1. Wstęp 2. Problemy diagnostyczne 3. Wnioski

DLACZEGO DIAGNOSTYKA BORELIOZY
JEST TAK TRUDNA?
z
1. Wstęp
Borrelia burgdorferi to Gram-ujemna bakteria o kształcie spiralnym, żyjąca w warunkach beztlenowych. Jest ona czynnikiem etiologicznym choroby z Lyme – boreliozy.
B. burgdorferi posiada budowę charakterystyczną ze względu na włókna osiowe umieszczone w przestrzeni peryplazmatycznej (pomiędzy peptydoglikanem a giętką błoną zewnętrzną), które to pozwalają jej na rotacyjny ruch w lepkim
środowisku. Unikanie odpowiedzi immunologicznej przez Borrelia warunkowane jest zmianą antygenów powierzchniowych, antygenowością cyst, a także przebywaniem w miejscach uprzywilejowanych immunologicznie.
W diagnostyce laboratoryjnej boreliozy zastosowanie znalazły białka pospolite (dające reakcje krzyżowe z innymi krętkami, a nawet niespokrewnionymi bakteriami) oraz białka specyficzne dla B. burgdorferi. Antygeny pospolite to np. białko p41
(flagelina), p66, p68, p71, p73. Do białek specyficznych należą m.in. białka błony zewnętrznej - OM: OspA (31kDa), OspB (34kDa), OspC (21–24kDa), BmpA (p39), p93, p83/100, OspE (19kDa), OspF (26kDa).
U chorych na boreliozę lub u osób z podejrzeniem pobiera się materiały badane, takie jak: surowica krwi (najczęściej), płyn mózgowo-rdzeniowy, płyn maziowy stawów, materiał uzyskany na drodze biopsji (np. skóry) i mocz (rutynowo jeszcze
niebadany). Do testów pośrednich, bazujących na wykrywaniu specyficznych przeciwciał w klasach IgG i IgM należą: ELISA, IFT, IHA i Western blot.
Wśród testów bezpośrednich, wykrywających bezpośrednio obecność czynnika zakaźnego wykorzystuje się następujące metody: PCR, test LUAT (Lyme Urine Antigen Test — metoda wykrywania antygenów B. burgdorferi moczu, niedostępna
w Europie), hodowla B. burgdorferi z materiałów biologicznych, testy na obecność kompleksów immunologicznych w płynach ustrojowych, biopsje tkanki bezpośrednie ich badanie pod kątem obecności komórek B. burgdorferi (małe znaczenie
diagnostyczne).
2. Problemy diagnostyczne
- zawodność złotego standardu badawczego stosowanego w mikrobiologii — hodowli
wykonanej z płynu mózgowo-rdzeniowego, której wynik często wypada ujemnie (efekt
przywierania bakterii B. burgdorferi struktur mielinowych będącego efektem organotropizmu).
- PCR: większość bakterii B. burgdorferi przywiera do mieliny, podczas gdy w krążącym płynie
można nie wykryć patogenu (ani jego materiału genetycznego). Ponadto samo wykrycie
materiału genetycznego patogenu nie musi świadczyć o obecności żywych krętków. Potwierdza
jedynie, że zakażenie miało miejsce.
- badaniem, które może pomóc w rozstrzygnięciu diagnostycznego problemu neuroboreliozy jest
poszukiwanie swoistych przeciwciał produkowanych lokalnie w obrębie OUN, ale swoista
odpowiedź humoralna jest procesem wymagającym czasu, tak więc wcześnie na początku
choroby wyniki badań serologicznych mogą być ujemne (długi czas tworzenia się przeciwciał
po zakażeniu – 4-6 tygodni). Ponadto: brak wolnych przeciwciał, kompleksy immunologiczne,
- zróżnicowanie antygenów użytych w testach serologicznych. Część antygenów
charakteryzuje się wysoką specyficznością, inne natomiast bardzo dużą reaktywnością krzyżową
(flagellina, hsp).
- wybór genogatunku B. burgdorferi, który powinien być zastosowany do przygotowania
testu, ponieważ różnią się one reaktywnością z surowicami pacjentów. W Europie, przy obecnej
sytuacji epidemiologicznej, uznano że gatunkiem satysfakcjonującym pod względem składu
antygenowego jest B. afzelii, która zabezpiecza najwyższy stopień czułości. W przypadku
neuroboreliozy zaleca się dodatkowe wykonanie badania z użyciem gatunku B. garinii, uznanej za
najczęstszy patogen odpowiedzialny za tę postać boreliozy, zwłaszcza gdy badanie z użyciem B.
afzelii wynik ujemny, a są podstawy, by podejrzewać boreliozę.
- western blot: pasma specyficzne dla B. burgdorferi pasma reagujące krzyżowo leżą bardzo
blisko siebie na pasku testowym, co może spowodować błędne odczytanie wyniku.
- niemożność odróżnienia aktywnego zakażenia od przebytego w przeszłości, nawet w
sytuacji, gdy wykrywane przeciwciała są całkowicie swoiste. Szczególnie komplikuje interpretację
wyniku obecność przeciwciał w obu klasach, niezależnie od czasu, jaki upłynął od momentu
zachorowania. Ponadto stężenia wykrywanych przeciwciał często nie korelują ze stanem
klinicznym pacjenta. Często wysokie stężenia przeciwciał towarzyszą łagodnym postaciom
boreliozy, podczas gdy u pacjentów z ciężkim przebiegiem choroby przeciwciała mogą
występować w niskich wartościach lub być nieobecne.
- przebywanie bakterii w obszarach immunologicznie uprzywilejowanych (mózg, aparat
ruchu, przestrzenie wewnątrzkomórkowe),
- wcześnie zastosowana antybiotykoterapia,
- słaba odpowiedź immunologiczna lub jej brak (defekt immunologiczny),
- posiadanie przez bakterię otoczki z proteoglikanów (osłonka śluzowa) układ odpornościowy jej
nie widzi ,
- zmienność antygenowa bakterii.
Test ELISA: Najstarsza z obecnie stosowanych metod diagnostycznych. Metoda polega na
identyfikacji specyficznych przeciwciał klasy IgG lub IgM w surowicy pacjenta.
Zalety: szybkość analizy, niska cena
Wady: reakcje krzyżowe powodują fałszywie pozytywne wyniki, wysokie miano przeciwciał nie
oznacza zakażenia bakterią (przeciwciała IgG mogą utrzymywać się we krwi przez wiele
miesięcy), rodzaj użytego testu oraz pochodzenie i rodzaj antygenów bakterii mają wpływ na
wynik. Różne laboratoria stosują zestawy do oznaczeń pochodzące od różnych producentów,
niska czułość testu oszacowana na ok. 50-70%.
Zalecane do pierwszego skriningu, choć wynik ujemny nie gwarantuje braku infekcji. Zalecane
jest dodatkowo, oprócz testu ELISA, przeprowadzenie testu Western-blot.
Western Blot: Test polegający na wykryciu antygenów bakterii krążących w krwioobiegu.
Zalety: wynik pozytywny jest dowodem bezpośrednim na obecność bakterii we krwi
Wady: niska czułość testu. Do jego przeprowadzenia potrzeba znacznego nagromadzenia
antygenów boreliozy we krwi. Z tego powodu wynik jest pozytywny jedynie w ok. 70%
przypadkach pacjentów zakażonych, wysoki koszt analizy, reakcje krzyżowe.
PCR: Wynik pozytywny jest dowodem świadczącym o obecności bakterii we krwi.
Zalety: wysoka czułość metody, wielokrotnie przewyższająca testy ELISA i WB, wysoka
powtarzalność oznaczeń, niska cena badania, wynik pozytywny jest dowodem bezpośrednim na
obecność bakterii we krwi
Wady: niewiele ośrodków w Polsce przeprowadza to badanie
Real-Time PCR: Najczulsza ze znanych obecnie metod diagnostycznych, pozwalająca na
wykrycie pojedynczych komórek bakterii w badanym materiale. Jest to modyfikacja PCR
polegająca na zastosowaniu w reakcji amplifikacji również specyficznych sond
fluorescencyjnych, przez co czułość reakcji została wielokrotnie zwiększona. Obecnie dostępna
w nielicznych Laboratoriach na terenie Polski, choć zapewne w przyszłości stanie się
standardem w diagnostyce.
Wyniki fałszywie ujemne w serodiagnostyce boreliozy: stadium zakażenia, upośledzenie
odpowiedzi immunologicznej – obecność kompleksów immunologicznych, wybór niewłaściwego
materiału do badania, wpływ antybiotykoterapii wdrożonej w początkowym stadium choroby.
Wyniki fałszywie ujemne w testach bezpośrednich: niezachowanie wszystkich wymaganych
warunków pobrania i przesłania materiału do badania, obecność w materiale badanym
inhibitorów polimerazy, np. heparyny, hemoglobiny, pochodnych porfiryn, posługiwanie się:
wadliwymi primerami, nieodpowiednią temperaturą na poszczególnych etapach reakcji,
niewłaściwym składem podłoża, niezachowaniem beztlenowych warunków hodowli, zbyt
wcześnie wykonany odczyt wyniku (wzrost B. burgdorferi od 1 do 5 tygodni), niewłaściwy dobór
materiału do badania, obecność tylko cyst krętków, posiew na krętki dopiero po wdrożeniu
antybiotykoterapii.
Wyniki fałszywie dodatnie w serodiagnostyce boreliozy: spowodowane reakcją krzyżową,
istnieniem innej infekcji, nie tylko krętkowej. Wyniki takie dają najczęściej zakażenia bakteryjne:
T. pallidum, H. pylori riketsje, ehrlichie, a także wirusy, np. HIV-1, herpeswirusy, szczególnie EBV.
Problem ten dotyczy szczególnie przeciwciał wykrywanych w klasie IgM.
Ryc. 1: Czas wykrywania antygenu i przeciwciał w rozwoju boreliozy oraz testy służące rozpoznaniu choroby
(zaznaczono ich skuteczność w stosunku do momentu zmiany klasy).
3. Wnioski
Diagnostyka boreliozy nie jest łatwa, ponieważ nie dysponujemy jednoznacznym testem (co wynika ze złożonej budowy i zmienności antygenowej bakterii) oraz z powodu trudności interpretacyjnych. Niestety, żadna z
dostępnych metod diagnostyki laboratoryjnej boreliozy nic pozwala na odróżnienie aktywnego zakażenia od śladu po jego przebyciu. Wyjątek stanowi hodowla, która jako jedyna dowodzi obecności żywych bakterii w
badanym materiale. W diagnostyce serologicznej boreliozy należy zwrócić szczególną uwagę na to kiedy i jaki materiał pobierany jest do badania oraz czy zostało ono prowadzone zgodnie z obowiązującymi standardami
postępowania. Wyniki należy interpretować zawsze uwzględniając stan kliniczny pacjenta. O ewentualnym powtarzaniu badań serologicznych powinien decydować lekarz po przeanalizowaniu dotychczasowych wyników
i postępu choroby. W przypadku utrzymywania się wyraźnych objawów klinicznych przy stałej seronegatywności należy przeprowadzić narządową diagnostykę różnicową w kierunku obecności innych schorzeń o
podobnym obrazie klinicznym jak stwierdzany w boreliozie.
Test Elisa jest mniej czuły i swoisty niż Western-blot
➢Często zdarza się seronegatywna postać boreliozy (zwłaszcza neuroboreliozy)
➢Hodowle krętków z płynu mózgowo-rdzeniowego np. u ponad 40% osób traktowanych jako SM (bez np. pleocytozy limfocytarnej w płynie mózgowo-rdzeniowym)
➢Dodatnie hodowle mimo 30-40 dniowej antybiotykoterapii!
➢
Zalecenia Polskiego Towarzystwa Epidemiologów i Lekarzy Chorób Zakaźnych
1. Badanie przesiewowe metodą ELISA: wynik negatywny → koniec diagnostyki
2. Dodatnie i wątpliwe wyniki sprawdzić potwierdzić testem Western Blot
Wyniki negatywne przemawiają przeciw rozpoznaniu boreliozy.
Łańcuchowa reakcja polimerazowa (PCR) nie powinna być wykorzystywana w diagnostyce rutynowej ze względu na niedostateczną standaryzację w diagnozowaniu zakażeń występujących na terenie Polski. PCR
pozwala na wykrycie DNA krętkowego nie określając czy pochodzi z żywych organizmów, a więc dodatni wynik nie jest równoznaczny z aktywnym zakażeniem.