Gotowe podłoże BBL do wykrywania

 Gotowe podłoże BBL do wykrywania enterokoków o silnej oporności na
aminoglikozydy i wankomycynę
Enterococcus Screen Agar QUAD Plate with Streptomycin / Gentamicin / Vancomycin

8809611JAA
2013-08
Polski
PRZEZNACZENIE
Enterococcus Screen Agar służy do badań enterokoków w kierunku silnej oporności na aminoglikozydy i wankomycynę w celu
dokonania oceny przewidywanej aktywności synergistycznej tych antybiotyków.
STRESZCZENIE I WYJAŚNIENIA
Enterokoki powodują różnego typu zakażenia. Najczęściej są one przyczyną zakażeń dróg moczowych, jamy brzusznej, krwi,
1
wsierdzia, dróg żółciowych, ran pooparzeniowych oraz założonych na stałe cewników . Od 80% do 90% zakażeń spowodowanych
2
jest przez bakterie Enterococcus faecalis, natomiast większość pozostałych — przez bakterie E. faecium. W Stanach
3
Zjednoczonych enterokoki są obecnie czwartą pod względem częstości występowania przyczyną bakteriemii . Współczynnik
umieralności w przypadkach bakteriemii spowodowanej przez enterokoki wynosi od 12% do 68%, przy czym zgon spowodowany
4
posocznicą występuje w 4% do 50% przypadków .
Leczenie zakażeń przy zastosowaniu samej penicyliny lub wankomycyny nie prowadzi do zniszczenia enterokoków, przez co
5
dochodzi do nawrotów zakażenia . Już od wielu lat wiadomo, że enterokoki wykazują niską oporność na wiele różnych antybiotyków
6
β-laktamowych i aminoglikozydowych . Dodanie aminoglikozydów, na które izolat okazał się wrażliwy, powodowało aktywność
7
synergistyczną w warunkach in vitro oraz in vivo, dając efekt bakteriobójczy . Podejrzewa się, że efekt synergistyczny
spowodowany jest niszczeniem ścian komórkowych przez penicylinę lub wankomycynę, co pozwala na wniknięcie aminoglikozydu i
8
zahamowanie syntezy białek w komórkach bakterii . Wytworzenie silnej oporności na streptomycynę (≥ 2000 µg/mL), gentamycynę
(≥ 500 µg/mL) i wankomycynę (≥ 6 µg/mL) może być powodem braku skuteczności penicyliny lub kombinacji wankomycyny i
aminoglikozydu w niszczeniu drobnoustrojów powodujących zakażenie. Dlatego ważne jest wykonywanie badań w kierunku silnej
oporności na streptomycynę, gentamycynę i wankomycynę. Amerykańska Komisja ds. Klinicznych Standardów Laboratoryjnych
(CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute) zaleca stosowanie w testach na silną oporność pożywki na bazie wyciągu z
9
mózgów i serc zawierającej streptomycynę (2000 µg/mL), gentamycynę (500 µg/mL) lub wankomycynę (6 µg/mL).
ZASADY PROCEDURY
Podłoże zawierające wyciąg z mózgów i serc to uniwersalna pożywka odpowiednia do hodowli wielu różnych drobnoustrojów i
9
zalecana do badań oporności enterokoków.
Wyciągi mięsne i peptony stanowią źródło organicznego azotu, węgla, siarki, witamin i substancji śladowych. Dekstroza jest źródłem
węglowodanów. Pożywka jest buforowana przy użyciu fosforanu(V) disodu. Do wykrywania silnej oporności na aminoglikozydy
9
stosowana jest streptomycyna w stężeniu 2000 µg/mL oraz gentamycyna w stężeniu 500 µg/mL. Do wykrywania oporności na
wankomycynę stosowana jest wankomycyna w stężeniu 6 µg/mL. Obojętne barwniki FD&C dodaje się w celu ułatwienia identyfikacji
antybiotyków.
ODCZYNNIKI
Enterococcus Screen Agar
Podłoże zawierające wyciąg z mózgów i serc
Przybliżony skład* w przeliczeniu na jeden litr wody oczyszczonej
Wyciąg z mózgów i serc .................................................... 8,0 g
Hydrolizat pepsynowy tkanki zwierzęcej ........................... 5,0 g
Trzustkowy hydrolizat kazeiny ........................................ 16,0 g
Chlorek sodu ..................................................................... 5,0 g
Dekstroza .......................................................................... 2,0 g
Fosforan(V) disodu ........................................................... 2,5 g
Agar ................................................................................ 13,5 g
Sekcja I zawiera wyciąg z mózgów i serc (kontrola wzrostu)
Sekcja II zawiera wyciąg z mózgów i serc z dodatkiem gentamycyny (0,5 g/L) oraz barwnika czerwonego FD&C nr 40 (1,02 g/L)
Sekcja III zawiera wyciąg z mózgów i serc z dodatkiem wankomycyny (6,0 mg/L) oraz barwnika żółtego FD&C nr 5 (0,56 g/L)
Sekcja IV zawiera wyciąg z mózgów i serc z dodatkiem streptomycyny (2,0 g/L) oraz barwnika niebieskiego FD&C nr 1 (0,4 g/L)
*Skorygowany i (lub) uzupełniony zgodnie z wymaganiami mającymi na celu spełnienie kryteriów wydajności.
Ostrzeżenia i środki ostrożności
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Podczas wykonywania wszystkich procedur należy przestrzegać aseptycznej techniki pracy i obowiązujących środków ostrożności
dotyczących zagrożenia mikrobiologicznego. Używane płytki z preparatami, pojemniki na próbki oraz inne materiały skażone należy
przed wyrzuceniem poddać sterylizacji w autoklawie. W razie zaobserwowania nadmiernego zawilgocenia należy wysuszyć dolną
powierzchnię płytki na powietrzu, aby nie dopuścić do powstawania warstwy wody między górną a dolną częścią płytki w trakcie
inkubacji.
Instrukcje przechowywania: Otrzymane płytki umieścić i przechowywać w ciemnym miejscu, w temperaturze od 2 do 8 °C. Unikać
zamrażania i przegrzewania. Otwierać dopiero bezpośrednio przed użyciem. Do minimum ograniczać kontakt ze światłem. Na
1
gotowych podłożach przechowywanych do momentu użycia w oryginalnych opakowaniach w formie rękawa, w temperaturze od
2 do 8 °C, można wykonywać posiewy do dnia określonego terminem ważności, a następnie prowadzić inkubację przez zalecany
czas. Przed posiewem ogrzać podłoże do temperatury pokojowej.
Pogorszenie jakości produktu: Nie należy używać płytek, jeżeli są na nich widoczne oznaki skażenia mikrobiologicznego,
odbarwienia, wyschnięcia, pęknięcia lub inne zjawiska wskazujące na pogorszenie jakości.
POBIERANIE PRÓBEK I POSTĘPOWANIE Z NIMI
Opisywane podłoża nie są przeznaczone do posiewów próbek lub hodowli mieszanych. Badane drobnoustroje muszą pochodzić z
czystej hodowli i być wstępnie zidentyfikowane jako należące do gatunku Enterococcus.
PROCEDURA
Dostarczane materiały: Enterococcus Screen Agar.
Materiały wymagane, ale niedostarczane: Pomocnicze pożywki hodowlane, odczynniki, szczepy do kontroli jakości i sprzęt
laboratoryjny wymagany do wykonania tej procedury.
Procedura testowa
1. Przygotować inokulum, sporządzając zawiesinę kilku dobrze odizolowanych kolonii izolatu enterokoków z inkubowanej przez
18 – 24 h hodowli w probówce z pożywką płynną Trypticase Soy Broth i skorygować zmętnienie do standardu 0,5 McFarland.
10
2. Miejscowo zaszczepić poszczególne sekcje podłoża 10 µL skorygowanej zawiesiny.
3. Poczekać, aż punktowo naniesiona zawiesina zostanie wchłonięta w podłoża.
4. Inkubować płytki w temperaturze 35 °C ± 2 °C w atmosferze tlenowej, przez pełne 24 h. Jeśli po 24 h wynik jest ujemny,
prowadzić inkubację testów zawierających streptomycynę przez następne 24 h.
Kontrola jakości przez użytkownika:
1. Obejrzeć płytki w poszukiwaniu oznak pogorszenia jakości, zgodnie z opisem w punkcie „Pogorszenie jakości produktu”.
2. Sprawdzić zachowanie hodowli, wykonując na reprezentatywnych próbkach podłoża posiew czystych kultur stabilnych
szczepów kontrolnych, dających znane, prawidłowe reakcje. Zalecane jest użycie następujących kultur:
BADANE SZCZEPY
OCZEKIWANE WYNIKI
I
II
III
IV*
Enterococcus faecalis
ATCC 29212
Sekcja
+
–
–
–
Enterococcus faecalis
ATCC 51299
+
+
+
+
Enterococcus gallinarum
ATCC 49573
+
–
+
–
+ = Wzrost > jednej kolonii
– = Brak wzrostu lub jedna kolonia
* Jeśli po 24 h wynik w sekcji IV jest ujemny, prowadzić inkubację przez następne 24 h.
Muszą być spełnione wymagania dotyczące kontroli jakości określone w odpowiednich przepisach lokalnych i/lub krajowych albo
warunkach akredytacji; konieczne jest ponadto przestrzeganie standardowych wewnętrznych procedur kontroli jakości danego
laboratorium. Zaleca się skorzystanie z odpowiednich wytycznych CLSI lub przepisów CLIA w celu ustalenia właściwych zasad
kontroli jakości.
WYNIKI
Po pełnych 24 h inkubacji zbadać płytki pod kątem wzrostu. Wzrost w sekcji I (podłoże kontrolne zawierające tylko wyciąg z
mózgów i serc) oznacza, że zawiesina pożywki zawiera odpowiednie drobnoustroje testowe i że test jest wiarygodny. W wypadku
braku wzrostu test należy uznać za nieważny i powtórzyć.
Wzrost na:
Sekcji II – czerwonej (podłoże z gentamycyną) i/lub
Sekcji III – żółtej (podłoże z wankomycyną) i/lub
Sekcji IV – niebieskiej (podłoże ze streptomycyną)
oznacza, że dany antybiotyk nie będzie wykazywał aktywności synergistycznej w terapii kombinowanej. Brak wzrostu oznacza, że
można spodziewać się synergii.
OGRANICZENIA PROCEDURY
Niniejszy produkt jest przeznaczony do użytku z gatunkiem Enterococcus. Sporadycznie izolaty enterokoków o granicznych
stężeniach MIC drobnoustrojów wrażliwych na antybiotyk mogą wykazywać wzrost. Produkt ten umożliwia zastosowanie metody
badań przesiewowych w celu określenia przewidywanego efektu synergistycznego aminoglikozydów z penicyliną lub wankomycyną.
Na podstawie wyników badań oporności na streptomycynę lub gentamycynę nie można przewidzieć aktywności synergistycznej
innych aminoglikozydów, a na podstawie wyników badań oporności na wankomycynę nie można przewidzieć aktywności
synergistycznej penicyliny.
10
Ostateczne określenie działania synergicznego możliwe jest przy wykorzystaniu technik miareczkowania i krzywych eradykacji.
Testowy szczep enterokoków może być oporny na penicylinę i ampicylinę w wyniku modyfikacji białek wiążących penicylinę lub
9
wytwarzania β-laktamazy. Odpowiednie metody badań opisano w dokumencie CLSI.
CHARAKTERYSTYKA WYNIKÓW
Zalecana przez CLSI procedura badań przesiewowych na obecność enterokoków silnie opornych na aminoglikozydy i
wankomycynę została przeprowadzona przez producenta na 49 izolatach szczepów Enterococcus z zastosowaniem podłoży
2
BBL do badań przesiewowych zawierających wyciąg z mózgów i serc oraz gentamycynę w stężeniu 500 µg/mL, wankomycynę w
stężeniu 6 µg/mL i streptomycynę w stężeniu 2000 µg/mL. Zestaw 49 izolatów enterokoków obejmował szczepy: 21 E. faecalis,
18 E. faecium, 4 E. gallinarum, 2 E. raffinosus, 1 E. casseliflavus, 1 E. mundtii oraz 2 E. avium. Oporności tych 49 szczepów
enterokoków przedstawiono w Tabeli 1.
Tabela 1. Badanie przeprowadzone przez producenta
(% korelacji z wynikami oczekiwanymi)
=
Łączna liczba opornych po
24 h / wynik oczekiwany
29/29 (100 %)
Łączna liczba opornych po
48 h / wynik oczekiwany
Gentamycyna
Łączna liczba badanych
szczepów
49
Wankomycyna
49
27/27 (100 %)
=
Streptomycyna
49
24/26 (92 %)
26/26 (100 %)
=
Charakterystykę fenotypową badano przy użyciu agaru i/lub roztworu pożywki bulionowej w celu ustalenia stężeń MIC
gentamycyny, wankomycyny i streptomycyny. W przypadku wszystkich 49 uzyskano 100% korelację między wynikami testów a
wynikami oczekiwanymi.
Badania odtwarzalności (3x/dzień przez 3 dni) prowadzono w dwóch ośrodkach terenowych na 14 izolatach enterokoków. Zestaw
14 izolatów obejmował szczepy: 7 E. faecalis, 3 E. faecium, 1 E. gallinarum, 1 E. avium, 1 E. casseliflavus oraz 1 E. raffinosus.
Oporności tych 14 szczepów enterokoków przedstawiono w Tabeli 2.
Tabela 2. Badanie powtarzalności wykonane w ośrodkach terenowych
(% korelacji z wynikami oczekiwanymi)
=
Łączna liczba testów
Gentamycyna
Łączna liczba badanych
szczepów
14
279
Łączna liczba opornych po
24 h / wynik oczekiwany
162/162 (100%)
Wankomycyna
14
279
135/135 (100%)
14
279
160/162 (99%)
Streptomycyna
Charakterystykę fenotypową badano przy użyciu agaru i/lub roztworu pożywki bulionowej w celu ustalenia stężeń MIC
gentamycyny, wankomycyny i streptomycyny. Również w tym przypadku wystąpiła 100% korelacja między wynikami testów i
wynikami oczekiwanymi.
DOSTĘPNOŚĆ
Nr kat. Opis
222201 BBL Enterococcus Screen Agar QUAD Plate with Streptomycin / Gentamicin / Vancomycin, opakowanie 10 płytek
PIŚMIENNICTWO
1. Jett, B.D., M.M. Huycke, and M.S. Gilmore. 1994. Virulence of enterococci. Clin. Microbiol. Rev. 7:462-478.
2. Moellering, R.C., Jr. 1992. Emergence of Enterococcus as a significant pathogen. Clin. Infect. Dis. 14:1173-1178.
3. Emori, T.G., and R.P. Gaynes. 1993. An overview of nosocomial infections, including the role of the microbiology laboratory.
Clin. Microbiol. Rev. 6:428-442.
4. Landry, S.L., D.L. Kaiser, and R.P. Wenzel. 1989. Hospital stay and mortality attributed to nosocomial enterococcal bacteremia:
a controlled study. Am. J. Infect. Control 17:323-329.
5. Moellering, R.C., Jr., O.M. Korzeniowski, M.A. Sande, and C.B. Wennersten. 1979. Species-specific resistance to antimicrobial
synergism in Streptococcus faecium and Streptococcus faecalis. J. Infect. Dis. 140:203-208.
6. Murray, B.E. 1990. The life and times of the enterococcus. Clin. Microbiol. Rev. 3:46-65.
7. Mandell, G.L. 1984. Enigmatic enterococcal endocarditis. Ann. Intern. Med. 100:904-905.
8. Moellering, R.C., Jr., and A.N. Weinberg. 1971. Studies on antibiotic synergism against enterococci. II. Effect of various
antibiotics on the uptake of 14C-labelled streptomycin by enterococci. J. Clin. Invest. 50:2580-2584.
9. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2013. Approved standard: M100-S23. Performance standards for
antimicrobial/susceptibility testing; 23rd informational supplement. CLSI, Wayne, Pa.
10. Sahm, D.F., and C. Torres. 1988. Effects of medium and inoculum variations on screening for high-level aminoglycoside
resistance in Enterococcus faecalis. J. Clin. Microbiol. 26:250-256.
3
=
 = Becton, Dickinson and Company
7 Loveton Circle
Sparks, MD 21152 USA
800-638-8663
www.bd.com/ds

Benex Limited
Pottery Road, Dun Laoghaire
Co. Dublin, Ireland
ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection.
BD, BD Logo, and all other are trademarks are property of Becton, Dickinson and Company. © 2013 BD=
4