Kinga Kamieniarz, Anna Goździcka

advertisement
PRACE PRZEGL¥DOWE
Zastosowanie AAV jako wektorów
w terapii genowej
Kinga Kamieniarz, Anna GoŸdzicka-Józefiak
Zak³ad Wirusologii Molekularnej, Instytut Biologii Molekularnej
i Biotechnologii, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza, Poznañ
Adeno-associated virus vectors in gene therapy
Summary
The development of targeted vectors, capable of tissue-specific transduction,
remains one of the most important aims of vector modification for gene therapy
applications. The gaining popularity of recombinant vectors based on adeno-associated viruses (rAAV) in gene therapy can be attributed to their lack of pathogenicity, added safety due to their replication defectiveness, relatively low
immunogenicity and their ability to mediate long-term expression in a variety of
tissues. The major shortcoming of these vectors is their small packaging capacity. AAV vectors have already broad utility in the therapy of many diseases, including neurological disorders and various types of cancer. Moreover, they can
also serve as transfer vehicles for DNA vaccines.
Key words:
AAV, adeno-associated virus, dependovirus, gene therapy, vector.
Adres do korespondencji
Kinga Kamieniarz,
Zak³ad Wirusologii
Molekularnej,
Instytut Biologii
Molekularnej
i Biotechnologii,
Uniwersytet
im. Adama Mickiewicza,
ul. Miêdzychodzka 5,
60-371 Poznañ.
1 (68) 79–94 2005
1. Wstêp
Celem wspó³czesnej medycyny jest zrozumienie Ÿróde³ schorzenia i zwalczenie jego przyczyn, w przeciwieñstwie do tradycyjnego ³agodzenia objawów. Wielki postêp w biologii i genetyce molekularnej dokonany w minionych dwudziestu latach umo¿liwia izolacjê, klonowanie i sekwencjonowanie genów, jak równie¿ dok³adne poznanie genetycznych przyczyn chorób. Dziêki
temu pojawi³a siê mo¿liwoœæ zastosowania tzw. terapii genowej,
polegaj¹cej na naprawie lub zast¹pieniu wadliwie funkcjonuj¹cego genu. Jedn¹ z przeszkód w rozwoju terapii genowej stanowi
Kinga Kamieniarz, Anna GoŸdzicka-Józefiak
koniecznoœæ znalezienia odpowiedniego wektora skutecznie wprowadzaj¹cego
geny do komórek docelowych i nie powoduj¹cego skutków ubocznych. W wiêkszoœci przypadków wektorami staj¹ siê pochodne wirusów, które rozwinê³y wydajny
system przenoszenia swoich genów do komórek cz³owieka. Z takiego wektora usuwa siê geny warunkuj¹ce proces chorobotwórczy, natomiast wprowadza gen wraz
z sekwencjami promotorowymi i reguluj¹cymi jego ekspresjê. Niekiedy zrekombinowan¹ cz¹steczkê DNA „pakuje” siê tylko w p³aszcz wirusowy, co umo¿liwia jej
przenikniêcie do odpowiednich komórek cz³owieka. W ostatnich latach du¿ym zainteresowaniem jako potencjalne wektory do terapii genowej ciesz¹ siê wirusy zale¿ne od adenowirusów – AAV (ang. adeno-associated viruses).
2. Ogólna charakterystyka parwowirusów
Dependowirusy, zwane te¿ AAV nale¿¹ do rodziny Parvoviridae, podrodziny
Parvovirinae (tab.). Ich cykl replikacyjny jest zale¿ny od wirusa wspomagaj¹cego,
którym jest adenowirus lub wirus herpes.
Tabela
Systematyka parwowirusów (wg 1)
Rodzina
Parvoviridae
podrodzina
Parvovirinae (wystêpuje u krêgowców)
Densovirinae (wystêpuje u bezkrêgowców)
rodzaje
Parvovirus
Erythrovirus
Dependovirus
Densovirus
Iteravirus
Contravirus
Parwowirusy s¹ jednymi z najmniejszych znanych wirusów (³ac. parvus: ma³y). Ich
wirion nie posiada os³onki, ma symetriê ikosaedraln¹ i œrednicê od 18 do 26 nm.
Materia³em genetycznym wirusa jest jednoniciowy DNA o polarnoœci dodatniej lub
ujemnej, zbudowany z oko³o 4 tysi¹cy zasad. Autonomiczne parwowirusy replikuj¹
siê w j¹drze komórkowym, gdy komórka jest w fazie intensywnej syntezy (fazie S),
a AAV wymagaj¹ do swojego powielania wirusa pomocniczego.
Genomy wszystkich parwowirusów autonomicznych zawieraj¹ na koñcach 3’ i 5’
specyficzne sekwencje koñcowe. Odcinki te s¹ bogate w pary GC i maj¹ zdolnoœæ
tworzenia struktury spinki do w³osów. Struktura spinki do w³osów na koñcu 3’
przyjmuje kszta³t litery Y lub T i jest istotna w procesie replikacji DNA.
W odró¿nieniu od autonomicznych parwowirusów, genom AAV posiada 145 nukleotydowe koñcowe powtórzenia sekwencji o odwróconej polarnoœci. Pierwsze
125 zasad zaanga¿owane jest w tworzenie struktury w kszta³cie litery Y lub T prawie identycznej ze struktur¹ na koñcu 3’ DNA parwowirusów autonomicznych.
80
PRACE PRZEGL¥DOWE
Zastosowanie AAV jako wektorów w terapii genowej
Rys. 1. Schemat mapy genetycznej parwowirusów.
Oba typy wirusów maj¹ dwie du¿e otwarte ramki odczytu REP i CAP, których sekwencje nie nak³adaj¹ siê na siebie. Koduj¹ one odpowiednio bia³ka niestrukturalne
wirusa i bia³ka p³aszcza. Pierwsza z nich rozci¹ga siê w przybli¿eniu od 5 do 40 pozycji na mapie, podczas gdy druga od 50 do 90 pozycji (rys. 1).
Zarówno autonomiczne parwowirusy, jak i AAV syntetyzuj¹ trzy bia³ka strukturalne: VP1, VP2 i VP3 o masie cz¹steczkowej odpowiednio 87 000, 73 000 i 62 000.
Bia³ko VP3 stanowi oko³o 80% ca³kowitej masy wirionu. Wszystkie bia³ka p³aszcza
kodowane s¹ przez sekwencje nak³adaj¹ce siê, dlatego te¿ ich sk³ad aminokwasowy
jest podobny. Proteiny s¹ bogate w aminokwasy kwaœne, nie s¹ glikozylowane i bardzo s³abo rozpuszczaj¹ siê w roztworach wodnych.
3. Ogólna charakterystyka dependowirusów
Dependowirusy spoœród innych wirusów zwierzêcych wyró¿nia to, ¿e namna¿aj¹
siê wy³¹cznie w obecnoœci niespokrewnionego z nimi wirusa wspomagaj¹cego (pomocniczego, ang. helper virus), adeno- lub herpeswirusa. Podczas jego nieobecnoœci,
ssDNA AAV ulega przepisaniu do dsDNA, a nastêpnie integracji z DNA komórkowym
na chromosomie 19q,13.3q. W takiej formie genom wirusa pozostaje w komórce do
czasu gdy dojdzie do jej infekcji wirusem pomocniczym. Po zaka¿eniu komórki wirusem wspomagaj¹cym, DNA AAV jest uwalniany z genomu komórkowego i rozpoczyna swój cykl replikacyjny, w którym prawdopodobnie bior¹ udzia³ bia³ka wirusa
pomocniczego. Chocia¿ wykazano, ¿e potraktowanie kilku linii komórkowych zestawem czynników toksycznych umo¿liwi³o produktywn¹ infekcjê AAV pod nieobecnoœæ wirusa wspomagaj¹cego. Na podstawie tych danych przypuszcza siê, ¿e rola
wirusa pomocniczego mo¿e polegaæ nie na dostarczeniu okreœlonych czynników
bior¹cych bezpoœredni udzia³ w replikacji, ale na specyficznej modyfikacji œrodowiska komórkowego.
Inn¹ wa¿n¹ cech¹ AAV jest brak powi¹zania z jak¹kolwiek znan¹ chorob¹. Co
wiêcej, wydaje siê, ¿e infekcja AAV mo¿e byæ korzystna dla gospodarza (poprzez hamowanie onkogennego wp³ywu adeno- i herpeswirusów oraz ich zdolnoœci do
transformowania komórek) (1).
U ssaków naczelnych wyizolowano 6 typów AAV, z których 5 uznano za odrêbne
serotypy. AAV6, jak siê wydaje, jest produktem rekombinacji miêdzy AAV1 i AAV2.
W badaniach seroepidemiologicznych wykazano, ¿e serotypy 2, 3 i 5 s¹ endemiczne
dla cz³owieka, AAV4 infekuje g³ównie inne naczelne, natomiast pochodzenie AAV1
BIOTECHNOLOGIA 1 (68) 79-94 2005
81
Kinga Kamieniarz, Anna GoŸdzicka-Józefiak
(i zwi¹zanego z nim AAV6) nie jest jasne. Istniej¹ równie¿ doniesienia o wyizolowaniu dwóch nowych typów AAV (AAV7 i 8). Ka¿dy z serotypów AAV ma odmienne
w³aœciwoœci jeœli chodzi o zdolnoœæ do infekcji komórek okreœlonej tkanki, co ma
decyduj¹ce znaczenie w konstrukcji wektorów (2-4).
3.1. Genom dependowirusów
DNA AAV, podobnie jak autonomicznych parwowirusów, zawiera dwie du¿e
otwarte ramki odczytu- CAP i REP, koduj¹ce odpowiednio bia³ka strukturalne i niestrukturalne (patrz wy¿ej). Ze wzglêdu na wyj¹tkowo ma³y rozmiar ich genomu, produkty bia³kowe obu ORF pe³ni¹ kilka funkcji. Tak te¿ REP koduje co najmniej cztery
bia³ka, których sekwencje nak³adaj¹ siê, podczas gdy CAP co najmniej trzy. Bia³ka
Rep pe³ni¹ funkcje regulatorowe w ka¿dej fazie cyklu replikacyjnego AAV. Pod nieobecnoœæ wirusa wspomagaj¹cego, Rep 68/78 hamuje ekspresjê genów AAV i replikacjê DNA, zdaje siê te¿ odgrywaæ wa¿n¹ rolê w procesie integracji wirusowego genomu do genomu gospodarza i wytworzenia stanu utajenia. Z kolei w obecnoœci wirusa pomocniczego Rep 68/78 jest transaktywatorem ekspresji wirusowych genów,
potrzebny jest te¿ do replikacji DNA oraz uwolnienia wirusowego genomu z DNA
komórkowego.
Zarówno do replikacji, jak i transkrypcji wirusowego DNA niezbêdne s¹ koñcowe
powtórzenia sekwencji o odwróconej polarnoœci. Rejony te odgrywaj¹ tak¿e wa¿n¹
rolê podczas op³aszczania wirusowego DNA i integracji do genomu komórkowego.
Wówczas gdy nie dochodzi do koinfekcji wirusem pomocniczym i brak jest jego
czynników bia³kowych, ekspresji ulega jedynie gen REP. Jego produkty s¹ odpowiedzialne za hamowanie ekspresji genów z niektórych promotorów heterologicznych
oraz co najmniej jednego, jeœli nie wszystkich promotorów w³asnych.
Replikacja parwowirusowego DNA zachodzi w j¹drze komórkowym. W procesie
tym udzia³ bierze komórkowa polimeraza DNA-a lub d. Jako starter w replikacji
s³u¿y grupa OH na koñcu 3’ w strukturze spinki do w³osów wirusowego DNA. Nie
ma dowodów na obecnoœæ starterów typu RNA ani fragmentów Okazaki. Jedna z nici
powsta³ego dsDNA jest przecinana przez bia³ko Rep 68/78, nastêpuje denaturacja
nici DNA na koñcu 5’ i dalsza elongacja (rys. 2).
82
PRACE PRZEGL¥DOWE
Zastosowanie AAV jako wektorów w terapii genowej
Rys. 2. Model replikacji DNA AAV (wg 1);
1) ssDNA AAV, na koñcach odwrócone palindromiczne powtórzenia, 2) dwa sposoby parowania koñców umo¿liwiaj¹ce inicjacjê replikacji DNA AAV, 3) replikacja.
BIOTECHNOLOGIA 1 (68) 79-94 2005
83
Kinga Kamieniarz, Anna GoŸdzicka-Józefiak
3.2. Integracja AAV do genomu komórkowego
Pod nieobecnoœæ wirusa wspomagaj¹cego, AAV penetruje do j¹dra, gdzie jego
genom integrowany jest do komórkowego DNA- powoduj¹c stan infekcji utajonej.
Aktywacja nastêpuje po zaka¿eniu komórki wirusem pomocniczym. Wirusowe DNA
w genomach wiêkszoœci zainfekowanych komórek wystêpuje w postaci tandemowych powtórzeñ odpowiadaj¹cym kilku genomom. Do integracji AAV dochodzi
w wyniku rekombinacji niehomologicznej w okreœlonym miejscu na chromosomie
19q. W rejonie tym wystêpuje jednak od 4 do 5 zasad homologicznych. Integracji
towarzysz¹ zmiany i inwersje zarówno w sekwencji DNA wirusa jak i komórki, a mimo ¿e jest ona miejscowo specyficzna, w proces ten zaanga¿owanych jest kilkaset
zasad.
Miejsce preintergracji w chromosomie (zbudowane z kilku tysiêcy zasad) zawiera sekwencjê (GCTC)3 wi¹¿¹c¹ bia³ko Rep. Proteina ta prawdopodobnie bierze
udzia³ w ligacji wirusowego DNA z DNA komórkowym. Ta w³aœciwoœæ bia³ka Rep
oraz pe³nione przez nie funkcje nukleazy i helikazy mog¹ t³umaczyæ mechanizm
specyficznoœci miejsca integracji AAV. Poza tym bia³ko Rep bierze równie¿ udzia³
w inicjacji replikacji DNA wirusa.
Czynnikiem decyduj¹cym o miejscowo specyficznej integracji AAV, jak siê wydaje, jest rozpoznawany rejon, a w³aœciwa rekombinacja zachodzi w miejscu oddalonym od niego o kilkaset par zasad. Struktura chromatyny chromosomu 19q prawdopodobnie nie ma znaczenia dla specyfiki miejsca integracji.
Mechanizm, dziêki któremu genom AAV przechodzi z formy jednoniciowej wystêpuj¹cej w wirionie, w dwuniciowy tandemowy stan obserwowany w komórkowym DNA nie jest dobrze poznany.
Nie wiadomo, jakie s¹ konsekwencje utajonej infekcji dla gospodarza (1).
4. AAV jako wektory
4.1. Cechy wektora AAV
AAV ciesz¹ siê du¿ym zainteresowaniem jako potencjalne wektory w terapii genowej. O ich u¿ytecznoœci decyduje wiele cech.
Zdolnoœæ wektorów AAV do infekcji wielu typów komórek ró¿nych gatunków
zwierz¹t, skutecznej ich transdukcji oraz stabilnej ekspresji przenoszonych genów
umo¿liwia szerokie ich stosowanie. Wydajnoœæ ekspresji jest jednak zró¿nicowana
w zale¿noœci od komórki i tkanki oraz u¿ytego serotypu wirusa. Wektory te mog¹
infekowaæ zarówno komórki proliferuj¹ce jak i nieproliferuj¹ce, nawet postmitotyczne neurony. Szczególnie dobre wyniki uzyskuje siê w przypadku komórek miêœni, siatkówki, centralnego uk³adu nerwowego i p³uc.
84
PRACE PRZEGL¥DOWE
Zastosowanie AAV jako wektorów w terapii genowej
Rosn¹c¹ popularnoœæ AAV w terapii genowej mo¿na te¿ t³umaczyæ brakiem ich
patogennoœci oraz defektywnoœci¹ replikacji, co jest dodatkowym zabezpieczeniem
przed rozwojem zaka¿enia. Bezpieczeñstwo mo¿na jeszcze zwiêkszyæ, konstruuj¹c
rekombinowane wektory AAV, integruj¹ce w specyficznym miejscu na chromosomie
19, tak jak ma to miejsce u dzikich AAV. Kolejnymi zaletami wektorów AAV jest stosunkowo niska immunogennoœæ oraz to, ¿e mog¹ one nie zawieraæ ¿adnych wirusowych genów.
Ekspresja transgenu po transdukcji AAV zachodzi z pewnym opóŸnieniem, ale za
to jest d³ugotrwa³a, nawet 18-miesiêczna (porównywano do Ad, HSV-1, retrowirusa).
Wa¿n¹ w³aœciwoœci¹ jest te¿ mo¿liwoœæ ponownego podania tego samego serotypu
po pewnym czasie od pierwszej terapii genowej (w zale¿noœci od tkanki i transportowanego genu- od kilku tygodni do kilku miesiêcy), co ma szczególne znaczenie
w przypadku leczenia schorzeñ chronicznych. Limit wielkoœci obcego DNA, który
mo¿na wklonowaæ do wirionu AAV to oko³o 4 do 4,5 tysiêcy zasad (2,6-22).
4.2. Wirusowe elementy sekwencji niezbêdne do replikacji zmodyfikowanego
AAV zawieraj¹cego transgen
Elementami, które wp³ywaj¹ na poziom ekspresji transgenu wprowadzonego
przez wektor utworzony na bazie AAV s¹: koñcowe powtórzenia w genomie AAV
oraz wirusowe bia³ka Rep. Obecnoœæ koñcowych powtórzeñ znacznie zwiêksza skutecznoœæ ekspresji transgenu. Chocia¿ produkty genu Rep s¹ potrzebne do uprzywilejowanej integracji, insercja tego genu mo¿e zmniejszaæ poziom ekspresji transgenu, np. w komórkach glejaka, co powodowane jest przypuszczalnie ich cytotoksycznym dzia³aniem (17,19,20,23).
4.3. Modyfikacje wektora
Pocz¹tkowo skonstruowano dwa g³ówne typy wektorów. W pierwszym z nich
wyciêto gen kapsydu i zast¹piono go obcym DNA. Ten typ wektora zachowuje gen
Rep i mo¿e integrowaæ siê w specyficznym dla AAV miejscu na chromosomie 19q.
W drugim typie wektora do obu koñców obcego DNA dodaje siê typowe dla AAV
koñcowe powtórzenia o odwróconej polarnoœci. W niektórych przypadkach taki
wektor mo¿e integrowaæ do genomu gospodarza i transformowaæ z czêstoœci¹ powy¿ej 50%, ale znacz¹co zredukowana jest specyfika miejsca integracji. Obecnie stosuje siê wektory na bazie plazmidów, wektory powstaj¹ce przez w³¹czenie AAV do
wiêkszego wirusa oraz op³aszczanie in vitro. W ten sposób nie tylko mo¿na w³¹czyæ
gen Rep, ale równie¿ dostarczyæ do komórki wiêksze geny terapeutyczne (20).
W celu zwiêkszenia u¿ytecznoœci wektorów, próbuje siê tak¿e modyfikowaæ ich
tropizm do komórek. Stosuje siê do tego celu specyficzne przeciwcia³a, które zwiêkBIOTECHNOLOGIA 1 (68) 79-94 2005
85
Kinga Kamieniarz, Anna GoŸdzicka-Józefiak
szaj¹ zdolnoœæ wektora do wi¹zania siê z komórk¹ oraz neutralizuj¹ tropizm wirusa
dzikiego. Innym sposobem jest zmodyfikowanie wirusowego kapsydu tak, ¿eby zawiera³ ligandy, rozpoznawane przez wybrane receptory. Czêsto stosowan¹ metod¹
jest op³aszczenie genomu AAV jednego serotypu kapsydem nale¿¹cym do innego
serotypu. Przyk³adem jest AAV2, który daje niezwykle trwa³¹ ekspresjê transgenu,
ale poziom infekcji jest niski z powodu trudnoœci z penetracj¹ tego wirusa do komórki. Wektor z³o¿ony z genomu AAV2 w kapsydzie AAV5 (AAV2/5), dziêki zdolnoœci wnikania do komórki przez inne receptory, pozwala na skuteczn¹ transdukcjê komórek wielu tkanek (2,5,15,19,24,25).
Aby zwiêkszyæ pojemnoœæ wektora, do ekspresji genu próbuje siê wykorzystaæ
dwa niezale¿ne wektory AAV. Dotychczas skutecznoœæ tej metody by³a niewielka,
zale¿na od wyboru w³aœciwego serotypu AAV, a jej przydatnoœæ dla zastosowañ medycznych ograniczona. Jednak w miêœniach szkieletowych efektywnoœæ uzyskanej
w ten sposób ekspresji transgenu by³a podobna do ekspresji nienaruszonego transgenu dostarczanego przy u¿yciu wektorów AAV2 umieszczonych w kapsydach AAV5
(AAV2/5) (5).
W celu polepszenia wydajnoœci transdukcji, do wektorów AAV przenosz¹cych
okreœlony gen dodaje siê promotor innych wirusów, np. cytomegalowirusa (CMV),
RSV (rous sarcoma virus), SV40 (simian virus) lub elementy specyficznie zwiêkszaj¹ce
ekspresjê genu w danej tkance takie jak: CK61 i MCK2 w miêœniach, czy CC103
w p³ucach (10,15,26,27).
Genom wirusa AAV jest tak¿e wykorzystywany do tworzenia wektorów hybrydowych. Przyk³adem jest hybrydowy wektor AAV/Ad. Jego zalet¹ jest po³¹czenie w jednej cz¹stce cech wektorów adenowirusowych (Ad)- du¿ej pojemnoœci oraz skutecznego dostarczania genu niezale¿nie od cyklu komórkowego, z cennymi w³aœciwoœciami wektorów AAV- d³ugoterminow¹ ekspresj¹ transgenu oraz brakiem genów wirusowych. Wektory takie uzyskuje siê poprzez po³¹czenie elementów genomu odpowiedzialnych za mechanizm replikacji AAV z fragmentami DNA bior¹cymi udzia³
w enkapsydacji adenowirusów (28).
4.4. Wady wektora AAV
Niestety stosowanie wektorów AAV zwi¹zane jest z pewnymi trudnoœciami.
G³ównym ograniczeniem jest ich ma³a pojemnoœæ genetyczna (4-4,5 tysiêcy zasad) (5,7,20).
Skutecznoœæ transdukcji wektorów AAV ró¿ni siê znacz¹co w ró¿nych komórkach i tkankach in vitro i in vivo. Stwierdzono, ¿e bia³ko limfocytów T zdolne do
wi¹zania leku immunosupresyjnego FK506 (bia³ko FKBP52), oddzia³uje na jednoniciow¹ sekwencjê koñcowych powtórzeñ DNA AAV, powoduj¹c zahamowanie syntezy drugiej nici wirusowego DNA- i w konsekwencji ograniczenie ekspresji transgenu. Fosforylacja tyrozyny komórkowego bia³ka FKBP52 silnie wp³ywa na wydajnoœæ
86
PRACE PRZEGL¥DOWE
Zastosowanie AAV jako wektorów w terapii genowej
transdukcji AAV, co mo¿e mieæ du¿y wp³yw na optymalne zastosowanie wektorów
AAV w terapii genowej cz³owieka (29).
Niski poziom transdukcji obserwowany w komórkach niektórych typów nowotworów tak¿e ogranicza zastosowanie wektorów AAV w leczeniu (31).
Poza tym transfer genu za poœrednictwem AAV wywo³uje niekiedy odpowiedŸ
immunologiczn¹ przeciw produktowi transgenu, czego skutkiem jest obni¿enie poziomu jego ekspresji, który zaobserwowano np. w miêœniach szkieletowych (26).
5. Zastosowanie wektorów AAV w terapii genowej
Pomimo kilku wymienionych wad AAV, podejmowane s¹ liczne próby ich zastosowania jako wektorów w terapii genowej.
Wiele uwagi poœwiêca siê mo¿liwoœci wykorzystania terapii genowej do leczenia
dystrofii miêœni typu Duchenne’a (DMD). Jest to najczêœciej wystêpuj¹ca œmiertelna
choroba genetyczna cz³owieka sprzê¿ona z chromosomem X. DMD dotyka jednego
na 3500 mê¿czyzn i w 1/3 przypadków jest nastêpstwem nowych, spontanicznych
mutacji. Dotychczas nie opracowano sposobu leczenia DMD. U chorych obserwuje
siê postêpuj¹ce zwyrodnienie miêœni prowadz¹ce do œmierci z powodu niewydolnoœci oddechowej lub sercowej, oko³o 20. roku ¿ycia. Za chorobê odpowiedzialne s¹
mutacje w genie DMD, koduj¹cym dystrofinê. S¹ to delecje, czêsto obejmuj¹ce du¿e
fragmenty genomu, duplikacje oraz mutacje punktowe. Prowadz¹ one do zmiany
w strukturze dystrofiny i w rezultacie zaburzeñ w jej funkcjonowaniu w miêœniu poprzecznie pr¹¿kowanym. To powoduje niestabilnoœæ sarkolemmy, co z kolei prowadzi do trwa³ego uszkodzenia miêœnia po skurczu. W przeprowadzonych badaniach
wykazano, ¿e domiêœniowe dostarczenie (za pomoc¹ wektorów AAV) prawid³owej
kopii genu dystrofiny lub cDNA tego genu stabilizuje sarkolemmê, i to na d³ugi
okres (nawet ponad roku). W miêœniu po wprowadzeniu wektora zauwa¿ono jednak
odpowiedŸ immunologiczn¹, w któr¹ zaanga¿owane by³y komórki prezentuj¹ce antygeny, takie jak mioblasty czy regeneruj¹ce siê, niedojrza³e w³ókna miêœniowe
(26,27,32,33).
Wektory AAV s¹ tak¿e powa¿nymi kandydatami do poœredniczenia w terapii wielu chorób neurologicznych. Oprócz wymienionych cech (patrz 4.1) przemawia za
nimi zdolnoœæ do infekowania nie dziel¹cych siê (postmitotycznych) neuronów.
Pierwszym klinicznym zastosowaniem AAV do transferu genu do komórek mózgu
ludzkiego by³a terapia choroby Canavana, zwi¹zanej z nieprawid³owoœciami w procesie mielinizacji mózgu. Genem terapeutycznym by³ gen acylazy asparaginianowej
(ASPA), podawany drog¹ neurochirurgiczn¹. Dostêpny jest protokó³ kliniczny leczenia z udzia³em 21 pacjentów, natomiast nie opublikowano dotychczas wyników terapii (11,12,22,34-36).
Opracowywanych jest te¿ kilka metod leczenia choroby Parkinsona z u¿yciem
AAV. Jedn¹ z nich jest miejscowa produkcja dopaminy w ciele pr¹¿kowanym uzyskaBIOTECHNOLOGIA 1 (68) 79-94 2005
87
Kinga Kamieniarz, Anna GoŸdzicka-Józefiak
na przez indukcjê ekspresji enzymów syntetyzuj¹cych dopaminê. W tym celu chorym podaje siê osobne wektory AAV koduj¹ce 3 enzymy niezbêdne do syntezy dopaminy. Wyniki doœwiadczeñ prowadzonych na zwierzêtach s¹ obiecuj¹ce. Inna metoda ma na celu spowolnienie zwyrodnienia neuronów wydzielaj¹cych dopaminê poprzez ekspresjê czynników neurotroficznych lub mózgowego, pêcherzykowego
transportera monoamin w ciele pr¹¿kowanym lub istocie czarnej mózgu (37).
W przypadku wielu chorób neurologicznych obserwuje siê niekontrolowan¹, patologiczn¹ apoptozê. Proces ten mo¿na powstrzymaæ dostarczaj¹c geny koduj¹ce
czynniki antyapoptotyczne bezpoœrednio do centralnego uk³adu nerwowego, równie¿ z wykorzystaniem AAV. Tego typu terapia mog³aby byæ u¿yteczna w schorzeniach zwyrodnieniowych uk³adu nerwowego, np. we wspomnianej chorobie Parkinsona (11).
W fazie prób klinicznych jest terapia genowa hemofilii B, w której choremu podaje siê domiêœniowo wektor AAV z genem koduj¹cym czynnik IX. Mo¿liwe jest, jak
siê wydaje, bezpieczne stosowanie nawet du¿ych dawek wektora. Innym testowanym sposobem dostarczenia czynnika IX jest wewn¹trznosowe podanie wektora
AAV2/5 wyposa¿onego w promotor specyficzny dla genów ulegaj¹cych ekspresji
w komórkach p³uc- CC10. Zalet¹ tej metody jest jej nieinwazyjnoœæ, d³ugotrwa³e wydzielanie terapeutycznego bia³ka oraz mo¿liwoœæ ponownego zastosowania tego
samego serotypu AAV w piêæ miesiêcy po pierwszym podaniu (15,38,39).
Zrekombinowane wektory na bazie AAV s¹ tak¿e zdolne do skutecznej transdukcji komórek siatkówki, dlatego podejmowane s¹ próby zastosowania ich w leczeniu
retinopatii. Tak na przyk³ad dostarczenie przez AAV genu koduj¹cego czynnik neurotroficzny uzyskany z komórek glejowych (GDNF) do siatkówki mo¿e chroniæ fotoreceptory przed ich degeneracj¹. W terapii siatkówki wa¿na jest kontrola poziomu
terapeutycznego bia³ka, zarówno jeœli chodzi o czas jak i miejsce jego ekspresji.
W badaniach z wykorzystaniem erytropoetyny jako markera sugeruje siê, ¿e mo¿liwa jest farmakologiczna kontrola ekspresji transgenu w oku za pomoc¹ rapamycyny
(5,30,40).
Terapia genowa mo¿e w przysz³oœci równie¿ znaleŸæ zastosowanie w leczeniu
dystrofii rogówki. W pierwszym doniesieniu demonstruj¹cym selektywny transfer
genów do komórek rogówki królika wprowadzono wektory na bazie AAV oraz wektory plazmidowe op³aszczone lipidami, przenosz¹ce geny beta-galaktozydazy i acetylotransferazy chloramfenikolowej. Oba wektory doprowadzi³y do ekspresji genu,
przy czym ekspresja w nastêpstwie transdukcji przez AAV by³a opóŸniona o kilka
dni, ale za to jej poziom by³ wy¿szy i ekspresja trwa³a d³u¿ej (6).
Innym wa¿nym problemem klinicznym jest krytyczne niedokrwienie koñczyn,
które czêsto skutkuje ich niepe³nosprawnoœci¹, a nawet ich utrat¹. Wykazano, ¿e
dostarczenie zrekombinowanego bia³ka czynnika wzrostu œródb³onka naczyniowego (VEGF), lub jego genu, pobudza arteriogenezê i kapilarn¹ angiogenezê u zwierz¹t dotkniêtych tym schorzeniem. Do tego celu równie¿ zastosowano wektory
AAV, które skutecznie transdukuj¹ miêœnie szkieletowe i umo¿liwiaj¹ d³ugotrwa³¹
88
PRACE PRZEGL¥DOWE
Zastosowanie AAV jako wektorów w terapii genowej
ekspresjê transgenu. Wewn¹trztêtniczy transfer AAV-VEGF(165) normalizuje niedobór tlenu w miêœniach i prowadzi do arteriogenezy u szczurów z powa¿nym niedotlenieniem koñczyn tylnych (41).
Prawdopodobnie terapia genowa bêdzie mia³a ogromne znaczenie w leczeniu
chorób sercowo-naczyniowych. W badaniach nad skutecznoœci¹ wektorów AAV
w przenoszeniu genu lacZ do serca wykazano, ¿e transfer genu zale¿ny jest od dawki wektorów AAV-lacZ. Stwierdzono te¿, ¿e ekspresja genu nie zmniejszy³a siê nawet po up³ywie szeœædziesiêciu dni, na co pozytywny wp³yw mia³ brak odpowiedzi
immunologicznej. Mo¿na wnioskowaæ, ¿e wektory AAV daj¹ mo¿liwoœæ skutecznego i jednostajnego transferu genów do miêœnia sercowego w modelu recyrkulacji
wieñcowej (8,42).
Terapiê genow¹ z zastosowaniem wektorów AAV próbuje siê zastosowaæ równie¿ w leczeniu tak ró¿norodnych chorób jak: jaskry (10), cukrzycy (przez wprowadzenie genu koduj¹cego insulinê) (43), choroby Fabry’ego (44), udaru mózgu (45),
chorób neuronów ruchowych np. ALS (18), przewlek³ej bia³aczki limfocytarnej (46),
mukowiscydozy (ma³o skuteczne) (47), g³uchoty (48), reumatoidalnego zapalenia
stawów (49) czy chorób miêœni (21,50).
Transfer genów za poœrednictwem AAV mo¿e byæ tak¿e wykorzystany w celu
zniesienia chronicznego bólu po uszkodzeniach uk³adu nerwowego (51) oraz do korekcji uszkodzeñ w podjednostce E1alfa kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej (52).
5.1. Wektory AAV w leczeniu nowotworów
Osobnym zagadnieniem jest wykorzystanie AAV jako wektorów w leczeniu nowotworów. Zahamowanie angiogenezy nowotworowej uzyskuje siê wprowadzaj¹c
do komórek œródb³onka lub guza nowotworowego, np. gen endostatyny, której produkt zwiêksza skutecznoœæ radioterapii oraz hamuje proliferacjê i migracjê komórek œródb³onka (53,54).
Wektory AAV stosowane s¹ nie tylko do wprowadzania genów terapeutycznych,
ale równie¿ genów zabójców. W tym przypadku do komórek nowotworowych dostarcza siê wektor AAV z wklonowanym genem kinazy tymidynowej wirusa opryszczki (HSV-tk), eksponuj¹c je równoczeœnie na dzia³anie leków: acyklowiru lub gancyklowiru (GCV). Transfer genów za pomoc¹ AAV jest specyficzny. Poniewa¿ u¿ywane
leki aktywowane s¹ poprzez produkt genu HSV-tk, zniszczeniu ulegaj¹ te komórki,
które zainfekowane zosta³y przez AAV. Metoda ta okaza³a siê szczególnie skuteczna
w przypadku komórek miêsaka HS-1 i HT1080, co jest wa¿ne ze wzglêdu na to, ¿e
komórki te s¹ ma³o podatne na chemioterapiê. Wektor AAV-2 bardzo wydajnie
transdukowa³ komórki HS-1 i HT1080 (ponad 90%). Wszystkie transdukowane komórki zginê³y ju¿ przy zastosowaniu takich dawek leku, przy których normalnie
prze¿ywa³o ponad 90% komórek.
BIOTECHNOLOGIA 1 (68) 79-94 2005
89
Kinga Kamieniarz, Anna GoŸdzicka-Józefiak
W innym przypadku po³¹czono dzia³anie HSV-tk wprowadzonej przez wektor
AAV (AAVtk), gancyklowiru oraz promieniowania gamma. Sposób ten okaza³ siê skuteczny w niszczeniu komórek raka krtani i HeLa. Zalet¹ kombinacji AAVtk/GCV z radioterapi¹ jest nie tylko du¿a skutecznoœæ, ale te¿ zmniejszenie toksycznoœci obu
czynników (31,55,56).
5.2. Wykorzystanie AAV w terapiach immunologicznych
Wirusy AAV mog¹ tak¿e s³u¿yæ do przenoszenia genów koduj¹cych cz¹steczki liganda CD40 (CD40L) do limfocytów. Limfocyty B pozbawione tej cz¹steczki nie s¹
zdolne do skutecznej aktywacji limfocytów T, co jest przyczyn¹ chronicznej bia³aczki limfocytarnej (CLL). Defekt ten mo¿na czêœciowo korygowaæ w³aœnie przez genetyczny transfer CD40L do limfocytów B. Próbowano zastosowaæ do tego celu adenowirusy, ale niezbêdna do ich transdukcji okaza³a siê wysoka koncentracja cz¹stek
wirusowych na komórkê (wielokrotnoœæ infekcji do 2000) ze wzglêdu na brak receptora umo¿liwiaj¹cego wi¹zanie adenowirusów do limfocytów B. Ponadto mo¿liwe
jest, ¿e adenowirusowe struktury w³ókniste powoduj¹ niespecyficzn¹ stymulacjê
immunologiczn¹. Dziêki swoim unikatowym w³aœciwoœciom, równie¿ w tym przypadku AAV sta³y siê obiektem zainteresowania jako potencjalne wektory. Do niedawna transdukcja wadliwych limfocytów B (B-CLL) za ich pomoc¹ by³a ma³o efektywna, ze wzglêdu na niski poziom ekspresji transgenu. Ostatnie ulepszenia, m.in.
wprowadzenie plazmidu koduj¹cego produkty genów adenowirusowych (jako wirusa pomocniczego) umo¿liwi³y stworzenie skutecznych i wolnych od samych adenowirusów wektorów rAAV. W przeprowadzonych badaniach w aktywacji limfocytów
T poœredniczy³y g³ównie limfocyty B-CLL aktywowane poprzez inkubacjê z komórkami transdukowanymi. Przypomina to sytuacjê szczepienia in vivo, gdzie liczba nie
zainfekowanych komórek B-CLL znacznie przewy¿sza³aby liczbê komórek transdukowanych. Zastosowanie tego bezpiecznego systemu wektorowego, jak siê wydaje,
nast¹pi ju¿ w bliskiej przysz³oœci (57).
Receptory NMDA4 odgrywaj¹ w mózgu wa¿n¹ rolê, wp³ywaj¹c na jego plastycznoœæ i rozwój, a jednoczeœnie poœrednicz¹ w uszkodzeniach neuronowych zwi¹zanych z licznymi schorzeniami neurologicznymi, jak udarem, epilepsj¹, demencj¹
i chorobami neurodegeneratywnymi. Liczne próby maj¹ce na celu wprowadzenie
farmakologicznych antagonistów receptora NMDA nie da³y oczekiwanych rezultatów, poniewa¿ ich skutecznoœæ by³a niewielka, ponadto mia³y szkodliwe dzia³ania
uboczne. Receptory NMDA sk³adaj¹ siê z trzech rodzajów podjednostek (NR1, NR2
i NR3A), tworz¹cych heterooligomeryczne kompleksy. Podjednostki NR1 s¹ niezbêdne dla funkcji receptorów NMDA, podczas gdy pozosta³e podjednostki modyfikuj¹
w³aœciwoœci receptora. Alternatywnym podejœciem do zantagonizowania receptorów NMDA mo¿e byæ wywo³anie humoralnej odpowiedzi autoimmunologicznej
przeciwko podjednostce NR1 tego receptora. Takie przeciwcia³a w normalnych wa90
PRACE PRZEGL¥DOWE
Zastosowanie AAV jako wektorów w terapii genowej
runkach nie powinny penetrowaæ do centralnego uk³adu nerwowego, nie mia³yby
zatem toksycznego dzia³ania, natomiast w nastêpstwie urazu mózgu mog³yby skuteczniej dostawaæ siê do mózgu, zantagonizowaæ receptor NMDA i os³abiæ uszkodzenia powsta³e za poœrednictwem tego receptora. Równie¿ w tym przypadku optymalnymi wektorami s¹, jak siê wydaje, AAV (58).
Wektory na bazie AAV próbuje siê tak¿e wykorzystaæ przy produkcji szczepionek (59). Genetyczna immunizacja polega na dostarczeniu genu koduj¹cego odpowiedni antygen do docelowych komórek gospodarza, w celu wywo³ania humoralnej
b¹dŸ komórkowej odpowiedzi immunologicznej.
Rak szyjki macicy jest jedn¹ z najbardziej rozpowszechnionych chorób na œwiecie, co roku diagnozowanych jest pó³ miliona nowych przypadków. Dominuj¹cym
czynnikiem etiologicznym dla tego typu nowotworu jest ludzki papillomawirus typu
16 (HPV-16), przenosz¹cy trzy transformuj¹ce onkogeny- E5, E6 i E7. Ich produkty s¹
zatem unikatowymi antygenami nowotworowymi i mog¹ byæ u¿ywane jako szczepionki. Opracowywane s¹ ró¿ne strategie szczepienia, przy u¿yciu wektorów wirusowych (wirusy vaccinia i ¿ó³taczki typu B) oraz niewirusowych. Wektory AAV ³¹cz¹
w sobie najlepsze cechy obu grup. Jedynym wirusowym DNA, które musi byæ zawarte w takim wektorze s¹ 145-zasadowe koñcowe powtórzenia. Dziêki temu jedynym
genem przenoszonym przez wektor AAV i ulegaj¹cym ekspresji jest wklonowany antygen. Co wiêcej, u¿ycie tego wektora nie jest zwi¹zane z siln¹ komórkow¹ odpowiedzi¹ immunologiczn¹ przeciwko transdukowanym komórkom, co pozwala na
d³ugotrwa³¹ ekspresjê przeniesionego genu (60).
Ju¿ od wielu lat liczne grupy naukowców prowadz¹ badania maj¹ce na celu opracowanie szczepionki przeciwko HIV. Próbuje siê to osi¹gn¹æ na wiele sposobów,
równie¿ z udzia³em AAV. Tworzone s¹ wektory rAAV przenosz¹ce gen env wirusa
HIV, zawieraj¹ce geny Rep i Cap oraz koñcowe powtórzenia AAV. Dodatkowo, zamiast wirusa pomocniczego dodawane s¹ geny E2A, E4 oraz VA adenowirusa. W badaniach przeprowadzonych na myszach, wektory te znacznie wzmocni³y humoraln¹
odpowiedŸ immunologiczn¹ (61,62). Inn¹ szczepionk¹ jest plazmid koduj¹cy gen
env opatrzony promotorem CMV. W³¹czenie koñcowych powtórzeñ o odwróconej
polarnoœci pochodz¹cych z DNA AAV do rejonu regulatorowego tego plazmidu
zwiêksza ekspresjê transgenu i immunogennoœæ szczepionki (63).
Kolejne mo¿liwoœci otworz¹ siê w chwili, kiedy wektory AAV zostan¹ zastosowane do genetycznej modyfikacji komórek dendrycznych. Komórki te pe³ni¹ podstawow¹ rolê w odpowiedzi immunologicznej, jako komórki prezentuj¹ce antygeny.
Dostarczenie genów koduj¹cych antygeny do komórek dendrycznych skutkuje d³ugotrwa³¹ ekspresj¹ antygenu oraz pozwala na modulacjê receptorów komórkowych
i wydzielanie cytokin przez te komórki. Co wa¿ne, transdukcja komórek dendrycznych za pomoc¹ zrekombinowanych AAV w warunkach in vitro nie wp³ywa na ¿ywotnoœæ, fenotyp ani funkcje immunologiczne tych komórek. Metoda ta mo¿e przyczyniæ siê do z³agodzenia szerokiego wachlarza stanów chorobowych: nowotworów,
zapaleñ, autoimmunizacji i alergii (64-68).
BIOTECHNOLOGIA 1 (68) 79-94 2005
91
Kinga Kamieniarz, Anna GoŸdzicka-Józefiak
Lista schorzeñ, w leczeniu lub zapobieganiu którym próbuje siê zastosowaæ
wektory na bazie AAV, jak widaæ jest d³uga. Rezultaty wielu badañ s¹ obiecuj¹ce,
niektóre s¹ ju¿ w fazie klinicznej. Wszystko wskazuje zatem na to, ¿e terapia genowa z zastosowaniem wektorów AAV bêdzie odgrywaæ znaczn¹ rolê w medycynie ju¿
w niedalekiej przysz³oœci.
6. Uwagi koñcowe
Wirusy typu DNA, tj. adenowirusy, wirusy herpes czy AAV s¹ szeroko stosowane
w biotechnologii jako wektory do wprowadzania obcych genów do komórek ludzkich. Decyduje o tym ich specyficzny tropizm do komórek okreœlonych typów, jak
równie¿ mo¿liwoœæ zast¹pienia genów wirusowych genem terapeutycznym. Wirusy
te wywo³uj¹ jednak niekiedy niepo¿¹dane skutki uboczne, np. wykazuj¹ w³aœciwoœci immunogenne i s¹ toksyczne dla organizmu. Dlatego do transferu obcych genów
próbuje siê tak¿e zastosowaæ liposomy. S¹ to sztucznie otrzymywane mikroskopijne pêcherzyki lipidowe, które mo¿na wype³niaæ substancjami, które chcielibyœmy
wprowadziæ do komórki. Efekt specyficznego ich kierowania do komórek docelowych mo¿na osi¹gn¹æ w wyniku modyfikacji ich parametrów fizycznych, tj. wielkoœci, wra¿liwoœci na pH, temperaturê lub po wprowadzeniu na ich powierzchniê cz¹steczek, które reaguj¹ specyficznie z komórk¹ docelow¹, podobnie jak wirusy. B³ony
liposomów mo¿na tak modyfikowaæ, ¿e nie bêd¹ mia³y w³aœciwoœci immunogennych
i nie bêd¹ toksyczne dla organizmu, a równoczeœnie, podobnie jak wirusy, bêd¹ wykazywaæ specyficzny tropizm do okreœlonych komórek.
Skróty:
1) CK6 – promotor cytokeratyny, specyficzny dla miêœni
2) MCK – promotor miêœniowej kinazy kreatyninowej, specyficzny dla miêœni
3) CC10 – promotor specyficzny dla p³uc (pochodzi z genu bia³ka clara cell 10 kDa)
4) NMDA – kana³ wapniowy, receptor kwasu glutaminowego (mo¿na go naœladowaæ N-metylo-D-asparaginianem, st¹d nazwa)
Literatura:
1.
2.
3.
4.
5.
92
Berns K. I., (1996), Fields Virology, Eds. Fields B. N., Knipe D. M., Howley P. M. i in., (1996),
2173-2197, Lippincott - Raven Publishers, Philadelphia.
Gao G. P., Alvira M. R., Wang L., Calcedo R., Johnston J., Wilson J. M., (2002), Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 99, 11854-11859.
Bantel-Schaal U., Delius H., Schmidt R., zur Hausen H., (1999), J. Virol., 73, 939-947.
Xiao W., Chirmule N., Berta S. C., McCullough B., Gao G., Wilson, J. M., (1999) J. Virol., 73,
3994-4003.
Reich S. J., Auricchio A., Hildinger M., Glover E., Maguire A. M., Wilson J. M., Bennett J., (2003),
Hum Gene Ther., 14, 37-44.
PRACE PRZEGL¥DOWE
Zastosowanie AAV jako wektorów w terapii genowej
6. Mohan R. R., Schultz G. S., Hong J. W., Mohan R. R., Wilson S. E., (2003), Exp. Eye Res., 76, 373-383.
7. Lai C. M., Lai Y. K., Rakoczy P. E.., (2002), DNA Cell Biol., 21, 895-913.
8. Asfour B., Baba H. A., Scheld H. H., Hruban R. H., Hammel D., Byrne B. J., (2002), Thorac. Cardiovasc. Surg., 50, 347-350.
9. Ponnazhagan S., Mahendra G., Kumar S., Thompson J. A., Castillas M. Jr, (2002), J. Virol., 76(24), 12900-12907.
10. Martin K. R., Klein R. L., Quigley H. A., (2002), Methods, 28(2), 267-275.
11. Mochizuki H., Miura M., Shimada T., Mizuno Y., (2002) Methods, 28(2), 248-252.
12. Okada T., Nomoto T., Shimazaki K., Lijun W., Lu Y., Matsushita T., Mizukami H., Urabe M., Hanazono Y., Kume A., Muramatsu S., Nakano I., Ozawa K., (2002), Methods, 28(2), 237-247.
13. Pruchnic R., Yokoyama T., Lee J. Y., Huard J., Chancellor M. B., (2002), Urol. Res., 30(5), 310-316.
14. Pajusola K., Gruchala M., Joch H., Luscher T. F., Yla-Herttuala S., Bueler H., (2002), J. Virol., 76(22),
11530-11540.
15. Auricchio A., O’Connor E., Weiner D., Gao G. P., Hildinger M., Wang L., Calcedo R., Wilson J. M.,
(2002), J. Clin. Invest., 110(4), 499-504.
16. Monahan P. E., Samulski R. J., (2000), Mol. Med. Today, 6, 433-440.
17. Hickman A. B., Ronning D. R., Kotin R. M., Dyda F., (2002), Mol. Cell, 10(2), 327-337.
18. Wang L. J., Lu Y. Y., Muramatsu S., Ikeguchi K., Fujimoto K., Okada T., Mizukami H., Matsushita T.,
Hanazono Y., Kume A., Nagatsu T., Ozawa K., Nakano I., (2002), J. Neurosci., 22(16), 6920-6928.
19. Smith R. H., Afione S. A., Kotin R. M., (2002), Biotechniques, 33(1), 204-206, 208, 210-211.
20. Owens R. A., (2002) Curr. Gene Ther., 2(2), 145-159.
21. Sanlioglu S., Monick M. M., Luleci G., Hunninghake G. W., Engelhardt J. F., (2001), Curr. Gene Ther.,
1(2), 137-147.
22. Mastakov M. Y., Baer K., Symes C. W., Leichtlein C. B., Kotin R. M., During M. J., (2001), J. Virol.,
76(16), 8446-8454.
23. Lam P., Hui K. M., Wang Y., Allen P. D., Louis D. N., Yuan C. J., Breakefield X. O., (2002), Hum. Gene
Ther., 13(18), 2147-2159.
24. Nicklin S. A., Baker A. H., (2002), Curr Gene Ther, 2(3), 273-293.
25. Halbert C. L., Rutledge E. A., Allen J. M., Russell D. W., Miller A. D., (2000), J. Virol., 74, 1524-1532.
26. Yuasa K., Sakamoto M., Miyagoe-Suzuki Y., Tanouchi A., Yamamoto H., Li J., Chamberlain J. S., Xiao X.,
Takeda S., (2002), Gene Ther., 9(23), 1576-1588.
27. Yue Y., Dongsheng D., (2002), Biotechniques, 33, 672-678.
28. Goncalves M. A., van der Velde I., Janssen J. M., Maassen B. T., Heemskerk E. H., Opstelten D. J.,
Knaan-Shanzer S., Valerio D., de Vries A. A., (2002), J. Virol., 76, 10734-10744.
29. Qing K., Li W., Zhong L., Tan M., Hansen J., Weigel-Kelley K. A., Chen L., Yoder M. C., Srivastava A.,
(2003), J. Virol., 77, 2741-2746.
30. Auricchio A., Rivera V. M., Clackson T., O’Connor E. E., Maguire A. M., Tolentino M. J., Bennett J.,
Wilson J. M., (2002), Mol. Ther., 6, 238-242.
31. Kanazawa T., Mizukami H., Okada T., Hanazono Y., Kume A., Nishino H., Takeuchi K., Kitamura K.,
Ichimura K., Ozawa K., (2003), Gene Ther., 10, 51-58.
32. Watchko J., O’Day T., Wang B., Zhou L., Tang Y., Li J., Xiao X., (2002), Hum. Gene Ther., 13,
1451-1460.
33. Takeda S., (2001), Rinsho Shinkeigaku, 41, 1154-1156.
34. Haberman R. P., McCown T. J., (2002), Methods, 28, 219-226.
35. Janson C., McPhee S., Bilaniuk L., Haselgrove J., Testaiuti M., Freese A., Wang D. J., Shera D., Hurh
P., Rupin J., Saslow E., Goldfarb O., Goldberg M., Larijani G., Sharrar W., Liouterman L., Camp A.,
Kolodny E., Samulski J., Leone P., (2002), Hum. Gene Ther., 13, 1391-1412.
36. Haskell R. E., Hughes S. M., Chiorini J.A., Alisky J. M., Davidson B. L., (2003), Gene Ther., 10, 34-42.
37. Muramatsu S., (2001), Rinsho Shinkeigaku, 41, 1157-1159.
38. Herzog R. W., Hagstrom J. N., (2001), Am. J. Pharmacogenomics, 1(2), 137-144.
39. Herzog R. W., Fields P. A., Arruda V. R., Brubaker J. O., Armstrong E., McClintock D., Bellinger D. A.,
Couto L. B., Nichols T. C., High K. A., (2002), Hum. Gene Ther., 13, 1281-1291.
BIOTECHNOLOGIA 1 (68) 79-94 2005
93
Kinga Kamieniarz, Anna GoŸdzicka-Józefiak
40. Wu W. C., Lai C. C., Chen S. L., Xiao X., Chen T. L., Tsai R. J., Kuo S. W., Tsao Y. P., (2002), Invest.
Ophthalmol. Vis. Sci., 43, 3480-3488.
41. Chang D. S., Su H., Tang G. L., Brevetti L. S., Sarkar R., Wang R., Kan Y. W., Messina L. M., (2003),
Mol. Ther., 7, 44-51.
42. Yasukawa H., Yajima T., Duplain H., Iwatate M., Kido M., Hoshijima M., Weitzman M. D., Nakamura T., Woodard S., Xiong D., Yoshimura A., Chien K. R., Knowlton K. U., (2003), J. Clin. Invest., 111,
469-478.
43. Jindal R. M., Karanam M., Shah R., (2001), Int. J. Exp. Diabetes Res., 2, 129-138.
44. Takahashi H., Hirai Y., Migita M., Seino Y., Fukuda Y., Sakuraba H., Kase R., Kobayashi T., Hashimoto Y., Shimada T., (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 13777-13782.
45. Tsai T. H., Chen S. L., Xiao X., Liu D. W., Tsao Y. P., (2002), Methods, 28, 253-258.
46. Wendtner C. M., Kofler D. M., Theiss H. D., Kurzeder C., Buhmann R., Schweighofer C., Perabo L.,
Danhauser-Riedl S., Baumert J., Hiddemann W., Hallek M., Buning H., (2002), Blood, 100, 1655-1661.
47. Wagner J. A., Nepomuceno I. B., Messner A. H., Moran M. L., Batson E. P., Dimiceli S., Brown B. W.,
Desch J. K., Norbash A. M., Conrad C. K., Guggino W. B., Flotte T. R., Wine J. J., Carter B. J., Reynolds
T. C., Moss R. B., Gardner P., (2002), Hum. Gene Ther., 13, 1349-1359.
48. Li Duan M., Bordet T., Mezzina M., Kahn A., Ulfendahl M., (2002), Neuroreport, 13, 1295-1299.
49. Apparailly F., Millet V., Noel D., Jacquet C., Sany J., Jorgensen C., (2002), Hum. Gene Ther., 13,
1179-1188.
50. Abadie J., Blouin V., Guigand L., Wyers M., Cherel Y., (2002), Gene Ther., 9(15), 1037-1043.
51. Eaton M. J., Blits B., Ruitenberg M. J., Verhaagen J., Oudega M., (2002), Gene Ther., 9(20), 1387-1395.
52. Owen R. 4th, Mandel R. J., Ammini C. V., Conlon T. J., Kerr D. S., Stacpoole P. W., Flotte T. R.,
(2002), Mol. Ther., 6, 394-399.
53. Shi W., Teschendorf C., Muzyczka N., Siemann D. W., (2003), Radiother. Oncol., 66, 1-9.
54. Zhang Z., Zhang Z., Zeng G., Zhang L., Xu C., Guo Y., (2002), Chin. Med. J. (Engl), 115, 1209-1212.
55. Fruehauf S., Veldwijk M. R., Berlinghoff S., Basara N., Baum C., Flasshove M., Hegewisch-Becker S.,
Kroger N., Licht T., Moritz T., Hengge U. R., Zeller W. J., Laufs S., (2002), Cells Tissues Organs, 172,
133-144.
56. Janouskova O., Sima P., Kunke D., (2003), Int. J. Oncol., 22, 569-577.
57. Wendtner C. M., Kofler D. M., Theiss H. D., Kurzeder C., Buhmann R., Schweighofer C., Perabo L.,
Danhauser-Riedl S., Baumert J., Hiddemann W., Hallek M., Buning H., (2002), Blood, 100(5), 1655-1661.
58. During M. J., Symes C. W., Lawlor P. A., Lin J., Dunning J., Fitzsimons H. L., Poulsen D., Leone P.,
Xu R., Dicker B. L., Lipski J., Young D., (2000), Science, 287, 1453-1460.
59. Clark K. R., Johnson P. R., (2001), Curr. Opin. Mol. Ther., 3(4), 375-384.
60. Liu D. W., Tsao Y. P., Kung J. T., Ding Y. A., Sytwu H. K., Xiao X., Chen S. L., (2000), J. Virol., 74,
2888-2894.
61. Xin K. Q., Ooki T., Mizukami H., Hamajima K., Okudela K., Hashimoto K., Kojima Y., Jounai N., Kumamoto Y., Sasaki S., Klinman D., Ozawa K., Okuda K., (2002), Hum. Gene Ther., 13, 1571-1581.
62. Xin K. Q., Urabe M., Yang J., Nomiyama K., Mizukami H., Hamajima K., Nomiyama H., Saito T., Imai
M., Monahan J., Okuda K., Ozawa K., Okuda K., (2001), Hum. Gene Ther., 12, 1047-1061.
63. Xin K. Q., Ooki T., Jounai N., Mizukami H., Hamajima K., Kojima Y., Ohba K., Toda Y., Hirai S., Klinman D. M., Ozawa K., Okuda K., (2003), J. Gene Med., 5, 438-445.
64. Ponnazhagan S., Mahendra G., Curiel D. T., Shaw D. R., (2001), J. Virol., 75, 9493-9501.
65. Banchereau J., Briere F., Caux C., Davoust J., Lebecque S., Liu Y.-J., Pulendran B., Palucka K., (2000),
Annu. Rev. Immunol., 18, 767-811.
66. Banchereau J., Steinman R. M., (1998), Nature, 392, 245-252.
67. Sallusto F., Lanzavecchia A., (1999), J. Exp. Med., 189, 611-614.
68. Timmerman J. M., Levy R., (1999), Annu. Rev. Med., 50, 507-529.
94
PRACE PRZEGL¥DOWE
Download
Random flashcards
bvbzbx

2 Cards oauth2_google_e1804830-50f6-410f-8885-745c7a100970

Motywacja w zzl

3 Cards ypy

Pomiary elektr

2 Cards m.duchnowski

Create flashcards