Izolacja chlorofilu z wybranych kultur roœlinnych

Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej
Katedra Technologii Leków i Biochemii
Kultury tkankowe i komórkowe roślin i zwierząt
Izolacja chlorofilu z wybranych kultur roślinnych
Wiele waŜnych substancji występujących w przyrodzie to związki chelatowe. W chelatach centralnie
połoŜony jon metalu (najczęściej dwu- lub trójwartościowy kation) jest związany ze strukturą złoŜoną
z atomów węgla, wodoru, tlenu i azotu. Do tej grupy związków naleŜy m.in. chlorofil, zielony barwnik
występujący u organizmów zdolnych do przeprowadzenia procesu fotosyntezy, takich jak rośliny wyŜsze,
glony (algi) i sinice (cyjanobakterie).
Cząsteczka kaŜdego chlorofilu zbudowana jest z pięciopierścieniowej pochodnej porfiryny
posiadającej róŜne podstawniki, tzw. feoporfiryny (rys.1). Cztery z pierścieni to pierścienie pirolowe, a
piąty pierścień tworzą same atomy węgla. Wiązania pomiędzy atomami tworzącymi pierścienie to
następujące po sobie wiązania pojedyncze i podwójne składające się na układ wiązań sprzęŜonych.
Centralne miejsce w układzie porfiryny zajmuje jon magnezu łączący się z atomami azotu kaŜdego z
pierścieni. Obecność magnezu wpływa na zdolność agregacji cząsteczek chlorofilu, co ułatwia
przekazywanie energii wzbudzenia pomiędzy cząsteczkami. U większości chlorofili feoporfiryna łączy się
poprzez wiązanie estrowe z długołańcuchowym alkoholem o dwudziestu atomach węgla – fitolem. Ten
silnie hydrofobowy fragment cząsteczki mocuje chlorofil w błonach białkowo-lipidowych. Do układu
porfiryny w róŜnych miejscach przyłączone są dodatkowe grupy, które wpływają na niewielkie zmiany
zdolności absorpcji kwantów światła przez poszczególne rodzaje chlorofili.
CHLOROFIL A R = CH3
CHLOROFIL B R = CHO
Rysunek 1. Struktura cząsteczki chlorofilu a i b.
Istnieje kilka rodzajów chlorofili. Najbardziej rozpowszechnione w przyrodzie to chlorofil a (główny
fotoreceptor) i chlorofil b występujące u wszystkich organizmów fotosyntetyzujących. Chlorofil a róŜni
się od chlorofilu b tym, Ŝe zawiera grupę metylową zamiast formylowej w jednym z pierścieni
pirolowych. Chlorofil a absorbuje światło czerwone o długości fali około 680 nm i światło fioletowe o
długości
fali
440
nm
(P-680),
natomiast
chlorofil
b
najintensywniej
absorbuje
światło
pomarańczowoczerwone i światło niebieskie (P-700) (rys.2). Tak więc dwa rodzaje chlorofilu uzupełniają
się wzajemnie w pochłanianiu promieniowania słonecznego. Chlorofile c i d występują jedynie u części
glonów. U Prokariota zdolnych do przeprowadzania procesu fotosyntezy mogą występować: chlorofil a u
% Absorpcji
sinic oraz wiele rodzajów bakteriochlorofili oznaczanych literami od a do g.
Długość fali [nm]
Rysunek 2. Widma absorpcji chlorofili.
U roślin eukariotycznych chlorofil wchodzi w skład większych kompleksów barwnikowo-białkowych
występujących w chloroplastach. Typowa komórka roślinna zawiera od 50 do 200 chloroplastów o
owalnym kształcie i średnicy 5–7 µm. Chloroplasty występują przede wszystkim w miękiszu
asymilacyjnym liści oraz w łodydze. Chloroplast (rys.3) otoczony jest dwiema błonami białkowolipidowymi o róŜnej przepuszczalności. Błona zewnętrzna dobrze przepuszcza jony. Błona wewnętrzna,
zawierająca białka transportujące, jest natomiast słabo przepuszczalna i tworzy liczne woreczki, zwane
tylakoidami. W chloroplastach granalnych ułoŜone są one w płaskie stosy zwane tylakoidami gran. U
chloroplastów bezgranalnych natomiast występują jedynie lamelle rozciągnięte wzdłuŜ całego
chloroplastu (w komórkach pochew okołowiązkowych niektórych roślin przeprowadzających fotosyntezę
C4 i glonów eukariotycznych). Błona tylakoidu zawiera barwniki fotosyntetyczne (chlorofil a i b) oraz
barwniki pomocnicze (karoten i ksantofil). Chlorofil i barwniki pomocnicze ułoŜone są w sposób
uporządkowany, tworząc układy antenowe, nazywane fotosystemami. U Prokariota występuje tylko jeden
fotosystem — fotosystem II (prawdopodobnie powstał jako pierwszy, ale nazwany tak, poniewaŜ został
odkryty jako drugi). U Eukariota występuje fotosystem I i II. Fotosystem I (PS I) zawiera chlorofil a i
karoteny, fotosystem II (PS II) zawiera cholorofil a i b oraz ksantofile. Wnętrze chloroplastu wypełnia
białkowa substancja – stroma. W jej skład wchodzą m.in. niewielkie ilości kolistego DNA (zawiera
kompletny genom chloroplastu), enzymy biorące udział w fazie ciemnej fotosyntezy oraz rybosomy typu
prokariotycznego (tzw. rybosomy małe, o stałej sedymentacji 70S), które biorą udział w produkcji białek.
Rysunek 3. Schemat budowy chloroplastu.
W środowisku kwaśnym chlorofil traci atom magnezu (zostaje on zastąpiony przez dwa atomy
wodoru), w wyniku czego powstaje oliwkowo-brunatna feofityna, a następnie odczepiony zostaje łańcuch
fitolu i powstaje feoforbidyna. W środowisku zasadowym natomiast z chlorofilu powstaje szereg róŜnych
chlorofilin.
Chlorofil jest jednym z najwaŜniejszych barwników występujących w przyrodzie biorącym udział w
procesie fotosyntezy. Fotosyntezą (gr. photos – światło i synthesis – budowanie) nazywa się, zaleŜny od
energii dostarczanej w formie kwantów światła, proces tworzenia glukozy i tlenu cząsteczkowego z
prostych, nieorganicznych substratów, a mianowicie wody i dwutlenku węgla, przebiegający u roślin w
myśl równania:
6 CO2 + 6 H2O + energia świetlna → C6H12O6 + 6 O2↑
Aktywność fotosyntetyczna roślin polega na przetwarzaniu – poprzez wiele etapów, energii
promienistej światła słonecznego w energię wiązań chemicznych. Fotosynteza składa się z dwóch etapów:
fazy jasnej (świetlnej) i fazy ciemnej (tzw. cykl Calvina). Faza jasna przebiega w granach, faza ciemna w
stromie chloroplastu. W fazie jasnej powstaje ATP i NADPH – siła asymilacyjna (redukcyjna) niezbędna
do realizacji fazy ciemnej fotosyntezy, w której powstają cukier i tlen.
Na przebieg procesu fotosyntezy ma wpływ wiele czynników:
• ilość światła,
• prawidłowa budowa chloroplastów,
• odpowiednia ilość chlorofilu,
• stęŜenie CO2,
• obecność i aktywność enzymów,
• obecność wody i soli mineralnych,
• odpowiednia temperatura.
Inne cząsteczki, których część organiczna posiada strukturę analogiczną do porfiryny, odgrywające
waŜną rolę w biochemicznych procesach oksydacyjno-redukcyjnych to:
• hem – w układzie porfirynowym zawiera atom Ŝelaza (Fe2+), występuje m.in. w hemoglobinie,
mioglobinie oraz w cytochromach;
• witamina B12 – w centrum porfiryny posiada atom kobaltu (Co3+), pełni w organizmach Ŝywych rolę
regulatora produkcji erytrocytów.
Intensywny zielony kolor chlorofilu wykorzystywany jest jako pigment w przemyśle, np. chlorofil a
uŜywany jest do barwienia mydła, oliwy, wosków, tkanin i kosmetyków. Komercyjnie dostępne pigmenty
o strukturze chemicznej podobnej do chlorofilu wytwarzane są w szerokiej gamie barw, np. poprzez
zastąpienie atomu magnezu atomem miedzi uzyskuje się pigment o barwie jasno niebieskiej.
Cel ćwiczenia:
Celem ćwiczenia jest izolacja chlorofilu z wybranych kultur roślinnych, porównanie całkowitej
zawartości chlorofilu oraz zawartości chlorofilu a i b w badanych próbkach.
Materiały i sprzęt:
ŚwieŜe liście szpinaku, nać pietruszki, igły sosny (materiał roślinny moŜe ulec zmianie) oraz dowolnie
przyniesiona roślina na zajęcia, aceton, woda destylowana, gaza, lejek, folia aluminiowa, moździerz,
cylinder miarowy 50 ml, kolby Erlenmayera 100 ml, lód, pipeta automatyczna, spekol.
Wykonanie ćwiczenia:
1. OdwaŜyć 0,5 g igieł sosny, liści szpinaku i naci pietruszki.
2. KaŜdą z próbek homogenizować w 25 ml (schłodzonego do 0°C) acetonu poprzez ucieranie w
moździerzu.
3. Otrzymaną zawiesinę gruntownie rozmiaŜdŜonej tkanki przesączyć przez podwójną warstwę gazy do
kolby 100 ml owiniętej folią aluminiową.
4. Osad przemywać małymi porcjami acetonu, aŜ chlorofil zostanie dokładnie wyekstrahowany.
5. Zmierzyć ilość otrzymanego ekstraktu i wprowadzić do niego wodę destylowaną w ¼ objętości (w
celu otrzymania 80 % wodnego roztworu acetonu).
6. Absorbancję odczytać wobec 80 % wodnego roztworu acetonu (tło) przy długości fali: 645, 652 i 663
nm.
Zawartość chlorofilów (c) a, b oraz a + b wyliczyć z następujących wzorów:
ca
12,7 A663 – 2,7 A645
cb
22,9 A645 – 4,7 A663
ca + cb
20,2 A645 + 8,0 A663 = 27,8 A652
Otrzymane wyniki wyraŜają zawartość chlorofilów w [mg/1] roztworów. Porównać całkowitą
zawartość chlorofilu w badanych próbkach oraz zawartość chlorofilów a i b w poszczególnych próbkach.
Opracowanie wyników:
Sprawozdanie powinno zawierać następujące elementy:
1. Cel i opis wykonania ćwiczenia.
2. Obliczenia zawartości chlorofilów a, b oraz a + b dla stosowanych materiałów roślinnych.
3. Porównanie całkowitej zawartości chlorofilu oraz ilości chlorofilów a i b w poszczególnych
próbkach.
4. Wnioski dotyczące zawartości poszczególnych chlorofilów w badanych próbkach.
5. Ciekawostka dotycząca chlorofilu.
Literatura:
1) „Ćwiczenia z biochemii" L. Kłyszejko-Stefanowicz; Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1999.
2) „Podstawy biologii komórki. Wprowadzenie do biologii molekularnej." B. Alberts, D. Bray, A.
Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter; Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1999.