy B obejmuj¹cej metalo-$-laktamazy [4].
Do karbapenemaz klasy A nale¿¹ chromosomalne enzymy IMI-1 i NMC-A, wykryte w izolatach Enterobacter cloacae, SME-1do SME-3 wykryte w izolatach
Serratia marcescens, jak równie¿ znajduj¹ce siê na plazmidzie KPC-1 i KPC-2,
wykryte w izolatach Klebsiella i GES-2 wykryty u Pseudomonas aeruginosa. Chromosomalne karbapenemazy klasy A (IMI-1, NMC-A, SME-1-3) charakteryzuje
wysoki poziom hydrolizy penicylin, niski poziom hydrolizy karbapenemów i aztreonamu i brak hydrolizy cefalosporyn o szerokim spektrum. Plazmidowe karbapenemazy (KPC-1-2, GES-2) hydrolizuj¹ zarówno penicyliny jak i szerokowachlarzowe
cefalosporyny. Enzym GES-2 w odró¿nieniu od KPC wykazuje niski poziom hydrolizy karbapenemów i brak hydrolizy aztreonamu. Ich aktywnoœæ jest hamowana
przez kwas klawulanowy [68, 82]. Ostatnio w klinicznych szczepach pa³eczek
K. pneumoniae wykryto now¹ $-laktamazê SHV-38, której profil substratowy obejmuje nie tylko cefalosporyny o rozszerzonym spektrum, ale równie¿ imipenem [77].
Jest to pierwsze doniesienie o $-laktamazie typu SHV, czyli klasycznym enzymie
o szerokim profilu substratowym, hydrolizuj¹cym imipenem.
95
Karbapenemazy klasy D, czyli enzymy z rodzaju OXA, wykryto w izolatach
pa³eczek Acinetobacter baumanii. Enzymy te charakteryzuje wysoki poziom hydrolizy penicylin i cefalosporyn pierwszej generacji, ale niski poziom hydrolizy karbapenemów, oraz brak zdolnoœci hydrolizy aztreonamu i cefalosporyn o szerokim
spektrum. Pierwszy znany szczep A. baumanii wytwarzaj¹cy karbapenemazê, któr¹
oznaczono ARI-1, wyizolowano w 1985 roku w Szkocji [70]. PóŸniej szczepy
A. baumanii wytwarzaj¹ce karbapenemazy izolowano przynajmniej w 12 krajach
[2]. Enzymy OXA, które hydrolizuj¹ karbapenemy, mo¿na na podstawie analizy
sekwencyjnej podzieliæ na dwie grupy. Pierwsza grupa zawiera enzymy OXA-23
(ARI-1) i OXA-27, które wykazuj¹ pomiêdzy sob¹ 99% homologii w sekwencji
aminokwasów, a druga zawiera OXA-24, OXA-25 i OXA-26, które wykazuj¹ 98%
homologii. Miêdzy tymi grupami istnieje tylko 60% homologii [2]. W badaniach
82 opornych na karbapenem izolatów A. baumanii z pó³nocnej Hiszpanii wykryto
enzym OXA-40, który jest wariantem grupy OXA-24-OXA-25-OXA-26. Sekwencja aminokwasów enzymu OXA-40 wykazuje zmianê tylko dwóch aminokwasów
w porównaniu do OXA-24 i OXA-25 i zmianê jednego aminokwasu w stosunku do
OXA-26 [58]. Enzymy OXA-23, -24, -25, -26 i -27 charakteryzuje s³aba aktywnoœæ
wobec karbapenemów, a wytwarzaj¹ce je szczepy A. baumanii s¹ w niewielkim
stopniu oporne na karbapenemy. Uwa¿a siê, ¿e w tym przypadku enzymy nie s¹
jedyn¹ przyczyn¹ opornoœci, a izolaty Acinetobacter mog¹ posiadaæ dodatkowe mechanizmy opornoœci takie jak zmiany przepuszczalnoœci lub zwiêkszon¹ ekspresjê
systemu czynnego usuwania leku z komórki. Opisano oporny na karbapenemy
szczep A. baumanii, który wytwarza³ enzym OXA-24, a dodatkowo mia³ obni¿on¹
ekspresjê bia³ek b³ony zewnêtrznej o wielkoœci 22 i 33 kDA [12].
Najwiêksze znaczenie kliniczne maj¹ $-laktamazy klasy B, czyli tzw. metalo$-laktamazy, które posiadaj¹ w centrum aktywnym dwuwartoœciowe kationy, zwykle cynk [15]. Ich aktywnoœæ jest hamowana przez zwi¹zki chelatuj¹ce metale,
natomiast nie jest hamowana przez znane inhibitory enzymów tj. kwas klawulanowy, sulbaktam i tazobaktam. Metalo-$-laktamazy hydrolizuj¹ imipenem i meropenem, a tak¿e wiêkszoœæ antybiotyków $-laktamowych, z wyj¹tkiem aztreonamu.
R a s s m u s e n i B u s h [82] zaproponowa³y podzia³ metalo-$-laktamaz na trzy
podgrupy. Pierwsza podgrupa 3a obejmuje enzymy, które hydrolizuj¹ penicyliny tak
samo szybko lub szybciej ni¿ imipenem. Enzymy te hydrolizuj¹ tak¿e cefalosporyny. Druga podgrupa 3b zawiera enzymy wyizolowane z pa³eczek Aeromonas sp.,
które s¹ prawdziwymi „karbapenemazami”. Enzymy te charakteryzuj¹ siê wysok¹
swoistoœci¹ dla karbapenemów. Trzecia podgrupa 3c zawiera tylko jeden enzym
pochodz¹cy z Legionella gormanii, który wykazuje bardzo wysoki stopieñ hydrolizy wszystkich cefalosporyn i cefamycyn. Pierwsze doniesienie, które pojawi³o siê
w piœmiennictwie w po³owie lat 60-tych, dotyczy³o wykrycia w Japonii chromosomalnej metalo-$-laktamazy u Bacillus cereus [83]. W latach 80-tych opisano kolejne
naturalnie wystêpuj¹ce chromosomalne metalo-$-laktamazy u Stenotrophomonas
maltophilia, Aeromonas hydrophila i Bacteroides fragilis. B e l l a i s i wsp. [7]
opisali u Chryseobacterium meningosepticum równoczesne wystêpowanie dwóch
typów metalo-$-laktamaz BlaB i GOB-1. Kombinacja dwóch naturalnie wystêpuj¹96
cych genów karbapenemaz u tego samego gatunku nie by³a wczeœniej opisywana.
Pierwsz¹ mobiln¹ metalo-$-laktamazê znajduj¹c¹ siê na plazmidzie, IMP-1, wykryto w Japonii u P. aeruginosa [99], a nastêpnie u Bacteroides fragilis i Serratia
marcescens. W latach 1992–1994 obecnoœæ genu dla enzymu IMP-1 wykazano
w 15 na 3700 izolatów P. aeruginosa otrzymanych z 17 szpitali na terenie Japonii
[86]. Dziewiêæ z tych szczepów by³o opornych na karbapenemy (imipenem, meropenem, panipenem), a wartoœæ MIC dla karbapenemów wynosi³a 16 – >28 mg/l.
Pozosta³e szeœæ szczepów wykazywa³o wra¿liwoœæ na jeden lub wiêcej karbapenemów przy wartoœci MIC <8 mg/l. Sugeruje to, ¿e nie zawsze obecnoœæ genu
blaIMP-1 warunkuje wysoki poziom opornoœci na karbapenemy, gdy¿ czasami nie
dochodzi do ekspresji genu blaIMP-1. Gen ten by³ zlokalizowany albo na du¿ych
plazmidach albo na chromosomie [86]. W innych badaniach przegl¹dowych przeprowadzonych w latach 1996–1997, tak¿e w Japonii, wykazano obecnoœæ enzymu
IMP-1 w 4,4% izolatów P. aeruginosa, 1,3% izolatów S. marcescens oraz izolatach
Escherichia coli i Citrobacter freundii [48].
W latach póŸniejszych enzym IMP-1 oraz warianty IMP rozprzestrzeni³y siê
wœród klinicznych izolatów na czterech kontynentach [29, 32, 92]. Obecnie opisano
ju¿ 13 wariantów enzymu IMP, które charakteryzuj¹ siê ró¿nicami w sekwencji
aminokwasów w zale¿noœci od wariantu 0,4% do 22,2% [8, 92]. Poza enzymami
IMP odkryto trzy inne typy metalo-$-laktamaz, posiadaj¹cych kliniczne znaczenie:
SPM-1 [94], GIM-1 [16] i grupa VIM [51, 78, 80].
Wszystkie metalo-$-laktamazy s¹ monomerami bia³kowymi, które wykazuj¹ charakterystyczne dla tej rodziny pofa³dowanie "$$" [65]. Wyj¹tkiem jest enzym L1
u S. maltophilia, który jest tetramerem. Ponadto z wyj¹tkiem metalo-$-laktamazy
Aeromonas sp., wszystkie enzymy dla swojej aktywnoœci wymagaj¹ obecnoœci
dwóch atomów cynku w centrum aktywnym. Enzym SPM-1 ma masê cz¹steczkow¹
27515 Da, znacznie wy¿sz¹ ni¿ IMP (25041 Da) lub VIM (25322 Da). Ta wy¿sza
masa cz¹steczkowa jest prawdopodobnie konsekwencj¹ posiadania przez SPM-1
unikalnej pêtli sk³adaj¹cej siê z 23 aminokwasów [94].
Pierwszy enzym z grupy VIM (VIM-1) zosta³ wykryty w szczepie P. aeruginosa
izolowanym w Weronie, W³ochy, st¹d pochodzi skrót enzymu VIM (Veronese Imipenemase) [51]. Obecnie rodzina VIM sk³ada siê z siedmiu metalo-$-laktamaz, które
charakteryzuje homologia sekwencji aminokwasów wynosz¹ca od 77–99% [93].
Enzym VIM-1 wykryto u P. aeruginosa i Achromobacter xylosoxidans we W³oszech
oraz u P. aeruginosa w Grecji. Enzym VIM-2, po raz pierwszy, wykryto w klinicznych izolatach Pseudomonas we Francja [78]. Nastêpnie enzym VIM-2 wykryto
w klinicznych izolatach Pseudomonas w innych krajach po³udniowej Europy (Grecja,
Hiszpania, W³ochy), krajach dalekiego wschodu (Korea, Taiwan), a tak¿e w Polsce
[98]. VIM-3, wariant VIM-2 ró¿ni¹cy siê tylko dwoma aminokwasami, znaleziono
tak¿e wœród klinicznych izolatów P. aeruginosa z Taiwanu. Enzym VIM-4 wykryto
po raz pierwszy w szczepie P. aeruginosa wyizolowanym w kwietniu 2001 w Grecji
[80]. Enzym VIM-4 ró¿ni siê od VIM-1 tylko jednym nukleotydem, co w konsekwencji prowadzi do zmiany seryny na argininê w pozycji 175. Nale¿y podkreœliæ,
¿e pozycjê 175 zajmuje arginina tak¿e w enzymach VIM-2 i VIM-3 [80]. Enzym
97
VIM-4 i VIM-2 wykryto u 88,7% opornych na karbapenemy izolatów P. aeruginosa
w czasie szpitalnej epidemii w Grecji. Typowanie genotypowe (PFGE) wykaza³o, ¿e izolaty zawieraj¹ce gen blaVIM-2 tworzy³y cztery podtypy, a zawieraj¹ce gen
blaVIM-4 trzy podtypy. Przenoszone one by³y jako pojedyñcze kasety genowe lub
razem z genem opornoœci na aminoglikozydy (aacA29a) na integronach klasy 1.
[79]. Ostatnio gen blaVIM-4 zidentyfikowano równie¿ w szczepie P. aeruginosa
w Szwecji [34]. W tym wypadku istnieje widoczny zwi¹zek z pierwsz¹ izolacj¹
enzymu VIM-4 w Grecji, gdy¿ pacjent by³ greckim obywatelem, który wyemigrowa³ do Szwecji w 2001 roku [34]. Ponadto w obu zbadanych szczepach integron
klasy 1 zawiera³ tylko jedna kasetê genow¹ blaVIM-4. Wœród opornych na imipenem izolatów P. aeruginosa, otrzymanych od dzieci leczonych w IP-CZD w latach
1998–2001, znaleziono 11 szczepów, które wytwarza³y metalo-$-laktamazê VIM-4
[72]. Pierwszy szczep P. aeruginosa posiadaj¹cy enzym VIM-4 wyizolowano od
dziecka leczonego na oddziale chirurgii w 1998 roku i od tego czasu sta³ siê on
szczepem endemicznym w szpitalu. Wszystkie 11 szczepów posiada³o identyczny
integron klasy 1, zawieraj¹cy dwie kasety genowe, na pierwszej pozycji kasetê
aacA4 i na drugiej pozycji kasetê blaVIM-4. Gen blaVIM-4 zawiera³ nietypowe bezpoœrednie powtórzenie 169 par zasad z 3’ koñca genu blaVIM-4. Ostatnio enzym VIM-5
wykryto u K. pneumoniae w Turcji, a Singapur by³ miejscem, gdzie wykryto enzym
VIM-6 u Pseudomonas putida. W tym roku ukaza³a siê pierwsza praca, która opisuje wykrycie metalo-beta-laktamazy w USA [93]. Enzym VIM-7, który wykryto
w szczepie P. aeruginosa, zlokalizowany jest na plazmidzie (24 kb), który mo¿na
³atwo przenieœæ do pa³eczek Enterobacteriaceae i pa³eczek Pseudomonas. Enzym
VIM-7 jest filogenetycznie odleg³y od innych enzymów z rodziny VIM (Rys. 5).
Posiada on tylko 77% homologii w sk³adzie aminokwasów porównaniu do enzymu
VIM-1, podczas gdy VIM-1 do VIM-6 wykazuj¹ 89–99% homologii.
Z wyj¹tkiem enzymu SPM-1, wszystkie metalo-$-laktamazy o klinicznym znaczeniu z grupy IMP i VIM s¹ kodowane przez mobilne kasety genowe, zlokalizowane w zmiennym regionie integronów klasy 1, które z kolei s¹ czêsto znajdowane
jako czêœæ z³o¿onych transpozonów. Ta genetyczna aran¿acja pozwala na ruchliwoœæ kaset genowych zawieraj¹cych metalo-$-laktamazy i ich przenoszenie do
ró¿nych gatunków bakterii Gram-ujemnych. Rozprzestrzenianie siê w œrodowisku
szpitalnym szczepów pa³eczek Gram-ujemnych opornych na karbapenemy stwarza
realn¹ groŸbê zmierzchu antybiotykoterapii.
Kolejn¹ grup¹ antybiotyków, na któr¹ bakterie rozwinê³y opornoœæ w nieco
mniejszym stopniu, ni¿ w przypadku $-laktamów stanowi¹ aminoglikozydy. W tym
przypadku tak¿e dominuj¹cym mechanizmem opornoœci jest zdolnoœæ do syntezy
enzymu modyfikuj¹cego antybiotyk. Do³¹czenie reszty acetylowej czy te¿ nukleotydylowej do miejsca aktywnego cz¹steczki antybiotyku, którym jest grupa hydroksylowa lub aminowa, prowadzi do utraty jego aktywnoœci biologicznej w wyniku
braku zdolnoœci wi¹zania z receptorem wewn¹trzkomórkowym antybiotyku, tj. podjednostk¹ 30S rybosomu. Enzymy modyfikuj¹ce wytwarzane przez oporne szczepy
bakterii, zarówno Gram-dodatnich jak i Gram-ujemnych, nale¿¹ do trzech rodzin, tj.
aminotransferaz, fosfotransferaz i nukleotydylotransferaz, których syntezê w komór98
Rys. 5. Drzewo filogenetyczne pokazuj¹ce pokrewieñstwo enzymu VIM-7
do innych mobilnych metalo-$-laktamaz
ce determinuj¹ zwykle geny zlokalizowane na ruchomych elementach genetycznych.
Czêsto jeden plazmid zawiera geny determinuj¹ce syntezê $-laktamaz oraz enzymów modyfikuj¹cych aminoglikozydy. Opisano oko³o 50 odmian izomerycznych
w obrêbie trzech wymienionych rodzin enzymów, które ró¿ni¹ siê preferencyjnoœci¹ modyfikacji substratu oraz w³aœciwoœciami fizykochemicznymi. Podobnie jak
w przypadku $-laktamaz, komórka bakteryjna mo¿e syntetyzowaæ dwa lub wiêcej
enzymów. Inne mechanizmy opornoœci szczepów pa³eczek Gram-ujemnych na
antybiotyki aminoglikozydowe polegaj¹ na czynnym usuwaniu antybiotyku z komórki, a tak¿e na mutacjach w obrêbie receptora rybosomalnego antybiotyku.
Komórki o wysokim stopniu opornoœci na aminoglikozydy zazwyczaj dysponuj¹
kilkoma mechanizmami opornoœci jednoczeœnie. Najwiêcej enzymów wytwarzanych
przez kliniczne szczepy pa³eczek Gram-ujemnych i P. aeruginosa modyfikuje gentamycynê i tobramycynê, zaœ najmniej amikacynê. Odsetki szczepów opornych na
aminoglikozydy zawieraj¹ siê w przedziale 20–30% i nie osi¹gnê³y takich wartoœci
jak w przypadku $-laktamów [22].
Fluorochinolony, których klasycznym przedstawicielem jest cyprofloksacyna,
jedyny doustny, o dzia³aniu uk³adowym preparat aktywny wobec pa³eczek Gramujemnych z gatunku P. aeruginosa, stanowi ci¹gle istotny lek w leczeniu powa¿nych zaka¿eñ szpitalnych wywo³ywanych przez szczepy oporne na inne grupy
antybiotyków. Warto jednak pamiêtaæ, ¿e tak¿e wœród izolatów szpitalnych wœród
niektórych gatunków bakterii wystêpuj¹ tak¿e szczepy oporne. Szerokie stosowanie
cyprofloksacyny w warunkach szpitalnych uwarunkowane jest miêdzy innymi
99
aktywnoœci¹ bakteriobójcz¹ leku, znakomit¹ farmakokinetyk¹, w tym dobr¹ penetracj¹ do tkanek uk³adu oddechowego oraz mo¿liwoœci¹ stosowania terapii sekwencyjnej, bowiem lek ma dwie postacie, tj. parenteraln¹ i doustn¹. Cyprofloksacyna
podobnie jak wszystkie chinolony dzia³a bakteriobójczo poprzez wp³yw na replikacjê DNA bakteryjnego. Miejscem docelowego dzia³ania preparatu jest gyraza DNA
(topoizomeraza II) u bakterii Gram-ujemnych i topoizomeraza IV u bakterii Gramdodatnich. Opornoœæ na fluorochinolony w œrodowisku szpitalnym najczêœciej rozwija siê wœród pa³eczek P. aeruginosa i gronkowców z³ocistych, zw³aszcza MRSA
[63]. Przyczyn¹ pojawienia siê szczepów opornych s¹ mutacje w genach determinuj¹cych syntezê ww. enzymów [40]. Wysokooporne szczepy rozwijaj¹ siê najczêœciej
w wyniku mutacji wielostopniowych. Opornoœæ na fluorochinolony mo¿e byæ tak¿e
spowodowana zaburzeniami przepuszczalnoœci œciany komórkowej bakterii lub aktywnym usuwaniem leku z komórki (efflux). W œrodowisku szpitalnym, zw³aszcza
wœród izolatów pochodz¹cych od osób doros³ych z uwagi na czêste stosowanie
fluorochinolonów coraz czêœciej wystêpuj¹ szczepy oporne. Wœród pa³eczek P. aeruginosa odsetki szczepów opornych siêgaj¹ oko³o 30% i s¹ znacznie wy¿sze wœród
pa³eczek z rodzaju Acinetobacter [96].
Ten krótki przegl¹d najwa¿niejszych drobnoustrojów szpitalnych sprawiaj¹cych
najwiêcej problemów terapeutycznych ma na celu uœwiadomienie czytelnikowi
ró¿norodnoœci zjawisk genetycznych, które mia³y miejsce w œrodowisku szpitalnym
po wprowadzeniu do terapii antybiotyków i chemioterapeutyków.
Piœmiennictwo
1. Abraham E.P., Chain E.: An enzyme from bacteria able to destroy penicillin. Nature, 146, 837 (1940)
2. Afzal-Shah M., Woodford N., Livermore D.M.: Characterization of OXA-25, OXA-26, and
OXA-27, molecular class D $-lactamases associated with carbapenem resistance in clinical isolates of Acinetobacter baumanii. Antimicrob. Agents Chemother. 45, 583–588 (2001)
3. Al-Obeid S., Billot-Klein D., Van Heijenoort J., Collatz E., Gutmann L.: Replacement of the
essential penicillin-binding protein 5 by high-molecular mass PBP’s may explain vancomycinbeta-lactam synergy in low-level vancomycin-resistant Enterococcus faecium D366. FEMS
Microb. Lett. 91, 79–84 (1992)
4. Ambler R.P.: The structure of $-lactamases. Philos. Trans. R. Soc. (London) Biol. 289, 321–331
(1980)
5. Arthur M., Courvalin P.: Genetics and mechanisms of glycopeptide resistance in enterococci.
Antimicrob. Agents Chemother. 37, 1563–1571 (1993)
6. Arthur M., Molinas C., Depardieu F., Courvalin P.: Characterization of Tn1546, a Tn3-related
transposon conferring glycopeptide resistance by synthesis of depsipeptide peptidoglycan precursors in Enterococcus faecium BM4147. J. Bacteriol. 157, 117–127 (1993)
7. Belais S., Aubert D., Naas T., Nordmann P.: Molecular and biochemical heterogeneity of class B
carbapenem-hydrolyzing $-lactamases in Chryseobacterium meningosepticum. Antimicrob. Agents
Chemother. 44, 1878–1886 (2000)
8. Bennett P.M.: Molecular basis of $-lactamase induction in bacteria. Antimicrob. Agents Chemother. 37, 153–158 (1993)
9. Biavasco F., Vignaroli C., Varaldo P.F.: Glycopeptide resistance in coagulase-negative staphylococci. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 19 (6), 403–17 (2000)
100
10. Billot-Klein D., Gutmann L., Collatz E.: Nucleotyde sequence of the SHV-5 $-lactamase gene of
a Klebsiella pneumoniae plasmid. Antimicrob. Agents Chemother. 34, 2439–2441 (1990)
11. Bonomo R.A., Rudin S.A., Shiaes D.M.: Tazobactam is a potent inactivator of selected inhibitorresistant class A $-lactamases. FEMS Microb. Lett. 148, 59–62 (1997)
12. Bou G., Cervero G., Dominguez M.A., Quereda C., Martinez-Beltran J.: Characterization of
a nosocomial outbreak caused by a multiresistant Acinetobacter baumanii strain with a carbapenem-hydrolyzing enzyme: high-level carbapenem resistance in A. baumanii is not due solely
to the presence of $-lactamases. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 1556–1561 (2000)
13. Bradford P.A.: Extended-spectrum $-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat. Clin. Microbiol. Rev. 14, 933–951 (2001)
14. Bush K., Jacoby G.A., Medeiros A.A.: A functional classification scheme for $-lactamases and
its correlation with molecular structure. Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1211–1233 (1995)
15. Bush K.: Metallo-$-lactamases: a class apart. Clin. Infect. Dis. 27 (Suppl. 1), S48–S53, (1998)
16. Castanheira M., Mendes R.E., Schmitz F: Molecular and biochemical characterization of a novel class B beta-lactamase GIM-1: a new subclass of metallo-beta-lactamase: report from
the SENTRY antimicrobial surveillance programme. In Abstracts of the 43rd Annual Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Chicago, ASM, Washington,
P76, (2003)
17. CDC. Interim guidelines for preventing and control of staphylococcal infections associated with
reduced susceptibility to vancomycin. MMWR, 46, 626–628, 635 (1997)
18. CDC. Staphylococcus aureus resistant to vancomycin – United States, 2002. MMWR, 51 (26),
565–567 (2002)
19. Chaibi E.B., Sirot D., Paul G., Labia R.: Inhibitor-resistant TEM-$-lactamases: phenotypic, genetic and biochemical characteristics. J. Antimicrob. Chemother. 43, 447–458 (1999)
20. Cohen M.L.: Epidemiology of drug resistance: implications for a post-antimicrobial era. Science,
257, 1050–1055 (1992)
21. Courvalin P.: Preparing for battle against vancomycin resistance. Lancet, 347, 525 (1996)
22. Dzier¿anowska D., Kamiñska W.: Zastosowanie metod biologii molekularnej do wykrywania
genów opornoœci na antybiotyki. Zaka¿enia, Nr 1, 24–33 (2003)
23. Dzier¿anowska D., Murawska B., Pawiñska A., Januszewicz P.: Wystêpowanie MRSA i Gramujemnych pa³eczek opornych na ceftazydym u dzieci przyjmowanych i hospitalizowanych
w Instytucie Pediatrii Centrum Zdrowia Dziecka. II Ogólnopolskie Symp. Kierowniczej Kadry
Medycznej „Profilaktyka i zwalczanie zaka¿eñ szpitalnych”, Warszawa, listopad 1997
24. Edmond M.B., Ober J.F., Weinbaum D.L., Pfaller M.A., Hwang T., Sanford M.D., Wenzel R.P.:
Vancomycin-resistant Enterococcus faecium bacteremia: risk factors for infection. Clin. Infect.
Dis. 20, 1126–1133 (1995)
25. Von Eiff C., Peters G., Heilmann C.: Pathogenesis of infections due to coagulase-negative staphylococci. Lancet, 2, 677–85 (2002)
26. Eliopoulos G.M.: Vancomycin-resistant enterococci: mechanism and clinical relevance. Infect.
Dis. Clin. North. Am. 11, 851–865 (1997)
27. Fleenor-Ford A., Hayden M.K., Weinstein R.A.: Vancomycin-resistant enterococci: Implications
for surgeons. Surgery, 125, 121–125 (1999)
28. Fontana R., Ligoziti M., Pittaluga F., Satta G.: Intrinsic penicillin resistance in enterococci.
Microb. Drug Res. 2, 209–213 (1996)
29. Gales A.C., Tognim M.C., Reis A.O., Jones R.N., Sader H.S.: Emergence of an IMP- like metalloenzyme in an Acinetobacter baumanii clinical strain from a Brazilian teaching hospital. Diagn.
Microbiol. Infect. Dis. 45, 77–79 (2003)
30. Garbutt J., Ventrapragada M., Littenberg B., Mundy L.M.: Asociation between resistance to
vancomycin and death in cases of Enterococcus faecium bacteremia. Clin. Infect. Dis. 30,
466–472 (2000)
31. Ghuysen J.M.: Serine $-lactamases and penicillin-binding proteins. Annu. Rev. Microbiol. 45,
37–67 (1991)
101
32. Gibb A.P., Tribuddharat C., Moore R.A., Louie T.J., Krulicki W., Livermore D.M., Palepou M.F.,
Woodford N.: Nosocomial outbreak of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa with
a new blaIMP allele, blaIMP-7. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 255–258 (2002)
33. Gierczyñski R., Szych J., Cieœlik A., Rastawicki W., Jagielski M.: The occurrence of the first two
CTX-M-3 and TEM-1 producing isolates of Salmonella enterica serovar Oranienburg in Poland.
Int. J. Antimicrob. Agents, 21, 497–499 (2003)
34. Giske C.G., Rylander M., Kronvall G.: VIM-4 in a carbapenem-resistant strain of Pseudomonas
aeruginosa isolated in Sweden. Antimicrob. Agents Chemother. 47, 3034–3035 (2003)
35. Gniadkowski M.: Ewolucja i epidemiologia szczepów pa³eczek z rodziny Enterobacteriaceae
wytwarzaj¹cych $-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (ES$L) w Polsce. Wyd.
Ak. Med., Warszawa, praca habilitacyjna 2003
36. Goldman D.A., Weinstein R.A., Wenzel R.P.: Strategies to prevent control the emergence and
spread of antimicrobial-resistant microorganisms in hospitals. JAMA, 275, 234–240 (1996)
37. Gray J.W., Marsh J., Steward D., Pedler S.J.: Enterococcal bacteremia: a prospective study of
125 episodes. J. Hosp. Infect, 27, 179–186 (1994)
38. Van Griethuysen A., Veen A., Buiting A., Walsh T., Kluytmans J.: High percentage of methicillinresistant Staphylococcus aureus isolates with reduced susceptibility to glycopeptidesin the
Netherlands. J. Clin. Microbiol. 41, 2487–2491 (2003)
39. Hiramatsu K., Hanaki H., Ino T., Yabuta T., Oguri T., Tenover F.C.: Methicillin resistant Staphylococcus aureus clinical strains with reduced vancomycin susceptibility. J. Antimicrob.
Chemother. 40, 135–146 (1997)
40. Hooper D.V.: Mechanisms of action and resistance of older and newer fluoroquinolones. Clin.
Infect. Dis. 31 (Suppl. 2), S24–S28 (2000)
41. Kawalec M., Gniadkowski M., Hryniewicz W.: Outbreak of vancomycin-resistant enterococci
in a hospital in Gdansk, Poland, due to horizontal transfer of different Tn1546-like transposon
variants and clonal spread of several strains. J. Clin. Microbiol. 38, 9, 3317–3322 (2000)
42. Kaye K.S., Fraimow H.S., Abrutyn E.: Pathogens resistant to antimicrobial agents: epidemiology,
molecular mechanisms, and clinical management. Infect. Dis. Clin. N. Am. 14, 293–313 (2000)
43. Kêdzierska J., Dole¿al M., Kachlik P.: Ocena stanu opornoœci pa³eczek Gram-ujemnych wyosobnionych z materia³u klinicznego. Med. Doœw. Mikrobiol. 51, 113–122 (1999)
44. Kliebe C., Nies B.A., Meyer J.F.: Evolution of plasmid-coded resistance to broad spectrum
cephalosporins. Antimicrob. Agents Chemother. 28, 302–307 (1985)
45. Knothe H., Shah P., Kromery V.: Transferable resistance to cefotaxime, cefoxitin, cefamandol
and cefuroxime in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Serratia marcescens. Infection,
11, 315–317 (1983)
46. Krzysztoñ-Russjan J., Gniadkowski M., Polowniak-Pracka H., Hagmajer E., Hryniewicz W.:
The first Staphylococcus aureus isolates with reduced susceptibility to vancomycin in Poland.
J. Antimicrob. Chemother. 50, 1065–1069, (2002)
47. Kubler J.: Polisacharydy zewn¹trzkomórkowe gronkowców koagulazo-ujemnych i ich rola
w chorobotwórczoœci. Post. Hig. Med. Doœw. 52, 311–324 (1998)
48. Kurokawa H., Yagi T., Shibata N., Shibayama K., Arakawa Y.: Worlwide proliferation of carbapenem-resistant gra-negative bacteria. Lancet, 354, 955 (1999)
49. Lallemand S., Touverez M., Boisson K., Talon D., Bertrand X.: Bacteraemia caused by coagulase-negative staphylococci exhibiting decreased susceptibility to teicoplanin. J. Hosp. Infect. 51,
207–214 (2002)
50. Laudy A.E.: Karbapenemazy – enzymy mog¹ce hydrolizowaæ szerokie spectrum $-laktamów.
Zaka¿enia, Nr 4, 32–38 (2003)
51. Lauretti L., Riccio M.L., Mazzariol A., Cornaglia G., Amicosante G., Fontana R., Rossolini G.M.:
Cloning and characterization of blaVIM, a new integron-borne metallo-$-lactamase gene from
Pseudomonas aeruginosa clinical isolate. Antimicrob. Agents Chemother. 43, 1584–1590 (1999)
52. Lautenbach E., Bilker W.B., Brennan P.J.: Enterococcal bacteremia: risk factors for vancomycin
resistance and predictors of mortality. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 20, 318–323 (1999)
102
53. Leclercq R., Courvalin P.: Resistance to glycopeptides in enterococci. Clin. Infect. Dis. 24,
545–556 (1997)
54. Li Z., Willke R.J., Pinto L.A., Littenhouse B.E., Rybak M.J., Pleil A.M., Crouch C.W., Hawkin B.,
Glick H.A.: Comparision of length of hospital stay for patients with known or suspected methicillin-resistant Staphylococcus sp. infections treated with linezolid or vancomycin: a randomized
multicenter trial. Pharmacothetapy, 21 (2), 263–74 (2001)
55. Livermore D.M., Woodford N.: Carbapenemases: a problem is waiting? Curr. Opin. Microbiol. 3,
489–495 (2000)
56. Livermore D.M.: $-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin. Microb. Rev. 8,
557–584 (1995)
57. Livermore D.M.: Quinupristin/dalfopristin and linezolid: were, when, which and whether to use?
J. Antimicrob. Chemother. 46, 347–350 (2000)
58. Lopez-Otsoa F., Gallego L., Towner K.J., Tyssal L., Woodford N., Livermore D.M.: Endemic
carbapenem resistance associated with OXA-40 carbapenemase among Acinetobacter baumanii
isolates from a hospital in northern Spain. J. Clin. Microbiol. 40, 4741–4743 (2002)
59. Lucas G., Lechtzin N., Puryear W., Yau L., Flexner C., Moore R.: Vancomycin-resistant and
vancomycin-susceptible enterococcal bacteremia: comparison of clinical features and outcomes.
Clin. Infect. Dis. 26, 1127–1133 (1998)
60. McManus J.: Vancomycin resistant staphylococcus reported in Hong Kong. BMJ, 318, 626 (1999)
61. Medeiros A.A.: $-Lactamases. Br. Med. Bull. 40, 18–27 (1985)
62. Megran D.W.: Enterococcal endocarditis. Clin. Infect. Dis. 15, 63–71 (1992)
63. M³ynarczyk G., Rosdahl V.T., Skov R., M³ynarczyk A.: Epidemiology of methicillin resistant
Staphylococcus aureus in a Warsaw hospital. J. Hosp. Infect. 34, 151–160 (1996)
64. Mundy L.M., Sahm D.F., Gilmore M.: Relationships between enterococcal virulence and antimicrobial resistance. Clin. Microbiol. Rev. 13, 4, 513–522 (2000)
65. Murphy T.A., Simm A.M., Toleman M.A., Jones R.M., Walsh T.R.: Biochemical characterization
of the aquired metallo-$-lactamase SPM-1 from Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents
Chemother. 47, 582–587 (2003)
66. National Nosocomial Infections Surveillance System Report: data summary from January 1990May 1999. Atlanta: Hospital Infections program, National Center for Infectious Diseases, Centers for Disease Control and prevention, Public health Service, US Department of Health and
Human Services, 1999
67. Noble W.C., Viarani Z., Cree R.: Co-transfer of vancomycin and other resistance genes from
Enterococcus faecalis NCTC 12201 to Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol. Lett. 93,
195–198 (1992)
68. Nordmann P., Poirel L.: Emerging carbapenemases in gram-negative aerobes. Clin. Microbiol.
Infect. 8, 321–331 (2002)
69. O’Grady N. P.: Guideline for the prevention of intravascular catheter-related infections. Pediatrics. 10, 1–24 (2002)
70. Paton R., Miles R.S., Hood J., Amyes S.G.B.: ARI-1: $-lactamase-mediated imipenem resistance
in Acinetobacter baumanii. Int. J. Antimicrob. Agents, 2, 81–88 (1993)
71. Patzer J., Dzier¿anowska D., Turner P.: Susceptibility patterns of Gram-negative bacteria from
a Polish intensive care unit, 1997–2000. Int. J. Antimicrob. Agents, 19, 431–434 (2002)
72. Patzer J., Toleman M.A., Deshpande L.M., Kamiñska W., Dzier¿anowska D., Bennett P.M., Jones
R.N., Walsh T.R.: Pseudomonas aeruginosa strains harbouring an unusual blaVIM-4 gene cassette
isolated from hospitalized children in Poland (1998–2001). J. Antimicrob. Chemother. (w druku)
73. Pawiñska A., £opaciuk U., Semczuk K., Dzier¿anowska D.: Wykorzystanie metod biologii molekularnej w ocenie podobieñstwa gronkowców koagulazo-ujemnych izolowanych z sekwencyjnych posiewów krwi. Ped. Pol. 11, 919–28. (2002)
74. Pawiñska A: Opornoœæ na wankomycynê u Staphylococcus aureus. Zaka¿enia, Nr 2, 89–96 (2003)
75. Pawiñska A.: Udzia³ gronkowców koagulazo-ujemnych w etiologii szpitalnych posocznic. Zaka¿enia, Nr 2, 125–128 (2003)
103
76. Petit A.: Molecular epidemiology of TEM-3 (CTX-1) $-lactamase. Antimicrob. Agents Chemother. 34, 219–224 (1990)
77. Poirel L., Heritier C., Podglajen I., Sougakoff W., Gutman L., Nordmann P.: Emergence in Klebsiella pneumoniae of a chromosome-encoded SHV $-lactamase that comprises the efficacy of
imipenem. Antimicrob. Agents Chemother. 47, 755–758 (2003)
78. Poirel L., Naas T., Nicolas D., Collet L., Bellais S., Cavallo J.D., Nordmann P.: Characterization
of VIM-2, a carbapenem-hydrolyzing metallo-$-lactamase and its plasmid- and integron-borne
gene from a Pseudomonas aeruginosa clinical isolate in France. Antimicrob. Agents Chemother.
44, 891–897 (2000)
79. Pournaras S., Maniati M., Petinaki E., Tzouvelekis L.S., Tsakris A., Legakis N.J., Maniatis A.N.:
Hospital outbreak of multiple clones of Pseudomonas aeruginosa carrying the unrelated metallo$-lactamase gene variants blaVIM-2 and blaVIM-4. J Antimicrob. Chemother. 51, 1409–1414 (2003)
80. Pournaras S., Tsakris A., Maniati M., Tzouvelekis L.S., Maniatis A.N.: Novel variant (blaVIM-4) of
metallo-$-lactamase gene blaVIM-1 in a clinical strain of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob.
Agents Chemother. 46, 4026–4028 (2002)
81. Raney P.M., Williams P.P., McGowan J.E., Tenover F.C.: Validation of Vitek version 7.01 software
for testing staphylococci against vancomycin. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 43, 135–40 (2002)
82. Rasmussen B.A., Bush K.: Carbapenem-hydrolyzing $-lactamase. Antimicrob. Agents Chemother. 41, 223–232 (1997)
83. Sabath L.D., Abraham E.P.: Zinc as a cofactor for cephalosporinase from Bacillus cereus 569.
Biochem. J. 98, 11c–13c (1966)
84. Sanders C.C.: $-lactam resistance in gramnegative bacteria: global trends and clinical impact.
Clin. Infect. Dis. 15, 824–839 (1992)
85. Schaberg D.R., Culver D.H., Gaaynes R.P.: Major trends in the microbial etiology of nosocomial
infection. Am. J. Med. 91 (suppl.3B), 72S–75S (1991)
86. Senda K., Arakawa Y., Nakashima K., Ito H., Ichiyama S., Shimokata K., Kato N., Ohta M.:
Multifocal outbreaks of metallo-$-lactamase-producing Pseudomonas aeruginosa resistant to
broad-spectrum $-lactams, including carbapenems. Antimicrob. Agents Chemother. 40, 349–353
(1996)
87. Smith T.L., Pearson M.L., Kenneth R.: Emergence of vancomycin resistance in Staphylococcus
aureus. N. Engl. J. Med. 340, 493–501 (1999)
88. Srinivasan A., Dick J.D., Perl T.M.: Vancomycin resistance in staphylococci. Clin. Microbiol.
Rev. 15, 430–438 (2002)
89. Swalbe R.S., Ritz W.J., Werma P.R., Barranco E.A., Gilligan P.H.: Selection of vancomycin resistance in clinical isolates of Staphylococcus haemolyticus. J. Infect. Dis. 161, 45–51 (1990)
90. Tassios P.T., Gazoull M., Tzelepi E. et al.: Clonally related cefotaxime-resistant Salmonella
typhimurium isolates from Greece, Russia and Hungary. Clin. Microbiol. Infect. 5 (Suppl. 3),
75–76 (1999)
91. Tenover F.C., Mohammed M.J., Gorton T.S., Dembek Z.F.: Detection and reporting of organisms
producing extended-spectrum $-lactamases: survery of laboratories in Connecticut. J. Clin.
Microbiol. 37, 4065–4070 (1999)
92. Toleman M.A., Biedenbach D., Bennett D., Jones R.N., Walsh T.R.: Genetic characterization of a
novel metallo-beta-lactamase gene bla IMP-13, harboured by a novel Tn5051-type transposon
disseminating carbapenemase genes in Europe: report from the SENTRY worldwide antimicrobial surveillance programme. J. Antimicrob. Chemother. 52, 583–590 (2003)
93. Toleman M.A., Rolston K., Jones R.N., Walsh T.R.: blaVIM-7, an evolutionarily distinct metallobeta-lactamase gene in a Pseudomonas aeruginosa isolate from the United States. Antimicrob.
Agents Chemother. 48, 329–332 (2004)
94. Toleman M.A., Simm A.M., Murphy T.A., Gales A.C., Biedenbach D.J., Jones R.N., Walsh T.R.:
Molecular characterization of SPM-1, a novel metallo-$-lactamase isolated in Latin America:
report from the SENTRY antimicrobial surveillance programme. J. Antimicrob. Chemother. 50,
673–679 (2002)
104
95. Tracolsomboon S., Danchaivijitr S., Rongrungruang Y., Dhiraputra C., Susaemgrat W., Ito T.,
Hiramatsu K.: First report of methicillin-resistant Staphylococcus aureus with reduced susceptibility to vancomycin in Thailand. J. Clin. Microbiol. 39, 591–595 (2001)
96. Trzciñski K., Tyski S., Zarêba T., Hryniewicz W.: Opornoœæ na chemioterapeutyki wa¿nych klinicznie bakterii izolowanych w Polsce w latach 1994–1995. Mikrobiol. Med. 4, 64–71 (1996)
97. Vincent J.L., Bihari D.J., Suter P.M., Bruining H.A.: For the EPIC International Advisory Committee: The prevalence of nosocomial infection in intensive care units in Europe. Results of the
European prevalence of infection in intensive care (EPIC) study. JAMA, 274, 639–644 (1995)
98. Walsh T.R., Toleman M.A., Hryniewicz W.: Evolution of an integron carrying blaVIM-2 in Eastern
Europe: report from the SENTRY antimicrobial surveillance programme. J. Antimicrob. Chemother. 52, 116–119 (2003)
99. Watanabe M., Iyobe S., Inoue M., Mitsuhashi S.: Transferable imipenem resistance in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 35, 147–151 (1991)
100. Wernwer G., Cuny C., Schmitz F-J., Witte W.: Methicilin-resistant quinupristin-dalfopristinresistant Staphylococcus aureus with reduced sensitivity to glycopeptides. J. Clin. Microbiol.
39, 3586–3590 (2001)
101. Zeckel M.L.: Bli¿sze spojrzenie na wankomycynê, teikoplaninê i opornoœæ drobnoustrojów. Zaka¿enia, Nr 2, 3–13 (1998)
Zak³ad Mikrobiologii i Immunologii Klinicznej
Instytut Pomnik-Centrum Zdrowia Dziecka
Al. Dzieci Polskich 20, 04-736 Warszawa
105
POST. MIKROBIOL.,
2004, 43, 1, 107–127
http://www.pm.microbiology.pl
MOLEKULARNE MECHANIZMY
ODPORNOŒCI NA GRULICÊ
Wies³awa Rudnicka
1. Wprowadzenie. 2. Pierwotne zaka¿enie Mycobacterium tuberculosis. 3. Los mikobakterii w makrofagach. 4. Aktywacja komórek dendrytycznych i makrofagów przez mikobakterie. 5. Rola
cytokin w przebiegu zaka¿eñ wywo³ywanych przez mikobakterie. 6. Szczepionki rekombinantowe
BCG. 7. Uwagi koñcowe
Molecular mechanisms of resistance to tuberculosis
Abstract: Tuberculosis is a major infectious disease with up to a third of the world’s population
infected, 8–10 million people developing the active disease and about 3 million dying of tuberculosis
each year. One key to the pathogenic potential of tubercule bacilli lies in their capacity to resist
destruction by macrophages. The development of genomics, proteomics and transcriptomics have
shed light on the exploitation of macrophages by mycobacteria. The initial interaction between
mycobacterial surface components and numerous macrophage receptors is critical in determining
the fate of the bacteria in a phagocyte. The inhibition of fagosom-lysosome fusion by pathogenic
mycobacteria promote their intracellular persistence and growth. Dendritic cells which exhibit the
unique ability to activate naive T lymphocytes are critical for triggering innate and acquired
anti-mycobacterial immunity. A large body of data show the regulatory role of numerous cytokines
and chemokines in the outcome of mycobacterial infection. The recognizing of the cytokines which
up-regulate and down-regulate protective immunity to tuberule bacilli could lead the way to innovative therapeutic approaches. The effectiveness of the currently used tuberculosis vaccine, Bacillus
Calmette-Guerin (BCG) has been highly variable. Recombinant BCG bacilli with an over production
of some mycobacterial antigens or cytokines have been shown to be more effective in generating
anti-mycobacterial immunity in mice and guinea pigs than the parental BCG bacilli.
1. Introduction. 2. The primary infection with Mycobacterium tuberculosis. 3. The fate of mycobacteria
in macrophages. 4. The activation of dendritic cells and macrophages by mycobacteria. 5. The role of
cytokines in the outcome of mycobacterial infections. 6. Recombinant BCG vaccine. 7. Conclusions
1. Wprowadzenie
Ponad pó³ wieku po odkryciu streptomycyny i upowszechnieniu szczepieñ przeciwgruŸliczych BCG gruŸlica pozostaje nadal najefektywniejszym „zabójc¹” wœród
chorób zakaŸnych [21,22]. Ka¿dego roku notuje siê w œwiecie 8–10 milionów nowych zachorowañ na gruŸlicê i oko³o 3 miliony zgonów spowodowanych t¹ chorob¹. Fakt, i¿ oko³o 1/3 populacji œwiata to ludzie, którzy przebyli zaka¿enie pr¹tkiem
gruŸlicy nie rokuje dobrze na przysz³oœæ. Problem stanowi wzrastaj¹ca czêstoœæ izolowania Mycobaterium tuberculosis opornych na wszystkie znane leki przeciwpr¹tkowe [76]. Chorzy z powodu zaka¿enia takimi pr¹tkami nie mog¹ byæ wyleczeni.
Narastaj¹cy problem gruŸlicy pozostaje równie¿ w zwi¹zku z pandemi¹ wirusa HIV.
107
Oko³o 40% zgonów chorych na AIDS spowodowanych jest gruŸlic¹. Chorych tych
charakteryzuje nasilona transmisja pr¹tków, zaostrzony przebieg gruŸlicy i szybka
umieralnoœæ. Pacjenci z „lekooporn¹ gruŸlic¹” i koinfekcj¹ HIV/M. tuberculosis
umieraj¹ w ci¹gu kilku miesiêcy. Niepokoj¹ce dane epidemiologiczne powoduj¹, ¿e
w wielu krajach znacznie wzros³y nak³ady na badania mikobakterii, wyznaczników
ich chorobotwórczoœci, które nadal pozostaj¹ s³abo poznane, mechanizmów reakcji
immunologicznych towarzysz¹cych zaka¿eniom pr¹tkami gruŸlicy. Intensywne
prace poœwiêcone s¹ równie¿ opracowywaniu nowych strategii immunoprofilaktyki
i immunoterapii gruŸlicy.
2. Pierwotne zaka¿enie Mycobacterium tuberculosis
Pierwotne zaka¿enie pr¹tkami M. tuberculosis odbywa siê zazwyczaj na drodze
inhalacyjnej. Wnikaj¹ce do uk³adu oddechowego pr¹tki s¹ wychwytywane przez
makrofagi (MØ) pêcherzyków p³ucnych (Rys. 1). Tylko u nielicznych osób MØ
alweolarne s¹ na tyle aktywne, i¿ ca³kowicie niszcz¹ wnikaj¹ce pr¹tki gruŸlicy.
U takich osób nie wykrywa siê œladu zaka¿enia w postaci dodatniego skórnego testu
tuberkulinowego. Makrofagi pêcherzyków p³ucnych wiêkszoœci osób s¹ za ma³o
aktywne aby zniszczyæ wszystkie wnikaj¹ce pr¹tki. Ocenia siê, ¿e zniszczeniu na
tym etapie ulega oko³o 90% wnikaj¹cych pr¹tków gruŸlicy. Pozosta³e namna¿aj¹
siê wewn¹trz MØ. Wytwarza siê s³aba reakcja zapalna z nastêpuj¹c¹ akumulacj¹
M. tuberculosis
Nieaktywny makrofag alweolarny.
Rozwój pr¹tków. Rozpad makrofaga.
„B o j o w y”
makrofag
alweolarny.
Eliminacja pr¹tków.
Brak œladów
zaka¿enia. Test
tuberkulinowy
ujemny.
Komórki
dendrytyczne
Monocyty
Akumulacja makrofagów i
komórek dendrytycznych.
S³aba reakcja zapalna.
Makrofagi s³abo aktywne
staj¹ siê nisz¹ ¿yciow¹
patogennych pr¹tków.
Faza
1 zaka¿enia
odsprawnoœci
sprawanoœci
mechanizmów
Faza
1 zaka¿eniazale¿y
zale¿y od
mechanizmów
ODPORNOŒCIWRODZONEJ,
WRODZONEJ, aktywnoœci
pr¹tkobójczej
ODPORNOŒCI
aktywnoœci
pr¹tkobójczej
makrofagów
wirulencji pr¹tków.
makrofagów
i iwirulencji
pr¹tków.
Rys. 1. Przebieg fazy 1 pierwotnego, inhalacyjnego zaka¿enia M. tuberculosis
108
2 – 3 tydzieñ: Rozwój NABYTEJ ODPORNOŒCI KOMÓRKOWEJ
MHC-zale¿ne
rozpoznanie
antygenów
bia³kowych
pr¹tków
CD4
CD8
CD8
CD1 – zale¿ne
rozpoznanie
glikolipidów
pr¹tków
Aktywowany MØ
zabija pr¹tki
IFN-g
NO
ROI
oϾ
czn
y
s
k
oto
Cyt
CD4
NO
ROI
NK
Granuloma
T
Rozpoznanie
fosfoantygenów
pr¹tków
gd
Limfocyty T rozpoznaj¹ce
swoiste antygeny pr¹tków.
-g
IFN
Hamowanie rozwoju pr¹tków
Centralna nekroza zmian
pierwotnych, zw³óknienie.
Test tuberkulinowy dodatni
Rys. 2. Rozwój nabytej odpornoœci komórkowej podczas pierwotnego zaka¿enia M. tuberculosis.
Limfocyty T: CD4+, CD8+, CD4–/CD8– (/*; IFN-( – interferon (; NK – komórka naturalna zabijaj¹ca;
NO – tlenek azotu; ROI – aktywne pochodne tlenu
komórek dendrytycznych i makrofagów. S³abo aktywne MØ staj¹ siê nisz¹ ¿yciow¹
M. tuberculosis. Przebieg pierwszej fazy zaka¿enia gruŸliczego zale¿y od sprawnoœci mechanizmów nieswoistych odpornoœci wrodzonej. W 2–3 tygodniu po zaka¿eniu pierwotnym, nastêpuje rozwój swoistej odpornoœci komórkowej nabytej (Rys. 2).
Limfocyty grasiczozale¿ne T rozpoznaj¹ antygeny mikobakterii i ró¿nicuj¹ siê
w limfocyty efektorowe. Efektorowe limfocyty T, CD4+ i CD8+, z receptorami "/$
dla antygenu (TCR-T cell receptor), rozpoznaj¹ antygeny bia³kowe pr¹tków po³¹czone z cz¹steczkami antygenów zgodnoœci tkankowej (MHC-major histocompatibility complex) odpowiednio klasy II i I. Komórki takie wydzielaj¹ IFN-( (interferon-(), który nasila aktywnoœæ pr¹tkobójcz¹ MØ. W aktywowanych MØ zachodzi
produkcja aktywnych form tlenu oraz tlenku azotu, którego pochodne s¹ toksyczne
[63]. Takie MØ zabijaj¹ poch³aniane pr¹tki. Efektorowe limfocyty T CD4+ pobudzone antygenami pr¹tków uwalniaj¹ równie¿ czynniki zatrzymuj¹ce MØ w ognisku gruŸliczym np. czynnik zahamowania migracji MØ (MIF-migration inhibition
factor) oraz czynnik chemotaktyczny dla tych komórek (MCF-macrophage chemotactic factor). Czêœæ limfocytów T CD4+ i CD8+ rozpoznaj¹cych antygeny bia³kowe pr¹tków, ró¿nicuje siê w efektorowe komórki cytotoksyczne, które powoduj¹
lizê zaka¿onych MØ lub innych komórek, w których zachodzi rozwój pr¹tków. Podczas lizy nie dochodzi do zniszczenia mikobakterii, ale mog¹ byæ one poch³oniête
i zabite przez bardziej aktywne MØ. W odpornoœci komórkowej na pr¹tki gruŸlicy
istotn¹ rolê przypisuje siê limfocytom T posiadaj¹cym receptory TCR (/*, które
109
Serowaciej¹ca (niekompletna)
nekroza; Ÿród³o od¿ywcze dla
szybko rozwijaj¹cych siê pr¹tków
Granuloma
HAMOWANIE ROZWOJU PR¥TKÓW
UP£YNNIENIE GRANULOMA
NASILONA NEKROZA
RÓWNOWAGA
pr¹tki
odpornoϾ
gospodarza
LATENCJA
u 90 – 95 % osób
przez ca³e ¿ycie
REAKTYWACJA
Miesiace, lata ,
dziesiatki lat po
pierwotnym
zaka¿eniu u 5-10%
osób
Rys. 3. Konsekwencje zaka¿enia chorobotwórczymi pr¹tkami zale¿ne od odpornoœci/podatnoœci
gospodarza i wirulencji zaka¿aj¹cych mikobakterii
rozpoznaj¹c fosfoantygeny pr¹tków wydzielaj¹ IFN-( [58]. Inn¹ wa¿n¹ grupê komórek T stanowi¹ limfocyty rozpoznaj¹ce glikolipidy pr¹tków po³¹czone z cz¹steczkami CD1 [46,62]. W³aœciwoœciami takimi obdarzone s¹ przede wszystkim komórki
naturalnie cytotoksyczne NK (natural-killer). Podczas rozwoju odpornoœci swoistej
komórkowej na antygeny pr¹tków powstaj¹ ziarniniaki – granuloma z³o¿one z centralnie zlewaj¹cych siê wieloj¹drowych makrofagów, makrofagów nab³onkowatych
i limfocytów, g³ównie T [30]. Granuloma stanowi¹ kluczowy element odpornoœci
komórkowej. Odgraniczaj¹ one pr¹tki od zdrowej tkanki i jednoczeœnie redukuj¹
ich dostêp do czynników od¿ywczych. Nastêpuje zahamowanie rozwoju pr¹tków,
spowolnienie ich metabolizmu. W miejscach zmian pierwotnych powstaje centralna
nekroza, zwapnienie, zw³óknienie. Jednoczeœnie z rozwojem odpornoœci komórkowej dochodzi do wytworzenia nadwra¿liwoœci typu póŸnego na tuberkulinê.
Przebieg zaka¿enia M. tuberculosis zale¿y od równowagi pomiêdzy rozwojem
pr¹tków w MØ, zabijaniem ich przez fagocyty oraz nasileniem nekrozy, zw³óknienia i regeneracji tkanek (Rys. 3). U 90–95% osób, które przeby³y zaka¿enie
M. tuberculosis dochodzi do wytworzenia siê stanu równowagi pomiêdzy ulegaj¹cymi latencji pr¹tkami i odpornoœci¹ gospodarza. Takie osoby nie choruj¹ na gruŸlicê, chocia¿ nieliczne pr¹tki gruŸlicy pozostaj¹ obecne w wygaszonych ogniskach
pierwotnych. U 5–10% osób które przeby³y zaka¿enie M. tuberculosis, w ró¿nym
czasie po pierwotnym zaka¿eniu, miesi¹ce, lata, dziesi¹tki lat, dochodzi do up³ynnienia granuloma (Rys. 3). Pr¹tki wykorzystuj¹, jako materia³ od¿ywczy serowaciej¹c¹ (niekompletn¹) nekrozê tkanki objêtej zaka¿eniem. Mno¿¹ siê intensywnie
110
pozakomórkowo. Dochodzi do wieloogniskowej nekrozy i destrukcji tkanki. Charakterystyczne jest to, i¿ w bardzo zaawansowanych postaciach gruŸlicy nastêpuje
zanik dodatniej reakcji nadwra¿liwoœci typu póŸnego na tuberkulinê.
3. Los mikobakterii w makrofagach
Najwa¿niejszym wyznacznikiem chorobotwórczoœci pr¹tków jest ich zdolnoœæ
do prze¿ywania i namna¿ania siê wewn¹trz zaka¿onych komórek nie wykluczaj¹c
nieaktywnych MØ. Wnikaj¹ one do MØ za poœrednictwem ró¿norodnych receptorów transdukuj¹c sygna³y sprzyjaj¹ce ich rozwojowi lub odpornoœci gospodarza
[23]. Poch³anianie mikobakterii przez makrofagi odbywa siê za poœrednictwem
receptorów dope³niacza CR1, CR3, CR4 i receptora mannozowo-fukozylowego
[23, 66], receptora fibronektyny, receptorów integrynowych, receptorów zmiataczy
[60, 67, 74] (Rys. 4). Wykorzystuj¹c ró¿ne receptory i czynniki humoralne gospodarza pr¹tki moduluj¹ odpowiedŸ MØ. Poch³oniête pr¹tki mog¹ byæ: 1) zabite i strawione, 2) mog¹ prze¿ywaæ w fagosomach, 3) mog¹ siê mno¿yæ doprowadzaj¹c do
zniszczenia MØ i rozsiewu w organizmie, 4) mog¹ indukowaæ apoptozê MØ i utrzymywaæ siê w cia³kach apoptycznych.
Nadmierne wi¹zanie siê pr¹tków z powierzchni¹ fagocytów mo¿e hamowaæ ich
aktywnoœæ bójcz¹. Fagocytozê pr¹tków u³atwiaj¹ kolektyny: MBL (mannose binding
¯ywy wirulentny pr¹tek gruŸlicy
IgG
Konwertaza C3
L
A
M
Aktywacja dope³niacza
C3b
CR1
iC3b
CR3
CR4
FcgR
MR
Ag85
Fibron
Ma
ektyna
c
n¹t ierz z
rzk
e
om wórk
ow
a
Receptor
zmiatacz
Fagosom
MØ
Rys. 4. Interakcje ligandów mikobakterii z receptorami makrofagów poprzedzaj¹ce
proces poch³aniania pr¹tków.
C3b i iC3b – aktywne sk³adniki dope³niacza; LAM – lipoarabinomannan; Ag85 – z³o¿ony antygen pr¹tków,
CR1, CR3, CR4 – receptory dope³niacza; FcR –receptor fragmentu Fc IgG; MR – receptor mannozowy
111
Poziom lektyny wi¹¿¹cej mannozê (MBL) w surowicy
Grupy badane
MBL w surowicy (mg/l)
Chorzy na gruŸlicê Chorzy na inne ni¿ gruŸlica
n = 68
choroby p³uc n = 30
15,8
13,7
Ta b e l a I
Zdrowi
n = 64
12,6
lectin), sk³adnik dope³niacza C1q, bia³ko A surfaktantu p³uc, które jednoczeœnie blokuje produkcjê tlenku azotu (NO), którego pochodne s¹ bakteriobójcze [20, 27].
Wysoki poziom bia³ka A surfaktantu wystêpuje w p³ucach pacjentów zaka¿onych
wirusem HIV, których MØ alweolarne wi¹¿¹ pr¹tki M. tuberculosis 3-krotnie silniej
ni¿ komórki osób bez zaka¿enia HIV. Odwrotnie bia³ko surfaktantu D blokuje wnikanie pr¹tków do MØ. Sugeruje to, ¿e stê¿enie ró¿nych bia³ek surfaktantu mo¿e
korelowaæ z ryzykiem zachorowania na gruŸlicê. Z drugiej strony stê¿enie mediatora
fagocytozy pr¹tków w œrodowisku nie wydaje siê wp³ywaæ znacz¹co na poch³anianie pr¹tków przez MØ prawdopodobnie ze wzglêdu na jednoczesne oddzia³ywania
pomiêdzy ró¿nymi receptorami MØ z odpowiednimi ligandami bakterii [53].
MBL wi¹¿¹c powierzchniowe cukry pr¹tków indukuje bezpoœrednio fagocytozê
poprzez nieznany receptor albo poœrednio przez aktywacjê dope³niacza. Polimorfizm
genu MBL odpowiada zró¿nicowanemu poziomowi MBL w surowicach ró¿nych
populacji. Polimorfizm warunkuj¹cy wysokie stê¿enie MBL w surowicy rozpatrywany jest, jako zwiêkszone ryzyko zachorowania na gruŸlicê [68]. W badaniach
w³asnych stwierdziliœmy znamiennie wy¿szy poziom MBL w surowicy chorych
z aktywn¹ gruŸlic¹ ni¿ w surowicach pacjentów z innymi ni¿ gruŸlica chorobami
i surowicach osób zdrowych (Tab. I) [11].
Poch³oniête przez nieaktywne MØ chorobotwórcze mikobakterie, takie jak
M. tuberculosis, M. leprae, M. avium, modyfikuj¹ uk³ad endosomalno – lisosomalny hamuj¹c dojrzewanie fagosomów do fagolisosomów [24]. Fagosomy nieaktywnych MØ zaka¿onych mikobakteriami zachowuj¹ markery wczesnych endosomów
(Rys. 5) i nie ulegaj¹ fuzji z degraduj¹cymi lisosomami. Pr¹tkowymi czynnikami
blokuj¹cymi powstawanie fagolisosomów s¹ mannolipoarabinomannan (man-LAM),
mykozydy, czynnik wi¹zkowy.
Dok³adny mechanizm hamowania dojrzewania fagosomów przez chorobotwórcze mikobakterie pozostaje nadal s³abo poznany. Stosuj¹c metodê hybrydyzacji
– cDNA subtractive hybridization technique, zidentyfikowano gen mig M. avium,
który ulega ekspresji w pr¹tkach rozwijaj¹cych siê wewn¹trzkomórkowo, w zaka¿onych MØ, ale nie podczas wzrostu pr¹tków w pod³o¿ach bakteriologicznych [48].
P l u m i C l a r k - C u r t i s s [57] wykazali, i¿ gen mig koduje bia³ko 58 kDa
o aktywnoœci syntetazy acylo koenzymu A (acyl-CoA), dla której substratem s¹
œrednio- i nienasycone d³ugo-³añcuchowe kwasy t³uszczowe. Obecnie, metoda
selektywnego wychwytywania sekwencji transkrybowanych (selective capture of
transcribed sequences – SCOTS), umo¿liwi³a identyfikacjê licznych genów, które
ulegaj¹ ekspresji w ró¿nym czasie po zaka¿eniu makrofagów pr¹tkami. H o u i wsp.
112
WCZESNE
ENDOSOMY
NIEPATOGENNE PR¥TKI
¯YWE M. tuberculosis
ZABIJANIE / TRAWIENIE
PR¥TKÓW
ROZWÓJ PR¥TKÓW
Rys. 5. Los chorobotwórczych i niepatogennych mikobakterii w makrofagach
[36] stosuj¹c tê metodê zidentyfikowali szereg genów pr¹tków M. avium ulegaj¹cych wzmo¿onej ekspresji wczeœnie, 48 godz. po zaka¿eniu makrofagów, podczas
d³u¿szej, 110 godz. obecnoœci w makrofagach, takich które ulega³y ekspresji wy³¹cznie w pr¹tkach hodowanych w pod³o¿u, oraz takich które ulega³y ekspresji
w ka¿dych warunkach. Analiza sekwencyjna pozwoli³a wœród genów pr¹tków ulegaj¹cych wzmo¿onej ekspresji w 48 godz. po zaka¿eniu MØ, zidentyfikowaæ miêdzy
innymi geny potencjalnie identyczne z genami M. tuberculosis koduj¹cymi lipoproteinê LprM, transporter magnezu BRAMP, przezb³onowe bia³ko NRAMP. Wœród
genów ulegaj¹cych ekspresji w pr¹tkach rozwijaj¹cych siê w fagosomach makrofagów, w 110 godz. po zaka¿eniu (czas generacji M. avium w makrofagach oceniono
na 20 godz.), zidentyfikowano miêdzy innymi geny o potencjalnej funkcji syntazy
ATP – AtpA i syntazy mikobaktyny MbtE M. tuberculosis. Liczne geny ulega³y
ekspresji w pr¹tkach zarówno w 48, jak i 110 godz. po zaka¿eniu MØ, ale nie
w bakteriach hodowanych w pod³o¿u. Przyk³adowo by³y to geny o potencjalnej funkcji dehydrogenazy kwasu "-ketoglutarowego SucA, prekursora bia³ka 85A antygenu
32 kDa (FbpA), deaminazy adenozyny (Add), syntazy fosforanu ","-trehalozy.
Patogenne mikobakterie zak³ócaj¹ dzia³anie pompy protonowej ATP co zapewnia utrzymanie pH fagosomu na poziomie 6,3 zamiast 5,2 i sprzyja rozwojowi pr¹tków [70]. Pewnym wyjaœnieniem molekularnego mechanizmu zahamowania dojrzewania i zakwaszania fagosomów przez chorobotwórcze mikobakterie jest brak
wzrostu stê¿enia Ca2+ w cytosolu MØ poch³aniaj¹cych ¿ywe M. tuberculosis, pozostaj¹cy w korelacji z zahamowaniem fuzji fagosomów z lisosomami i prze¿ywalnoœci¹ pr¹tków [42]. Postawiono hipotezê, ¿e upoœledzona aktywacja efektorowych
bia³ek zale¿na od Ca2+, kalmoduliny (CaM) i kinazy bia³kowej II zale¿nej od uwapnionej kalmoduliny [Ca2+-bound CaM (Ca2+-CaM) – dependent protein kinaze II
113
(CaMKII)] pe³ni istotn¹ rolê w prze¿ywaniu pr¹tków. Weryfikuj¹c tê hipotezê stwierdzono, i¿ fagosomy zawieraj¹ce ¿ywe M. tuberculosis wykazywa³y obni¿ony poziom kalmoduliny i kinazy proteinowej II zale¿nej od uwapnionej kalmoduliny
w porównaniu do fagosomów zawieraj¹cych zabite pr¹tki. Dodatkowo, podwy¿szenie poziomu Ca2+ przez inkubacjê makrofagów w obecnoœci jonoforu Ca2+ A23187,
powodowa³o zyskiwanie kalmoduliny i aktywacjê CaMKII na fagosomach zawieraj¹cych ¿ywe M. tuberculosis. Odwrotnie u¿ycie chelatora Ca2+ MAPTAM blokowa³o
dojrzewanie fagosomów wywo³ane dzia³aniem jonoforu Ca2+ i nasila³o wewn¹trzkomórkowe prze¿ywanie pr¹tków. Obserwacje te zwracaj¹ uwagê, i¿ upoœledzone
pobudzanie komponentów sygna³owych aktywowanych wapniem sprzyja prze¿ywaniu i rozwojowi chorobotwórczych pr¹tków w makrofagach.
Inn¹ konsekwencj¹ blokowania dojrzewania i zakwaszania fagosomów przez
chorobotwórcze mikobakterie mo¿e byæ zahamowanie przetwarzania i prezentacji
antygenów pr¹tków limfocytom T CD4+ bowiem przetwarzanie antygenów, które
mog¹ byæ prezentowane w po³¹czeniu z cz¹steczkami MHC klasy II, zachodzi
w przedzia³ach o niskim pH. Zatem zahamowanie dojrzewania fagolisosomów mo¿e
powodowaæ zahamowanie rozwoju efektorowych limfocytów CD4+, których produkty aktywuj¹ makrofagi zwiêkszaj¹c ich aktywnoœæ pr¹tkobójcz¹ [51].
Pomimo, i¿ chorobotwórcze mikobakterie opóŸniaj¹ dojrzewanie fagosomów do
fagolisosomów to pozostaj¹ one w ³¹cznoœci z uk³adem endosomalnym co zapewnia
im dostêp czynników od¿ywczych i wzrostowych [16, 64]. Obserwowano przenikanie cz¹steczek o wzglêdnie niskiej masie (dekstranu 70 kDa) z cytosolu do „mikobakteriowego fagosomu” oraz lipoarabinomannanu (LAM) pr¹tków zlokalizowanych w fagosomach do cytosolu, a nawet do œrodowiska zewn¹trzkomórkowego
[4, 54, 69, 75]. Niedojrza³e fagosomy zawieraj¹ce ¿ywe pr¹tki ulegaj¹ recyrkulacji
z mo¿liwoœci¹ pozyskiwania receptorów transferynowych i egzogennych glikolipidów [51]. Z drugiej strony, mikobakteriowe glikolipidy s¹ wydzielane poza fagosomy
i mog¹ ulegaæ transferowi do komórek s¹siednich w procesie egzocytozy. Wydzielane glikolipidy mog¹ ³¹czyæ siê z cz¹steczkami CD1 i spekuluje siê, ¿e w po³¹czeniu
z CD1 mog¹ one byæ rozpoznawane przez odpowiedni¹ subpopulacjê limfocytów T
[59] co mo¿e mieæ znaczenie w odpornoœci.
Mikobakterie s¹ wyj¹tkowo bogate w lipidy, w tym tak¿e w lipoproteiny. Jedn¹
z nich jest lipoproteina 19 kDa obecna tak¿e w BCG [32]. Zwi¹zana jest ona ze
œcian¹ pr¹tków i podlega potranslacyjnej acylacji i glikozylacji [51]. Stymuluje ona
wrodzon¹ odpornoœæ poprzez receptor Toll-like (Rys. 6). Jest tak¿e rozpoznawana
przez swoiste przeciwcia³a oraz efektorowe limfocyty T w³¹czaj¹c limfocyty
CD8+. Œledz¹c los lipoproteiny 19kDa w MØ zaka¿anych ¿ywymi pr¹tkami BCG
lub M. tuberculosis H37Rv, wykazano jej „eksport” poza fagosom ju¿ w czasie
1 godz. od zaka¿enia makrofagów. Takiego zjawiska nie obserwowano w MØ inkubowanych z zabitymi pr¹tkami; w tym przypadku antygen 19 kDa pozostawa³ na
powierzchni pr¹tków. Zjawiska „eksportu” nie obserwowano w odniesieniu do dysmutazy ponadtlenkowej mikobakterii. ¯ywy rekombinant M. vaccae z ekspresj¹
genu lipoproteiny 19 kDa M. tuberculosis u¿yty do zaka¿enia makrofagów pozwoli³
równie¿ obserwowaæ zjawisko „eksportu” lipoproteiny ju¿ w 1 godz. po zaka¿eniu,
114
M. tuberculosis
LBP
CD14
L
A
M
TL
R2
19-kDa lipoproteina
TL
R2
CD14
?
CD14
DNA ?
TL
R4
?
TL
R6
TL
R9
AKTYWACJA KINAZ
NFkB
AKTYWACJA Makrofaga
MØ
Rys. 6. Udzia³ receptorów Toll – podobnych (TLR – Toll-like receptor) w aktywacji makrofagów.
LBP – bia³ko wi¹¿¹ce LPS/LAM; LAM – lipoarabinomannan; CD14 – receptor makrofaga
(PRR – pattern recognition receptor)
podobnie jak to obserwowano w doœwiadczeniu z pr¹tkami BCG. Fagosomy zawieraj¹ce rekombinanty M. vaccae – 19 kDa lub BCG – 19 kDa nie ulega³y zakwaszeniu
przez wiele godzin na co wskazywa³ brak v-ATPazy w ich b³onach. Fagosomy takie
nie akumulowa³y kwasotropowego barwnika, jakim jest „Lysotracker”. Stosuj¹c
rekombinanty M. vaccae zawieraj¹ce zmutowan¹ lipoproteinê 19 kDa wykazano znaczenie acylacji w mo¿liwoœci jej „wydobywania siê” poza fagosomy. Ponadto wykazano, i¿ lipoproteina 19 kDa, jako rekombinowane bia³ko w M. vaccae, stanowi³a
Ÿród³o peptydów rozpoznawanych przez limfocyty T CD8+ cytotoksyczne, pobudzane przez immunopeptydy przetwarzane w cytosolu zaka¿onych komórek docelowych.
Œledz¹c los chorobotwórczych mikobakterii w MØ powstaje pytanie, w jaki
sposób bakterie te „chroni¹” MØ stanowi¹ce ich niszê ¿yciow¹ przed zniszczeniem.
Okazuje siê, i¿ in vivo, mog¹ one hamowaæ apoptozê. M o g g a i wsp. [45]
wykazali nadekspresjê onkogenu Bcl-2 w MØ garnuloma p³uc myszy zaka¿anych
dootrzewnowo M. tuberculosis. Onkogen ten nadaje odpornoœæ na apoptozê, a jego
koncentracjê obserwowano w miejscach intensywnego wewn¹trzkomórkowego
rozwoju pr¹tków. Dla wewn¹trzkomórkowego rozwoju M. tuberculosis w makrofagach istotne znaczenie mo¿e mieæ nadekspresja ligandu FasL na MØ „prze³adowanych” pr¹tkami, jakie wystêpuj¹ w granuloma p³uc chorych na gruŸlicê.
Sugeruje siê, ¿e MØ z nadekspresj¹ FasL mog¹ unikaæ zniszczenia przez efektorowe
komórki T cytotoksyczne indukuj¹c w nich proces apoptozy poprzez cz¹steczki
Fas limfocytów [50]. Jednak zdaniem innych badaczy [65] wywo³ana dzia³aniem
mikobakterii apoptoza zaka¿onych MØ dostarcza cia³ek apoptycznych zawieraj¹cych
115
mikobakteriowe antygeny, które nastêpnie mog¹ byæ prezentowane przez komórki
dendrytyczne, w po³¹czeniu z cz¹steczkami MHC klasy I lub CD1b, limfocytom T
cytotoksycznym CD8+.
4. Aktywacja komórek dendrytycznych i makrofagów przez mikobakterie
Niedojrza³e komórki dendrytyczne p³uc (<1% ogó³u komórek), podobnie, jak
MØ wykazuj¹ silne w³aœciwoœci fagocytarne wobec M. tuberculosis [10]. Poch³aniaj¹ one pr¹tki g³ównie za poœrednictwem adhezyny DC-SIGN (dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3 grabbing nonintegrin) rozpoznaj¹cej reszty
mannozy w man-LAM [73,74]. W przeciwieñstwie do MØ, komórki dendrytyczne
wykazuj¹ raczej pr¹tkostatyczn¹ ni¿ pr¹tkobójcz¹ aktywnoœæ. Stanowi¹ one wa¿ny
rezerwuar pr¹tków; u myszy zaka¿anych do¿ylnie pr¹tkami M. bovis BCG, ¿ywe
pr¹tki by³y obecne w komórkach dendrytycznych jeszcze 2 tygodnie po zaka¿eniu
[37]. Od myszy zaka¿anych rekombinowanymi pr¹tkami BCG z ekspresj¹ bia³ka
MalE E. coli, w ci¹gu 1–2 dni po zaka¿eniu, mo¿na by³o izolowaæ komórki dendrytyczne prezentuj¹ce bia³ko MalE swoistym klonom limfocytów T (Rys. 7). Takiej
w³aœciwoœci nie wykazywa³y izolowane od zwierz¹t MØ, albo ze wzglêdu na s³ab-
12 godz po zaka¿eniu
alE
ji M
ntac
e
z
e
k pr
Bra
T
T T
T T
T
T
e
ist
wo
-s
lE
Ma
MalE E.coli
MMØ
Ø
MØ
Prezentacja MalE
Proliferacja.
Produkcja
cytokin.
rBCG-MalE
do¿ylnie
Komórki
dendrytyczne
Rys. 7. Rola komórek dendrytycznych w prezentowaniu antygenów mikobakterii
efektorowym limfocytom T.
MalE – antygen bia³kowy E. coli; rBCG-MalE – rekombinant BCG produkuj¹cy MalE;
linie limfocytów T o swoistoœci w stosunku do MalE
116
sz¹ ekspresjê antygenów MHC, albo na skutek braku powstawania w³aœciwych immunopeptydów podczas zablokowanego zakwaszania i dojrzewania fagosomów do
fagolisosomów. Ostatni¹ mo¿liwoœæ wydaje siê popieraæ fakt, i¿ aktywnoœæ prezentowania antygenu MalE limfocytom T wykazywa³y komórki dendrytyczne izolowane
tylko podczas 2 pierwszych dni po zaka¿eniu myszy BCG-MalE, ale nie póŸniej,
kiedy nastêpowa³o os³abienie ekspresji cz¹steczek MHC na ich powierzchni [37].
Rozpoznanie M. tuberculosis przez MØ przebiega z udzia³em receptorów Toll-like
(TLR) [78]. Bia³ko wi¹¿¹ce LPS (LPS-binding protein – LBP) wi¹¿e LAM œciany
komórkowej pr¹tków i przenosi go na makrofagowe cz¹steczki CD14 tworz¹ce kompleks z receptorem TLR2 (Rys. 6). Podobnie nastêpuje wi¹zanie lipoproteiny 19 kDa
pr¹tków do kompleksów CD14-TLR2 lub CD14-TLR6 [61]. W rozpoznawaniu powierzchniowej, niezidentyfikowanej struktury pr¹tków bierze równie¿ udzia³ kompleks CD14-TLR4 oraz TLR9 wi¹¿¹cy prawdopodobnie DNA bakterii. Konsekwencj¹ interakcji powierzchniowych struktur mikobakterii z tzw. pattern recognition
receptors (PRR) MØ i komórek dendrytycznych jest uruchomienie szlaku sygnalizacyjnego obejmuj¹cego cz¹steczki My88 (myeloid differentiation protein 88), kinazy
IRAK (IL-1-associated kinase) i czynniki transkrypcyjne takie, jak NF6B. Dochodzi
do pobudzenia produkcji cytokin i ekspresji cz¹stek kostymuluj¹cych warunkuj¹cych
dzia³anie mechanizmów odpornoœci wrodzonej i nabytej [10, 31, 62].
Kluczowa rola receptorów Toll-like w rozpoznawaniu wzorów strukturalnych
pr¹tków i przekazywaniu sygna³ów aktywacji w fagocytach nasuwa przypuszczenie, ¿e ich polimorfizm mo¿e warunkowaæ zró¿nicowan¹ odpowiedŸ organizmów
na zaka¿enie M. tuberculosis i podatnoœæ/odpornoœæ na gruŸlicê. Cz¹steczki CD14 s¹
nieodzowne dla aktywacji komórek z udzia³em receptorów Toll-podobnych. W surowicach pacjentów z aktywn¹ gruŸlic¹ stwierdziliœmy znamiennie wy¿szy poziom
rozpuszczalnych cz¹steczek CD14 (soluble CD14 – sCD14) w porównaniu do poziomu wykrywanego w surowicach osób zdrowych (Tab. II) [D r u s z c z y ñ s k a,
K a r t t u n e n, R u d n i c k a, wyniki nie publikowane]. Mo¿e to sugerowaæ znaczenie polimorfizmu CD14 w podatnoœci na gruŸlicê.
Ta b e l a I I
Poziom sCD14 w surowicach chorych na gruŸlicê i osób zdrowych
Grupa badana
sCD14 w surowicy :g/ml
Chorzy na gruŸlicê
3234 ± 1410
Osoby zdrowe
1516 ± 398
5. Rola cytokin w przebiegu zaka¿eñ wywo³ywanych przez mikobakterie
Ograniczenie zaka¿enia wywo³ywanego przez chorobotwórcze mikobakterie zale¿y w istotny sposób od dzia³ania cytokin i chemokin produkowanych i wydzielanych przez stymulowane pr¹tkami i ich produktami komórki dendrytyczne, limfocyty, MØ, a nawet granulocyty [2, 38, 71, 69]. Na Rys. 8 przedstawiono schemat
117
M. tuberculosis
Stymulacja komórek
produkuj¹cych IFN-g
Samoindukcja
(IL-12, IL-15, IL-18)
TNF-a, IL-1b, IFN-g
IFN- g
MAKROFAG /Kom.
DENDRYTYCZNA
Ostra faza
odpowiedzi
IL-6
Chemotaksja
Tworzenie
granuloma
IL-8, MCP-1, MIP-1a,
RANTES
Inicjacja odpornoœci
NABYTEJ KOMÓRKOWEJ
g³ównie TH1
MHC, CD1, CD80, CD86, IL-27,
IL-12, IL-23, IL-18, TNF-a,
OdpowiedŸ antygenowo
swoistych limfocytów T
Hamowanie rozwoju pr¹tków przez MØ
(IFN-g, TNFa, granulizyna)
Rys. 8. Oddzia³ywania cytokinowe w przebiegu odpowiedzi immunologicznej
na chorobotwórcze mikobakterie.
TNF-" – czynnik martwicy guzów "; IL – interleukina; IFN-( – interferon (; MHC – antygen
g³ównego uk³adu zgodnoœci tkankowej; CD80 i CD86 – cz¹steczki kostymuluj¹ce komórek
dendrytycznych; MCP-1 – bia³ko chemotaktyczne monocytów, MIP-1a – bia³ko zapalne
makrofagów; RANTES – chemokina regulowana przez aktywacjê
obrazuj¹cy udzia³ produkowanych przez komórki dendrytyczne i MØ cytokin i chemokin decyduj¹cych o powstawaniu granuloma, które hamuj¹ skutecznie rozwój
mikobakterii. Ostr¹ fazê odpowiedzi na zaka¿enie mikobakteriami reguluj¹ IL-6,
TNF-", IL-1$, IFN-( dzia³aj¹ce w sposób autokrynny [9]. Chemotaktycznie dzia³aj¹ca IL-8, bia³ko chemotaktyczne dla monocytów MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), bia³ko zapalne makrofagów MIP-1a (macrophage inflammatory protein 1a) i RANTES stanowi¹ wa¿ne Ÿród³o komórek zapalnych dla powstaj¹cych
granuloma. Zasadnicze znaczenie nale¿y przypisaæ IL-12 [12] uwalnianej przez
pobudzane pr¹tkami MØ i komórki dendrytyczne, która wspó³dzia³aj¹c z IL-15
i IL-18 potêguje dzia³anie mechanizmów odpornoœci wrodzonej stymuluj¹c przede
wszystkim komórki NK do produkcji IFN-( zwiêkszaj¹cego aktywnoœæ pr¹tkobójcz¹ MØ [77]. Jednoczeœnie IL-12 odgrywa zasadnicz¹ rolê w inicjowaniu rozwoju
swoistej odpornoœci komórkowej promuj¹c rozwój swoistych efektorowych limfocytów T CD4+ typu Th1, które pobudzone przez antygeny pr¹tków wydzielaj¹
IFN-( i czynnik wzrostowy wszystkich limfocytów, jakim jest IL-2. W œrodowisku
produkowanych przez MØ cytokin, dochodzi do nasilonej ekspresji na komórkach
dendrytycznych antygenów MHC klasy II i I, CD1 i cz¹steczek kostymuluj¹cych
CD80 i CD86 pe³ni¹cych wa¿n¹ rolê w prezentowaniu antygenów pr¹tków limfocytom T. Efektorowe limfocyty T swoiste w stosunku do antygenów pr¹tków, g³ównie
CD4+ Th1 s¹ nieodzowne dla powstawania granuloma i efektywnego hamowania
118
Cytokiny, których deficyt zwiêksza dzia³anie mikobacterii
Cytokina
Dzia³anie ochronne
T a b el a III
Udzia³ w patogenezie
TNF-" Powstawanie granuloma, aktywacja MØ i KD. W gruŸlicy, gor¹czka, wyniszczenie,
Nasilona aktywnoœæ pr¹tkobójcza MØ.
wysoki poziom cytokiny w BAL/surowicy.
Indukowanie apoptozy zaka¿onych MØ.
Silny rozwój pr¹tków w MØ alweolarnych
(in vitro).
IL-1$
U myszy IL-1–/– lub IL-R–/– silny rozwój
pr¹tków. Brak powstawania granuloma.
Zawy¿ony poziom w ogniskach
gruŸliczych.
IL-6
Myszy IL-6–/– wykazuj¹ zwiêkszon¹
podatnoœæ na zaka¿enie pr¹tkami.
Hamowanie produkcji IFN-(.
Wczesna produkcja w zaka¿eniu.
IL-12
Indukcja produkcji IFN-( (NK, MØ). Rozwój U chorych na gruŸlicê obecna
limfocytów Th1 (dalsza produkcja IFN-().
w wysiêkach p³ucnych, granuloma, tak¿e
Mutacja genów IL-12p40 i IL-12R zwiêksza w limfodenopatiach.
ryzyko gruŸlicy.
IL-18
Aktywacja limfocytów Th1 do produkcji
IFN-(. Myszy IL-18–/– bardziej podatne na
zaka¿enie. Os³abiona produkcja u chorych
na gruŸlicê.
INF-(
Nasilenie aktywnoœci bójczej MØ. Wzrost
ekspresji antygenów MHC klasy II i I na
PC. Produkowany od pocz¹tku zaka¿enia,
kolejno przez NK, MØ, limfocyty T (/* i "/$
CD4 i CD8. Wspomaga leczenie gruŸlicy.
IL-4
U myszy IL–/– nadmierny rozrost granuloma Nadprodukcja IL-4 u chorych
jest przyczyn¹ rozwoju wirulentnych pr¹tków. z zaawansowan¹ gruŸlic¹.
Jednoj¹drzaste leukocyty krwi chorych na
gruŸlicê s³abo produkuj¹ IFN-(
w odpowiedzi na antygeny mikobakterii
w skutek dzia³ania immunosupresyjnego
man-LAM i czynnika wi¹zkowego pr¹tków.
rozwoju chorobotwórczych mikobakterii. Swoistym limfocytom T CD8+ przypisuje
siê nieco mniejsze znaczenie w odpornoœci adaptacyjnej na mykobakterie. Tym
niemniej komórki te mog¹ niszczyæ w reakcji cytotoksycznej komórki, w których
dochodzi do namna¿ania siê pr¹tków i stanowi¹ one wa¿ne Ÿród³o IFN-(. Efekty
prozapalnej odpowiedzi MØ i komórek dendrytycznych na komponenty mikobakterii s¹ os³abiane przez czynniki przeciwzapalne. Rozpuszczalne receptory I i II
TNF-" zapobiegaj¹ wi¹zaniu cytokiny do komórek. Receptory IL-Ra antagonizuj¹
IL-1$. IL-10 i TGF-$ (transforming growth factor - $) ograniczaj¹ aktywacjê limfocytów Th i polaryzuj¹ odpowiedŸ komórkow¹ Th1/Th2 promuj¹c rozwój limfocytów
Th2 produkuj¹cych IL-4, IL-5 i IL-13. Z drugiej strony IL-10 powoduje konwersjê
komórek dendrytycznych w komórki podobne do makrofagów (macrophage-like)
wykazuj¹cych zwiêkszon¹ aktywnoœæ pr¹tkobójcz¹ [26]. W Tabeli III i IV, przedstawiono w skrócie informacje o roli cytokin w przebiegu zaka¿eñ wywo³ywanych
przez chorobotwórcze pr¹tki, zwracaj¹c uwagê na ich dzia³anie nasilaj¹ce odpornoœæ przeciwpr¹tkow¹ gospodarza (Tab. III) i hamuj¹c¹ mechanizmy obronne
(Tab. IV), a tym samym potêguj¹c¹ chorobotwórcze dzia³anie bakterii i ich rozwój
119
Cytokiny wykrywane w wysokim stê¿eniu u chorych na gruŸlicê
Cytokina
IL-10
T a b e l a IV
Udzia³ w patogenezie
Hamowanie produkcji IFN-(, IL-12, TNF-", NO, ekspresji antygenów MHC klasy II na
komórkach prezentuj¹cych antygeny. Hamowanie rozwoju odpornoœci komórkowej
wrodzonej i nabytej. Hamowanie apoptozy MØ prze³adowanych pr¹tkami. Nadprodukcja
u chorych na gruŸlicê zw³aszcza tych z anergi¹ na tuberkulinê.
TGF-$ Hamowanie proliferacji i produkcji IFN-( przez limfocyty T pobudzane antygenami
mikobakterii. Hamowanie nadwra¿liwoœci typu póŸnego na tuberkulinê u chorych
z zaawansowan¹ gruŸlic¹.
IL-8
Obecna w wysokim stê¿eniu w BAL chorych na gruŸlicê, zw³aszcza tych ze z³ym
rokowaniem.
zewn¹trzkomórkowy i wewn¹trzkomórkowy. Prezentuj¹c dane zawarte w tabelach
3–4 trzeba zauwa¿yæ, i¿ ci¹gle istnieje wiele kontrowersji dotycz¹cych roli oddzia³ywañ cytokinowych w przebiegu zaka¿eñ wywo³ywanych przez pr¹tki gruŸlicy wynikaj¹cych z: 1) tylko czêœciowego odwzorowywania w modelach zwierzêcych przebiegu gruŸlicy u ludzi, 2) u¿ywania modelu myszy ze wzglêdu na dostêpnoœæ
materia³ów biologicznych do badañ, 3) prowadzenia badañ u zwierz¹t zaka¿anych
do¿ylnie lub dootrzewnowo zamiast inhalacyjnie i u¿ywanie do zaka¿enia zbyt
wysokiego inoculum, 4) wyrywkowego badania poszczególnych cytokin lub ich
receptorów. Wprowadzony ostatnio do badañ system cDNA microarray pozwalaj¹cy jednoczeœnie œledziæ transkrypcjê setek genów, zarówno in vitro, jak i in vivo,
z pewnoœci¹ pozwoli lepiej zrozumieæ ci¹gle s³abo poznane w³aœciwoœci chorobotwórcze pr¹tków gruŸlicy i protekcyjne i patologiczne reakcje indukowane przez nie
u zaka¿onych gospodarzy. Stosuj¹c system cDNA microarray, C o u s s e n s i wsp.
[19] wykazali, i¿ w jednoj¹drzastych leukocytach krwi pochodz¹cych od byd³a
z objawow¹ chorob¹ Crohn’a, pr¹tki M. pseudotuberculosis indukowa³y represjê a¿
83 genów (np. koduj¹cych czynnik wzrostu fibroblastów i kinazê bia³kow¹ Lyn B)
i ekspresjê tylko 8 genów (np. IL-10, INF-(, cz¹steczki kostymuluj¹cej CD40L,
tkankowego inhibitora metaloproteinaz). Odwrotnie w identycznie zaka¿anych jednoj¹drzastych leukocytach krwi pochodz¹cych od byd³a z bezobjawowym zaka¿eniem M. pseudotuberculosis obserwowano represjê tylko 16 genów (np. receptora
IL-1 – IL-R1, bia³ka fibrynogeno-podobnego) i ekspresjê a¿ 71 genów (np. CD40L,
metaloproteinaz). Lepszego zrozumienia procesów immunologicznych protekcyjnych i patologicznych w zaka¿eniach wywo³ywanych przez mikobakterie powinny
wkrótce dostarczyæ prace bazuj¹ce na ostatnio ustalonej sekwencji produkcji cytokin przez komórki dendrytyczne pobudzane przez wewn¹trzkomórkowe patogeny
(Rys. 9). Jako pierwsza po zaka¿eniu, produkowana jest IL-27 aktywuj¹ca limfocyty
niedojrza³e Th0 i Th0/1 posiadaj¹ce receptory WSX-1 [12]. Nastêpnie wydzielana
IL-12 powoduje ró¿nicowanie siê efektorowych komórek Th1. Wi¹¿¹cy siê do receptora IL-12R$1 homodimer ³añcucha ciê¿szego IL-12 – (p40)2 blokuje dzia³anie tej
120
(p40)2
Th0
IL-27
Th0/1
Th efektorowy
Th
pamiêci
IL-12
APC
IL-18
IL-23
pr¹tki
Rys. 9. Udzia³ cytokin z rodziny IL-12 w promowaniu odpowiedzi komórkowej Th1.
Th – limfocyt pomocniczy; APC – komórka prezentuj¹ca antygen; (p402) – homodimer ciê¿szego ³añcucha IL-12
cytokiny [34]. W wyniku dzia³ania IL-12 dochodzi do ekspresji receptora dla IL-18
na limfocytach Th1 efektorowych, która dzia³a synergistycznie z IL-12 w promowaniu odpowiedzi komórek Th1 [7, 8, 28, 80]. Produkowana przez zaka¿one
komórki dendrytyczne IL-23 dzia³a na komórki Th1 pamiêciowe.
6. Szczepionki rekombinowane BCG
Od 1948 r oko³o 2,5 biliona ludzi zaszczepiono szczepionk¹ BCG. Jej zalety to:
mo¿liwoœæ aplikacji tu¿ po urodzeniu i powtórnego szczepienia w wieku póŸniejszym, wzglêdnie d³ugotrwa³y efekt immunizacji, indukcja odpornoœci komórkowej
z aktywacj¹ limfocytów pomocniczych CD4 + /Th1 i limfocytów cytotoksycznych
CD8, niska cena, bezpieczeñstwo.
Obecnie u¿ywane szczepionki BCG pochodz¹ z atenuowanego przez Calmette
i Guérin szczepu M. bovis uzyskanego po wykonaniu (w latach 1908–1921) ok.
230 pasa¿y bakterii na pod³o¿u ziemniaczanym z glicerolem i ¿ó³ci¹. Mo¿na podzieliæ je na dwie grupy. BCG Tokyo, Moreau, Rosyjski i Szwedzki wydzielaj¹
du¿o antygenu MPB70, posiadaj¹ dwie kopie insercyjne ISI986, zawieraj¹ metoksymykolan i gen MPB64. Szczepy BCG Pasteur, Kopenhaga, Glaxo i Tice wydzielaj¹ ma³o MPB70, maj¹ pojedyncz¹ sekwencjê insercyjn¹ ISI986, nie posiadaj¹
metoksymykolanu i genu MPB64 [25, 40, 43,44]. Porównuj¹c genomy szczepów BCG
i M. tuberculosis wykazano 16 delecji [5, 13, 41, 55]. W szczepach wirulentnych
121
M. bovis stwierdzano brak 11 regionów. Regionu RD1 nie stwierdzono w ¿adnym
podszczepie BCG chocia¿ by³ on obecny we wszystkich laboratoryjnych i klinicznych szczepach M. tuberculosis i M. bovis. Ten region prawdopodobnie zosta³ utracony podczas atenuacji szczepionkowego BCG [14]. Ostatnio przedstawiono sugestiê, i¿ ograniczona zdolnoœæ pr¹tków M. bovis BCG do prze¿ywania w organizmie
spowodowana jest pewnym defektem w katabolizmie alaniny i seryny [15].
Szczepionka BCG od pocz¹tku budzi³a wiele kontrowersji [29]. Jej skutecznoœæ
oceniana jest na 0 do 80% protekcji w zale¿noœci od obszarów geograficznych [1].
Aktualnie prowadzone s¹ intensywne badania nad mo¿liwoœci¹ wykorzystania szczepionki BCG jako noœnika rekombinowanych antygenów ró¿norodnych patogenów,
wirusów, bakterii i parazytów [39]. Efektywnoœæ takich szczepionek zale¿y od rodzaju u¿ytego promotora, sekwencji sygna³owej, noœnika bia³kowego, jak i wektora.
Znajomoœæ genomu M. tuberculosis [18] i nowoczesne techniki proteomiki i transkryptomiki rokuj¹ postêp w rozpoznaniu genów i bia³ek bakterii, które ulegaj¹ ekspresji podczas zaka¿eñ, i które mog¹ byæ docelowe w nowo produkowanych szczepionkach przeciwgruŸliczych [6, 17, 49].
Wyró¿nia siê dwa typy optymalizowanych rekombinowanych pr¹tków BCG,
kandyduj¹cych na nowe szczepionki przeciwgruŸlicze. rBCG typu I produkuj¹ antygeny protekcyjnej w zwiêkszonej iloœci. Przyk³adem mo¿e byæ rBCG z ekspresj¹
bia³ka 18 kDa M. leprae stymuluj¹cy u myszy produkcjê przeciwcia³ przeciwko bia³ku 18 kDa i ró¿nicowanie efektorowych limfocytów proliferuj¹cych w odpowiedzi
na ten antygen [3]. Rekombinant BCG z nadprodukcj¹ antygenu Ag85A mikobakterii hamowa³ namna¿anie M. leprae w poduszeczkach ³ap myszy bardziej skuteczne
ni¿ rodzicielski szczep BCG [52]. Podobnie rBCG produkuj¹cy antygen sekrecyjny
30 kDa M. tuberculosis skuteczniej chroni³ œwinki morskie przed inhalacyjnym zaka¿eniem pr¹tkami gruŸlicy ni¿ wyjœciowe pr¹tki BCG [35]. Rekombinowane pr¹tki
BCG typu II reguluj¹ proces przetwarzania i prezentacji antygenów pr¹tków. Tak¹
szczepionk¹ jest rBCG wydzielaj¹cy aktywn¹ biologicznie listeriolizynê O Listeria
monocytogenes. Listeriolizyna O jest tworz¹c¹ pory hemolizyn¹ niszcz¹c¹ b³onê
fagosomu i umo¿liwiaj¹c¹ przenikanie ¿ywych bakterii do cytosolu komórek. Umo¿liwia to przetwarzanie antygenów bakterii w cytosolu, ich ³¹czenie z cz¹steczkami
MHC klasy I, w której to postaci s¹ rozpoznawane przez cytotoksyczne limfocyty T
(cytotoxic T lymphocytes – CTL) niszcz¹ce komórki zaka¿one pr¹tkami [33].
Uwzglêdniaj¹c istotn¹ rolê IL-18 w odpornoœci na wewn¹trzkomórkowe patogeny
skonstruowano równie¿ pr¹tki produkuj¹ce tê interleukinê [7]. Wyniki dotychczasowych badañ sugeruj¹, i¿ rekombinanty BCG-IL-18 mog¹ w wiêkszym stopniu ni¿
rodzicielskie pr¹tki BCG promowaæ rozwój odpowiedzi komórkowej typu Th1 istotnej dla odpornoœci na gruŸlicê [7]. W pracach nad now¹ szczepionk¹ przeciwgruŸlicz¹ uwzglêdnia siê równie¿ mo¿liwoœæ wykorzystania niechorobotwórczych pr¹tków M. vaccae. Inaktywowane ciep³em M. vaccae podawane doskórnie zdrowym
doros³ym osobom by³y dobrze tolerowane i wzbudza³y rozwój odpowiedzi immunologicznej na antygeny mikobakterii [79]. W modelach zwierzêcych odpornoœæ na
zaka¿enie M. tuberculosis udaje siê równie¿ wzbudziæ poprzez szczepienia plazmidowym DNA koduj¹cym wybrane antygeny pr¹tków [47].
122
7. Uwagi koñcowe
Dotychczasowe niepowodzenia w kontrolowaniu gruŸlicy na œwiecie spowodowa³y istotny wzrost nak³adów na badania mikobakterii i procesów odpornoœciowych
towarzysz¹cych zaka¿eniom przez nie wywo³ywanym, których finalnym celem jest
opracowanie nowych sposobów profilaktyki i leczenia gruŸlicy. Intensywny rozwój
genomiki, proteomiki, a ostatnio transkryptomiki, ale tak¿e precyzyjnej mikroskopii
wykorzystuj¹cej nowe immunologiczne i genetyczne znaczniki umo¿liwi³ badanie
pr¹tków wewn¹trz komórek wykorzystywanych przez nie, jako nisza ¿yciowa. Opisano nowe, nieznane wczeœniej mechanizmy jakie wykorzystuj¹ patogenne mikobakterie aby unikn¹æ skutków dzia³ania procesów obronnych gospodarzy. Opracowanie nowych metod badania komórek dendrytycznych umo¿liwi³o udowodnienie
naczelnej roli tych komórek w inicjacji swoistej odpornoœci komórkowej oraz polaryzacji w kierunku limfocytów Th1 pe³ni¹cych naczeln¹ rolê w odpornoœci na gruŸlicê. Bogata wiedza o oddzia³ywaniach cytokinowych w zaka¿eniach wywo³ywanych przez chorobotwórcze mikobakterie mo¿e dostarczyæ wskazówek dla nowych
strategii immunoterapii gruŸlicy. Chocia¿ nale¿y zaznaczyæ, i¿ obserwuj¹c ró¿nice
w poziomie cytokin lub innych markerów odpornoœci komórkowej u ludzi chorych
na gruŸlicê i zdrowych nie mo¿na wiedzieæ dok³adnie czy te ró¿nice wynikaj¹
z odmiennego profilu genetycznego warunkuj¹cego odpornoœæ lub podatnoœæ na chorobê czy te¿ s¹ spowodowane samym procesem chorobowym. Byæ mo¿e identyfikacja genów odpornoœci lub podatnoœci na gruŸlicê pozwoli wkrótce rozstrzygn¹æ ten
problem. Inne istotne pytanie czekaj¹ce na odpowiedŸ dotyczy odró¿nienia protekcyjnych reakcji odpornoœci komórkowej od tych, które s¹ odpowiedzialne za procesy
patologiczne w gruŸlicy. OdpowiedŸ na to pytanie jest wa¿na dla oceny efektywnoœci
przygotowywanych w wielu laboratoriach na œwiecie szczepionek przeciwgruŸliczych
w postaci rekombinantów BCG wzbogaconych w antygeny protekcyjne, szczepionek
DNA, a nawet szczepionek wykorzystuj¹cych komórki dendrytyczne.
Piœmiennictwo
1. Andersen P.: TB vaccines: progress and problems. Trends Immunol. 22, 160–166 (2001)
2. Barnes P.F., Chatterjee D., Abrams J.S., Lu S., Wang E., Yamamura M., Brennan P.J., Modlin R.L.:
Cytokine production induced by Mycobacterium tuberculosis lipoarabinomannan. J. Immunol.
149, 541–547 (1992)
3. Baumgart K.W., McKenzie K.R., Radford A.J., Ramshaw I., Britton W.J.: Immunogenecity and
protection studies with recombinant mycobacteria and vaccinia vectors coexpressing the 18-kilodalton protein of Mycobacterium leprae. Infect. Immun. 64, 2274–2281 (1996)
4. BeattyW., Rhoades E., Ullrich H.J., Chatterjee D., Heuser J., Russel D.: Trafficing and release of
mycobacterial lipids from infected macrophages. Traffick, 1, 235–242 (2000)
5. Behr M.A., Wilson M.A., Gill W.P., Salamon H., Schoolnik G.K., Rane S., Small P.M.: Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray. Science, 284, 1520–1523
(1999)
6. Betts J.C.: Transcriptomics and Proteomics: Tools for the identification of novel targets and vaccine candidates for tuberculosis. IUBMB Life, 53, 239–242 (2002)
123
7. Biet F., Kremer L., Wolowczuk I., Delacre M., Locht C.: Mycobacterium bovis BCG producing
IL-18 increases antigen-specific gamma interferon production in mice. Infect. Immun. 70,
6549–6557 (2002)
8. Biet F., Locht C., Kremer L.: Immunoregulatory functions of interleukin 18 and ist role in defence
against bacterial pathogens. J. Mol. Med. 80, 147–162 (2002)
9. Bikmaeva A.R., Sibiryak S.V., Valiakhmetova D.Kh., Khusnutdinova E.K.: Polymorphism of the
tumor necrosis factor a gene in patients with infiltrative tuberculosis from the Bashkortostan
populations. Mol. Biol. 36, 631–633 (2002)
10. Bodnar K.A., Serbina N.V., Flynn J.L.: Fate of Mycobacterium tuberculosis within murine dendritic cells. Infect. Immun. 69, 800–809 (2001)
11. Bonar A., Andryszkiewicz M., Chmiela M., Rudnicka W., Mackiewicz P., Krawczyk Z., Szemraj J.,
Ró¿alska B.: The level of serum mannose-binding lectin (MBL) and mbl gene polymorphism in
patients with tuberculosis and in healthy individuals. Centr. Eur. J. Immunol. 27 (Suppl. 1) 7, (2002)
12. Brombacher F., Kastelein R.A., Alber G.: Novel IL-12 family members shed light on the orchestration of Th1 responses. Trends Immunol. 24, 207–212 (2003)
13. Brosch R., Gordon S.V., Billault A., Garnier T., Eiglmeier K., Soravito G.K., Barrell B.G., Cole
S.T.: Use of a Mycobacterium tuberculosis H37Rv bacterial artificial chromosome (BAC) library
for genome mapping, sequencing, and comparative genomics. Infect. Immun. 66, 2221–2229 (1998)
14. Brosch R., Gordon S.V., Buchrieser C., Pym A.S., Garnier T., Cole S.T.: Comparative genomics
uncovers large tandem chromosomal duplications in Mycobacterium bovis BCG Pasteur. Yeast,
17, 111–123 (2000)
15. Chen J.M., Alexander D.C., Behr M.A., Liu J.: Mycobacterium bovis BCG vaccines exhibit
defects in alanine and serine catabolism. Infect. Immun. 71, 708–716 (2003)
16. Clemens D., Horwitz M.: The Mycobacterium tuberculosis phagosome interacts with early endosomes and is accessible to exogenously administered transferrin. J. Exp. Med. 184, 1349–1355 (1996)
17. Cockle P.J., Gordon S.V., Lalvani A., Buddle B.M., Hewinson R.G., Vordermeier H.M.: Identification of novel Mycobacterium tuberculosis antigens with potential as diagnostic reagents or subunit vaccine candidates by comparative genomics. Infect. Immun. 70, 6996–7003 (2002)
18. Cole S., Brosch R., Parkhill J., Garnier T., Churcher C., Harris D., Gordon S., Eiglmeier K., Gas S.,
Barry R., Tekaia F., Badcock K., Basham D., Brown D., Chillingworth T., Conor R., Davis R.,
Devlin K., Feltwell T., Gentles S., Hamlin N., Holroyd S., hernsby T., jagels K., Barrell B.G. et al.:
Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence.
Nature, 393, 1537–544 (1988)
19. Coussens P.M., Colvin Ch.J., Wiersma K., Abouzied A., Sipkovsky S.: Gene expression profiling
of peripheral blood mononuclear cells from cattle infected with Mycobacterium paratuberculosis. Infect. Immun. 70, 5494–5502 (2002)
20. Downing J.F., Pasula R., Wright J.R., Twigg H.L.D., Martin W.J.D.: Surfactant protein A promotes attachment of Mycobacterium tuberculosis to alveolar macrophages during infection with
human immunodeficiency virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 4848–4852 (1995)
21. Duncan K. Update anti-infectives. Tuberculosis annual update. Exp. Opin. Ther. Patents, 7,
129–137 (1997)
22. Dye C., Scheele S., Dolin P., Pathania V., Raviglione M.C.: Global burden of tuberculosis: estimated incidence, prevalence and mortality by country. JAMA, 282, 677–686 (1999)
23. Ernst J.D.: Macrophage receptors for Mycobacterium tuberculosis. Infec. Immun. 66, 1277–1281
(1998)
24. Ferrari G., Langen H., Naito M., Pieters J.: A coat protein on phagosomes involved in the intracellular survival of mycobacteria. Cell, 97, 435–447 (1999)
25. Fomukong N.G., Dale J.W., Osborn T.W., Grange J.M.: Use of gene probes based on the insertion
sequence IS 986 to differentiate between BCG vacccine strains. J. Appl. Bacteriol. 72, 126–33
(1992)
26. Förtsch D., Röllinghoff M., Stenger S.: IL-10 converts human dendritic cells into macrophagelike cells with increased antibacterial activity against virulent Mycobacterium tuberculosis.
J. Immunol. 165, 978–987 (2000)
124
27. Gold J.A., Hoshino Y., Tanaka N., Rom W,N., Raju B., Condos R., Weiden MD.: Surfactant protein A modulates the inflammatory response in macrophages during tuberculosis. Infect. Immun.
72, 645–650 (2004)
28. Gracie JA., Robertson S.E., McInnes I.B.: Interleukin-18. J. Leukoc.Biol. 73, 213–224 (2003)
29. Groves M.J.: BCG: the past, present and future of tuberculosis vaccine. J. Pharm. Pharmacol. 49
(Suppl. 1), 7–15 (1997)
30. Hansch H.C., Smith D.A., Mielke M.E., Hahn H., Bancroft G.J., Ehlers S.: Mechanisms of granuloma formation in murine Mycobacterium avium infection: the contribution of CD4+ T cells. Int.
Immunol. 8, 1299–1310 (1996)
31. Henderson R.A., Watkins S.C., Flynn J.L. Activation of human dendritic cells following infection
with Mycobacterium tuberculosis. J. Immunol. 159, 635–643 (1997)
32. Hermann J., O,Gaora P., Gallaghar A., Thole J., Young D.: Bacterial glycoproteins: a link between
glycosilation and proteolytic cleavage of a 19 kDa antigen from Mycobacterium tuberculosis.
EMBO J. 15, 3547–3554 (1996)
33. Hess J., Miko D., Catic A., Lehmensiek V., Russell D.G., Kaufmann S.H.: Mycobacterium bovis
Bacille Calmette-Guérin strains secreting listeriolysin of Listeria monocytogenes. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 95, 5299–5304 (1998)
34. Holscher C., Atkinson R.A., Arendse B., Brown N., Myburgh E., Alber G., Brombacher F.:
A protective and agonistic function of IL-12p40 in mycobacterial infection. J. Immunol. 167,
6957–6966 (2001)
35. Horwitz M.A., Harth G.: A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infet. Immun.
71, 1672–1679 (2003)
36. Hou J.Y., Graham J.E., Clark-Curtiss J.E.: Mycobacterium avium genes expressed during growth
in human macrophages detected by selective capture of transcribed sequences (SCOTS). Infect.
Immun. 70, 3714–3726 (2002)
37. Jiao X., Lo-Man R., Guermonprez P., Fiette L., Deriaud E., Burgaud S., Gicquel B., Winter N.,
Leclerc C.: Dendritic cells are host cells for Mycobacteria in vivo that trigger innate and acquired
immunity. J. Immunol. 168, 1294–1301 (2002)
38. Jurkiewicz M., Paziak-Domañska B., Ró¿alska B., Rudnicka W., Klink M., Huygen K.: The relation between Mycobacterium driven response of lymphocytes and granulocytes and tuberculin
test in BCG-vaccinated humans. EFIS 2000, 14th European Immunology Meeting, Intern. Proc.
Div. Red. Monduzzi, 479–484 (2001)
39. Kaufmann S.H.E.: A personal view on the development of novel vaccines against tuberculosis.
Nova Acta Leopoldina NF, 80, 247–258 (1999)
40. Li H., Ulstrup J.C., Jonassen T.O., Melby K., Nagai S., Harboe M.: Evidence for absence of the
MPB64 gene in some substrains of Mycobacterium bovis BCG. Infect. Immun. 61, 1730–1734
(1993)
41. Mahairas G.G., Sabo P.J., Hickey M.J., Singh D.C., Stover C.K.: Molecular analysis of genetic
differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovis. J. Bacteriol. 178,
1274–1282 (1996)
42. Malik Z.A., Shankar S.I., Kusner D.J.: Mycobacterium tuberculosis phagosomes exhibit altered
calmodulin-dependent signal transduction: contribution to inhibition of phagosome-lysosome
fusion and intracellular survival in human macrophages. J. Immunol. 166, 3392–3401 (2001)
43. Minnikin D.E., Minnikin S.M., Dobson G., Goodfellow M., Portaels F., van den Breen L., Sesardic
D.: Mycolic acid patterns of four vaccine strains of Mycobacterium bovis BCG. J. Gen. Microbiol. 129, 889–891 (1983)
44. Miura K., Nagai S., Kinomoto M., Haga S., Tokunaga T.. Comparative studies with various substrains of Mycobacterium bovis BCG on the production of an antigen protein, MPB70. Infect.
Immun. 39, 540–545 (1983)
45. Mogga S.J., Mustafa T., Sviland L., Nilsen R.: Increased Bcl-2 and reduced Bax expression in
infected macrophages in slowly progressive primary murine Mycobacterium tuberculosis infection. Scand. J. Immunol. 56, 383–391 (2002)
125
46. Moody D.B., Guy M.R., Grant E., Cheng T.Y., Brenner M.B., Besra G.S., Porcelli S.A.:
CD1b-mediated T cell recognition of a glycolipid antigen generated from mycobacterial lipid and
host carbohydrate during infection. J. Exp. Med. 192, 965–976 (2000)
47. Morris S., Kelley C., Howard A., Li Z., Collins F.: The immunogenity of single and combination
vaccine against tuberculosis. Vaccine, 18, 2155–2163 (2000)
48. Morsczek C., Berger S., Plum G.: The macrophage-induced gene (mig) of Mycobacterium avium
encodes a medium chain acyl-coenzyme A synthetase. Biochem. Biophys. Acta, 1521, 59–65 (2001)
49. Mustafa A.S.: Development of new vaccines and diagnostic reagents against tuberculosis. Mol.
Immunol. 39, 113–119 (2002)
50. Mustafa T., Bjune G., Jonsson R., Hernandez Pando R., Nilsen R.: Increased expression of Fas
ligand in human tuberculosis and leprosy lesions: a potential novel mechanism of immune evasion in mycobacterial infection. Scand. J. Immunol. 54, 630–639 (2001)
51. Neyrolles O., Gouldt K., Gares M.-P.. Brett S., Janssen R., O,Gaora P., Hermann J.-L., Prevost
M.-Ch., Perret E., Thole J.E.R., Young D.: Lipoprotein access to MHC class I presentation during
infection of murine macrophages with live mycobacteria. J. Immunol. 166, 447–455 (2001)
52. Ohara N., Matsuoka M., Nomaguchi H., Naito M., Yamada T.: Inhibition of multiplication of
Mycobacterium laepre in mouse foot pads by recombinant Bacillus Calmette-Guérin (BCG).
Vaccine, 18, 1294–1297 (2000)
53. Paziak-Domañska B., Bonar B., Kowalewicz-Kulbat M., Klink M., Kowalski M., Karhukorpi,
Karttunen R., Jurkiewicz M., Ró¿alska B., Rudnicka W.: The lack of relationship between serum
content of MBL, sCD14, anti-PPD and anti-Hsp65 IgG and ingestion of Mycobacterium bovis
BCG bacilli by phagocytes. Arch. Immunol. Ther. Exp. 50, 337–344 (2002)
54. Peteroy-Kelly M.A., Venketaraman V., Talaue M., Seth A., Connel N.D.: Modulation of J774.1
macrophage L-arginine metabolism by intracellular Mycobacterium bovis BCG. Infect. Immun.
71, 1011–1015 (2003)
55. Phillip W.J., Nair S., Guglielmi G., Lagranderie M., Gicquel B., Cole S.T.: Physical mapping of
Mycobacterium bovis BCG Pasteur reveals differences from the genome map of Mycobacterium
tuberculosis H37Rv and from M. bovis. Microbiology, 142, 3135–3145 (1996)
56. Pieters J., Gatfield J.: Hijacking the host: survival of pathogenic mycobacteria inside macrophages. Trends Microbiol. 10, 142–146 (2002)
57. Plum G., Clark-Curtiss J.E.: Induction of Mycobacterium avium gene expression following phagocytosis by human macrophages. Infect. Immun. 62, 476–483 (1994)
58. Poquet Y., Halary F., Champagne E., Davodeau F., Gougeon M.L., Bonneville M., Fournie J.J.:
Human g/d T cells in tuberculosis. Res. Immunol. 147, 542–549 (1996)
59. Prigozy T.I., Sieling P.A., Clemens D., Stewart P.L., Behar S.M., Porcelli S.A., Brenner M.B.,
Modlin R.L., Kronenberg M.: The mannose receptor delivers lipoglycan antigens to endososmes
for presentation to T cells by CD1b molecules. Immunity, 6, 187–197 (1997)
60. Rao S.P., Ogata K., Catanzaro A.: Mycobacterium avium- Mycobacterium intracellulare binds
to the integrin receptor "v$3 on human monocytes and monocyte-derived macrophages. Infect.
Immun. 61, 663–670 (1993)
61. Reiling N., Holscher Ch., Fehrenbach A., Kroger S., Kirschning C.J., Goyert S., Ehlers S.:
Cutting edge: Toll-like receptor (TLR)2- and TLR4- mediated pathogen recognition in resistance
to airborne infection with Mycobacterium tuberculosis. J. Immunol. 169, 3480–3484 (2002)
62. Reiling N., Klug K., Krallmann-Wenzel U., Laves R., Goyert S., Taylor M.E., Lindhorst T.K.,
Ehlers S.: Complex encounters at the macrophage-Mycobacterium interface: Studies on the role
of the mannose receptor and CD14 in experimental infection models with Mycobacterium avium.
Immunobiol. 204, 558–571 (2001)
63. Rudnicka W., Brzychcy M., Klink M., Gomez Lopez A., Fonteyne P.A., Rusch-Gerdes S., Ró¿alska
B.: The production of nitric oxide and tumor necrosis factor by murine macrophages infected with
mycobacterial strains differing by hemolytic activity. Microbiol. Immunol. 43, 637–644 (1999)
64. Russel D., Dant J., Sturgill-Koszycki S.: Mycobacterium avium- and Mycobacterium tuberculosis- containing vacuoles are dynamic, fusion- competent vesicles that are accessible to glycosphingolipids from the host cell plasmalemma. J. Immunol. 156, 4764–4773 (1996)
126
65. Schaible U.E., Winau F., Sieling P.A., Fischer K., Collins H.L., Hagens K., Modlin R.L., Brinkmann V., Kaufmann S.H. Apoptosis facilitates antigen presentation to T lymphocytes through
MHC-I and CD1 in tuberculosis. Nature Med. 8, 1039–1046 (2003)
66. Schlesinger, L.S: Macrophage phagocytosis of virulent but not attenuated strains of Mycobacterium tuberculosis is mediated by mannose receptors in addition to complement receptors.
J. Immunol. 150, 2920–2930 (1993)
67. Schorey J.S., Carroll M.C., Brown E.J.: A macrophage invasion mechanism of pathogenic mycobacteria. Science, 277, 1091–1093 (1997)
68. Selvaraj P., Narayanan P.R., Reetha A.M.: Association of functional mutant homozygotes of the
mannose binding protein gene with susceptibility to pulmonary tuberculosis in India. Tuber. Lung
Dis. 79, 221–227 (1999)
69. Strohmeier G.S., Fenton M.J.: Roles of lipoarabinomannan in the pathogenesis of tuberculosis.
Microb. Infect. 1, 709–717 (1999)
70. Sturgill-Koszycki S., Schlesinger P.H., Chakraborty P., Haddix P.L., Collins H.L., Fok A.K.,
Allen R.D., Gluck S.L., Heuser J., Russell D.G.: Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase. Science, 263, 678–681 (1994)
71. Sugawara I., Yamada H., Mizuno S., Iwakura Y.: IL-4 is required for defense against mycobacterial infection. Microbiol. Immunol. 44, 971–979 (2000)
72. Sugita M., Grant E.P., Van Donselaar E., Hsu V.W., Rogers R.A., Peters P.J., Brenner M.B.: Separate pathways for antigen presentation by CD1 molecules. Immunity, 11, 743–752 (1999)
73. Tailleux L., Maeda N., Nigou J., Gicquel B., Neyrolles O. How is the phagocyte lectin keyboard
played? Master class lesson by Mycobacterium tuberculosis. Trends Microbiol. 11, 259–263 (2003)
74. Tailleux L., Schwartz O., Hermann J.-L., Pivert E., Jackson M., Amara A., Legres L., Dreher D.,
Nicod L.P., Gluckman J.C., Lagrange P.H., Gicquel B., Neyrolles O.: DC-SIGN is the major
Mycobacterium tuberculosis receptor on human dendritic cells. J. Exp. Med. 197, 121–127 (2003)
75. Teitelbaum R., Cammer M., Maitland M., Freitag N.E., Condeelis J., Bloom B.R.: Mycobacterial
infection of macrophages results in membrane-permeable phagosomes. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 96, 15190–15195 (1999)
76. Thielen H., Heykes-Uden H., Niemann S.: Spread of a drug-resistant strain of mycobacterium
tuberculosis among homeless people in a german city. Pneumologie, 58, 17–22 (2004)
77. Tominaga K., Yoshimoto T., Torigoe K., Kurimoto M., Matsui K., Hada T., Okamura H., Nakanishi K.: IL-12 synergizes with IL-18 or IL-1$ for IFN-( production from human T cells. Intern.
Immunol. 12, 151–160 (2000)
78. Underhill D.M., Ozinsky A., Smith K.D., Aderem A. Toll-like receptor 2 mediates mycobacteria
induced proinflammatory signaling in macrophages. Immunity, 96, 14459–14463 (1999)
79. Von Reyn C.F., Arbeit RD., Yeaman G., Waddell R.D., Marsh B.J., Morin P., Modlin J.F., Remold
H.G.: Immunization of healthy adult subjects in the United States with inactivated Mycobacterium vaccae administered in a three-dose series. Clin. Infect. Dis. 24, 843–848 (1997)
80. Xu D., Chan WL., Leung BP., Hunter D., Schultz K., Carter RW, McInnes IB., Robinson JH.:
Selective expression and functions of intereleukin 18 receptor on T helper (Th) type1 but not Th2
cells. J. Exp. Med. 188, 1485–1492 (1988)
Podziêkowanie. Autorka dziêkuje Katarzynie Witkowskiej i Maciejowi Wierzbickiemu, studentom
specjalnoœci mikrobiologia na Wydziale Biologii i Ochrony Œrodowiska Uniwersytetu £ódzkiego, za
pomoc przy wykonaniu rysunków.
Zak³ad Immunologii Komórkowej, Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej
Instytut Mikrobiologii i Immunologii, Uniwersytet £ódzki
ul. Banacha 12/16, 90-237 £ódŸ, E-mail: [email protected]
127
POST. MIKROBIOL.,
2004, 43, 1, 129–133
http://www.pm.microbiology.pl
INFORMACJA DLA AUTORÓW
Postêpy Mikrobiologii zamieszczaj¹ artyku³y przegl¹dowe ze wszystkich dziedzin mikrobiologii
nie drukowane w innych czasopismach oraz w dziale Nowoœci Wydawniczych recenzje nowych
ksi¹¿ek z zakresu mikrobiologii i nauk pokrewnych, które ukazuj¹ siê w Polsce. Artyku³y drukowane
w Postêpach Mikrobiologii nie mog¹ byæ bez zgody Redakcji publikowane w innych periodykach.
1. Sposób przygotowania manuskryptu
1.1. Tekst
Prace nale¿y przysy³aæ do Sekretariatu Redakcji w postaci elektronicznego zapisu tekstu w edytorze Microsoft Word dowolnej edycji w wersji PL na dyskietkach komputerowych (3,5” 1,44 MB).
Do dyskietki powinny byæ do³¹czone 2 egz. tekstu artyku³u ca³kowicie zgodnego z zapisem elektronicznym. Objêtoœæ pracy nie powinna przekraczaæ wraz z piœmiennictwem i ilustracjami 30 stron
maszynopisu. Maszynopis powinien byæ jednostronny (wielkoœæ czcionki 12, odstêp pomiêdzy wierszami 1,5), z numeracj¹ stron. Po tytu³ach wydzielonych nie nale¿y stawiaæ kropek.
Na oddzielnej stronie (strona tytu³owa) nale¿y podaæ tytu³ pracy, pod nim w pe³nym brzmieniu
imiona i nazwiska autorów, spis treœci (tytu³y poszczególnych rozdzia³ów) oraz kilka (nie wiêcej jak
piêæ) s³ów kluczowych (ang. key words). S³owa kluczowe mog¹ b¹dŸ nie pojawiaæ siê w tytule pracy
– nale¿y je podaæ w porz¹dku alfabetycznym. Tytu³ pracy i spis treœci nale¿y powtórzyæ w jêzyku
angielskim. Praca powinna koñczyæ siê krótkim podsumowaniem, zawieraj¹cym najistotniejsze elementy treœci. Na oddzielnej stronie nale¿y do³¹czyæ krótkie streszczenie pracy w jêzyku angielskim
(maksymalnie 250 s³ów). Tekst pracy powinien byæ zgodny z zaleceniami szczegó³owymi Redakcji.
Przesy³ane do redakcji prace winny byæ napisane poprawn¹ polszczyzn¹. Redakcja rekomenduje
P.T. Autorom S³ownik Poprawnej Polszczyzny (red. Witold Doroszewski, Halina Kurkowska,
Wydawnictwo Naukowe PWN. Warszawa, 1998) jako pomoc w redagowaniu tekstu. Jakkolwiek
Postêpy Mikrobiologii s¹ polskojêzyczne, nie wyklucza siê druku prac, napisanych po angielsku.
1.2. Ilustracje
Tabele i rysunki (po dwa egz., o rozmiarze nie przekraczaj¹cym 26,5 cm × 18 cm) winny byæ
wykonane starannie (dok³adne krycie) czarnym tuszem na kalce technicznej lub w formie wydruku
z drukarki laserowej lub atramentowej. Fotografie (po dwa egz.) nale¿y sporz¹dzaæ na b³yszcz¹cym
papierze, najlepiej w formacie 13 cm × 18 cm. Materia³y te nale¿y za³¹czyæ oddzielnie. Nie nale¿y
pozostawiaæ w maszynopisach wolnych miejsc na rysunki i zdjêcia, a tylko na kopii zaznaczyæ miejsce,
w którym powinny byæ umieszczone, np. tab. 1, rys. 1. Liczbê rysunków i tabel nale¿y ograniczyæ do
istotnie niezbêdnej iloœci. Te same wskazówki odnosz¹ siê do pojedynczych wzorów chemicznych.
Ka¿da tabela powinna byæ oznaczona kolejnym numerem rzymskim oraz mieæ nag³ówek opisuj¹cy
jej treœæ. Na osobnej kartce nale¿y za³¹czyæ spis z objaœnieniami jakie powinny siê znaleŸæ pod
rysunkami lub z uwag¹ „objaœnienia w tekœcie”. Podpisy pod wykresami, rysunkami, zdjêciami nale¿y
umieœciæ na osobnej stronie.
1.3. Piœmiennictwo
Cytowan¹ literaturê (Piœmiennictwo) nale¿y wpisaæ oddzielnie jako ostatnie strony maszynopisu,
wymieniaj¹c pozycje w kolejnoœci alfabetycznej. W wykazie powinny byæ podane kolejno: liczba
porz¹dkowa, nazwisko autora, pierwsze litery imion, nazwiska wspó³autorów pracy i pierwsze litery
ich imion (w kolejnoœci podanej w cytowanej pracy), pe³ny tytu³ cytowanej pracy, skrócony tytu³
czasopisma, tom, strona, i rok wydania (w nawiasach).
129
Dla cytowanych wydawnictw nieperiodycznych nale¿y podaæ kolejno: nazwisko i pierwsze litery
imion autora, lub wspó³autorów, tytu³ dzie³a, wydawnictwo, miejsce i rok wydania. W przypadku odwo³ywania siê do artyku³u w pracy zbiorowej nale¿y dodatkowo podaæ tytu³ tej pracy oraz nazwisko jej
redaktora, wydawnictwo, miejsce wydania, rok, tom oraz na koñcu stronê, np. Portnoy D.A., Sun A.N.,
Bielecki J.E.: Escape from the phagosome and cell-to-cell spread of Listeria monocytogenes (w) Microbial Adhesion and Invasion, red. M. Hook, L. Œwitalski, Springer Verlag, New York, 1991, s. 86.
Powo³ywanie siê w tekœcie na pozycje cytowanej literatury nastêpuje przez wymienienie liczby
porz¹dkowej w nawiasach np. [10]. Iloœæ cytowañ w piœmiennictwie nie mo¿e przekraczaæ 100 pozycji.
1.3.1. Piœmiennictwo danych cytowanych z sieci internetowej
Warunkiem koniecznym przy u¿yciu informacji ze strony internetowej jest sprawdzenie i aktualizacja zapisu informacyjnego na stronie WEB w dniu wysy³ania maszynopisu. W przypadku niew³aœciwego adresu i niemo¿liwoœci odtworzenia informacji z sieci komputerowej, prace bêd¹ zwracane autorom.
Cytowanie informacji publikowanej na stronach sieci internetowej powinno wygl¹daæ nastêpuj¹co:
XYZ Website 14 listopada 1999 roku (Online). Nazwisko wydawcy, jeœli jest znane, http://
cbx.iou.pgr. (10 PaŸdziernika 1999 roku, data ostatniego sprawdzenia adresu). Cytowanie ksi¹¿ek
powinno zawieraæ szczegó³owe dane o wydawnictwie.
Cytacja w piœmiennictwie pracy oryginalnej przes³anej poprzez sieæ komputerow¹ powinna zawieraæ nastêpuj¹ce dane: nazwisko autora, inicja³y imion, 5 paŸdziernika 1999 r. (data przyjêcia pracy),
tytu³ pracy, nazwa czasopisma, numery stron (jeœli s¹ dostêpne), (Online), adres internetowy, data
potwierdzenia wa¿noœci adresu.
1.3.2. Elektroniczne wersje ilustracji
Szczegó³owe informacje dotycz¹ce prawid³owego zapisu ilustracji znajduj¹ siê na stronie internetowej pod adresem http:\\cjs.cadmus.corn/da. Redakcja Postêpów Mikrobiologii najchêtniej akceptuje ilustracje wykonane w programach graficznych Adobe Photoshop 4.0 i Macromedia Freehand
7.0 zgodne z systemem Windows 3.1, Windows 95 i 98 oraz Windows NT. Rysunki powinny byæ
zachowane w formacie TIFF lub EPS. Grafiki kolorowe nale¿y zachowywaæ w pliku EPS (CMYK
mode). Dane s¹ przyjmowane na standardowych mediach takich jak dyskietki 3,5 cala lub CD-ROM.
Przes³ane dyski lub dyskietki nie bêd¹ zwracane autorom. Zalecana przez redakcjê kompresja informacji to PKZIP lub WINZIP w systemie Windows. Minimalna rozdzielczoœæ stosowana w ilustracjach to: 300 dpi dla zdjêæ szarych i kolorowych, 600 dpi dla liter i 1200 dpi dla linii w wykresach.
Wszystkie grafiki powinny byæ przesy³ane w 100% wymiarze bez koniecznoœci skalowania. W celu
szczegó³owej informacji proszê wysy³aæ zapytanie przez e-mail na adres [email protected].
2. Prawo autorskie
W przypadku reprodukcji w pracy cudzych rysunków lub tabel – nawet w formie zmodyfikowanej
– b¹dŸ cytowania fragmentów cudzego tekstu, Autorzy Postêpów Mikrobiologii przed przys³aniem
tych materia³ów do Redakcji s¹ zobowi¹zani do uzyskania pisemnej zgody od Autorów oryginalnych
prac i Wydawnictwa (z której materia³y te pochodz¹) na ich reprodukcjê. Cytowany tekst powinien
byæ wyraŸnie oznaczony w odpowiednim miejscu manuskryptu, zaœ u do³u strony powinna byæ
zamieszczona informacja dotycz¹ca pochodzenia cytatu oraz uzyskanej zgody na przedruk.
Zaœwiadczenia wraz z informacj¹ którego rysunku, tabeli lub cytatu dotycz¹, nale¿y przes³aæ
wraz z manuskryptem przeznaczonej do publikacji pracy.
3. Zalecenia szczegó³owe
3.1. Nazewnictwo drobnoustrojów
Nale¿y stosowaæ dwucz³onowe nazwy zawieraj¹ce nazwê rodzajow¹ oraz gatunkow¹ (np. Escherichia coli). Nazwy rodzajowe mog¹ byæ u¿yte same tj. bez nazwy gatunkowej, natomiast nie mo¿na
u¿yæ samych tylko nazw gatunkowych. Gdy w pracy podaje siê pierwszy raz nazwê gatunku, musi
ona sk³adaæ siê z pe³nych wyrazów, przy ponownym u¿yciu tej nazwy, podaje siê tylko pierwsz¹
130
literê nazwy rodzajowej (zawsze du¿¹ ) oraz nazwê gatunkow¹ w pe³nym brzmieniu np. E. coli).
Nazwy gatunku, rodziny, rzêdu, klasy, dzia³u oraz królestwa nale¿y pisaæ kursyw¹. Informacje szczegó³owe dotycz¹ce pisowni oraz prawid³owego nazewnictwa (zgodnego z wymogami wspó³czesnej
systematyki) – przyjête przez Redakcjê Postêpów Mikrobiologii, za instrukcj¹ ASM – mo¿na znaleŸæ
w Instructions to Authors, J. Bacteriol. Jan. 2004.
Zgodnie z propozycjami WHO – Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella
(„Antigenics Formules of the Salmonella Serovars” (M. Y. Popoff and L. Le Minor, WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella, Institut Pasteur, Paris, France, 1997) and
„Identification and Serotyping of Salmonella and an Update of the Kaufmann-White Scheme”
(A.C. McWhorter-Murlin and F. W. Hickman-Brenner, Centers for Disease Control and Prevention,
Atlanta, Ga.) do rodzaju Salmonella nale¿¹ tylko dwa gatunki tj. S. enterica i S. bongori – pierwszy
z nich podzielony zosta³ na 6 podgatunków. Stosowane dotychczas zwyczajowe nazwy, nie posiadaj¹ce
statusu taksonomicznego, takie jak serotyp, typ serologiczny, zosta³y zast¹pione nazw¹ serowaru
(w oryginale serovar, sv.). Nazwê serowaru nale¿y pisaæ du¿¹ liter¹ oraz prostym pismem (np.
Typhi, Paratyphi B, Typhimurium itp.). Zgodnie z powy¿szym, nazwê pierwszego podgatunku rodzaju
Salmonella mo¿na zapisaæ: S. enterica subsp. enterica sv. Typhimurium lub Salmonella subsp. I. sv.
Typhimurium, b¹dŸ po prostu, Salmonella Typhimurium.
3.2. Nomenklatura genetyczna
W³aœciwoœci genetyczne szczepu opisywane s¹ w terminach fenotypu oraz genotypu. Fenotyp
opisuje obserwowane w³aœciwoœci organizmu. Genotyp okreœla genetyczn¹ strukturê organizmu,
zwykle odnosi siê do szczepu dzikiego. Ww. okreœlenia s¹ bli¿ej objaœnione w pracy Demerec i wsp.
Genetics 54 61: 76, 1966.
(a) Fenotypowe okreœlenie w³aœciwoœci organizmu stosuje siê gdy zmutowane loci nie zosta³y zidentyfikowane oraz zmapowane. Mo¿e byæ tak¿e u¿yte w przypadku, gdy identyfikuje siê produkt
genu np. bia³ko OmpA. Zapis fenotypu zasadniczo sk³ada siê z trzech liter, nie mo¿na ich pisaæ
kursyw¹, pierwsza litera powinna byæ zawsze du¿¹ liter¹. Preferuje siê u¿ycie liczb rzymskich
lub arabskich dla oznaczania bliŸniaczych fenotypów np.Pol1, Pol2, Pol3 itd. Typ dziki mo¿na
zapisaæ dodatkowym oznaczeniem plus (Pol+); w odró¿nieniu do tego oznaczenie minus okreœlaæ
bêdzie fenotyp mutanta (Pol–). Czasami pewne charakterystyczne w³aœciwoœci organizmu mo¿na
zapisaæ u¿ywaj¹c liter np. (StrS).
(b) Genotypowe oznaczenia s¹ podobne do fenotypowych – w obu przypadkach stosuje siê zestaw
trzech liter; genotyp pisze siê zawsze ma³ymi literami oraz kursyw¹ (np. ara, his, rps.). Promotor,
terminator oraz operator oznacza siê literami p, t oraz o (np. lacZp, lacZt, lacZo;. Bachman
i Low; Microbiol. Rev. 44, 1–56, 1980).
(c) Typ dziki alleli mo¿na zaznaczyæ wpisuj¹c dodatkowe oznaczenie plus nad oznaczeniem genu
np. ara+, his+, nie oznacza siê natomiast zmutowaych alleli znakiem minus.
(d) Miejsca mutacji oznacza siê poprzez wstawiania liczby kolejnych izolacji (liczby alleli) po symbolu zmutowanego locus (np. araA1, araA2 itp.). W przypadku, gdy tylko jedno takie locus istnieje,
lub gdy nie wiadomo w którym kolejnym locus mutacja powsta³a – po oznaczeniu genu wstawia siê
myœlnik w miejscu du¿ej litery oznaczaj¹cej locus , zaœ dalej podaje siê liczbê izolacji (np. ara-23).
(e) Zapis genotypu mo¿e byæ wzbogacony innymi oznaczeniami jak plus, dla typu dzikiego czy
minus dla mutanta – mo¿na wprowadziæ oznaczenia okreœlaj¹ce mutacje jak np. mutacja Amber
(Am), mutant termowra¿liwy (Ts), mutant konstytutywny (Con), mutant wra¿liwy na niskie temperatury (Cs), bia³ko hybrydowe (Hyb) np. araA230(Am), his D21(Ts). Wprowadzanie innych
wzbogaceñ powinno byæ poprzedzone w tekœcie odpowiednim wyjaœnieniem.
(f) Dodatkowe oznaczenia mog¹ te¿ byæ u¿yte w przypadku koniecznoœci rozró¿nienia tego samego
genu znajduj¹cego siê w ró¿nych organizmach lub szczepach tego samego gatunku np. hisE.coli
lub hisK-12. Dodatkowe oznaczenia stosuje siê równie¿ dla rozró¿nienia pomiêdzy genetycznymi
elementami o tej samej nazwie np. promotory operonu gln; glnA1 i glnA2.
(g) Delecjê oznacza siê symbolem DD usytuowanym przed zdelecjonowanym genem lub regionem
np. DDtrpA432, DD(aroP-aceE)419, lub DDhis(dhuA hisJ hisQ)1256. Fuzjê genów ara i lac
mo¿na przedstawiæ w ten sam sposób – FF(ara-lac)1256. Podobnie FF(araB’ -lacZ+)(Hyb)
131
oznacza, ¿e fuzja nast¹pi³a pomiêdzy genami araB a lacZ. Inwersja jest oznaczana nastêpuj¹co
IN (rrnD-rrnE)1. Insercjê genu his E. coli do plazmidu pSC101 w pozycji 0 zasad (0kb) zapisuje
siê nastêpuj¹co pSC101 WW(Okb::K-12hisB)4.
Oznaczenie obecnoœci episomu polega na podaniu jego symboli w nawiasie po nazwie szczepu
rodzicielskiego np. W3110/F’ 8(gal+).
3.3. Skróty nazw chemicznych
Nie wymagaj¹ dodatkowych wyjaœnieñ skróty nazw, jak np.:
– nazwy miar i wag regulowanych przez Systeme International dXUnites (SI), ogólnie akcetowane jednostki takie jak bp, kb, Da, masa cz¹st., m. cz¹st.
– skróty nazw chemicznych takich jak: DNA, cDNA, RNA, cRNA, RNaza, DNaza, rRNA,
mRNA, tRNA; AMP, ADP, ATP, dATP, ddATP, GTP itp., ATPaza, dGTPaza itp. NAD+, NADH,
NADPH, NADP+, poly(A), poly(dT) itp., DEAE, EDTA, HEPES
– nazwy powszechnie stosowanych technik biologii molekularnej np. PCR, SDS-PAGE, nazwy
ogólnie znanych linii komórkowych np. HeLa, J774
– nazwy jednostek biologicznych; PFU (jednostka formowania ³ysinek), CFU (jednostka formowania kolonii), MIC (minimalne stê¿enia hamuj¹ce wzrost), itp.
Nowe zasady kszta³towania nomenklatury endonukleaz restrykcyjnych oraz metylotransferaz
zosta³y opublikowane w Nucleic Acids Research 2003, 31: 1805–1812. Przy pisaniu prac prosimy
o korzystanie z zawartych tam informacji.
3.4. Pisownia danych numerycznych
Standardowe jednostki metryczne s¹ stosowane dla okreœlania d³ugoœci, wagi i objêtoœci. W przypadku przedstawiania tych wartoœci oraz molarnoœci nale¿y stosowaæ przedrostki m, mm, n oraz p
dla wartoœci 10–3, 10–6, 10–9 oraz 10–12. Temperaturê nale¿y przedstawiaæ tylko w stopniach
Celsjusza np. 37oC.
3.5. Pisownia substancji znakowanych izotopami
Jeœli wyznakowana jest pojedyncza cz¹steczka w zwi¹zku chemicznym nale¿y nazwê tego zwi¹zku
zapisaæ w nastêpuj¹cy sposób 14CO2, 3H2O, H235SO4. Taki sam sposób zapisu stosuje siê gdy radioaktywna cz¹steczka nie wystêpuje w naturalnej formie wyznakowanego zwi¹zku np. 32S-ATP lub gdy
symbol izotopu zwi¹zany jest z niespecyficzn¹ nazw¹ zwi¹zku np. 14C aminokwasy, 3H-liganty itp.
W przypadku niektórych specyficznych zwi¹zków chemicznych mo¿na stosowaæ nawiasy kwadratowe obejmuj¹ce symbole radioaktywnej cz¹steczki przed nazw¹ chemiczn¹ zwi¹zku np. [14C]
mocznik, L-[metylo-14C] metionina, [gg–32P] ATP.
4. Uwagi dodatkowe
Redakcja zastrzega sobie mo¿liwoœæ dokonywania skrótów i poprawek nie wp³ywaj¹cych na treœæ
pracy. W przypadku koniecznoœci wprowadzenia zmian w treœci odsy³a siê autorowi jeden egzemplarz pracy oraz dyskietkê w celu dokonania poprawek.
Adresy instytucji, w których pracuj¹ autorzy (adres pocztowy oraz e-mail) nale¿y podawaæ
w maszynopisie pracy po piœmiennictwie.
Prace nie odpowiadaj¹ce wymaganiom Redakcji bêd¹ odsy³ane autorom bez rozpatrzenia merytorycznego. W razie nie przyjêcia pracy do druku Redakcja zwraca dyskietkê oraz jeden egzemplarz
wydruku, drugi zatrzymuje u siebie. Za datê wp³ywu przyjmuje siê dzieñ otrzymania pracy w formie
zgodnej z instrukcj¹ dla autorów. Autorzy otrzymuj¹ bezp³atnie 15 odbitek pracy. Za prace opublikowane w Postêpach Mikrobiologii nie przewiduje siê honorariów autorskich. Prace nale¿y nadsy³aæ na
adres sekretarza naukowego redakcji:
Dr Bohdan Jerzy Staroœciak
Zak³ad Mikrobiologii Farmaceutycznej,
Akademia Medyczna
ul. Oczki 3 (parter), 02-007 Warszawa
132
Oœwiadczenie dotycz¹ce praw Autorskich
1. ........................................................................................................
(nazwisko/a i imiê/ona autora/ów – proszê podkreœliæ autora korespondencyjnego)
................................................................
................................................................
................................................................
Adres Autorów: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.................................................................................
Tytu³ pracy:
...........................................................................
..............................................................................
..............................................................................
..............................................................................
2. Oœwiadczenie (proszê wype³niæ a lub b)
(a) Oœwiadczam. I¿ w mojej/naszej pracy przeznaczone do opublikowania rysunki oraz tabele,
s¹ oryginalne tzn. zosta³y wymyœlone i zaprojektowane przez autorów przedk³adanego
Redakcji manuskryptu. W pracy nie ma cytatów z obcej publikacji.
.....................................
(miejsce i data)
.....................................
(podpis korespondencyjnego autora)
(b) Oœwiadczam, i¿ uzyska³em/liœmy zgodê Autorów na reprodukcjê rysunków nr: . . . . . . . . . . . ,
zamieszczonych w* . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Oœwiadczam, i¿ uzyska³em/liœmy zgodê Autorów na reprodukcjê tabel nr: . . . . . . . . . . . ,
zamieszczonych w* . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Oœwiadczam, i¿ uzyska³em/liœmy zgodê Wydawnictwa na reprodukcjê rysunków nr: . . . . . . . ,
zamieszczonych w*: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Oœwiadczam, i¿ uzyska³em/liœmy zgodê Wydawnictwa na reprodukcjê tabel nr: . . . . . . . ,
zamieszczonych w*: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
(* podaæ bibliografie prac oryginalnych, z których reprodukowane bêd¹ rysunki lub tabele)
Do Oœwiadczenia za³¹czam oryginalne zezwolenia reprodukcji w liczbie: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ,
Rysunków: . . . . . . . . . . . . . . . . . , tabel: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , cytowanego tekstu: . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.....................................
(miejsce i data)
.....................................
(podpis korespondencyjnego autora)
133
Spis treœci
Prof. dr hab. Krystyna Kote³ko (1920–2003) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
K. B r z o s t e k – Mechanizmy regulacji czynników wirulencji Yersinia enterocolitica . . . . . . .
7
G. M i e l n i k, W. D o r o s z k i e w i c z, A. K o r z e n i o w s k a - K o w a l – Struktury
zewnêtrzne bakterii Gram-ujemnych, a bakteriobójcza aktywnoœæ dope³niacza . . . . . . . .
39
L. S e r w e c i ñ s k a, P. S t ¹ c z e k, A. J a w o r s k i – Inteiny – budowa, funkcje biologiczne
i filogeneza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
Profesor dr hab. Bernard Zab³ocki – w pierwsz¹ rocznicê œmierci . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
D. D z i e r ¿ a n o w s k a, A. P a w i ñ s k a, W. K a m i ñ s k a, J. P a t z e r – Lekooporne
drobnoustroje w zaka¿eniach szpitalnych . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
W. R u d n i c k a – Molekularne mechanizmy odpornoœci na gruŸlicê . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
Contents
Prof. dr hab. Krystyna Kote³ko (1920–2003) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
K. B r z o s t e k – Regulation of virulence factors in Yersinia enterocolitica . . . . . . . . . . . . . . . . .
7
G. M i e l n i k, W. D o r o s z k i e w i c z, A. K o r z e n i o w s k a - K o w a l – The outer
membrane components of Gram-negative rods and bacterial activity of complement . . . 39
L. S e r w e c i ñ s k a, P. S t ¹ c z e k, A. J a w o r s k i – Inteins – organization, biological functions and phylogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
Profesor dr hab. Bernard Zab³ocki (1907–2002) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
D. D z i e r ¿ a n o w s k a, A. P a w i ñ s k a, W. K a m i ñ s k a, J. P a t z e r – Antimicrobial
resistant pathogenes in nosocomial infections . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
W. R u d n i c k a – Molecular mechanisms of resistance to tuberculosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107