(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 191508 PL 191508 B1

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12)
OPIS PATENTOWY
(19)
PL
(21) Numer zgłoszenia: 331817
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej Polskiej
(22) Data zgłoszenia: 08.03.1999
191508
(13) B1
(11)
(51) Int.Cl.
8
C12N 15/82
C12N 15/54
C12N 15/63
Sposób otrzymywania roślin transgenicznych
o korzystnych cechach hodowlanych
(54)
(73) Uprawniony z patentu:
Instytut Biochemii i Biofizyki PAN,
Warszawa,PL
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
11.09.2000 BUP 19/00
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
(72) Twórca(y) wynalazku:
Agnieszka Sirko,Warszawa,PL
Anna Błaszczyk,Warszawa,PL
Robert Brodzik,Tuchowicz,PL
31.05.2006 WUP 05/06
(74) Pełnomocnik:
Brodowska Iwona,
Lex-Pat Biuro Prawno-Patentowe s.c.
PL 191508 B1
(57)
1. Sposób otrzymywania roślin transgenicznych o korzystnych cechach hodowlanych, znamienny tym, że genom rośliny-gospodarza transformuje się materiałem genetycznym, do którego
wprowadzono bakteryjny gen kodujący acetylotransferazę serynową, taki jak gen cysE lub jego
zmutowane pochodne pochodzące z Escherichia coli, znajdujące się w obrębie roślinnej kasety
ekspresyjnej, korzystnie o sekwencji:
znajdujący się w obrębie roślinnej kasety ekspresyjnej, po czym uzyskuje się materiał roślinny
w znany sposób.
2
PL 191 508 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania roślin o korzystnych cechach hodowlanych
tj. bardziej opornych na stresy biotyczne i abiotyczne, mających zwiększoną zawartość nie białkowych
związków z grupą tiolową (-SH) z wykorzystaniem metod inżynierii genetycznej.
Uzyskiwane sposobem według wynalazku transgeniczne rośliny o zwiększonym poziomie cysteiny i glutationu (czyli związków zawierających zredukowaną siarkę) mogą znaleźć potencjalne zastosowanie np. w rolnictwie (zwiększona oporność na stresy biotyczne i abiotyczne) lub ochronie środowiska (zdolność do usuwania zanieczyszczenia atmosfery dwutlenkiem siarki i siarkowodorem lub
zanieczyszczenia gleby nadmiarem siarczanów i siarczynów). Ponadto, zwiększenie zawartości cysteiny oraz glutationu w roślinach uprawnych poprawia ich walory paszowe, ponieważ cysteina jest dla
zwierząt aminokwasem egzogennym tj. musi być dostarczona w pożywieniu.
Tylko bakterie, rośliny i grzyby zdolne są do przeprowadzenia biosyntezy cysteiny z nieorganicznego siarczanu. Etapy metabolizmu siarki w komórkach roślinnych i bakteryjnych są identyczne
i obejmują: pobranie siarczanu ze środowiska, jego kilkustopniową redukcję do siarczku, asymilację
do cysteiny i włączenie w białka oraz inne metabolity. Cysteina jest produktem reakcji katalizowanej
przez syntazę cysternową, polegającej na przyłączeniu siarczku do „dostarczającej szkieletu węglowego”
O-acetylo-L-seryny (OAS). Reakcja biosyntezy OAS z acetylo-CoA i seryny przeprowadzana jest
przez enzym zwany acetylotransferazą serynową (SAT; EC 2.3.1.30). U bakterii Escherichia coli enzym SAT kodowany jest przez gen cysE (GenBank accession number: M34333).
Cysteina jest jednym z trzech aminokwasów wchodzących w skład glutationu (γ-glutamylo-cysteinyloglicyny), którego biosynteza przeprowadzana jest w dwóch etapach, katalizowanych odpowiednio przez syntetazę -glutamylo-cysteinową oraz syntetazę glutationu. Glutation to nie tylko główny nie
białkowy związek magazynujący zredukowaną formę siarki w roślinach tj. zawierający grupę tiolową (-SH),
ale przede wszystkim związek pełniący ważną rolę w kontroli stanu utlenienia komórki, odpowiedzi
roślin na różnego rodzaju stresy biotyczne i abiotyczne np. wysoką i niską temperaturę, suszę, UV, obecność metali ciężkich (1) a także detoksyfikacji herbicydów oraz ksenobiotyków (2). Glutation zapobiegając utlenieniu innych związków przechodzi z formy zredukowanej (GSH) do formy utlenionej (GSSG).
Obecna w komórce aktywność reduktazy glutationu zapewnia powrót formy utlenionej do formy zredukowanej. Zwykle, w warunkach bezstresowych, stosunek GSH do GSSG jest wysoki i wynosi około 10:1.
Dotychczasowe próby zwiększenia poziomu GSH w roślinach polegały na wprowadzeniu do roślin dodatkowych kopii genów kodujących syntetazę γ-glutamylo-cysteinową, syntetazę glutationu lub
reduktazę glutationu (3, 4, 5) czyli genów kodujących enzymy bezpośrednio zaangażowane w metabolizm GSH. Dostępność aminokwasów składowych wydawała się być jednakże elementem ograniczającymi poziom glutationu (3, 7).
Nieoczekiwanie okazało się że sposobem według wynalazku możliwe jest zwiększenie poziomu
biosyntezy bezpośredniego prekursora cysteiny, co szczególnie przy nielimitowanej dostępności nieorganicznego siarczanu, prowadzi do zwiększenia dostępności cysteiny, czyli jednego z aminokwasów wchodzących w skład GSH.
Sposób według wynalazku polega na tym, że genom rośliny-gospodarza transformuje się materiałem genetycznym do którego wprowadzono bakteryjny gen kodujący acetylotransferazę serynową,
taki jak gen cysE lub jego zmutowane pochodne pochodzące z Escherichia coli, znajdujące się w obrębie roślinnej kasety ekspresyjnej, korzystnie o sekwencji:
PL 191 508 B1
3
znajdujący się w obrębie roślinnej kasety ekspresyjnej, po czym uzyskuje się materiał roślinny
w znany sposób.
Do transformacji roślin stosuje się plazmid, w skład którego oprócz powyżej wspomnianego genu wchodzi dowolny znany promotor, o którym wiadomo, że zapewnia inicjację transkrypcji w roślinach wybrany z grupy promotorów wyizolowanych z roślin lub wirusów roślinnych, korzystnie promotor
wirusa mozaiki kalafiora „CaMV 35S” oraz dowolny znany terminator transkrypcji, funkcjonujący
w komórkach roślinnych, zapewniający odpowiednie zakończenie tego transkryptu za wprowadzonym
fragmentem bakteryjnego DNA.
W sposobie według wynalazku prowadzi się: (1) rekombinację DNA w celu skonstruowania
wektora zawierającego fragment bakteryjnego DNA z genem kodującym serynową acetylotransferazę
(SAT), (2) przeniesienie fragmentu DNA wraz z genem kodującym SAT oraz sygnałami zapewniającymi jego ekspresję (określane dalej jako roślinna kaseta ekspresyjna) z wektora plazmidowego do
genomu wybranej rośliny, (3) regenerację oraz selekcję transgenicznych roślin produkujących bakteryjny enzym SAT.
W wyniku zastosowania sposobu według wynalazku otrzymane rośliny mają zwiększony poziom
aktywności SAT, zawierają podwyższony poziom cysteiny i glutationu tj. nie białkowych związków zawierających zredukowaną siarkę w postaci grupy tiolowej (-SH) oraz wykazują większą oporność na stresy.
W sposobie według wynalazku do transformacji roślin stosuje się materiał genetyczny (plazmid)
korzystnie uzupełniony markerem umożliwiającym pozytywną selekcję komórek roślinnych posiadających wbudowane do genomu obce DNA. Marker ten warunkuje oporność selekcjonowanych roślin na
antybiotyki (np. kanamycynę) lub herbicydy (np. fosfinotrycynę).
Do wprowadzenia roślinnej kasety ekspresyjnej zawierającej bakteryjny gen cysE oraz marker
selekcyjny stosuje się dowolną znaną metodę, taką jak bezpośrednie bombardowanie komórek roślinnych materiałem genetycznym lub transformacja roślin za pośrednictwem Agrobacterium i plazmidów
Ti. Wybór metody wprowadzenia obcego materiału genetycznego do roślinnego-gospodarza zależy od
tego jaki gatunek rośliny zostanie wybrany do procesu transformacji genetycznej. Jednakże podstawową metodą zapewniającą stabilną integrację fragmentu DNA do genomu rośliny, co zapewnia dziedziczenie wprowadzonej modyfikacji genetycznej oraz utrzymywanie się uzyskanych pożądanych
4
PL 191 508 B1
cech w potomstwie transgenicznych roślin jest transformacja za pomocą Agrobacterium. Istnieje możliwość wykorzystania wielu szczepów Agrobacterium. Ponadto, można zastosować liczne strategie
konstrukcji plazmidów w celu zapewnienia optymalnego poziomu ekspresji transgenu. Powszechne
metody transformacji z użyciem Agrobacterium to transformacja dysków liściowych (Ref. 8) lub transformacja siewek roślin (9), które mogą być przeprowadzone z dowolnym materiałem roślinnym posiadającym zdolność do różnicowania komórek niezbędną do regeneracji roślin po transformacji. Wybór materiału roślinnego, w którym można przeprowadzić proponowaną manipulację jest również dość szeroki.
Okazało się, że sposobem według wynalazku uzyskuje się transgeniczne rośliny o zwiększonym,
w porównaniu z roślinami macierzystymi, poziomie glutationu (2-3-kromie) oraz cysteiny (2-7-krotnie) poprzez wprowadzenie do nich bakteryjnego genu kodującego serynową acetylotrasferazę. Rośliny takie
charakteryzują się nie zmienionymi tempem wzrostu oraz wykazują typowe cechy roślin o zwiększonym poziomie GSH tj. są bardziej oporne niż rośliny macierzyste na stresy abiotyczne (takie jak np.
stres spowodowany przez związki utleniające lub zasolenie).
Prawdopodobne wydaje się, że wszystkie procesy, w które zaangażowany jest GSH mogą
w roślinach przebiegać sprawniej np. mogą one wykazywać zwiększoną oporność na jony metali ciężkich lub ksenobiotyki. Ponadto, zwiększenie ilości cysteiny oraz glutationu może podnieść wartość
paszową roślin uprawnych. Warto podkreślić, że z powodu zwiększenia ilości „szkieletu węglowego”
dla biosyntezy cysteiny czyli OAS, rośliny takie powinny być zdolne do inaktywacji większej ilości toksycznych związków zawierających nieorganiczną siarkę np. dwutlenku siarki, a zatem mogłyby być
potencjalnie wykorzystane do usuwania zanieczyszczenia atmosfery lub gleby.
Zregenerowane transgeniczne rośliny posiadają znacznie podwyższoną w porównaniu z roślinami kontrolnymi aktywność serynowej acetylotransferazy, co można wykazać poprzez oznaczenie
aktywności SAT dowolną znaną metodą (10). Zwiększenie aktywności enzymu zaangażowanego
w biosyntezę cysteiny prowadzi do zwiększenia ilości tego aminokwasu w roślinach. Powstający nadmiar cysteiny jest metabolizowany do glutationu (lub jego analogów), który jest głównym nie białkowym związkiem zawierającym grupy tiolowe. Konsekwencją podwyższonego poziomu nie białkowych
związków zawierających grupy tiolowe w roślinach jest zwiększenie oporności roślin na stresy abiotyczne i biotyczne (11). Innymi konsekwencjami może być zwiększenie oporności roślin na jony metali
ciężkich, ponieważ glutation jest prekursorem fitochelatyn czyli związków potrzebnych do wiązania
jonów metali ciężkich w komórkach roślinnych (12) lub zwiększenie oporności na różne inne substancje szkodliwe (ksenobiotyki) oraz herbicydy, ponieważ glutation zaangażowany jest w ich detoksyfikację (2). Poza tym, rośliny posiadające podwyższoną (i nie wrażliwą na regulację przez roślinne czynniki) aktywność SAT posiadają zwiększoną zdolność do metabolizowania nieorganicznych związków
siarki (siarczynu, siarczanu, siarczku). Mogą być zatem wykorzystane do usuwania tego rodzaju zanieczyszczeń środowiska, w tym zanieczyszczenia powietrza dwutlenkiem siarki.
Poniżej przedstawiono przykład wykonania wynalazku nie ograniczający jego zakresu.
P r z y k ł a d.
1. Konstrukcja wektora binarnego i transformacja Agrobacterium tumefaciens
Gen cysE został namnożony w reakcji PCR na matrycy pASH12 (13). W reakcji PCR wykorzystano następującą parę primerów (5'-cgg gat cca tgt cgt gtg aag aac tgg aaa oraz 5'-gcg gta cct tag
atc cca tcc cca tac tca). Primery te wprowadziły dodatkowo miejsca dla enzymów restrykcyjnych:
BamHI (w górę od miejsca startu transkrypcji) i Kpnl (w 3'-końcu sekwencji genu cysE nie podlegającej translacji). Po strawieniu przez BamHI i Kpnl, produkt reakcji o wielkości 0,8 kb wklonowano do
wektora pRoc2 (14). Transformanty selekcjonowano na podłożu LB z dodatkiem kanamycyny (25 ug/ml),
kolonie bakterii zawierających pożądaną wstawkę DNA identyfikowano izolując plazmidy metodą lizy
alkalicznej i trawiąc je enzymami restrykcyjnymi BamHI i Kpnl. Wyselekcjonowano klon pACE1 niosący
odpowiednią wstawkę tj. gen cysE w orientacji zapewniającej inicjację transkrypcji ze znajdującego się
w pRoc2 promotora „CaMV S35” oraz terminację transkrypcji w regionie terminatora genu nopalinowego.
2. Transformacja, regeneracja i warunki hodowli roślin
Do transformacji użyto linii tytoniu (Nicotiana tabacum) o niskiej zawartości alkaloidów LA Burley 21 (15). Nasiona (ofiarowane przez G. Collins´a, ale również dostępne z U.S. Department of Agriculture) zostały powierzchniowo wysterylizowane i kiełkowane in vitro na pożywce Murashige i Skoog´a (16). 2-3
tygodniowe siewki transformowano zawiesiną Agrobacterium tumefaciens (LBA 4404) zawierającą
plazmid pACE1. Zregenerowano ok. 30 transformantów opornych na kanamycynę i przeanalizowano
je pod względem aktywności SAT. Rośliny ze znacznie wyższą aktywnością SAT w stosunku do nie
transformowanych roślin przeniesiono do warunków in vivo i hodowano w warunkach szklarniowych.
PL 191 508 B1
5
Obecność bakteryjnego genu cysE w tych roślinach była potwierdzona za pomocą reakcji PCR, a jego
ekspresja potwierdzona na poziomie RNA za pomocą hybrydyzacji Northern oraz na poziomie białka
przez oznaczenie aktywności SAT.
3. Sprawdzenie poziomu cysteiny i glutationu
Poziom cysteiny i glutationu w tkance liściowej był wyznaczany po znakowaniu monobromobimanem (Sigma) i rozdziale za pomocą HPLC o odwróconych fazach (17). Fragmenty liści (100 mg;
pobrane z liści w 4-6 pozycji licząc od góry) z dojrzałych, ale nie kwitnących roślin, hodowanych 4
tygodnie w warunkach szklarniowych, pobrano i zamrożono bezpośrednio w ciekłym azocie. Próbki
trzymano w -80°C aż do momentu oznaczania. Zamrożony materiał rozcierano w 250 µl buforu ekstrakcyjnego (1M HClO4, 10mM EDTA), worteksowano i dodawano kolejne 250 µl buforu ekstrakcyjnego.
Próbki wirowano przy 14000 rpm, 10 min, 4°C. Do 50 µl supernatantu dodawano 300 µl 0,2M HEPES
(pH 12,4), aby zneutralizować pH do wartości 7,5. Po dodaniu 35 µl 250mM NaBH4 (Merck) próbki
inkubowano 15 min w temperaturze pokojowej.
Wyznakowane pochodne tiolowe otrzymano po dodaniu 35 µl 30mM monobromobimanu i dalszej inkubacji 15 min w temperaturze pokojowej. Reakcję zatrzymano przez dodanie 400 µl 2% kwasu
octowego. Próbki przefiltrowano przez 0,2 µm filtr nylonowy i nakładano na kolumnę RP18 (Nucleosil 5,
C18, Machery Nagel) wykorzystując system HPLC firmy Shimadzu. Do elucji (1,2 ml/min) zastosowano następujący liniowy gradient: 0 min, 15%B; 5 min, 15%B; 15 min, 23%B; 21 min, 100%B; 25 min,
15%B; 40 min 15%B. Tiolowe pochodne monobromobimanu wykrywane były fluorometrycznie (pochłanianie 380 nm; emisja 480 nm). Stosując wzorce związków traktowane tak samo jak próbki, określono piki w 8 min i 16 min odpowiednio jako cysteinę i glutation. Rośliny transgeniczne zawierały
kilkukrotnie podwyższony poziom cysteiny oraz 2-krotnie podwyższony poziom glutationu w porównaniu z roślinami macierzystymi.
4. Analiza oporności roślin na wybrane stresy abiotyczne
Fragmenty liści (ok. 1 cm2) wycinane losowo z pełni rozwiniętych liści z roślin hodowanych
w szklarni zanurzano w 500 mM NaCl, 1M H2O2 lub destylowanej H2O na 46 godzin przy 26°C na
świetle (19,000 µE m-2 s-1). Następnie określano spektrofotometrycznie zawartość chlorofilu a i b, po
ekstrakcji barwników 80% acetonem (Ref. 18). Wartości dla poszczególnych roślin (utratę barwników
na skutek stresu) obliczano następująco: ilość barwników na gram liści traktowanych H2O2 dzielono
przez ilość barwników na gram liści traktowanych H2O, a wynik wyrażano w procentach. Uzyskane
rośliny transgeniczne wykazywały kilkukrotnie zwiększoną oporność na działanie zastosowanych
związków w porównaniu z roślinami macierzystymi.
Literatura:
1. De Kok LJ, Stulen l (1993) Role of glutathione in plants under oxidative stress. In LJ De Kok, l
Stulen, H Rennenberg, C Brunold, WE Rauser, eds, Sulfur Nutrition and Assimilation in Higher Plants,
Regulatory, Agricultural and Environmental Aspects. SBP Academic Publishers, The Hague, The
Netherlands, pp 125-138
2. Coleman JOD, Blake-Kalff MMA, Davies TGE (1997) Detoxification of xenobiotics by plants:
chemical modification and vacuolar compartmentation. Trends Plant Sci 2: 144-151
3. Noctor G, Strohm M, Jouanin L, Kunert KJ, Foyer CH, Rennenberg H (1996) Synthesis of glutathione in leaves of transgenic poplar overexpressing γ-glutamylcysteine synthetase. Plant Physiol 112:
1071-1078
4. Foyer CH, Souriau N, Perret S, Lelandais M, Kunert KJ, Pruvost C, Jouanin L. (1995) Overexpression of glutathione reductase but not glutathione synthetaze leads to increases in antioxidant
capacity and resistance to photoinhibition in poplar trees. Plant Physiol 109: 1047-1057
5. Noctor G, Arisi ACM, Jouanin L, Foyer CH (1998) Manipulation of glutathione and amino acids
biosynthesis in the chloroplast. Plant Physiol.118: 471-482
6. Strohm M, Jouanin L, Kunert KJ, Pruvost C, Polle A, Foyer CH, Rennenberg H (1995) Regulation of glutathione synthesis in leaves of transgenic poplar (Populus tremula x P. alba) overexpressing glutathione synthase. Plant J 7: 141-145
7. Neuenschwander U, Suter M, Brunold C (1991) Regulation of sulfate assimilation by light and
O-acetyl-L-serine in Lemna minor L. Plant Physiol 106: 1241-1255
8. Firoozabady E, Kuehnle AR. (1995) Agrobacterium-mediated transformation In OL. Gamborg, GC Phillips (Eds.) Plant cell, tissue and organ culture. Fundamental methods. Springer-Verlag
Berlin Heidelberg, Germany, pp181-195
6
PL 191 508 B1
9. Rossi L, Escudero J, Hohn B, Tinland B (1993) Efficient and sensitive assay for T-DNAdependent transient gene expression. Plant Mol Biol Rep 11: 220-229
10. Kredich NM, Tomkins GM (1966) The enzymic synthesis of L-cysteine in Escherichia coli
and Salmonella typhimurium. J Biol Chem 241: 4955-4965
11. Noctor G, Arisi A-C M, Jouanin L, Kunert KJ, Rennenberg H, Foyer CH (1998) Glutathione:
biosynthesis, metabolism and relationship to stress tolerance explored in transformed plants. J Exp.
Bot. 49: 623-647
12. Zenk, MH (1996) Heavy metal detoxification in higher plants - a review. Gene 179: 21-30
13. Sirko A, Hulanicka D (1988) Cloning of cysE gene of Escherichia coli with a mini-Mu-lac
containing a plasmid replicon. Acta Biochim Polon 35: 51-55
14. Hilder VA, Gatehouse AMR, Sheerman SE, Barker RF, Boulter D. (1987) A novel mechanism of insect resistance engineered into tobacco. Nature 330: 160-163
15. Legg PD, Chaplin JF, Collins GB (1969) Inheritance of percent total alkaloids in Nicotiana
tabacum L J Heredity 60: 213-217
16. Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15: 473-493
17. Kosower NS, Kosower EM (1987) Thiol labeling with bromobimanes. Methods Enzymol 143: 76-96
18. Lichtenthaler HK, Wellburn AR (1983) Determination of total carotenoids and chlorophylls
a and b of leaf extracts in different solvents. Biochem Soc Trans 11: 591-592
Zastrzeżenia patentowe
1. Sposób otrzymywania roślin transgenicznych o korzystnych cechach hodowlanych, znamienny tym, że genom rośliny-gospodarza transformuje się materiałem genetycznym, do którego
wprowadzono bakteryjny gen kodujący acetylotransferazę serynową, taki jak gen cysE lub jego zmutowane pochodne pochodzące z Escherichia coli, znajdujące się w obrębie roślinnej kasety ekspresyjnej, korzystnie o sekwencji:
znajdujący się w obrębie roślinnej kasety ekspresyjnej, po czym uzyskuje się materiał roślinny
w znany sposób.
PL 191 508 B1
7
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do transformacji roślin stosuje się plazmid,
w skład którego oprócz powyżej wspomnianego genu wchodzi dowolny znany promotor, o którym
wiadomo, że zapewnia inicjację transkrypcji w roślinach wybrany z grupy promotorów wyizolowanych
z roślin lub wirusów roślinnych, korzystnie promotor wirusa mozaiki kalafiora „CaMV 35S” oraz dowolny znany terminator transkrypcji, funkcjonujący w komórkach roślinnych, zapewniający odpowiednie
zakończenie tego transkryptu za wprowadzonym fragmentem bakteryjnego DNA.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się materiał genetyczny (plazmid) do
transformacji roślin uzupełniony markerem umożliwiającym pozytywną selekcję komórek roślinnych
posiadających wbudowane do genomu obce DNA warunkujące oporność roślin na dowolny marker
selekcyjny np. antybiotyk korzystnie wybrany z grupy obejmującej np. kanamycynę lub herbicyd korzystnie wybrany z grupy obejmującej np. fosfinotrycynę.
8
PL 191 508 B1
Departament Wydawnictw UP RP
Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.